DE2705514C3 - Nonapeptide und diese enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

Seit vielen Jahren wird nach Substanzen gesucht, die nach Verabreichung an Warmblüter die Rückbildung und/oder die Beseitigung von Tumoren bewirken, ohne wesentliche nachteilige Wirkungen auf das gesunde Gewebe des Empfängers auszuüben.

Es wurde nun gefunden, daß eine Reihe von eng verwandten Peptiden die Fähigkeit hat, den Stoffwechsel gewisser Tumore bis zu einem Punkt zu stören, bei dem ihr Zellwachstum drastisch geschädigt wird, was wiederum iur Rückbildung und häufig zur vollständigen Beseitigung des Tumors führt.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, für die Behandlung von Warmblütern, die von einem oder mehreren aktiven Tumoren oder Neoplasmen befallen sind, ein Mittel verfügbar zu machen, das bei den von diesen Tumoren befallenen Warmblütern eine chemische Behandlung ermöglicht, durch die die Größe des Tumors verringert wird, ohne den vom Tumor Befallenen zu schädigen.

Es wurde nun gefunden, daß Nonapeptide der allgemeinen Formel

I. L-PyroGlul. His-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-X-

L-Leu-LArg-L-Pro-NH-CjH,

worin X die optisch aktive D-Form einer Aminosäure der Formel

NH CH R· CO

worin R' ein Benzylrest. 3-lndolylrest oder p-Hydroxybenzvlrest ist. d.h. D-Phenylalanyl. D-Tryptophyl oder D-Tyrosyl bedeutet, die gewünschten Wirkungen haben, wenn sie Warmblütern, die einen wachsenden Tumor in sich tragen, in einer effektiven Tagesdosis verabreicht werden.

Das erfindungsgemäße Mitiel wird Warmblütern, die von einem Mammatumor oder von durch 7.12- Dirnethylben/anthracen induzierbaren Tumoren befallen, sind, in einer parenteralen Dosis zwischen I und 6ö 200 (Ig/kg pro Tag als Einzeldösis öder aufgeteilt in zwei bis vier entsprechend kleineren Tagesdosen Verabreicht. Wenn die orale Verabreichung gewünscht wird, liegt die Dosis im Bereich zwischen 2 und 500 Hg/kg pro Tag und kann leicht überschritten werden, da die Verbindungen der Föfiiiel I bei oralen Dösen von 100 mg/kg öder mehr keine toxischen Wirkungen zeigen, Die vorstehend genannte »parenlcrale« Behandlung umfaßt alle Verabreichungen außer der oralen, insbesondere die intramuskuläre, subkutane und intravenöse Injektion oder Infusion, die intravaginale Verabreichung, die Verabreichung durch Suppositorien, Nasentropfen usw. Für diese Formulierungen stellen Lösungen der Verbindungen (!) in einer Konzentration von 5 bis 100 μg/ml in 0,9%iger Kochsalzlösung eine ausgezeichnete Arzneimittelform dar. Gegebenenfalls können geringe Mengen Albumin zugesetzt werden, um die Adsorption der Verbindung (I) am Glasgefäß, in dem diese Arzneimittelform hergestellt oder gelagert wird, zu verhindern.

Die Verbindungen der Formel (I) sind sehr leicht wasserlöslich. Sie können im wesentlichen unendlich lange als Feststoff oder als Lösung in Wasser oder Kochsalzlösung gelagert werden. Natürl^;.ih können, falls gewünscht. Puffer wie Tris(hydroxymethyl)aminomethan oder andere pharmazeutisch unbedenkliche Zusatzstoffe den Lösungen vor der Lagerung oder vor dem Gebrauch zugesetzt werden.

Für die orale Verabreichung kommen alle pharmazeutischen Zubereitungen, z. B. Sirupe, Elixiere und Suspensionen, in Frage, oder die Verbindungen können zu Oblaten, Pillen oder Tabletten formuliert werden. Da jedoch die erforderliche Dosis extrem gering ist, erfordern die üblichen Tablettierverfahren die Verwendung von Füllstoffen und anderen Hilfsstoffen zur Herstellung von Tabletten einer handgerechten Größe. Bei einer bevorzugten Ausführungsform besteht die orale Arzneimittelform aus einer Tablette, die 0.1 bis 5,0 mg eines der vorstehend genannten Peptide pro Tablette enthält. Diese Tabletten können in üblicher Weise mit einem (Il crzug versehen werden, indem vorzugsweise ein leicht lösliches Überzugsmaterial, z. B. Zucker, verwendet wird, oder die genannte Menge kann in Gelatinekapseln, die sich nach Einführung in den Magen sofort lösen, eingearbeitet werden. In jedem Fall können die üblichen Geschmacksstoffe und Farbstoffe ohne Einfluß auf das in dieser Weise eingearbeitete aktive Peptid verwendet werden.

Tabletten dieser Art werden in üblicher Weise hergestellt, indem das aktive Ingrediens mit Stärke gemischt, das Gemisch granuliert und nach Zugabe der notwendigen Füllstoffe, Geschmacksstoffe. Gleitmittel homogenisiert und durch ein 0.59-mm-Sieb gegeben wird. Das gleichmäßige Gemisch wird dann mit dem üblichen Stempel ni Tabletten der gewünschten Härte, vorzugsweise zu Tabletten mit Bruc-H^erbe zur leichteren Verabreichung in geteilten Tagesdosen, gepreßt.

Die Herstellung und Verwendung der Verbindungen gemäß der Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Im Rahmen dieser Beschreibung werden die Ausdrücke »Neoplasma« und »Tumor« austauschbar gebraucht.

Beispiel 1

t Butyloxycarbonyl-prolin wird nach der Methode, die von Stewart und Mitarbeitern in »SOLID PIiASK PFFfIDE SYNTHESIS« (Verlag Free man & Company, San Francisco (Ö69), Seite 1, beschrieben wird, verestert« indem Gs rtiit einem chiormethylier* ten DiViriyibehZoUSiyfo^Gopolyfnerisal (»Merrifield-Harz«») zusammengegeben wird, Irt dieser Weise wird ein Hafz gebildet, das nach der Afninosäure^Analyse 0,47 111M0I Prolin/g Harz enthält: In einer automatischen Syntheseapparattir, die nach der genannten Merrifield'Appafatur entwickelt wurde, werden 4,6 g dieses Harz/Aminosäure-Maierials für die Synthese des

gewünschten Nonapeptjds verwendet. Jede N-blockierte Aminosäure wird im dreifachen Überschuß zugesetzt und der Kupplung an den vorliegenden Aminosäure-Harzester dem üblichen Kupplungsprozeß überlassen. Die Kupplungsreaktion wird 4,5 Stunden unter ständigern Schütteln durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend sechsmal je 1,5 Minuten mit Methanol-Chloroform (1 :2) und viermal je 1,5 Minuten mit Äthanol gewaschen. In jedem Fall wird ein Gesamtvolumen von 48 ml verwendet Die Ablaßzeit nach dem Schütteln beträgt gewöhnlich etwa 1,5 Minuten.

Nach der Kupplung wird das Gemisch viermal je 1,5 Minuten mit Dioxan, zweimal mit 4n-Salzsäure/Dioxan für 5 Minuten bzw. 25 Minuten, fünfmal je 1,5 Minuten mit Dioxan, dreimal je 3 Minuten mit Äthanol, dreimal je 1,5 Minuten mit Chloroform, dreimal je 1,5 Minuten mit 10% Triäthylamin/Chloroform, viermal je 1,5 Minuten mit Chloroform und sechsmal je 1,5 Minuten mit Dichlormethan gewaschen. Normalerweise wird als Lösungsmittel für die Kupplungsreaktion Dichlormethan oder, wenn die Löslichkeit der blockierten Aminosäure gering ist, ein Gemisch von Dichlormethan und Dimethylformamid verwendet. Die Kupplung erfolgt durch Zusatz einer Lösung ν-.,·η Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan im 25-fachen Oberschuß.

Die aufeinanderfolgenden Schritte zur Entfernung der Schutzgruppe, Neutralisation und Kupplung der nächsten Aminosäure wird in einem voll automatischen System, das vorsi-rhend beschrieben wurde, durchgeführt. In dieser Weise wird das Pep^>;d zusammengefügt, indem nacheinander

Boc-Arg(Tos),

Boc-Leu,

Boc-D-Trp, Boc-Tyr(Cl₂Bzl),

Boc-Ser(Bzl),

Boc-Trp,

Boc-His(DNP)und

PyroGlu

verwendet werden, worin alle Aminosäuren in der L-Form vorliegen, ausgenommen im Falle des Tryptophane.

Das Harz wird aus dem Gefäß entnommen und in 200 ml 5% Triäthylamin/Methanol suspendiert. Zur Suspension werden 100 ml destilliertes Äthylamin gegeben. Nach 24 Stunden wird das Harz abfiltriert und die Lösung eingedampft, wobei ein Feststoff erhalten wird. Der Feststoff wird in Eisessig aufgenommen und auf eine 3 χ 50 cm große Säule von Kieselgel aufgebracht, das mit 5% Methanol/Chloroform ins Gleichgewicht gebracht worden ist.

Die Säule wird mit 5% Methanol in Chloroform eluiert, bis alle Spuren von N-Äthyldinitroanilin, dem gelben Nebenprodukt der das Histidin schützenden Gruppe DNP, entfernt sind. Das Elutionsmittel wird dann gegen 33% Methanol/Chloroform ausgewechselt. Fraktionen von je 30 ml werden aufgefangen. Die Verbindung wird durch Dünnschichtchromatographie von aliquoten Teilen der Fraktionen (Kieselgcl G, 33% MeOH/CHCb, Clz/Tölidiri-Spräy) bestimmt. Die Frak^ tiönen, die das Produkt enthalten, werden ZUsammertge* gössen und eingedampft, wobei ein Feststoff erhalten wifdi der aus Methanol mit Äther ausgefällt wird. Diese dreifach geschützte Nonapeptid (Schutzgruppen bei Sef, Typ Und Arg) wird ifi dieser Weise in einer Menge von 1,69 g entsprechend einer Ausbeule Von 43% der Theorie erhallen,

Eine Probe von 250 mg dieses Produkts wird mit 250 mg Anisol in ein Fluorwasserstoff-Reaktionsgefäß gegeben, in das etwa 5 ml wasserfreier Fluorwasserstoff destilliert werden. Nach einer Stunde bei 0⁰C wird der Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in 1% Essigsäure aufgenommen. Diese Lösung wird mit Äther extrahiert. Die wäßrige Phase wird auf eine 1 χ 30 cm große Säure eines stark basischen Ionenaustauscherharzes, das quarternäre Ammoniumgruppen in einem mit 2% Divinylbenzol vernetzten Styrolpolymer- Latex aufweist, in der Essigsäureform aufgegeben. Das Produkt wird mit 0,ln-Essigsäure eluiert und durch Dünnschichtchromatografie (CHCI₃/Me0H/32% HOAc: 120/90/40 Kieselgel G, Cb/Tolidin bestimmt Die das Produkt enthaltende Lösung wird gefriergetrocknet, an einem Dextrangel, das mit 6% Epichlorhydrin vernetzt ist mit einer molaren Ausschlußgrenze unterhalb 1000 bis 5000 erneut chromatographiert Das eluierte Produkt wird aufgefangen und gefriergetrocknet, wobei ein flockiger weißer Feststoff in einer Gesamtausbeute von 25% erhalten wird.

Wenn bei der vorstehend beschriebenen Synthese das Bic-D-Trp (das die Verbindung mit X = D-Trp ergibt) durch Boc-D-Tyr(Cb) (das die Verbindung mit X = D-Tyr ergibt) oder durch Boc-D-phenyl-alanin (das die Verbindung mit X = D-Phe ergibt) ersetzt wird, verläuft diese Synthese in der oben beschriebenen automatischen Synthsseapparatur wieder in der gleichen Weise. In allen Fällen werden die Nonapeptide durch die Aminosäure-Analyse und das NMR-Spektrum identifiziert. Diese Analysen bestätigen die Anwesenheit der Aminosäuren in der Sequenz im erwarteten Moiverhältnis.

Charakterisierung der erfindungsgemäßen
Verbindungen

1. Nonapeptid mit X = D-Trp
Ausbeute 16%

[α] 60,3° (c= 0,5 in 5-prozentiger wäßriger Essigsäure)

Rr = O₁Il (a)
= 0.64 (b)
= 0.62 (c)

Aus 582 mg Tripeptid wurden 132 mg Endprodukt erhalten.

2. Nonapeptid mit X = D-Phe

Ausbeute 15%; [α] =59,4° (c=0,5 in 5 prozentiger ν äßriger Essigsäure)

Rr = 0.15(a)

= 0.65(b)

= 0.54(c)

Aus 582 mg Tripeplid wurden 150 mg Endprodukt erhallen.

3. Nonapeptid mit X = D-Tyr
Ausbeute 44%

[V]. =62.2^ (t-=0,5 in 5 pro7eniigcr wäßriger Essigsäure)
Rf = 0,13(a)
= 0,64(b)
= 0,56(c)

Aus 582 mg Tripeplid wurden 720 mg Endprodukt erhalten,

Die verwendeten LösUhgsmiUelsysteffle waren:
(a) Essigsäureäifiyiester/Pyridin/Essigsäurc/Haö
30; 10:3:5

(b) n-Bulanol/Pyridin/Essigsäure/HiO
15:10:3:12

(c) n-Biitanol/Essigsäureäthylester/Essigsäiire/HiO
1:1:1:1

Beispiel 2

Bei drei weiblichen, 50 Tage alten Ratten wurden Tumore erzeugt, indem 20 mg 7,12-Dimethylbenzanthracen (DMBA) in 2 ml Sesamöl dem Magen zugeführt wurden. Die Tumore entwickelten sich bei den Tieren in 10 bis 12 Wochen. Alle Tiere erhalten während der auf die Verabreichung des DMBA folgenden 100 Tage normales Futter. Nach 100 Tagen wurde mit der Behandlung mit der Verbindung mit X = D-Trp begonnen. Hierbei wurde eine Dosis von 20 μg/Tag 1:5 während einer Zeit von 11 Tagen in mehreren über den Tag verteilten Dosen subkutan als Lösung in isotonischer Kochsalzlösung, die 0,1% (Gewicht/Volumen) Rinderserumalbumin enthielt, verabreicht

Beispiel 3

Die Tiere wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 vorbereitet und vorbehandelt, jedoch wurde die Verbindung mit X = D-Tyr für die lltägige Behandlung verwendet.

Beispiel 4

Der Versuch wurde in der in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen Weise durchgeführt, wobei jedoch die Verbindung mit X = D-Phe verwendet wurde.

Die Gesamtvolumen der Tumore der Ratten zü.ti Beginn, nach 3 Tagen, am 6. Tag. am 10. Tag und am 11. Tag sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt. Für die erfindungsgemäßen Verbindungen mit X = D-Trp, D-Tyr, D-Phe sind jeweils in der ersten Reihe die Gesamtvolumen der Tumoren bei drei Ratten aufgeführt, in der zweiten Reihe jeweils das Tumorvolumen eines bestimmten Einzeltieres. Die in der ersten Reihe unter D-Phe festgestellte Vergrößerung des Gesamtvolumens der Tumore war auf einen einzelnen Tumor bei einem Tier zurückzuführen. Dieser Tumor vergrößerte sich zwischen den Tagen 6 und 10 spontan von 0.38 auf 4,6 cm^ä, jedoch wurde festgestellt, daß dieser Tumor am Tag 11 auf 3.0 cm¹ zurückgeganger, war. Ein in der gleichen Weise behandeltes drittes Tier begann die Behandlung mit vier Tufuoren von 28,1 cm³, die sich bis zum Tag 6 auf 15 cm¹ zurückgebildet hatten. Das Tier starb einschließend durch Urs.nchen, die aufgrund der Diagnose keinen Zusammenhang mit den Tumoren oder mit der Behandlung zu tun hatten (chronische murine Pneumonie).

PyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pru-MH-CjHs

X	Gesamt-Volumen der Tumore, cm3	nach 3 Tagen	am 6. Tag	am 10. Tag	am 11. Tag	Volumen
	zu Beginn					verminderung
		26,7	18,6	8,7	8,7	■an
D-Trp	39,2	7,5	8,1	3,8	3,76
	11,65	37,5	24,9	16,3	15,0	67,7%
D-Tyr	43,3	2,5	1,33	0,73	0,125
	3,6	10,1	5,4	6,4	5,5	96,5%
D-Phe	13,4		IS
	28,1

Wie die vorstehenden Versuchsergebnisse zeigen, bewirkt die Behandlung mit den Verbindungen der Formel I eine starke Rückbildung von mit DMBA erzeugten Tumoren. Es ist anerkannt, daß diese Wirkung in enger Beziehung zu der Behandlung von Brusttumoren steht, für die die mit DMBA erzeugten Tumore als Modelle dienen (siehe »Pathology of Tumours in Laboratory Animals«, Band 1, Seite 31, herausgegeben von der internationalen Gesellschaft für Krebsforschung, Lyon 1973). Die vorstehend definierte enge Klasse von Verbindungen kann somit für die Besserung von Tumoren nach langer dauernder

Behandlung sowie die Verlängerung der Überlebenszeit der Erkrankten verwendet werden. Da diese Verbindungen selbst in Dosen von 100 mg/kg im wesentlichen keine Toxizität aufweisen und die für die erfolgreiche Behandlung von Warmblütern anzuwendenden Dosen

^r>n im Bereich von μg/kg liegen, ist der therapeutische

' Index der Verbindungen äußerst hoch.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Nonapeptide der allgemeinen Formel
PyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-NH-C^Hs

in der X

D-Tyr,

D-Trp oder

D-Phe
bedeutet

2. Arzneimittel zur Verringerung der Größe von Mammatumoren oder von durch 7,12-DimethyIbenzanthracen induzierbaren Tumoren bei Warmblütern, enthaltend ein Nonapeptid gemäß Anspruch 1.