CN117607315A - 一种分离并检测异甘草酸镁及其有关物质的高效液相色谱法及其应用 - Google Patents
一种分离并检测异甘草酸镁及其有关物质的高效液相色谱法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种分离并检测异甘草酸镁及其有关物质的高效液相色谱法及其应用。其中色谱柱固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为磷酸氢二钾溶液‑乙腈，所述有关物质选自有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8和有关物质9中的任一种或其组合。本发明的方法能实现异甘草酸镁及其有关物质的高效分离与检测，能有效控制药品质量。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种分离并检测异甘草酸镁及其有关物质的高效液相色谱法及其应用。
背景技术
异甘草酸镁是一种肝细胞保护剂，具有抗炎、保护肝细胞膜及改善肝功能的作用。目前异甘草酸镁在临床上用于治疗慢性病毒性肝炎和急性药物性肝损伤。其化学名称为(18α,20β)-20-羧基-11-氧代-30-去甲齐墩果-12-烯-3β-基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-α-D-吡喃葡萄糖苷醛酸镁四水合物，化学结构如下：
有关物质的存在直接关系到药品的质量和安全性。有关物质包括药物原料带入的杂质、过程中产生的有关物质以及降解相关的有关物质等，其会直接影响药物的纯度和质量，甚至会造成严重的不良反应，影响临床用药的有效性、安全性。为了提升异甘草酸镁的产品质量并保障临床用药安全有效，需充分研究其有关物质情况并开发适用的分离检测方法，将杂质控制在安全限度范围以内，实现药品质量可控，保障临床用药的安全有效。
发明内容
本发明一方面的目的在于提供一种分离并检测异甘草酸镁原料药或制剂中异甘草酸镁及其有关物质的高效液相色谱法，其中，色谱柱固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，色谱柱柱温为20℃-40℃，流动相为磷酸氢二钾溶液-乙腈，流动相流速为0.8ml/min-1.2ml/min，进样体积为10μl-30μl，所述高效液相色谱法配紫外检测器，所述紫外检测器的检测波长为240nm-260nm，所述有关物质选自有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8和有关物质9中的任一种或其组合：
本发明优选的技术方案中，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为商购获得，优选为ThermoFisher、YMC、Phenomenex、ES、Merck、Agilent、Kromasil、Agela、Techmate、Waters或中谱红的任一公司生产的十八烷基硅烷键合硅胶柱。
本发明优选的技术方案中，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱选自Eclipse PlusC18、Kromasil 100-5-C18、Kromasil Eternity-5-C18、Kromasil EternityXT-10-C18、Kromasil 100-10-C18、Kromasil 300-5-C18、YMC Pack ODS-AQ C18、YMC Pack ODS-AMC18、YMC Triart C18、Phenomenex kinetex C18、Titank C18、ES-C18、Epic C18、ZORBAXSB-C18、ZORBAX 300SB-C18、Poroshell 120 EC-C18、XDB-C18、TC-C18、Extend-C18、Bonshell C18、Bonshell ASB C18、Venusil HLP C18、Venusil C18 Plus、Venusil XBPC18(A)、Venusil XBP C18(B)、Venusil MP C18、Innoval Neo XD C18、Techmate C18-ST、Techmate C18-STⅡ、Techmate CI8 UG、中谱红AQ-C18中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱优选为YMC PackODS-AQ C18 4.6×250mm，3μm。
本发明优选的技术方案中，所述色谱柱的柱温为25℃-35℃，优选为28℃-32℃，更优选为30℃。
本发明优选的技术方案中，所述流动相中磷酸氢二钾溶液与乙腈的体积比为60-90：40-10，优选为60-80：40-20，更优选为65-75：35-25，再优选为69-71：31-29。
本发明优选的技术方案中，所述流动相中磷酸氢二钾溶液的pH为6.0-8.0，优选pH为6.5-7.5，更优选pH为6.8-7.2，再优选为7.0。
本发明优选的技术方案中，所述流动相中磷酸氢二钾溶液用pH调节剂调节pH，所述pH调节剂选自甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸的任一种或其组合，优选为磷酸。
本发明优选的技术方案中，所述流动相中磷酸氢二钾溶液的浓度为0.01M-0.1M，优选为0.03M-0.08M，更优选为0.048M-0.052M。
本发明优选的技术方案中，所述流动相中磷酸氢二钾溶液的浓度为0.05M，并且其用磷酸调节pH为7.0。
本发明优选的技术方案中，所述流动相的流速为0.9ml/min-1.1ml/min，优选为1.0ml/min。
本发明优选的技术方案中，所述流动相为等度洗脱或梯度洗脱，优选为等度洗脱。
本发明优选的技术方案中，所述进样体积为15μl-25μl，优选为18μl-22μl。
本发明优选的技术方案中，所述紫外检测器检测波长为245nm-255nm，优选为250nm。
本发明的优选技术方案中，出峰顺序依次为有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、异甘草酸镁、有关物质6、有关物质7、有关物质8、有关物质9，其中，异甘草酸镁峰与有关物质5峰、有关物质6峰之间以及各有关物质峰之间的分离度均大于1.5。
本发明的优选技术方案中，所述高效液相色谱法包括下述步骤：
1)溶液配制：
供试品溶液：取异甘草酸镁适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg的溶液；
混合溶液：分别取异甘草酸镁、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8、有关物质9各适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg与分别含有关物质1～有关物质9各约1-10μg的混合溶液；
2)以色谱柱YMC Pack ODS-AQ C18 4.6×250mm，3μm为固定相，柱温为28℃-32℃，流动相为磷酸氢二钾溶液-乙腈，所述磷酸氢二钾溶液的浓度为0.048M-0.052M，所述磷酸氢二钾溶液用磷酸调pH值至6.8-7.2，所述磷酸氢二钾溶液与乙腈的体积比为69-71：31-29，将洗脱样品注入液相色谱仪，进样量为20μl；紫外检测器检测波长为250nm；流速为每分钟0.9ml-1.1ml，洗脱并记录色谱图。
本发明的另一目的在于提供本发明所述的分离检测异甘草酸镁及其有关物质的高效液相色谱法在用于高效分离并检测异甘草酸镁原料药或制剂中异甘草酸镁及其有关物质中的应用。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
(1)本发明科学筛选优化了高效液相色谱法的洗脱条件，实现了对异甘草酸镁及其有关物质等10种结构近似、难以分离的化合物的有效分离与检测，分离效果良好，可以有效进行药品质量控制，减少药物临床试验中和治疗中可能出现的不良反应，保证了患者用药的有效性、安全性。
(2)本发明方法耗时短，可节约时间成本，提高经济效益，适宜工业化、规模化生产。本发明的流动相容易配制，按照常规方法配制即可。
(3)本发明方法专属性强，各有关物质与空白溶剂不互相干扰，各成分峰之间的分离度均大于1.5；本发明色谱条件检测有关物质灵敏度高；色谱条件微小变化时，不影响各成分峰分离，该方法的耐用性良好。
附图说明
图1为实施例1的高效液相色谱图。
图2为实施例2的高效液相色谱图。
图3为实施例3的高效液相色谱图。
图4为实施例4的高效液相色谱图。
图5为实施例5的高效液相色谱图。
图6为实施例6的高效液相色谱图。
图7为实施例7的高效液相色谱图。
图8为实施例8的高效液相色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
实施例1异甘草酸镁及其有关物质的HPLC分离检测
液相色谱仪：岛津公司LC-20A
色谱柱：GL Inertsil ODS-3，4.6mm×250mm，5μm
柱温：30℃
流动相：乙腈-冰醋酸-水(38:1:61)
流速：1ml/min
紫外检测器检测波长：250nm
进样体积：20μl
混合溶液：分别取异甘草酸镁、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8和有关物质9各适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg与分别含有关物质1～有关物质9各约1-10μg的混合溶液。
混合溶液色谱结果见图1。
结果显示：多个化合物未出峰，不能实现有效分离，无法控制产品质量。
实施例2异甘草酸镁及其有关物质的HPLC分离检测
液相色谱仪：岛津公司LC-20A
色谱柱：Waters Xbridge C18 4.6×250mm，5μm
柱温：30℃
流动相：0.1M磷酸氢二钾溶液(用磷酸调pH值至7.0)-乙腈(80:20)
流速：1ml/min
紫外检测器检测波长：250nm
进样体积：20μl
混合溶液：分别取异甘草酸镁、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8和有关物质9各适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg与分别含有关物质1～有关物质9各约1-10μg的混合溶液。
混合溶液色谱结果见图2。
结果显示：多个化合物未出峰，不能实现有效分离，无法控制产品质量。
实施例3异甘草酸镁及其有关物质的HPLC分离检测
液相色谱仪：岛津公司LC-20A
色谱柱：Agilent ZOBAX Eclipse C18 4.6×250mm，5μm
柱温：30℃
流动相：0.1M磷酸氢二钾溶液(用磷酸调pH值至7.0)-乙腈(80:20)
流速：1ml/min
紫外检测器检测波长：250nm
进样体积：20μl
混合溶液：分别取异甘草酸镁、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8和有关物质9各适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg与分别含有关物质1～有关物质9各约1-10μg的混合溶液。
混合溶液色谱结果见图3。
结果显示：多个化合物未出峰，不能实现有效分离，无法控制产品质量。
实施例4异甘草酸镁及其有关物质的HPLC分离检测
液相色谱仪：岛津公司LC-20A
色谱柱：YMC Pack ODS-AQ 4.6×250mm，3μm
柱温：30℃
流动相：0.1M磷酸氢二钾溶液(用磷酸调pH值至7.0)-乙腈(80:20)
流速：1ml/min
紫外检测器检测波长：250nm
进样体积：20μl
混合溶液：分别取异甘草酸镁、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8和有关物质9各适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg与分别含有关物质1～有关物质9各约1-10μg的混合溶液。
混合溶液色谱结果见图4。
结果显示：化合物分离情况有所改善，但仍不能实现有效分离，无法控制产品质量。
实施例5异甘草酸镁及其有关物质的HPLC分离检测
液相色谱仪：岛津公司LC-20A
色谱柱：YMC Pack ODS-AQ 4.6×250mm，3μm
柱温：30℃
流动相：0.05M磷酸氢二钾溶液(用磷酸调pH值至7.0)-乙腈(90:10)
流速：1ml/min
紫外检测器检测波长：250nm
进样体积：20μl
混合溶液：分别取异甘草酸镁、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8和有关物质9各适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg与分别含有关物质1～有关物质9各约1-10μg的混合溶液。
混合溶液色谱结果见图5。
结果显示：分离情况有所改善，但仍有杂质未出峰，不能实现有效分离。
实施例6异甘草酸镁及其有关物质的HPLC分离检测
液相色谱仪：岛津公司LC-20A
色谱柱：YMC Pack ODS-AQ 4.6×250mm，3μm
柱温：30℃
流动相：0.05M磷酸氢二钾溶液(用磷酸调pH值至7.0)-乙腈(60：40)
流速：1ml/min
紫外检测器检测波长：250nm
进样体积：20μl
混合溶液：分别取异甘草酸镁、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8和有关物质9各适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg与分别含有关物质1～有关物质9各约1-10μg的混合溶液。
混合溶液色谱结果见图6。
结果显示：该体系不能实现主成分和多个杂质化合物的有效分离，无法控制产品质量。
实施例7异甘草酸镁及其有关物质的HPLC分离检测
液相色谱仪：岛津公司LC-20A
色谱柱：YMC Pack ODS-AQ 4.6×250mm，3μm
柱温：30℃
流动相：0.05M磷酸氢二钾溶液(用磷酸调pH值至7.0)-乙腈(70：30)
流速：1ml/min
紫外检测器检测波长：250nm
进样体积20μl
混合溶液：分别取异甘草酸镁、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8和有关物质9各适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg与分别含有关物质1～有关物质9各约1-10μg的混合溶液。
混合溶液色谱结果见图7。
结果显示：异甘草酸镁与相邻杂质之间，以及各杂质化合物之间均能实现较好分离。
实施例8本发明HPLC分离检测方法的专属性
液相色谱仪：岛津公司LC-20A
色谱柱：YMC Pack ODS-AQ 4.6×250mm，3μm
柱温：30℃
流动相：0.05M磷酸氢二钾溶液(用磷酸调pH值至7.0)-乙腈(70:30)
流速：1ml/min
紫外检测器检测波长：250nm
进样体积20μl
溶剂：0.05M磷酸氢二钾溶液(用磷酸调pH值至7.0)-乙腈(70:30)；
定位溶液：分别取异甘草酸镁、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8和有关物质9各适量，分别用溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含10-100μg的溶液；
混合溶液：分别取异甘草酸镁、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8和有关物质9各适量，用溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg与分别含有关物质1～有关物质9各约1-10μg的混合溶液；
混合溶液色谱结果见下表1和图8。
表1
结果表明：该方法下各杂质峰之间以及主成分与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，且方法专属性良好。
实施例9本发明HPLC分离检测方法的灵敏度
色谱条件同实施例8。
溶液配制方法：分别取异甘草酸镁、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8、有关物质9各适量，用溶剂逐级稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁与有关物质1～有关物质9各约0.5μg的混合溶液，作为定量限溶液(要求各成分主峰的信噪比不小于10)，取定量限溶液用溶剂稀释3倍作为检测限溶液(要求各成分主峰的信噪比不小于3)。
检测限和定量限结果分别见下表2和表3。
表2
表3
结果表明：用本发明的方法检测异甘草酸镁及各有关物质，灵敏度高，在各化合物低至ng级别即可完成定量检测。
实施例10本发明HPLC分离检测方法的耐用性
色谱条件同实施例8。
溶剂：0.05M磷酸氢二钾溶液(用磷酸调pH值至7.0)-乙腈(70:30)；
混合溶液：分别取异甘草酸镁、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8、有关物质9各适量，用溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg与分别含有关物质1～有关物质9各约1-10μg的混合溶液。
分离度结果见下表4。
表4
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结果表明：对本发明实施例8的色谱条件做部分调整后，各成分分离度均仍符合要求，本发明方法的耐用性良好。
虽然本发明所揭露的实施例如上，但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
Claims (10)
1.一种分离并检测异甘草酸镁原料药或制剂中异甘草酸镁及其有关物质的高效液相色谱法，其中，色谱柱固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，色谱柱柱温为20℃-40℃，流动相为磷酸氢二钾溶液-乙腈，流动相流速为0.8ml/min-1.2ml/min，进样体积为10μl-30μl，所述高效液相色谱法配紫外检测器，所述紫外检测器的检测波长为240nm-260nm，所述有关物质选自有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8和有关物质9中的任一种或其组合：
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为商购获得，优选为ThermoFisher、YMC、Phenomenex、ES、Merck、Agilent、Kromasil、Agela、Techmate、Waters或中谱红的任一公司生产的十八烷基硅烷键合硅胶柱。
3.根据权利要求1-2任一项所述的高效液相色谱法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱选自Eclipse Plus C18、Kromasil 100-5-C18、Kromasil Eternity-5-C18、Kromasil EternityXT-10-C18、Kromasil 100-10-C18、Kromasil 300-5-C18、YMC PackODS-AQ C18、YMC Pack ODS-AM C18、YMC Triart C18、Phenomenex kinetex C18、TitankC18、ES-C18、Epic C18、ZORBAX SB-C18、ZORBAX 300SB-C18、Poroshell 120EC-C18、XDB-C18、TC-C18、Extend-C18、Bonshell C18、Bonshell ASB C18、Venusil HLP C18、VenusilC18 Plus、Venusil XBP C18(A)、Venusil XBP C18(B)、Venusil MP C18、Innoval Neo XDC18、Techmate C18-ST、Techmate C18-STⅡ、Techmate CI8 UG、中谱红AQ-C18中的任一种或其组合。
4.根据权利要求3所述的高效液相色谱法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为YMC Pack ODS-AQ C18 4.6×250mm，3μm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的高效液相色谱法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为25℃-35℃，优选为28℃-32℃，更优选为30℃，所述流动相中磷酸氢二钾溶液与乙腈的体积比为60-90：40-10，优选为60-80：40-20，更优选为65-75：35-25，再优选为69-71：31-29，所述流动相中磷酸氢二钾溶液的pH为6.0-8.0，优选pH为6.5-7.5，更优选pH为6.8-7.2，再优选为7.0，所述流动相中磷酸氢二钾溶液用pH调节剂调节pH，所述pH调节剂选自甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸的任一种或其组合，优选为磷酸，所述流动相中磷酸氢二钾溶液的浓度为0.01M-0.1M，优选为0.03M-0.08M，更优选为0.048M-0.052M。
6.根据权利要求1-5任一项所述的高效液相色谱法，其特征在于，所述流动相中磷酸氢二钾溶液的浓度为0.05M，并且其用磷酸调节pH为7.0。
7.根据权利要求1-6任一项所述的高效液相色谱法，其特征在于，所述流动相的流速为0.9ml/min-1.1ml/min，优选为1.0ml/min，所述流动相为等度洗脱或梯度洗脱，优选为等度洗脱，所述进样体积为15μl-25μl，优选为18μl-22μl，所述紫外检测器检测波长为245nm-255nm，优选为250nm。
8.根据权利要求1-7任一项所述的高效液相色谱法，其特征在于，出峰顺序依次为有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、异甘草酸镁、有关物质6、有关物质7、有关物质8、有关物质9，其中，异甘草酸镁峰与有关物质5峰、有关物质6峰之间以及各有关物质峰之间的分离度均大于1.5。
9.根据权利要求1-8任一项所述的高效液相色谱法，其特征在于，所述高效液相色谱法包括下述步骤：
1)溶液配制：
供试品溶液：取异甘草酸镁适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg的溶液；
混合溶液：分别取异甘草酸镁、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8、有关物质9各适量，用溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg与分别含有关物质1～有关物质9各约1-10μg的混合溶液；
2)以色谱柱YMC Pack ODS-AQ C18 4.6×250mm，3μm为固定相，柱温为28℃-32℃，
流动相为磷酸氢二钾溶液-乙腈，所述磷酸氢二钾溶液的浓度为0.048M-0.052M，所述磷酸氢二钾溶液用磷酸调pH值至6.8-7.2，所述磷酸氢二钾溶液与乙腈的体积比为69-71：31-29，将洗脱样品注入液相色谱仪，进样量为20μl；紫外检测器检测波长为250nm；流速为每分钟0.9ml-1.1ml，洗脱并记录色谱图。
10.根据权利要求1-9任一项所述的高效液相色谱法在用于高效分离并检测异甘草酸镁原料药或制剂中异甘草酸镁及其有关物质中的应用。
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