KR20010101151A - 에키노칸딘 시클로펩티드 화합물의 정제 - Google Patents

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피터 지. 스트링거
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Abstract

적어도 하나의 양성자수용성 아미노기를 함유하는 크게 다양한 발효 시클로펩티드 생성물(탈아실화된 에키노칸딘 형 화합물을 포함함)을 그것들의 발효 또는 혼합 브로스 및 부분 정제된 공정 스트림으로부터, 혼합물을 소수성의, 역상 크로마토그라피 매질상에 흡착시키고 물 중의 부피로 0.1% 아세트산 내지 10.0% 아세트산의 범위에 이르는 연속적인 선형 아세트산 구배로 용리함으로써 분리 및 정제하는 방법이 기술되어 있다. 유도체화제에 의하여 발효생성물로부터 트리펩티드-알데히드 부산물을 제거하는 방법도 기술되어 있다.

Description

에키노칸딘 시클로펩티드 화합물의 정제{PURIFICATION OF ECHINOCANDIN CYCLOPEPTIDE COMPOUNDS}
에키노칸딘 시클로펩티드는 항진균 활성을 갖는 것으로 밝혀진 천연생성물이다. 에키노칸딘 시클로펩티드 부류에는 에키노칸딘 B (ECB), 에키노칸딘 C, 아쿨레아신 Aγ, 물룬도칸딘, 스포리오펀진 A, 뉴모칸딘 A0, WF11899A, 및 뉴모칸딘 B0와 같은 천연생성물이 포함된다. 천연생성물은 전형적으로 여러가지 미생물을 배양함으로써 생성된다. 예를 들면, 에키노칸딘 B는 진균,Aspergillus nidulans의 발효로부터 생성된다.
더 활성인 물질에 대한 연구에서, 천연생성물은 여러가지 방법으로 변형되어왔다. 가장 통상적인 변형 중 하나는 반합성 유도체를 생성하기 위한 천연생성물상의 N-아실 측쇄의 치환이었다. 예를 들면, 미국특허 Nos. 4,293,489; 4,320,052; 5,166,135; 및 5,541,160; 그리고 EP 359529; 448353; 447186; 462531; 및 561639는 다양한 정도의 항진균 활성을 제공하는 다양한 N-아실 유도체화된 에키노칸딘 화합물을 기술한다.
N-아실 유도체는 천연생성물을 탈아실화하고 이어서 다른 아실기로 재아실화함으로써 생성된다. 탈아실화는 전형적으로 효소(예를 들면, 디아실라제 효소)에 의해 달성된다. 디아실라제 효소는 미생물Actinoplanes utahensis또는Pseudomonas종으로부터 얻어질 수도 있다. 즉, 미국특허 Nos. 4,293,482; 및 4,304,716; 및 EP 460882 참조. 탈아실화 화합물은 전형적으로 대응하는 천연생성물의 핵을 말한다(즉, 에키노칸딘 B의 탈아실화 생성물은 에키노칸딘 B 핵(ECBN)을 말한다). 불행하게도, 발효 및 탈아실화공정은 둘다 제거하기 어려운 몇가지 부산물을 생성하고 원하는 탈아실화 고리펩티드 핵의 순도를 감소시킨다.
미국특허 No.4,874,848은 에키노칸딘 형 생성물을 정제하기 위해 역전된 방식으로 비관능성 수지를 사용하는 크로마토그라피 방법을 기술한다. 이 방법은 발효공정으로부터 유도된 생성물의 순도를 개선하였을지라도, 중간체 탈아실화된 핵과 최종 아실화된 약학적으로 활성인 화합물 둘다로부터 분리하기 어려운 오염물질을 제거하기 위한 더이상의 개선이 여전히 필요하다. 최종 제약생성물의 효능은 최종생성물을 만들기 위해 사용된 중간체의 순도에 의존하기 때문에 제조공정의 어떤 단계에서 순도의 개선은 크게 바람직하다. 이상적으로는, 오염물질이 제조공정의가능한한 가장 초기의 단계에서 제거되는 것이다.
액체 크로마토그라피 분리에서 비관능성 수지 및 그것들의 용도의 일반적 논의는J. Chromatography,201, 287-292 (1980) 및 Grieser, M.D. et al,Analytical Chemistry,45, 1348-1353 (1973)에서 찾아볼 수 있다. 단계나 연속적 구배의 어느 하나의 사용이 논의되어 있다; 그러나, 용리액은 상당량의 유기용매를 함유한다. 제조공정에서, 유기용매의 사용은 환경상의 조절(예를 들면, 공기 질 방출기준), 특수 취급요건(예를 들면, 가연성 기준) 그리고 처분 제한(예를 들면, 독성 폐기물 조절)과 같은 몇가지 관심사를 불러 일으킨다. 그러므로, 유기용매의 사용을 최소화하면서 여전히 혼합물을 그것들의 순수한 성분으로 효과적으로 분리하는 용리액 시스템에 대한 필요가 있다.
본 발명은 적어도 하나의 양성자수용성(protonatable) 아미노기를 함유하는 시클로펩티드 화합물의 정제방법에 관한 것이며, 구체적으로, 방법은 소수성의, 역상 크로마토그라피 매질상에 흡착시키고 증가하는 아세트산의 연속적인 거의 선형의 구배로 용리함으로써 에키노칸딘(Echinocandin) 형 화합물의 정제에 관련된다. 에키노칸딘 발효공정의 트리펩티드-알데히드 부산물을 선택적으로 제거하여 고순도 에키노칸딘 화합물을 수득하는 방법도 기술되어 있다.
본 발명은 적어도 하나의 양성자수용성 아미노기를 함유하는 크게 다양한 발효 시클로펩티드 생성물(탈아실화된 에키노칸딘 형 화합물을 포함함)을 그것들의 발효 또는 혼합 브로스 및 부분 정제된 공정 스트림으로부터, 혼합물을 소수성의, 역상 크로마토그라피 매질상에 흡착시키고 물 중의 부피로 0.1% 아세트산 내지 10.0% 아세트산에 이르는 연속적인 거의 선형의 아세트산 구배로, 바람직하게는 0.5%(pH=5.5) 내지 4.0%(pH=2.5) 아세트산으로 용리함으로써 분리 및 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 발효 혼합물 또는 부분 정제된 혼합물에서 알데히드 부산물(특히, 트리펩티드-알데히드 부산물)을 유도체화제와 반응시키는 경우 에키노칸딘 형 화합물 (그것의 간단한 유도체 포함)의 정제방법이 제공된다. 바람직하게는, 발효 브로스 또는 혼합 브로스를 상기한 방법을 사용하는 대응하는 에키노칸딘 핵의 정제에 앞서 유도체화제와 반응시킨다.
여기서 사용된 바, 용어 "유도체화제"는 트리펩티드 부산물의 알데히드 관능성과 반응하여 원하는 에키노칸딘 형 화합물로부터 트리펩티드 중간체의 분리를 허용하는 소수성이 상당히 다른 중간체를 생성할 수 있는 시약을 말한다.
용어 "양성자수용성 아미노기"는 본 발명의 용리 조건(즉, 물 중의 부피로 0.1% 아세트산 내지 10% 아세트산)을 받았을 때 양성자첨가(protonation)를 당하는 아미노기를 말한다.
용어 "에키노칸딘 형 화합물"은 어떤 간단한 유도체를 포함하는 다음의 일반 구조식을 갖는 화합물을 말한다.
상기식에서, R은 수소 또는 -C(O)R'이고 R'는 적어도 하나의 양성자수용성 아미노기가 부착되어 있는 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 또는 헤테로아릴기이고; R1은 -H 또는 -OH이고; R2는 -H 또는 -CH3이고; R3은 -H, -CH3, -CH2CONH2또는 -CH2CH2NH2이고; R4는 -H 또는 -OH이고; R5는 -OH, -OPO3H2또는 -OSO3H이고; R6은 -H 또는 -OSO3H이다. "에키노칸딘 핵"은 R이 수소인 탈아실화된 에키노칸딘 화합물을 말한다. "ECBN"은 R1, R4 및 R5가 히드록실기이고, R2, R3 및 R7은 메틸기이고; R1 및 R6는 수소인 에키노칸딘 B핵을 말한다.
용어 "알킬"은 달리 표시되지 않으면 1 내지 30 탄소원자를 함유하는 일반식 CnH2n+1의 탄화수소 라디칼을 말한다. 알칸 라디칼은 곧은 (예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 등), 분지(예를 들면, 이소프로필, 이소부틸, tert-부틸, 네오펜틸, 등), 고리(예를 들면, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 메틸시클로펜틸, 시클로헥실, 등), 또는 다고리(예를 들면, 비시클로[2.2.1]헵탄, 스피로[2.2]펜탄, 등)이 될 수 있다. 알칸 라디칼은 치환되거나 비치환될 수도 있다. 마찬가지로, 알콕시기 또는 알카노에이트의 알킬부분은 상기와 같은 정의를 갖는다.
용어 "알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 함유하는 비고리 탄화수소를 말한다. 알켄라디칼은 곧은, 분지, 고리, 또는 다고리가 될 수 있다. 알켄라디칼은 치환되거나 비치환될 수도 있다.
용어 "알키닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중결합을 함유하는 비고리 탄화수소를 말한다. 알킨라디칼은 곧은 또는 분지가 될 수 있다. 알킨라디칼은 치환되거나 비치환될 수도 있다.
용어 "아릴"은 단일(예를 들면, 페닐) 또는 융합고리 시스템(예를 들면, 나프탈렌, 안트라센, 페난트렌, 등)을 갖는 방향족 부분을 말한다. 아릴기는 치환될수도 있고 비치환될 수도 있다.
용어 "헤테로아릴"은 방향족 고리 시스템내에 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 방향족 부분을 말한다(예를 들면, 피롤, 피리딘, 인돌, 티오펜, 푸란, 벤조푸란, 이미다졸, 피리미딘, 퓨린, 벤즈이미다졸, 퀴놀린, 등). 방향족 부분은 단일 또는 융합 고리 시스템으로 구성될 수도 있다. 헤테로아릴기는 치환되거나 비치환될 수도 있다.
유기화학분야내에서 및 구체적으로 유기생화학의 분야내에서, 화합물의 상당한 치환이 허용되거나 또는 유용하기도 함은 크게 이해되고 있다. 본 발명에서, 예를 들면, 용어 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 헥실, 이소옥틸, 도데실, 스테아릴, 등과 같은 종래의 알킬인 치환체를 허용한다. 용어 "기"는 구체적으로 비치환 알킬기를 포함할 뿐만 아니라, 히드록시, 할로겐, 알콕시, 카르보닐, 케토, 에스테르, 카르바마토, 등과 같은 본 분야에 통상적인 알킬에 대한 치환을 허용하고 포함한다. 그러나, 당업자들은 치환체가 화합물의 약리학적 특성에 불리하게 영향을 미치지 않고 또는 의약의 사용을 불리하게 방해하지 않도록 선택되어야 함을 일반적으로 잘 이해하고 있다. 상기 정의된 어떤 기에 대한 적합한 치환체들은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 할로, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 메르캅토, 알킬티오, 아릴티오, 모노- 또는 디-알킬아미노, 4차 암모늄염, 아미노알콕시, 히드록시알킬아미노, 아미노알킬티오, 카르바밀, 카르보닐, 카르복시, 글리콜릴, 글리실, 히드라지노, 구아닐, 및 그것들의 조합을 포함한다.
발명을 수행하기위한 최상의 방식
발효 및 혼합 브로스는 원하는 시클로펩티드 생성물로부터 분리하기 매우 어려운 많은 부산물을 함유한다. "혼합 브로스"는 발효 브로스를 정제없이 탈아실화 효소로 직접 처리하여 탈아실화 생성물(예를 들면, ECBN)을 생성하는 전환 혼합물을 말한다. 역상, 액체 크로마토그라피는 과거에 합리적인 성공을 거두면서 사용되어왔다; 그러나, 더 고순도의 화합물에 대한 필요가 더 개선된 정제방법을 요구한다. 본 출원인은 양성자수용성 아미노기를 함유하는 원하는 발효생성물로부터 발효부산물의 분리를 연속적인, 거의 선형의 아세트산 용리체계와 조합하여 역상 크로마토그라피 매질을 사용함으로써 개선될 수 있다는 것을 발견하였다.
적합한 소수성 크로마토그라피 매질은 역상 실리카, 그리고 스티렌과 디비닐벤젠의 공중합체, 메타크릴레이트 중합체와 같은 유기 중합체를 포함한다. 다양한 역상 실리카는 BTR, E. Merck, Eka Nobel, Millipore, Phenomenex, Whatman, 또는 YMC와 같은 제조업자로부터 시중 구입될 수 있다. 실리카는 길이가 C1내지 C18(C1, C4, C8및 C18이 가장 일반적인 것이다)에 이르는 직쇄 알킬 탄화수소 또는 다른 소수성 리간드(예를 들면, 페닐 또는 시아노)와 함께 유도체로 된다. 역상, 액체 크로마토그라피를 위해 설계된 다양한 스티렌/디비닐벤젠 수지도 또한 DiaionTMHP 및 SP 수지(일본 도쿄의 Mitsubishi Chemical Industries Limited 로부터 구입됨), 그리고 Amberlite XAD-2,4, 및 16수지(펜실바니아 필라델피아의 Rohm and Haas Chemical Co.로부터 구입됨),그리고 Toso Haas(펜실바니아 몽고메리빌)로부터의 CG-161, 300, 및 1000 Amberchrom 수지와 같은 것들이 시중 구입된다. 비관능성 수지는 일반적으로 그것들의 기공부피(0.5-4.5ml/g), 비표면적(200-800㎡/g), 기공직경(40-1300Å), 기공크기 분포 및/또는 비드크기 분포로 특징지어 진다. 바람직한 비관능성 수지는 500㎡/g의 표면적, 200-300Å의 기공크기 및 200-800㎛의 입도를 갖는 Diaion HP-20; 1,000㎡/g의 표면적, 50-60Å의 기공크기 및 250-600㎛의 입도를 갖는 SP-825; 630㎡/g의 표면적, 100-200Å의 기공크기 및 200-800㎛의 입도를 갖는 SP-207 (HP-20의 브롬화된 형태); 그리고 900㎡/g의 표면적, 110-175Å의 기공크기 및 80-160㎛의 입도를 갖는 CG-161CD를 포함한다. 더 바람직한 것은 HP-20 및 SP-825수지이다.
초기에는, 적어도 하나의 양성자수용성 아미노기를 갖는 원하는 고리 펩티드 화합물을 함유하는 미정제 또는 부분정제된 용액이 제공된다. 일반적으로, 아미노기는 5.5 내지 2.5의 pH범위에 걸친 아세트산 구배의 과정 중에 양성자첨가될 수 있다. 바람직하게는, 아미노기는 1차 아민이다; 그러나, 아미노기는 질소원자상의 추가의 치환체가 양으로 하전된 아민의 극성을 극복할 정도로 충분히 소수성이지 않는 한 2차아민 또는 3차아민일 수도 있다. 용액은 발효공정 또는 합성공정으로부터 생길 수도 있다. 예를 들면, 고리 펩티드 화합물은 미국특허 No. 5,696,084;J. Am. Chem. Soc.,108, 6041 (1986); Evans, D.A., et al.,J. Am. Chem. Soc.,109, 5151(1987);J. Med. Chem., 35, 2843 (1992); Kurokawa, N., etal.,Tetrahedron,49, 6195 (1993)에 기술된 합성방법들에 의해 제조될 수도 있다. 미정제 용액은 보통 혼합 브로스이다. 또 다르게는, 부분정제된 재료를 더 정제(또는 연마)하기 위한 공정이 사용될 수도 있다.
사용된 구체적인 발효공정에 따라, 크로마토그라피 공정을 방해할 수도 있는 입자들을 제거하기 위해 용액을 사전여과하는 것이 바람직할 수도 있다. 여과는 중력여과, CeliteTM필터 보조물 등을 포함하거나 포함하지 않을 수도 있는 세라믹 필터를 통한 진공여과를 포함하는 당업자들에게 알려진 어떠한 수의 수단들에 의해 달성될 수도 있다. 발효 브로스에서 고형물은 또한 원심분리에 이어서 고형물로부터 액체를 따라냄으로써 제거될 수도 있다.
발효용액은 원하다면 증발농축, 동결건조 등과 같은 당업자들에게 또한 잘 공지되어 있는 다양한 수단을 사용하여 농축시킬 수도 있다. 농축액은 농축공정의 동안에 형성되었을 수도 있는 침전을 제거하기 위해 또 한번 여과할 수도 있다.
미정제 또는 부분정제된 용액을 상기한 소수성 크로마토그라피 매질의 한가지로 패킹된 크로마토그라피컬럼상에 로딩한다. 다음에 원하는 고리 펩티드 생성물을 약 0.1% 아세트산 내지 약 10% 아세트산, 바람직하게는 약 0.5% 아세트산(pH=5.5) 내지 약 4% 아세트산 (pH=2.5)에 이르는 연속적인 거의 선형의 구배를 사용하여 크로마토그라피 매질로부터 용리한다. 선택된 아세트산 농도의 범위의 상한은 사용된 크로마토그라피의 안정성과 그 pH에서 정제되는 화합물의 안정성에 기초한다. 범위의 하한은 아미노기가 양성자첨가되는 pH와 소수성 표면으로부터 생성물을 용리하는데 요구되는 아세트산의 농도에 기초한다. 당업자들은 구배가 완전히 선형이어야하지는 않는다는 것을 인식할 것이다. "거의 선형"의 의미안에는 편평한 볼록 또는 오목한 구배를 포함한다.
구배용리공정 단계의 끝에서, 더 높은 농도의 아세트산 용액의 추가의 부피가 전형적으로 용리를 완결하기위해 사용된다. 공정의 끝에서, 컬럼을 추가의 정제 사이클을 위해 재사용할 수 있도록 재생할 수도 있다. 재생단계는 전형적으로 컬럼을 중성과 알칼리성 pH 모두에서 유기용매와 물의 혼합물로 세척하여 컬럼 매트릭스에 남아있는 어떤 잔류물질을 제거하는 것을 수반한다. 적합한 용매는 아세토니트릴, 메탄올, 이소프로판올, 및 아세톤을 포함한다. 선형의 아세트산 용리체계는 양호한 선택성을 제공할 뿐만 아니라(즉, 이하 실시예 1 참조), 유기용매의 사용을 컬럼 조작의 재생단계로 제한한다. 따라서, 사용되는 유기용매의 절대량과 처분에 앞서 처리되어야하는 컬럼 유출액의 부피가 모두 최소화된다.
발효 생성물은 다양한 방법을 사용하여 용출액으로부터 회수될 수 있다. 적합한 회수방법은 결정화, 증발농축, 및 동결건조를 포함한다.
에키노칸딘 B를 위한 발효브로스는 다음의 화학식 Ia를 갖는 여러 레벨의 트리펩티드-알데히드 (Asn-Gln-Leu-H) 부산물을 함유한다. 트리펩티드-알데히드 부산물은 효소학적 탈아실화 공정의 동안에 에키노칸딘 B뿐만 아니라, 탈아실화를 당하여 대응하는 탈아실화 트리펩티드-알데히드(화학식 Ib)를 형성한다.
상기식에서, R은 C(O)CH2CH(OH)C9H19(화학식 Ia-발효 부산물) 또는 수소(화학식 Ib-혼합브로스로부터의 탈아실화 부산물)이다.
놀랍게도, 탈아실화 트리펩티드-알데히드의 보유시간은 최적 용리조건하에서도 역상, 액체 크로마토그라피에서 ECBN과 매우 유사하여, 따라서 원하는 ECBN으로부터 탈아실화 트리펩티드-알데히드(화학식 Ib)를 분리하기가 매우 어렵게 만든다. 만일 트리펩티드가 제거되지 않으면 트리펩티드의 유리 아미노기가 재아실화 공정의 동안에 ECBN 화합물의 유리 아미노기와 경합한다. 그 결과, ECBN 화합물의 완전한 아실화를 보장하기 위해서는 과량의 아실화 화합물이 첨가되어야 한다. 트리펩티드 오염물질은 필요한 출발물질을 소비시킬 뿐만 아니라 아실화된 ECB 화합물의 후속 정제에서 제거되기 어려운 아실화 부산물을 생성한다. 바람직하게는, 트리펩티드 부산물은 ECBN 화합물의 재아실화에 앞서 제거된다.
트리펩티드-알데히드 부산물은 크로마토그라피 정제에 앞서 알데히드를 유도체화제와 반응시킴으로써 발효 혼합물이나 아니면 혼합 브로스(즉, 탈아실화 혼합물)로부터 제거될 수도 있다 유도체화제는 원하는 ECB 화합물과 관련하여 트리펩티드-알데히드의 크로마토그라피 보유시간을 변화시키기 위해 알데히드 관능성에 첨가될 수 있다. 적합한 유도체화제는 중아황산나트륨, 히드록실아민 및 세미카바자이드 염산염을 포함한다. 크로마토그라피 보유시간을 변경시키는 다른 수단과 반대로 유도체화제를 사용하는 몇가지 이점은 알데히드 관능성에 대한 유도체화제의 선택성과 반응이 일어나는 온화한 조건이다. 만일 유도체화제와 트리펩티드-알데히드간의 반응이 가역적이라면, 알데히드는 유도체화제를 제거함으로써 쉽게 회수될 수 있다. 회수된 트리펩티드는 그 다음 다른 목적을 위해 사용될 수 있다.
다음의 축약은 각각의 열거된 재료를 나타내기 위해 실시예를 통해 사용된다.
ACN - 아세토니트릴
TFA - 트리플루오로아세트산
HP-20 - 500㎡/g의 표면적, 200-300Å의 기공크기 및 200-800㎛의 입도를 갖는 스티렌/디비닐벤젠 수지.
SP-825 - 1,000㎡/g의 표면적, 50-60Å의 기공크기 및 250-600㎛의 입도를 갖는 스티렌/디비닐벤젠 수지.
SP-207 - 630㎡/g의 표면적, 100-200Å의 기공크기 및 200-800㎛의 입도를 갖는 브롬화 스티렌/디비닐벤젠 수지.
CG-161CD - 900㎡/g의 표면적, 110-175Å의 기공크기 및 80-160㎛의 입도를 갖는 스티렌/디비닐벤젠 수지.
크로마토그라피 제제 및 ECBN 정제과정:
0.2 내지 5리터 크기에 이르는 유리 컬럼을 사용하였다. 연구한 크로마토그라피 매트릭스는 HP-20, SP-825 및 SP-207 (모두 Mitsubishi로부터 구입됨) 그리고 CG-161CD (Toso Haas로부터 구입됨)를 포함하였다. 매트릭스를 컬럼 패킹에 앞서 50/50 물/ACN, 0.1M 수산화나트륨, 그리고 최종적으로 순수한 아세토니트릴(ACN)로배치 세척하였다. 선택한 매트릭스를 간단한 슬러리 가라앉히는 기술을 사용하여 적당한 크기 컬럼에 패킹하였다. 1리터 미만의 컬럼 크기를 종래의 FPLC 기기장치(Parmacia로부터 구입됨)를 사용하여 조작하였다. Waters Delta Prep 3000 콘트롤러 시스템을 사용하여 5 리터 컬럼 실험을 행하였다.
ECBN 혼합물을 각각의 컬럼에 로딩하기에 앞서 Cuno 30S 필터를 사용하는 여과에 의해 정화하였다. HP-20 및 SP-825 컬럼을 0.5% 아세트산(HOAc)에서 사전평형화시키고, 수산화나트륨(NaOH)으로 pH 5.5로 조절하고, 정화된 ECBN 용액으로 로딩하였다. HP-20 컬럼을 패킹된 수지의 대략 5 내지 5.5 gECBN/리터로 로딩하였고, 한편 SP-825 컬럼을 대략 11 내지 12 g/리터로 로딩하였다. 로딩후, 컬럼을 5 컬럼 부피(CV)의 평형 완충액으로 세척하였다. 0.5% HOAc(pH=5.5) 내지 4% HOAc (pH=2.5)에 이르는 연속적인 5 CV의, 선형의 구배를 사용하여 생성물을 용리하였다. 구배의 끝에서, 4% HOAc 용액의 추가의 2 CV를 사용하여 용리를 완결하였다. 생성물의 용리의 동안에 0.2 CV 분획을 수집하였다. 분획을 다양한 역상 HPLC (RP-HPLC)법에 의해 특징짓고, 적당한 분획들을 합하여 주류 푸울을 수득하였다. 컬럼을 ACN과 물의 3 CV 60/40 혼합물로 세척하고 이어서 ACN과 0.1M NaOH의 3 CV 60/40 혼합물로 세척하였다. 조작의 동안에 사용된 유속은 로드, 세척, 재생 및 재평형화에 대해 2 CV/시간(150 cm/시간)이었고, 용리에 대해 1 CV/시간(75㎝/시간)이었다. 주류 푸울을 농축시켰다.
비교를 위해, 다음의 유동상 조건(유기변형제 및 pH)과 구배 용리 프로파일을 매트릭스 유형에 더하여 연구하였다.
ACN 변형제: 5 CV, 선형의 ACN구배(아세테이트 완충액으로 pH 5.5)를 사용한 실시예1-3.
아세트산 용리: 초기 기술한 조건에 더하여, 아세트산의 농도를 5%로 증가시켰다(실시예 10). 단계 구배 및 볼록 구배를 또한 HP-20과 SP-825 컬럼 모두에 대해 상기한 연속적인 선형 구배와 비교하였다(실시예 13-19).
샘플의 분석 특성화:
ECBN 크로마토그라피 샘플의 질과 양을 다음의 분석법을 사용하여 평가하였다.
인산염 시스템: Zorbox SB C-18, 3.5 미크론 입자 컬럼(0.46 ㎝ID ×15 ㎝)를 1.0ml/분의 유속으로 0.2% 인산/ACN 유동상으로 용리하였다. 컬럼을 40℃에서 조작하고 유출물을 210nm에서 모니터하였다. 1% ACN에서 평형화시키고 샘플 주입후 9분에 걸친 1 내지 18.5% ACN에 이르는 구배를 사용하여 ECBN을 용리하였다. 용리후, 컬럼을 50% ACN으로 세척하여 고도로 보유된 성분들을 용리하였다.
인산염/옥타술폰산(OSA) 시스템: 이 시스템은 상기 논의한 인산염 시스템과 유사하나, 단 유동상이 30mM OSA를 함유한다. 컬럼을 9% ACN으로 평형화시켰다. 샘플을 주입후, 9분에 걸친 9 내지 24% ACN에 이르는 구배로 ECBN의 용리를 달성하였다. 그 다음, 컬럼을 50% ACN으로 세척하여 고도로 보유된 성분들을 용리하였다. 컬럼 유속 및 검출기 파장은 상기와 같았고, 컬럼 온도는 50℃이었다. 이 시스템은 Asn-Gln-Leu-H 트리펩티드-알데히드 성분을 정량하기 위해 특히 유용하다.
TFA 시스템: 분석(assay)를 위해 Vydac C-18, 3.5 미크론 컬럼(0.46 ×25㎝)을 사용하였다. 유동상은 0.1% TFA를 함유하였고 20분간에 걸친 0 내지 10%의 선형 ACN구배를 사용하고 이어서 50%의 컬럼 세척을 하여 용리를 달성하였다. 컬럼 유속, 온도, 및 검출기 파장은 상기한 인산염 시스템에 대한 것과 같았다.
트리펩티드 함량을 결정하는 대안적 방법으로서 아미노산 분석(AAA)을 샘플에 대해 또한 행하였다. 샘플을 산 가수분해하고 가수분해물 중의 Asn, Gln 및 Thr의 몰수를 이온교환 크로마토그라피 및 닌히드린 유도체화에 의해 결정하였다. Thr회수율을 사용하여 샘플 중의 ECBN의 몰수를 결정하는 한편, Gln 함량을 트리펩티드 레벨로 나타내었다. Asn-Gln-Leu-H 트리펩티드 대 ECBN의 몰%(M%)를 다음 식을 사용하여 계산하였다:
M% Asn-Gln-Leu-H = 2×[Gln]/[Thr]
명시된 파장에서 선택된 샘플에 대해 광학밀도(OD) 측정을 행하여 상대 샘플 탁도(OD @550nm) 또는 총 단백질 함량(OD @280nm)을 개산하였다.
다음의 실시예를 예시를 위해 제공하며 특허청구된 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
실시예 1은 아세토니트릴 용리 체계를 사용하는 RP-HPLC 크로마토그라피 공정을 다양한 비관능성 수지와 조합하여 아세트산 용리 체계와 비교한다. 표 1은 지정된 용리 체계와 컬럼 매질을 사용하여 관찰된 결과를 요약한다.
표1에서, *비교예;a수지 리터당 ECBN의 측정된 그램 수;b데스메틸 불순도는 메틸기가 각각 트레오닌에서와 메틸 프롤린 펩티드 단위에서 빠져 있는 두가지 ECBN 화합물의 혼합물을 말한다.
(ACN)변형제 체계는 양호한 수율, 전체 순도 및 데스메틸 성분의 분해능을 제공하였다; 그러나, 아세토니트릴이 유기용매이다. 표 1은 아세트산이 종래의 유기용매 용리 체계의 대안을 제공한다는 것을 분명히 나타낸다. 데이타는 또한 아세트산의 연속 구배가 아세트산의 단계 구배나 아니면 볼록 구배와 비교하여 분해능을 상당히 향상시킴을 나타낸다. 실시예 5(선형 구배)에 대한 생성물 수율은 약간 더 낮고 주류 부피는 실시예 4(단계 구배)에 비하여 더 크나, 전면적인 ECBN 순도는 더 높고(83% 대 71%) 데스메틸 함량은 더 낮다(2% 대 11%).
아세트산 용리 공정을 사용하는 소수성 매트릭스로부터 ECBN의 용리는 두가지 방식으로 달성되는 것으로 생각된다: (1) 아세트산은 유기 변형제로서 작용하여 이로써 유동상의 용리강도를 증가시키고; (2) B 용매의 낮은 pH(강한 용리 용매, pH=2.5)는 ECBN의 아민 관능성을 양성자첨가하여 이로써 그것을 더 극성으로 만들고 따라서 소수성 정지상에 의해 더 적게 보유되게 만드는 역할을 한다. 유기 변형제와 pH 둘다에 대해 4% 아세트산 용액의 영향은 실시예 8 및 9를 비교하여 명백하다. 실시예 9에서는 100mM 인산(pH=2.5)으로 B 용매로서의 4% HOAc(pH=2.5)를 대신하였다. ECBN의 용리는 유동상의 pH에만 의존한다면 ECBN의 용리위치 및 회수율은 실시예 8에서 관찰된 것과 유사해야 한다. 사실상, 인산염 용리는 ECBN의 단지 약 50%회수를 가져왔고 생성물 피크는 상당한 정도의 꼬리 형성을 나타내었다. 따라서 4% HOAc는 유동상의 pH를 낮춤으로써와 유기 변형제로서 작용함으로써 유동상의 용리강도를 증가시킴으로써 용리를 가져올 수 있다.
아세트산은 또한 아세토니트릴보다 더 큰 선택성을 제공한다. ACN 대 HOAc (각각, 실시예 1 및 5)로 용리된 HP-20 컬럼으로부터 수집된 주류에 대한 RP-HPLC 크로마토그램을 비교할 때, HOAc를 사용하여 용리된 주류 중의 뒷부분 불순물의 부재가 관찰되었다. HOAc 용리 체계에서 이들 성분은 컬럼이 재생될 때까지 용리되지 않는다.
실시예 2
실시예 2는 단일 컬럼/선형 아세트산 용리체계(상기한 것)를 사용하는 크로마토그라피 공정을 이중 컬럼/볼록 아세토니트릴 용리체계와 비교한다. 게다가, ECBN의 미처리 로트(실시예 2-8 및 2-10)의, 컬럼상에서의 정제에 앞서 메타아황산나트륨으로 처리된 ECBN로트(실시예 2-7 및 2-9)와의 비교를 기술한다. 메타중아황산나트륨으로의 전처리는 컬럼 충전물에 10mM의 메타중아황산나트륨을 단순히 첨가하고 용액을 6-18시간의 기간동안 교반하도록 둠으로써 달성되었다. 단일 컬럼 공정은 선형 구배 아세트산 용리 체계를 사용하는 상기한 것과 같다.
비교용의 이중 컬럼 공정은 리드-꼬리 구조에서 조작하는 두개의 HP-20컬럼을 사용한다. 발효 브로스는 직렬로 연결된 두개의 HP-20 컬럼상에 로딩한다. 제1 컬럼에 의해 보유되지 않는 어떤 ECBN도 제2 컬럼상에 농축된다. ECBN은 두 컬럼사이에 대략 같은 비율로 분포되는 것으로 생각된다. 로딩후, 리드 컬럼은 연결을 끊고 3.8 컬럼 부피(CV)의 물로 세척한다. 리드 컬럼의 용리는 3.3 CV의 5% HOAc로 세척함으로써 달성된다. 제1 컬럼으로부터의 주류는 5.0의 pH로 조절되고 부분 로딩된 제2(꼬리) 컬럼상에 충전된다. 컬럼을 용리에 앞서 6.3 CV의 물로 세척한다. 볼록 아세토니트릴 구배(0.5% HOAc를 함유하는 약 5 CV에 걸친 0-9.4%)를 사용하여 컬럼을 용리한다. 컬럼 유출물을 분별하고 원하는 순도(75%역상 HPLC 주 피크 순도 이상이고 10% 미만의 데스메틸 성분)를 갖는 분획을 주류로서 모았다. 그 다음, 모은 용액을 농축하였다.
표 2는 단일 컬럼 대 이중 컬럼 크로마토그라피 공정, 그리고 처리 대 미처리 ECBN 발효 브로스에 대해 관찰된 결과를 비교한다.
표 2에서,a보고된 값은 두 독립적인 결정화와 분석 결정의 평균을 나타낸다;b%주 피크 대 총 RP-HPLC 피크 면적;c%데스메틸 불순도;dECBN/OD = ECBN(RP-HPLC)의 그램/총OD 그램; 여기서 OD 그램 OD@280nm 이고 1.0의 E0.1%를 취한다;e두로트 중 하나는 더 높은 물 함량을 가졌고; 따라서 평균 효능이 감소되었다.
ECBN 순도에 대해 상기 보고된 분석 결과는 주류를 농축한 후 얻어졌다. 역상 HPLC 주 피크 순도와 데스메틸 수준은 단일의 HP-20 및 SP-825 컬럼 실험에 대해 유사하다. 그러나, 단일의 HP-20조작은 데스메틸 성분에서 약간 더 큰 감소를 일관되게 산출한다. 일반적으로, 단일 컬럼 공정의 ECBN 역상 HPLC 순도는 2 컬럼 공정으로부터의 ECBN 순도와 동등하거나 보다 더 양호하여 정제의 더 경제적인 수단을 제공한다.
컬럼 정제 체계의 어떤 것도 트리펩티드의 레벨을 상당히 감소시킬 수 없다; 그러나, 중아황산나트륨으로의 전처리는 트리펩티드 불순물의 양을 상당히 감소시켰다. 단일 컬럼 연구로부터의 생성물의 ECBN/OD 순도는 2 컬럼 연구에서 얻어진 것과 동등하거나 보다 더 컸다. ECBN/OD 값은 순도의 절대 척도를 나타내지 않으나, 여러가지 컬럼 조작으로부터 가져오는 ECBN 순도의 양호한 상대적 비교를 제공한다. 모든 컬럼 조작들은 컬럼 충전 용액에 대한 값들을(데이타는 나타내지 않음) 이들 농축된 주류와 비교할 때 ECBN/OD 순도에 있어서 10-15배 증가를 제공하였다.
여기 인용된 모든 참고문헌은 여기에 참고로 포함된다. 전술한 발명은 명료성과 이해를 목적으로 일부 상세히 기술하였으나, 어떤 변화와 수정이 실행될 수 있음은 당업자들에게 명백할 것이다. 그러므로, 상세한 설명과 실시예는 청구범위에 의해 상세히 서술되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

Claims (20)

  1. (i) 적어도 하나의 양성자수용성 아미노기가 부착된 시클로펩티드를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계;
    (ii) 상기 혼합물을 소수성의, 역상 크로마토그라피 매질상에 흡착시키는 단계; 그리고
    (iii) 물 중의 부피로 0.1% 아세트산 내지 10.0% 아세트산에 이르는 연속적인 거의 선형의 아세트산 구배로 용리하는 단계를 포함하는 시클로펩티드 생성물의 분리 및 정제 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 아세트산 구배는 물 중의 부피로 0.5% 아세트산 내지 4.0% 아세트산에 이르는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 시클로펩티드 화합물은 다음 구조식으로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
    상기식에서, R은 수소 또는 -C(O)R'이고 R'는 적어도 하나의 양성자수용성 아미노기가 부착되어 있는 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 또는 헤테로아릴기이고; R1은 -H 또는 -OH이고; R2는 -H 또는 -CH3이고; R3은 -H, -CH3, -CH2CONH2또는 -CH2CH2NH2이고; R4는 -H 또는 -OH이고; R5는 -OH, -OPO3H2또는 -OSO3H이고; R6은 -H 또는 -OSO3H이다.
  4. 제 3 항에 있어서, R은 수소인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 소수성의, 역상 매질은 유기 중합체인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 유기 중합체는 스티렌과 디비닐벤젠의 공중합체 또는 메타크릴레이트 중합체인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 유기 중합체는 500㎡/g의 표면적, 200-300Å의 기공크기 및 200-800㎛의 입도를 갖는 스티렌/디비닐벤젠 수지; 또는 1,000㎡/g의 표면적, 50-60Å의 기공크기 및 250-600㎛의 입도를 갖는 스티렌/디비닐벤젠 수지인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 혼합물은 혼합 브로스의 생성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, (iv) 상기 시클로펩티드 화합물을 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. (i) 에키노칸딘 형 화합물과 알데히드 부산물의 혼합물을 제공하는 단계;
    (ii) 상기 혼합물에 유도체화제를 첨가하여 유도체로 된 알데히드 생성물을 생성하는 단계; 그리고
    (iii) 상기 유도체로 된 알데히드 생성물로부터 상기 에키노칸딘 형 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 알데히드 부산물을 함유하는 에키노칸딘 형 화합물의의 정제 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 분리 단계(iii)은 제 1항의 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 에키노칸딘 형 화합물은 다음 구조식으로 표시되는것을 특징으로 하는 방법.
    상기식에서, R은 수소 또는 -C(O)R'이고 R'는 적어도 하나의 양성자수용성 아미노기가 부착되어 있는 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 또는 헤테로아릴기이고; R1은 -H 또는 -OH이고; R2는 -H 또는 -CH3이고; R3은 -H, -CH3, -CH2CONH2또는 -CH2CH2NH2이고; R4는 -H 또는 -OH이고; R5는 -OH, -OPO3H2또는 -OSO3H이고; R6은 -H 또는 -OSO3H이다.
  13. 제 12 항에 있어서, R은 수소인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 분리 단계(iii)은 제 1항의 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 알데히드 부산물은 다음 구조식으로 표시되는 것을특징으로 하는 방법.
    상기식에서, R은 -C(O)CH2CH(OH)C9H19또는 수소이다.
  16. 제 10 항에 있어서, 상기 혼합물은 발효 브로스의 생성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 10 항에 있어서, 상기 혼합물은 혼합 발효 브로스의 생성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 10 항에 있어서, 상기 유도체화제는 중아황산나트륨, 히드록실아민 및 세미카바자이드 염산염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 15 항에 있어서, 상기 유도체화제는 중아황산나트륨인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 15 항에 있어서, 상기 분리 단계(iii)은 제 1항의 방법을 포함하는 것을특징으로 하는 방법.
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