CN116381068A - 一种分离并检测玛巴洛沙韦中有关物质的高效液相色谱法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种分离并检测玛巴洛沙韦中有关物质的高效液相色谱法，色谱柱固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为含酸溶液并由A相和B相组成，所述有关物质选自有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8、有关物质9、有关物质10和有关物质11中的任一种或其组合。所述方法实现玛巴洛沙韦及其有关物质的高效分离与检测，且该方法具有很好的灵敏度、重现性。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种高效分离并检测玛巴洛沙韦中有关物质的高效液相色谱法。
背景技术
玛巴洛沙韦(Baloxavir marboxil)为Baloxavir的前药，是一种帽依赖性核酸内切酶抑制剂，可抑制mRNA的合成，目前已被获批用于治疗甲型和乙型流感，化学名称为：({(12aR)-12-[(11S)-7,8-二氟-6,11-二氢二苯并[b,e]硫杂
-11-基]-6,8-二氧-3,4,6,8,12,12a-六氢-1H-[1,4]噁嗪并[3,4-c]吡啶并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基}氧代)甲基碳酸甲酯，结构式如下：
CN111665297A公开了一种用液相色谱法分离测定Baloxavir marboxil及其光学异构体的方法，采用多糖衍生物为填料的手性色谱柱，以低级烷烃与低级醇的混合液为流动相。所述多糖衍生物为直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)、直链淀粉-三[(S)-α-甲苯基氨基甲酸酯]、纤维素-(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三[(4-甲基苯甲酸酯]或纤维素-(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)或其组合。所述流动相中含有三氟乙酸。涉及的Baloxavir marboxil光学异构体包括：SR构型、SS构型、RR构型和RS构型。
CN112858534A公开了一种玛巴洛沙韦中间体及其有关物质的HPLC检测方法，采用十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相为磷酸溶液和甲醇的混合液。玛巴洛沙韦中间体及其有关物质分别是7,8-二氟-6,11-二氢-二苯并[B,E]噻吩并-11-醇、3,4-二氟-2-甲基苯甲酸、3,4-二氟-2-甲基苯甲酸甲酯、3,4-二氟-2-溴甲基苯甲酸甲酯、3,4-二氟-2-苯硫甲基苯甲酸甲酯、3,4-二氟-2-苯硫甲基苯甲酸、7,8-二氟二苯并[b,e]硫杂卓-11(6H)-酮。但该方法仅能分离检测有限的几种杂质，对于玛巴洛沙韦制备中涉及到的其它一些关键中间体及杂质仍无法有效分离。
有关物质包括药物原料带入的杂质、过程中产生的有关物质以及降解相关的有关物质等，其会直接影响药物的纯度和质量，甚至会造成严重的不良反应，影响临床用药的有效性、安全性。为了提升玛巴洛沙韦的产品质量并保障临床用药安全有效，需充分研究其制备过程中存在的过程有关物质以及降解相关有关物质并开发适用的分离检测方法，将杂质控制在安全限度范围以内，实现药品质量可控，保障临床用药的安全有效。
发明内容
本发明的目的一方面在于提供一种高效分离并检测玛巴洛沙韦及其有关物质的高效液相色谱法，其中，色谱柱固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相由A相和B相组成，其中A相为甲酸水溶液且B相为甲酸的乙腈溶液，所述流动相为梯度洗脱，所述高效液相色谱法配紫外检测器。
本发明优选的技术方案中，所述A相甲酸水溶液的浓度为0.01％-1％(V/V)，优选为0.05％-0.5％(V/V)，更优选为0.1％-0.3％(V/V)。
本发明优选的技术方案中，所述B相中甲酸的浓度为0.01％-1％(V/V)，优选为0.05％-0.5％(V/V)，更优选为0.1％-0.3％(V/V)。
本发明优选的技术方案中，所述流动相的流速为0.7ml-1.4ml/min，优选为0.9ml-1.2ml/min，更优选为1.0-1.1ml/min。
本发明优选的技术方案中，所述紫外检测器检测波长为240nm-280nm，优选为250nm-270nm，更优选为254-260nm。
本发明优选的技术方案中，所述梯度洗脱程序为：
本发明优选的技术方案中，所述梯度洗脱程序为：
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本发明优选的技术方案中，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为商购获得，优选为ThermoFisher、YMC、Phenomenex、ES、Merck、Agilent、Kromasil、Agela或Techmate的任一公司生产的十八烷基硅烷键合硅胶柱。
本发明优选的技术方案中，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱选自Eclipse PlusC18、Kromasil 100-5-C18、Kromasil Eternity-5-C18、Kromasil EternityXT-10-C18、Kromasil100-10-C18、Kromasil 300-5-C18、YMC Triat C18、YMC ODS C18、YMC-Pack C18、Phenomenex kinetex C18、Titank C18、ES-C18、Epic C18、ZORBAX SB-C18、ZORBAX 300SB-C18、Poroshell 120EC-C18、XDB-C18、TC-C18、Extend-C18、Bonshell C18、BonshellASBC18、Venusil HLP C18、Venusil C18 Plus、Venusil XBP C18(A)、Venusil XBP C18(B)、Venusil MP C18、Innoval Neo XD C18、Techmate C18-ST、Techmate C18-STⅡ、TechmateCI8 UG中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱优选为KromasilC18，4.6mm×250mm，5μm。
本发明优选的技术方案中，所述色谱柱的柱温为5℃-40℃，优选为10℃-35℃，更优选为25-30℃。
本发明优选的技术方案中，所述有关物质选自有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8、有关物质9、有关物质10和有关物质11中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，出峰顺序依次为有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、玛巴洛沙韦、有关物质7、有关物质8、有关物质9、有关物质10、有关物质11，其中，玛巴洛沙韦峰与有关物质6、有关物质7(玛巴洛沙韦的光学异构体)峰之间的分离度均大于1.5。
本发明的优选技术方案中，有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8、有关物质9、有关物质10、有关物质11的含量分别不大于样品总量的0.15％。
本发明的优选技术方案中，所述高效液相色谱法含洗脱样品，所述洗脱样品包括定位溶液、供试品溶液和分离度溶液的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述定位溶液的浓度为0.1μg/ml-20μg/ml，优选为0.5-10μg/ml，更优选为5-10μg/ml。
本发明优选的技术方案中，所述供试品溶液的浓度为0.1μg/ml-20μg/ml，优选为0.5μg/ml-10μg/ml，更优选为5-10μg/ml。
本发明优选的技术方案中，所述定位溶液和供试品溶液的溶剂选自甲醇、乙腈的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述高效液相色谱法包括下述步骤：
1)定位溶液：取有关物质1-11各适量，分别用乙腈溶解并稀释成1ml中约含有关物质1-11各10μg的溶液，作为定位溶液；
供试品溶液：取玛巴洛沙韦适量，用乙腈溶解并稀释成1ml中约含玛巴洛沙韦10μg的溶液，作为供试品溶液；
分离度溶液：取玛巴洛沙韦和有关物质1-11样品各适量，用乙腈溶解并稀释成每1ml中约含玛巴洛沙韦10μg，约含有关物质1-11各10μg的混合溶液，作为分离度溶液；
2)以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相(Kromasil C18，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)：流动相A为含0.1％(V/V)甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％(V/V)甲酸的乙腈溶液，将洗脱样品注入液相色谱仪，进样量为25μl，按如下梯度进行洗脱；柱温为25℃；检测器检测波长为254nm；流速为每分钟1.0ml，记录色谱图：
本发明的另一目的在于提供本发明所述的检测玛巴洛沙韦中有关物质的高效液相色谱法在用于高效分离并检测玛巴洛沙韦中的有关物质中的应用。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
(1)本发明通过科学的筛选优化了高效液相色谱的洗脱条件和检测条件，实现了对玛巴洛沙韦及其光学活性异构体、有关物质等12种结构近似、难以分离的有关物质的有效分离与检测，分离效果良好，有效进行了药品质量控制，减少药物临床试验中和治疗中可能出现的不良反应，保证了患者用药的有效性、安全性。另外，本发明的方法还用于药品的稳定性考察，保证药品在储藏、运输中保持质量稳定。
(2)本发明方法耗时短，可节约时间成本，提高经济效益，适宜工业化、规模化生产。本发明的流动相容易配制，按照常规方法配制即可，避免了由于样品保留时间变化需要重新调整流动相比例的问题。
(3)本发明方法专属性强，各有关物质与空白溶剂不互相干扰，各成分峰之间的分离度均大于1.5；本发明色谱条件检测有关物质灵敏度高；各有关物质的相关系数线性良好；进样精密度良好；重复试验项下，不同分析人员在不同的时间、不同的仪器上的测定结果一致，方法重现性好；各有关物质回收率在合理范围；色谱条件微小变化时，不影响各成分峰分离；该方法的耐用性良好。
附图说明
图1为对比例1的高效液相色谱图。
图2为对比例2的高效液相色谱图。
图3为实施例1的高效液相色谱图。
图4为实施例2的高效液相色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
对比例1玛巴洛沙韦和有关物质的HPLC检测
定位溶液：取有关物质1-11各适量，分别用乙腈溶解并稀释成1ml中约含有关物质1-11各10μg的溶液，作为定位溶液；
供试品溶液：取玛巴洛沙韦适量，用乙腈溶解并稀释成1ml中约含玛巴洛沙韦10μg的溶液，作为供试品溶液；
分离度溶液：取玛巴洛沙韦和有关物质1-11样品各适量，用乙腈溶解并稀释成每1ml中约含玛巴洛沙韦10μg，约含有关物质1-11各10μg的混合溶液，作为分离度溶液；
液相色谱仪：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相(Waters Xselect CSH C18，3.0mm×150mm，3.5μm)，以含0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠的0.1％三氟乙酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，将洗脱样品注入液相色谱仪，进样量为5μl，柱温为35℃；紫外检测器检测波长为259nm；流速为0.6ml/mim，按如下梯度进行洗脱：
分离度溶液色谱结果如表1和图1。
表1
结果显示，该方法未能实现①有关物质6、玛巴洛沙韦和有关物质7的良好分离，②有关物质9和10的良好分离，有关物质6是作为前药的玛巴洛沙韦制备中的中间体以及降解有关物质5的光学活性异构体，有关物质7为玛巴洛沙韦的RR型光学异构体，有关物质9为玛巴洛沙韦制备中产生的中间体杂质，有关物质10为其制备中的起始物料之一。开发一种能实现以上各成分有效分离与检测的方法具有重要的产业价值。
对比例2
定位溶液：取有关物质1-11各适量，分别用乙腈溶解并稀释成1ml中约含有关物质1-11各10μg的溶液，作为定位溶液；
供试品溶液：取玛巴洛沙韦适量，用乙腈溶解并稀释成1ml中约含玛巴洛沙韦10μg的溶液，作为供试品溶液；
分离度溶液：取玛巴洛沙韦和有关物质1-11样品各适量，用乙腈溶解并稀释成每1ml中约含玛巴洛沙韦10μg，约含有关物质1-11各10μg的混合溶液，作为分离度溶液；
液相色谱仪：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相(Kromasil C18，4.6mm×250mm，5μm)，以10mM的K2HPO4缓冲溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，将洗脱样品注入液相色谱仪，进样量为25μl，柱温为25℃；紫外检测器检测波长为254nm；流速为1.0ml/mim，按如下梯度进行洗脱：
分离度溶液色谱结果见图2，由图2可知，多个杂质峰互相重叠，该方法未能实现对玛巴洛沙韦及其各有关物质的有效分离。
实施例1本发明检测玛巴洛沙韦和有关物质的方法
定位溶液：取有关物质1-11各适量，分别用乙腈溶解并稀释成1ml中约含有关物质1-11各10μg的溶液，作为定位溶液；
供试品溶液：取玛巴洛沙韦适量，用乙腈溶解并稀释成1ml中约含玛巴洛沙韦10μg的溶液，作为供试品溶液；
分离度溶液：取玛巴洛沙韦和有关物质1-11样品各适量，用乙腈溶解并稀释成每1ml中约含玛巴洛沙韦10μg，约含有关物质1-11各10μg的混合溶液，作为分离度溶液；
液相色谱仪：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相(Kromasil C18，4.6mm×250mm，5μm)，以0.1％(V/V)甲酸水溶液为流动相A，以0.1％(V/V)甲酸乙腈溶液为流动相B，将洗脱样品注入液相色谱仪，进样量为25μl，柱温为25℃；紫外检测器检测波长为254nm；流速为1.0ml/mim，按如下梯度进行洗脱：
分离度溶液色谱图结果见表2和图3。
表2
结果显示，该方法实现了玛巴洛沙韦以及所有11种有关物质的有效分离，分离度均大于1.5，各物质峰互不干扰。
实施例2本发明检测方法灵敏度测试
取玛巴洛沙韦和有关物质1-11样品各适量，用乙腈溶解并稀释成每1ml中约含玛巴洛沙韦和有关物质1-11各0.5μg的混合溶液，作为灵敏度测试溶液。
色谱条件同实施例1。
灵敏度测试结果见下表3和图4：
表3
结果显示，采用实施例1的方法，杂质1-11及玛巴洛沙韦在含量低至约10ng水平时仍可实现较好的分离及检测，本发明方法灵敏度好，可有效检测低含量杂质，排除潜在用药风险，保障药品质量的有效性和安全性。
虽然本发明所揭露的实施例如上，但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
Claims (9)
1.一种高效分离并检测玛巴洛沙韦中有关物质的高效液相色谱法，其特征在于：色谱柱固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相由A相和B相组成，其中A相为甲酸水溶液且B相为甲酸的乙腈溶液，所述流动相为梯度洗脱，所述高效液相色谱法配紫外检测器。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法，所述A相甲酸水溶液的浓度为0.01％-1％V/V，优选为0.05％-0.5％(V/V)，更优选为0.1％-0.3％(V/V)。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱法，所述B相中甲酸的浓度为0.01％-1％V/V，优选为0.05％-0.5％(V/V)，更优选为0.1％-0.3％(V/V)。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱法，所述流动相的流速为0.7ml-1.4ml/min，优选为0.9ml-1.2ml/min，更优选为1.0-1.1ml/min。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱法，所述梯度洗脱程序为：
6.根据权利要求1所述的高效液相色谱法，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱选自Eclipse Plus C18、Kromasil 100-5-C18、Kromasil Eternity-5-C18、KromasilEternityXT-10-C18、Kromasil 100-10-C18、Kromasil 300-5-C18、YMC Triat C18、YMCODS C18、YMC-Pack C18、Phenomenex kinetex C18、Titank C18、ES-C18、Epic C18、ZORBAXSB-C18、ZORBAX300SB-C18、Poroshell 120EC-C18、XDB-C18、TC-C18、Extend-C18、BonshellC18、Bonshell ASB C18、Venusil HLP C18、Venusil C18 Plus、Venusil XBP C18(A)、Venusil XBP C18(B)、Venusil MP C18、Innoval Neo XD C18、Techmate C18-ST、TechmateC18-STⅡ、Techmate CI8 UG中的任一种或其组合。
7.根据权利要求1所述的高效液相色谱法，所述色谱柱的柱温为5℃-40℃，优选为10℃-35℃，更优选为25-30℃。
8.根据权利要求1所述的高效液相色谱法，所述有关物质选自有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8、有关物质9、有关物质10和有关物质11中的任一种或其组合
9.根据权利要求1-8中任一项所述的高效液相色谱法在用于高效分离并检测玛巴洛沙韦中有关物质中的应用。
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