DE69433090T2

DE69433090T2 - Conotoxine, die an den acetylcholinrezeptor anbinden

Info

Publication number: DE69433090T2
Application number: DE69433090T
Authority: DE
Inventors: Baldomero M. Olivera; Jean E.F. Rivier; Lourdes J. Cruz; Fe Abogadie; Chris E. Hopkins; John Dykert; Josep L. Torres
Original assignee: University of Utah Research Foundation UURF; Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: University of Utah Research Foundation UURF; Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1993-06-29
Filing date: 1994-06-27
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2014-06-28
Also published as: EP0706566B1; CA2165566A1; ATE286128T1; DE69433090D1; DE69434217D1; US5700778A; EP0706566A1; EP1336617A2; WO1995001436A1; AU678837B2; AU7115894A; DE69434217T2; EP1336617B1; ATE248222T1; US5432155A; EP1336617A3; CA2165566C; USRE39240E1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft relativ kurze Peptide und insbesondere Peptide mit einer Länge zwischen etwa 16 und etwa 46 Resten, die in der Natur im Gift der Kegelschnecken in winzigen Mengen vorliegen und die eine oder mehrere cyclisierende Disulfidbindungen enthalten können.
Stand der Technik
Mollusken der Gattung Conus produzieren ein stark toxisches Gift, aufgrund dessen sie in der Lage sind, eine einzigartige räuberische Lebensweise zu haben. Die Beute wird durch das Gift bewegungsunfähig gemacht, indem dieses mit Hilfe eines hochspezialisierten Giftapparates injiziert wird, wobei es sich um einen einmal verwendbaren hohlen Zahn handelt, der sowohl als Harpune als auch als subkutane Nadel dient.
Wenige Wechselwirkungen zwischen Organismen sind radikaler als die zwischen einem giftigen Tier und seinem vergifteten Opfer. Das Gift kann als direkte Waffe eingesetzt werden, um eine Beute zu fangen, oder es kann als Verteidigungsmechanismus dienen. Diese Gifte unterbrechen in dem vergifteten Tier die Funktionen essentieller Organsysteme, wobei viele dieser Gifte Moleküle enthalten, die gegen die Rezeptoren und lonenkanäle von neuromuskulären Systemen gerichtet sind.
Die räuberischen Kegelschnecken (Conus) haben eine einzigartige biologische Strategie entwickelt. Ihr Gift enthält relativ kleine Peptide, die gegen verschiedene neuromuskuläre Rezeptoren gerichtet sind und in ihrer pharmakologischen Vielseitigkeit möglicherweise den Alkaloiden von Pflanzen oder sekundären Metaboliten von Mikroorganismen ebenbürtig sind. Viele dieser Peptide zählen zu den kleinsten, durch Nukleinsäuren codierten Translationsprodukten, die definierte Konformationen aufweisen, und sind als solche in gewisser Weise ungewöhnlich, da bei Peptiden in diesem Größenbereich normalerweise ein Gleichgewicht zwischen vielen Konformationen vorliegt, denn Proteine mit einer festgelegten Konformation sind im Allgemeinen viel größer.
Die Kegelschnecken, die diese toxischen Peptide produzieren, welche im Allgemeinen als Conotoxine oder Conotoxinpeptide bezeichnet werden, sind eine große Gattung von giftigen Gastropoden, die etwa 500 Arten umfasst. Alle Kegelschneckenarten sind Raubtiere, die Gift in eine Beute injizieren, um sie zu fangen, wobei das Spektrum der Tiere sehr groß ist, die durch die gesamte Gattung vergiftet werden können. Eine große Vielfalt von Jagdstrategien wird eingesetzt; wobei jedoch jede Kegelschneckenart im Wesentlichen das gleiche Grundmuster der Vergiftung nutzt.
Als erstes wurden die wichtigsten paralytischen Peptide in diesen Giften der Fische jagenden Kegelschnecken identifiziert und charakterisiert. Im Gift von C. geographus wurden drei Klassen von disulfidreichen Peptiden gefunden: die α-Conotoxine (die die nicotinischen Acetylcholin-Rezeptoren ansteuern und blockieren); die μ-Conotoxine (die die Na⁺-Kanäle der Skelettmuskeln ansteuern und blockieren); und die ω-Conotoxine (die die präsynaptischen neuronalen Ca²⁺-Kanäle ansteuern und blockieren). Jedoch gibt es in jeder Toxinklasse mehrere homologe Substanzen; z. B. liegen im Gift von C. geographus alleine mindestens fünf verschiedene ω-Conotoxine vor. In der Sequenz fallen deutliche Unterschiede auf, und als verschiedene ω-Conotoxinsequenzen erstmals miteinander verglichen wurden, zeigte sich, dass nur die Cysteinreste, die an der Disulfidbindung beteiligt sind, und ein Glycinrest unveränderlich sind. Eine weitere, im Gift von C. geographus gefundene Klasse von Conotoxinen ist die Gruppe, die als Conantokine bezeichnet wird, die bei jungen Mäusen Schlaf und bei älteren Mäusen eine Hyperaktivität auslösen, wobei sie gegen den NMDA-Rezeptor gerichtet sind. Jedes Conus-Gift scheint seine eigene charakteristische Gruppe oder Unterschrift aus verschiedenen Conotoxinsequenzen zu besitzen.
Viele dieser Peptide haben sich inzwischen in der neurowissenschaftlichen Forschung praktisch zu Standardmitteln entwickelt. Die μ-Conotoxine sind aufgrund ihrer Fähigkeit, vorzugsweise die muskulären und nicht die axonalen Na⁺-Kanäle zu blockieren, herkömmliche Mittel, um Skelettmuskeln zu immobilisieren, ohne axonale oder synaptische Ereignisse zu beeinflussen. Die ω-Conotoxine haben sich zu herkömmlichen pharmakologischen Mitteln entwickelt, mit denen spannungsempfindliche Ca²⁺-Kanäle erforscht werden können, und sie werden eingesetzt, um präsynaptische Termini und die Freisetzung von Neurotransmittern zu blockieren. Ein Beispiel hierfür ist das ω-Conotoxin GVIA aus dem Gift von C. geographus, das an neuronale spannungsempfindliche Ca²⁺-Kanäle bindet. Die Affinität (K_d) des ω-Conotoxins GVIA für seine hochaffinen Ziele liegt im sub-pikomolaren Bereich; es dauert mehr als sieben Stunden, bis 50% des Peptids dissoziiert sind. Somit kann das Peptid eingesetzt werden, um die synaptische Übertragung praktisch irreversibel zu blockieren, denn es hemmt präsynaptische Ca²⁺-Kanäle. Jedoch ist das ω-Conotoxin extrem gewebespezifisch. Im Gegensatz zu den herkömmlichen Ca²⁺-Kanal-blockierenden Arzneistoffen (z. B. den Dihydropyridinen, wie Nifedipen und Nitrendipen, die verbreitet bei Angina und Herzproblemen eingesetzt werden), die an Ca²⁺-Kanäle in glatten, Skelett- und Herzmuskeln und außerdem in neuronalem Gewebe binden können, binden die ω-Conotoxine im Allgemeinen nur an eine Untergruppe von neuronalen Ca²⁺-Kanälen, hauptsächlich des Subtyps N. Beim ω-Conotoxin liegt das Verhältnis, mit dem die Unterscheidung zwischen einer Bindung an spannungsempfindliche Ca²⁺-Kanäle in neuronalem Gewebe im Vergleich zu nicht-neuronalem Gewebe (z. B. Skelett- oder Herzmuskel) erfolgt, in vielen Fällen bei über 10⁸.
Es gibt weitere Conotoxinpeptide mit diesen allgemeinen Eigenschaften, die in Zukunft noch zu untersuchen sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Gruppe von bioaktiven Conotoxinpeptiden bereit, die extrem wirksame Inhibitoren der synaptischen Übertragung an der motorischen Endplatte sind und/oder die gegen spezifische lonenkanäle gerichtet sind. Sie können als Pestizide eingesetzt werden, und viele von ihnen oder nah verwandte Analoga davon sind gegen spezifische Insekten oder andere Schädlinge gerichtet. Deshalb kann es vorteilhaft sein, die DNA, die solche Conotoxinpeptide codiert, in Pflanzen als ein Pflanzenverteidigungs-Gen einzubauen, wodurch die Pflanzen gegen bestimmte Schädlinge resistent gemacht werden.
Diese Conotoxinpeptide haben die nachstehend angegebenen Formeln. Außerdem wird beim Analysieren der Formeln deutlich, dass zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Klassen noch zwei neue Klassen von Conotoxinpeptiden dargestellt sind. Klasse A umfasst die Peptide SEQ ID NO: 1 bis NO: 6; jedes Peptid weist sechs Cys-Reste auf, die durch drei Disulfidbindungen miteinander verbunden sind, wobei die zwei Cys-Reste, die dem N-Terminus am nächsten liegen, Teil der Sequenz -Cys-Cys-Gly- sind. Alle sechs Mitglieder weisen mindestens einen 4Hyp-Rest und einen C-Terminus auf, der amidiert vorliegt. Es liegen zwei Aminosäure(AA)-Reste vor, die den dritten und den vierten Cys-Rest, wie numeriert (vom N-Terminus aus), voneinander trennen, und ein einzelner AA-Rest hält den Abstand zwischen dem vierten und dem fünften Cys-Rest aufrecht. Außerdem ist in dieser Klasse der zweite Cys-Rest normalerweise vom dritten Cys-Rest durch entweder sechs oder sieben AA-Reste getrennt, wohingegen etwa drei bis etwa sechs AA-Reste vorliegen können, die den fünften und den sechsten Cys-Rest voneinander trennen. Ein Beispiel von Klasse B ist SEQ ID NO: 7, in der eine zentrale Sequenz von fünf AA-Resten mit zwei Paaren von Cys-Resten vorliegt, die einen zentralen Rest flankieren, der vorzugsweise Asn ist, und in der zwei weitere Paare von Cys-Resten mit einem bestimmten Abstand N-terminal bzw. C-teminal zu dieser zentralen Sequenz liegen. SEQ ID NO: 8 scheint ein Mitglied der bekannten Klasse von α-Conotoxinen zu sein. SEQ ID NO: 9 scheint ein Mitglied der bekannten Klasse der μ-Conotoxine zu sein. SEQ ID NO: 10 und NO: 11 sind möglicherweise Mitglieder der Klasse der ω-Conotoxine. SEQ ID NO: 12 scheint ein Mitglied der Klasse der Conantokine zu sein, die durch die N-terminale Sequenz Gly-Glu-Gla-Gla gekennzeichnet sind, und SEQ ID NO: 13 ist möglicherweise ein Mitglied einer bisher noch nicht charakterisierten Klasse, die ein träges Verhalten auslöst. Die einzelnen Formel dieser Conotoxine sind wie folgt:
wobei Xaa 4Hyp (4-Hydroxyprolin) ist und der C-Terminus amidiert ist;
wobei Glu in der Position 1 pGlu ist, Xaa 4Hyp ist und der C-Terminus amidiert ist; Ser in der Position 7 kann glykosyliert sein;
wobei Xaa 4Hyp ist und der C-Terminus amidiert ist;
wobei Xaa 4Hyp ist und der C-Terminus amidiert ist;
wobei Xaa 4Hyp ist und der C-Terminus amidiert ist;
wobei Xaa 4Hyp ist und der C-Terminus amidiert ist;
wobei Xaa 4Hyp ist; der C-Terminus kann gegebenenfalls amidiert sein;
wobei Xaa Gla ist und der C-Terminus amidiert ist;
wobei Xaa 4Hyp ist;
wobei Xaa Gla ist und der C-Terminus amidiert ist;

wobei Xaa Gla (γ-Carboxyglutamat) ist; und
wobei Glu in der Position 1 pGlu (Pyroglutaminsäure) ist und der C-Terminus amidiert sein kann; Thr kann glykosyliert sein.
Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung Conotoxinpeptide bereit, die die allgemeine Formel aufweisen: Xaa₁-Cys-Cys-Gly-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄-Cys-Xaa₅-Cys-Xaa₆-Cys-Xaa₇-NH₂ (SEQ ID NO: 14), wobei Xaa₁ des-Xaa₁ oder Gly oder pGlu-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Ser-Val-Ile-Thr-Thr ist; Xaa₂ Ser-Tyr-Pro-Asn-Ala-Ala oder Tyr-Asp-4Hyp-Gly-Thr-Met oder Val-4Hyp-Asn-Ala-Ala oder Ser-Tyr-4Hyp-Asn-Ala-Ala ist; Xaa₃ His, 4Hyp oder Pro ist; Xaa₄ Pro oder 4Hyp ist; Xaa₅ Ser, Arg oder Val ist; Xaa₆ Lys-Asp-Arg-4Hyp-Ser-Tyr oder Thr-Asn-Ser oder Asn-Lys-Thr oder Lys-Asn-Thr ist; und Xaa₇ des-Xaa₇ oder Gly oder Gly-Gln ist.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Conotoxinpeptide bereit, die sechs Cys-Reste aufweisen, die durch drei Disulfidbindungen miteinander verbunden sind, wobei die zwei Cys-Reste, die dem N-Terminus am nächsten liegen, Teil der Sequenz Cys-Cys-Gly sind und wobei der Abstand zwischen dem dritten, dem vierten und dem fünften Rest aus zwei Resten bzw. einem Rest besteht, wobei die zwei Reste aus His, Pro und 4Hyp ausgewählt sind, der einzelne Rest Ser, Arg oder Val darstellt, und der C-Terminus amidiert ist, wobei dieses Conotoxin an den Acetylcholin-Rezeptor bindet.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Conotoxinpeptide bereit, die acht Cys-Reste aufweisen, die durch vier Disulfidbindungen miteinander verbunden sind, wobei die zentralen vier Cys-Reste Teil der Sequenz Cys-Cys-Asn-Cys-Cys (SEQ ID NO: 15) sind, wobei das Conotoxin eine sofortige Lähmung bewirkt, wenn es an Labormäuse interkranial verabreicht wird.
Diese Peptide, die allgemein Conotoxine genannt werden, sind klein genug, um chemisch synthetisiert werden zu können. Nachstehend. werden allgemeine chemische Synthesen zum Herstellen der vorstehenden Conotoxine zusammen mit den spezifischen chemischen Synthesen mehrerer Conotoxine und den Indikationen von biologischen Aktivitäten dieser synthetischen Produkte beschrieben. Verschiedene dieser Conotoxine können auch erhalten werden, indem sie aus spezifischen Conus-Arten isoliert und gereinigt werden, wobei das im US-Patent Nr. 4 447 356 (8. Mai 1984) beschriebene Verfahren eingesetzt wird.
Viele dieser Conotoxinpeptide sind extrem wirksame Inhibitoren der synaptischen Übertragung an der motorischen Endplatte, während gleichzeitig weder eine Hemmung der Nerven-Aktionspotentialausbreitung noch der Muskel-Aktionspotentialausbreitung nachweisbar ist. Man kann davon ausgehen, dass sie eingesetzt werden können, um bestimmte Muskeln während einer Operation zu entspannen.
Die Wirkung von jedem dieser Conotoxinpeptide ist frei reversibel, wenn das Toxin verdünnt oder aus dem betroffenen Muskel entfernt wird. Außerdem wird die Toxizität der cyclischen Peptide im Allgemeinen durch Mittel zerstört, die in den cyclischen Conotoxinen Disulfidbindungen spalten, dies legt nahe, dass ein korrektes Ausbilden von Disulfidbindungen für die biologische Wirkung essentiell ist; jedoch kann möglicherweise eine korrekte Faltung und/oder Umlagerung eines Conotoxins in vivo erfolgen, so dass für bestimmte Zwecke in einigen Fällen das lineare Peptid verabreicht werden kann. Im Allgemeinen falten sich die synthetischen linearen Peptide jedoch spontan, wenn sie einer Luftoxidation bei kalten Raumtemperaturen ausgesetzt werden, wodurch die korrekten Disulfidbindungen entstehen, die die biologische Aktivität vermitteln, demgemäß werden die Substanzen vorzugsweise auf diese Weise bearbeitet. Die Conotoxine zeigen bei einem großen Spektrum von Wirbeltieren, einschließlich Menschen, sowie bei Insekten eine Wirkung, und viele können eingesetzt werden, um einen Muskel oder eine Gruppe von Muskeln bei Menschen oder anderen Wirbeltierarten reversibel zu immobilisieren. Viele dieser Conotoxine und Derivate davon können weiterhin zum Nachweisen und Messen von Acetylcholin-Rezeptoren und anderen spezifischen Rezeptoren verwendet werden, die nachstehend im Zusammenhang mit verschiedenen bestimmten Peptide angegeben sind.
Viele dieser Conotoxinpeptide sind auch in der medizinischen Diagnose einsetz bar. Z. B. kann ein Immunfällungstest mit einem radiomarkierten ω-Conotoxin verwendet werden, um das myasthenische Lambert-Eaton-Syndrom zu diagnostizieren, das eine Erkrankung ist, bei der fälschlicherweise Autoimmunantikörper, die gegen endogene Ca²⁺-Kanäle gerichtet sind, hervorgerufen werden, wodurch Muskelschwäche und autonome Dysfunktion ausgelöst werden.
Verschiedene Conotoxinpeptide können ferner zum Behandeln von neuromuskulären Störungen und zum raschen reversiblen Immobilisieren von Muskeln in Wirbeltierarten, einschließlich Menschen, eingesetzt werden, wodurch das Einrichten von Brüchen und Verrenkungen erleichtert wird. Diese Conotoxine hemmen im Allgemeinen die synpatische Übertragung an der motorischen Endplatte und binden stark an den Acetylcholin-Rezeptor der Muskelendplatte, und deshalb sind viele Conotoxine besonders gut dazu geeignet, Acetylcholin-Rezeptoren nachzuweisen und zu testen. Solche Messungen sind für die klinische Diagnose der Myasthenia gravis besonders wichtig, folglich eignen sich verschiedene dieser Conotoxine dazu, wenn sie zusammen mit . einer radioaktiven Markierung oder als ein fluoreszierendes Derivat synthetisiert werden, Acetylcholin-Rezeptoren genauer quantitativ zu bestimmen und Tests auf Acetylcholin-Rezeptoren mit einer größeren Empfindlichkeit durchzuführen.
Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Zwar können die Conotoxine aus den angegebenen Kegelschnecken gereinigt werden, da jedoch die Mengen der Conotoxine, die aus den einzelnen Schnecken isoliert werden können, nur sehr klein sind, werden die gewünschten, im Wesentlichen reinen Conotoxine in kommerziell nutzbaren Mengen in der Praxis am besten durch eine chemische Synthese hergestellt. Z. B. kann es sein, dass die Ausbeute aus einer einzelnen Kegelschnecke etwa 10 μg Conotoxin oder weniger beträgt. Mit im Wesentlichen rein ist gemeint, dass das Peptid vorliegt und andere biologische Moleküle des gleichen Typs im Wesentlichen fehlen; es liegt vorzugsweise in einer Menge vor, die mindestens etwa 85 Gew.-% und stärker bevorzugt mindestens etwa 95% von solchen vorliegenden biologischen Molekülen des gleichen Typs ausmacht, d. h. Wasser, Puffer und harmlose kleine Moleküle können vorhanden sein. Die chemische Synthese eines biologisch aktiven Conotoxinpeptids hängt natürlich von der korrekten Bestimmung der Aminosäuresequenz ab, wobei diese Sequenzen nun bestimmt wurden und in der vorstehenden Zusammenfassung angegeben sind.
Viele der Conotoxine weisen etwa das gleiche Aktvitätsniveau auf, und ein Vergleich von ihnen legt nahe, dass es bei diesen Peptiden eine angemessene Toleranz für eine Substitution in der Nähe ihres Carboxyterminus gibt. Demgemäß können gleichwertige Moleküle durch die Substitution von gleichwertigen Resten in diesem Bereich erzeugt werden, wobei anhand solcher geeigneter Substitutionen bestimmte, für wirbellose Tiere spezifische Conotoxine hergestellt werden können.
In einem Großteil dieser Conotoxine liegen Cysteinreste vor, und verschiedene der hier beschriebenen Conotoxine zeigen ähnliche Disulfid-Vernetzungsmuster wie Erabutoxin, ein bekanntes Proteintoxin aus dem Gift der Seeschlange. Die Tatsache, dass die biologische Aktivität dieser bestimmten Verbindungen durch Mittel zerstört wird, die Disulfidbindungen aufbrechen, wie Natriumborhydrid oder β-Mercaptoethanol, zeigt, dass eine spezifische gefaltete Konfiguration, die durch Disulfidvernetzungen induziert wird, für die biologische Aktivität dieser bestimmten Conotoxine essentiell ist. Es wurde gefunden, dass eine Luftoxidation der linearen Peptide für längere Zeit unter kalten Raumtemperaturen zur Folge hat, dass eine wesentliche Menge der bioaktiven Disulfid-vernetzten Moleküle gebildet wird. Deshalb besteht das bevorzugte Verfahren zum Herstellen dieser Peptide darin, das lineare Peptid zu oxidieren und dann das resultierende Produkt unter Verwendung einer Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) oder dergleichen zu fraktionieren, wodurch Peptide abgetrennt werden, die andere gebundene Konfigurationen aufweisen. Danach kann die bestimmte Fraktion, die die korrekte Bindung für eine maximale biologische Wirksamkeit aufweist, einfach bestimmt werden, indem entweder diese Fraktionen mit der Elution des nativen Materials verglichen werden oder indem ein einfacher Test eingesetzt wird. Außerdem zeigt sich, dass das lineare Peptid oder das oxidierte Produkt, das mehr als eine Fraktion ausmacht, manchmal auch zur in vivo-Verabreichung genutzt werden kann, da gefunden wurde, dass das biologisch wirksame Conotoxinmolekül durch die in vivo ablaufende Vernetzung und/oder Umlagerung erzeugt wird; jedoch kann es sein, dass aufgrund der Verdünnung, die durch das Vorliegen anderer Fraktionen mit einer geringeren biologischen Wirksamkeit zustande kommt, eine etwas höhere Dosis erforderlich ist.
Diese hier beschriebenen Conotoxine hemmen im Allgemeinen die synaptische Übertragung an der motorischen Endplatte, indem sie an den Acetylcholin-Rezeptor einer Endplatte im Muskel binden. Eine besonders geeignete Eigenschaft einer Reihe dieser Conotoxine besteht in ihrer hohen Affinität für bestimmte makromolekulare Rezeptoren, begleitet von einer engen Rezeptor-Ziel-Spezifität. Ein Hauptproblem in der Medizin stellen Nebenwirkungen dar, die Arzneistoffe sehr häufig zeigen, von denen einige dadurch ausgelöst werden, dass der betreffende Arzneistoff nicht nur an den bestimmten Rezeptor-Subtyp bindet, der den therapeutischen Wert vermittelt, sondern auch an nah verwandte, therapeutisch irrelevante Rezeptor-Subtypen, die häufig unerwünschte physiologische Effekte auslösen können. Im Gegensatz zu den meisten Arzneistoffen können diese Conotoxine im Allgemeinen zwischen nah verwandten Rezeptor-Subtypen unterscheiden.
Die Peptide werden durch ein geeignetes Verfahren synthetisiert, z. B. durch ausschließlich Festphasenverfahren, durch teilweise Festphasenverfahren, durch Fragment-Kondensation oder durch klassische Kopplungen in Lösung. Die kürzlich entwickelten DNA-Rekombinationstechniken können eingesetzt werden, um diese Peptide herzustellen, insbesondere die längeren, die nur natürliche Aminosäurereste enthalten, für die keine posttranslationalen Prozessierungsschritte erforderlich sind.
In der herkömmlichen Peptidsynthese in Lösungsphase kann die Peptidkette durch eine Reihe von Kopplungsreaktionen hergestellt werden, in denen die Aminosäurebestandteile zu der wachsenden Peptidkette in der gewünschten Sequenz angefügt werden. Bekannte klassische Peptidverfahren bestehen aus der Verwendung verschiedener N-Schutzgruppen, verschiedener Kopplungsreagenzien, z. B. Dicyclohexylcarbodiimid oder Carbonyldiimidazol, verschiedener aktiver Ester, z. B. Ester von N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxysuccinimid, und der verschiedenen Spaltungsreagenzien, um die Umsetzung in Lösung durchführen zu können, und dem anschließenden Isolieren und Reinigen von Zwischenprodukten. Die klassische Synthese in Lösung wird ausführlich in der Abhandlung „Methoden der organischen Chemie" (Houben-Weyl): „Synthese von Peptiden", E. Wunsch (Hrsg.), (1974), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, BRD, beschrieben. Verfahren für eine ausschließliche Festphasen-Synthese finden sich in dem Handbuch „Solid-Phase Peptide Synthesis", Stewart & Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969, und werden beispielhaft beschrieben durch die Offenbarung des US-Patents Nr. 4 105 603 von Vale et al., veröffentlicht am 8. August 1978. Das Fragmentkondensations-Verfahren der Synthese wird im US-Patent Nr. 3 972 859 (3. August 1976) beschrieben. Andere verfügbare Synthesen sind als Beispiele im US-Patent Nr. 3 842 067 (15. Oktober 1974) und im US-Patent Nr. 3 862 925 (28. Januar 1975) dargestellt.
Solchen chemischen Synthesen ist gemeinsam, dass die labilen Seitenkettengruppen der verschiedenen Aminosäurereste mit geeigneten Schutzgruppen geschützt werden, die so lange verhindern, dass an dieser Stelle eine chemische Reaktion abläuft, bis die Gruppe schließlich entfernt wird. Üblicherweise ist ihnen auch gemeinsam, dass eine α-Aminogruppe auf einer Aminosäure oder einem Fragment geschützt wird, während die Einheit an der Carboxygruppe reagiert, hierauf folgt das selektive Entfernen der α-Amino-Schutzgruppe, so dass die anschließende Umsetzung an dieser Stelle erfolgen kann. Demgemäß ist es üblich, dass als ein Schritt in einer solchen Synthese ein Zwischenprodukt hergestellt wird, das jeden der Aminosäurereste umfasst, die in der Peptidkette in der gewünschten Sequenz vorliegen, wobei geeignete Seitenketten-Schutzgruppen mit verschiedenen Resten gekoppelt sind, die labile Seitenketten besitzen.
Bezüglich der Seitenketten-Amino-Schutzgruppen wird so verfahren, dass im Allgemeinen eine solche Schutzgruppe gewählt wird, die bei der Entfernung der α-Amino-Schutzgruppen während der Synthese nicht entfernt wird. Jedoch ist bei einigen Aminosäure, z. B. His, im Allgemeinen kein Schutz erforderlich. Beim Auswählen einer bestimmten Seitenketten-Schutzgruppe, die in der Synthese der Peptide eingesetzt werden soll, werden die folgenden allgemeinen Regeln befolgt: (a) Die Schutzgruppe behält vorzugsweise ihre Schutzeigenschaften bei und wird unter den Kopplungsbedingungen nicht abgespalten, (b) die Schutzgruppe sollte unter den Reaktionsbedingungen stabil sein, die zum Entfernen der α-Amino-Schutzgruppe in jedem Schritt der Synthese gewählt wurden, und (c) die Seitenketten-Schutzgruppe muss entfernt werden können, wenn die Synthese vollständig abgelaufen und die gewünschte Aminosäuresequenz erreicht ist, dies muss unter solchen Reaktionsbedingungen erfolgen, die die Peptidkette nicht unerwünscht verändern.
Es sollte möglich sein, viele dieser Peptide oder sogar alle Peptide unter Verwendung der DNA-Rekombinationstechnik herzustellen; wenn Peptide jedoch nicht auf diese Weise hergestellt werden, werden sie vorzugsweise anhand der Merrifield-Festphasensynthese erzeugt, obwohl auch andere gleichwertige chemische Synthesen, die dem Fachmann bekannt sind, wie früher erwähnt eingesetzt werden können. Die Festphasensynthese wird vom C-Terminus des Peptids aus begonnen, indem eine geschützte α-Aminosäure an ein geeignetes Harz gekoppelt wird. Ein solches Ausgangsmaterial kann hergestellt werden, indem eine α-Amino-geschützte Aminosäure durch eine Esterbindung an ein chlormethyliertes Harz oder ein Hydroxymethyl-Harz, oder durch eine Amidbindung an ein Benzhydrylamin-Harz (BHA-Harz) oder Paramethylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz) angehängt wird. Das Zubereiten des Hydroxymethyl-Harzes wird von Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597–1598 (1966), beschrieben. Chlormethylierte Harze sind im Handel von Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, und von Lab. Systems, Inc., verfügbar. Das Zubereiten eines solchen Harzes wird von Stewart et al., „Solid Phase Peptide Synthesis", vorstehend, beschrieben. BHA- und MBHA-Harzträger sind im Handel verfügbar und werden allgemein eingesetzt, wenn das gewünschte Polypeptid, das synthetisiert wird, am C-Terminus ein unsubstituiertes Amid aufweist. Hierbei können die festen Harzträger solche sein, die dem Fachmann bekannt sind, z. B. Träger der folgenden Formeln: -O-CH₂-Harzträger, -NH-BHA-Harzträger oder -NH-MBHA-Harzträger. Wenn das unsubstituierte Amid gewünscht ist, ist die Verwendung eines BHA- oder MBHA-Harzes bevorzugt, da das Amid durch eine Spaltung direkt erhalten wird. In dem Fall, dass das N-Methylamid gewünscht ist, kann es aus einem n-Methyl-BHA-Harz erzeugt werden. Sollten andere substituierte Amide gewünscht sein, können die Anleitungen des US-Patent Nr. 4 569 967 befolgt werden, oder sollten noch andere Gruppen als die freie Säure am C- Terminus gewünscht sein, kann es bevorzugt sein, das Peptid unter Verwendung klassischer Verfahren herzustellen, die in der Anleitung von Houben-Weyl beschrieben sind.
Wenn ein Peptid synthetisiert werden soll, das am C-Terminus eine freie Säure aufweist, kann zuerst die C-terminale Aminosäure, die durch Boc und durch eine Seitenketten-Schutzgruppe geschützt ist, sofern geeignet, an ein chlormethyliertes Harz gemäß dem Verfahren, das in Chemistry Letters, K. Horiki et al., 165–168 (1978), beschrieben ist, unter Verwendung von KF in DMF bei etwa 60°C unter Rühren in 24 Stunden gekoppelt werden. Nach der Verknüpfung der BOC-geschützten Aminosäure mit dem Harzträger wird die α-Amino-Schutzgruppe entfernt, z. B. durch Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid oder von TFA alleine. Die Entfernung der Schutzgruppe erfolgt bei einer Temperatur zwischen etwa 0°C und Raumtemperatur. Ferner können auch andere herkömmliche Spaltungsreagenzien, wie HCl in Dioxan, und Bedingungen zum Entfernen spezifischer α-Amino-Schutzgruppen eingesetzt werden, wie in Schroder und Lubke, „The Peptides", 1, S. 72–75, Academic Press (1965), beschrieben.
Nach Entfernen der α-Aminoschutzgruppe werden die restlichen α-Amino- und Seitenketten-geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolgen gebunden, so dass das wie vorstehend definierte Zwischenprodukt erhalten wird, oder als Alternative, anstatt bei der Synthese jede Aminosäure getrennt anzufügen, können einige der Aminosäuren miteinander gekoppelt werden, bevor sie in den Festphasen-Reaktor zugegeben werden. Der Fachmann kann ein geeignetes Kopplungsreagens auswählen. Besonders geeignet als Kopplungsreagens ist N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC).
Die Aktivierungsreagenzien, die in der Festphasen-Synthese der Peptide eingesetzt werden, sind dem Fachmann der Peptidchemie bekannt. Beispiele von geeigneten Aktivierungsreagenzien sind Carbodiimide, wie N,N'-Diisopropylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid. Andere Aktivierungsreagenzien und ihre Verwendung in der Peptidkopplung werden von Schroder und Lubke, vorstehend, in Kapitel III, und von Kapoor, J. Phar. Sci. 59, S. 1–27 (1970), beschrieben.
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in den Festphasenreaktor in einem etwa zweifachen oder größeren Überschuss eingeführt, sodann kann die Kopplung in einem Medium wie Dimethylformamid (DMF) : CH₂Cl₂ (1 : 1) oder in DMF oder CH₂Cl₂ alleine durchgeführt werden. In den Fällen, wenn die Kopplung unvollständig abläuft, wird die Kopplungsprozedur wiederholt, bevor die α-Amino-Schutzgruppe entfernt und die nächste Aminosäure gebunden wird. Der Erfolg der Kopplungsreaktion wird in jedem Stadium der Synthese, sofern sie per Hand durchgeführt wird, vorzugsweise durch die Ninhydrin-Reaktion überwacht, wie von E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595 (1970), beschrieben. Die Kopplungsreaktionen können au tomatisch durchgeführt werden, z. B. auf einem automatischen Synthesizer Beckman 990, wobei ein Programm verwendet wird, wie in Rivier et al., Biopolymers 17, S. 1927– 1938 (1978), beschrieben.
Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz vollständig synthetisiert wurde, kann das Peptidzwischenprodukt vom Harzträger durch Behandeln mit einem Reagens, wie flüssigem Fluorwasserstoff, entfernt werden, wodurch nicht nur das Peptid vom Harz abgespalten wird, sondern auch alle restlichen Seitenketten-Schutzgruppen und außerdem die α-Amino-Schutzgruppe am N-Terminus entfernt werden, sofern sie nicht früher schon entfernt wurde, so dass das Peptid in Form der freien Säure erhalten wird. Wenn in der Sequenz Met vorliegt, wird die Boc-Schutzgruppe vorzugsweise zuerst unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA)/Ethandithiol entfernt, bevor das Peptid durch HF vom Harz abgespalten wird, um einem mögliche S-Alkylierung zu verhindern. Wenn Fluorwasserstoff zum Spalten eingesetzt wird, werden in das Reaktionsgefäß ein oder mehrere Scavenger zugegeben, wie Anisol, Cresol, Dimethylsulfid und Methylethylsulfid.
Vorzugsweise erfolgt die Cyclisierung des linearen Peptids, im Gegensatz zum Cyclisieren des Peptids, das ein Teil des Peptidharzes ist, so dass Bindungen zwischen Cys-Resten erzeugt werden. Eine solche cyclisierende Disulfidbindung kann hergestellt werden, indem das vollständig geschützte Peptid von einem hydroxymethylierten oder chlormethylierten Harzträger durch Ammonolyse abgespalten wird, wie dem Fachmann bekannt ist, wodurch das vollständig geschützte Amidzwischenprodukt erhalten wird, das danach geeignet cyclisiert und von den Schutzgruppen befreit wird; andererseits kann das Entfernen der Schutzgruppen und das Abspalten des Peptids von den vorstehenden Harzen oder einem Benzhydrylamin-Harz (BHA-Harz) oder einem Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz) bei 0°C mit Fluorwasserstoff (HF) erfolgen, worauf eine Luftoxidation unter den Bedingungen einer starken Verdünnung folgt.
Somit stellt ein Aspekt der Erfindung auch ein Verfahren zum Herstellen eines synthetischen Conotoxinpeptids von Interesse bereit, indem die folgenden Schritte durchgeführt werden: (a) Herstellen eines Peptidzwischenprodukts, das die gewünschte Aminosäuresequenz und mindestens eine Schutzgruppe aufweist, die an eine labile Seitenkette eines Restes, wie Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His, Cys, Arg oder Lys, gebunden ist, und dessen C-Terminus gegebenenfalls durch eine verankernde Bindung am Harzträger befestigt ist; (b) Abspalten der Schutzgruppe oder -gruppen und der verankernden Bindung aus dem Peptidzwischenprodukt, so dass ein lineares Peptid gebildet wird; (c) Erzeugen einer cyclisierenden Bindung zwischen den im linearen Peptid vorliegenden Cys-Resten, so dass ein cyclisches Peptid entsteht; und (d), sofern gewünscht, Umwandeln des resultierenden cyclischen Peptids zu einem nicht-toxischen Salz da von. Bestimmte Seitenketten-Schutzgruppen und Harzträger sind dem Fachmann bekannt und in den früher erwähnten Patenten beschrieben.
Die folgenden Beispiele sind dargestellt, um spezifisch bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung genauer zu erläutern.
Beispiel 1
Das Conotoxin SEQ ID NO: 1 (auch als J-020 bezeichnet), das die folgende chemische Formel aufweist:
H-Gly-Cys-Cys-Gly-Ser-Tyr-Pro-Asn-Ala-Ala-Cys-His-Pro-Cys-Ser-Cys-Lys-Asp-Arg-4Hyp-Ser-Tyr-Cys-Gly-Gln-NH₂, wird durch eine schrittweise Verlängerung vom Carboxyterminus aus unter Verwendung des Merrifield-Festphasen-Peptidsyntheseverfahrens synthetisiert. Fakultative Einzelheiten dieses allgemeinen Verfahrens, die nachstehend nicht angegeben sind, finden sich in Stewart, J. M., und Young, J., „Solid Phase Peptide Synthesis", 2. Aufl., Pierce Chemical Co., Rockford, III., (1984), und in Rivier et al., US-Patent Nr. 5 064 939 (12. Nov. 1991).
Als Festphasenträger wird ein Methylbenzhydrylamin-Harz eingesetzt, das die Produktion des amidierten Peptids erleichtert. Die Aminosäurereste werden in Form ihrer Boc-Derivate (tert.-Butyloxycarbonyl-Derivate) nacheinander an das Harz gekoppelt, wobei Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) als Kopplungs- oder Kondensierungsmittel verwendet wird. In jedem Zyklus der schrittweisen Anfügens von Aminosäuren wird die Boc-Gruppe durch Säurelyse mit 50% (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid unter Einsatz eines geeigneten Scavengers, wie 1,2-Ethandithiol, entfernt, wodurch eine neue α-Aminogruppe für den anschließenden Kopplungsschritt freigelegt wird. Insbesondere werden, wenn eine automatisierte Vorrichtung und etwa 5 g Harz verwendet werden, nach dem Koppeln jedes Aminosäurerestes, das Waschen, Entfernen der Schutzgruppe und Koppeln des nächsten Restes vorzugsweise gemäß dem folgenden Schema durchgeführt:
Die Seitenketten-Schutzgruppen werden im Allgemeinen aus einem Standardsatz von mäßig säurestabilen Derivaten ausgewählt. Solche Schutzgruppen sind vorzugsweise Gruppen, die während des Entblockierens durch Trifluoressigsäure in Methylenchlorid nicht entfernt werden; jedoch werden alle diese Gruppen durch wasserfreien Fluorwasserstoff (HF) wirksam abgespalten, so dass die funktionellen Seitenketten freigelegt werden. Cysteinreste in den Positionen 2, 3, 11, 14, 16 und 23 des Peptids werden durch p-Methoxybenzylgruppen (Mob-Gruppen) geschützt, so dass beim Entfernen der Schutzgruppen Sulfhydryle freigelegt werden. Die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr wird durch 2-Brombenzyloxycarbonyl (Brz) geschützt. Die Seitenkette von 4-Hydroxyprolin (4Hyp) wird durch Benzylether (OBzl) geschützt und ist in dieser geschützten Form im Handel erhältlich. Die Seitenkette von Arg wird mit Tos (p-Toluolsulfonyl) geschützt. Die Seitenkette von Asp wird als Cyclohexylester (OChx) geschützt. und die primäre Aminoseitenkette von Lys wird mit 2-Chlorbenzyloxycarbonyl (Clz) geschützt. Das Imidazol-Stickstoffatom von His wird durch Tos geschützt. Serin wird durch Benzylether (OBzl) geschützt. Asn wird ohne Seitenkettenschutz in Gegenwart von Hydroxybenzotriazol (HOBt) gekoppelt.
Am Ende der Synthese wird das folgende Peptidzwischenprodukt erhalten:
Bos-Gly-Cys(Mob)-Cys(Mob)-Gly-Ser(OBzl)-Tyr(Brz)-Pro-Asn-Ala-Ala-Cys(Mob)-Nis(Tos)-Pro-Cys(Mob)-Ser(OBzl)-Cys(Mob)-Lys(Clz)-Asp(OChx)-Arg(Tos)-4Hyp(Bzl)-Ser(OBzl)-Tyr(Brz)-Cys(Mob)-Gly-Gln-MBHA-Harzträger. Alle Seitenketten-blockierenden Gruppen können durch HF abgespalten werden.
Nach Entfernen der N-terminalen Boc-Gruppe mit TFA wird das lineare Peptid vom Harz abgespalten und die Schutzgruppen mit HF entfernt, indem 150 ml HF, 16 ml Anisol und etwa 4 ml Dimethylsulfid etwa 1,5 Stunden bei 0°C eingesetzt werden, wodurch alle restlichen Schutzgruppen entfernt werden. Alle flüchtigen Substanzen werden durch Anlegen eines Vakuums entfernt, sodann wird das Peptid mit Ethylether gewaschen und danach in 5% Essigsäure gelöst. Anschließend wird die Lösung auf etwa 15 Liter verdünnt und der pH-Wert mit Diisopropylethylamin auf etwa 8,0 eingestellt. Das Ganze wird vier Tage einer Luftoxidation in einem kalten Raum bei etwa 4°C ausgesetzt, wodurch die Disulfid-Vernetzungen oder Brücken gebildet werden. Um den Fortschritt der Oxidationsreaktion zu verfolgen, wird etwa alle zwölf Stunden ein Tropfen des Gemisches entnommen und zu einem Tropfen einer Lösung zugegeben, die Dithiobis(2-nitrobenzoe)säure in einem molaren Puffer von K₂HPO₄ (pH 8) enthält (Ellman-Test). Der pH-Wert wurde während der ganzen Umsetzung durch Zugabe von Diisopropylethylamin bei 8 gehalten. Nach 50 Stunden wird in dem Test mit Dithio-bis(2-nitrobenzoe)säure festgestellt, dass keine gelbe Färbung vorliegt.
Nach Ausbilden der Disulfidbrücken wird der cyclisierte Peptidpool auf eine Bio- Rex-70-Säule (5 × 15 cm) aufgetragen, in destilliertem Wasser gewaschen (100 ml) und mit 50% Essigsäure eluiert. Die Fraktionen mit dem cyclisierten Peptid werden gewonnen und gefriergetrocknet.
Anschließend werden die gefriergetrockneten Peptidfraktionen durch präparative oder semipräparative HPLC gereinigt, wie von Rivier et al., J. Chromatography 288, 303–328 (1984); und Hoeger et al., BioChromatography 2, 3, 134–142 (1987), beschrieben. Die chromatographischen Fraktionen werden durch HPLC sorgfältig überwacht, und nur diejenigen Fraktionen werden vereinigt, die eine wesentliche Reinheit zeigen.
Das Peptid wird als homogen bewertet, dies erfolgt anhand einer Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie unter Verwendung eines Waters HPLC-Systems mit einer Säule von 0,46 × 25 cm, gepackt mit 5 μm C₁₈-Kielselgel, Porengröße von 300 Å. Die Bestimmung erfolgt bei Raumtemperatur unter Verwendung von Gradienten-Bedingungen mit zwei Puffern. Puffer A ist eine wässrige Lösung von Trifluoressigsäure (TFA), die aus 1,0 ml TFA pro 1000 ml Lösung besteht. Puffer B ist 1 ml TFA, verdünnt mit H₂O auf 400 ml, zugegeben zu 600 ml Acetonitril. Die analytische HPLC wird unter Gradienten-Bedingungen laufen gelassen, diese werden gleichmäßig innerhalb von zehn Minuten von 20 Vol.-% (v./o.) Puffer B zu 35 v./o. Puffer B verändert, wobei eine konstante Fließrate von 2 ml pro Minuten verwendet wird; die Retentionszeit für das biologisch wirksame cyclische Conotoxin beträgt 10,6 Minuten.
Das Produkt wird außerdem durch Aminosäureanalyse charakterisiert. Ein μg des synthetischen Toxins, das in eine Maus intrazerebral (i.c.) injiziert wird, ist in weniger als zehn Minuten letal, dies zeigt, dass das synthetische Produkt hochtoxisch ist, somit ergibt die Synthese durch das beschriebene Verfahren, sofern hierauf eine Luftoxidation folgt, die korrekte Anordnung von Disulfidpaarungen, wodurch die biologische Aktivität sichergestellt wird. Das synthetische Peptid ist mit dem nativen Conotoxin im Wesentlichen identisch, dies wird anhand der gleichzeitigen Elution auf HPLC, der Ami nosäureanalyse und der biologischen Aktivität gezeigt. Dieses Peptid bindet an den Acetylcholin-Rezeptor und hemmt dessen Funktion, wodurch eine Paralyse ausgelöst wird, anschließend verendet das Tier. Es kann in Tests auf den Acetylcholin-Rezeptor eingesetzt werden.
Beispiel 2
Das Conotoxin SEQ ID NO: 2 (auch als J-005 bezeichnet), das die folgende chemische Formel aufweist:
H-pGlu-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Ser-Val-Ile-Thr-Thr-Cys-Cys-Gly-Tyr-Asp-4Hyp-Gly-Thr-Met-Cys-4Nyp-4Nyp-Cys-Arg-Cys-Thr-Asn-Ser-Cys-NH₂, wird durch schrittweises Verlängern vom Carboxyterminus aus synthetisiert, wobei das in Beispiel 1 beschriebene Festphasensynthese-Verfahren und das gleiche Methylbenzhydrylamin-Harz eingesetzt werden.
Die Seitenketten von Hydroxyprolin, Threonin und Serin werden durch Benzylether (Bzl) geschützt.
Am Ende der Synthese wird das folgende Peptidzwischenprodukt erhalten:
Boc-pGlu-Lys(Clz)-Ser(Bzl)-Leu-Val-Pro-Ser(Bzl)-Val-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Cys(Mob)-Cys(Mob)-Gly-Tyr(Brz)-Asp(OChx)-4Hyp(Bzl)-Gly-Thr(Bzl)-Met-Cys(Mob)-4Hyp(Bzl)-4Hyp(Bzl)-Cys(Mob)-Arg(Tos)-Cys(Mob)-Thr(Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Cys(Mob)-MBHA-Harzträger. Alle Seitenketten-blockierenden Gruppen können durch HF abgespalten werden.
Nach Entfernen der N-terminalen Boc-Gruppe mit TFA wird das lineare Peptid von 3 g Harz abgespalten und die Schutzgruppen entfernt, wobei 100 ml HF, 1 ml Anisol und etwa 4 ml Dimethylsulfid etwa 1,5 Stunden bei 0°C eingesetzt werden, wodurch alle restlichen Schutzgruppen entfernt werden. Alle flüchtigen Substanzen werden durch Anlegen eines Vakuums entfernt, sodann wird das Peptid mit Ethylether gewaschen und danach mit 10% Essigsäure, enthaltend 10% Cyanomethan, extrahiert. Anschließend wird die Lösung auf etwa 4 Liter und einen pH-Wert von etwa 6,95 verdünnt. Die Lösung wird in einem kalten Raum bei etwa 4°C einer Luftoxidation ausgesetzt, dies erfolgt ausreichend lange, so dass sie vollständig oxidiert wird, indem die Disulfid-Vernetzungen oder Brücken gebildet werden, d. h. einen Zeitraum von etwa ein bis zwei Wochen.
Nach Ausbilden der Disulfidbrücken wird der cyclisierte Peptidpool auf eine Bio-Rex-70-Säule (5 × 15 cm) aufgetragen und mit 50% Essigsäure eluiert. Die Fraktionen mit dem cyclisierten Peptid werden gewonnen und gefriergetrocknet. Das synthetische Peptid ist mit dem nativen Conotoxin im Wesentlichen identisch, dies wird anhand der gleichzeitigen Elution auf HPLC, der Aminosäureanalyse und der biologischen Aktivität gezeigt, wobei der Vergleich mit dem nativen Conotoxin nach der Deglykosylierung durchgeführt wird, wodurch das an Ser in der Position 7 gebundene Kohlenhydrat entfernt wird, welches die biologische Aktivität erhöht.
Wenn das Peptid in Mäuse i.c. injiziert wird, hat dies zur Folge, dass die Mäuse spastisch werden und eine Paralyse erleiden. Somit weiß man, dass es eine hohe Affinität und Spezifität für einen bestimmten Rezeptor aufweist und eingesetzt werden kann, um diesen Rezeptor anzusteuern, und dass es in Tests auf diesen Rezeptor genutzt werden kann.
Beispiel 3
Das Peptid OB-34 (SEQ ID NO: 3) wird anhand der in Beispiel 1 allgemein beschriebenen Synthese hergestellt. Das betreffende Peptid weist die folgende Formel auf:
Die Synthese wird auf einem MBHA-Harz durchgeführt, und zum Schützen der α-Aminogruppen wird Boc eingesetzt. Die gleichen Seitenketten-Schutzgruppen wie vorstehend beschrieben werden verwendet.
Etwa 4 ½ g des Peptidharzes werden mit 5 ml Anisol, 1 ml Methylethylsulfid und 60 ml HF ½ Stunde bei –20°C und eine Stunde bei 0°C behandelt. Danach wird das Peptid extrahiert und in 4,5 Liter Ammoniumacetatpuffer gelöst, einer Lösung, die etwa 10 g Ammoniumacetat bei einem pH-Wert von etwa 4,3 enthält. Der pH-Wert wird mit Ammoniumhydroxid auf etwa 7,75 eingestellt und die Lösung ausreichend lange in einem kalten Raum bei etwa 4°C gehalten, so dass die Luftoxidation vollständig ablaufen kann. Anschließend wird eine Reinigung wie vorstehend beim Beispiel 2 beschrieben durchgeführt und das gereinigte Peptid einer analytischen HPLC unterworfen. Das Produkt zeigt einen einzelnen Peak, und zwar sowohl bei einem Gradientenlauf als auch bei einem isokratischen Lauf mit geeigneten Puffern. Die Reinheit der Verbindung wurde bestimmt und war größer als etwa 99%. Das synthetische Peptid wird auf einer HPLC gemeinsam mit dem nativen Peptid eluiert.
Die intrazerebrale Injektion von 1 μg des synthetischen Peptids OB-34 in eine Maus hat zur Folge, dass die Maus eine reproduzierbare physische Wirkung zeigt, die für die Bindung an einen spezifischen Rezeptor spricht und bestätigt, dass durch die Luftoxidation eine geeignete Vernetzung entsteht, so dass das synthetische Conotoxin biologisch wirksam ist. Somit weiß man, dass es eine hohe Affinität und Spezifität für einen bestimmten Rezeptor aufweist und eingesetzt werden kann, um diesen Rezeptor anzusteuern, und dass es in Tests auf diesen Rezeptor genutzt werden kann.
Beispiel 4
Das Peptid J-019 (SEQ ID NO: 4) wird anhand der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens synthetisiert. Das synthetische Peptid weist die folgende Formel auf:
Ein MBHA-Harz wird verwendet, und die α-Aminogruppen von jeder der Aminosäuren, die in der Synthese eingesetzt werden, werden durch Boc geschützt. Seitenketten-Schutzgruppen werden wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet.
Das Abspalten vom Harz und die Luftoxidation zum Durchführen der Cyclisierung werden wie in Beispiel 1 angegeben durchgeführt.
Das cyclische Peptid wird anhand des in Beispiel 1 dargestellten Verfahrens gereinigt und durch eine analytische HPLC auf Reinheit getestet, die zeigt, dass ein im Wesentlichen reines synthetisches Material vorliegt. Das synthetische Peptid ist mit dem nativen Conotoxin im Wesentlichen identisch, dies wird anhand der gleichzeitigen Elution auf HPLC, der Aminosäureanalyse und der biologischen Aktivität gezeigt. Die intrazerebrale Injektion des Peptids in eine Maus bewirkt einen anfänglichen heftigen Kratzanfall, worauf eine Paralyse folgt, und schließlich verendet die Maus, wodurch bestätigt wird, dass die Luftoxidation eine geeignete Vernetzung erzeugen kann, so dass das synthetische Conotoxin biologisch wirksam ist. Somit weiß man, dass es eine hohe Affinität und Spezifität für einen bestimmten Rezeptor aufweist und eingesetzt werden kann, um diesen Rezeptor anzusteuern, und dass es in Tests auf diesen Rezeptor genutzt werden kann.
Beispiel 5
Das Verfahren von Beispiel 4 wird mit einer einzigen Änderung der Aminosäure an Position 13 wiederholt, wobei Prolin für 4-Hydroxyprolin subsitutiert wird und dadurch das Peptid J-026 (SEQ ID NO: 5) synthetisiert wird. Das synthetische Peptid weist die folgende Formel auf:
Das Abspalten vom Harz und die Luftoxidation zum Durchführen der Cyclisierung erfolgen wie in Beispiel 1 beschrieben.
Durch analytische HPLC wird gezeigt, dass eine im Wesentlichen reine Verbindung vorliegt. Das synthetische Peptid ist mit dem nativen Conotoxin im Wesentlichen identisch, dies wird anhand der gleichzeitigen Elution auf HPLC, der Aminosäureanalyse und der biologischen Aktivität gezeigt. Das Testen durch eine i.c.-Injektion in eine Maus hat heftige Bewegungen zur Folge, anschließend kommt es zur Paralyse, worauf die Maus schließlich verendet. Somit weiß man, dass es eine hohe Affinität und Spezifität für einen bestimmten Rezeptor aufweist und eingesetzt werden kann, um diesen Rezeptor anzusteuern, und dass es in Tests auf diesen Rezeptor genutzt werden kann.
Beispiel 6
Die Synthese von Peptid OB-26 (SEQ ID NO: 6) wird anhand eines Verfahrens durchgeführt, das im Allgemeinen das gleiche ist wie das in den Beispielen 1 und 3 beschriebene Verfahren. Das synthetische Peptid hat die folgende Formel:
Das Abspalten vom MBHA-Harz und die Luftoxidation erfolgen wie in Beispiel 1 beschrieben. In ähnlicher Weise erfolgt die Reinigung über HPLC des vernetzten Peptids. Das resultierende synthetische Peptid wird durch analytische HPLC untersucht, wobei gezeigt wird, dass eine im Wesentlichen reine Verbindung vorliegt. Das synthetische Peptid ist mit dem nativen Conotoxin im Wesentlichen identisch, dies wird anhand der gleichzeitigen Elution auf HPLC, der Aminosäureanalyse und der biologischen Aktivität gezeigt. Die i.c.-Injektion von 1 μg des synthetischen Peptids in eine Maus hat eine reproduzierbare physische Wirkung zur Folge, wodurch bestätigt wird, dass die geeigneten Disulfidbindungen während des Luftoxidationsschrittes gebildet werden. Somit weiß man, dass das Peptid eine hohe Affinität und Spezifität für einen bestimmten Rezeptor aufweist und eingesetzt werden kann, um diesen Rezeptor anzusteuern, und dass es in Tests auf diesen Rezeptor genutzt werden kann.
Beispiel 7
Die Synthese des Peptids J-029 (SEQ ID NO: 7) wird auf einem chlormethylierten Harz im gleichen allgemeinen Verfahren wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt. Das synthetische Peptid hat die folgende Formel:
Das Peptid wird mit Anisol, Methylethylsulfid und HF vom Harz abgespalten, und anschließend wird eine Luftoxidation unter den Bedingungen durchgeführt, die in Beispiel 1 allgemein beschrieben sind, wodurch die cyclische Verbindung erhalten wird. Danach erfolgt die Reinigung unter Verwendung einer HPLC wie vorstehend angegeben. Das endgültige Auftragen des gereinigten Peptids auf eine analytische HPLC zeigt, dass eine im Wesentlichen reine Verbindung vorliegt. Das synthetische Peptid ist mit dem nativen Conotoxin im Wesentlichen identisch, dies wird anhand der gleichzeitigen Elution auf HPLC, der Aminosäureanalyse und der biologischen Aktivität gezeigt.
Die i.c.-Injektion einer Dosis von etwa 1 μg des synthetischen Conotoxins in eine Maus zeigt eine Paralyse, die im Wesentlichen unmittelbar auftritt. Somit weiß man, dass es eine hohe Affinität und Spezifität für einen bestimmten Rezeptor aufweist und eingesetzt werden kann, um diesen Rezeptor anzusteuern, und dass es in Tests auf diesen Rezeptor genutzt werden kann.
Beispiel 8
Die Synthese des Peptids OB-20 (SEQ ID NO: 8) mit der folgenden Formel:
wird im Allgemeinen wie in Beispiel 3 beschrieben unter Verwendung einer Fmoc-Strategie auf einem 2,4-Dimethoxyalkoxybenzylamin-Harz durchgeführt.
Das Peptid wird vom Harz abgespalten, indem ein Gemisch aus TFA, Thioanisol, Wasser und DCM in den folgenden Volumenverhältnissen eingesetzt wird: 40 : 10 : 1 : 44. Das Abspalten erfolgt etwa acht Stunden bei 37°C. Nach dem Spalten wird eine Luftoxidation wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, um das Peptid zu cyclisieren.
Das cyclisierte Peptid wird wie vorstehend beschrieben gereinigt. Wenn das gereinigte Peptid einer HPLC und einer Aminosäureanalyse unterworfen wird, zeigt sich, dass ein Peptid mit einer Reinheit von mehr als 95% vorliegt, das bei der Aminosäureanalyse das erwartete Verhältnis von Resten aufweist. Das synthetische Peptid wird auf einer HPLC gemeinsam mit dem nativen Peptid eluiert.
Die intrazerebrale Injektion von 1 μg des synthetischen Peptids OB-20 in eine Maus hat zur Folge, dass die Maus eine reproduzierbare physische Wirkung zeigt, dies bestätigt, dass die Luftoxidation eine geeignete Vernetzung erzeugt, so dass das synthetische Conotoxin biologisch wirksam ist. Somit weiß man, dass es eine hohe Affinität und Spezifität für einen bestimmten Rezeptor aufweist und eingesetzt werden kann, um diesen Rezeptor anzusteuern, und dass es in Tests auf diesen Rezeptor genutzt werden kann.
Beispiel 9
Die Synthese, die in Beispiel 1 allgemein beschrieben ist, wird unter Verwendung von etwa 25 g eines chlormethylierten Polystyrol-Harzes des Typs, der allgemein im Handel verfügbar ist, durchgeführt, um das Peptid J-021 (SEQ ID NO: 9) herzustellen, das die folgende Formel aufweist:
Die gleichen Seitenketten-Schutzgruppen wie in Beispiel 1 beschrieben werden verwendet, und die Hydroxylseitenkette von 4-Hydroxyprolin wird als Benzylether geschützt. Das Koppeln des N-terminalen His-Restes wird unter Verwendung von Boc-His(Tos) durchgeführt, das in DMF gelöst ist und wobei etwa 2 mMol Benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP) als Kopplungsreagens eingesetzt werden.
Nachdem der letzte His-Rest mit dem Peptidharz verbunden wurde, wird die Boc-Gruppe durch 45% TFA in Methylenchlorid entfernt. Danach wird das Peptidharz mit Anisol und Methylethylsulfid und HF behandelt. 5 g Harz werden mit 10 ml Anisol, 1 ml Methylethylsulfid und 125 ml HF ½ Stunde bei –20°C und eine Stunde bei 0°C be handelt. Danach wird das abgespaltene Peptid unter Verwendung von 200 ml 50% Essigsäure bei einer Temperatur unter 0°C extrahiert. Anschließend wird das extrahierte Peptid in 8 Liter 1% Ammoniumacetat bei einem pH-Wert von etwa 4,35 gelöst. Der pH-Wert wird mit Ammoniumhydroxid auf etwa 7,74 erhöht und die Luftoxidation wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Die Reinigung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben, anschließend wird die Reinheit unter Verwendung einer analytischen HPLC getestet. Das Peptid wird auf eine Umkehrphasen-C₁₈-Säule aufgetragen und danach eluiert, indem die Säule einem Gradienten der Puffer A und B bei einer Fließrate von etwa 0,21 ml pro Minute unterworfen wird, wobei sich der Gradient innerhalb eines Zeitraums von 20 Minuten gleichmäßig von 0% Puffer B zu 20% Puffer B ändert. Puffer A ist eine 1% wässrige Lösung von TFA, und Puffer B besteht aus 0,1% TFA und 70% Acetonitril. Diese HPLC zeigt, dass das Peptid bei etwa 18,6 Minuten eluiert wird und eine Reinheit von mehr als 99% aufweist. Das synthetische Peptid wird auf der HPLC gemeinsam mit dem nativen Peptid eluiert. Die Aminosäureanalyse des reinen Peptids zeigt, dass die erwarteten Reste vorliegen.
Man geht davon aus, dass sich beim Testen zeigen wird, dass dieses Peptid eine hohe Affinität und Spezifität für einen bestimmten Rezeptor aufweist, so dass es eingesetzt werden kann, um diesen Rezeptor anzusteuern oder um Tests auf diesen Rezeptor durchzuführen.
Beispiel 10
Das Peptid J-010 (SEQ ID NO: 10) wird anhand der Fmoc-Schutz-Strategie synthetisiert, wobei das im Beispiel 8 allgemein beschriebene Verfahren verwendet wird. Das synthetische Peptid hat die folgende Formel:
Das Peptid wird vom Harz abgespalten, indem ein Gemisch aus TFA, Thioanisol, Wasser und DCM in den folgenden Volumenverhältnissen eingesetzt wird: 40 : 10 : 1 : 44. Das Abspalten erfolgt etwa acht Stunden bei 37°C. Nach dem Abspalten wird eine Luftoxidation wie vorstehend beschrieben durchgeführt, um das Peptid zu cyclisieren.
Das cyclisierte Peptid wird wie vorstehend beschrieben gereinigt, und das gereinigte Peptid wird einer HPLC unterworfen, die zeigt, dass ein im Wesentlichen reines Peptid vorliegt. Das synthetische Peptid ist mit dem nativen Conotoxin im Wesentlichen identisch, dies wird anhand der gleichzeitigen Elution auf HPLC, der Aminosäureanalyse und der biologischen Aktivität gezeigt. Die intrazerebrale Injektion von etwa 1 μg des synthetischen Peptids in eine Maus hat zur Folge, dass die Maus mit einem schnellen Laufen und Strecken beginnt und schließlich verendet. Somit weiß man, dass es eine hohe Affinität und Spezifität für einen bestimmten Rezeptor aufweist und eingesetzt werden kann, um diesen Rezeptor anzusteuern, und dass es in Tests auf diesen Rezeptor genutzt werden kann.
Beispiel 11
Die Synthese wird im Allgemeinen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, wodurch das Peptid J-008 (SEQ ID NO: 11) mit der folgenden Formel hergestellt wird:
Der C-terminate Rest in dem Peptid ist Asn in seiner freien Säureform. Ein MBHA-Harz wird verwendet, und der Einbau eines Bos-geschützten Asp erfolgt über seine β-Carboxygruppe.
Das Abspalten vom Harz und das Cyclisieren werden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Endprodukt wird genauso durch HPLC zur Homogenität gereinigt, und die Aminosäureanalyse des gereinigten Peptids ergibt die erwarteten Ergebnisse. Das synthetische Peptid wird auf der HPLC gemeinsam mit dem nativen Peptid eluiert.
Das synthetische Toxin wird in einem Maus i.c. injiziert und erweist sich innerhalb von weniger als zehn Minuten als letal, dies bestätigt, dass das synthetische Produkt hochtoxisch ist und dass durch die angegebene Synthese eine Verbindung mit einer biologischen Aktivität produziert wird. Somit weiß man, dass es eine hohe Affinität und Spezifität für einen bestimmten Rezeptor aufweist und eingesetzt werden kann, um diesen Rezeptor anzusteuern, und dass es in Tests auf diesen Rezeptor genutzt werden kann.
Beispiel 12
Die Synthese des Conotoxins SEQ ID NO: 12 (auch als J-017 bezeichnet), das die folgende Formel aufweist:
H-Gly-Glu-Gla-Gla-Val-Ala-Lys-Met-Ala-Ala-Gla-Leu-Ala-Arg-Gla-Asn-Ile-Ala-Lys-Gly-Cys-Lys-Val-Asn-Cys-Tyr-Pro-OH, erfolgt im Allgemeinen wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei jedoch die nachstehend angegebenen Modifikationen verwendet werden.
Ein im Handel verfügbares p-Alkoxybenzylalkohol-Harz wird für die Synthese eingesetzt, das ein Standardharz darstellt, das normalerweise für die Festphasensynthese unter Verwendung der Fmoc-Aminosäure-Strategie verwendet wird. Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) wird eingesetzt, um die α-Aminogruppen von jeder der Aminosäuren zu schützen, und die Seitenketten-Aminogruppen von Lys werden mit Boc geschützt. Die Tyr-Seitenkette wird durch O-tBu geschützt, und die Cys-Seitenkette wird durch Diphenylmethyl (Trityl) geschützt. Die Carboxyseitenkette von Glu und die Seitenketten von Gla werden wie nachstehend beschrieben durch O-t-Bu geschützt. Arg wird durch 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl (Mtr) geschützt.
Fmoc-L-Gla(O-t-Bu)₂-OH wird wie nachstehend beschrieben hergestellt. Die Kondensation von Z-L-Ser(Tos)-OCH₃ mit Di-tert.-butylmalonat zum Erhalt von Z-DL-Gla(O-t-Bu)₂-OCH₃ erfolgt durch eine Modifikation des Verfahrens von Rivier et al., Biochemistry 26, 8508–8512 (1987). Natriumhydrid wird zweimal mit Pentan gespült, in absolutem Benzol suspendiert und danach zu der Benzollösung von Di-tert.-butylmalonat zugegeben. Die Umsetzung lässt man zehn Minuten unter Reflux vollständig ablaufen. Die resultierende Suspension wird in einem Eisbad gekühlt und das in Benzol/Tetrahydrofuran gelöste Z-L-Ser(Tos)-OCH₃ unter einer Argon-Atmosphäre unter kräftigem Rühren zugefügt, wobei das Ganze weitere zwei Stunden auf 0°C gekühlt wird. Anschließend wird das Rühren weitere 48 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt. Währenddessen wird die Suspension gekühlt und sodann nacheinander mit Eiswasser, 1 N HCl und Wasser gewaschen. Nach einem Rotationsverdampfen bei Raumtemperatur wird das Öl in Benzol gelöst, sodann wird Pentan zugefügt, um die Kristallisation in Gang zu setzen. Beim Herstellen von 0,5 Mol beträgt die Ausbeute 40 bis 60%. Der Methylester wird hydrolysiert, indem er in Alkohol gelöst und 1,2 Äquiv. KOH, gelöst in Wasser/Ethanol, zugefügt werden. Die Lösung wird mehrere Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen; die Umsetzung wird durch HPLC unter Verwendung einer C₁₈-5-μm-Säule mit 0,1% TFA-Acetonitril als Lösungsmittel überwacht. Wenn die Umsetzung vollständig abgelaufen ist, wird die Lösung bei Raumtemperatur eingedampft und das Produkt nach Zugabe von NaHSO₄ mit Essigsäureethylester extrahiert. Der Essigsäureethylester-Extrakt wird über Na₂SO₄ getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt; die Ausbeute beträgt 80 bis 90%.
Die D- und L-Isomere werden durch Kristallisation des Chininsalzes des D-Isomers aufgetrennt. Z-DL-di-t-Bu-Gla-OH in Essigsäureethylester wird mit einer äquivalenten Menge von Chinin umgesetzt. Die Kristalle werden von der Mutterflüssigkeit abgetrennt und das Z-D-di-t-Bu-Gla-OH in Essigsäureethylester umkristallisiert. Das Chininsalz wird in Ether suspendiert und das Chinin durch Zugeben einer 20% Zitronensäurelösung bei 0°C entfernt. Das gleiche Verfahren wird eingesetzt, um das Chinin aus der flüssigen Phase zu entfernen. Das L-Isomer wird in Form seines Ephedrinsalzes aus Essigsäureethylester-Pentan ausgefällt und umkristallisiert (Marki et al., Helv. Chim. Acta. 60, 798–800, 1977). Das Entfernen des Ephedrins durch Säureextraktion, Hydrieren der Z-Gruppe und Einführen des Fmoc sind alle herkömmliche Laborverfahren. Die optische Reinheit der L- und D-Isomere von Fmoc-Gla(O-t-Bu)₂-OH wird nach der Hydrolyse zu Glu (6 N HCl, 110°C, 20 Stunden) festgestellt, wobei jedes Isomer zu etwa 99% rein ist.
Das Koppeln der Fmoc-geschützten Aminosäuren an das Harz erfolgt nach einem Schema, das im Allgemeinen ähnlich ist wie das in Beispiel 1 beschriebene Schema, wobei jedoch die Fmoc-Gruppe durch die zehnminütige Anwendung einer 20% Lösung (Vol./Vol.) von frisch destilliertem Piperidin in Dimethylformamid (DMF) entfernt wird. Das Harz wird gründlich gewaschen, indem DMF, Methanol oder Dichlormethan (DCM) wiederholt angewendet werden. Die Kopplungen erfolgen durch DCC in entweder DCM, DMF oder Gemischen daraus, abhängig von der Löslichkeit des jeweiligen Aminosäurederivats. Fmoc-Asn wird in das Peptid mit einer ungeschützten Seitenkette in Gegenwart von 2 Äquiv. HOBT eingebaut und in DMSO/DMF oder DMSO/DCM gekoppelt.
Das Peptid wird aus 4 g des Peptidharzes als die C-terminale freie Säure durch Behandlung mit einem frisch hergestellten Gemisch aus TFA, Thioanisol, H₂O, EDT und DCM (40/18/1/2/49) (40 ml) bei etwa 37°C in sechs bis acht Stunden freigesetzt. Experimentelle Spaltungen von kleinen Mengen zeigen, dass das Peptid frei vorliegt und dass alle Seitenketten-Schutzgruppen, einschließlich der schwierigen Mtr-Gruppe, entfernt sind, während Gla intakt bleibt.
Das Peptid wird aus der Spaltungslösung nach Extraktion mit Methyl-tert.-butylether ausgefällt. Danach wird das Peptid in destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert der resultierenden Lösung mit verdünntem Ammoniumhydroxid auf etwa 7 bis 8 eingestellt, nachdem das Harz abfiltriert wurde. Das Ausbilden der Disulfid-Vernetzung erfolgt am rohen Peptidprodukt anhand eines Luftoxidationsschritts in flüssiger Phase in einem kalten Raum wie in Beispiel 1 beschrieben. Das rohe Peptid wird durch präparative HPLC gereinigt, wobei eine präparative Kartusche (15 bis 20 μm, 300 Å Vydac C₁₈) und ein TEAP-Puffer, pH 2,25, sowie ein 0,1% TFA-Puffer und geeignete Gradienten von Acetonitril verwendet werden. Hochgereinigte Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet, so dass das Peptid als sein TFA-Salz erhalten wird. Die optische Drehung in 1% Essigsäure beträgt [α]_D = –64° (c = 1) bei 20°C. Die Aminosäureanalyse ergibt die erwarteten Werte. Eine FAB-Massenspektrometrie wird mit dem Peptid durchgeführt, wobei das Spektrum ein protoniertes Molekülion (MH⁺) bei m/z = 3097,4 zeigt, dies entspricht dem berechneten monoisotopen Peptid von 3097,36. Ein Chromatogramm des Rohpräparats nach Spalten mit TFA und Entfernen der Schutzgruppen macht deutlich, dass das Hauptprodukt besonders rein ist und nur eine relativ kleine Menge von hydrophoben Verunreinigungen vorliegen. Die Sequenzanalyse ergibt bei jedem Zyklus den erwarteten Rest, mit Ausnahme von Lücken mit Gla-Resten, hierdurch wird bestätigt, dass das reine Zielpeptid erhalten wurde. Das synthetische Peptid wird auf einer HPLC gemeinsam mit dem nativen Peptid eluiert.
Wenn es in junge Mäuse i.c. injiziert wird, induziert es Schlaf; wenn es jedoch in ältere Mäuse injiziert wird, ruft es eine Hyperaktivität hervor. Somit weiß man, dass es eine hohe Affinität und Spezifität für einen bestimmten Rezeptor aufweist und eingesetzt werden kann, um diesen Rezeptor anzusteuern, und dass es in Tests auf diesen Rezeptor genutzt werden kann, der vorläufig als der NMDA-Rezeptor identifiziert wurde. Es kann eingesetzt werden, um eine Neuroprotektion bereitzustellen.
Beispiel 13
Die Synthese des linearen Peptids J-004 (SEQ ID NO: 13) wird auf einem MBHA-Harz unter Verwendung des in Beispiel 1 allgemein beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Das lineare Peptid J-004 hat die folgende Formel:
H-Glu-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu-NH₂.
Das endgültige lineare Peptid wird gereinigt und einer Aminosäureanalyse unterworfen; diese zeigt, dass die erwarteten Reste in der Peptidsequenz vorliegen. Das synthetische Peptid wird auf einer HPLC zusammen mit dem nativen Peptid eluiert, nachdem das native Conotoxin deglykosyliert wurde, wobei das Kohlenhydrat entfernt wurde, das am Thr in der Position 10 gebunden ist und das die biologische Aktivität zu steigern scheint. Wenn man das synthetische Peptid durch i.c.-Injektion in eine Maus testet, zeigt sich, dass die Maus schnell träge wird und nicht mehr in der Lage ist, zu stehen oder normal zu funktionieren, dies macht deutlich, dass das synthetische Peptid die erwartete biologische Wirksamkeit besitzt. Somit weiß man, dass es eine hohe Affinität und Spezifität für einen bestimmten Rezeptor aufweist und eingesetzt werden kann, um diesen Rezeptor anzusteuern, und dass es in Tests auf diesen Rezeptor genutzt werden kann.
Diese synthetischen Peptide sollten zum Verabreichen an Menschen eine Reinheit von mindestens etwa 95% (nachstehend als im Wesentlichen rein bezeichnet) und vorzugsweise eine Reinheit von mindestens etwa 98% aufweisen. Die Reinheit für diese Anwendungszwecke bezieht sich auf das Gewicht des betreffenden Peptids im Vergleich zum Gewicht aller vorliegender Peptidfragmente. Diese synthetischen Peptide, entweder in der freien Form oder in Form eines nicht-toxischen Salzes, werden üblicherweise mit einem pharmazeutisch oder tiermedizinisch verträglichen Träger kombiniert, so dass ein Mittel zum Verabreichen an Lebewesen, einschließlich Menschen, oder zum Verwenden in in vitro-Tests hergestellt wird. Die in vivo-Gabe sollte durch einen Arzt erfolgen, wobei die erforderliche Dosis mit dem jeweils verfolgten Ziel variiert. In dieser Hinsicht wurden Richtlinien zum Verwenden anderer Conotoxine, wie Conotoxin GI, entwickelt, und solche, die dem Fachmann bekannt sind, werden für den jeweiligen Verwendungszweck befolgt.
Wie vorstehend angegeben kann die DNA, die die Aminosäurestruktur eines dieser Conotoxine codiert, eingesetzt werden, um die Proteine rekombinant herzustellen und um außerdem verschiedene Varietäten von Pflanzen mit pestiziden Eigenschaften zu versehen.
Wenn ein Protein mit einer gewünschten Conotoxin-Aminosäuresequenz anhand rekombinanter DNA synthetisiert werden soll, kann eine doppelsträngige DNA-Kette synthetisch konstruiert werden, welche die Sequenz Codiert. Obwohl heutzutage die PCR-Verfahren als Verfahren der Wahl gelten, um DNA-Ketten herzustellen, kann eine DNA-Kette, die die gewünschte Sequenz codiert, auch entworfen werden, indem bestimmte charakteristische Codons verwendet werden, die für die Expression des Polypeptids in einem bestimmten Organismustyp wirksamer sind, d. h. zum Selektieren können diese Codons verwendet werden, die für die Expression in dem Organismustyp am wirksamsten sind, der als Wirt für den rekombinanten Vektor dienen soll. Jedoch kann jeder beliebige korrekte Satz von Codons ein gewünschtes Produkt codieren, vielleicht aber mit einer etwas geringeren Wirksamkeit. Die Auswahl von Codons kann auch von Überlegungen zur Vektorkonstruktion abhängen; z. B. kann es erforderlich sein, zu vermeiden, dass eine bestimmte Restriktionsstelle in der DNA-Kette plaziert wird, wenn der Vektor nach dem Einfügen der synthetischen DNA-Kette unter Verwendung des Restriktionsenzyms manipuliert werden soll, das an einer solchen Stelle spaltet. Außerdem sollte man natürlich vermeiden, Restriktionsstellen in der DNA-Kette zu plazieren, wenn der Wirtsorganismus, der mit dem rekombinanten Vektor, der die DNA-Kette enthält, transformiert werden soll, dafür bekannt ist, dass er ein Restriktionsenzym produziert, welches an einer solchen Stelle innerhalb der DNA-Kette spalten würde.
Um eine solche synthetische, nicht-chromosomale, Conotoxin-codierende DNA-Kette zusammenzubauen, werden Oligonucleotide durch herkömmliche Verfahren konstruiert, wie z. B. in J. Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) (nachstehend: Sambrook et al.), beschrieben. Sense- und Antisense-Oligonucleotidketten mit einer Länge von bis zu etwa 70 Nucleotidresten werden synthetisiert, vorzugsweise auf automatischen Synthesizern, wie dem DNA-Synthesizer, Modell 380A, von Applied Biosystem Inc.. Die Oligonucleotidketten werden so konstruiert, dass sich Teile der Sense- und Antisense-Oligonucleotide überlappen, wobei sie sich durch Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Basenpaaren aneinander lagern und dadurch doppelsträngige Ketten bilden, in den meisten Fällen mit Lücken in den Strängen. Anschließend werden die Lücken in den Strängen aufgefüllt und Oligonucleotide jedes Strangs mit Nucleotidtriphosphaten in Gegenwart geeigneter DNA-Polymerasen und/oder mit Ligasen Ende-zu-Ende verbunden.
Als Alternative zu einer solchen schrittweisen Konstruktion einer synthetischen DNA-Kette kann die cDNA cloniert werden, die dem gewünschten Conotoxin entspricht. Wie bekannt ist, wird eine cDNA-Bank oder eine Expressionsbank in herkömmlicher Weise durch reverse Transkription aus der messenger-RNA (mRNA) aus einem geeigneten Gewebe der Kegelschnecke von Interesse hergestellt. Clone, die gewünschte Sequenzen enthalten, können selektiert werden, indem eine Hybridisierungssonde oder ein gemischter Satz von Sonden, die der Degeneration des genetischen Codes Rech nung tragen und einem ausgewählten Teil des Proteins von Interesse entsprechen, hergestellt und eingesetzt wird, um Clone zu identifizieren, die solche Sequenzen enthalten. Außerdem kann ein Screening einer solchen Expressionsbank mit Antikörpern, die gegen das Protein hervorgebracht wurden, erfolgen, und zwar entweder alleine oder in Verbindung mit Hybridisierungssonden, um das Vorliegen von DNA-Sequenzen in Clonen der cDNA-Bank zu identifizieren oder zu bestätigen, die das Protein von Interesse exprimieren. Solche Verfahren sind z. B. in Sambrook et al., vorstehend, beschrieben.
Eine DNA-Kette sollte zusätzlich zu den Protein-codierenden Sequenzen noch weitere Sequenzen enthalten, diese hängen von Überlegungen zur Konstruktion des Vektors ab. Typischerweise weist eine synthetisierte DNA-Kette an ihren Enden Linker auf, wodurch die Insertion in Restriktionsstellen innerhalb eines Clonierungsvektors erleichtert wird. Eine DNA-Kette kann so konstruiert werden, dass sie die Protein-Aminosäuresequenzen als ein Teil eines Fusionspolypeptids enthält; und wenn dies der Fall ist, enthält sie im Allgemeinen terminale Sequenzen, die Aminosäuresequenzen codieren, die als proteolytische Prozessierungsstellen dienen, so dass das gewünschte Polypeptid vom Rest des Fusionspolypeptids proteolytisch abgespalten werden kann. Die terminalen Teile der synthetischen DNA-Kette können auch geeignete Start- und Stopp-Signale enthalten.
Demgemäß wird eine doppelsträngige Conotoxin-codierende DNA-Kette mit geeigneten Linkern konstruiert oder modifiziert, so dass sie in einen bestimmten geeigneten Clonierungsvektor eingefügt werden kann. Der Clonierungsvektor, der rekombiniert werden soll, dass er die DNA-Kette einbaut, wird entsprechend seiner Lebensfähigkeit und der Expression in einem Wirtsorganismus oder in einer Zelllinie als geeignet ausgewählt, und die Art der Insertion der DNA-Kette hängt von Faktoren ab, die für den jeweiligen Wirt spezifisch sind. Wenn z. B. die DNA-Kette in einen Vektor eingefügt werden soll, der sodann in eine prokaryotische Zelle, wie E. coli, insertiert werden soll, wird die DNA-Kette 3' von einer Promotorsequenz, einer Shine-Delgarno-Sequenz (oder Ribosomenbindungsstelle), d. h. innerhalb eines 5'-nicht-translatierten Teils, und einem ATG-Start-Codon eingefügt. Das ATG-Start-Codon weist einen geeigneten Abstand zur Shine-Delgarno-Sequenz auf, und die codierende Sequenz liegt im korrekten Leseraster mit dem ATG-Start-Codon vor. Der Clonierungsvektor stellt außerdem eine 3'-nicht-translatierte Region und eine Translations-Terminationsstelle bereit. Für die Insertion in eine eukaryotische Zelle, wie eine Hefezelle oder eine aus einem höheren Lebewesen erhaltene Zelllinie, wird die Conotoxin-codierende Oligonucleotidsequenz in geeignetem Abstand von einer Capping-Stelle und im korrekten Leseraster mit einem ATG-Start-Signal plaziert. Der Clonierungsvektor stellt außerdem eine 3'-nicht-translatierte Region und eine Translations-Terminationsstelle bereit.
Prokaryotische Transformationsvektoren, wie pBR322, pMB9, Col E1, pCR1, RP4 und Lambda-Phage, sind zum Einfügen einer DNA-Kette der Länge, die das Conotoxin codiert, verfügbar, bei denen im Wesentlichen die Sicherheit besteht, dass zumindest eine gewisse Expression des codierten Polypeptids erfolgt. Typischerweise werden solche Vektoren so konstruiert oder modifiziert, dass sie eine oder mehrere einmalige Restriktionsstellen aufweisen, die im Bezug auf einen Promotor, z. B. den lac-Promotor, geeignet positioniert sind. Die DNA-Kette kann mit geeigneten Linkern in eine solche Restriktionsstelle eingefügt werden, wobei im Wesentlichen die Sicherheit besteht, dass das gewünschte Protein in einer prokaryotischen Zelllinie produziert wird, die mit dem rekombinanten Vektor transformiert ist. Um das richtige Leseraster sicherzustellen, können Linker von verschiedener Länge an den Enden der Protein-codierenden Sequenzen bereitgestellt werden. Andererseits sind Kassetten verfügbar, die Sequenzen umfassen, wie die 5'-Region des lac-Z-Gens (umfassend Operator, Promotor, Transkriptions-Startstelle, Shine-Delgarno-Sequenz und Translations-Initiationssignal), die regulatorische Region aus dem Tryptophan-Gen (trp-Operator, Promotor, Ribosomen-Bindungsstelle und Translations-Initiator) und ein Fusionsgen, das diese zwei Promotoren enthält, das als trp-lac- oder üblicherweise als Tac-Promotor bezeichnet wird, in welche die synthetische DNA-Kette einfach eingefügt werden kann, und anschließend kann die Kassette in einen Clonierungsvektor der Wahl insertiert werden.
Genauso sind eukaryotische Transformationsvektoren, wie das clonierte Genom des Rinder-Papillomavirus, die clonierten Genome der murinen Retroviren, und eukaryotische Kassetten, wie das pSV-2-gpt-System (beschrieben von Mulligan und Berg, Nature 277, 108–114, 1979), das Okayama-Berg-Clonierungssystem (Mol. Cell Biol. 2, 161–170, 1982), und der Expressions-Clonierungsvektor, der kürzlich vom Genetics Institute beschrieben wurde (Science 228, 810–815, 1985), verfügbar, bei denen im Wesentlichen die Sicherheit besteht, dass in der transformierten eukaryotischen Zelllinie zumindest eine gewisse Expression des Conotoxins erfolgt.
Wenn die Produktion eines Proteins mit der Länge der Conotoxine von Interesse sichergestellt werden soll, ist es wie vorstehend erwähnt günstig, das Protein anfangs als ein Segment eines gencodierten Fusionsproteins zu produzieren. In einem solchen Fall wird die DNA-Kette so konstruiert, dass das exprimierte Protein enzymatische Prozessierungsstellen aufweist, die die Aminosäuresequenzen des Conotoxins flankieren. Eine Conotoxin-codierende DNA-Kette kann z. B. in das β-Galactosidase-Gen zur Insertion in E. coli eingefügt werden, in diesem Fall wird das exprimierte Fusionsprotein anschließend mit proteolytischen Enzymen gespalten, so dass das Conotoxin aus den β-Galactosidase-Peptidsequenzen freigesetzt wird.
Ein Vorteil der Vorgehensweise, die Protein-codierende Sequenz so einzufügen, dass die gewünschte Sequenz als ein spaltbares Segment eines Fusionsproteins ex primiert wird, z. B. als die Conotoxin-Sequenz, die innerhalb der β-Galactosidase-Peptidsequenz fusioniert ist, besteht darin, dass das endogene Protein, in das die gewünschte Conotoxin-Sequenz eingefügt wird, im Allgemeinen dadurch nicht-funktionell gemacht wird, so dass die Vektoren selektiert werden können, die das Fusionsprotein codieren.
Die Conotoxin-Proteine können auch in Hefe reproduziert werden, wobei bekannte DNA-Rekombinations-Techniken eingesetzt werden können. Z. B. wird ein geeignetes Plasmid, das in einem E. coli-Clon amplifiziert wurde, isoliert und mit Eco RI und Sal I gespalten. Dieses gespaltene Plasmid wird einer Elektrophorese auf einem Agarose-Gel unterworfen, wodurch der amplifizierte Einschub von Interesse abgetrennt und gewonnen werden kann. Das Insert wird in das Plasmid pYEp eingefügt, einen Pendelvektor, der sowohl zum Transformieren von E. coli als auch der Hefe Saccharomyces cerevisiae eingesetzt werden kann. Die Insertion der synthetischen DNA-Kette an dieser Stelle stellt sicher, dass die DNA-Sequenz unter der Kontrolle eines Promotors, im richtigen Leseraster von einem ATG-Signal aus und mit dem richtigen Abstand im Bezug auf eine Cap-Stelle liegt. Mit dem Pendelvektor wird URA3 transformiert, ein Stamm der Hefe S. cerevisiae, aus dem das Oratat-Monophosphat-Decarboxylase-Gen deletiert ist.
Die transformierte Hefe wird in einem Medium bis zum Erreichen der log-Phase gezüchtet. Die Hefe wird aus ihrem Kulturmedium abgetrennt, und sodann werden Zelllysate davon hergestellt. Die vereinigten Zelllysaten werden durch RIA getestet, und dabei wird bestimmt, dass sie mit einem gegen das Conotoxin gerichteten Antikörper reagieren, dies macht deutlich, dass innerhalb der Hefezellen ein Protein exprimiert wird, das ein Proteinsegment enthält.
Die Produktion von Conotoxinen kann sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zelllinien erfolgen, wodurch ein Protein bereitgestellt wird, das für biologische und therapeutische Zwecke eingesetzt werden kann. Während die Synthese von Conotoxinen unter Verwendung von Bakterien oder Hefezellen einfach gezeigt werden kann, sollte es auch möglich sein, die synthetischen Gene für die Expression in die Zellen höherer Tiere, wie Säuger-Tumorzellen, sowie in Pflanzenzellen einzufügen. Solche Säugerzellen können z. B. als peritoneale Tumoren in Wirtstieren gezüchtet werden, sodann können bestimmte Conotoxine aus der Peritonealflüssigkeit geerntet werden. Die clonierte DNA kann in Pflanzenvarietäten von Interesse eingefügt werden, wobei die Pflanze sie als ein Pflanzen-Verteidigungsgen nutzt, d. h. sie produziert ausreichende Mengen des Pestizids von Interesse, um Insekten oder dergleichen abzuwehren, die natürliche Feinde solcher Pflanzenarten sind.
Obwohl die vorstehenden Beispiele zeigen, dass Conotoxine durch DNA-Rekombinations-Techniken synthetisiert werden können, erheben die Beispiele nicht den Anspruch, eine maximierte Conotoxin-Produktion darzustellen. Man kann davon ausgehen, dass die Ausbeute durch eine anschließende Selektion von wirksameren Clonierungsvektoren und Wirtszelllinien gesteigert werden kann und dass bekannte Verfahren zum Amplifizieren von Genen sowohl für eukaryotische und als auch für prokaryotische Zellen eingesetzt werden können, um die Produktion zu steigern. Einen wichtigen Faktor bei der Aufgabe, bestimmte synthetische Proteine in großen Mengen zu erhalten, stellt außerdem die Sekretion des gencodierten Proteins aus der Wirtszelllinie ins Kulturmedium dar.
Die Erfindung wurde zwar hinsichtlich bestimmter bevorzugter Ausführungsformen beschrieben, sie sollte jedoch so verstanden werden, dass verschiedene Änderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, die für den Fachmann offensichtlich sind, ohne dass vom Umfang der Erfindung abgewichen wird, der in den beiliegenden Patentansprüchen dargestellt ist. Z. B. kann eine Substitution von verschiedenen der Aminosäurereste, die in den Aminosäuresequenzen angegeben sind, durch Reste erfolgen, von denen bekannt ist, dass sie zu den Resten äquivalent sind, wodurch äquivalente Peptide hergestellt werden, die ähnliche biologische Aktivitäten besitzen. Außerdem ist bekannt, dass weitere Substitutionen der Aminosäuresequenz im Allgemeinen im ganzen C-terminalen Teil des Peptids, d. h. innerhalb des Teils von etwa 1/3 der Länge des Conotoxins, der seinem C-Terminus am nächsten liegt, durchgeführt werden können, um Conotoxine herzustellen, die eine phylogenetische Spezifität aufweisen; somit können solche Substitutionen in dieser Region durchgeführt werden, um wertvolle gleichwertige Strukturen herzustellen. Der C-Terminus von vielen der erläuterten Peptide ist amidiert, und man geht davon aus, dass durch Einbau eines substituierten Amids am C-Terminus solcher Peptide, wie vorstehend beschrieben, ein äquivalentes Conotoxin hergestellt wird.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Im Wesentlichen reines Conotoxinpeptid, welches an den Acetylcholinrezeptor bindet und welches 6 Cys-Reste aufweist, die durch 3 Disulfidbindungen miteinander verbunden sind, wobei die 2 Cys-Reste, die dem N-Terminus am nächsten liegen, Teil der Sequenz Cys-Cys-Gly sind und wobei die 3., 4. und 5. Cys-Reste voneinander durch zwei Aminosäurereste bzw. einen Aminosäurerest getrennt sind.
Conotoxin nach Anspruch 1, wobei die zwei Reste, welche die 3. und 4. Cys-Reste voneinander trennen, ausgewählt sind aus His, Pro und 4-Hydroxyprolin.
Conotoxinpeptid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
wobei Glu in der 1-Position pGlu ist, Xaa 4Hyp ist und der C-Terminus amidiert ist;
, wobei Xaa 4Hyp ist und der C-Terminus amidiert ist;
wobei Xaa 4Hyp ist und der C-Terminus amidiert ist;
wobei Xaa 4Hyp ist und der C-Terminus amidiert ist; und
, wobei Xaa 4Hyp ist und der C-Terminus amidiert ist.
Conotoxin nach Anspruch 1 mit der Formel:
, wobei Xaa₁ des-Xaa₁ oder Gly oder pGlu-Lys- Ser-Leu-Val-Pro-Ser-Val-Ile-Thr-Thr ist; Xaa₂ Ser-Tyr-Pro-Asn-Ala-Ala oder Try-Asp-4Hyp-Gly-Thr-Met oder Val-4Hyp-Asn-Ala-Ala oder Ser-Tyr-4Hyp-Asn-Ala-Ala ist; Xaa₃ His, 4Hyp oder Pro ist; Xaa₄ Pro oder 4Hyp ist; Xaa₅ Ser, Arg oder Val ist; Xaa₆ Lys-Asp-Arg-4Hyp-Ser-Tyr oder Thr-Asn-Ser oder Asn-Lys-Thr oder Lys-Asn-Thr ist; und Xaa₇ des-Xaa₇ oder Gly oder Gly-Gln ist.
Conotoxin nach Anspruch 1 mit der Formel Gly-Cys-Cys-Gly-Ser-Tyr-Pro-Asn-Ala-Ala-Cys-His-Pro-Cys-Ser-Cys-Lys-Asp-Arg-4Hyp-Ser-Tyr-Cys-Gly-Gln-NH₂.
Conotoxin nach Anspruch 4, wobei Xaa₁ des-Xaa₁ ist.
Conotoxin nach Anspruch 4, wobei Xaa₁ Gly ist.
Conotoxin nach Anspruch 4, wobei Xaa₇ Gly-Gln ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung an einen Säuger, um reversibel eine Gruppe von Muskeln zu immobilisieren, wobei diese Zusammensetzung eine wirksame Menge eines synthetischen Conotoxins nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen pharmakologisch annehmbaren toxinfreien flüssigen oder festen Träger dafür umfasst.
Kit zum Durchführen eines Tests für die Anwesenheit eines Acetylcholinrezeptors, wobei dieser Kit eine zum Durchführen eines Tests wirksame Menge eines synthetischen Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst.