DE60032822T2

DE60032822T2 - Analoge der substanz p zur behandlung von krebs

Info

Publication number: DE60032822T2
Application number: DE60032822T
Authority: DE
Inventors: C. Anand BURMAN; Sudhanand Prasad; Rama Mukherhee; Manu Jaggi; T. Anu SINGH
Original assignee: Dabur Pharma Ltd
Current assignee: Fresenius Kabi Oncology Ltd
Priority date: 2000-07-31
Filing date: 2000-07-31
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2020-08-01
Also published as: CA2405724A1; CA2405724C; EP1337551B1; DE60032822D1; AU2000263936A1; WO2002010194A1; EP1337551A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst neuartige synthetische Peptid-Analogsubstanzen, bei denen es sich um Antagonisten zur Substanz P, Substanz P-ähnlichen Peptiden und verwandten Peptiden handelt und die zur Behandlung von Krebs verwendbar sind. Speziell bezieht sich die Erfindung auf den Aufbau und die Synthese der neuartigen Substanz P-Antagonist-Analogsubstanzen, in die in einer ortspezifischen Weise α,α-dialkylierte Aminosäuren eingebaut sind. Die Erfindung umfasst Verfahren für die Erzeugung dieser Peptide, diese Peptide enthaltende Zusammensetzungen sowie pharmakologische Anwendungen dieser Peptide speziell in der Behandlung und Verhütung von Krebs.
Hintergrund der Erfindung
Die Substanz P ist eine der Hauptvertreter der Tachykinin-Familie. Die Tachykinine sind bei Säugern regulatorische Peptide und liegen in den zentralen und peripheren Nervensystemen vor sowie in basalgekörnten Zellen. Die Substanz P war das erste intestinale Neuropeptid, das entdeckt wurde. Es ist ein Neuropeptid mit elf Resten der folgenden Sequenz:
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-HH₂ (SEQ ID NO: 1)
Substanz P reguliert die gastrointestinale Motilität, erhöht den Blutfluss in den Darm, stimuliert die Sekretion des Pankreas, der Speicheldrüsen, des Dünndarms und hemmt die Säuresekretion. Im Zentralnervensystem spielen die Tachykinine eine Rolle in den sensorischen Nervenbahnen und in der motorischen Steuerung (Dockray, G.J., 1994, 401 Gut peptides: Biochemistry and Physiology, Raven Press Ltd., New York).
Die Rolle der Substanz P bei Krebs ist speziell im kleinzelligen Bronchialkarzinom. Das kleinzellige Bronchialkarzinom (SCLC) hat ein Zellwachstum, das durch mehrfache autokrine und parakrine Wachstumsschleifen aufrechterhalten wird, bei denen Neuropeptide ein Rolle spielen. Bei der Suche nach neuartigen proliferationshemmenden Mitteln für das kleinzellige Bronchialkarzinom war die erste P-Antagonist-Substanz, die untersucht wurde, die Substanz P (Antagonist A) [D-Arg¹, D-Pro², D-Trp^7,9, Leu¹¹]. Substanz P ist strukturell nicht verwandt mit Bombesin/GRP und verfügt nicht über eine Bombesin/GRP-Antagonist-Aktivität; von Antagonist A wurde festgestellt, dass es die sekretorischen Einflüsse von Bombesin auf ein pankreatisches Präparat blockiert, die Bombesin/GRP-Bindung an dessen Rezeptor verringert und Mitogenese in Swiss 3T3-Zellen hemmt (Jensen et al., 1984, Nature, 309; 61-63; Zachary and Rozengurt, 1986, Biochem. Biophys. Res. Commun., 137; 135-141). Allerdings beeinflusst es nicht die durch Polypeptid-Wachstumsfaktoren eingeleitete Mitogenese, wie beispielsweise Thrombozytenderivierter Wachstumsfaktor und epidermaler Wachstumsfaktor. Unter anderen Gattungsverwandten der Substanz P, die auf Bombesin/GRP-Antagonismus getestet wurden, wurden zwei Verbindungen mit inhibitorischer Wirksamkeit identifiziert: Antagonist D, [D-Arg¹, D-Phe⁵, D-Trp^7,9, Leu¹¹]-Substanz P und Antagonist G [Arg⁶, D Tip^7,9, MePhe⁸]-Substanz P (6-11). Der Antagonist D erwies sich als um das 5-fache wirksamer als Antagonist A bei der Verhütung zellulärer Einflüsse von Bombesin/GRP und Vasopressin in Maus 3T3-Zellen und in der Hemmung des Wachstums von SCLC-Zellen im serumfreien Medium. Allerdings lies sich in Swiss 3T3-Zellen für beide Antagonisten nachweisen, dass sie die Fähigkeit nicht nur zur Hemmung der Einflüsse von Bombesin/GRP, sondern auch der Einflüsse anderer Neuropeptide und einschließlich Vasopressin, Brachykinin, Endothelin und Substanz P gemeinsam haben. Dieses spiegelt sich auch anhand der Daten wider, mit denen gezeigt wird, dass Antagonist G um das 10-fache weniger als Antagonist D beim Blockieren von Bombesin/GRP-vermittelter Mitogenese in Swiss 3T3-Zellen in der Lage ist und es fast genau so stark wirksam als Antagonist D bei der Hemmung von SCLC-Proliferation in vitro ist. Antagonist D hemmte Proliferation von H-510- und H-69-SCLC-Zellen in flüssigen Kulturmedien und in halbfesten Medien (IC50 = 5 μM). Durch mehrfache Neuropeptide und einschließlich Vasopressin und Brachykinin stimulierte Koloniebildung wurde ebenfalls durch Antagonist D geblockt (Seckl, M.J. et al., 1997, Can Res, 57(1):51-4). Darüber hinaus zeigte Antagonist G eine Hemmung von SCLC-Xenotransplataten in vivo. Wolf P.J. und Rozengurt, E., 1990, Can. Res., 50(13):3968-73; Everard, M.J., et al., 1993, Eur. J. Cancer, 29A(10):1450-3; Br J. Cancer, 1992, 65(3):388-92). Reeve, J.G. und Bleehen, N.M. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 199(3):1313-19, haben festgestellt, dass die Behandlung von Lungentumorzellen mit Antagonist D einen konzentrationsabhängigen Verlust der Zellenlebensfähigkeit bewirkt, die begleitet ist von dem Einsetzen einer Apoptosis, wie sie durch cytologische Kriterien und DNA-Fragmentierung festgelegt ist.
Kurzkettige SP-Antagonisten, d.h. viz.pHOPA-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu-NH₂ (Analog R) (SEQ ID NO: 2) und dessen Analogsubstanzen wurden von einer ungarischen Gruppe untersucht und es wurde festgestellt, dass sie die Proliferation von H69 SCLC-Zellen sowohl in vitro als auch in Xenotransplantaten in vivo bei Nacktmäusen hemmen (Int. J. Cancer, 1995, 60(1):82-7). In einer weiter ausgeführten Arbeit wurde die C-terminale Peptidbindung durch eine Methylenamino (Pseudopeptid)-Bindung ersetzt. Substanz P-Analogsubstanzen: D-MePhe-D-Trp-Phr-D-TrpLeu(psi)-(CH₂NH)-Leu-NH₂)(SEQ ID NO: 3); Analog 6 und D-MePhe-D-Trp-Phe-DTrp-Leu-MPA (SEQ ID NO:4): Analog 7, hemmte die SCLC-Proliferation wirksamer als Analog R (6:IC50 = 2 μM; 7:IC50 = 5 μM und R:IC50 = 10 μM). Darüber hinaus hemmte Analog 6 die respiratorische Aktivität von Bronchialkarzinomzellen SK-MES 1 vom Epitheltyp hinsichtlich der Proliferation, jedoch nicht in dem ruhigen Zustand, was nahe legt, dass die proliferationshemmende Wirkung dieser Verbindungen nicht auf eine einfache mit Cytotoxizität zurückzuführen ist und diese kurzkettigen SP-Analogsubstanzen vielversprechende Kandidaten als therapeutische Mittel in der Behandlung SCLC sein können (Nyeki, O., et al., 1998, J. Pept. Sci, 4(8):486-95). Antagonist D und seine Rolle bei Krebs ist in der US-P-5 434 132 und der WO 88/07551 beschrieben worden.
In der vorliegenden Erfindung werden Peptid-Analogsubstanzen von Substanz P beschrieben sowie die Herstellung und Verwendung von Peptid-Analogsubstanzen der Substanz P und speziell der Antagonist D der Substanz P unter Verwendung von strukturbeschränkten Aminosäure und deren Verwendung für die Krebstherapie allein oder in Kombination oder als Zusatztherapie zur Krebs-Chemotherapie.
Der Aufbau von struktureingeschränkten bioaktiven Peptid-Derevaten ist für die Entwicklung von therapeutischen Mitteln auf Peptid-Basis einer der Herangehensweisen gewesen, die eine breite Anwendung gefunden hat. Standardfremde Aminosäure mit starken Konformationspräferenzen können verwendet werden, um den Verlauf der Polypeptid-Kettenfaltung eine Richtung zu geben, indem lokale stereochemische Einschränkungen in neueren Vorgehensweisen für den Peptidaufbau aufgeprägt werden. Die Strukturmerkmale von α,α-dialkylierten Aminosäuren sind umfangreich untersucht worden. Der Einbau dieser Aminosäuren beschränkt die Rotation der Φ,Ψ-Winkel innerhalb des Moleküls ein, wodurch eine gewünschte Peptid-Konstellation stabilisiert wird. Von dem Prototyp des Vertreters der α,α-dialkylierten Aminosäuren, α-Aminoisobutansäure (Aib) oder α,α-Dimethylglycin, ist gezeigt worden, dass sie eine 3-fach-Drehung oder helikane Konfiguration bei Einbau in eine Peptid-Sequenz induzieren (Prasad und Balaram, 1984, CRC Crit. Rev. Biochem. 16, 307-347; Karle und Balaram, 1990 Biochemistry, 29, 6747-6756). Die Struktureigenschaften der höheren Homologa von α,α-dialkylierten Aminosäuren, wie beispielsweise Diethylglycin (Deg), Di-n-propylglycin (Dpg) und Di-n-butylglycin (Dbg) sowie die cyclischen Seitenketten-Analogsubstanzen von α,α-dialkylierten Aminosäuren, wie beispielsweise 1-Aminocyclopentancarbonsäure (Ac5c), 1-Aminocyclohexancarbonsäure (Ac6c), wie 1-Aminocycloheptancarbonsäure (Ac7c) und 1-Aminocyclooctancarbonsäure (Ac8c) haben ebenfalls gezeigt, dass sie eine gefaltete Konfiguration induzieren (Prasad, S. et al., 1995, Bioploymers, 35,11-20; Karle, LL. et al., 1995, J. Amer. Chem. Soc., 117, 9632-9637). α,α-dialkylierte Aminosäuren sind für den Aufbau hochwirksamer chemotaktischer Peptid-Analogsubstanzen verwendet worden (Prasad, S. et al., 1996 Int. J. Peptide Protein Res. 48, 31218). Allerdings sind den Patentanmeldern keine Quellen aus dem Stand der Technik für die Synthese neuartiger Peptid-Analogsubstanzen bekannt, wie sie in die vorliegende Erfindung einbezogen sind, und speziell für die Synthese solcher Substanz P-Peptid-Analogsubstanzen, die α,α-dialkylierte Aminosäuren enthalten. Darüber hinaus ist auch die Verwendung derartiger eingeschränkter Aminosäuren für den Aufbau von Peptiden, die eine anticancerogene Wirksamkeit besitzen, im gesamten Stand der Technik unbekannt. In der vorliegenden Erfindung werden die Struktureigenschaften derartiger α,α-dialkylierten Aminosäuren für den Aufbau biologisch wirksamer Peptid-Derivate von Substanz P mit spezifischer anticancerogener Aktivität genutzt. Darüber hinaus ist im Stand der Technik gezeigt worden, dass eine Lipophilisierung von bioaktiven Peptiden die Stabilität, Bioverfügbarkeit und die Fähigkeit zur Durchdringung von Biomembranen verbessert (Dasgupta, P et al.; 1999, Pharmaceutical Res. 16,1047-1053; Gozes, I. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 427-432).
Ebenfalls in die vorliegende Erfindung einbezogen sind synthetische Pep tid-Derivate mit N-terminalen Alkanoyl-Gruppen von 2 bis 18 Kohlenstoffatomen mit verbesserter anticancerogener Aktivität.
Abkürzungen und Symbole
In der nachfolgenden Formel (I) sowie in der gesamten Patentbeschreibung und den Patentansprüchen werden die Aminosäure-Reste mit ihren Standardabkürzungen bezeichnet. Sofern durch D oder DL, die vor dem Symbol erscheinen und durch einen Bindestrich getrennt sind, nicht anders angegeben wird, sind die Aminosäuren in ihrer L-Konfiguration angegeben.
In der vorliegenden Patentanmeldung wurden die folgenden Abkürzungen verwendet:

Aib: = α-Aminobutansäure
Deg: = α,α-Di-ethylglycin
Dpg: = α,α-Di-n-propylglycin
Ac5c: = 1-Aminocyclopentancarbonsäure
Ac6c: = 1-Aminocyclohexancarbonsäure
BOP:: Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexofluorphosphat
PyBOP:: Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphoniumhexofluorphosphat
HBTU:: O-Benzotriazoll-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorphosphat
TBTU:: 2-(1N-Benzotriazol-1yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluorborat
HOBt:: 1-Hydroxybenzotriazol
DCC:: Dicyclohexylcarbodiimid
DICPDI:: Diisopropylcarbodiimid
DIEA:: Diisopropylethyldiimid
DMF:: Dimethylformamid
DCM:: Dichlormethan
NMP:: N-Methyl-2-pyrrolidinon
TFA:: Trifluoressigsäure

Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst Polypeptide der folgenden allgemeinen Formel: X-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-R-NH₂, worin sind:
X eine Acetyl- oder geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkanoyl-Gruppe mit 3 bis 18 Kohlenstoffatomen oder sie ist weggelassen;
R Aib, Deg, Dpg, Ac5c oder Ac6c; oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz des Peptids, worin sind:
Aib stellt eine α,α-Aminoisobutansäure dar, Deg stellt ein α,α-Diethylglycin dar, Dpg stellt ein α,α-Di-n-propylglycin dar, Ac5c stellt eine 1-Aminocyclo-pentancarbonsäure dar und Ac6c stellt eine 1-Aminocyclohexancarbonsäure dar.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die in vivo-Antitumoraktivität von Substanz P-Analogsubstanzen auf Xenotransplantaten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die neuartigen Peptid-Analogsubstanzen von Substanz P, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, enthalten Aminosäuren, nämlich α,α-dialkylierte Aminosäuren, von denen bekannt geworden ist, dass sie stark spezifische Einschränkungen in dem Peptid-Grundgerüst hervorrufen. Die α,α-dialkylierten Aminosäuren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden synthetisch dargestellt aus entsprechenden Ketonen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Ketone zunächst in die entsprechenden Hydantoine umgewandelt, die hydrolysiert werden, um die vorgenannten Aminosäuren zu ergeben. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind als hydrolysierende Mittel Schwefelsäure, Salzsäure oder eine starke Base eingesetzt worden, beispielsweise NaOH.
Die vorliegende Erfindung umfasst Polypeptide der folgenden allgemeinen Formel: X-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-.Trp-Leu-R-NH₂ worin sind:
X eine Acetyl- oder geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkanoyl-Gruppe mit 3 bis 18 Kohlenstoffatomen, oder sie ist weggelassen;
R Aib, Deg, Dpg, Ac5c oder Ac6c; oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz des Peptids.
Vorzugsweise hat der Alkyl-Teil der Alkanoyl-Gruppe 2 bis 12 Kohlenstoffatome. Bevorzugte Alkanoyl-Gruppen sind: Acetyl, Butanoyl, Octanoyl, Lauroyl, Myristoyl, Palmitoyl, n-Hexanoyl, Isohexanoyl, Cyclohexanoyl, Cyclopentylcarbonyl, Heptanoyl, Decanoyl, n-Undecanoyl und 3,7-Dimethyloctanoyl.
Salze, die unter dem Begriff „pharmazeutisch duldbare Salze" fallen, beziehen sich auf nichttoxische Salze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Vertreter der Salze und Ester schließen die Folgenden ein:
Acetat, Ascorbat, Benzolsulfonat, Benzoat, Hydrogencarbonat, Hydrogensulfat, Bitartrat, Borat, Camsylat, Carbonat, Citrat, Dihydrochlorid, Methansulfonat, Ethansulfonat, p-Toluolsulfonat, Cyclehexylsulfamat, Chinat, Edetat, Edisylat, Estolat, Esylat, Fumarat, Gluconat, Glutamat, Glycerophosphate, Hydrobromid, Hydrochlorid, Hydroxynaphthoat, Lactat, Lactobionat, Laurat, Malat, Maleat, Mandelat, Mesylat, Mucat, Napsylat, Nitrat, n-Methylglucamin, Oleat, Oxalat, Palinoat, Pamoat (Embonat), Palmitat, Pantothenat, Perchlorate, Phosphat/Diphosphat, Polygalacturonat, Salicylate, Stearat, Succinate, Sulfat, Sulfamat, Subacetat, Succinat, Tannat, Tartrat, Tosylat, Trifluoracetat und Valerat.
Andere Salze schließen ein: Ca-, Li-, Mg-, Na- und K-Salze; Salze von Aminosäuren, wie beispielsweise Lysin oder Arginin; Guanidin, Diethanolamin oder Cholin; Ammonium, substituierte Ammoniumsalze oder Aluminium-Salze.
Die Salze werden mit Hilfe konventioneller Methoden hergestellt.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Fragmente der vorgenannten Peptide, die die Formel haben: D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-R-NH₂ worin sind:
R Aib, Deg, Dpg, Ac5c oder Ac6c; oder ein pharmazeutisch duldbares Salz des Peptids.
Die Salze sind wie vorstehend festgelegt.
Die bevorzugten neuartigen Analogsubstanzen von Substanz P der vorliegenden Erfindung sind folgende:
D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂ (SEQ ID NO: 5)
Acetyl-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂ (SEQ ID NO: 6)
Butanoyl-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂ (SEQ ID NO: 7)
Octanoyl-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂ (SEQ ID NO: 8)
Lauroyl-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂ (SEQ ID NO: 9)
D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac6c-NH₂ (SEQ ID NO: 10)
Butanoyl-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac6c-NH₂ (SEQ ID NO: 11)
Octanoyl-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac6c-NH₂ (SEQ ID NO: 12)
D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Aib-NH₂ (SEQ ID NO: 13)
D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Deg-NH₂ (SEQ ID NO: 14)
D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Dpg-NH₂ (SEQ ID NO: 15)
D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Aib-NH₂ (SEQ ID NO: 16)
D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂ (SEQ ID NO: 17)
D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac6c-NH₂ (SEQ ID NO: 18)
D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Deg-NH₂ (SEQ ID NO: 19)
D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Dpg-NH₂ (SEQ ID NO: 20)
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Zusammensetzungen ein, worin die Wirkstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, um den vorgesehenen Zweck zu erreichen.
Der Begriff „eine wirksame Menge" bedeutet diejenige Menge eines Arzneimittels oder pharmazeutischen Mittels, die die biologische oder medizinische Reaktion eines Gewebes, Systems, bei einem Tier oder Menschen hervorbringt, die angestrebt wird. Zusätzlich zu den Wirkstoffen können pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch unbedenkliche zuträgliche Stoffe enthalen, wie Trägersubstanzen, Streckmittel, Lösemittel, Geschmacksverbesserer, Farbmittel, usw. Die Präparate lassen sich in jeder beliebigen Form formulieren, einschließlich Tabletten, Dragees, Kapseln, Pulver, Sirupe, Suspensionen, Aufschlemmungen, als Formulierungen mit zeitabhängiger Freisetzung, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung, Pillen, Granalien, Emulsionen, Pflaster, Injektionen, Lösungen, Liposome und Nanopartikel, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Geeignete Darreichungswege sind solche, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind und schließen die orale, rektale, transdermale, vaginale, transmukosale oder intestinale Verabreichung ein; die parenterale Zuführung, einschließlich intramuskuläre, subkutane, intramedulläre Injektionen sowie intrathecale, direkte intraventriculare, intravenöse, intraperitoneale, intranasal oder intraoculare Injektionen.
Die exakte Formulierung, der Darreichungsweg und die Dosierung lassen sich unter Berücksichtigung des Zustandes des Patienten vom einzelnen Arzt auswählen.
Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit der Peptide der vorliegenden Erfindung kann mit Hilfe von Standardprozeduren der Pharmazeutik in Zellkulturen oder Tierversuchen ermittelt werden.
Synthese von Peptiden
Die neuartigen Peptide in der vorliegenden Erfindung sind unter Anwendung von Festphasenmethoden, durch Kombination von Prozeduren in der Lösungsphase und Methoden der Festphase oder durch Fragmentkondensation erzeugt worden. Diese Methoden für die chemische Synthese von Polypeptiden sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (Stewart und Young, 1969, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co.).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden die Peptide synthetisch dargestellt unter Anwendung der Fmoc-Strategie auf einem halbautomatischen Peptid-Synthesizer (CS Bio, Modell 536) unter Anwendung eines optimalen Nebenkettenschutzes. Die Peptide wurden vom C-Ende bis zum N-Ende zusammengestellt. Peptide, die an dem Carboxy-Terminus amidiert sind, wurden synthetisch unter Anwendung des „Rink Amid"-Harzes hergestellt. Die Beladung der ersten Fmoc-geschützten Aminosäure wurde über die Erzeugung einer Amid-Bindung mit dem festen Träger erreicht, die durch Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI) und HOBt vermittelt wurde. Die Substitutionsmengen bei der automatischen Synthese lagen bevorzugt zwischen 0,2 und 0,8 mMol Aminosäure pro Gramm Harz.
Die N-terminale Amino-Gruppe wurde durch 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Gruppe geschützt. Die bevorzugten Schutzgruppen für die Imidazol- Gruppe von Histidin-Harz waren Trityl (trt) oder tert-Butyloxycarbonyl (Boc). Die Hydroxyl-Gruppen von Serin, Threonin und Tyrosin waren vorzugsweise geschützt durch eine tert-Butyl-Gruppe (tBu) 2,2,5,7,8-Pentamethyl-chroman-6-sulfonyl (Pmc) oder 2,2,4,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf), die die bevorzugten Schutzgruppen für die Guanidino-Gruppe von Arginin waren. Die bevorzugte Schutzgruppe für Asparagin und Glutamin war Trityl und die bevorzugte Schutzgruppe für die Asparaginsäure und Glutaminsäure war die tert-Butyl-Gruppe (tBu). Der Tryptophan-Rest wurde entweder ungeschützt gelassen oder mit Boc-Schutz verwendet. Die Seitenketten-Aminogruppe von Lysin wurde vorzugsweise unter Verwendung der Boc-Gruppe geschützt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurden 2 bis 8 val Fmoc-geschützte Aminosäure pro Harz-Stickstoff-Äquivalent verwendet. Die aktivierenden Reagenzien, die verwendet wurden, um Aminosäuren in der Festphasen-Peptidsynthese an dem Harz anzukuppeln, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Diese schließen ein: DCC, DIPCDI, DIEA, BOP, PyBOP, HBTU, TBTU und HOBt. Als aktivierende Reagenzien wurden in den Kupplungsreaktionen vorzugsweise DCC oder DIPCDI/HOBt oder HBTU/HOBt und DIEA verwendet.
Die geschützten Aminosäuren wurden entweder in situ aktiviert oder in Form von voraktivierten Estern zugesetzt, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie beispielsweise NHS-Ester, Opfp-Ester usw.; Atherton, E. et al., 1988, J. Chem. Soc., Perkin Trans. I, 2887, Bodansky, M. in „The Peptides, Analysis; Synthesis and Bilogy" (E. Gross, J., Meienhofer Herausg.) Bd. 1, Academic Press, New York, 1979, 106.
Die Kupplungsreaktion wurde ausgeführt in DMF, DCM oder NMP oder in einer Mischung dieser Lösemittel und wurden überwacht mit Hilfe des Kaiser-Tests (Kaiser et al., Anal. Biochem., 34, 595-598 (1970)). Im Fall eines positiven Kaiser-Tests wurde die geeignete Aminosäure unter Verwendung frisch hergestellter aktivierter Reagenzien erneut gekuppelt.
Nach Beendigung des Aufbaus des Peptids wurde die Amino-terminale Fmoc-Gruppe abgespalten und sodann das Peptidharz mit Methanol gewaschen und getrocknet. Die Peptide wurden sodann von der Schutzgruppe befreit und von dem Harzträger durch Behandlung mit Trifluoressigsäure, kristallinem Phenol, Ethandithiol, Thianisol und deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur für 1,5 bis 5 Stunden abgespalten. Das rohe Peptid wurde durch Ausfällung mit kaltem wasserfreien Ether erhalten, filtriert, aufgelöst und lyophilisiert.
Das resultierende rohe Peptid wurde mit Hilfe der präparativen Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer LiChroCART^®C₁₈ (250 × 10)-Umkehrpohasensäule (Merck, Darmstadt, Deutschland) auf einem präparativen HPLC-Sytem (Shimadzu Corporation, Japan) unter Verwendung eines Gradienten von 0,1 % TFA in Acetonitril und Wasser gereinigt. Die eluierten Fraktionen wurden erneut auf einem Analyse-HPLC-System (Shimadzu Corporation, Japan) unter Verwendung einer C18 LiChrospher^®, WP-300 (300 × 4)-Umkehrphasensäule analysiert. Das Acetonitril wurde abgedampft und die Fraktionen lyophilisiert, um das reine Peptid zu erhalten. Die Identität des jeweiigen Peptids wurde mit Hilfe der Elektronenstrahlmassenspektroskopie bestätigt.
Bevorzug wurden halbautomatische, schrittweise Festphasenmethoden für die Synthese von Peptiden der Erfindung in den Beispielen gewährt, die in dem nachfolgenden Abschnitt des vorliegenden Dokuments diskutiert werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun eingehender unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben.
Bei den Schritten, die in der Synthese der Substanz P-Analogsubstanzen beteiligt waren, wurde das folgende Protokoll eingehalten: Tabelle I
Beispiel 1
Erstes Beladen auf Rink-Amidharz
Es wurde eine typische Herstellung des Fmoc-Ac5c-Rink-Amidharzes unter Verwendung von 1,0 g 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxy-methyl-derivatisierten Polystyrol mit 1 % Divinylbenzol (Rink-Amid)-Harz (0,7 mMol/g)(100 bis 200 mesh) ausgeführt, das von Advanced Chemtech, Louisville, KY, USA, erhalten wurde. Das Quellen des Harzes wurde typischerweise in Dichlormethan ausgeführt, indem die Volumina von 10 bis 40 ml/g Harz gemessen wurden. Das Harz lies man in Dichlormethan quellen (2 × 25 ml für 10 Minuten). Es wurde einmal mit Dimethylformamid (DMF) für 1 Minute gewaschen. Alle Lösemittel in dem Protokoll wurden in Portionen von 20 ml pro Zyklus zugegeben. Die Fmoc-Schutzgruppe am Harz wurde mit Hilfe der folgenden Schritte 3 bis 7 in dem Protokoll abgespalten. Die Schutzgruppenabspaltung der Fmoc-Gruppe wurde anhand des Vorhandenseins von blauen Kügelchen im Kaiser-Versuch überprüft. Für die Beladung der ersten Aminosäure an der freien Amino(NH₂)-Gruppe des Harzes wurde die erste Aminosäure in 3- bis 6-fachen Überschuss zusammen mit einem ähnlich vielfachen Überschuss von HOBt in dem Aminosäure-Behälter des Peptid-Synthetisiervorrichtung gewogen. Diese wurden in Dimethylforamid (ACS-Qualität)(J.T. Baker, New Jersey, USA) aufgelöst und mit DIPCDI unmittelbar vor der Zugabe zum Harz in dem Reaktionsbehälter der Peptid-Synthetisiervorrichtung aktiviert. HOBt wurde in allen Kupplungsreaktionen und speziell im Fall von Glutamin und Histidin zugegeben. Die Kupplungsreaktion wurde für eine Dauer im Bereich von 1 bis 3 Stunden ausgeführt. Das Beladen der Aminosäure auf dem Harz wurde auf Grund des Vorhandenseins farbloser Kügelchen im Kaiser-Versuch bestätigt. Die Wirksamkeit des Beladens wurde anhand der Gewichtserhöhung des Harzes nach der Zugabe der Aminosäure festgestellt.
Beispiel 2
Synthese von D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂ (SEQ ID NO: 17)
Die Synthese des Peptids, SEQ ID NO: 17, wurde unter Verwendung des mit Fmoc-Ac5c-OH beladenen Harzes eingeleitet, das im vorgenannten Beispiel 1 über eine 1 g-Skala hergestellt wurde. Dieses wurde einer stufenweisen Schutzgruppenabspaltung und Kupplungsschritten wie in den Schritten 1 bis 10 des Synthesezykluses unterworfen. In jeder Kupplungsreaktion wurde ein 4-facher Überschuss von Aminosäure, DICPDI und HOBt, verwendet. Nach Beendigung der Synthese und der Entfernung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe (Schritte 1 bis 6 des Synthesezykluses) wurde das Peptidharz zweimal mit Methanol gewaschen, getrocknet und gewogen und so 1,649 g erhalten. Dieses wurde einer Abspaltung in einer Abspaltmischung, bestehend aus Trifluoressigsäure und Fängern, kristallinem Phenol, Thioanisol, Ethandithiol und Wasser, für eine Dauer von 1 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Rühren unterworfen. Das Peptid wurde unter Verwendung von kaltem, wasserfreien Ether ausgefällt, um das rohe Peptid zu erhalten. Das rohe Peptid wurde auf einer C18-präparativen Umkehrphasen-HPLC-Säule (250 × 10) auf einem Gradientensystem gereinigt, das Acetonitril aufwies und Wasser in 0,1 % TFA entsprechend der Beschreibung im Stand der Technik. Die hervorragenden Peaks wurden aufgenommen und lyophilisiert, erneut analysiert auf einer analytischen HPLC und einer Massenspektrometrie unterzogen. Es gab eine gute Übereinstimmung zwischen dem beobachteten Molekulargewicht und dem berechneten Molekulargewicht (berechnete Masse etwa 1.036; beobachtete Masse = 1.037,2). Das reine Peptid wurde sodann für Bioassays verwendet.
Beispiel 3
Synthese von D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂ (SEQ ID NO: 5)
Die Synthese wurde wie in den vorgenannten Beispielen unter Verwendung der entsprechenden Aminosäuren ausgeführt. Ferner wurde die Abspaltung und Reinigung entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2 vorgenommen. Das gereinigte Peptid wurde weiter mit Hilfe seiner Massenanalyse gekennzeichnet. Die berechnete Masse des vorgenannten Peptids betrug etwa 1.515 und die beobachtete Masse 1.514,29.
Beispiel 4
Synthese von Butanoyl-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂ (SEQ ID NO: 7)
Die Konjugation der Butanoyl-Gruppe an der N-terminalen Stelle wurde auf Festphase vorgenommen.
Die vorgenannte Peptidsequenz wurde synthetisch auf dem in Beispiel 2 beschriebenen Harz dargestellt. Nach der Schutzgruppenabspaltung der D-Arg-Aminosäure wurde ferner eine Kupplung mit Butansäure in DMF unter Verwendung von DIPCDI und HOBt und unter Einhaltung des Standardprotokolls vorgenommen. Die Abspaltung und Reinigung wurde ferner nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Standardprotokoll ausgeführt. Das fertige, gereinigte Peptid wurde ferner mit Hilfe der Massenspektroskopie analysiert. Die berechnete Masse und die beobachtete Masse standen in guter Übereinstimmung (die berechnete Masse betrug etwa 1.585 und die beobachtete Masse betrug 1.586).
Beispiel 5
Synthese von Octanoyl-D-Arg-Pro-Llys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂ (SEQ ID NO: 8)
Die Konjugation der Oktanoyl-Gruppe an der N-terminalen Stelle erfolgte auf Festphase.
Die vorgenannte Peptidsequenz wurde synthetisch auf Harz in ähnlicher Weise dargestellt, wie in Beispiel 4 beschrieben wurde, jedoch mit der Ausnahme, dass anstelle der Butansäure Octansäure verwendet wurde. Das fertige, gereinigte Peptid wurde weiter mit Hilfe der Massenspektroskopie analysiert. Die berechnete Masse und die beobachtete Masse standen in guter Übereinstimmung (die berechnete Masse betrug etwa 1.641, die beobachtete Masse betrug 1.642,2).
Beispiel 6
Synthese von Acetyl-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂ (SEQ ID NO: 6)
Die Konjugation der Acetyl-Gruppe an der N-terminalen Stelle erfolgte auf Festphase unter Verwendung von Essigsäureanhydrid in ähnlicher Weise, wie in Beispiel 4 beschrieben wurde. Das fertige, gereinigte Peptid wurde weiter mit Hilfe der Massenspektroskopie analysiert. Die berechnete Masse und die beobachtete Massen in guter Übereinstimmung (die berechnete Masse betrug etwa 1.557 und die beobachtete Masse betrug 1.558,5).
Beispiel 7
In vitro-cytotoxische Aktivität der neuartigen synthetischen Peptid-Analogsubstanzen
Die cytotoxische Aktivität von synthetisch dargestellten Peptiden wurde an sechs Human-Tumorzelllinien getestet, nämlich MCF7 (Brust), U373 (Glioblastom), PTC (Colon), L132 (Lunge), Su 86.86 (Pankreas) und KB (oral). Die Tumorzellen wurden in der exponentiellen Wachstumsphase genommen und erneut in Medium suspendiert (1,5 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640 mit einem Gehalt von 10% FBS). Den Mulden einer 96-Gewebekultur-Titerplatte (Nunc, Dänemark) wurden 150 μl Medium zugegeben, gefolgt von 30 μl Zell-Suspension. Die Platte wurde über Nacht in einem Inkubator (37°C, 5% CO₂) gelassen. Zur Markierung der Mulden in der 96-Titerplatte wurden 20 μl des Peptids (100 pMol bis 10 μMol Konzentration) gegeben. Jede Konzentration wurde in 3-facher Form aufgezogen. Zur Kontrolle der Mulden wurden 20 μl alleiniges Medium zugegeben, während Mulden ohne Zellen als Blindproben dienten. In jeder Mulde wurde ein Gesamtvolumen von 200 μl sichergestellt und die Platte im Inkubator gelassen (37°C, 5% CO₂). Nach einer Inkubation von 72 Stunden wurde ein MTT-Assay ausgeführt und die prozentuale Cytotoxizität in Bezug auf Kontrollzellen berechnet. Tabelle 2 und 3 zeigen die Cytotoxizität, die in den verschiedenen Karzinomzelllinien verschiedener Peptide erreicht wurde.
Cytotoxische Wirksamkeit von (SEQ ID NO: 7) Tabelle 2
Cytotoxische Wirksamkeit von (SEQ ID NO: 5) Tabelle 3
Beispiel 8
In vitro cytotoxische Aktivität von Lipo-Konjugaten von Substanz P-Analog
Die cytotoxische Aktivität von Lipo-Konjugaten von Substanz P-Analog, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8, wurde mit Hilfe eines MTT-Assay untersucht, der auf dem Prinzip der Aufnahme von MTT [3-[4,5-Dimethyldiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium-bromid] beruhte, ein Tetrazolium-Salz durch die metabolisch aktiven Zellen, wo es durch aktive Mitochondrien zu einem blau gefärbten Formazan-Produkt verstoffwechselt wird, das sich spektrophotometrisch auslesen lässt. Verkürzt wurden Tumorzellen-KB (Mundschleimhaut), U87MG (Bioblastom), HBL100 (Brust), HeP2 (Kehlkopf), ECV304 (Endothel), PA-1 (Ovarien) und L132 (Lunge), wurden mit den Peptid-Analogsubstanzen für 48 Stunden bei 37°C in einer 96-Titerplatte inkubiert, gefolgt von einer Zugabe von 100 μg MTT und einer weite ren Inkubation für 1 Stunde. Die Formazan-Kristalle, die sich an den Innenseiten der Zellen gebildet hatten, wurden mit einem Detergenz aufgelöst, das 10 Natriumdodecylsulfat und 0,01 n HCl aufwies, und die Extinktion auf einem Multiscan-ELISA-Leser ausgelesen. Die Extinktion war direkt proportional mit der Zahl proliferierender und metabolisierender aktiver Zellen. Die prozentuale Cytotoxizität der Peptid-Analogsubstanzen wird in der folgenden Tabelle gezeigt.
SEQ ID NO: 6
SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 8
Beispiel 9
In vivo Antitumoraktivität von Substanz P-Analog auf PCT-Tumor-Xenotransplantaten
Protokoll
Die Antitumoraktivität von Substanz P-Analog wurde in Human Colon-Adenocarzinomen(PTC)-Xenotransplantaten in Nacktmäusen untersucht. Die PTC-Tumor-Xenotransplantate wurden in Balb/c-athymischen Nacktmäusen mit Hilfe einer subkutanen Impfung einer einzelligen Suspension von PTC-Zellen (15 × 10⁶ Zellen/100 μl) aufgezogen. Die Tiere, die den Tumor hatten, wurden in 4 Gruppen von drei Tieren unterteilt, in denen jeweils eine Gruppe ein unbehandeltes Kontroll-Tier aufwies. Die Behandlung mit Substanz P-Rezeptorantagonisten wurde eingeleitet, wenn die mittleren Tumorvolumina, die mit Hilfe einer Schiebelehre gemessen wurden, zwischen 400 und 800 mm³ betrugen. Die Peptide der SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 wurden bei einer Konzentration von 42,5 μg/ml hergestellt und intravenös der bezeichneten Tiergruppe, die den Tumor hatte, in einer Dosis von 4,25 μg/100 μl zweimal täglich verabreicht, so dass die jedem Tier verabreichte Gesamtdosis 8,5 μg betrug. Die Behandlung wurde für eine Dauer von 10 Tagen fortgesetzt.
Ergebnisse
Die Antitumoraktivität der Verbindungen wurde kontrolliert, indem 15 Tumorvolumina alle 14 Tage unter Verwendung der Formel W·W·L·0,4 (W = kleinere Durchmesser, L = größere Durchmesser) gemessen wurden. Die prozentuale Hemmung des Tumorwachstums wurde unter Verwendung der Formel berechnet: (1 – Tumorvolumen, behandelt/Tumorvolumen, Kontrolle) × 100. Tabelle 4 zeigt die Tumorvolumina der einzelnen gemessenen Tiere bis zum 21. Tag nach der Beimpfung. 1 zeigt die Tumorkinetik bis zum 21. Tag der behandelten und nicht behandelten Tiere. Alle drei Peptide zeigten eine deutliche Antitumoraktivität auf PTC-Xenotransplantaten. Die prozentuale Hemmung des Tumorwachstums, die von den SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 im Vergleich mit Kontrollen nach 19 Tagen hervorgerufen wurde, betrug jeweils 68,34 %, 78,54 % bzw. 75,16 %.
Sequenzliste

Claims

Peptid der allgemeinen Formel: X-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-R-NH₂, worin sind: X eine Acetyl- oder geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkanoyl-Gruppe mit 3 bis 18 Kohlenstoffatomen oder ist weggelassen; R Aib, Deg, Dpg, Ac5c oder Ac6c; Aib stellt α,α-Aminoisobutansäure dar, Deg stellt α,α-Diethylglycin dar, Dpg stellt α,α-Di-n-propylglycin dar, Ac5c stellt 1-Aminocyclopentancarbonsäure und Ac6c stellt 1-Aminocyclohexancarbonsäure dar; oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz des Peptids.
Peptid der Formel: D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-R-NH₂, worin sind: R Aib, Deg, Dpg, Ac5c oder Ac6c; Aib stellt α,α-Aminoisobutansäure dar, Deg stellt α,α-Diethylglycin dar, Dpg stellt α,α-Di-n-propylglycin dar, Ac5c stellt 1-Aminocyclopentancarbonsäure und Ac6c stellt 1-Aminocyclohexancarbonsäure dar; oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz des Peptids.
Peptid nach Anspruch 1, worin X weggelassen ist und R Ac5c ist und wobei das Peptid die Formel hat: D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂, (SEQ ID NO: 5) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin X Acetyl ist und R Ac5c ist und wobei das Peptid die Formel hat: Acetyl-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂, (SEQ ID NO: 6) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin X Butanoyl ist und R Ac5c ist und wobei das Peptid die Formel hat: Butanoyl-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂, (SEQ ID NO: 7) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin X Octanoyl ist und R Ac5c ist und wobei das Peptid die Formel hat: Octanoyl-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂, (SEQ ID NO: 8) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin X Lauroyl ist und R Ac5c ist und wobei das Peptid die Formel hat: Lauroyl-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂, (SEQ ID NO: 9) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin R Ac6c ist und wobei das Peptid die Formel hat: D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac6c-NH₂, (SEQ ID NO: 10) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin X Butanoyl ist und R Ac6c ist und wobei das Peptid die Formel hat: Butanoyl-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac6c-NH₂, (SEQ ID NO: 11) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin X Octanoyl ist und R Ac6c ist und wobei das Peptid die Formel hat: Octanoyl-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac6c-NH₂, (SEQ ID NO: 12) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin R Aib ist und wobei das Peptid die Formel hat: D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Aib-NH₂, (SEQ ID NO: 13) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin R Deg ist und wobei das Peptid die Formel hat: D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Deg-NH₂, (SEQ ID NO: 14) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin R Dpg ist und wobei das Peptid die Formel hat: D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Dpg-NH₂, (SEQ ID NO: 15) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 2, worin R Aib ist und wobei das Peptid die Formel hat: D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Aib-NH₂, (SEQ ID NO: 16) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 2, worin R Ac5c ist und wobei das Peptid die Formel hat: D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac5c-NH₂, (SEQ ID NO: 17) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 2, worin R Ac6c ist und wobei das Peptid die Formel hat: D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Ac6c-NH₂, (SEQ ID NO: 18) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 2, worin R Deg ist und wobei das Peptid die Formel hat: D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Deg-NH₂, (SEQ ID NO: 19) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Peptid nach Anspruch 2, worin R Dpg ist und wobei das Peptid die Formel hat: D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Dpg-NH₂, (SEQ ID NO: 20) oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Zusammensetzung, gekennzeichnet durch eine wirksame Menge eines Peptids nach Anspruch 1 und eines pharmazeutisch unbedenklichen Trägers.
Zusammensetzung, gekennzeichnet durch eine wirksame Menge eines Peptids nach Anspruch 2 und eines pharmazeutisch unbedenklichen Trägers.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikamentes für die Behandlung von Krebs.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 2 zum Herstellen eines Medikamentes für die Behandlung von Krebs.
Festphase-Syntheseprozess für die Herstellung eines Peptids analog der Formel (I): X-D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trip-Leu-R-NH₂ worin sind: X eine Acetyl- oder eine geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkanoyl-Gruppe mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen oder ist weggelassen; R Aib, Deg, Dpg, Ac5c oder Ac6c; wobei der Prozess das sequentielle Laden geschützter α,α-dialkylierter Aminosäuren in sequentiellen Zyklen auf dem Amino-Terminus eines Festphaseharzes umfasst, das Koppeln der Aminosäuren zum Zusammensetzen einer Peptidharz-Gruppe; Entfernen der schützenden Gruppen und Abspalten des Peptids von dem Harz, um ein Peptid zu erhalten, worin Aid α,α-Aminoisobutansäure darstellt, Deg stellt α,α-Diethylglycin dar, Dpg stellt α,α-Di-n-propylglycin dar, Ac5c stellt 1-Aminocyclopentancarbonsäure und Ac6c stellt 1-Aminocyclohexancarbonsäure dar.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die α,α-dialkylierten Aminosäuren an ihren α-Amino-Gruppen durch eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Gruppe geschützt sind.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Koppeln in Gegenwart aktivierter Mittel ausgeführt wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus DC, DIPCDI, DIEA, BOP, PyBOP, HBTU, TBTU und HOBt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Koppeln in Gegenwart eines Lösemittels ausgeführt wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus DMF, DCM und NMP oder einer Mischung davon.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Peptid von der Peptid-Harz-Anordnung durch Behandlung mit Trifluoressigsäure, kristallinem Phenol, Ethandithiol, Thioanisol und Wasser für 1 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur abgespalten wird.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die α,α-dialkylierte Aminosäure hergestellt wird durch Umwandlung eines Ketons zu einem Hydantoin und Hydrolyse des Hydantoins.