DE69838678T2

DE69838678T2 - ZYKLISCHE ANTAGONISTEN DER C5a REZEPTOREN SOWIE DER G-PROTEIN GEKOPPELTEN REZEPTOREN

Info

Publication number: DE69838678T2
Application number: DE69838678T
Authority: DE
Inventors: David Springwood FAIRLIE; Stephen Maxwell Bellbird Park TAYLOR; Angela Monique Narangba FINCH; Allan Bundaberg WONG
Original assignee: University of Queensland UQ
Current assignee: Promics Pty Ltd
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1998-06-25
Publication date: 2008-10-30
Anticipated expiration: 2018-06-26
Also published as: JP2002508767A; US20060160726A1; ATE377606T1; EP1017713B1; US20090203760A1; EP1017713A4; WO1999000406A1; AU744991B2; US6821950B1; DK1017713T3; ES2294816T3; AU8092698A; US20130005644A1; CY1107133T1; USRE41287E1; AUPO755097A0; HK1029595A1; JP4686696B2; EP1017713A1; PT1017713E

Description

Diese Erfindung betrifft neue cyclische Verbindungen, welche das Vermögen zur Modulation der Aktivität von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren besitzen, Agonisten und Antagonisten. Insbesondere stellt die Erfindung cyclische peptidische und cyclische nichtpeptidische Antagonisten von C5a zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind sowohl wirksam als auch selektiv und sind zur Behandlung vieler entzündlicher Zustände verwendbar.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Aktivierung des humanen Komplements, eines Systems von Plasmaproteinen, das an der immunologischen Abwehr von Infektion und Verletzung beteiligt ist, trägt wesentlich zur Pathogenese zahlreicher akuter und chronischer Erkrankungen bei. Insbesondere wurde das Komplementprotein C5a umfassend untersucht. Für einen allgemeinen Überblick siehe Whaley (1987) und Sim (1993). Tabelle 1 liefert eine Zusammenfassung der bekannten Funktionen von C5a bei einer Erkrankung.
Bei der Wirtsabwehr löst das Komplementsystem aus Plasmaproteinen entzündliche und zelluläre Immunreaktionen auf Reize, wie infektiöse Organismen (Bakterien, Viren, Parasiten), chemische oder physikalische Schädigung, Strahlung oder Neoplasie, aus. Das Komplement wird durch eine komplexe Kaskade von verknüpften proteolytischen Vorgängen aktiviert, die mehrere bioaktive Peptide erzeugen, wobei einige (z. B. Anaphylatoxine C3a und C5a) mit Zellbestandteilen zusammenwirken, wodurch sich entzündliche Prozesse ausbreiten. Die Komplementaktivierung, entweder über den klassischen Weg, nach Antigen-Antikörper-Bindung (Ag/Ab), oder über den alternativen antikörperunabhängigen Weg, endet mit einer abschließenden Abfolge, wobei das Protein C5 durch C5-Konvertase proteolytisch in C5a und C5b gespalten wird. Letzteres ermöglicht den Aufbau eines „Membranangriffskomplexes", der Löcher in Membranen von Zielzellen, wie Bakterien, stanzt, was zu Undichtigkeit, Lyse und Zelltod führt. Die Schritte in der Kaskade sind streng reguliert, um eine schrittweise Verstärkung der Proteolyse durch sequentiell gebildete Proteasen zu verhindern. Wenn diese regulatorischen Mechanismen wirkungslos werden, kann eine verzögerte Aktivierung des Komplements resultieren, wodurch verstärkte Entzündungsreaktionen, wie bei Autoimmunerkrankungen, hervorgerufen werden.
Obwohl die umfassenden Merkmale des Komplementsystems und seiner Aktivierung bekannt sind, bleiben die mechanistischen Einzelheiten schwer verständlich. Ein Hauptmediator und sehr wirksamer Mediator von Entzündungsreaktionen ist das Plasmaglycoprotein C5a, welches mit spezifischen Oberflächenrezeptoren (C5aR) auf Mastzellen, Neutrophilen, Monozyten, Makrophagen, nichtmyeloischen Zellen und Gefäßendothelzellen wechselwirkt (Gerard und Gerard, 1994). C5aR ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor mit sieben Transmembranhelices (Gerard und Gerard, 1991). Dieser Rezeptor ist einer von der Rhodopsin-Superfamilie der GTP-gebundenen Bindungsproteine, unterscheidet sich jedoch von Rhodopsin-Rezeptoren darin, dass der Rezeptor und das G-Protein vor der Aktivierung verbunden werden.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind im gesamten menschlichen Körper verbreitet, umfassend ca. 80% der bekannten Zellrezeptortypen, und vermitteln die Signaltransduktion über die Zellmembran bei einer sehr großen Auswahl von endogenen Liganden. Sie sind an einer mannigfaltigen Reihe von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt, einschließend, aber nicht beschränkt auf jene die mit dem Herz-Kreislauf-System, zentralem und peripherem Nervensystem, Fortpflanzungs-, Stoffwechsel-, Verdauungsstörungen, immunentzündlichen Erkrankungen und Wachstumsstörungen sowie anderen Zellregulations- und Proliferationsstörungen verbunden sind. Agentien, sowohl Agonisten als auch Antagonisten, welche Funktionen von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren selektiv modulieren, haben wichtige therapeutische Anwendungen.

C5a ist einer der wirksamsten bekannten chemotaktischen Stoffe und rekrutiert Neutrophile und Makrophagen zu Verletzungsstellen, verändert ihre Morphologie; führt Degranulation herbei; erhöht Calciummobilisierung, Gefäßdurchlässigkeit (Ödem) und Neutrophilenhaftfähigkeit; kontrahiert glatte Muskulatur; stimuliert die Freisetzung von Entzündungsmediatoren (einschließlich Histamin, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, Prostaglandinen, Leukotrienen) und lysosomalen Enzymen; fördert die Bildung von Sauerstoffradikalen und erhöht die Antikörperproduktion (Gerard und Gerard, 1994). Überexpression oder Herunterregulation von C5a ist in die Pathogenese von immunentzündlichen Zuständen, wie rheumatoider Arthritis, Schocklunge (ARDS), systemischem Lupus erythematodes, Gewebetransplantatabstoßung, ischämischer Herzerkrankung, Reperfusionsschädigung, septischem Schock, Psoriasis, Gingivitis, Atherosklerose, Alzheimer-Krankheit, Lungenverletzung und extrakorporalem Postdialyse-Syndrom, und in viele andere Zustände, einbezogen, wie in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1 Die Funktion von C5a bei einer Erkrankung

Zustand/Erkrankung	C5a-Spiegel	C5aR-Expression	Details
Allergie	++		Herausforderung durch Allergene führt zu nasalen Symptomen und erhöhten C5a-Spiegeln
Alzheimer-Krankheit	++		++ Heraufregulation des Rezeptors in reaktiven Astrozyten, Mikroglia- und Endothelzellen im ZNS, Komplementsystem, aktiviert durch β-Amyloid
ARDS/Schocklunge	++
Behçet-Krankheit	++		Spiegel am höchsten genau vor Befall der Augen
Asthma bronchiale	++
Capillary Leak Syndrome	++
chronische Lungenerkrankung	++		erhöhte C5a-Spiegel in abfließender Lungenflüssigkeit von mechanisch beatmeten Säuglingen mit chronischer Lungenerkrankung
Churg-Strauss-Granulomatose			Überempfindlichkeit von Granulozyten gegen C5a
Mukoviszidose			Bildung von C5a/Auswirkungen auf PMNs
Dekompressionsstress	++		erhöhte C5a-Spiegel beim Sättigungstauchen
Diabetes Typ 1	++		C5a gebildet während Ausbruch; zirkulierende Monozyten bei Patienten mit neu diagnostiziertem Diabetes Typ 1 werden aktiviert
Familiäres Mittelmeerfieber			Fehlen von C5a-Inaktivator
Guillain-Barre-Syndrom	++		CSF-Spiegel erhöht
ischämische Erkrankungszustände/Myokardinfarkt			Migration von Monozyten in die Herzmuskulatur nach Reperfusion. Schädigung verhindert mit sCR1
Kimura-Krankheit			humoraler Faktor reguliert die Antwort von PMNs auf C5a herauf
Multiple Sklerose		++	++ erhöhte Expression des Rezeptors auf schaumigen Makrophagen bei akuter und chronischer MS und faserigen Astrozyten bei chronischer MS
Meningitis			C5a löst experimentelle Meningitis aus; PMN-Akkumulation beim CSF zu beobachten
Pankreatitis	++
Postdialyse-Syndrom	++	-	C5a gebildet über Komplementaktivierung durch Schlauchmaterial, C5aR-Spiegel herabgesetzt auf PMNs und Monozyten im chronischen Zustand
Präeklampsie/HELLP	++		C5a-Spiegel erhöht bei Entbindung
Psoriasis	++		C5a-Spiegel hoch in Schuppen
Reperfusionsschädigung	++		gehemmt durch C5-Antikörper
Retinitis	++		C5a nachgewiesen in Glaskörperflüssigkeit
rheumatoide Arthritis	++		erhöhte Konzentration an C5a gefunden in Synovialflüssigkeit (5-fach) und Plasma (3-fach)
schwere kongenitale Neutropenie		-
Transplantatabstoßung/Gewebeabstoßung	++		monoklonale Antikörper blockieren die Schädigung, zu erkennen bei heterogenem Transplantat; erhöhte Spiegel von C5a zu erkennen im Plasma und Urin von Patienten mit Nierentransplantatabstoßung

Neue Wirkstoffe, welche die entzündungsfördernden Wirkungen von C5a begrenzen, haben das Potential zur Unterdrückung von chronischer Entzündung und der sie begleitenden Schmerzen und Gewebeschädigung. Aus diesen Gründen sind Moleküle, welche die Bindung von C5a an seine Rezeptoren verhindern, zur Behandlung von chronisch entzündlichen Erkrankungen, die durch Komplementaktivierung gesteuert werden, verwendbar. Wesentlich liefern derartige Verbindungen wertvolle neue Erkenntnisse zu Mechanismen der komplementvermittelten Immunität.
In einem anderen Zusammenhang kann auch festgestellt werden, dass C5a-Rezeptoren oder andere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren therapeutische Wirksamkeit bei Zuständen haben, wo entweder der G-Protein-gekoppelte Rezeptor als Erkennungsstelle für die Arzneistoffabgabe verwendet werden kann oder wo das Auslösen derartiger Rezeptoren zur Stimulation einiger Aspekte des menschlichen Immunsystems, z. B. bei der Behandlung von Krebserkrankungen, Virus- und Parasiteninfektionen, verwendet werden kann.
Eine Vorgehensweise bei der Entwicklung von Agonisten oder Antagonisten von C5a ist über die Entwicklung auf Rezeptorbasis, mittels der Kenntnis der dreidimensionalen Strukturen von C5a, seines Rezeptors C5aR und der Wechselwirkungen zwischen ihnen. Die Struktur des Rezeptors ist unbekannt. Die Lösungsstruktur von humanem C5a, einem 74-Aminosäuren-Peptid, das stark kationisch und mit einem Kohlenhydrat von 3 kDa an Asn64 N-glycosyliert ist, wurde ermittelt und ist im Wesentlichen ein 4-Helix-Bündel. Es wurde festgestellt, dass das C-terminale Ende (Reste 65–74, C5a_65–74) unstrukturiert ist (Zuiderweg et al., 1989), und diese Konformationsflexibilität beim C-Terminus hat die Interpretation von Struktur-Funktion-Untersuchungen äußerst erschwert.
C5a hat eine hochgeordnete Kerndomäne (Reste 1–64; C5a₁_₆₄), bestehend aus einem kompakten antiparallelen 4-Helix-Bündel (Reste 4–12, 18–26, 32–39, 46–63), verbunden durch Schleifen (13–17, 27–31, 40–45) und außerdem stabilisiert durch 3 Disulfidbrücken (C21-Cys47, Cys22-Cys54, Cys34-Cys55).
Obwohl die Struktur des C5a-Rezeptors, C5aR, unbekannt ist, wurde die C5a-Bindungsuntereinheit des von humanen Monozyten stammenden C5aR kloniert und als G-Protein-gekoppelter Rezeptor mit Transmembranhelices (Gerard und Gerard, 1991) identifiziert. Die Wechselwirkungen zwischen C5a und C5aR waren Gegenstand vieler Untersuchungen, die, zusammengefasst, nahe legen, dass C5a über einen Zweistellenmechanismus bindet, wobei die N-terminale Kerndomäne von C5a an der Rezeptorerkennung und -bindung beteiligt ist, während der C-Terminus für die Rezeptoraktivierung verantwortlich ist. Dieser Mechanismus ist in 1 schematisch dargestellt. Nur die C-terminale „Effektor"region verfügt über alle Informationen, die für die Signaltransduktion erforderlich sind, und man nimmt an, dass sie in der interhelikalen Rezeptorregion bindet (Siciliano et al., 1994; DeMartino et al., 1995).
Eine N-terminale, interhelikale, positiv geladene Region von C5a ist für Rezeptorerkennung und -bindung verantwortlich und bindet an eine negativ geladene extrazelluläre Domäne von C5aR (Stelle 1), während man glaubt, dass die C-terminale „Effektor"region von C5a an der interhelikalen Region des Rezeptors (Stelle 2) bindet und für die zur Signaltransduktion führende Rezeptoraktivierung verantwortlich ist (Siciliano et al., 1994).
Es wurde entdeckt, dass zahlreiche kurze Peptidderivate des C-Terminus von C5a Agonisten von C5a sind (Kawai et al., 1991; Kawai et al., 1992; Kohl et al., 1993; Drapeau et al., 1993; Ember et al., 1992; Sanderson et al., 1994; Sanderson et al., 1995; Finch et al., 1997; Tempern et al., 1997; Konteatis et al., 1994; DeMartino et al., 1995). Die Strukturen einiger dieser Agonisten sind in nachstehender Tabelle 2 dargestellt (Verbindungen 1–6). Hochmolekulare Polypeptidinhibitoren der Wirkung von C5a an seinem Rezeptor, wie monoklonale Antikörper gegen den C5a-Rezeptor, sind außerdem bekannt (Morgan et al., 1992).
Ein kleines Molekül, N-Methylphenylalanin-lysin-prolin-D-cyclohexylalanin-tryptophan-D-arginin (7, MeF-K-P-dCha-W-r), ist ein Vollantagonist des C5a-Rezeptors, ohne Agonisten-Aktivität bei Testung an isolierten Zellmembranen (Konteatis et al., 1994) oder intakten ganzen Zellen. Dieses Hexapeptid wurde durch Modifizierungen des Agonisten NMe-F-K-P-dCha-L-r entwickelt, wobei das Molekül an Leucinresten mit Substituenten von zunehmender Größe (Cha, F, Nph und W) stufenweise substituiert wurde. Das hatte die Wirkung der Verringerung der Agonisten-Aktivität. Rezeptorbindungsassays, durchgeführt an isolierten Membranen von humanen Neutrophilen, zeigten, dass der Antagonist nur 0,04% relative Affinität von C5a für den Rezeptor besaß (Konteatis et al., 1994). Ein Hauptmerkmal dieser Berichte ist die Definition der Bindung von 7 an den C5a-Rezeptor. Diese Autoren geben an, dass das C-terminale Arginin für Rezeptorbindung und Antagonisten-Aktivität unbedingt notwendig ist. Das ist auch der Fall bei allen Darstellungen der Agonisten-Aktivität von kleinen Peptidanaloga des C-Terminus von C5a. Beim Antagonisten 7 gehen die Autoren jedoch weiter und führen aus, dass „das C-terminale Carboxylat eine wesentliche Voraussetzung für Antagonisten-Aktivität und Rezeptorbindung ist".
Sie schlugen vor, dass das Erfordernis für Carboxylat wahrscheinlich die Folge seiner spezifischen Wechselwirkung mit einem Arginin (Arg 206) in dem Rezeptor ist (DeMartino et al., 1995). Diese Meinung wurde durch eine bedeutende Verringerung der Rezeptoraffinität für ein Analogon von 7 gestützt, wobei das D-Arginin (NH₂-CH(CO₂H)-(CH₂)₃NHC(:NH)NH₂) durch Agmatin (NH₂-CH₂-(CH₂)₃NHC(:NH)NH₂) ersetzt wurde. Zusammengefasst machen DeMartino et al., geltend, dass das D-Arginin über seine Guanidiniumseitenkette mit einer negativ geladenen Aminosäureseitenkette im Rezeptor in Wechselwirkung tritt. Man nimmt außerdem an, dass eine zweite Wechselwirkung zwischen dem negativ geladenen, C-terminalen Carboxylat von 7 und einem positiv geladenen Seitenkettenrest im Rezeptor stattfindet.
Wir haben jetzt die Lösungsstruktur dieses Hexapeptids 7 und mehrerer Analoga bestimmt und haben erstaunlicherweise festgestellt, dass eine terminale Carboxylatgruppe für die Bindung an C5aR oder für die Antagonisten-Aktivität in Wirklichkeit nicht benötigt wird und dass stattdessen ein ungewöhnliches, bisher unerkanntes Strukturmerkmal, eine Turn-Konformation, für Bindung und Aktivität von C5a-Antagonisten oder C5a-Agonisten verantwortlich ist. Das Hexapeptid und mehrere neue, strukturell verwandte Antagonisten wurden sowohl auf ihre Rezeptorbindungsaffinitäten als auch Antagonisten-Aktivität, mittels intakter polymorphonukleärer Zellen (PMN), untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen die bisher unbekannte spezifische Strukturvoraussetzung für die Bindung von C5a-Antagonisten oder C5a-Agonisten an den C5a-Rezeptor, wobei wir annehmen, dass sie an Liganden der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren üblich ist. Unsere Feststellung dieser spezifischen Strukturvoraussetzung hat uns befähigt, verbesserte Spacer des Komplementsystems und von Arzneistoffen auf C5a-Basis zu entwickeln und kleine Moleküle zu entwickeln, die andere G- Protein-gekoppelte Rezeptoren welche wegen ihrer wichtigen Funktionen bei der Signaltransduktion zunehmend als wichtige Arzneistoffangriffsziele erkannt werden, anzielen (G protein-coupled Receptors, IBC Biomedical Library Series, 1996).
Somit haben uns unsere Ergebnisse befähigt, gehinderte strukturelle Matrizen zu entwickeln, welche ermöglichen, dass hydrophobe Reste in einen hydrophoben Bereich zur Wechselwirkung mit einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor, z. B. an Stelle 2 des C5a-Rezeptors, dargestellt in 1, eingebracht werden. Derartige Matrizen oder Gerüste, welche cyclisch oder acyclisch sein können, wurden bisher bei Modulatoren der Aktivität von C5a-Rezeptoren oder anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren nicht vorgeschlagen.
US-A-5,386,011 offenbart cyclische C5a-Agonisten und ihre Verwendung bei der Behandlung von entzündlichen Erkrankungszuständen.
WO-A 95/25957 betrifft ein Assay zum Nachweis von Verbindungen, die als C5a-Antagonisten und lineare C5a-Antagonisten verwendbar sind, und ihre Verwendung als Entzündungshemmer und Immunregulatoren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt cyclische Modulatoren der Aktivität von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zur Verfügung.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen Antagonisten-Aktivität gegen C5aR, weisen keine C5a-Agonisten-Aktivität auf und haben die allgemeine Formel: Struktur II
wobei A für H, Alkyl, Aryl, NH₂, NH-Alkyl, N(Alkyl)₂, NH-Aryl oder NH-Acyl; OH, O-Alkyl, O-Aryl steht;
B ein Alkyl-, Aryl-, Phenyl-, Benzyl-, Naphthyl- oder Indolrest oder die Seitenkette einer D- oder L-Aminosäure, ausgewählt aus Phenylalanin, Homophenylalanin, Tryptophan, Homotryptophan, Tyrosin und Homotyrosin, ist;
C die Seitenkette einer D-, L- oder Homoaminosäure, ausgewählt aus Prolin, Alanin, Leucin, Valin, Isoleucin, Arginin, Histidin, Aspartat, Glutamat, Glutamin, Asparagin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin, Cyclohexylalanin, Norleucin, Tryptophan, Cystein und Methionin, ist;
D die Seitenkette einer D- oder L-Aminosäure, ausgewählt aus Cyclohexylalanin, Homocyclohexylalanin, Leucin, Norleucin, Homoleucin, Homonorleucin und Tryptophan, ist;
E die Seitenkette einer D- oder L-Aminosäure, ausgewählt aus Tryptophan und Homotryptophan, ist;
F die Seitenkette einer D- oder L-Aminosäure, ausgewählt aus Arginin, Homoarginin, Lysin und Homolysin, ist und
X¹ für -(CH₂)_nNH- oder (CH₂)_n-S-, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 4, bevorzugt 2 oder 3, ist, -(CH₂)₂O-, -(CH₂)₃O-, -(CH₂)₃-, -(CH₂)₄- oder -CH₂COCHRNH-, wobei R die Seitenkette einer herkömmlichen oder nicht herkömmlichen Aminosäure ist, steht.
Für die Zwecke dieser Beschreibung soll der Begriff „Alkyl" verwendet werden, um eine geradkettige, verzweigte oder cyclische, substituierte oder unsubstituierte Alkylkette mit 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 4, Kohlenstoffatomen zu bedeuten. Am meisten bevorzugt ist der Alkylrest eine Methylgruppe. Der Begriff „Acyl" soll genommen werden, um einen substituierten oder unsubstituierten Acylrest mit 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 4, Kohlenstoffatomen zu bedeuten. Am meisten bevorzugt ist der Acylrest eine Acetylgruppe. Der Begriff „Aryl" ist zu verstehen, dass er einen substituierten oder unsubstituierten, homocyclischen oder heterocyclischen Arylrest bedeutet, wobei der Ring vorzugsweise 5 oder 6 Glieder besitzt.
Eine „herkömmliche" Aminosäure ist eine L-Aminosäure, ausgewählt aus Glycin, Leucin, Isoleucin, Valin, Alanin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Aspartat, Asparagin, Glutamat, Glutamin, Cystein, Methionin, Arginin, Lysin, Prolin, Serin, Threonin und Histidin.
Eine „nicht herkömmliche" Aminosäure schließt ein, aber ist nicht beschränkt auf, D-Aminosäuren, Homoaminosäuren, N-Alkylaminosäuren, Dehydroaminosäuren, aromatische Aminosäuren (außer Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan), o-, m- oder p-Aminobenzoesäure, Omithin, Citrullin, Norleucin, γ-Glutaminsäure, Aminobuttersäure und α,α-disubstituierte Aminosäuren.
Für die Zwecke dieser Beschreibung ist klar zu verstehen, dass das Wort „umfassend" „einschließend, aber nicht beschränkt auf" bedeutet und dass das Wort „umfasst" eine übereinstimmende Bedeutung hat.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten, zur Verfügung.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können zur oralen oder parenteralen Verwendung formuliert werden, orale Formulierungen werden jedoch bevorzugt. Es wird erwartet, dass die meisten, wenn nicht alle erfindungsgemäßen Verbindungen in Gegenwart von Verdauungsenzymen stabil sein werden. Solch eine Stabilität kann leicht mit den Fachleuten bekannten Routineverfahren getestet werden.
Geeignete Formulierungen zur Verabreichung über einen gewünschten Weg können mit Standardverfahren hergestellt werden, z. B. unter Bezug auf gut bekannte Fachbücher, wie Remington; The Science and Practice of Pharmacy, Bd. II, 1995 (19. Auflage), A. R. Gennaro (Hrsg.), Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania oder Australian Prescription Products Guide, Bd. 1, 1995 (24. Auflage), J. Thomas (Hrsg.), Australian Pharmaceutical Publishing Company Ltd, Victoria, Australien.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Herstellung eines Medikaments, das in einem Verfahren zur Behandlung eines pathologischen Zustands, der durch einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor vermittelt wird, verwendet werden soll, umfassend den Schritt der Verabreichung einer wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung an einen behandlungsbedürftigen Säuger, zur Verfügung.
Bevorzugt ist der durch einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor vermittelte Zustand ein durch einen C5a-Rezeptor vermittelter Zustand und ist stärker bevorzugt mit Überexpression oder Unterregulation von C5a verbunden. Derartige Zustände schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, rheumatoide Arthritis, Schocklunge (ARDS), systemischen Lupus erythematodes, Gewebetransplantatabstoßung, ischämische Herzerkrankung, Reperfusionsschädigung, septischen Schock, Psoriasis, Gingivitis, Atherosklerose, Alzheimer-Krankheit, Lungenverletzung und extrakorporales Postdialyse-Syndrom.
Obwohl die Erfindung in keiner Weise auf die Behandlung eines speziellen Lebewesens oder einer speziellen Spezies beschränkt ist, wird insbesondere in Erwägung gezogen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen bei der medizinischen Behandlung von Menschen verwendbar sind und auch bei der tierärztlichen Behandlung verwendbar sind, insbesondere von Haustieren, wie Katzen und Hunden, Vieh, wie Rindern, Pferden und Schafen, und Zootieren, einschließlich großer Boviden, Feliden, Huftieren und Caniden.
Die Verbindungen können in jeder geeigneten Dosis und über jeden geeigneten Weg verabreicht werden. Die orale Verabreichung wird wegen ihrer größeren Anwendungsfreundlichkeit und Akzeptanz bevorzugt. Die wirksame Dosis wird von der Art des zu behandelnden Zustands und dem Alter, Gewicht und grundlegenden Gesundheitszustand der individuellen Behandlung abhängig sein. Das wird im Ermessen des behandelnden Arztes oder Tierarztes liegen. Geeignete Dosierungsmengen können durch Experimentieren mit Versuch und Irrtum, unter Verwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren, leicht ermittelt werden.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine schematische Darstellung des Zweistellenmodells für die Bindung von C5a an seinen G-Protein-gekoppelten Rezeptor, C5aR. Die schwarzen Balken stellen α-helikale Regionen dar und die offenen Zylinder verkörpern die Transmembranhelices. Die Stellen 1 und 2 sind in der Figur angegeben.
2 zeigt gestapelte graphische Darstellungen von ¹H-NMR-Spektren, wobei die zeitabhängige Abnahme von Amid-NH-Resonanzen bei Trp-Resten (8,10 ppm) und D-Cha-Resten (7,90 ppm) von 7 in d₆-DMSO mit D₂O nach 10 Minuten (Grundlinie) und dann 25, 40, 55, 70, 130, 190, 250, 385 und 520 Minuten dargestellt ist.
3 stellt die C-, N-, O-Gerüstatome der 20 niedrigsten energieminimierten NMR-Strukturen von 7 in d₆-DMSO bei 24°C dar.
4 zeigt eine schematische Darstellung der H-Brückenbindung in der Struktur von 7 aus Protonen-NMR-Spektren in d₆-DMSO.
5a stellt die Rezeptorbindung dar, wie gekennzeichnet durch Hemmung der Bindung von ¹²⁵I-C5a an humane PMNs durch 7 (⦁); 8 (Δ); 9 (
); 12 (o).
5b stellt die C5a-Antagonisten-Wirksamkeit als Hemmung der Freisetzung von Myeloperoxidase (MPO) aus humanen PMNs durch 7 (∎, n = 9) und 12 (
, n = 4) dar.
5c stellt C5aR-Bindung und Antagonisten-Wirksamkeiten von 7, 15 und 17 dar.
A–C zeigen den Einfluss zunehmender Konzentrationen (von oben nach unten) von C5a-Antagonisten unter Hemmung der Freisetzung von Myeloperoxidase in humanen PMNs (n = 3 in A–C).

A: 7 bei 0; 0,1; 0,3; 1,0 μM (von oben nach unten)
B: 15 bei 0; 0,1; 0,03; 0,1 μM (von oben nach unten)
C: 17 bei 0; 0,01; 0,03; 0,1 μM (von oben nach unten)
D: Vergleichsaffinitäten für PMN-C5qR-Rezeptor. Hemmung der Bindung von ¹²⁵I-C5a an humane PMNs durch 7 (oben); 15 (Mitte); 17 (unten).

Alle Werte sind Mittelwerte ± SEM.
6 stellt die Rezeptorbindung von cyclischen C5a-Antagonisten dar, wie veranschaulicht durch Hemmung der Bindung von ¹²⁵I-C5a an humane PMNs (n = 5).
7 zeigt übereinander gelagerte Strukturen von 7 (hell, NMR-Struktur) und 12 (dunkel, computermodellierte Struktur). Die Seitenketten von Phe und Trp werden bei 12 wegen der Übersichtlichkeit weggelassen.
8 stellt die Hemmung einer C5a-induzierten Neutropenie bei Wistar-Ratten durch den cyclischen Antagonisten F-[OPdChaWR], gegeben i.v. zu 1 mg/kg, dar. Ergebnisse dargestellt aus n = 3 in jeder Gruppe, *P < 0,05 im Vergleich zu der nur mit C5a behandelten Gruppe. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM wiedergegeben.
9 zeigt die Hemmung von LPS-induzierter Neutropenie und die durch den cyclischen Antagonisten F-[OPdChaWr] (0,03–10 mg/kg, i.v., 10 min vor Lipopolysaccharid [LPS]) hervorgerufenen Veränderungen des Hämatokrits bei Wistar-Ratten. Abszisse: Zeit nach LPS (1 mg/kg, Injektion i.v.). Ordinate: prozentuale Veränderung des Hämatokritwertes (A) oder der Menge der zirkulierenden polymorphonukleären (PMN) Leukozyten (B) gegenüber Zeit 0.
10 stellt die Hemmung des carrageenaninduzierten (Wistar-)Rattenpfotenödems durch den cyclischen Antagonisten (3D35) AcF-[OPdChaWr] (1 mg/kg Einzeldosis, i.p., gegeben 30 min vor Carrageenan) dar. Ergebnisse dargestellt von 4 Ratten/Gruppe, Mittelwert ± SEM. Ordinate: prozentuale Veränderung des Pfotenvolumens. Abszisse: Zeit (min) nach Carrageenaninjektion.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung wird jetzt nur durch Bezugnahme auf die folgenden generellen Verfahren und Versuchsbeispiele und auf die Figuren beschrieben. Die hierin verwendeten Abkürzungen sind folgendermaßen:

BOP	Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium-hexafluorophosphat
D-Cha	D-Cyclohexylamin
DIPEA	Diisopropylethylamin
DMF	Dimethylformamid
DMSO	Dimethylsulfoxid
HBTU	O-Benzotriazol-N'‚N',N',N'-tetramethyluronium-hexafluorophosphat
LPS	Lipopolysaccharid
PMN	polymorphonukleärer Granulozyt
RMSD	Wurzel aus der mittleren quadratischen Abweichung
RP-HPLC	Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
TFA	Trifluoressigsäure

In der gesamten Beschreibung werden der herkömmliche Ein- und Dreibuchstabencode zur Darstellung der Aminosäuren verwendet.
Allgemeine Verfahren
Geschützte Aminosäuren und Harze wurden von Novabiochem bezogen. TFA, DIPEA und DMF (Qualität für die Peptidsynthese) wurden von Auspep erworben. Alle anderen Stoffe hatten Reagentienqualität, wenn nicht anders angegeben. Trennungen mit präparativer Umkehrphasen-HPLC wurden auf einer C18 Umkehrphasensäule (2,2 × 25 cm) von Vydac durchgeführt, und Trennungen mit analytischer Umkehrphasen-HPLC wurden auf einer C18 Umkehrphasensäule Delta-Pak PrepPak (0,8 × 10 cm) von Waters, unter Verwendung von Gradientengemischen von Lösungsmittel A = Wasser/0,1% TFA und Lösungsmittel B = Wasser 10%/Acetonitril 90%, 0,09% TFA vollzogen. Das Molekulargewicht der Peptide wurde mit Elektrospray-Massenspektrometrie, aufgezeichnet auf einem Dreifachquadrupolmassenspektrometer (PE SCIEX API III), bestimmt, wie an anderer Stelle beschrieben (Haviland et al., 1995). ¹H-NMR-Spektren wurden entweder auf einem Bruker ARX 500 MHz Spektrometer oder einem Varian Unity 400 Spektrometer aufgenommen. Die Protonenverteilungen wurden mit 2D-NMR-Experimenten ermittelt (DFCOSY, TOCSY, NOESY).
Nichtpeptidische Verbindungen wurden mittels herkömmlicher organisch-chemischer Verfahren synthetisiert. Die Verbindungen wurden mit ¹H-NMR-Spektroskopie und mit Massenspektrometrie analysiert.
Peptidsynthese
Einige repräsentative Peptidsynthesen werden jetzt angeführt. Lineare Peptidsequenzen wurden durch manuelle schrittweise Festphasenpeptidsynthese mit HBTU-Aktivierung und In-situ-Neutralisierung mit DIEA aufgebaut. Die Boc-Chemie wurde für den temporären N^α-Schutz von Aminosäuren mit zwei einminütigen Behandlungen mit TFA zur Abspaltung der Boc-Gruppen angewandt. Die Peptide wurden vollständig entschützt und durch Behandlung mit flüssiger HF (10 ml; p-Kresol (1 ml); –5°C; 1–2 h) gespalten. Analytische HPLC (Gradient; 0% B bis 50% B über 40 min): 7, Rt = 32,0 min, [M+H]⁺ (berechnet) = 900,5, [M+H]⁺ (experimentell) = 900,7; 8, Rt = 32,2 min, [M+H]⁺ (berechnet) = 899,6, [M+H]⁺ (experimentell) = 899,7; 9, Rt = 30,0 min, [M+H]⁺ (berechnet) = 900,5, [M+H]⁺ (experimentell) = 900,7; 10, Rt = 23,8 min, [M+H]⁺ (berechnet) = 860,5, [M+H]⁺ (experimentell) = 860,5.
Die Strukturen der Peptide sind in nachstehender Tabelle 4 dargestellt.
a) Synthese von Cyclus 11
Dies ist ein allgemeines Verfahren, verwendet zur Synthese einer Vielzahl von cyclischen Antagonisten, die dieses Patent umfasst. Beispielsweise wurde im Falle von Cyclus 11 sein lineares Vorläuferpeptid über Fmoc-Chemie mittels HBTU/DIEA-Aktivierung an einem Fmoc-D-Arg(Mtr)-Wang-Harz synthetisiert. Die Abspaltung der Fmoc-Gruppen wurde mittels zweier einminütiger Behandlungen mit 50% Piperidin/DMF herbeigeführt. Spaltung und Entschützung mit 95% TFA/2,5% TIPS/2,5% H₂O lieferte das Mtr-geschützte Peptid, das durch RP-HPLC gereinigt wurde. Die Cyclisierung des geschützten, gereinigten Peptids unter Verwendung von 3 Äquiv. BOP und 10 Äquiv. DIEA bei einer Konzentration von 1 mM in DMF unter Rühren für 15 h ergab das cyclisierte Produkt, welches mit 1 M TMSBr in TFA vollständig entschützt wurde. Eine Endreinigung mit RP-HPLC lieferte das gewünschte Peptid in Ausbeuten von 50% für die Cyclisierung. Rt = 37,7 min, [M+H]⁺ (berechnet) = 910,5; [M+H]⁺ (experimentell) = 910,7.
b) Synthese von Cyclus 12
Cyclisierung des gespaltenen und vollständig entschützten Peptids wurde durch Rühren einer 1 mM Lösung in DMF mit 3 Äquiv. BOP und 10 Äquiv. Pyridin als Base für 15 h erreicht. Eine Endreinigung mit RP-HPLC ergab das gewünschte Peptid in Ausbeuten von 22% für die Cyclisierung. Rt = 37,3 min, [M+H]⁺ (berechnet) = 896,5; [M+H]⁺ (experimentell) = 896,5.
NMR-Strukturbestimmung
¹H-NMR-Spektren wurden für Verbindung 7 (3 mg in 750 μl d₆-DMSO, δ 2,50), bezogen auf das Lösungsmittel, auf einem Varian Unity 400 Spektrometer bei 24°C aufgenommen. Zweidimensionale ¹H-NMR-NOESY-Experimente (Relaxationsverzögerung 2,0 s, Mischzeit 50–300 ms), -DFQ-COSY-Experimente und -TOCSY-Experimente (Mischzeit 75 ms) wurden erarbeitet und im phasenempfindlichen Modus aufgenommen. Erfassungszeiten = 0,186 s, spektrale Breite = 5500 Hz, Anzahl der komplexen Punkte (Dimension t₁) = 1024 bei allen Experimenten. Die Daten wurden mit Nullen aufgefüllt und einer Fourier-Transformation auf 1024 tatsächliche Punkte in beiden Dimensionen unterzogen.
Die NMR-Daten wurden unter Verwendung der Software TRIAD (Tripos Assoc.) auf einer Indy-Workstation von Silicon Graphics verarbeitet. 2D-NOE-Kreuzpeaks wurden integriert und als stark (1,8–2,5 Å), mittel (2,3–3,5 Å) und schwach (3,3–5,0 Å) charakterisiert. Die vorläufigen dreidimensionalen Strukturen wurden aus Reihen oberer und unterer Abstandsbeschränkungen mit Diana 2.8 (69 Abstandsbeschränkungen, einschließlich 27 für benachbarte Reste und 6 für weiter entfernte) mit der Strategie der redundanten Diederwinkelbeschränkungen (REDAC-Strategie) berechnet. Obere und untere Abstandsbeschränkungen wurden unter Verwendung von MARDIGRAS genau berechnet. Auf dieser Stufe wurde das Peptid auf mögliche Wasserstoffbrückenbindungen untersucht, und diese wurden als Abstandsbeschränkungen hinzugefügt. Die 50 Diana-Strukturen mit der niedrigsten Energie wurden gehinderter Moleküldynamik (RMD) und Energieminimierung (REM) unterzogen. Anfangs bestand REM aus einer steilsten Verringerung in 50 Schritten, gefolgt von einer Minimierung mit konjugierten Gradienten in 100 Schritten. RMD wurde durch simuliertes Erwärmen der Strukturen auf 300 K über 1 ps, gefolgt von 500 K über 1 ps, vollzogen. Die Temperatur wurde schrittweise über 2 ps auf 300 K und am Ende über 2 ps auf 200 K gesenkt. REM wurde nochmals mit einer steilsten Verringerung in 50 Schritten, einem konjugierten Gradienten in 200 Schritten, gefolgt von einer Powell-Minimierung in 300 Schritten, vorgenommen. Die Endstrukturen wurden untersucht, um eine mittlere paarweise RMS-Differenz der schweren Gerüstatome (N, Cα und C) zu erhalten. 20 der 50 Strukturen hatten einen mittleren RMSD-Wert < 0,5 Å bei allen Gerüstatomen (O, N, C).
Molekülmodellierung
Ein Modell von Cyclus 12, dargestellt in 7, wurde aus der NMR-Struktur von 7 durch Entfernen aller NMR-Grenzen, Ankondensieren des Ornithinseitenkettenamins an das C-terminale Carboxylat von D-Arg unter Bildung eines Amids und Minimieren mittels Powell-Kraftfeld (1000 Iterationen) erstellt. Die modellierte Struktur wurde anschließend über die NMR-Struktur mit einem RMSD-Wert von 0,224 Å überlagert.
Rezeptorbindungsassay
Die Assays wurden mit frischen humanen PMNs, isoliert wie vorher beschrieben (Sanderson et al., 1995), unter Verwendung eines Puffers von 50 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,5% Rinderserumalbumin, 0,1% Bacitracin und 100 μM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) durchgeführt. In den bei 4°C durchgeführten Assays wurden Puffer, unmarkiertes rekombinantes humanes C5a (Sigma) oder Peptid, nach Hunter/Bolton markiertes ¹²⁵I-C5a (ca. 20 pM) (New England Nuclear, MA) und PMNs (0,2 × 106) der Reihe nach auf eine Multiscreen-Assayplatte (HV 0,45) von Millipore mit einem Endvolumen von 200 μl/Vertiefung hinzugegeben. Nach Inkubation für 60 min bei 4°C wurden die Proben filtriert und die Platte wurde einmal mit Puffer gewaschen. Die Filter wurden getrocknet, ausgestanzt und in einem LKB-Gammazähler ausgezählt. Die unspezifische Bindung wurde durch den Einschluss von 1 mM Peptid oder 100 nM C5a, was üblicherweise zu einer totalen Bindung von 10–15% führte, beurteilt.
Die Daten wurden mittels nichtlinearer Regression und Statistik mit Dunnett-Nachtest ausgewertet.
Freisetzung von Myeloperoxidase
Die Zellen wurden isoliert, wie vorher beschrieben (Sanderson et al., 1995), und mit Cytochalasin B (5 μg/ml, 15 min, 37°C) inkubiert. Ranks Balanced Salt Solution mit 15% Gelatine und Peptid wurde auf eine Platte mit 96 Vertiefungen (Gesamtvolumen 100 μl/Vertiefung) gegeben, gefolgt von 25 μl Zellen (4 × 10⁶/ml). Zur Bewertung des Vermögens jedes Peptids zur Antagonisierung von C5a wurden die Zellen 5 min bei 37°C mit jedem Peptid inkubiert, gefolgt von Zusetzen von C5a (100 nM) und weiterer Inkubation für 5 min. Dann wurden 50 μl Natriumphosphat (0,1 M, pH 6,8) in jede Vertiefung hinzugegeben, die Platte wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und 25 μl eines frischen Gemischs aus gleichen Volumina von Dimethoxybenzidin (5,7 mg/ml) und H₂O₂ (0,51%) wurden in jede Vertiefung hinzugefügt. Die Umsetzung wurde bei 10 min durch Zusatz von 2% Natrimazid gestoppt. Die Extinktionen wurden bei 450 nm in einem Bioscan 450 Plattenlesegerät gemessen, auf die Kontrollwerte (ohne Peptid) korrigiert und durch nichtlineare Regression ausgewertet.
In vivo-Versuche der entzündungshemmenden Wirkung
Die folgenden, bekannten In vivo-Versuchssysteme können zur Bewertung der entzündungshemmenden Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden. Alle Versuchsdaten werden mittels nichtlinearer Regressionsanalyse und Student-t-Test, Varianzanalyse, mit p < 0,05 als Schwellenwert der Signifikanz, ausgewertet.
(a) Carrageenan-Pfotenödem
Narkotisierten (i.p. Ketamin und Xylazin) Wistar-Ratten (150–200 g) oder Mäusen wurde sterilisierte Luft (20 ml Tag 1, 10 ml Tag 4) in das Subkutangewebe des Rückens injiziert. Die Höhle kann nach 6 Tagen verwendet werden, wonach Carrageenan (2 ml, 1% w/w in 0,9%iger Kochsalzlösung) in die Lufttasche injiziert wurde und das Exsudat nach 10 h gesammelt wurde. Die Testverbindungen werden nach Tag 6 täglich verabreicht und ihre entzündungshemmenden Wirkungen durch Differentialzählung der Zellen in dem Lufttaschenexsudat geprüft. Die Tiere wurden zu entsprechenden Zeiten nach der Injektion getötet und 2 ml 0,9%ige Kochsalzlösung wurden zur Spülung der Höhle verwendet, die Spülflüssigkeiten wurden in ein heparinisiertes Röhrchen überführt und die Zellen wurden mit einem Hämozytometer und einem mit Diff-Quik gefärbten, zytozentrifugierten Präparat gezählt.
Alternativ wurde ein übliches Carrageenan-Pfotenödem bei Wistar-Ratten durch Verabreichung einer Fußinjektion von Carrageenan zur Auslösung von Ödem, das nach 2 h sichtbar und in 4 h maximiert ist, ausgebildet. Die Testverbindungen werden 40 min vor dem Entzündungsauslöser gegeben und durch Microcalipermessungen der Pfoten nach 2 und 4 h bewertet. Siehe D. P. Fairlie et al. (1987). Siehe auch Walker und Whitehouse (1978).
(b) Adjuvans-Arthritis
Die Adjuvans-Arthritis wurde bei Ratten (3 Stämme) entweder mikrobiell (Injektion von durch Hitze abgetötetem Mycobacterium tuberculosis) oder chemisch (mit Avridin) durch Inokulation mit dem arthritogenen Adjuvans, gemeinsam mit öligen Trägern verabreicht, (Freund-Adjuvantien) in der Schwanzbasis ausgelöst. (Siehe M. W. Whitehouse, Handbook of Animal Models for the Rheumatic Diseases, Hrsg. R. A. Greenwald, H. S. Diamond, Bd. 1, S. 3–16, CRC Press).
Innerhalb von 13 Tagen manifestiert sich die Adjuvans-Arthritis durch örtliche Entzündung und Ulzeration am Schwanz, starkes Anschwellen aller vier Pfoten, entzündliche Läsionen an Pfoten und Ohren, Gewichtsabnahme und Fieber. Diese Symptome, die denen einer entzündlichen Erkrankung bei Menschen ähneln, (Winter und Nuss, 1966) können durch Mittel, wie Indomethacin oder Cyclosporin, welche auch günstige Wirkungen beim Menschen zeigen, gelindert werden (z. B. Ward und Cloud, 1966). Ohne Arzneistoffbehandlung am Tag 14 hatten arthritische Ratten Hypertrophie der Pfoten, vermindertes Albumin, aber erhöhte Akute-Phase-Proteine im Serum und einen herabgesetzten Leberstoffwechsel von Xenobiotika, wie durch verlängerte barbituratinduzierte Schlafzeiten gekennzeichnet.
Zur Beurteilung der Aktivität wurden die Verbindungen über 4 Tage oral (≤ 10 mg/kg/Tag) oder i.p. von den Tagen 10–13 an verabreicht, gefolgt von Inokulation mit Arthritisauslöser (Tag 0). Die Entzündung war bei den Hinter- oder Vorderpfoten entweder nicht sichtbar oder erheblich vermindert, wie durch Microcalipermessungen der Pfotendicke und des Schwanzvolumens sowie durch oberflächliche Betrachtung der entzündlichen Läsionen beurteilt. Die Tiere werden am Tag 18 durch Halswirbeldislokation getötet, außer wenn die Arthritiszeichen fehlen, wonach die Dauer der Beobachtungen mit spezieller Genehmigung durch die Ethikkommissionen fortgeführt wird. Die Versuche werden gestaffelt, um den Durchlauf zu maximieren und frühe Vergleiche zwischen Verbindungen zu ermöglichen. Dieser Routineversuch ist als Nachweis von Entzündungshemmern zur Verwendung bei Menschen gut akzeptiert.
Beispiel 2 NMR-Struktur eines C5a-Antagonisten
Wir verwendeten zweidimensionale kernmagnetische Resonanzspektroskopie zur Ermittlung der dreidimensionalen Struktur von 7 und stellten fest obwohl es keine erkennbare Struktur in Wasser gibt, dass es einen Nachweis einer stabilen γ-Turn-Struktur in Dimethylsulfoxid gibt.
Das 1D-¹H-NMR-Spektrum von Peptid 7 in d₆-DMSO bei 24°C zeigt 4 verschiedene Resonanzen für Amid-NH-Protonen, wie in Tabelle 3 zusammengefasst. Um ihre mögliche Beteiligung an intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen festzustellen, wurde ein Deuteriumaustauschversuch durch Zugeben eines 10-fachen Überschusses an D₂O zu der Lösung durchgeführt. Zwei der Amid-NH-Dubletts verschwanden sofort, zusammen mit Resonanzen, die den N-terminalen Methylaminprotonen zuordenbar sind. Die anderen beiden Amid-NH-Resonanzen sowie eine breite Resonanz bei ca. 8,05 ppm blieben jedoch bis zu 6,5 Stunden bestehen (2). Diese drei langsam austauschenden Protonen werden den Amid-NH von Trp und D-Cha und dem Seitenkettenamin von Lys zugeordnet, das langsame Austauschverhalten ist typisch für Wasserstoffbrückenbindung. Die Aminzuordnung wurde aus dem TOCSY-Spektrum ermittelt, wo Kreuzpeaks zwischen dem protonierten Amin und den Protonen von ε-CH₂, δ-CH₂ und γ-CH₂ beobachtet wurden. Eine Untersuchung der Temperaturabhängigkeit (20–60°C) der chemischen Verschiebungen der Amid-NH (Δδ/T = 2,5 ppb/Grad), dCha-NH; 6 ppb/Grad, Trp-NH; 6,5 ppb, Lys-NH; 8,7 ppb, d-Arg-NH) bestätigte eindeutig nur die Beteiligung von dCha-NH an der intramolekularen Wasserstoffbrückenbindung.
Eine Reihe von 2D-¹H-NMR-Spektren wurde für 7 bei 24°C in d₆-DMSO zur Ermittlung der dreidimensionalen Struktur gemessen. TOCSY- und DFQ-COSY-Experimente wurden zum Nachweis der Restearten verwendet, während sequentielle Zuordnungen aus der Auswertung von NOESY-Daten vorgenommen wurden. Aus einer Reihe von 100 aus NOESY-Daten erzeugten Strukturen wurden 50 der Strukturen mit der niedrigsten Energie gehinderter Moleküldynamik (200–500 K) unterzogen und energieminimiert. Eine Reihe von 20 berechneten Strukturen mit einer Wurzel aus der mittleren quadratischen Abweichung (RMSD) < 0,5 Å (Gerüstatome) wird in 3 übereinander gelagert und stellt eindeutig eine Drehungskonformation dar.
In Kombination legen die NMR-Daten der Hinderung, ³J_NH-CαH-Werte, Daten des Deuteriumaustauschs und der Temperaturabhängigkeit eine ungewöhnliche Turn-Struktur für Hexapeptid 7 fest, welche durch bis zu drei Wasserstoffbrückenbindungen gehindert ist, wie in 4 dargestellt. Die Anhaltspunkte für eine intramolekulare Wasserstoffbrückenbindung von dCha-NH....OC-Lys (2,72 Å, Winkel von N-H..O 157°, Winkel von C=O...H 84°), wobei ein 7-gliedriger Ring gebildet wird, der einen inversen γ-Turn festlegt, sind sehr stark. Der Winkel von dCha-NH-O-Trp-NH beträgt 56,4°. Die Daten des Deuteriumaustauschs und die NMR-Daten der Hinderung weisen zusammen auf eine zweite intramolekulare Wasserstoffbrückenbindung Trp-H....OC-Lys (3,31 Å, Winkel von N-H...O 159°, Winkel von CO...H 137,3°) hin, wobei ein 10-gliedriger Ring gebildet wird, der für einen β-Turn typisch ist. Die Winkel ϕ und ψ (ϕ₂ = –58,4°, ψ₂ = 62,0°; ϕ = 96,6°, ψ₃ = 16,6°) entsprechen am genauesten eines β-Turns des Typs II (Bandekar, 1993; Hutchinson und Thornton, 1994), welche durch Vorliegen des γ-Turns gänzlich innerhalb der β-Drehung verdreht ist.
Unseres Wissens ist dies das erste Beispiel einer intramolekularen Wasserstoffbrückenbindung zwischen Resten innerhalb eines β-Turns, obwohl es viele Beispiele von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen einem Rest innerhalb des „10-gliedrigen Rings" einer β-Drehung und einem Rest außerhalb davon gibt (Bandekar, 1993). Eine dritte Wasserstoffbrückenbindung (2,76 Å, Winkel von N-H...O 160,3°) zwischen dem Seitenkettenamin von Lys und dem C-terminalen Carboxylat wird durch die NMR-Daten der Hinderung, durch langsamen NH/ND-Austausch und durch Nachweis eines schwachen NOE zwischen Lys-NH...Trp-αCH2 nahegelegt. Das kann das Molekül weiter in die beobachtete Turn-Konformation zwingen. Solch eine Ionenpaarbildung ist in dipolaren aprotischen Lösungsmitteln, wie Dimethylsulfoxid, häufig und kann auch in einer hydrophoben Proteinumgebung relevant sein.
NMR-Lösungsstrukturen wurden außerdem bei mehreren der cyclischen Antagonisten ermittelt, beschrieben in den folgenden Beispielen, und zeigen, dass in jedem Fall der β-Turn des Typs II durch die cyclische Struktur erhalten und stabilisiert wird.
Die einschränkenden β- und γ-Turns, welche für das lineare Peptid 7 vorgeschlagen werden, haben Entsprechungen in cyclischen Peptiden. Wir haben vorher überlappende β- und γ-Turns in einem cyclischen Octapeptid von Ascidiacyclamid festgestellt (Abbenante et al., 1996). Kombinationen eines β- und γ-Turns wurden auch in den Gerüsten von cyclischen Penta- und Hexapeptiden, insbesondere jenen mit alternierenden D- und L-Aminosäuren, gefunden (Marraud und Aubry, 1996; Fairly et al., 1995; Kessler et al., 1995; Stradley et al., 1990). Beispielsweise wurden ein β-Turn des Typs II und ein inverser γ-Turn bei den cyclischen Antagonisten c-(D-Glu-Ala-D-allo-Ile-Leu-D-Trp) (Ihara et al., 1991; Coles et al., 1993; Ihara et al., 1992; Bean et al., 1994) und c-(D-Asp-Pro-D-Val-Leu-D-Trp) (Bean et al., 1994) für Endothelin-Rezeptoren und bei Mitgliedern der Rhodopsin-Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren mit sieben Transmembrandomänen (X.-M. Cheng et al., 1994) nachgewiesen. Im letzteren Fall bildet sich, wie bei 7, ein inverser γ-Turn zwischen den Resten (Asp-CO....Val-NH, Lys-CO....dCha-NH), die das Prolin flankieren, aus.
Beispiel 3 Struktur-Aktivität-Beziehungen in vitro
Wir untersuchten auch die Rezeptorbindung und Antagonisten-Aktivität des Hexapeptids 7 zum Vergleich mit unseren neuen Verbindungen. Der frühere Bericht von Konteatis et al. (1994) betraf das Vermögen von 7 zum Konkurrieren mit der Bindung von C5a an Rezeptoren in isolierten PMN-Membranen (IC₅₀ 70 nM), was nicht unbedingt physiologisch relevant ist. Wir untersuchten die Konkurrenz zwischen 7 und C5a unter Verwendung intakter PMN-Zellen und stellten fest, dass 7, unter diesen Bedingungen, mit einer viel geringeren Rezeptoraffinität von IC₅₀ von 1,8 μM bindet. Wir bestätigten, dass 7 ein Vollantagonist ohne Agonisten-Wirkung ist. Diese Ergebnisse sind in 5a und Tabelle 4 zusammengefasst. Die relative Affinität (Verhältnis) von 7 für den C5aR bei intakten PMNs in unseren Assays ähnelte der, von der bei isolierten PMN-Membranen vorher berichtet wurde.
Wir haben außerdem festgestellt, dass 7 Antagonisten-Aktivität gegen sowohl C5a (5b) als auch ein C-terminales Agonist-Decapeptidanalogon 4 (YSFKPMPLaR) (Finch et al., 1997) des C-Terminus C5a_65–74 aufweist, was nahelegt, dass es an Stelle 2 des Rezeptors wirkt. Die Verbindungen 7 und 4 haben eine ähnliche μM Affinität für den Rezeptor C5aR auf intakten polymorphonukleären Leukozyten, wie in Tabelle 4 dargestellt.
Eine neue Entdeckung aus den Daten in Tabelle 4 ist die lineare Korrelation zwischen dem Logarithmus der Bindungsaffinitäten und dem Logarithmus der Antagonisten-Wirksamkeiten bei diesen Antagonisten an Stelle 2 (Verbindungen 7–12, Tabelle 4). Die Bedeutung dieses linearen Zusammenhangs ist, da Rezeptoraffinität und Antagonisten-Aktivität direkt proportional sind, dass das experimentell einfachere Verfahren der Messung der Rezeptorbindung zur Bewertung der Antagonisten-Aktivität bei derartigen kleinen Verbindungen verwendet werden kann, mit der Maßgabe, dass es keinen Nachweis der Agonisten-Aktivität gibt.
Es wurde vorher vorgeschlagen, dass der C-Terminus von C5a und von Agonist-Peptiden für die Aktivität unbedingt notwendig ist, wegen seiner Wechselwirkung mit positiv geladenem Arg206 des Rezeptors (DeMartino et al., 1995). Wir bestätigen hier, dass das C-terminale Carboxylat tatsächlich entscheidend für die Aktivität (8 gegen 7) ist, fragten uns aber, ob die Herkunft dieser Wirkung auf Wasserstoffbrückenbindung zwischen dem Carboxylatanion und der positiv geladenen Aminseitenkette von Lysin zurückzuführen sein könnte. Die Umwandlung des Amids (8) verringert zweifellos sowohl Rezeptoraffinität als auch Antagonisten-Aktivität um etwa das 5-Fache. Der Wechsel der Chiralität des Arg-Cα (9 gegen 7) bewirkt eine ähnliche Verringerung der Aktivität, und das Ersetzen von dCha durch den weniger sperrigen Leu-Rest (10) ist ebenfalls nachteilig für die Rezeptorbindung. Jedoch wird die Wirksamkeit bei den cyclischen Verbindungen 11 und 12 wiederhergestellt, wobei eine Amidbindung an dem C-Terminus zugelassen wird, übereinstimmend mit der vorstehenden Strukturauswertung, dass der Vorteil des Carboxylats in 7 mit einer intramolekularen Wasserstoffbrückenbindung in Zusammenhang stehen kann. Der Austausch dieser Wasserstoffbrückenbindung in 7 gegen eine kovalente Amidbindung in 11 und 12 stabilisiert die Drehungskonformation wirksamer.
5c vergleicht die C5aR-Bindung und Antagonisten-Wirksamkeit in vitro auf humanen PMNs bei den Verbindungen 15 und 17 mit denen bei Verbindung 7. Sowohl 15 als auch 17 sind wirksame Inhibitoren der Wirkung von C5a und der Bindung von ¹²⁵I-C5a an seinen Rezeptor bei nM Konzentrationen (z. B. 4, K_b = 1,4 nM). Ihr cyclischer Charakter und die Acetylierung am N-terminalen Phenylalanin schützen beide gegen den proteolytischen Abbau, dem man bei Peptiden normalerweise begegnet, was derartige cyclische Verbindungen als Arzneistoffkandidaten geeigneter als acyclische Pepitide macht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5 Rezeptorbindung und Antagonisten-Aktivität von cyclischen Molekülen
Bezieht sich auf die Stereochemie der Arg-Seitenkette.
Beispiel 4 Cyclische Antagonisten von C5a
Einige Beispiele dieser cyclischen Antagonisten und ihrer ersichtlichen Rezeptorbindungsaffinitäten und Antagonisten-Wirksamkeiten sind in den Tabellen 4, 5 und 6 sowie in den 5 und 6 angegeben. In den Tabellen wird der Einbuchstabencode für Aminosäuren verwendet.

^a pD₂/IC₅₀; Konzentration des Peptids, die zu einer 50%igen Hemmung der Bindung von [¹²⁵I]C5a an intakte PMNs führt. Der IC₅₀-Wert ist der Antilogarithmus des Mittelwertes pD₂.
^b pD₂/IC₅₀; Konzentration des Peptids, die eine 50%ige Hemmung des Vermögens von C5a (100 nM) zur Bewirkung der Freisetzung von MPO aus PMNs zur Folge hat
X = (CH₂)-NH₂
X² = (CH₂)₂-NH₂

Die pD₂-Werte sind als Mittelwert ± SE wiedergegeben.

n bedeutet die Anzahl der durchgeführten Versuche
* Signifikante Änderung der Affinität/Wirksamkeit im Vergleich zu NMeFKPdChaWr (p < 0,05)
# gibt die Isomernummer an

Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass:

(1) die cyclischen Moleküle eine höhere offensichtliche Rezeptoraffinität aufweisen und wirksamere Antagonisten als acyclische (lineare) Peptide sein können,
(2) dass eines der beiden möglichen cyclischen Diastereomere bei der Bindung an den C5a-Rezeptor durchweg bevorzugt wird, und es ist erstaunlicherweise die entgegengesetzte Stereochemie (L-Arginin) zu der, die bei den linearen Verbindungen (D-Arginin) begünstigt ist,
(3) die Cyclen eine optimale Ringgröße für die Rezeptorbindung aufweisen,
(4) es einen pseudolinearen Zusammenhang zwischen log(Antagonisten-Wirksamkeit) und log(Rezeptoraffinität) gibt.

Die Tabellen 5 und 6 führen die C5a-Rezeptoraffinitäten einiger Beispiele von cyclischen Antagonisten von C5a und ihr Vermögen zur Bindung an humane PMNs und zur Hemmung der Bindung von C5a an humane PMNs auf, wie in 6 dargestellt. Überraschenderweise zeigen diese Daten, dass das L-Arginin gegenüber dem D-Arginin bevorzugt wird, im Gegensatz zu der linearen Verbindung 7, wobei das D-Arginin die höhere Affinität für den Rezeptor als das L-Arginin gewährt. Die Daten zeigen auch, dass die Größe des Makrocyclus optimal ist, wenn n = 2 oder 3, der kleinere Cyclus, wobei n = 1, und der größere Cyclus, wobei n = 4, sind eindeutig weniger wirksam. Dieses Erfordernis eines stark gehinderten Cyclus ergibt sich wahrscheinlich aus der Notwendigkeit einer korrekten Lage der gebundenen Seitenkettenreste von z. B. Trp, D-Cha, Arg und Phe zur Wechselwirkung mit dem Rezeptor.
Beispiel 5 Computermodellierung von Antagonisten-Strukturen
7 vergleicht die computermodellierte Struktur des cyclischen Antagonisten 12 mit der NMR-Lösungsstruktur für den acyclischen Antagonisten 7. Diese Gerüststrukturen sind auffallend ähnlich und legen sehr nahe, dass die Rezeptorbindungskonformationen dieser Moleküle die gleiche Turn-Struktur umfassen. Verbindung 12, ein wirksamerer Antagonist als 11, hat auch einen kürzeren Linker, welcher die Drehung strafft und den Konformationsraum, der an den Hauptseitenketten von Phe, dCha, Trp und Arg erreichbar ist, leicht verändert. Die Konformationseinschränkungen die dem Hexapeptidderivat 12 durch den Cyclus auferlegt sind, sind für eine Erhöhung der Rezeptorbindungsaffinität gegenüber dem konformationsflexiblen Decapeptid-C-Terminus von C5a von ≥ 10⁴ verantwortlich (1, Tabelle 2).
Es besteht eine Korrelation zwischen Bindungsaffinitäten und Antagonisten-Wirksamkeit bei den Antagonisten an Stelle 2 (Verbindungen 7–12, Tabelle 2). Es hat daher den Anschein, dass die Antagonisten-Wirksamkeit nur von den Veränderungen, die an Stelle 2 stattfinden, abhängig ist. Ohne an einen vorgeschlagenen Mechanismus gebunden sein zu wollen, nehmen wir an, dass dies wegen des Mechanismus des Antagonismus sein kann, der mit der Konformationsänderung zu einer Drehungskonformation, die durch 7 an Stelle 2 des Rezeptors bewirkt wird, in Zusammenhang steht.
Beispiel 6 Charakterisierung von C5aRs auf verschiedenen Zellen
Gegenwärtig gibt es keine Informationen über unterschiedliche Typen von C5aRs. Wir haben bisher die markanten Unterschiede in der Ansprechbarkeit verschiedener Zellen mit funktionellen C5aRs auf Agonisten gezeigt (Sanderson et al., 1994, 1995; Finch et al., 1997) und wir können jetzt durch Untersuchung der Wirkungsstärke und Wirksamkeit von selektiven Agonisten und Antagonisten bezüglich humanem rekombinanten C5a mehr Daten liefern. Bei Agonisten kann die Gewebe- oder Zellselektivität funktionell unterschiedliche Rezeptoren deutlich machen. Bindungsassays mit humanen PMNs, U937-Zellen oder zirkulierenden Monozyten werden zur Bestimmung der Affinitäten für C5aRs verwendet. Die Selektivität für unterschiedliche C5aRs wird durch einen unterschiedlichen Antagonismus bestimmt. Dieses kombinierte Verfahren ermöglicht die pharmakologische Charakterisierung neuer Agonisten oder Antagonisten und kann zu einer möglichen funktionellen Klassifizierung von C5aRs auf verschiedenen Zellen führen.
Beispiel 7(a) Neutropenie und C5a-Antagonismus in vivo
Die Verbindungen wurden im akuten Modell einer C5a-induzierten Neutropenie bewertet. Die vorübergehende Neutropenie maximiert sich 5 min nach i.v. C5a und ist tiefgreifend, wobei bei wirksamen Dosen von C5a > 90% der zirkulierenden Neutrophilen aus dem Blutkreislauf verschwinden, wie in 8 dargestellt. Die Neutropenie ist auf eine vorübergehende Adhäsion von zirkulierenden Neutrophilen an das Gefäßendothel zurückzuführen. Die vorläufigen Daten zeigen, dass durch i.v. C5a ausgelöste Neutropenie durch einen C5a-Antagonisten blockiert wird. Beispielsweise hemmt F-[OPdChaWR] (1 mg/kg), gegeben vor 2 μg C5a i.v., C5a-induzierte Neutropenie in vivo (8).
Beispiel 7 (b) Hemmung von Lipopolysaccharid-induzierten Wirkungen durch C5a-Antagonisten
LPS löst schnelle Neutropenie bei Ratten aus. Wenn diese Wirkung von LPS durch C5a-Antagonisten blockiert wird, dann kann C5a bei akuten Wirkungen von LPS von großer Bedeutung sein und die in 9 dargestellten Ergebnisse stimmten mit dieser Hypothese überein. C5a-Antagonisten wurden 10 min vor Herausforderung durch LPS injiziert (Bolus i.v.). Die Ratten wurden narkotisiert und Blutproben (0,3 ml) wurden für Messungen der PMNs entnommen. Die PMNs werden isoliert und quantifiziert. Die vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass F-[OPdChaWR] (1 mg/kg), gegeben vor i.v. LPS, Neutropenie hemmt.
Die Ergebnisse deuten außerdem daraufhin, dass der C5a-Antagonist die durch LPS bewirkte Erhöhung des Hämatokrits blockiert, was zeigt, dass das durch LPS verursachte Entweichen von Serum aus Gefäßen ebenfalls gehemmt wird.
Diese Ergebnisse zeigen, dass C5a-Rezeptor-Antagonisten, wie jene in dieser Erfindung beschriebenen, therapeutischen Nutzen bei Individuen mit Septikämie haben können. Das Vermögen zur Blockierung der Adhäsion von PMNs an das Gefäßendothel und zur Hemmung der Gefäßundichtigkeit nach LPS, wie durch die Verringerung der Hämatokritwerte ersichtlich, kennzeichnet starke entzündungshemmende Wirkungen dieser Verbindungen gegen entzündungsfördernde Reize, die das Komplementsystem aktivieren, wie Endotoxin oder LPS.
Beispiel 8 In-vivo-Aktivität von cyclischen C5a-Antagonisten
Die vorläufigen Versuche bei Ratten haben deutlich gemacht, dass die in Tabelle 5 zusammengefassten cyclischen Antagonisten bei weniger als 20 mg/kg als Entzündungshemmer bei der Unterdrückung der Entstehung von entweder carrageenaninduziertem Pfotenödem oder adjuvansinduzierter Polyarthritis wirksam sind. Die maximal wirksamen Dosierungen selbst für mäßig wirksame Antagonisten betragen 10 mg/kg oder weniger, gegeben i.p. oder p.o. Viele der gegenwärtig bei Menschen verwendeten entzündungshemmenden Arzneistoffe wurden anfangs in derartigen Versuchen bewertet und zeigten Aktivität in diesen Rattenmodellen der Entzündung. Diese vorläufigen Anzeichen der Wirksamkeit in vivo zeigen, dass C5a-Antagonisten therapeutisches Potential bei entzündlichen Zuständen beim Menschen besitzen.
Unter Verwendung des Carrageenan-Rattenpfotenödem-Tests entdeckten wir, dass eine Verbindung, AcF-[O-P-dCha-W-r], die in vitro als C5a-Antagonist in PMNs 100-mal weniger aktiv als 17 ist, eine gewisse In vivo-Aktivität bei Ratten, denen 1 mg/kg der Verbindung i.p. 30 min vor der Carrageenaninjektion gegeben wurde, aufweist. Die Pfotenschwellung wurde über bis zu 4,5 h gemessen. Die Ergebnisse, dargestellt in 10, legen nahe, dass selbst dieser schwache C5a-Antagonist die Ausbildung des Ödems nach 180 und 270 min erheblich hemmt. Diese entzündungshemmende Wirkung legt nahe, dass C5a-Rezeptor-Antagonisten, wie jene in dieser Erfindung beschriebenen, therapeutische Wirksamkeit bei Erkrankungen, die mit Gefäßundichtigkeit nach Entzündungsreizen verbunden sind, haben können.
In den letzten Jahren wurden viele Versuche zur Nachahmung von β- und γ-Turn-Peptide, die bioaktive Proteinoberflächen verkörpern, durchgeführt, was zu bemerkenswerten Mimetika für RGD-Peptide (Arginin-Glycin-Aspartat), Somatostatin- und Opioidpeptide führte, um einige durch Struktur-Aktivität-Beziehungen abgeleitete zu nennen, (siehe z. B. Marraud und Aubry, 1996; Fairlie et al., 1995). Die meisten dieser Beispiele bewahren eine Turn-Struktur durch Cyclisierung des Peptids. Andererseits gibt es relativ wenige kurze acyclische Peptide, bei denen eine wirkliche Turn-Struktur in Lösung festgestellt wurde (Dyson et al., 1988; Rizo und Gierasch, 1992; Pràcheur et al., 1994). Es wird gewöhnlich argumentiert, dass kurze acyclische Peptide eine Myriade von Lösungsstrukturen annehmen, die kleine Bestände an Turn-Strukturen, die für die Bioaktivität verantwortlich sind, einschließen können.
Diese Erfindung beschreibt eine Reihe von konformationsgehinderten Molekülen welche Turns enthalten, die zur Bindung an den/die gleichen G-Protein-gekoppelten Rezeptor(en) von humanen Zellen, die durch humanes C5a angezielt werden, präorganisiert sind. Die Erfindung ist auf andere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren anwendbar.
Das Hauptmerkmal der erfindungsgemäßen Verbindungen ist die präorganisierte Anordnung, welche mindestens drei hydrophobe Reste und einen geladenen Rest in einen angrenzenden Zwischenraum einbringt, wodurch ein hydrophober Oberflächen"fleck" erzeugt wird. Diese Ergebnisse ermöglichen die Entwicklung von sogar wirksameren konformationsgehinderten, aus kleinen Molekülen bestehenden Antagonisten von C5a.
Angesichts des vorstehend erwähnten Standes der Technik war es überraschend festzustellen, dass ein C-terminales Carboxylat in unseren Verbindungen nicht erforderlich war, um eine gute Rezeptorbindung oder Antagonisten-Aktivität zu erzielen. Die cyclischen Antagonisten besitzen eine Amidbindung an der „C-terminalen" Argininposition. Der Austausch des Carboxylats in 7 gegen eine kovalente Amidbindung stabilisiert wirksam die benötigte Drehungskonformation.
Cyclische und nichtpeptidische Antagonisten haben als Arzneistoffe einige wesentliche Vorteile gegenüber Peptiden. Die in dieser Erfindung beschriebenen Cyclen sind stabil gegen proteolytischen Abbau über mindestens einige Stunden bei 37°C im menschlichen Blut oder Plasma oder in den Magensäften von Mensch oder Ratte oder in Gegenwart von Verdauungsenzymen, wie Pepsin, Trypsin und Chymotrypsin. Dagegen werden kurze Peptide, die aus L-Aminosäuren bestehen, innerhalb einiger Minuten unter diesen Bedingungen schnell zu ihren Aminosäurekomponenten abgebaut. Ein zweiter Vorteil liegt in den gehinderten einzigen Konformationen, die von den cyclischen und nichtpeptidischen Molekülen angenommen werden, während acyclische oder lineare Peptide flexibel genug sind, um verschiedene Strukturen in Lösung außer der benötigten Rezeptorbindungsstruktur anzunehmen. Drittens sind cyclische und nichtpeptidische Verbindungen, wie jene in dieser Erfindung beschriebenen, als Arzneistoffe gewöhnlich stärker lipidlöslich und besser pharmakologisch bioverfügbar als Peptide, welche selten oral verabreicht werden können. Viertens sind die Plasmahalbwertszeiten cyclischer oder nichtpeptidischer Moleküle normalerweise länger als die von Peptiden.
Die hierin zitierten Quellenangaben sind auf den folgenden Seiten aufgeführt.
QUELLENVERZEICHNIS

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Claims

Verbindung mit Antagonisten-Aktivität gegen den C5a-Rezeptor und ohne C5a-Agonisten-Aktivität mit der allgemeinen Formel: Struktur II
wobei A für H, Alkyl, Aryl, NH₂, NH-Alkyl, N(Alkyl)₂, NH-Aryl oder NH-Acyl steht; B ein Alkyl-, Aryl-, Phenyl-, Benzyl-, Naphthyl- oder Indolrest oder die Seitenkette einer D- oder L-Aminosäure ist, ausgewählt aus Phenylalanin, Homophenylalanin, Tryptophan, Homotryptophan, Tyrosin und Homotyrosin; C die Seitenkette einer D-, L- oder Homoaminosäure ist, ausgewählt aus Prolin, Alanin, Leucin, Valin, Isoleucin, Arginin, Histidin, Aspartat, Glutamat, Glutamin, Asparagin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin, Cyclohexylalanin, Norleucin, Tryptophan, Cystein und Methionin; D die Seitenkette einer D- oder L-Aminosäure ist, ausgewählt aus Cyclohexylalanin, Homocyclohexylalanin, Leucin, Norleucin, Homoleucin, Homonorleucin und Tryptophan; E die Seitenkette einer D- oder L-Aminosäure ist, ausgewählt aus Tryptophan und Homotryptophan; F die Seitenkette einer D- oder L-Aminosäure ist, ausgewählt aus Arginin, Homoarginin, Lysin und Homolysin, wobei X¹ für -(CH₂)_nNH- oder (CH₂)_n-S-, -(CH₂)₂O-, -(CH₂)₃O-, -(CH₂)₃-, -(CH₂)₄- oder -CH₂COCHRNH- steht, wobei R die Seitenkette einer herkömmlichen oder nicht herkömmlichen Aminosäure ist, „Alkyl" eine geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, „Aryl" einen homocyclischen oder heterocyclischen Rest bedeutet, bei dem der Ring 5 oder 6 Kohlenstoffatome aufweist, und „Acyl" einen Acylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet.
Verbindung nach Anspruch 1, in der F die Seitenkette einer L-Aminosäure ist.
Verbindung nach Anspruch 2, in der F die Seitenkette von L-Arginin ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in der A für H oder NH-Acetyl steht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in der B ein Indol-, Benzyl-, Phenyl- oder Naphthylrest ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in der B die Seitenkette von Phenylalanin ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in der C für D- oder L-Cyclohexylalanin (Cha), Leucin, Valin, Isoleucin, Phenylalanin, Tryptophan oder Methionin steht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in der C die Seitenkette von Prolin, Methionin oder Lysin ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in der D die Seitenkette von D-Cyclohexylalanin ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, in der E die Seitenkette von Tryptophan ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, in der F die Seitenkette von Arginin ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, in der X¹ -(CH₂)_n-NH- ist, wobei n 3 oder 4 ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, ausgewählt aus den Verbindungen Ac-F-[KP(dCha)Wr], Ac-F-[OP(dCha)Wr], F[NH(CH₂NH)CO-PdChaWR], F-[NH((CH₂)₂NH)CO-PdChaWR], AcF-[OPdChaWR], [FWPdChaWr], AcF-[KMdChaWr], AcF-[KKdChaWr], AcF-[NH(CH₂NH)CO-PdChaWr], AcKF-[OPdChaWr], F-[OP(dCha)WR] und F-[KP(dCha)WR].
Verbindung nach Anspruch 13 mit der Struktur
Zusammensetzung umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines durch den C5a-Rezeptor vermittelten pathologischen Zustands.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei der durch C5a-Rezeptoren vermittelte Zustand Überexpression oder Unterregulation von C5a beinhaltet.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer entzündlichen Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die entzündliche Erkrankung entzündliche Arthritis ist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei der Zustand aus rheumatoider Arthritis, Schocklunge (ARDS), systemischem Lupus erythematodes, Gewebetransplantatabstoßung, ischämischer Herzerkrankung, Reperfusionsverletzung, septischem Schock, Psoriasis, Gingivitis, Artherosklerose, Alzheimer-Krankheit, Multipler Sklerose, Lungenverletzung und extrakorporalem Postdialyse-Syndrom ausgewählt ist.