CN107102083B

CN107102083B - 一种phba工艺杂质检测方法

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Publication number: CN107102083B
Application number: CN201710332153.XA
Authority: CN
Inventors: 袁伟成; 葛真真; 周鸣强; 徐小英; 刘斌
Original assignee: Chengdu Likai Chiral Tech Co ltd
Current assignee: Chengdu Likai Chiral Tech Co ltd
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2037-05-12
Also published as: CN107102083A

Abstract

本发明公开了一种PHBA工艺杂质检测方法，采用正相高效液相色谱法，其中色谱条件如下：色谱柱C18柱或C8柱；流动相组成水相：乙腈=70:30‑40:60；流动相流速：0.7‑1.0mL/min；检测波长：220‑280 nm；柱温：20‑40℃；检测器：紫外线检测器或二级管阵列检测器；本发明实现了PHBA与其工艺杂质A和工艺杂质B的分离，具有很高的灵敏度和专属性，操作简便，分离度大于1.50，符合药典规定，可用于PHBA的质量控制，而且出峰时间在10 min以内，检测方法快速高效，具有很好的工业实用性。

Description

一种PHBA工艺杂质检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种PHBA工艺杂质检测方法。

背景技术

PHBA，即(S)-α-羟基-γ-N-邻苯二甲酰亚氨基丁酸，是作为合成药物阿米卡星的重要中间体。阿米卡星俗称丁胺卡那霉素、阿米卡霉素，是第三代半合成氨基糖苷类抗生素，对大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、志贺菌属、沙门菌属、铜绿假单胞菌及其他假单胞菌、不动杆菌属、产碱杆菌属等具有较强的药理作用；对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、耶尔森菌属、胎儿弯曲菌、结核杆菌及某些非结核分枝杆菌属等据有较强的药理作用。阿米卡星又具有低耳毒性、低肾毒性等优势，在氨基糖苷类抗生素中所占的份额已由1999年5％上升到现在的12％，无论是非典型肺炎的治疗还是禽流感的预防，阿米卡星都起到了重要作用，是我国临床广泛应用的抗生素之一。

PHBA的结构式为：

在其生产过程中，一般主要含有两种杂质，即下述的杂质A和杂质B：

杂质A：邻苯二甲酸

结构式：

杂质B：邻苯二甲酰亚胺

结构式：

任何影响药物纯度的物质统称为杂质。杂质的研究是药物研发中十分重要的一个环节。它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定杂质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定杂质的合理限度。这一研究贯穿于药品研发的整个过程。由于药品在临床使用中产生的不良反应除了与药品本身的药理活性有关外，有时与药品中存在的杂质也有很大关系。

随着科学的进步，以及人们对物质的了解程度日益增加，对事物的要求也越来越高。因此，目前药物研发中增加了一个主要的关注点：原辅料的质量情况，尤其是药物生产时所用到的关键物料的质量是重中之重。目前，国外许多药物官方注册程序中都要求提供关键物料的杂质研究资料，并要求将杂质限度列入关键物料质量标准中。PHBA作为阿米卡星的关键物料，关于其杂质的研究有助于控制和了解后期原料药的质量。

从目前公开的技术文献来看，对PHBA的分析方法主要是针对PHBA本身进行定性或者定量分析。但对PHBA相关工艺杂质的分离分析尚未有报道。从现有PHBA的合成路线可以看出，上述杂质A和杂质B是必然会存在的杂质。因此，为了加强对产品质量的控制，有必要建立一种检测方法，针对PHBA每一步生产过程，以及最终产品中杂质含量进行分析。

《中国药典》规定，杂质与主要成分之间，以及杂质与杂质之间分离度(R) 应大于1.5。分离度(R)为相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值，也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。分离度计算公式：R＝ 2(t_R2-t_R1)/(W₁+W₂)。R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当R＜1时，两峰有部分重叠；当R＝1.0时，分离度可达98％；当R＝1.5时，分离度可达99.7％。通常用R＝1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。当R ＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4％，内侧峰基重叠约2％。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7％。R≥1.5称为完全分离。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种PHBA工艺杂质检测方法，以解决上述问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种PHBA工艺杂质检测方法，采用正相高效液相色谱法，其中色谱条件如下：

色谱柱C18柱或C8柱；通过实验证明，C18柱、C8柱在同样条件下均能实现很好的分离效果；

流动相组成水相：乙腈＝70:30-40:60(v/v)；

流动相流速：0.7-1.0mL/min；

检测波长：220-280nm；

柱温：20-40℃；

检测器：紫外线检测器(VWD)或二级管阵列检测器(DAD)。

作为优选的技术方案：所述流动相的水相中还含有三氟醋酸。

作为优选的技术方案：所述流动相流速为0.8mL/min。

作为优选的技术方案：所述检测波长为280nm。

作为优选的技术方案：所述柱温为30℃。

作为优选的技术方案：供试品溶液浓度为0.2-1.0mg/mL。

作为进一步优选的技术方案：所述供试品溶液浓度为0.5mg/mL。

作为优选的技术方案：单针进样量为5-40μL。

作为进一步优选的技术方案：所述单针进样量为20μL。

作为优选的技术方案：所述色谱柱为Phenomenex-C18GEMINI 110A，优选规格为5μm x 4.6mm x 25cm。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供的一种PHBA检测方法，实现了PHBA与其工艺杂质A和工艺杂质B的分离，具有很高的灵敏度和专属性，操作简便，分离度大于1.50，符合药典规定，可用于PHBA的质量控制，而且出峰时间在10min以内，检测方法快速高效，具有很好的工业实用性。

附图说明

图1是实施例2中液相色谱图；

图2是实施例3中液相色谱图；

图3是实施例4中液相色谱图；

图4是实施例5中液相色谱图；

图5是实施例6中液相色谱图；

图6是实施例7中液相色谱图；

图7是实施例8中液相色谱图；

图8是实施例9中液相色谱图；

图9是实施例12中杂质A的线性回归图；

图10是实施例12中杂质B的线性回归图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进一步的详细描述。

为了使本发明的目的、方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

溶剂的选择及溶液浓度的选择

溶解样品的溶剂选择，我们分别用乙腈、流动相溶解样品，都可以溶解，为了减少溶剂峰的出现，我们使用流动相溶解样品。

实施例2

仪器与检测条件

美国Agilent 1200高效液相色谱仪，自动进样器；Phenomenex C18柱 (4.6×250mm,5μm)；流动相为水相(纯水)：乙腈＝50：50(V/V)；进样量为 20μl；检测波长为280nm；流速为0.8ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取PHBA及其杂质适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml含有PHBA 0.5 mg、0.5mg杂质A和0.5mg杂质B的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图1。

图1表明PHBA、杂质A和杂质B合为一个峰，未能达到分离。

实施例3

仪器与检测条件

美国Agilent 1200高效液相色谱仪，自动进样器；Phenomenex C18柱 (4.6×250mm,5μm)；流动相为水相(0.1％三氟醋酸-水:)：乙腈＝50：50(V/V)；进样量为20μl；检测波长为280nm；流速为0.8ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取PHBA及其杂质适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml含有PHBA 0.5 mg、0.5mg杂质A和0.5mg杂质B的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图2。

图2表明PHBA与杂质A分离度小于1.5，PHBA与杂质B分离度符合药典规定。

实施例4

仪器与检测条件

美国Agilent 1200高效液相色谱仪，自动进样器；Phenomenex C18柱 (4.6×250mm,5μm)；流动相为水相(纯水)：乙腈＝60：40(V/V)；进样量为20μl；检测波长为280nm；流速为0.8ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取PHBA及其杂质适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml含有PHBA 0.5 mg、0.5mg杂质A和0.5mg杂质B的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图3。

图3表明PHBA、杂质A和杂质B分离度均符合药典规定。

实施例5

仪器与检测条件

美国Agilent 1200高效液相色谱仪，自动进样器；Phenomenex C18柱(4.6×250mm,5μm)；流动相为水相(纯水)：乙腈＝70：30(V/V)；进样量为 20μl；检测波长为280nm；流速为0.8ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取PHBA及其杂质适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml含有PHBA 0.5 mg、0.5mg杂质A和0.5mg杂质B的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图4。

图4表明PHBA、杂质A和杂质B分离度均符合药典规定。

实施例6

仪器与检测条件

美国Agilent 1200高效液相色谱仪，自动进样器；Phenomenex C18柱 (4.6×250mm,5μm)；流动相为水相(纯水)：乙腈＝70：30(V/V)；进样量为 20μl；检测波长为254nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取PHBA及其杂质适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml含有PHBA 0.5mg、 0.5mg杂质A和0.5mg杂质B的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图5。

图5表明PHBA、杂质A和杂质B分离度均符合药典规定。

实施例7

仪器与检测条件

美国Agilent 1200高效液相色谱仪，自动进样器；Phenomenex C18柱 (4.6×250mm,5μm)；流动相为水相(纯水)：乙腈＝60：40(V/V)；进样量为20μl；检测波长为220nm；流速为0.6ml/min；柱温为40℃。

实验步骤

取PHBA及其杂质适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml含有PHBA 0.5 mg、0.5mg杂质A和0.5mg杂质B的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图6。

图6表明PHBA、杂质A和杂质B分离度均符合药典规定。但是在220nm 处，样品吸收较强，影响分离度和峰形。

实施例8

仪器与检测条件

美国Agilent 1200高效液相色谱仪，自动进样器；Phenomenex C8柱 (4.6×250mm,5μm)；流动相为水相(纯水)：乙腈＝70：30(V/V)；进样量为20μl；检测波长为280nm；流速为0.8ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取PHBA及其杂质适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml含有PHBA 0.5 mg、0.5mg杂质A和0.5mg杂质B的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图7。

图7表明PHBA、杂质A和杂质B分离度均符合药典规定。

实施例9

仪器与检测条件

美国Agilent 1200高效液相色谱仪，自动进样器；Phenomenex C18柱 (4.6×250mm,5μm)；流动相为水相(纯水)：乙腈＝40：60(V/V)；进样量为20μl；检测波长为280nm；流速为0.8ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取PHBA及其杂质适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml含有PHBA 0.5 mg、0.5mg杂质A和0.5mg杂质B的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图8。

图8表明PHBA与杂质A分离度小于1.5，PHBA与杂质B分离度符合药典规定。

实施例10

系统适用性试验

根据实施例5条件进行系统适用性试验：

称取PHBA样品25mg、杂质A 25mg、杂质B 25mg于50ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀作为系统适用性溶液。

试验方法：将系统适用性溶液连续进6针，记录色谱图。结果见表1。

表1系统适用性试验结果

实施例11

专属性

根据实施例5条件进行专属性试验：

称取PHBA样品25mg于50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。称取PHBA标准品25mg、杂质A对照品5mg、杂质B对照品5mg，分别置于3个50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，分别作为PHBA、杂质A、杂质B对照品溶液。

将供试品溶液和3个对照品溶液分别注入液相色谱仪进行分析。试验结果显示，杂质A、杂质B与PHBA具有较好的分离度，分别为6.45和4.62，之间互不干扰，也无其他杂质干扰。证明本发明分离度好，无其他干扰，具有较好的专属性。

实施例12

线性与范围

根据实施例5条件进行线性与范围试验：

称取适量PHBA、杂质A和杂质B于50ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，配置成每mL含有PHBA 0.1mg，杂质A 5μg，杂质B 5μg的线性贮备液。精密量取线性贮备液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL分别置于10mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试液。

将供试液注入液相色谱仪进行分析。分别以两个杂质峰面积作为纵坐标，分别以两个杂质的浓度作为横坐标(μg/mL)进行线性回归。杂质A的线性回归方程：y＝8.419x-0.0615，结果见图9，由图9可知，图中趋势线的相关系数 R²＝0.9999，可见在该色谱条件下，PHBA的杂质A在0.5-3.0μg的浓度范围线性关系良好。杂质B的线性回归方程：y＝24.548x+0.0466，结果见图10，由图10可知，图中趋势线的相关系数R²＝0.9998，可见在该色谱条件下，PHBA 的杂质B在0.5-3.0μg的浓度范围线性关系良好。

实施例13

准确度试验

根据实施例5条件进行PHBA准确度(回收率)试验：

精密称取PHBA标准品25mg于50ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，配制成每mL含有PHBA标准品0.5mg的标准品溶液。精密称取PHBA 样品20mg、25mg、30mg分别置于不同的50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，配制成每mL含有PHBA样品0.4mg、0.5mg、0.6mg的准确度供试品溶液。

将标准品溶液和供试液注入液相色谱仪进行分析。

以外标法计算供试品溶液中PHBA的测得量，以此除以PHBA样品称样量，即得回收率，计算公式如下：

样品测定量的计算：

上式中：

M₁为供试品的测定量，g；

A_U为供试品的峰面积；

A_S为标准品的峰面积；

M_S为标准品的称样量，％；

回收率计算：

上式中：

M₁为供试品的测定量，g；

M₂为供试品的称样量，g；

试验结果显示，本发明检测方法，平均回收率均大于99％，说明本发明的方法准确度好。

实施例14

检测限与定量限

根据实施例5条件进行杂质的检测限与定量限试验：

取实施例11项下最低浓度的溶液，杂质A为0.5μg/mL，杂质B为0.5 μg/mL。用流动相稀释至基线噪音：杂质峰高＝1：10，作为定量限溶液，基线噪音：杂质峰高＝1:3，作为检测限溶液。将定量限溶液与检测线溶液分别注入液相色谱仪进行分析。经计算，杂质A定量限：0.51ng，检测限：0.17ng；杂质B定量限：0.11ng，检测限：0.04ng。

综上所述，本发明通过选定特定高效液相色谱检测条件，达到了精确检测 PHBA含量及其杂质含量的效果。并且，本法重复性好，专属性强，准确度高，检出限低，可用于PHBA生产过程及最终产品的质量控制，进一步保证了下游药物安全性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种同时检测PHBA及其工艺杂质的方法，其特征在于：采用反相高效液相色谱法，其中色谱条件如下：

色谱柱为 Phenomenex -C18柱或Phenomenex C8柱，规格为5μm× 4 .6 mm× 25 cm；

流动相组成水相：乙腈=70:30-40:60，V/V；

流动相流速：0 .8 mL/min；

检测波长：280 nm；

柱温：30 ℃；

检测器：紫外线检测器或二级管阵列检测器；

所述PHBA为(S)-α-羟基-γ-N-邻苯二甲酰亚氨基丁酸；

所述PHBA工艺杂质为杂质A：邻苯二甲酸和杂质B：邻苯二甲酰亚胺。

2.根据权利要求1所述的同时检测PHBA及其工艺杂质的方法，其特征在于：所述流动相的水相中还含有三氟醋酸。

3.根据权利要求1所述的同时检测PHBA及其工艺杂质的方法，其特征在于：供试品溶液浓度为0 .2-1 .0 mg/mL。

4.根据权利要求3所述的同时检测PHBA及其工艺杂质的方法，其特征在于：所述供试品溶液浓度为 0 .5 mg/mL。

5.根据权利要求1所述的同时检测PHBA及其工艺杂质的方法，其特征在于：单针进样量为 5-40μL。

6.根据权利要求5所述的同时检测PHBA及其工艺杂质的方法，其特征在于：所述单针进样量为 20μL。