CN101906138B - 一种假环多肽及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种假环多肽及其合成方法和应用。本发明假环多肽为包含了Loloatin C药核序列结构-A1-A2-A3-A4-，即包含了Tyr、Pro、Trp和Phe的序列片段，四个氨基酸残基为L-或D-构型。本发明假环多肽的合成方法是采用液相法合成结构构件，固相法合成线性假多肽，最后经稀溶液环化法合成得到假环多肽，总收率5～12％。本发明假环多肽的制备方法具有反应条件温和、操作简便安全、产品纯度高、容易自动化、总收率稳定的优点，合成的假环多肽可以用于制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的药物。

Description

一种假环多肽及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及抗菌药物领域，具体涉及一种具有抗菌功能的假环多肽及其合成方法和应用。

背景技术

抗菌肽是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽。传统抗生素类药物一般而言，其抗菌谱一般较窄且通常只对细菌有效，对真菌、病毒等病原体无效且易产生耐药性；抗菌肽则不仅具有高效、广谱的抗菌活性，而且具有潜在的抗病毒、抗肿瘤活性、不易产生耐药性等特点。因此抗菌肽在生物医学、药学、免疫学等许多方面有着可观的发展前景。迄今为止，已经从动物、植物、微生物和人体上发现超过300多种抗菌肽。

Loloatins抗菌肽家族包含4个成员，即Loloatin A、B、C和D，它们是在实验室条件下由采集于巴布亚新几内亚南部海滩沿岸大堡礁上的海洋微生物的发酵液中分离出来的一类环十肽抗菌素。研究发现，该家族中的Loloatin C[结构式为cyclo-(-L-Val-L-Orn-L-Leu-D-Tyr-L-Pro-L-Trp-D-Phe-L-Asn-L-Asp-L-Trp)]不仅对革兰氏阳性菌(G⁺)表现出和tyrocidine C一致甚至更好的抗菌活性，还对革兰氏阴性菌(G^-)Escherichia coli表现出明显的抗菌活性(Gerard，J.M.，etal.J.Nat.Prod.1999，62，80-85)。Chen随后的研究发现Loloatin C的药核结构为-D-Tyr-Pro-Trp-D-Phe-，即该四肽序列结构对Loloatin C抑菌活性的发挥起着关键的作用(Chen H.Preparation and Evaluation of the Loloatins and Their Analogues.Ann Arbor，Mich：UMI，2003)。

研究结果表明，抗菌肽是通过破坏细菌细胞膜的完整性从而使得膜的穿透性增加而杀死细菌(Ghadiri，M.R.et al.，Nature，2001，412：452-455；Zasloff，M.，Nature，2002，415：389-395)。因此，以Loloatin C的药核结构作为模板，设计不同边链环化的假环多肽化合物，以此调控环的三维结构，使其具有更刚性的α-螺旋结构特征或纳米管状结构，将是构建具有更强抗菌活性的抗菌肽的有效途径。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的抗菌素类药物中存在的抗菌谱较窄且通常只对细菌有效，对真菌、病毒等病原体无效，易产生耐药性的缺点，提供一种高效、广谱、不易产生耐药性的抗菌假环多肽。

本发明另一目的在于提供上述假环多肽的合成方法。

本发明还有一个目的在于提供上述假环多肽的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明假环多肽是在对来自海洋微生物代谢物Loloatin C抗菌药核结构研究的基础上设计合成的，该假环多肽包含Loloatin C的药核序列结构-A1-A2-A3-A4-。

作为一种优选方案，所述A1为L-酪氨酸或D-酪氨酸；所述A2为L-脯氨酸或D-脯氨酸；所述A3为L-色氨酸或D-色氨酸；所述A4为L-苯丙氨酸或D-苯丙氨酸。

作为一种最优选方案，本发明假环多肽对边链骨架进行环化，Loloatin C的药核结构具体序列为-D-Tyr-Pro-Trp-D-Phe-，如式(I)所示，其中，m可以是2、3、或4；n可以是2、3、4或6；

式(I)。

本发明假环多肽的合成方法是采用液相法合成结构构件，固相法合成线性假多肽，最后经稀溶液环化法合成得到假环多肽。

式(I)所示的假环多肽的合成途径如下：

1.H₂N(CH₂)_nNH₂→Cbz-HN(CH₂)_nNH₂

作为一种优选方案，本发明假环多肽的具体合成步骤如下所示：

(1)构件Cbz-NH(CH₂)_n-NH₂的合成：室温下将二胺H₂N(CH₂)_nNH₂溶解于二氯甲烷中，冷至0℃，滴加氯甲酸苄酯(Cbz-Cl)进行反应。二胺和氯甲酸苄酯的摩尔比为1.0∶(0.5～0.3)，最好为1.0∶0.33，保持0℃反应过夜，然后撤去冰浴，升至室温反应1～3h。反应完成后，反应液经过滤、洗涤、干燥、减压蒸馏，最后快速柱层析纯化，制得Cbz-NH(CH₂)_n-NH₂，产率见表1；

表1构件Cbz-NH(CH₂)_n-NH₂的合成产率

(2)构件HOOC(CH₂)_m-CO₂Bzl的合成：将相应的酸酐加热至熔融状态，逐滴滴加苄醇，酸酐与苄醇的摩尔比为1.0∶(1.0～3.0)，最后为1.0∶1.5。滴加完毕，继续搅拌反应1h，冷却，加入饱和氯化钠溶液，二氯甲烷萃取，合并有机相，经水洗、干燥、减压蒸馏除溶剂，快速柱层析纯化，制得目标产物，产率见表2；

表2构件HOOC(CH₂)_m-CO₂Bzl的合成产率

(3)线性假多肽的合成：氨基酸的装配从C端到N端逐个进行，由人工控制或合成仪(美国应用系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪)设定自动控制。首先称取0.1mmol结合了第一个氨基酸即D-Phe的Wang树脂(购自吉尔生化(上海)有限公司)，装于多肽反应器中，用20％体积比的二氯甲烷(DCM)二甲基甲酰胺(DMF)溶液溶胀30min，然后用30％体积比的哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护基(Fmoc)，DMF清洗3次。将9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸溶于三吡咯基膦氧苯骈三氮唑六氟合磷盐(PyBOP)，羟基苯骈三唑(HOBt)和二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液加于反应器中偶合反应60～120min，DMF清洗3次；重复以上脱保护、偶合反应、清洗等步骤直到制备结束，制备完成后，线性假多肽经如下步骤从树脂上剪切：取下反应后的肽树脂，加入切肽试剂(其组成为：95％三氟醋酸，2.5％二氯甲烷，2.5％三乙基硅烷)，室温反应2h，过滤，滤液在室温下用旋转蒸发仪蒸除易挥发溶剂，加适量冷乙醚洗涤，残留物加少量水，冷冻干燥得线性假多肽粗品；线性假多肽的纯化采用反相高效液相法(RP-HPLC)，洗脱液为甲醇-0.1％三氟醋酸水溶液，收集洗脱峰，冷冻干燥，产品经质谱分析鉴定，线性假多肽的序列结果及产率见表3；

表3线性假多肽的结构及产率

(4)抗菌假环多肽的合成：准确称取线性假多肽溶解于干燥的乙腈中，使得溶液浓度在10^-2～10^-4mol/L之间，分批加入4～6倍量、一般为5倍量的环合试剂，环合试剂一般为O-苯骈三氮唑基-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟合硼盐(TBTU)/羟基苯骈三唑(HOBt)/二异丙基乙胺(DIPEA)。旋转蒸除溶剂，粗品用反向高效液相(RP-HPLC)分离纯化，假环多肽的结构及产率见表4。

表4抗菌假环多肽的结构及产率

本发明假环多肽可以用于制备抗菌药物，特别是用于制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的药物。利用96孔板法检测抗菌肽的抗菌活性，并以预先合成的天然抗菌肽Loloatin C为对照，进行抗菌活性检测。结果表明，本发明所设计合成的抗菌假环多肽CHR-2、CHR-5、CHR-9保留了Loloatin C的抗菌活性，抗菌假环多肽CHR-6比Loloatin C具有更好的抗菌活性。

此外，本发明还检测了合成抗菌假环多肽对人体红细胞的溶血活性，实验表明，抗菌假环多肽的溶血率值很低，证实本发明所涉及的合成抗菌假环多肽的溶血毒性很小。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明假环多肽用于制备抗菌药时，具有高效、广谱、不易产生耐药性的特点，其中假环多肽CHR-6的抗菌活性比Loloatin C更好；

(2)实验证实，本发明假环多肽的溶血毒性很小，用于抗菌药时，对人体的毒副作用小，适合推广应用；

(3)本发明假环多肽的制备方法反应条件温和，操作简便安全，产品纯度高，容易自动化，总收率稳定。

附图说明

图1为线性假多肽L的质谱图；

图2为假环多肽CHR-2的质谱图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1抗菌假环多肽CHR-2的制备及分离纯化

抗菌假环多肽CHR-2的结构见通式I和表4，经4个步骤合成。

(1)Cbz-NH(CH₂)₂NH₂的制备：将1.8g(30mmol)乙二胺溶解在250mL的二氯甲烷中，充分搅拌，冰浴冷却至0℃，随后向此溶液中缓慢滴加溶有10mmol苄氧羰基氯的10mL二氯甲烷溶液，约需要1h，滴加完后，继续保持在0℃下反应过夜。撤去冰浴，反应液升至室温，继续搅拌反应2h。反应结束后，将白色悬浮物过滤除去，滤液用饱和氯化钠水溶液洗涤(3×50mL)，无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发除去溶剂，快速柱层析纯化，得3.92g N-苄氧羰基乙二胺，产率为67.2％。产物经NMR和MS谱鉴定。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.34(m，5H)，5.18(br，1H，-CONH-)，5.08(s，2H)，3.25(d，J＝6.0Hz，1H)，3.20(d，J＝6.0Hz，1H)，2.80(t，J＝6.0Hz，2H)，1.48(s，2H，-NH2)；ESI-MS m/z：calc forC₁₀H₁₄N₂O₂ 194.1；found for[M+H]⁺ 195.3。

(2)HOOC(CH₂)₂CO₂Bzl的制备：将1.5g(15mmol)丁二酸酐加入到50mL的圆底烧瓶中，油浴加热到120℃让其刚好熔解，保持120℃，搅拌下逐滴滴加1.08g(10mmol)苄醇，15min内滴完，继续反应1h。随后加入50mL饱和氯化钠水溶液终止反应，并用二氯甲烷萃取(3×50mL)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤(3×50mL)、无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发除去溶剂，快速柱层析纯化，得丁二酸单苄酯2.84g，产率为91.3％。产物经NMR和MS鉴定。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.37-7.34(m，5H)，5.15(s，2H)，2.74-2.66(m，4H)；¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)δ：178.4，172.0，135.6，128.5，128.2，128.1，66.6，28.9，28.8；ESI-MS m/z：calc for C₁₁H₁₃O₄ 208.2；found for[M+Na]⁺231.7。

(3)线性假多肽HOOC(CH₂)₂CO-D-Tyr-Pro-Trp-D-Phe-NH(CH₂)₂NH₂(L)的制备：采用固相多肽合成法，氨基酸的装配从C端到N端逐个进行，由人工控制。首先称取0.1mmol结合了第一个氨基酸即D-Phe的Wang树脂(购自吉尔生化(上海)有限公司)，加到多肽合成反应器中，用20％体积比的二氯甲烷(DCM)二甲基甲酰胺(DMF)溶液溶胀30min，然后用30％体积比的哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护基(Fmoc)，DMF清洗3次。将9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸即Fmoc-Trp-OH溶于三吡咯基膦氧苯骈三唑六氟合磷盐(PyBOP)，羟基苯骈三唑(HOBt)和二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液加入多肽反应器中偶合反应60～120min，DMF清洗3次；重复以上脱保护、偶合反应、清洗等步骤，依次偶合Pro，D-Tyr，丁二酸单苄酯，得肽树脂。

取下反应后的肽树脂，加入切肽试剂(其成分为95％三氟醋酸，2.5％二氯甲烷，2.5％三乙基硅烷)，室温反应2h，过滤，滤液在室温下用旋转蒸发仪蒸除易挥发溶剂，加少量水，冷冻干燥得中间体化合物A。

称取80.2mg(0.1mmol)中间体A，57.2mg PyBOP(0.11mmol)及13.5mgHOBt(0.11mmol)，分别加到10mL的西林瓶中，同时加入5mL新鲜干燥的DCM/DMF混合溶液和0.06mL DIEA，避光搅拌反应15min。用滴管将所生成的活沷酯溶液转移至溶有64.1mg(0.33mmol)1-N-苄氧羰基-1，2-乙二胺的5mL二氯甲烷溶液，避光偶合反应2h，旋转蒸发将溶剂尽量除去，然后将其溶解在10mL甲醇中，加入0.2g 5％Pd/C，并通入氢气，进行脱苄氧羰基保护基及脱苄酯保护基，搅拌反应8h，旋转蒸发将溶剂除去，得线性假多肽L粗品。

线性假多肽粗品的纯化采用反相高效液相法(RP-HPLC)，洗脱液为甲醇-0.1％三氟醋酸水溶液，采用梯度洗脱，收集各洗脱峰馏分，室温下旋转蒸发除去甲醇，水溶液经冷冻干燥，得44.1mg  线性假多肽HOOC(CH₂)₂CO-D-Tyr-Pro-Trp-D-Phe-NH(CH₂)₂NH₂纯品L，产率为58.4％。产品经质谱分析鉴定：目标线性假多肽的理论分子量M值为753.84，质谱图1中显示的分子量为754.5，为[M+H]⁺峰。

(4)抗菌假环多肽CHR-2的合成：准确称取75.4mg(0.1mmol)线性假多肽样品L，溶解在100mL无水乙腈，室温搅拌下分批加入环化剂0.6mmolTBTU/HOBT/DIPEA，搅拌环化24h。室温下旋转蒸发将溶剂除去，得相应的假环多肽粗品。粗品的纯化采用反相高效液相法(RP-HPLC)，洗脱液为甲醇-0.1％三氟醋酸水溶液，采用梯度洗脱，收集各洗脱峰馏分，室温下旋转蒸发除去甲醇，水溶液经冷冻干燥，得4.5mg抗菌假环多肽CHR-2，产率6.1％。产品经质谱分析鉴定：目标假环多肽的理论分子量M值为735.93，质谱图2中显示的分子量为735.7和736.6，分别为[M]⁺和[M+H]⁺峰。

实施例2合成抗菌假环多肽的抗菌活性检测

以下实施例中所使用的各种菌株购于中国生物制品鉴定所。

采用96孔板法对合成的抗菌肽的抗菌活性进行检测，具体步骤是：将菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑菌体于MH培养基中，37℃培养过夜，稀释菌液使其浓度为10⁴～10⁵CFU/ml，按每孔100μl菌液接种于96孔板中，随后将多肽按一定比例稀释后，每孔中加入10μl，将96孔板置于37℃培养过夜，酶标仪检测OD₅₇₀值。检测结果列于表5。

含有抗菌肽的细菌的生长浓度(OD₅₇₀)与不加抗菌肽的细菌的生长浓度(OD₅₇₀)的差值相比于后者的比值若大于90％时，其抗菌肽浓度即近似等同于最小抑制浓度(MIC)。MIC被定义为显著抑制细菌生长的最低浓度。

表5中，MIC值越小，表示抗菌假环多肽的抗菌能力越强。

表5五种抗菌环肽对不同细菌的最小抑菌浓度(MIC)

实施例3体外溶血活性检测

本实施例用于检测合成抗菌假环肽对人体红细胞的溶血活性，使用的血样取于正常人血。

具体的检测步骤是：人血红细胞经PBS缓冲溶液(35mM磷酸缓冲液/0.15mol/L NaCl，pH 7.0)洗涤，取100μl的8％人血红细胞悬液于96孔板中，每孔中加入100μl抗菌肽溶液，37℃摇荡1h后，1500rpm离心5min，转移100μl上清液于新的96孔板中，通过酶标仪检测414nm波长下的吸收。阳性对照采用0.1％Triton X-100，阴性对照采用PBS。检测结果列于表6。

表6中抗菌肽的溶血率值越小，表示其溶血毒性越小。

表6五种抗菌环肽的溶血活性

Claims (5)

1.一种假环多肽，其特征在于该假环多肽对边链骨架进行环化，其结构如式(I)所示，其中，当m为2时，n为3；当m为3时，n为2或3；当m为4时，n为2；

式(I)。

2.权利要求1所述假环多肽的合成方法，其特征在于所述方法是采用液相法合成结构构件，固相法合成线性假多肽，最后经稀溶液环化法合成得到假环多肽。

3.根据权利要求2所述假环多肽的合成方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

(1)构件Cbz-NH(CH₂)_n-NH₂的合成：室温下将二胺H₂N(CH₂)_nNH₂溶解于二氯甲烷中，冷至0℃，滴加氯甲酸苄酯进行反应，保持0℃反应过夜，撤去冰浴，升至室温反应1～3h，反应完成后，反应液经过滤、洗涤、干燥、减压蒸馏，最后快速柱层析纯化，制得Cbz-NH(CH₂)_n-NH₂；

(2)构件HOOC(CH₂)_m-CO₂Bzl的合成：将相应的酸酐加热至熔融状态，逐滴滴加苄醇，滴加完毕，继续搅拌反应1h，冷却，加入饱和氯化钠溶液，二氯甲烷萃取，合并有机相，经水洗、干燥、减压蒸馏除溶剂，快速柱层析纯化，制得HOOC(CH₂)_m-CO₂Bzl；

(3)线性假多肽的合成：氨基酸的装配从C端到N端逐个进行，将结合了第一个氨基酸的Wang树脂装于多肽反应器中，用二氯甲烷二甲基甲酰胺溶液溶胀30min，再用哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护基，二甲基甲酰胺清洗3次，将9-芴甲氧羰基保护的氨基酸溶于三吡咯基膦氧苯骈三氮唑六氟合磷盐、羟基苯骈三唑和二异丙基乙基胺，溶解后的溶液加于反应器中偶合反应60～120min，二甲基甲酰胺清洗3次，重复以上步骤直到合成结束；合成完成后，从树脂上剪切线性假多肽，过滤、蒸除易挥发溶剂、洗涤、冷冻干燥，得线性假多肽粗品；将线性假多肽粗品进行纯化，得到线性假多肽；

(4)假环多肽的合成：将线性假多肽溶解于乙腈中，加入环合试剂，旋转蒸除溶剂，所得粗品经分离纯化，得到假环多肽。

4.权利要求1所述假环多肽在制备抗菌药物中的应用。

5.根据权利要求4所述假环多肽的应用，其特征在于所述假环多肽用于制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的药物。

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