实施例
现在,根据实施例将进一步详细描述本发明,但应理解本发明决不受此限制。此外,下面实施例和对比例中使用的各种基质是其表面上具有醇羟基的载体(亲水性的基质)。在含水条件下有关多孔结构的基质的性能通过排阻极限分子量和孔隙率进行评估。测量方法如下。
排阻极限分子量和孔隙率的测量
通过使用亲水性基质的凝胶浆料水溶液,以最高填充密度将基质放入具有10.7mm内径和150mm长度的不锈钢柱子中,然后,将填充的柱子装在配备RI-8020检测器(由TOSOH CORPORATION制造)的HPLC系统(由TOSOH CORPORATION制造)上。
然后,通过使用分子量为40,000,000的葡聚糖、具有表1中所示的相应分子量的普鲁兰多糖和聚乙二醇作为标准物质,将各种分子量的所述标准物质以0.5ml/min的流速引入,并且由洗脱量获得排阻极限分子量。此外,从葡聚糖和乙二醇的洗脱量和柱子体积可获得孔隙率。
用于测量的亲水性基质为5种填充材料,即聚甲基丙烯酸酯多孔填充材料[TOYOPEARL HW-65C、HW-60C、HW-55C和HW-50C(由TOSOHCORPORATION制造)]、交联的琼脂糖填充材料[Sepharose 6-Fast Flow(由GE Healthcare制造)]和交联的葡聚糖填充材料[Sephadex G-25(由GEHealthcare制造)]。所得结果由表1中所示。
表1
基质 |
排阻极限分子量 |
标准聚合物 |
孔隙率(%) |
HW65C |
2,100,000 |
普鲁兰多糖 |
75 |
HW60C |
600,000 |
普鲁兰多糖 |
74 |
HW50C |
10,000 |
普鲁兰多糖 |
78 |
Sepharose 6FF |
400,000 |
普鲁兰多糖 |
90 |
Sephadex G25 |
3,000 |
PEG1) |
70 |
1)PEG:聚乙二醇
制备例1
将表面上具有醇羟基的聚甲基丙烯酸酯多孔填充材料[由TOYOPEARL HW-60C(由TOSOH CORPORATION制造)]反复用二噁烷溶剂悬浮并在玻璃过滤器上过滤以除去水分,并且通过抽滤除去这样的填充材料浆料中的分散溶剂以制备抽干的凝胶块。
将50g凝胶块和100ml二噁烷加入到300ml分液瓶中并进行搅拌。将60mmol CDI溶解于30g二噁烷中,并且在30℃的恒温下将该CDI溶液滴加到该分液瓶中。在滴加后,继续搅拌1小时。然后,用玻璃过滤器过滤浆料,并且用二噁烷溶剂洗涤凝胶以除去未反应的CDI或副产物,从而合成经CDI活化的抽干的凝胶块。
将全部量的所得凝胶块再次加入到300ml分液瓶中并加入100ml二甲基甲酰胺(下文称作DMF),接着进行搅拌。将24mmol L-苯丙氨酸和6mmol甘氨酸溶解于25ml含有1mol/L氢氧化钠的水溶液中,加入50mlDMF并混合。将这种氨基酸溶液一次投入到上述分液瓶中并搅拌以在室温下进行反应16小时。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMF、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠溶液和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由这个反应获得的凝胶称作填充材料1。
离子交换容量的测量
将10g经洗涤的填充材料1(抽干的凝胶块)悬浮于15ml纯水中,并将其注入到具有20mm内径并配备有玻璃过滤器的玻璃柱中,并且通过抽滤除去溶剂。从所形成的床(柱子中填充材料的沉降部分)中除去超出10ml的填充材料部分(即柱子中的填充材料变为10ml),接着用30ml的0.5mol/L盐酸洗涤两次。然后用40ml纯水重复洗涤直到滤液的pH变为5或更高。将经洗涤的填充材料取出并转移到200ml烧杯中,然后悬浮于100ml的0.5mol/L氯化钠溶液中并用0.5mol/L氢氧化钠溶液通过使用自动滴定装置(COM-450,由Hiranuma Sangyo Corporation制造)进行滴定。终点pH为8.5。由直到终点时的滴定液体体积计算出离子交换容量为125毫克当量/升。填充材料1的苯丙氨酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料1的离子交换容量并且为125mmol/L。
制备例2
经CDI活化的抽干的凝胶块按与制备例1相同的方式合成。将全部量的所得凝胶块再次加入到300ml分液瓶中,并且加入100ml的DMF,接着进行搅拌。将24mmol DL-苯丙氨酸和6mmol乙醇胺溶解于25ml的1mol/L氢氧化钠水溶液中,加入50ml DMF并混合。将这种氨基酸溶液一次投入到分液瓶中并搅拌以在室温下进行反应16小时。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMF、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由该反应获得的凝胶称作填充材料2。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且得到为80毫克当量/升。填充材料2的苯丙氨酸配体的引入量对应于填充材料2的离子交换容量并且为80mmol/L。
制备例3
经CDI活化的抽干的凝胶块按与制备例1相同的方式合成。将全部量的所得凝胶块再次加入到300ml分液瓶中,并且加入100ml的DMF,接着进行搅拌。将30mmol 4-氨基甲基苯甲酸溶解于25ml的1mol/L氢氧化钠水溶液中,加入50ml DMF并混合。将这种氨基酸溶液一次投入到分液瓶中并搅拌以在室温下进行反应16小时。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMF、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由该反应获得的凝胶称作填充材料3。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且得到为105毫克当量/升。填充材料3的4-氨基甲基苯甲酸配体的引入量对应于填充材料3的离子交换容量并且为105mmol/L。
制备例4
经CDI活化的抽干的凝胶块按与制备例1相同的方式合成。将全部量的所得凝胶块再次加入到300ml分液瓶中,并且加入100ml的DMF,接着进行搅拌。将30mmol L-亮氨酸溶解于25ml的1mol/L氢氧化钠水溶液中,加入50ml DMF并混合。将这种氨基酸溶液一次投入到分液瓶中并搅拌以在室温下进行反应16小时。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMF、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由该反应获得的凝胶称作填充材料4。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为110毫克当量/升。填充材料4的亮氨酸配体的引入量对应于填充材料4的离子交换容量并且为110mmol/L。
制备例5
将交联的琼脂糖填充材料[Sepharose 6-Fast Flow(由GE Healthcare制造)]反复用二噁烷溶剂悬浮并且在玻璃过滤器上过滤以除去水分,并且通过抽滤除去这样的填充材料浆料中的分散溶剂以制备抽干的凝胶块。
将50g凝胶块按与制备例1相同的方式反应并且处理以获得填充材料5。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为100毫克当量/升。填充材料5的苯丙氨酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料5的离子交换容量并且为100mmol/L。
制备例6
将表面上具有醇羟基的聚甲基丙烯酸酯多孔填充材料[由TOYOPEARL HW-65C(由TOSOH CORPORATION制造)]反复用二噁烷溶剂悬浮并且在玻璃过滤器上过滤以除去水分,并且通过抽滤除去这样的填充材料浆料中的分散溶剂以制备抽干的凝胶块。
将50g凝胶块按与制备例1相同的方式反应并且处理以获得填充材料6。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为80毫克当量/升。填充材料6的苯丙氨酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料6的离子交换容量并且为80mmol/L。
制备例7
将表面上具有醇羟基的聚甲基丙烯酸酯多孔填充材料[TOYOPEARLHW-50C(由TOSOH CORPORATION制造)]反复用二噁烷溶剂悬浮且在玻璃过滤器上过滤以除去水分,并且通过抽滤除去这样的填充材料浆料中的分散溶剂以制备抽干的凝胶块。
将50g凝胶块按与制备例1相同的方式反应并且处理以获得填充材料7。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为185毫克当量/升。填充材料7的苯丙氨酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料7的离子交换容量并且为185mmol/L。
制备例8
将交联的葡聚糖填充材料[Sephadex G-25(由GE Healthcare制造)]反复用二甲亚砜(下文称作DMSO)溶剂悬浮并在玻璃过滤器上过滤以除去水分,并且通过抽滤除去这样的填充材料浆料中的分散溶剂以制备抽干的凝胶块。
将50g凝胶块和100ml DMSO加入到300ml分液瓶中,接着进行搅拌。将60mmol CDI溶解于30g二噁烷中,并且在30℃的恒温下将该CDI溶液滴加到该分液瓶中。在滴加后,继续搅拌1小时。然后,用玻璃过滤器过滤浆料,并且用DMSO溶剂洗涤凝胶以除去未反应的CDI或副产物,从而合成经CDI活化的抽干的凝胶块。
将全部量的所得凝胶块再次加入到300ml分液瓶中并加入100mlDMSO,接着进行搅拌。将24mmol L-苯丙氨酸和6mmol甘氨酸溶解于25ml含有1mol/L氢氧化钠的水溶液中,加入50ml DMSO并混合。将这种氨基酸溶液一次投入到上述分液瓶中并搅拌以在室温下进行反应16小时。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMSO、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由这个反应获得的凝胶称作填充材料8。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为160毫克当量/升。填充材料8的苯丙氨酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料8的离子交换容量并且为160mmol/L。
由制备例1-8制得的每种填充材料的基质、活化剂、配体和离子交换容量示于表2中。
表2
1)EA:乙醇胺,4-AMBA:4-氨基甲基苯甲酸,L-Leu:L-亮氨酸
制备例9
将制备例1中也使用的TOYOPEARL HW-60C(由TOSOHCORPORATION制造)反复用纯水悬浮并在玻璃过滤器上过滤用以纯水置换,然后通过抽滤除去这样的填充材料浆料中的分散溶剂以制备抽干的凝胶块。
将120g凝胶块、0.8mol氯乙酸钠和140ml纯水加入到500ml分液瓶中,并且随着搅拌,在50℃反应温度下将48%氢氧化钠水溶液以相当于1.6摩尔氢氧化钠的量经1小时滴加到分液瓶中。在滴加后,继续反应1小时,并且用纯水洗涤所得凝胶。通过该反应获得的具有作为离子交换基团的羧甲基的凝胶称作CM离子交换填充材料1(CM是羧甲基的缩写)。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为155毫克当量/升。
溶胀度的测量
用30ml的0.5mol/L氢氧化钠将CM离子交换填充材料1洗涤两次,然后用40ml纯水反复洗涤直到滤液的pH变成8.5或更低。将10g经洗涤的填充材料(抽干的凝胶块)悬浮于15ml纯水中,将其注入到具有20mm内径并配备有玻璃过滤器的玻璃柱中,并且通过抽滤除去溶剂。从所形成的床中除去超出10ml的填充材料部分,然后将剩余的10ml填充材料转移到玻璃过滤器中,接着用30ml的0.5mol/L盐酸洗涤两次。然后用40ml纯水反复洗涤该填充材料直到滤液的pH变为5或更高。然后用40ml丙酮洗涤两次后,取出经洗涤的填充材料并在40℃下减压干燥,测量10ml填充材料的重量以计算出溶胀度[溶胀度(ml/g)=体积(ml)/重量(g)]。该填充材料的溶胀度为5.2ml/g。
此外,使用经干燥的填充材料作为用于元素分析的样品,通过CHN自动分析仪(2400II,由Perkin Elmer制造)测量氮重量%。在制备例10和随后的制备例中,按相同的方式进行经干燥的填充材料的元素分析。
制备例10
将60g在制备例9中合成的CM离子交换填充材料1用0.5mol/L盐酸在玻璃过滤器上进行洗涤,然后用纯水洗涤直到滤液变为中性。此外,反复用二噁烷溶剂进行悬浮和过滤以除去水分,并且通过抽滤除去这种填充材料浆料中的分散溶剂以制备抽干的凝胶块。
将60g凝胶块和150ml二噁烷加入到300ml分液瓶中,然后加入30mmol N-羟基丁二酰亚胺(下文简单地称作NHS)和30mmol二异丙基碳二亚胺(下文简单地称作DIC),接着进行搅拌。在30℃下继续搅拌4小时,然后用玻璃过滤器过滤该浆料。用二噁烷溶剂洗涤所得凝胶以除去未反应的物质或副产物,从而获得63.5g抽干二噁烷的凝胶块。由该反应获得的凝胶块称作经NHS活化的填充材料1。
取20g经NHS活化的填充材料1并将其加入到100ml分液瓶中,然后加入20ml二噁烷、40ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.9)和12mmolL-色氨酸,接着进行搅拌。在25℃下反应16小时后,过滤并除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L盐酸、纯水和0.1mol/L氢氧化钠按该顺序进行洗涤以除去未反应的物质或副产物。由该反应获得的填充材料称作填充材料9。填充材料9的离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为148毫克当量/升。此外,填充材料9的溶胀度按与制备例9相同的方式进行测量,并且发现为4.8ml/g。
制备例11
取20g在制备例10中合成的经NHS活化的填充材料1并将其加入到100ml分液瓶中,然后加入20ml二噁烷、40ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.9)和12mmol L-色氨酸,接着进行搅拌。在25℃下反应16小时后,过滤并除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L盐酸、纯水、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的填充材料称作填充材料10。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为148毫克当量/升。此外,其溶胀度按与制备例9相同的方式进行测量,并且发现为4.8ml/g。
制备例12
取20g在制备例10中合成的经NHS活化的填充材料1并将其加入到100ml分液瓶中,然后加入20ml二噁烷、40ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.9)和12mmol α-氨基辛酸,接着进行搅拌。在25℃下反应16小时后,过滤并除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L盐酸、纯水和0.1mol/L氢氧化钠按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的填充材料称作填充材料11。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为148毫克当量/升。此外,其溶胀度按与制备例9相同的方式进行测量,并且发现为4.8ml/g。
制备例13
将30g(相当于35ml)在制备例9中合成的CM离子交换填充材料1和35ml纯水加入到300ml分液瓶中,并且逐渐加入0.5mol/L盐酸以调节pH为4.8。然后,将30ml二噁烷和10.9mmol NHS加入到分液瓶中,接着进行搅拌并混合以溶解NHS。将10.9mmol 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(下文简单地称作EDC)溶解于3.5ml纯水中,然后在25℃将其加入到分液瓶中,并且继续搅拌以反应2小时。通过过滤除去反应溶液,然后将获得的凝胶用纯水和二噁烷按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物,并且进行抽滤以获得31.5g抽干二噁烷的凝胶块。获得的凝胶块称作经NHS活化的填充材料2。
取20g经NHS活化的填充材料2并将其加入到100ml分液瓶中,然后加入20ml二噁烷、40ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.9)和12mmol4-氨基甲基苯甲酸,接着进行搅拌。在25℃下反应16小时后,过滤并除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L盐酸和纯水按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的填充凝胶称作填充材料12。填充材料12的离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为146毫克当量/升。此外,填充材料12的溶胀度按与制备例9相同的方式进行测量,并且发现为4.8ml/g。
制备例14
将制备例6中也使用的TOYOPEARL HW-65C(由TOSOHCORPORATION制造)反复用纯水悬浮并在玻璃过滤器上过滤用以纯水置换,然后抽滤以制备抽干的凝胶块。
将90g凝胶块、0.6mol氯乙酸钠和140ml纯水加入到300ml分液瓶中,并且随着搅拌,在50℃反应温度下将48%氢氧化钠水溶液经1小时滴加到分液瓶中(相当于1.2摩尔氢氧化钠)。在滴加后,继续反应1小时,并且用纯水洗涤获得的凝胶。通过该反应获得的凝胶称作CM离子交换填充材料2。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为115毫克当量/升。此外,其溶胀度按与制备例9相同的方式进行测量,并且发现为5.0ml/g。
制备例15
将20g(相当于25ml)在制备例14中合成的CM离子交换填充材料2和45ml纯水加入到100ml分液瓶中,并且逐渐加入0.5mol/L盐酸以调节pH为5.0。然后,将25ml二噁烷、5.7mmol NHS和2.85mmol L-色氨酸加入到分液瓶中,然后搅拌、混合且溶解。将5.3mmol EDC溶解于2.5ml纯水中,并且在40℃将其加入到分液瓶中,并且继续搅拌进行反应6小时。通过过滤除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的凝胶称作填充材料13。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为108毫克当量/升。此外,其溶胀度按与制备例9相同的方式进行测量,并且发现为4.8ml/g。
制备例16
将20g(相当于25ml)在制备例14中合成的CM离子交换填充材料2和45ml纯水加入到100ml分液瓶中,并且逐渐加入0.5mol/L盐酸以调节pH为5.0。然后,将25ml二噁烷、5.7mmol NHS和2.85mmol L-色氨酸加入到分液瓶中,然后搅拌、混合且溶解。将3.8mmol EDC溶解于2.5ml纯水中,并且在40℃将其加入到分液瓶中,并且继续搅拌进行反应6小时。通过过滤除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的凝胶称作填充材料14。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为108毫克当量/升。此外,其溶胀度按与制备例9相同的方式进行测量,并且发现为4.8ml/g。
制备例17
交联的琼脂糖弱阳离子交换凝胶[CM-Sepharose Fast Flow(由GEHealthcare制造)]的离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为105毫克当量/升。
将交联的琼脂糖弱阳离子交换凝胶反复用纯水悬浮并在玻璃过滤器上过滤用以纯水置换,然后抽滤以制备抽干的凝胶块。
将17g(相当于20ml)该凝胶块和36ml纯水加入到100ml分液瓶中,并且逐渐加入0.5mol/L盐酸以调节pH为5.0。然后,将20ml二噁烷、4.2mmol NHS和2.1mmol DL-苯丙氨酸加入到分液瓶中,然后搅拌、混合且溶解。将4.2mmol EDC溶解于2ml纯水中,并且在25℃将其加入到分液瓶中,并且继续搅拌进行反应16小时。通过在玻璃过滤器上过滤除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的凝胶称作填充材料15。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为98毫克当量/升。此外,其溶胀度按与制备例9相同的方式进行测量,并且发现为10.6ml/g。
制备例18
将制备例6中也使用的TOYOPEARL HW-65C(由TOSOHCORPORATION制造)反复用纯水悬浮并在玻璃过滤器上过滤用以纯水置换,然后抽滤以制备抽干的凝胶块。
将60g凝胶块、100g纯水和0.4mol表氯醇加入到300ml分液瓶中,并且进行搅拌和混合使温度达到45℃。在搅拌并且维持反应温度处于45℃时,将0.38mol 48%氢氧化钠经2小时滴入分液瓶中,在滴加完成后,继续搅拌进行反应2小时。用玻璃过滤器过滤反应混合物,用纯水清洗掉未反应的材料或副产物从而获得31.2g用于环氧活化填充材料的抽干凝胶块。
将30g用于环氧活化填充材料的抽干凝胶块、25mmol DL-苯丙氨酸、40ml纯水、20ml二噁烷和10mmol碳酸钠加入到100ml分液瓶中,并且进行搅拌同时维持反应温度处于25℃从而进行反应16小时。用玻璃过滤器过滤反应混合物,用50%二噁烷、0.1mol/L盐酸、纯水、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序清洗掉未反应的材料或副产物从而获得通过仲胺键将DL-苯丙氨酸引入其中的填充材料。该填充材料称作填充材料16。此外,其溶胀度按与制备例9相同的方式进行测量,并且发现为4.7ml/g。
制备例19
将30g在制备例18中合成的用于环氧活化填充材料的抽干凝胶块、90ml纯水和10ml 0.1mol/L盐酸加入到300ml分液瓶中,并且随着搅拌同时维持反应温度处于80℃,进行反应4小时通过开环将环氧基团转变成二醇基团。用纯水洗涤这种二醇填充材料,然后将全部量的该洗涤的二醇填充材料、50ml纯水和13mmol高碘酸钠加入到100ml分液瓶中,并且随着搅拌同时维持反应温度处于40℃,进行反应1.5小时将二醇基团甲酰化,接着用纯水进行洗涤以获得甲酰化填充材料。将全部量的甲酰化填充材料、30mmol DL-苯丙氨酸、60ml纯水和30ml二噁烷加入到300ml分液瓶中,搅拌并且在25℃的反应温度下溶解,接着冷却至5-10℃。将40mmol硼氢化钠溶解于12ml纯水中,然后经30分钟滴加到分液瓶中。在反应1小时后,将温度上升至25℃,并且进行反应30分钟。用玻璃过滤器过滤反应混合物,用50%二噁烷、0.1mol/L盐酸、纯水、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序清洗掉未反应的材料或副产物从而获得通过仲胺键将DL-苯丙氨酸引入其中的填充材料。该填充材料称作填充材料17。此外,其溶胀度按与制备例9相同的方式进行测量,并且发现为4.8ml/g。
由制备例9-19制得的每种填充材料的基质、活化剂、配体、离子交换容量和元素分析结果一起示于表3中。
实施例1
关于在制备例1-4中制得的填充材料1-4,就每种填充材料测量每种蛋白质样品的主峰洗脱时间和BSA吸附量。所得结果示于表2中。
此外,根据pH梯度洗脱方法的蛋白质吸附和洗脱和BAS吸附量及回收率的测量如下。
(1)根据pH梯度洗脱方法的蛋白质吸附和洗脱:
将表2中所示的填充材料分别填充到各具有7.5mm内径的75mm不锈钢柱中,将这些填充柱安装在液相色谱系统(由TOSOH CORPORATION制造)上,该系统包含进料泵(CCPM-II)、自动进样器(AS-8020)、紫外-可见光吸附吸收光度计(UV-8020)和系统控制器(SC-8020)。然后,在下面的色谱条件下进行操作来测量每个样品的峰洗脱时间。
色谱条件1:
洗脱液1:50mmol/L乙酸缓冲液(含有0.15mol/L氯化钠,pH 4.5),
洗脱液2:50mmol/L磷酸盐缓冲液(含有0.15mol/L氯化钠,pH 7.2),
洗脱方法:从100%洗脱液1至100%洗脱液2的60分钟线性梯度洗脱,然后用100%洗脱液2洗脱5分钟,接着是用100%洗脱液1再生平衡15分钟,
洗脱液的流速:1.0ml/分钟,
样品:大豆胰蛋白酶抑制剂(下文简单地称作STI)、牛血清白蛋白(下文简单地称作BSA)、人γ-球蛋白(下文简单地称作IgG)和牛α-胰凝乳蛋白酶原A(下文简单地称作CHY),
样品浓度:分别为2.0g/L(如溶解于洗脱液1中),
样品注入量:0.2ml,
温度:25℃,
检测:紫外光吸收,波长:280nm。
(2)BSA吸附量和回收率的测量
将30ml吸附缓冲液和1.0ml在表1和2中所示的一种填充材料加入到200ml锥形烧瓶中。将10ml具有溶解于吸附缓冲液达到7.5g/L浓度的BSA的溶液加入到锥形烧瓶中,并且在25℃室温下振摇3.0小时以便让BSA被吸附。然后,用吸附缓冲液将其上清液稀释两倍,并且测量该吸收。还按上述相同的方式稀释不包含填充材料的空白样,并且测量该吸收。从二者之间差值获得BSA的吸附量。
吸光度差:ΔI=Ib-W×Is
Ib:两倍稀释的空白样的吸光度,
Is:两倍稀释的上清液的吸光度,
W:填充材料中水含量的曳力系数(在所有填充材料中,W=1.015)。
BSA吸附量:A=80×F(ΔI)
F(ΔI):吸光度和BSA浓度之间关系的函数
在本文中,在得到BSA吸附量时,制备具有0.75g/L和1.5g/L浓度的BSA溶液,并且初步测量它们在280nm波长时的吸光度,以建立BSA浓度和在280nm波长时的紫外吸收度的关系表达式。
然后,用30ml吸附缓冲液洗涤吸附BSA的填充材料,将其转移到配备有过滤器的柱子(内径:10mm)中,然后还用10ml吸附缓冲液将未吸附的BSA清洗掉。然后,将洗脱缓冲液注入柱子中并且在50ml测量烧瓶中收集和回收至少45ml洗脱液,接着用洗脱缓冲液进行稀释以测量吸光度。由吸光度和BSA浓度之间关系的函数计算BSA回收量。由计算的吸附量和回收量来计算回收率。
吸附缓冲液:50mmol/L乙酸缓冲液(含有0.15mol/L氯化钠,pH 4.0),
洗脱缓冲液:0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(含有0.3mol/L氯化钠,pH 8.5)
表2中所示的填充材料是按与基质(TOYOPEARL HW-60C)相同的方式制备的填充材料,所述基质具有按普鲁兰多糖计算的800,000排阻极限分子量和75%孔隙被CDI活化,然后引入各自的配体。可以确认,在弱酸性条件下它们吸附并且保持各种蛋白质,并且在pH升高时可洗脱被吸附的蛋白质。
例如,在测量各种填充材料pKa的情况下,具有引入的4-氨基甲基苯甲酸的填充材料3具有约5.1的pKa,其高于pKa为4.2的具有所引入的其它配体的三种类型的填充材料。因此,对于填充材料3,洗脱时间延迟,这是因为该填充材料为亲水性的并且蛋白质在洗脱液的pH较高时被洗脱。
在另一方面,具有L-亮氨酸作为配体的填充材料4的疏水性相对弱,因此通过降低离子化而将其亲水性化,由此其洗脱时间相对于大多数蛋白质变得较快。然而,相对于BSA,观察到相对强的相互作用。
此外,关于所有这些填充材料,BSA吸附量均在55-60mg/ml的范围内并且通过用于该填充材料的基质(TOYOPEARL HW-60C)对于BSA的有效表面积进行粗略测定,尽管取决于配体可存在稍微差异。此外,在所有情况下回收率高,为至少94%的水平。
实施例2
关于在制备例10-12中制得的填充材料9-11,按与实施例1相同的方式就每种填充材料测量每种蛋白质样品的主峰洗脱时间和BSA吸附量。所得结果示于表3中。
填充材料9-11,如同填充材料1-4,是这样的填充材料,该填充材料中TOYOPEARL HW-60C用作基质,并且使用引入了羧甲基的填充材料通过酰胺键引入疏水性氨基酸。
由表3明显的是,各个配体通过酰胺键被引入到的填充材料(填充材料9-11)的基团还得到确认的是,它们在弱酸性条件下吸附并且保持各种蛋白质,然后在pH升高时洗脱被吸附的蛋白质。
此外,具有引入α-氨基辛酸作为配体的填充材料11的疏水性相对弱,因此通过不同于具有引入其它配体的填充材料的选择性从而洗脱蛋白质,这与填充材料4的原因相同。
关于所有填充材料,BSA吸附量均在56-60mg/ml的范围内,并且通过用于该填充材料的基质(TOYOPEARL HW-60C)对于BSA的有效表面积进行粗略测定,尽管取决于配体可存在稍微差异。此外,在所有情况下回收率高,为至少93%的水平。
实施例3
在制备例5-8中制得的填充材料5-8为其中使用与填充材料1不同孔隙性能的基质,并且在按与填充材料1相同的方式进行CDI活化后,引入L-苯丙氨酸和甘氨酸的填充材料。关于这些填充材料,每种蛋白质样品的峰值洗脱时间和BSA吸收量按与实施例1相同的方式进行测量。所得结果示于表2中。
由表2明显的是,填充材料5具有类似于填充材料1的排阻极限分子量,但由具有高孔隙率的基质[Sepharose 6-Fast Flow(由GE Healthcare制造)]来合成。每种蛋白质的洗脱性质、BSA吸附量和回收率也显示出类似于填充材料1的结果。
此外,填充材料6具有类似于填充材料1的孔隙率,但它的排阻极限分子量大并且由对于蛋白质具有小的有效表面积的基质[TOYOPEARLHW-65C(由TOSOH CORPORATION制造)]合成。尽管每种蛋白质的洗脱性质表现出类似的结果,BSA吸附的量为填充材料1的57%。回收率显示类似的结果。因此,可以确定所需的作用。
此外,填充材料7具有类似于填充材料1的孔隙率,但它由具有小排阻极限分子量的基质[TOYOPEARL HW-50C(由TOSOH CORPORATION制造)]合成,其中限制可通过具有至少一万分子量的蛋白质的孔隙。配体结合蛋白质的量最大,但高分子量蛋白质例如IgG的保留时间稍微较短,关于其它蛋白质,所述值类似于填充材料1的。
其BSA吸附量为填充材料1的40%,并且其回收率显示出类似结果。可以确认,其作用是在弱酸性条件下其吸附以盐水溶液的盐浓度溶解的蛋白质并且在中性条件下将它们洗脱,尽管所述吸附量受蛋白质的分子大小的影响。
此外,填充材料8具有小的排阻极限分子量,并由蛋白质能够透过的基本上无空隙的基质[Sephadex G-25(由GE Healthcare制造)]合成。由此,可以确认,能够与蛋白质接触的配体仅限于被引入到颗粒的外表面的配体,尽管所述配体可被引入到孔隙之内。因此所得结果使吸附量非常小,尽管蛋白质的回收率处于相同的水平。
可以确认,填充材料8的作用是在弱酸性条件下其吸附以盐水溶液的盐浓度溶解的蛋白质并且在中性条件下将它们洗脱。
实施例4
关于在制备例13中制得的填充材料12,按与制备例1相同的方式测量每种蛋白质样品的主峰洗脱时间和BSA吸附量。所得结果示于表3中。
填充材料12是这样的一种填充材料,该填充材料中具有被引入到作为基质的TOYOPEARL HW-60C中的羧甲基,并且按与填充材料1-4相同的方式通过酰胺键引入4-氨基甲基苯甲酸。
由表3明显的是,可以确认,这种配体通过酰胺键被引入到其中的填充材料12在弱酸性条件下还吸附并且保持各种蛋白质,然后在pH升高时可洗脱它们。
填充材料12的pKa约为5.0,这与填充材料3的原因相同,并且通过不同于具有引入其它配体的填充材料的选择性从而洗脱蛋白质。
BSA吸附量为60mg/ml,这类似于其它填充材料(其中TOYOPEARLHW-60C用作基质)的吸附量。此外,其回收率高,为96%的水平。因此,可以确认这种填充材料具有所需作用。
实施例5
关于在制备例15和16中制得的填充材料13和14,按与制备例1相同的方式就每种填充材料测量每种蛋白质样品的主峰洗脱时间和BSA吸附量。所得结果示于表3中。
填充材料13和14是这样的一种填充材料,该填充材料中具有大孔径尺寸的TOYOPEARL HW-65C用作基质,并另外引入羧基,然后与色氨酸一起作为配体通过酰胺键被固定。通过升高或降低所使用EDC的量可观察到被固定的量的不同。由元素分析得到的填充材料13中氮百分数为0.8%和填充材料14中的为0.3%。这些被固定的量的差异明显为蛋白质的洗脱量的差异。
在另一方面,填充材料各自的BSA吸收量为32mg/ml和30mg/ml,因此显示出类似的结果,与配体固定量的不同无关。这可解释为所吸附的量对于BSA通过用于填充材料的基质的有效表面积进行粗略测定。此外,回收率高,为至少95%的水平。
实施例6
填充材料15是这样的填充材料,该填充材料中使用引入羧甲基的琼脂糖填充材料[产品名称:CM-Sepharose-Fast Flow]作为基质,其中通过酰胺键引入DL-苯丙氨酸作为配体。按与制备例1相同的方式测量每种蛋白质样品的主峰洗脱时间和BSA吸附量。所得结果示于表3中。
由表3明显的是,BSA吸附量为60mg/ml,这类似于其它填充材料的吸附量(其中基质为TOYOPEARL-60C)。此外,回收率高,处于95%的水平。
对比例1
关于在制备例9-14中合成的CM离子交换填充材料1-2,按与制备例1相同的方式就每种填充材料测量每种蛋白质样品的主峰洗脱时间和BSA吸附量。所得结果示于表3中。
由表3明显的是,在这些填充材料中,在低的盐浓度情况下通过阳离子交换作用保持和吸附BSA。然而,因为吸附缓冲液含有0.15mol/L氯化钠,BSA没被吸附而被洗脱。因此通过亲水性的CM离子交换填充材料不能实现本发明的目的,这是由于它们需要稀释或脱盐作为预处理。
对比例2
关于在制备例18中合成的填充材料16,按与制备例1相同的方式测量每种蛋白质样品的主峰洗脱时间和BSA吸附量。所得结果示于表3中。
由表3明显的是,基于疏水性的蛋白质吸附没有发生,并且所有被引入的蛋白质直接从其中通过且被洗脱。
在填充材料16中,属于配体的苯丙氨酸的羧基和键合到环氧基上的氨基共存。因此,氨基将在酸性条件下被离子化,而羧基在碱性条件下被离子化,并且在中间范围条件下这两种官能团均被离子化。换言之,因为填充材料16没有表现出足够的疏水性,其不能够通过洗脱液的pH变化而完成吸附和脱附蛋白质的目的。
对比例3
关于在制备例19中合成的填充材料17,按与制备例1相同的方式测量每种蛋白质样品的主峰洗脱时间和BSA吸附量。所得结果示于表3中。
由表3明显的是,基于疏水性蛋白质吸附没有发生,并且所有被引入的蛋白质直接从其中通过且被洗脱。
在填充材料17中,如同填充材料16,属于配体的苯丙氨酸的羧基和仲氨基(通过甲酰基键合、接着通过还原处理而获得)共存。因此,与填充材料16的原因相同,填充材料17没有表现出足够的疏水性,其不能够通过洗脱液的pH变化而完成吸附和脱附蛋白质的目的。
制备例20
将表面上具有醇羟基的聚甲基丙烯酸酯多孔填充材料[TOYOPEARLHW-65C(由TOSOH CORPORATION制造)]反复用纯水悬浮并在玻璃过滤器上过滤,并且通过抽滤除去这样的基质浆料中的纯水以制备抽干的凝胶块。
将200g凝胶块、300ml纯水和100g氯甲基环氧乙烷加入到1L分液瓶中,并且随着搅拌,经2小时滴加85g 48%氢氧化钠同时维持反应温度处于45℃。在滴加后,再进行反应1小时,然后反复用纯水进行悬浮和过滤以洗涤来制备环氧活化基质的抽干的凝胶块。将全部量的环氧活化的凝胶块、130g具有500,000重均分子量的葡聚糖和350ml纯水加入到1L分液瓶中,然后搅拌同时维持反应温度处于25℃以溶解葡聚糖。此外,加入10g 48%氢氧化钠,并且再进行反应16小时,然后反复用纯水进行悬浮和过滤以洗涤来制备固定葡聚糖的基质的抽干的凝胶块。这称作中间基质1。中间基质1的葡聚糖的固定量通过下面的方法进行测量。
多糖固定量1的测量
将10g中间基质1(抽干的凝胶块)悬浮于15ml纯水中,然后将其注入到具有20mm内径并配备有玻璃过滤器的玻璃柱中,然后通过抽滤除去溶剂。由所形成的床(柱子中填充材料的沉降部分)的高度获得基质的体积。分别地,取5g中间基质1(抽干的凝胶块)并在50℃下减压干燥,于是测量其重量。将干燥的凝胶块和20ml 2mol/L盐酸加入到100ml配备有回流冷凝器的锥形烧瓶中,然后在90℃下将葡聚糖水解150分钟。反应后,在玻璃过滤器上通过反复用纯水悬浮和过滤以洗涤基质并再次在50℃下减压干燥,于是测量其重量。从基质水解之前和水解之后的干燥重量的差值可获得葡聚糖的固定量。所得测量结果示于表4。
表4
HECel:羟乙基纤维素
然后,将50mg中间基质1(抽干的凝胶块)反复用N,N-二甲基甲酰胺(下文称作DMF)溶剂悬浮并过滤以除去水分,通过抽滤除去这样的填充材料浆料中的分散溶剂以制备抽干的凝胶块。
将50g凝胶块和100ml DMF加入到300ml分液瓶中并进行搅拌。将60mmol CDI溶解于30g二噁烷中,并且在30℃的恒温下将该CDI溶液滴加到该分液瓶中。在滴加后,继续搅拌1小时。然后,用玻璃过滤器过滤浆料,并且用DMF溶剂洗涤凝胶以除去未反应的CDI或副产物,从而合成经CDI活化的抽干的凝胶块。
将全部量的所得凝胶块再次加入到300ml分液瓶中并加入100ml二甲基甲酰胺(下文称作DMF),接着进行搅拌。将24mmol L-苯丙氨酸和6mmol甘氨酸溶解于25ml含有1mol/L氢氧化钠的水溶液中,加入50ml DMF并混合。将这种氨基酸溶液一次投入到上述分液瓶中并搅拌以在室温下进行反应16小时。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMF、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由该反应获得的凝胶称作填充材料18。
离子交换容量的测量:
将10g经洗涤的填充材料18(抽干的凝胶块)悬浮于15ml纯水中,并将其注入到具有20mm内径并配备有玻璃过滤器的玻璃柱中,并且通过抽滤除去溶剂。从所形成的床中(柱子中填充材料的沉降部分)除去超出10ml的填充材料部分(即柱子中的填充材料变为10ml),接着用30ml的0.5mol/L盐酸洗涤两次。然后用40ml纯水重复洗涤直到滤液的pH变为5或更高。将经洗涤的填充材料取出并转移到200ml烧杯中,然后悬浮于100ml的0.5mol/L氯化钠溶液中并用0.5mol/L氢氧化钠溶液通过使用自动滴定装置(COM-450,由Hiranuma Sangyo Corporation制造)进行滴定。终点pH为8.5。由直到终点时的滴定液体体积计算出离子交换容量为125毫克当量/升。填充材料18的苯丙氨酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料18的离子交换容量并且为115mmol/L。
制备例21
按与制备例20相同的方式并在相同的条件下通过使用TOYOPEARLHW-65C合成环氧活化的基质的抽干的凝胶块。将全部量的得到的环氧活化的凝胶块、150g具有200,000重均分子量的葡聚糖和350ml纯水加入到1L分液瓶中,然后通过搅拌溶解葡聚糖同时维持反应温度处于25℃。然后,注入10g 48%氢氧化钠,并且再进行反应16小时,然后反复用纯水进行悬浮和在玻璃过滤器上过滤以洗涤来制备固定葡聚糖的基质的抽干的凝胶块。所得凝胶称作中间基质2。中间基质2的葡聚糖的固定量按与制备例20相同的方式进行测量,所得测量结果示于表4中。
然后,使用中间基质2,按与制备例20相同的方式合成经CDI活化的抽干的凝胶块。按与制备例20相同的方式,使用全部量的所得经CDI活化的凝胶块、L-苯丙氨酸和甘氨酸在室温条件下搅拌16小时进行反应。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMF、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由该反应获得的凝胶称作填充材料19。
其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为110毫克当量/升。填充材料19的苯丙氨酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料19的离子交换容量并且为110mmol/L。
制备例22
按与制备例20相同的方式并在相同的条件下通过使用TOYOPEARLHW-65C合成环氧活化的基质的抽干的凝胶块。将全部量的得到的环氧活化的凝胶块、150g具有200,000重均分子量的普鲁兰多糖和350ml纯水加入到1L分液瓶中,然后通过搅拌溶解普鲁兰多糖同时维持温度处于25℃。然后,注入10g 48%氢氧化钠,并且再进行反应16小时,然后反复用纯水进行悬浮和在玻璃过滤器上过滤以洗涤来制备固定普鲁兰多糖的基质的抽干的凝胶块。所得凝胶称作中间基质3。中间基质3的葡聚糖的固定量按与制备例20相同的方式进行测量。所得测量结果示于表4中。
然后,使用中间基质3,按与制备例20相同的方式合成经CDI活化的抽干的凝胶块。按与制备例20相同的方式,使用全部量的所得经CDI活化的凝胶块、L-苯丙氨酸和甘氨酸在室温条件下搅拌16小时进行反应。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMF、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由该反应获得的凝胶称作填充材料20。
其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为135毫克当量/升。填充材料20的苯丙氨酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料20的离子交换容量并且为135mmol/L。
制备例23
将表面上具有醇羟基的聚甲基丙烯酸酯多孔填充材料[TOYOPEARLHW-55C(由TOSOH CORPORATION制造)]通过反复用纯水悬浮和过滤来进行洗涤,并且通过抽滤除去这样的基质浆料中的纯水以制备抽干的凝胶块。
在与制备例20相同的条件下,合成环氧活化的基质的抽干的凝胶块。将全部量的所得环氧活化的凝胶块、150g具有70,000重均分子量的葡聚糖和350ml纯水加入到1L分液瓶中,然后通过搅拌溶解葡聚糖同时维持反应温度处于25℃。然后,注入10g 48%氢氧化钠,并且再进行反应16小时,然后在玻璃过滤器上反复用纯水进行悬浮和过滤以洗涤来制备固定葡聚糖的基质的抽干的凝胶块。所得凝胶块称作中间基质5。中间基质4的葡聚糖的固定量按与制备例20相同的方式进行测量。所得测量结果示于表4中。
然后,使用中间基质4,按与制备例20相同的方式合成经CDI活化的抽干的凝胶块。按与制备例20相同的方式,使用全部量的所得经CDI活化的凝胶块、L-苯丙氨酸和甘氨酸在室温条件下搅拌16小时进行反应。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMF、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由该反应获得的凝胶称作填充材料21。
其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为145毫克当量/升。填充材料21的苯丙氨酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料21的离子交换容量并且为145mmol/L。
制备例24
将表面上具有醇羟基的聚甲基丙烯酸酯多孔填充材料[TOYOPEARLHW-50C(由TOSOH CORPORATION制造)]通过反复用纯水悬浮和过滤进行洗涤,并且通过抽滤除去这样的基质浆料中的纯水以制备抽干的凝胶块。
在与制备例20相同的条件下,合成环氧活化的基质的抽干的凝胶块。将全部量的所得环氧活化的凝胶块、150g具有10,000重均分子量的葡聚糖和350ml纯水加入到1L分液瓶中,然后通过搅拌溶解葡聚糖同时维持反应温度处于25℃。然后,注入10g 48%氢氧化钠,并且再进行反应16小时,然后反复用纯水进行悬浮和在玻璃过滤器上过滤以洗涤来制备固定葡聚糖的基质的抽干的凝胶块。所得凝胶块称作中间基质5。中间基质5的葡聚糖的固定量按与制备例20相同的方式进行测量。所得测量结果示于表4中。
然后,使用中间基质5,按与制备例20相同的方式合成经CDI活化的抽干的凝胶块。按与制备例20相同的方式,使用全部量的所得经CDI活化的凝胶块、L-苯丙氨酸和甘氨酸在室温条件下搅拌16小时进行反应。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMF、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由该反应获得的凝胶称作填充材料22。
其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为188毫克当量/升。填充材料22的苯丙氨酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料22的离子交换容量并且为188mmol/L。
制备例25
将交联的琼脂糖填充材料[Sepharose 6-Fast Flow(由GE Healthcare制造)]反复用纯水悬浮并在玻璃过滤器上进行过滤,并且通过抽滤除去这样的基质浆料中的纯水以制备抽干的凝胶块。
按与实施例20相同的方式,将120g凝胶块、180ml纯水和60g氯甲基环氧乙烷加入到0.5L分液瓶中,并且随着搅拌,经2小时滴加51g 48%氢氧化钠同时维持反应温度处于45℃。在滴加后,再进行反应1小时,并且反复用纯水进行悬浮和在玻璃过滤器上过滤以洗涤来制备126.9g环氧活化的基质的抽干的凝胶块。
将总量的5/6即105.75g的环氧活化的凝胶块、75g具有200,000重均分子量的葡聚糖和175ml纯水加入到0.5L分液瓶中,并且通过搅拌溶解葡聚糖,同时维持反应温度处于25℃。然后,注入5g 48%氢氧化钠,并且再进行反应16小时,然后反复用纯水进行悬浮和过滤以洗涤来制备114.7g固定葡聚糖的基质的抽干的凝胶块。所得凝胶块称作中间基质6。中间基质6的葡聚糖的固定量通过下面的用于多糖固定量2的测量方法进行测量,这是因为所述基质可通过酸而被水解。
多糖固定量2的测量:
首先,将10g环氧活化的基质的抽干的凝胶块在50℃下减压干燥,并测量其重量。然后,用该重量乘以用于葡聚糖固定反应的凝胶块的重量从而获得干重。然后,将10g中间基质6(抽干的凝胶块)在50℃下减压干燥,并测量其重量。然后,将所得重量乘以中间基质6的凝胶块的重量从而获得干重。在中间基质6和用于反应的环氧活化的基质之间的干重的差值成为固定葡聚糖的重量,这是按每克(中间基质6的干重)的(固定的葡聚糖的量)毫克数来计算。所得测量结果示于表4中。
然后,使用中间基质6,按与制备例20相同的方式合成经CDI活化的抽干的凝胶块。按与制备例1相同的方式,使用全部量的所得经CDI活化的凝胶块、L-苯丙氨酸和甘氨酸在室温条件下搅拌16小时进行反应。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMF、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由该反应获得的凝胶称作填充材料23。
其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为85毫克当量/升。填充材料23的苯丙氨酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料23的离子交换容量并且为85mmol/L。
制备例26
将交联的琼脂糖填充材料[Sephadex G-25(由GE Healthcare制造)]反复用纯水悬浮并在玻璃过滤器上进行过滤,并且通过抽滤除去这样的基质浆料中的纯水以制备抽干的凝胶块。
按与实施例20相同的方式,将120g凝胶块、180ml纯水和60g氯甲基环氧乙烷加入到0.5L分液瓶中,并且随着搅拌,经2小时滴加51g 48%氢氧化钠同时维持反应温度处于45℃。在滴加后,再进行反应1小时,并且反复用纯水悬浮和在玻璃过滤器上过滤以洗涤来制备123.6g环氧活化的基质的抽干的凝胶块。
将总量的5/6即103.0g的环氧活化的凝胶块、75g具有200,000重均分子量的葡聚糖和175ml纯水加入到0.5L分液瓶中,并且通过搅拌溶解葡聚糖,同时维持反应温度处于25℃。然后,注入5g 48%氢氧化钠,并且再进行反应16小时,然后反复用纯水悬浮和过滤以洗涤来制备103.5g固定葡聚糖的基质的抽干的凝胶块。所得凝胶块称作中间基质7。中间基质7的葡聚糖的固定量通过上述用于多糖固定量2的测量方法进行测量,这是因为所述基质可通过酸而被水解。所得测量结果示于表4,并且重量提高在测量误差的范围之内。
然后,使用中间基质7,按与制备例20相同的方式合成经CDI活化的抽干的凝胶块。按与制备例20相同的方式,使用全部量的所得经CDI活化的凝胶块、L-苯丙氨酸和甘氨酸在室温条件下搅拌16小时进行反应。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMF、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由该反应获得的凝胶称作填充材料24。
其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为163毫克当量/升。填充材料24的苯丙氨酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料24的离子交换容量并且为163mmol/L。
在制备例20-26中制备的中间基质的多糖固定量示于表4中。
制备例27
将TOYOPEARL HW-65C反复用二噁烷溶剂悬浮并在玻璃过滤器上过滤以除去水分,并通过抽滤除去这样的填充材料浆料中的分散溶剂以制备抽干的凝胶块。
将50g凝胶块和100ml二噁烷加入到300ml分液瓶中并进行搅拌。将60mmol CDI溶解于30g二噁烷中,并且在30℃的恒温下将该CDI溶液滴加到该分液瓶中。在滴加后,继续搅拌1小时。然后,用玻璃过滤器过滤浆料,并且用二噁烷溶剂洗涤凝胶以除去未反应的CDI或副产物,从而合成经CDI活化的抽干的凝胶块。
将全部量的所得凝胶块再次加入到300ml分液瓶中,并加入100mlDMF,接着进行搅拌。将24mmol L-苯丙氨酸和6mmol甘氨酸溶解于25ml含有1mol/L氢氧化钠的水溶液中,加入50ml DMF并混合。将这种氨基酸溶液一次投入到上述分液瓶中并搅拌以在室温下进行反应16小时。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMF、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由该反应获得的凝胶称作填充材料25。其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为80毫克当量/升。填充材料25的苯丙氨酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料25的离子交换容量并且为80mmol/L。
制备例28
将交联的琼脂糖填充材料[Sepharose 6-Fast Flow(由GE Healthcare制造)]反复用二噁烷溶剂悬浮并在玻璃过滤器上过滤以除去水分,并通过抽滤除去这样的填充材料浆料中的分散溶剂以制备抽干的凝胶块。
将50g凝胶块反应,并且按与制备例26相同的方式进行处理从而获得填充材料26。其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为100毫克当量/升。填充材料26的苯丙氨酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料26的离子交换容量并且为100mmol/L。
制备例29
通过使用50g在制备例20中合成的中间基质1(抽干的凝胶块),按与制备例20相同的方式合成经CDI活化的抽干的凝胶块。
将所得凝胶块的一半量加入到100ml分液瓶中并加入50ml DMF,接着进行搅拌。将12mmol 4-氨基甲基苯甲酸和3mmol甘氨酸溶解于12.5ml含有1mol/L氢氧化钠的水溶液中,加入25ml DMF并混合。将这种氨基酸溶液一次投入到上述分液瓶中并搅拌以在室温下进行反应16小时。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMF、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由该反应获得的凝胶称作填充材料27。
其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为115毫克当量/升。填充材料27的4-氨基甲基苯甲酸和甘氨酸的总配体量对应于填充材料27的离子交换容量并且为115mmol/L。
制备例30
将在制备例29合成的剩余的经CDI活化的抽干的凝胶块的一半量加入到100ml分液瓶中并加入50ml DMF,接着进行搅拌。将15mmolα-氨基辛酸溶解于含有1mol/L氢氧化钠的水溶液中,加入25ml DMF并混合。将这种氨基酸溶液一次投入到上述分液瓶中并搅拌以在室温下进行反应16小时。
反应结束后,在玻璃过滤器上用DMF、50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序将获得的凝胶再次洗涤。由该反应获得的凝胶称作填充材料28。
其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为105毫克当量/升。填充材料28的4-氨基辛酸的配体量对应于填充材料28的离子交换容量并且为105mmol/L。
由制备例20-30制得的每种填充材料的基质、活化剂、配体和离子交换容量示于表5中。
制备例31
将120g在制备例21中合成的中间基质2的凝胶块、0.8mol氯乙酸钠和240ml纯水加入到500ml分液瓶中,并且随着搅拌,在50℃反应温度下将48%氢氧化钠水溶液以相当于1.1摩尔氢氧化钠的量经1小时滴加到分液瓶中。在滴加后,继续进行反应3小时,并且用纯水洗涤所得凝胶。通过该反应获得的具有作为离子交换基团的羧甲基的凝胶称作CM中间基质2(下文,CM是羧甲基的缩写)。其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为160毫克当量/升。
将60g所得CM中间基质2的凝胶块在玻璃过滤器上用0.5mol/L盐酸进行洗涤,然后用纯水洗涤直到滤液变为中性。此外,反复用二噁烷溶剂进行悬浮和过滤以除去水分,并且通过抽滤除去这种填充材料浆料中的分散溶剂以制备抽干的凝胶块。
将60g凝胶块和150ml DMF加入到300ml分液瓶中,然后加入35mmolN-羟基丁二酰亚胺(下文简单地称作NHS)和30mmol二异丙基碳二亚胺(下文简单地称作DIC),接着进行搅拌。在30℃下继续搅拌2小时,然后用玻璃过滤器过滤该浆料。用二噁烷溶剂洗涤所得凝胶以除去未反应的材料或副产物,从而获得63.5g抽干二噁烷的凝胶块。由该反应获得的凝胶块称作经NHS活化的填充材料1。
取20g经NHS活化的填充材料1并将其加入到100ml分液瓶中,然后加入10ml二噁烷、40ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.9)和6mmol L-色氨酸,接着进行搅拌。在25℃下反应16小时后,过滤并除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L盐酸、纯水和0.1mol/L氢氧化钠按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的填充材料称作填充材料29。填充材料29的离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为152毫克当量/升。此外,测量填充材料29的溶胀度,并且发现为4.0ml/g。
溶胀度的测量
用30ml的0.5mol/L氢氧化钠将填充材料29洗涤两次,然后用40ml纯水反复洗涤填充材料直到滤液的pH变成8.5或更低。将10g经洗涤的填充材料(抽干的凝胶块)悬浮于15ml纯水中,将其注入到具有20mm内径并配备有玻璃过滤器的玻璃柱中,并且通过抽滤除去溶剂。从所形成的床中除去超出10ml的填充材料部分,然后将剩余的10ml填充材料转移到玻璃过滤器中,接着用30ml的0.5mol/L盐酸将填充材料29洗涤两次。然后用40ml纯水反复洗涤直到滤液的pH变为5或更高。然后用40ml丙酮洗涤两次后,取出经洗涤的填充材料并在40℃下减压干燥,测量10ml填充材料的重量以计算溶胀度[溶胀度(ml/g)=体积(ml)/重量(g)]。该填充材料的溶胀度为5.2ml/g。
此外,使用经干燥的填充材料作为用于元素分析的样品,通过CHN自动分析器(2400II,由Perkin Elmer制造)测量氮重量%。在制备例32和随后的制备例中,按相同的方式进行经干燥的填充材料的元素分析。
制备例32
通过使用120g在制备例22中合成的中间基质3的凝胶块,按与制备例31相同的方式,合成具有作为离子交换基团的羧甲基的CM中间基质3。其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为180毫克当量/升。
将60g所得CM中间基质3的凝胶块在玻璃过滤器上用0.5mol/L盐酸进行洗涤,然后用纯水洗涤直到滤液变为中性。此外,反复用DMF溶剂进行悬浮和过滤以除去水分,并且通过抽滤除去这种填充材料浆料中的分散溶剂以制备抽干的凝胶块。
将60g凝胶块与NHS按与制备例29相同的方式反应来合成经NHS活化的填充材料。
将反应后获得的浆料在玻璃过滤器上过滤。然后用二噁烷溶剂洗涤所得凝胶以除去未反应的材料或副产物,从而获得63.3g抽干二噁烷的凝胶块。
取20g由该反应获得的经NHS活化的填充材料的凝胶块,按与制备例31相同的方式再次进行其与L-色氨酸的加成反应。将获得的凝胶按相同的方式进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的填充材料称作填充材料30。填充材料30的离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为172毫克当量/升。此外,测量填充材料30的溶胀度,并且发现为4.0ml/g。
制备例33
通过使用120g在制备例23中合成的中间基质4的凝胶块,按与制备例31相同的方式,合成具有作为离子交换基团的羧甲基的CM中间基质4。其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为185毫克当量/升。
将60g所得CM中间基质4的凝胶块在玻璃过滤器上用0.5mol/L盐酸进行洗涤,然后用纯水洗涤直到滤液变为中性。此外,反复用DMF溶剂进行悬浮和过滤以除去水分,并且通过抽滤除去这种填充材料浆料中的分散溶剂以制备抽干的凝胶块。由该反应获得的经NHS活化的填充材料的凝胶块称作经NHS活化的填充材料2。
取20g经NHS活化的填充材料2的凝胶块,按与制备例31相同的方式再次进行其与L-色氨酸的加成反应。将获得的凝胶按相同的方式进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的填充材料称作填充材料31。填充材料31的离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为178毫克当量/升。此外,测量填充材料31的溶胀度,并且发现为4.2ml/g。
制备例34
通过使用120g在制备例25中合成的中间基质6的凝胶块,按与制备例31相同的方式,合成具有作为离子交换基团的羧甲基的CM中间基质6。其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为115毫克当量/升。
将60g所得CM中间基质6的凝胶块在玻璃过滤器上用0.1mol/L盐酸进行洗涤,然后用纯水洗涤直到滤液变为中性。此外,反复用DMF溶剂进行悬浮和过滤以除去水分,并且通过抽滤除去这种填充材料浆料中的分散溶剂以制备抽干的凝胶块。由该反应获得的经NHS活化的填充材料的凝胶块称作经NHS活化的填充材料3。
取20g经NHS活化的填充材料3的凝胶块,按与制备例31相同的方式再次进行其与L-色氨酸的加成反应。将获得的凝胶按相同的方式进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的填充材料称作填充材料32。填充材料32的离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为103毫克当量/升。此外,测量填充材料32的溶胀度,并且发现为4.5ml/g。
制备例35
将30g(相当于35ml)在制备例31中合成的CM中间基质2和35ml纯水加入到300ml分液瓶中,并且逐渐加入0.5mol/L盐酸以调节pH为5.2。然后,将30ml二噁烷、10.9mmol NHS和6mmol 4-氨基甲基苯甲酸加入到分液瓶中,接着进行搅拌以溶解。将10.9mmol 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(下文有时简单地称作EDC)溶解于3.5ml纯水中,然后在25℃将其加入到分液瓶中,并且在25℃下进行反应16小时。通过过滤除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L盐酸和纯水按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的凝胶称作填充材料33。填充材料33的离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为151毫克当量/升。此外,将填充材料33的溶胀度按与制备例31相同的方式进行测量,并且发现为4.0ml/g。
制备例36
将30g(相当于35ml)在制备例31中合成的CM中间基质2和35ml纯水加入到100ml分液瓶中,并且逐渐加入0.5mol/L盐酸以调节pH为5.2。然后,将30ml二噁烷、10.9mmol NHS和6mmol DL-苯丙氨酸加入到分液瓶中,接着进行搅拌以溶解。将10.9mmol 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于3.5ml纯水中,然后在25℃将其加入到分液瓶中,并且在25℃下进行反应16小时。通过过滤除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L盐酸和纯水按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的凝胶称作填充材料34。填充材料34的离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为153毫克当量/升。此外,填充材料34的溶胀度按与制备例31相同的方式进行测量,并且发现为4.0ml/g。
制备例37
将30g(相当于35ml)在制备例33中合成的CM中间基质4和35ml纯水加入到100ml分液瓶中,并且逐渐加入0.5mol/L盐酸以调节pH为5.2。然后,将30ml二噁烷、10.9mmol NHS和6mmol DL-苯丙氨酸和2-乙醇胺加入到分液瓶中,接着进行搅拌以溶解。将10.9mmol 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于3.5ml纯水中,然后在25℃将其加入到分液瓶中,并且在25℃下进行反应16小时。通过过滤除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L盐酸和纯水按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的凝胶称作填充材料35。填充材料35的离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为130毫克当量/升。此外,将填充材料35的溶胀度按与制备例31相同的方式进行测量,并且发现为4.2ml/g。
制备例38
将30g(相当于35ml)在制备例32中合成的CM中间基质3和35ml纯水加入到100ml分液瓶中,并且逐渐加入0.5mol/L盐酸以调节pH为5.2。然后,将30ml二噁烷、10.9mmol NHS和6mmol DL-色氨酸加入到分液瓶中,接着进行搅拌以溶解。将10.9mmol 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于3.5ml纯水中,然后在25℃将其加入到分液瓶中,并且在25℃下进行反应16小时。通过过滤除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L盐酸和纯水按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的凝胶称作填充材料36。填充材料36的离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为170毫克当量/升。此外,将填充材料36的溶胀度按与制备例12相同的方式进行测量,并且发现为4.0ml/g。
制备例39
将30g(相当于35ml)在制备例34中合成的CM中间基质6和35ml纯水加入到100ml分液瓶中,并且逐渐加入0.5mol/L盐酸以调节pH为5.2。然后,将30ml二噁烷、10.9mmol NHS和6mmol DL-色氨酸加入到分液瓶中,接着进行搅拌以溶解。将10.9mmol 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于3.5ml纯水中,然后在25℃将其加入到分液瓶中,并且在25℃下进行反应16小时。通过过滤除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L盐酸和纯水按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的凝胶称作填充材料37。填充材料37的离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为105毫克当量/升。此外,将填充材料37的溶胀度按与制备例12相同的方式进行测量,并且发现为4.2ml/g。
制备例40
CM-TOYOPEARL 650M(由TOSOH CORPORATION制造)是具有作为基质的H W-65C的CM离子交换填充材料,并且其离子交换容量为110毫克当量/升。将该填充材料反复用纯水悬浮并在玻璃过滤器上过滤用以纯水置换,并抽滤以制备抽干的凝胶块。
将30g(相当于35ml)所述凝胶块和35ml纯水加入到100ml分液瓶中,并且逐渐加入0.5mol/L盐酸以调节pH为5.2。然后,将30ml二噁烷、10.9mmol NHS和6mmol DL-色氨酸加入到分液瓶中,接着进行搅拌以溶解。将10.9mmol 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于3.5ml纯水中,然后在25℃将其加入到分液瓶中,并且在25℃下进行反应16小时。通过过滤除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L盐酸和纯水按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的凝胶称作填充材料38。填充材料38的离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为102毫克当量/升。此外,填充材料38的溶胀度按与制备例31相同的方式进行测量,并且发现为4.0ml/g。
制备例41
交联的琼脂糖的弱阳离子交换凝胶[CM-Sepharose-Fast Flow(由GE-Healthcare制造)]的离子交换容量进行测量,并且发现为105毫克当量/升。
将交联的琼脂糖的弱阳离子交换凝胶反复用纯水悬浮并在玻璃过滤器上过滤用以纯水置换,并通过抽滤以制备抽干的凝胶块。
将17g(相当于20ml)所述凝胶块和36ml纯水加入到100ml分液瓶中,并且逐渐加入0.5mol/L盐酸以调节pH为5.0。然后,将20ml二噁烷、4.2mmol NHS和2.1mmol DL-苯丙氨酸加入到分液瓶中,接着进行搅拌以溶解。将4.2mmol EDC溶解于2ml纯水中,然后在25℃将其加入到分液瓶中,并且在25℃下继续搅拌16小时进行反应。通过在玻璃过滤器上过滤除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L氢氧化钠和纯水按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的凝胶称作填充材料39。其离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为98毫克当量/升。此外,其溶胀度按与制备例31相同的方式进行测量,并且发现为10.6ml/g。
制备例42
在与制备例20相同的条件下,通过使用TOYOPEARL HW-65C在相同条件下合成环氧活化的基质的抽干的凝胶块。将全部量的环氧活化的凝胶块和溶液(其中将100g具有400,000重均分子量的羟乙基纤维素溶解于350ml纯水中)加入分液瓶中并使其混合,然后,在搅拌并且维持反应温度处于25℃的同时,加入10g 48%氢氧化钠,并且再进行反应16小时,然后反复用纯水进行悬浮和在玻璃过滤器上过滤以洗涤来制备固定羟乙基纤维素的基质的抽干的凝胶块。所得凝胶块称作中间基质8。中间基质8的羟乙基纤维素的固定量按与制备例20相同的方式进行测量。所得测量结果示于表4中。
通过使用120g合成的中间基质8的凝胶块,按与制备例31相同的方式,合成具有作为离子交换基团的羧甲基的CM中间基质8。其离子交换容量按与制备例1相同的方式进行测量,并且发现为86毫克当量/升。
将30g(相当于35ml)所述CM中间基质8和35ml纯水加入到100ml分液瓶中,并且逐渐加入0.5mol/L盐酸以调节pH为5.2。然后,将30ml二噁烷、10.9mmol NHS和6mmol DL-色氨酸加入到分液瓶中,接着进行搅拌以溶解。将10.9mmol 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于3.5ml纯水中,然后在25℃将其加入到分液瓶中,并且在25℃下进行反应16小时。通过过滤除去反应溶液,然后将获得的凝胶用50%丙酮、0.1mol/L盐酸和纯水按该顺序进行洗涤以除去未反应的材料或副产物。由该反应获得的凝胶称作填充材料40。填充材料40的离子交换容量按与制备例20相同的方式进行测量,并且发现为86毫克当量/升。此外,填充材料40的溶胀度按与制备例31相同的方式进行测量,并且发现为4.2ml/g。
由制备例31-42制得的每种填充材料的基质、活化剂、配体、离子交换容量和元素分析的结果示于表6中。
实施例7
关于在制备例20-26中制得的填充材料18-24,就每种填充材料测量各蛋白质样品的主峰洗脱时间、牛血清白蛋白(下文简单地称作BSA)的吸附量和人γ-球蛋白(下文简单地称作IgG)的吸附量。所得结果示于表5中。
此外,根据pH梯度洗脱方法的蛋白质吸附和洗脱,BAS和IgG吸附量以及回收率的测量如下进行。
(1)根据pH梯度洗脱方法的蛋白质吸附和洗脱:
将表5中所示的填充材料分别填充到各具有7.5mm内径的75mm不锈钢柱中,将这些填充柱按装在液相色谱系统(由TOSOH CORPORATION制造)上,该系统包含进料泵(CCPM-II)、自动进样器(AS-8020)、紫外-可见光吸收光度计(UV--8020)和系统控制器(SC-8020)。然后,在下面的色谱条件下进行操作来测量每个样品的峰洗脱时间。
色谱条件1:
洗脱液1:50mmol/L乙酸缓冲液(含有0.15mol/L氯化钠,pH 4.5),
洗脱液2:50mmol/L磷酸缓冲液(含有0.15mol/L氯化钠,pH 7.2),
洗脱方法:从100%洗脱液1至100%洗脱液2的60分钟线性梯度洗脱,然后用100%洗脱液2洗脱5分钟,接着是用100%洗脱液1再生平衡化15分钟,
洗脱液的流速:1.0ml/分钟,
样品:大豆胰蛋白酶抑制剂(下文简单地称作STI)、牛血清白蛋白(下文简单地称作BSA)、人γ-球蛋白(下文简单地称作IgG)和牛α-胰凝乳蛋白酶原A(下文简单地称作CHY),
样品浓度:分别为2.0g/L(如溶解于洗脱液1中),
样品注入量:0.2ml,
温度:25℃,
检测:紫外光吸收,波长:280nm。
(2)BSA吸附量和回收率的测量
将30ml吸附缓冲液和1.0ml在表5中所示的一种填充材料加入到200ml锥形烧瓶中。将10ml具有溶解于吸附缓冲液中达到15g/L浓度的BSA的溶液加入到锥形烧瓶中,并且在25℃室温下振摇3.0小时以便让BSA被吸附。然后,用吸附缓冲液将其上清液稀释2.5倍,并且测量该吸光度。还按上述相同的方式稀释不包含填充材料的空白样,并且测量该吸光度。从二者之间差值获得BSA的吸附量。
吸光度差:ΔI=Ib-W×Is
Ib:2.5倍稀释的空白样的吸光度,
Is:2.5倍稀释的上清液的吸光度,
W:填充材料中水含量的曳力系数(coefficient for drag-in water cotent)(在所有填充材料中,W=1.015)。
BSA吸附量:A=80×F(ΔI)
F(ΔI):吸光度和BSA浓度之间关系的函数
在本文中,在得到BSA吸附量时,制备具有0.75g/L和1.5g/L浓度的BSA溶液,并且初步测量它们在280nm波长时的吸光度,以建立BSA浓度和在280nm波长时的紫外吸收度的关系表达式。
然后,用30ml吸附缓冲液洗涤吸附BSA的填充材料,将其转移到配备有过滤器的柱子(内径:10mm)中,并然后再用10ml吸附缓冲液将未吸附的BSA清洗掉。然后,将洗脱缓冲液注入柱子中并且在50ml测量烧瓶中收集和回收至少45ml洗脱液,接着用洗脱缓冲液进行稀释以测量吸光度。由吸光度和BSA浓度之间关系的函数计算BSA回收量。由计算的吸附量和回收量来计算回收率。
吸附缓冲液:50mmol/L乙酸缓冲液(含有0.15mol/L氯化钠,pH 4.0),
洗脱缓冲液:0.1mol/LTris-H Cl缓冲液(含有0.3mol/L氯化钠,pH 8.5)
(3)IgG的吸附量和回收率
将30ml吸附缓冲液和1.0ml在表5中所示的一种填充材料加入到200ml锥形烧瓶中。将5ml具有约150mg/ml浓度的人γ-球蛋白(由The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute制造)溶解于吸附缓冲液中并然后稀释至50ml。将10ml该溶液加入到锥形烧瓶中,并且在25℃温度下振摇3.0小时以便让IgG被吸附。然后,用吸附缓冲液将其上清液稀释5倍,并且测量该吸光度。还按上述相同的方式稀释不包含填充材料的空白样,并且测量该吸光度。从二者之间差值获得IgG的吸附量。
吸光度差:ΔI=Ib-W×Is
Ib:5倍稀释的空白样的吸光度,
Is:5倍稀释的上清液的吸光度,
W:填充材料中水含量的曳力系数(在所有填充材料中,W=1.015)。
IgG吸附量:A=200×ΔI/1.4
(每1.0g IgG的吸光度是1.4)
然后,用30ml吸附缓冲液洗涤吸附IgG的填充材料,将其转移到配备有过滤器的柱子中(内径:10mm),并然后还用10ml吸附缓冲液将吸附的IgG清洗掉。然后,将洗脱缓冲液注入柱子中并且收集和回收至少50ml洗脱液,接着在200ml容量瓶中用洗脱缓冲液进行稀释以测量吸光度。由吸光度计算IgG回收量。由计算的吸附量和回收量来计算回收率。
IgG回收量:R=200×Ir/1.4
Ir:回收IgG溶液的吸光度
此外,吸附缓冲液和洗脱缓冲液是用于BSA吸附量测量的相同溶液。
表5中所示的填充材料18-24是这样的填充材料,该填充材料中基质具有按普鲁兰多糖计算10,000-2,100,000或按聚乙二醇计算3,000的排阻极限分子量,所述基质是通过非离子多糖被固定到其上的中间基质用CDI将其活化,然后引入L-苯丙氨酸和甘氨酸。由表5明显的是,可以确认,在弱酸性条件下它们吸附并且保持各种蛋白质,并且在pH升高时可洗脱被吸附的蛋白质。
此外,可以确认,在所有情况下得自具有按普鲁兰多糖计算至少300,000排阻极限分子量的基质的填充材料18-21和23的BSA和IgG吸附量非常高,为至少85mg/ml的水平。
在使用得自具有大排阻极限分子量的基质的填充材料18-20时,对于具有大分子量(分子量:155,000)的IgG的提高吸附量的影响大。对于得自具有小排阻极限分子量的基质的填充材料21-23,提高BSA(分子量:66,000)吸附量的影响大而提高IgG吸附量的影响相对小。
在另一方面,提高对于具有至多10,000排阻极限分子量的填充材料22和24的BSA和IgG吸附量的影响在这两种填充材料中不大。然而,估计对于填充材料22,与BSA(具有至多50,000分子量的蛋白质)或肽相比具有较小分子量的蛋白质的吸附量可能提高。此外,对于填充材料24,吸附量绝对值的提高不大,这是因为仅颗粒的外表面可用于蛋白质。
此外,在所有情况下所述回收率高,为至少94%的水平。
参考例1
在制备例27-28中制得的填充材料25和26是这样的填充材料,该填充材料中将具有400,000或2,100,000排阻极限分子量的基质用于CDI活化,然后引入L-苯丙氨酸和甘氨酸。按与实施例7相同的方式,就每种填充材料测量各蛋白质样品的主峰洗脱时间和BSA和IgG的吸附量。所得结果示于表5中。
由表5明显的是,可以确认,在弱酸性条件下这些填充材料吸附并且保持各种蛋白质,并且在pH升高时洗脱被吸附的蛋白质。然而,甚至在具有合适于蛋白质吸附量的孔隙性能的填充材料26的情况下,BSA和IgG的吸附量达不到65mg/ml。对于具有大排阻极限分子量和较小有效表面积的填充材料25,其吸附量更小。在另一方面,通过使用多糖被固定到其上的中间基质合成的填充材料18-21和23的吸附量约是填充材料25的3倍,这可理解为通过使用多糖被固定到其上的中间基质显著提高了其性能。
此外,在所有填充材料中蛋白质回收率高,为至少94%的水平。
实施例8
在制备例29和30中制得的填充材料27和28是这样的填充材料,该填充材料中将具有按普鲁兰多糖计算2,100,000排阻极限分子量的基质用于CDI活化,然后分别引入4-氨基苯甲酸和α-氨基辛酸。按与实施例7相同的方式,就每种填充材料测量各蛋白质样品的主峰洗脱时间和BSA吸附量。所得结果示于表5中。
由表5明显的是,可以确认,在弱酸性条件下这些填充材料吸附并且保持各种蛋白质,并且在pH升高时洗脱被吸附的蛋白质。此外,在这两种填充材料中,可以确认BSA和IgG的吸附量非常高,为至少95mg/ml的水平。此外,在所有情况下蛋白质回收率高,为至少92%的水平。
实施例9
在制备例31-34中制得的填充材料29-32是这样的填充材料,该填充材料中使用具有按普鲁兰多糖计算300,000或2,100,000排阻极限分子量的基质来合成非离子多糖被固定到其上的中间基质,引入羧基,接着通过使用有机混合物中的碳二亚胺进行NHS活化,然后引入L-色氨酸。按与实施例7相同的方式,就每种填充材料测量每种蛋白质样品的主峰洗脱时间和BSA和IgG的吸附量。所得结果示于表6中。
由表6明显的是,可以确认,在弱酸性条件下那些填充材料吸附并且保持各种蛋白质,并且在pH升高时可洗脱被吸附的蛋白质。此外,在所有填充材料中,可以确认BSA和IgG的吸附量非常高,为至少85mg/m的水平。对于得自具有大排阻极限分子量的基质的填充材料29和30,对于具有大分子量的IgG的提高吸附量的影响大。对于得自具有较小排阻极限分子量的基质的填充材料31和32,提高IgG吸附量的影响相对小而提高BSA吸附量的影响大。此外,在所有填充材料中蛋白质回收率高,为至少94%的水平。
实施例10
在制备例35-37中制得的填充材料33-35是这样的填充材料,该填充材料中使用具有按普鲁兰多糖计算300,000或2,100,000排阻极限分子量的基质来合成非离子多糖被固定到其上的中间基质,并引入羧基,然后通过使用有机溶剂和水的混合物中的水溶性碳二亚胺同时进行NHS活化并且引入配体。按与实施例7相同的方式,就每种填充材料测量各蛋白质样品的主峰洗脱时间和BSA和IgG的吸附量。所得结果示于表6中。
由表6明显的是,可以确认,在弱酸性条件下那些填充材料吸附并且保持各种蛋白质,并且在pH升高时可洗脱被吸附的蛋白质。此外,在所有填充材料中,可以确认BSA和IgG的吸附量非常高,为至少100mg/ml的水平。得自具有大排阻极限分子量的基质的填充材料33和34,对具有大分子量的IgG的提高吸附量的影响大。对于得自具有较小排阻极限分子量的基质的填充材料35,提高IgG吸附量的影响相对小而提高BSA吸附量的影响大。此外,在所有填充材料中蛋白质回收率高,为至少93%的水平。
实施例11
在制备例38、39和42中制得的填充材料36、37和40是这样的填充材料,该填充材料中使用具有按普鲁兰多糖计算400,000或2,100,000排阻极限分子量的基质来合成非离子多糖或多糖衍生物被固定到其上的中间基质,并引入羧基,然后通过使用有机溶剂和水的混合物中的水溶性碳二亚胺同时进行NHS活化并且引入配体(L-色氨酸)。按与实施例7相同的方式,就每种填充材料测量每种蛋白质样品的主峰洗脱时间和BSA和IgG的吸附量。所得结果示于表6中。
由表6明显的是,可以确认,在弱酸性条件下那些填充材料吸附并且保持各种蛋白质,并且在pH升高时可洗脱被吸附的蛋白质。此外,在所有填充材料中,可以确认BSA和IgG的吸附量非常高,为至少92mg/ml的水平。对于得自具有大排阻极限分子量的基质的填充材料38和42,提高具有大分子量的IgG吸附量的影响大。对于得自具有较小排阻极限分子量的基质的填充材料39,提高IgG吸附量的影响相对小而提高BSA吸附量的影响大。此外,在所有填充材料中蛋白质回收率高,为至少94%的水平。
参考例2
在制备例40和41中制得的填充材料38和39的基质的排阻极限分子量分别相当于填充材料36和37的基质的排阻极限分子量,但多糖间隔基团没有被固定。换言之,它们是其中羧基直接被引入基质的离子交换填充材料,和其中通过使用有机溶剂和水的混合物中的水溶性碳二亚胺同时进行NHS活化和引入配体(L-色氨酸)的填充材料。按与实施例7相同的方式,就每种填充材料测量每种蛋白质样品的主峰洗脱时间和BSA和IgG的吸附量。所得结果示于表6中。
由表6明显的是,可以确认,在弱酸性条件下这些填充材料吸附并且保持各种蛋白质,并且在pH升高时可洗脱被吸附的蛋白质。然而,甚至在具有合适于蛋白质吸附量的孔隙性能的填充材料39的情况下,BSA和IgG的吸附量达不到65mg/ml。对于具有大排阻极限分子量和较小有效表面积的填充材料38,其吸附量更小。在另一方面,通过使用多糖固定于其上的中间基质合成的填充材料36和37的吸附量约是填充材料38的3倍,这可理解为通过使用多糖被固定到其上的中间基质显著提高了其性能。
此外,在所有填充材料中蛋白质回收率高,为至少93%的水平。
将2008年12月18日提交的日本专利申请No.2008-322642和2009年3月11日提交的日本专利申请No.2009-058122(包括说明书、权利要求书和概述)的全部内容引入作为参考。