DE3223087A1 - Verfahren zur reinigung von interferon - Google Patents
Verfahren zur reinigung von interferonInfo
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Description
HOPFMANN · EITLE & PARTNER
PATENTANWÄLTE
DIPL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN
ARABELLASTRASSE 4 . D-8000 MO NCHEN 81 · TELEFON (08?) 9Π087 · TELEX 05-29619 (PATHE)
~A- 36 820 rci/fg
MOCHIDAPHARMACEUTICAL CO., LTD., Tokyo / Japan
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von
Interferon.
Interferon stellt ein Protein dar, welches nach Infektion durch einen Virus oder durch eine Immunoreaktion, wie z.B.
eine Antigen-Antikörper-Reaktion erzeugt wird. Interferon hat einen antiviralen Effekt.
Es sind verschiedene Verfahren bekannt, um Interferon zu erzeugen. Leukozyten oder lymphoblastische Zellen können stimuliert
werden, um mit geeigneten Viren oder Lectinen Interferon zu erzeugen.
Fibroblast-Zellen können ebenfalls stimuliert werden, um mit Viren oder synthetischen Nucleinsäuren Interferon zu produzieren.
Ausserdem machen es die neuerlichen Entwicklungen der rekorabinierenden
DNA-Technologie möglich, Interferon zu erzeugen, und zwar nicht mit Hilfe von Zellkulturen von Säugetieren;
sondern durch Kulturen von Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli und Bacillus subtilis, welche
mit einem Plasmid, welches ein Interferongen trägt, transformiert werden.
Interferon wird, je nach dessen Ursprung, in drei Kategorien eingeteilt. Leukozyten und lymphoblastische Zellen, welche
mit Viren stimuliert wurden, erzeugen Interferon-alpha; jene
Zellen, welche mit Lectinen stimuliert wurden, produzieren Interferon-gamma; Fibroblast-Zellen, welche mit einer synthetischen
Nucleinsäure stimuliert wurden, produzieren Interferon-beta.
In den letzten Jahren wurden klinische Versuche mit diesen drei Typen, insbesondere mit den alpha- und beta-Typen von
■ Interferon, als Anti-Tumor- oder anti-virales Agens durchgeführt.
Jedoch beträgt- gegenwärtig -.. die Reinheit von Interferonpräparationen
für die klinische Verwendung ca. 0,01 bis 1,0 %, sowohl bei Inter feron-alpha als auch bei Interferonbeta.
Es wurde von Nebeneffekten, z.B. Pyrexie, Allergie, etc.,berichtet, was vermutlich auf Verunreinigungen zurückzuführen
1st. Aus diesem Grunde ist die Entwicklung von hochgereinigten Interferon-Präparationen wünschenswert.
Es wurden zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, um Interferon
zu reinigen, z.B. Versuche welche basieren auf: Affini-
\ tätschromatografie; CPG (Edy, V. G. et al., J. Gen. Virol.,
Vol. 33, 517-521, 1976), Zinkchelate (Edy, V. G. et al., J. Biol. Chem. Vol. 252, 5934-5935, 1977), Concanavalin A
(Davey, M.W. et al., Biochem., VoI 15, 704-713, 1976; Carter
W.A. et al., Pharmac. Ther., Vol. 8, 359-377, 1980), AntiInterferon-Antikörper (Berg, K. et al., J. Immunol., Vol.114,
- < 640-644, 1975), oder Versuche die auf dem Verfahren mit KSCN
J§ beruhen (Cantell, K. et al., Pharmac. Ther. C, Vol. 1, 369,
30°! 1977). Keines dieser Verfahren erfüllt jedoch in ausreichen-
"ί dem Masse die Anforderungen an die Ausbeute (recovery rate)
und die gewünschte Reinheit; ausserdem zeigt sich in jedem Falle das folgende Dilemma: die Herstellung eines hochgereinigten
Interferons würde zu einer Reduzierung der Ausbeute führen, während eine hohe Ausbeute wiederum zu einer geringen Reinheit
führt.
32230S7
Im Hinblick auf die vorstehenden Umstände und die Nachteile des Standes der Technik wurden von der Anmolderin ausgedehnte
Untersuchungen über viele Jahre hindurch ausgeführt; schliesslich konnte die Anmelderin ein Adsorbens auffinden, welches
ein hohes Acrylonitrilpolymer, das spezifisch Interferon adsorbiert,
enthält. Hochgereinigtes Interferon kann in einfacher Weise mit nahezu 100%iger Rückgewinnungsrate durch einen
einzigen Eluierungsschritt des Interferons mit einem geeigneten Puffer erhalten werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Reinigung von Interferon zur Verfügung zu stellen,
mit welchem die Nachteile des Standes der Technik vermieden werden.
Diese Aufgabe wird gemäss der Erfindung durch ein Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine interferonhaltige
Lösung in Kontakt mit einem oder mehreren Adsorbentien bringt, welche ein Acrylonitril-Makropolymer zur
Adsorption des Interferons an dasselbe enthalten, und daraufhin dieses eluiert.
Ein. weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur
Reinigung von Interferon zur Verfügung zu stellen, mit Hilfe dessen ein hochgereinigtes Interferon mit einer Rückgewinnungsausbeute
von nahezu 100 % erhalten werden kann.
Ausserdem. ist es Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Peinigung
von Interferon zur Verfügung zu stellen, bei welchem eine wässrige Lösung von gewöhnlichen organischen Substanzen als
Eluierungsmittel verwendet wird.
Ein weiteres Ziel gemäss der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Reinigung von Interferon zur Verfügung zu stellen, bei
welchem Protein, Zucker oder Aminosäure zu dem Eluat zugegeben
wird, um das Interferon in demselben zu stabilisieren.
Die vorliegende Erfindung lässt sich nicht nur auf die Reinigung von Interferon anwenden, welches durch Säugetierzellen produziert
wurde, sondern ist auch anwendbar auf die Reinigung von Interferon, welches durch ein beliebig anderes Verfahren, z.B.
durch rekombinante DNA-Technik etc. produziert wurde.
Das allgemeine Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss der vorliegenden Erfindung wird auf folgende Weise durchgeführt:
a) Eine interferonhaltige Lösung wird auf einen pH-Wert von 4,0 bis 8,5, vorzugsweise 5,0 bis 8,0, eingestellt,
b) die Lösung wird in Kontakt mijt einem oder mehreren Adsorbentien
gebracht, welche hochpolymeres Acrylonitril enthalten, mit Hilfe der Säulenmethode oder einem chargenweisen
Verfahren (batch method), um das Interferon an das Adsorbens zu adsorbieren, und
c) daraufhin wird das Interferon mit einer geeigneten Lösung wiedergewonnen.
Geeignete Adsorbentien, die gemäss der Erfindung verwendet werden, stellen vorzugsweise Fasermaterialien dar, welche
ein hochpolymeres Acrylonitril
enthalten; die Auswahl der Adsorbentien ist jedoch nicht auf Fasermaterialien limitiert. Die Fasern, welche Acrylonitril
enthalten, werden in Japan nach den Bestimmungen zur Qualitätsangabe wie folgt klassifiziert, d.h. Fasern, welche
50 Gew.-% oder mehr Acrylonitril enthalten, werden "Acryl"
genannt, und solche Fasern, die weniger als die vorstehenden enthalten, werden als "acrylic" bezeichnet; in den Vereinigten
Staaten wird die Bezeichnung "Acryl" für solche Fasern verwendet, die 85 Gew.-% oder mehr Acrylonitril enthalten, und
die Bezeichnung "Modacryl" für solche verwendet, die 35 bis 85 % (ausschliesslich) nach dem Gewicht enthalten. In der
vorliegenden Erfindung ist es aufgrund der Tatsache, dass
sämtliche der vorstehend genannten Fasern spezifisch Interferon adsorbieren und eluieren können, nicht erforderlich/
zwischen denselben zu unterscheiden; aus diesem Grunde umfasst das Adsorbens gemäss der Erfindung sämtliche der vorstehend
genannten Fasern.
Als geeignete Fasern können z.B. genannt werden: Cashimilon (Asahi Chemical), Kanebo Acryl (Kanebeo), Kanekalon (Kanebo),
Voneil (Mitsubishi Rayon), Exlan (Japan Exlan), Beslon (Toho
Beslon) Toraylon (Toray), Pewlon (Asahi Chemical), Silpalon (Mitsubishi Rayon), Promix (Toyo Spinning), Orion, Acrilan,
Creslan, Zefran, Verel, Dynel, Vinyon N in den Vereinigten
Staaten; Courtelle, Teklan in Grossbritannien, Pan, Dralon
in der Bundesrepublik Deutschland, etc.. Ausserdem können ausser Fasern alle weiteren Formen, wie Schwämme, Pulver,
Flocken, poröse Granalien, Filme, lineare Formprodukte (linear molded products) oder daraus hergestellte Sekundärprodukte
verwendet werden. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass das hochpolymere Acrylonitril auch Comonomerkomponenten
enthalten kann, wie Methylacrylat, Methylmethacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Vinylacetat, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid,
etc..
Es bestehen keine besonderen Beschränkungen in bezug auf das Eluierungsmittel für Interferon, so lange dieses das Interferon
von dem Adsorbens, welches das hochpolymere Acrylonitril enthält, eluieren kann; gute Ergebnisse werden mit einer
wässrigen Lösung von gewöhnlichen, organischen oder anorganischen Substanzen, wie Natriumchlorid,. Ammoniumchlorid,
phosphaten, Acetaten, Aminosäuren, Alkoholen, Alkylenglykolen, Polyalkylenglykolen, Dimethylfulfoxid, etc., erhalten.
Obwohl der pIi>Wart άοα Eluierungsmittels im Boreich von pH
2 bis 9 im allgemeinen zu bevorzugen ist, und zwar aufgrund der Stabilität des Interferons, ist es nicht erforderlich,
unbedingt auf diesem pH-Bereich zu bestehen. Würde z.B. in
einem Falle die Eluierung bei Verwendung eines pH 1O Eluierungsmittels
durchgeführt, so ergäbe dies kein Problem, sofern der pH-Wert des Eluats wieder auf einen geeigneten pH-Wert
zurückgebracht wird, bei welchem das Interferon stabil ist. Ausserdem ist es auch möglich, das Interferon in dem Eluat
durch Zugabe von ca. 0,005 bis 1 % Protein, wie z.B. Humanserumalbumin, Gelatine, etc.,ca'. 1.bis'10% Zucker, wie Sucrose.
Mannit, Glucose, etc., oder ca. 0,01 bis 1 % Aminosäure, wie Glycin, Cystin, etc., zu dem Eluat zu stabilisieren.
Im folgenden werden Vergleichsbeispiele mit Hilfe des erfindungsgemässen
Verfahrens und konventioneller Verfahren beschrieben; Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass sich die
Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Ungereinigte Lösungen von Interferon, die - wie in den Beispielen gezeigt, gereinigt werden sollten - wurden wie folgt
hergestellt:
A) Human-Fibroblast-Zellen wurden unter Verwendung von
Eagle's Minimum Essential Medium (MEM), welches durch 10 % Rinder-Fötalserum ergänzt wurde, bis zur Konfluenz kultiviert;
von der Kultur wurde Interferon-beta (IFN-beta) nach dem von
Mozes, L.W. et al (Virology, Volk. 65, 100-111,1975) beschriebenen
Verfahren erhalten. Der Gehalt an IFN-beta betrug 6.500 internationale Einheiten pro ml (IU/ml).
B) Von Humanleukozyten wurde Interferon alpha (IFN-alpha) gemäss
dem. von Strander, H. et al (Ann. Med. Exp. Fenn., Vol.
44, 264-273, 1966) beschriebenen Verfahren erhalten. Der Gehalt an IPN-alpha betrug 104.000 IU/ml.
C) Von einer menschlichen lymphoblastischen Zellinie (Namalwa)
wurde eine Interferonlösung erhalten, die hauptsächlich IFN-alpha (1.0.200 IU/ml) enthielt, nach dem von Strander H. et al
-Kf-
(Literatur siehe oben) beschriebenen Verfahren,
Beispiel 1
1.000 ml (6,5 χ 10 IU) IFN-beta, welches nach der vorstehend
beschriebenen Methode A) erhalten worden war, wuräsn.mit 0,5 N
Essigsäure auf pH 6,0 eingestellt und durch eine Säule mit
5 g Polyacrylonitril-Faser (Handelsname: Vonnel, Mitsubishi
Rayon) · geleitet, um das IFN-beta auf der Säule zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 500 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4)
gewaschen; dann wurde das IFN-beta mit 300 ml 3 M NH.Cl
eluiert.
1.000 ml (6,5 χ 106 IU) IFN-beta, welches nach Methode A)
erhalten worden war, wurden'.'mit 0,5 N wässrigem Ammoniak auf
pH 8,0 eingestellt, und über eine Säule, welche mit 4,6 g Polyacrylonitril-Faser (Handeslname: Cashimilon, Asahi Chemical)
gepackt war, geleitet, um das IFN-beta auf der Säule zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 200 ml 1 M NaCl gewaschen
und dann das IFN-beta mit 100 ml 0,5 M NaGl/50 % Ethylenglykol-Lösung
eluiert.
2.000 ml IFN-beta, welches gemäss Methode A) erhalten worden
war, wurden mit 0,01 N Salzsäure auf pH .7,0 eingestellt und über eine mit 6,5 g Polyacrylonitril-Faser (Handelsname:
Toreion, Toray) gepackte Säule geleitet; dann wurde die Säule mit 450 ml 0,01 M Phosphatpuffer, welcher 1 M NaCl enthielt,
gewaschen. Daraufhin wurde IFN-beta mit Hilfe von 100 ml 1 M NaCl/60% Propylenglykol-Lösung von der Säule eluiert.
Ein Vergleich der Ergebnisse mit denjenigen konventioneller
Verfahren ist in Tabelle 1 wiedergegeben.
| Tabelle | 1 | Rückgewinnung | Spezifische |
| Ausbeute | Aktivität | ||
| (%) | (Iü/mq) | ||
| Verfahren gemäss der Erfindung | 109 | 2,3 χ 107 | |
| Beispiel 1 | 97 | 6,8 χ 107 | |
| Beispiel 2 | 102 | 9,0 χ 107 | |
| Beispiel 3 | |||
| Konventionelle Verfahren | 52 | 1,0 χ 106 | |
| Concanavalin A* | 57 | 1,3 χ 106 | |
| Zn-Chelat ** |
* gemäss dem Verfahren nach Davey, M.W. et al (Biochim., Vol. 15, 704-713, 1976).
** gemäss dem Verfahren nach Edy, V.G. et al (J. Biol. Chem.,
VoI 252, 5934-5935, 1977).
Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, zeigt sich deutlich, dass das Reinigungsverfahren gemäss der Erfindung im Vergleich zu den
konventionellen Methoden sowohl in bezug auf die Rückgewinnungsausbeute und die Reinheit überlegen ist.
Eine Lösung von Interferon-alpha (IFN-alpha), welches nach
der Methode B) erhalten worden war, wurde mit 0,1 N HCl auf pH 5,5 eingestellt; zu 50 ml (5x10 IU) dieser Lösung wurden
1,5 g Polyacrylonitril-Kugeln (beads) zugegeben; nach 60-minütigem Rühren wurden die Kugeln mit dem daran adsorbierten
Interferon zurückgewonnen. Nach dem Waschen der Kugeln mit 30 ml 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0) wurde das Interferon
mit 10 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) / 0,3 M NaCl eluiert.
2.000 ml der Lösung, welche nach der Methode C) erhalten worden war, und welche IFN-alpha als Haupfckomponente enthielt, wurden
mit 0,1-N Essigsäure auf pH 4,0 einaestellt, und über eine
mit 5 g Polyacrylonitril-Faser gepackte Säule geleitet. Die
Säule wurde dann mit 400 ml 0,01 M Phosphatpuffer (pH 6,5) gewaschen und daraufhin mit 150 ml 0,05 M Phosphatpuffer
(pH 7,5) /0,5 M NaCl/30 % Ethylenglykol-Lösung eluiert.
Verfahren gemäss der Konventionelles Verfahren
Erfindung Verfahren nach Canteil,
Beispiel 4 Beispiel 5 K. et al * . r
Rückgewinnungs-
ausbeute 108 % 100 % 50 % Spezifische
Aktivität 2x107IU/mg 32x1O7 IU/mg 1.4 χ 1O7 IU/mg
* Cantell, K. et al (Pharmac.Ther.C., Vol. 1, 369, 1977)
Wie in Tabelle 1 ist auch aus vorstehender Tabelle die Überlegenheit
des erfindungsgemässen Verfahrens deutlich ersichtlich.·.
Wie vorstehend beschrieben wurde, ist das Reinigungsverfahren gemäss der Erfindung in hohem Grade effizient. Auf diese Weise
wird durch das erfindungsgemässe Verfahren gewährleistet, dass Interferon mit hoher Reinheit in einer. Rückgewinnungsausbeute
von ca. 100 % durch einen einzigen einfachen Verfahrensschritt
erhalten werden kann. Das Reinigungsverfahren gemäss
der Erfindung ist allgemein auf die Reinigung von Interferon anwendbar. Dieses Verfahren ist nicht nur geeignet zur
Reinigung von Interferon, welches von Zellen von Säugetieren produziert wurde, sondern auch von Interferon, das nach irgendeinem
anderen Verfahren produziert wurde, z.B. ein durch rekombinante DNA-Technik erhaltenes Interferon etc..
Claims (18)
1. Verfahren zur Reinigung von Interferon, dadurch gekennzeichnet, dass man eine interferonhaltige
Lösung mit einem oder mehreren Aldsorbentien in Kontakt bringt, wobei das Adsorbens ein hohes Acrylonitrilpolymer
zur Adsorption des Interferon an dasselbe enthält, und daraufhin dasselbe mit einem Eluierungsmittel unter Gewinnung
eines Eluats ediert.
2. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet , dass das Adsorbens
ein Fasermaterial umfasst, welches ein hohes Acrylonitrilpolymer enthält.
3. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch 1,
oder 2, dadurch gekennzeichnet , dass das
Fasermaterial/ welches ein hohes Acrylonitrilpolymer enthält, ein Material umfasst, welches aus dor folgenden
Gruppe ausgewählt wird: Cashimilon, Kanebo-Acryl, Kanekalon,
Vonnel, Exlan, Beslon, Toraylon, Pewlon, Silpalon, Promix,
Orion, Acrilan, Creslan, Zefran, Verel, Dynel, Vinyon N,
Couttelle, Teklan, Pan und Dralon.
4. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch 1
oder 2, dadurch gekennzeichnet / dass das hohe Acrylonitrilpolymer als Comonomerkomponente einen
oder mehrere Vertreter aus der folgenden Gruppe enthält:
Methylacrylat, Methylmethacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure,
Vinylacetat, Vinylchlorid und Vinylidenchlorid.
5. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss 'Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet , dass das hohe Acrylonitrilpolymer als Comonomerkomponente einen oder
mehrere Vertreter aus der folgenden Gruppe enthält: Methylacrylat, Methylmethacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure,
Vinylacetat, Vinylchlorid und' Vinylidenchlorid.
6. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet , dass das Eluierungsmittel
für Interferon eine wässrige Lösung von üblichen organischen oder anorganischen Substanzen darstellt.
7. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass die genannten
anorganischen Substanzen aus der Gruppe Natriumchlorid, Ammoniumchlorid und der Phosphate ausgewählt werden.
8. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet , dass die genannten organischen Substanzen aus der Gruppe der Acetate,
Aminosäuren, Alkohole, Alkylenglykole, Polyalkylenglykole und Dimethylsulfoxid ausgewählt werden.
9. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch Ί,
dadurch gekennzeichnet , dass der pH-Wert des Eluierungsmittels auf den Bereich von 2,0 bis 9,0
eingestellt wird.
10. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet , dass der pH-Wert des Eluierungsmittels auf den Bereich von 5,0 bis
8,0 eingestellt wird.
11. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet , dass der pH-Wert des Eluats unverzüglich wieder auf den Neutralpunkt
eingestellt wird, falls der pH-Wert des Eluierungsmittels ausserhalb des Bereiches von 2,0 bis 9,0 liegt.
12. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Ansprüchen 1,6,7 oder 8, dadurch gekennzeichnet ,
dass Protein, Zucker oder Aminosäure zu dem Eluat zur Stabilisierung von Interferon in dem Eluat zugegeben wird.
13. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet , dass das Protein Humanserumalbumin oder Gelatine darstellt.
14. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , dass das genannte
Protein in einer Menge von 0,005 - 1 % zugegeben wird.
15. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , dass der Zucker
Sucrose, Mannit oder Glucose darstellt.
16. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , dass der genannte
Zucker in einer Menge von 1 bis 10 % zugegeben wird.
17. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , dass die Aminosäure
Glycin oder Cystin darstellt.
18. Verfahren zur Reinigung von Interferon gemäss Anspruch 17,
dadurch gekennzeichnet , dass die genannte
Aminosäure in einer Menge von ca. 0/01 bis 1 % zugegeben
wird.
5
5
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Patent Citations (1)
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