DE4404124C2

DE4404124C2 - TNF-Muteine, kodierendes Polynucleotid, Vektor, Mikroorganismus, Verfahren zur Herstellung der TNF-Muteine und TNF-Muteine enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung

Info

Publication number: DE4404124C2
Application number: DE4404124A
Authority: DE
Inventors: Hang-Cheol Shin; Nam-Kyu Shin; Inkyung Lee; Sungzong Kang
Original assignee: Hanil Synthetic Fiber Co Ltd
Current assignee: Hanil Synthetic Fiber Co Ltd
Priority date: 1993-02-09
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 1999-12-30
Anticipated expiration: 2014-02-10
Also published as: GB9401977D0; KR940019726A; KR970005042B1; KR970005043B1; GB2275683B; JP2837344B2; FR2701264B1; US5773582A; FR2701264A1; GB2275683A; DE4404124A1; JPH0770193A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft TNF-Muteine, kodierendes Polynucleotid, Vektor, Mikroorganismus, Verfahren zur Herstel lung der TNF-Muteine und eine TNF-Muteine enthaltende pharma zeutische Zusammensetzung gemäß den Patentansprüchen.

Tumor-Nekrose-Faktor ("TNF" oder "TNF-α"), ein Zytokin, das in erster Linie von aktivierten Monozyten und Makrophagen produziert wird, induziert bekanntlich in vivo die hämorr hagische Nekrose von transplantierten Tumoren und wirkt in vitro zytotoxisch gegen verschiedene Tumor-Zellinien [Aggar wal, B. B., Drugs of the Future, 891-898 (1987)]. Weiter ist bekannt, daß TNF antivirale Wirkung zeigt [Mestan, J. et al., Nature, 323, 816-819 (1986); Wong, G. H. W. & Goeddel, D. V., Nature, 323, 819-822 (1986)] und bestimmte Spezies von Mala riaparasiten in vivo desaktiviert [Taverne, J. et al., Clin. Exp. Immunol., 67, 1 (1987)].

TNF wird zunächst als Prohormon produziert; wenn es jedoch sekretiert wird, werden 76 Aminosäuren seiner aminotermina len Region unter Bildung eines aktiven reifen humanen TNF mit einer intramolekularen Disulfidbindung abgespalten [Aggarwal, B. B. et al., J. Biol. Chem., 260, 2345-2354 (1985)].

Das Gen, das für humanen Tumor-Nekrose-Faktor codiert, wurde 1984 in Escherichia coli kloniert und exprimiert [Pennica, D. et al., Nature, 312, 724-729 (1984); Shirai, T. et al., Natu re, 313, 803-806 (1985)].

Wildtyp-TNF war jedoch nicht in der Lage, eine zur Behandlung von Krebspatienten zufriedenstellende Wirkung gegen Krebs auszuüben wenn es alleine verabreicht wurde, insbesondere, wenn es zur systemischen Therapie verwendet wurde [Blick, M. et al., Cancer Res., 47, 2986 (1987); Creaven, P. J. et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 20, 137 (1987); Kimura, K. et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 20, 223 (1987)]. Der Grund für dieses Versagen liegt darin, daß TNF sehr toxisch ist und schwerwiegende Nebenwirkungen hat und deshalb nicht in aus reichender Dosis verabreicht werden kann, um seine Wirkung gegen Krebs zu entfalten.

Um dieses Problem zu überwinden, wurden verschiedene Versuche durchgeführt, um mutierte TNF-Proteine mit höherer Antitumor- Aktivität aber geringeren Nebenwirkungen herzustellen, bei spielsweise durch Entfernen mehrere Aminosäuren am Aminoter minus und/oder durch Zufallsmutagenese (Mattews et al., Br. J. Cancer, 42, 416 ( 1980); Ruff et al., J. Immunol., 125, 1671 (1980); Mannel et al., Infect. Immunity, 28, 204 (1980); Haranaka et al., Japan. J. Exp. Med., 51, 191 (1981); EP-A- 0 090 892; EP-A-0 086 475; JP-PS 21621/1983; EP-A-0 155 549; EP-A-0 168 214; und EP-A-0 251 037). Die Ergebnisse, die mit solchen TNF-Muteinen erhalten wurden, zeigen jedoch gegenüber Wildtyp-TNF bestenfalls eine siebenfach höhere Antitumor- Aktivität [Nakamura, S. et al., Int. J. Cancer, 48, 744-748 (1991)].

Die DE 38 43 534 A1 betrifft TNF-Muteine, in denen u. a. eine der Aminosäuren in den Positionen 9 , 10, 35, 52, 54, 56, 87 und 157 von Wild-Typ TNF durch andere Aminosäuren ersetzt sein kann und worin zwischen 1 und 7 Aminosäuren des N-Terminus deletiert sein können. Die EP 340 333 A2 beschreibt TNF-Muteine, in denen 7 Aminosäuren des N-Terminus deletiert sein können und die Aminosäuren in den Positionen 7, 8, 9 und 10 gleichzeitig Met, Arg, Lys bzw. Arg sind. Die EP 205 038 A1 offenbart (5-157)-TNF und (4-157)4Mez-TNF.

Andererseits ist bekannt, daß Human-TNF ("hTNF") in seiner dreidimensionalen Struktur in Form einer elongierten, anti parallelen β-Faltblatt-Sandwich-Struktur mit Geleeröllchen ("jelly-roll")-Topologie und als Trimer mit dreifacher Sym metrieachse vorliegt [Jones, E. Y. et al., Nature (London), 338, 225-228 (1989); Eck, M. J. und Sprang, S. R., J. Biol. Chem., 264, 17595-17605 (1989)]. Die Bestimmung der dreidi mensionalen Struktur von hTNF durch Röntgenkristallographie [Eck, M. J. und Sprang, S. R., J. Biol. Chem., 264, 17595-17606 (1989)] und Mutationsanalysen [Ostade, X. V., EMBO J., 10, 827-836 ( 1991)] legten nahe, daß das oder die für die Antitu mor-Aktivität von TNF verantwortlichen aktiven Zentren bei den Polypeptidregionen lokalisiert sind, die sich um jede Seite der drei Furchen herum befinden, die von den drei Mono meren gebildet werden, die in der Basis der dreidimensionalen Struktur vereinigt sind.

Unerwarteterweise ließen sich durch systemische Mutagenese dieser Polypeptidregionen TNF-Muteine erhalten, die eine höhere Antitumor-Aktivität als Wildtyp-TNF oder irgendein anderes bekanntes TNF-Mutein aufweisen. Insbesondere ist wenigstens eine Aminosäure in den sechs Polypeptidregionen an der Basis des TNF-Trimers, nämlich der N-terminalen Region oder Region 1 (Aminosäuren 1-10), Region 2 (Aminosäuren 37- 41), Region 3 (Aminosäuren 52-56), Region 4 (Aminosäuren 84- 88), Region 5 (Aminosäuren 126-130) und Region 6 (Aminosäuren 156-157), zu einem hydrophoben, positiv geladenen oder nega tiv geladenen Rest mutiert.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es dementsprechend, TNF-Muteine mit ausgezeichneter Antitumor-Aktivität bereitzu stellen, in denen wenigstens eine Aminosäure in den sechs Polypeptidregionen an der Basis des TNF-Trimers durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.

Diese Aufgabe wird gemäß Anspruch 1 durch TNF-Muteine ge löst, in denen wenigstens eine der Aminosäuren in den Posi tionen 4 bis 7, 38 bis 41, 52 bis 54 , 56, 85 bis 88, 127 bis 129, 156 und 157 des Wildtyp-TNF-Polypeptids der folgenden Aminosäuresequenz [1]

durch eine in Anspruch 1 angegebene Aminosäure ersetzt ist, wobei gegebenen falls eine oder mehrere der Aminosäuren 1 bis 7 des N-Termi nus deletiert sein können.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Polynukleo tide, die für diese TNF-Muteine codieren, und Vektoren, die diese Polynukleotide umfassen. Gegenstand sind ferner Wirts zellen, die mit diesen Vektoren transformiert sind und Ver fahren zur Herstellung obiger TNF-Muteine unter Verwendung dieser Transformanten. Ein weiterer Gegenstand sind pharma zeutische Zusammensetzungen, die die TNF-Muteine als aktiven Wirkstoff umfassen.

Spezielle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den Unteransprüchen wiedergegeben.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgende Be schreibung bevorzugter Ausführungsformen in Verbindung mit den Fig. 1 und 2 näher erläutert.

Fig. 1 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid pGHH- TNF;

Fig. 2 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid pT7- TNF.

Wenn das TNF-Mutein ferner in Mikroorganismen wie E. coli produziert wird, weist der N-Terminus obiger Aminosäurese quenz einen Methioninrest (Met) auf, da das für Met codieren de und für die Initiation der Translation wesentliche Codon ATG notwendigerweise vom Translationsprozeß mit eingeschlos sen wird.

Zur Expression der erfindungsgemäßen Polynukleotide in Mikro organismen wie E. coli ist ATG als Initiationscodon erforder lich; das ATG-Initiationscodon kann aus dem Vektor stammen, in den das Polynukleotid inseriert wird, oder es kann der erfindungsgemäßen Polynukleotidsequenz zugefügt werden.

Die Polynukleotide, die für ein erfindungsgemäßes hTNF-Mutein codieren, können durch chemische Synthese der gesamten Se quenz hergestellt werden; sie können auch hergestellt werden, indem man ein Oligonukleotid synthetisiert, das die Region enthält, die ausgetauscht werden soll, und dieses dann mit tels Polymerase-Ketten-Reaktion ("Polymerase Chain Reaction", "PCR") [Saiki, R. K. et al., Science, 230, 1350-1354 (1985)] amplifiziert, wobei man eine cDNA von Human-TNF, die bei spielsweise die folgende Polynukleotidsequenz [2] umfaßt, als Matrize und das Oligonukleotid als Primer verwendet:

Beispielsweise kann eine DNA, die für ein TNF-Mutein codiert, dessen vierte und fünfte Aminosäure (Serine) jeweils durch Arginin ausgetauscht sind und bei dem drei Aminosäuren vom N- Terminus deletiert sind, nach den folgenden Verfahren herge stellt werden.

Ein DNA-Fragment mit einer Nukleotidsequenz, die für Wildtyp- hTNF-α codiert, wird mittels PCR aus einer cDNA-Bank von Human-Monozyten der Zellinie U937 (Clontech, USA) präpariert. Ein Sinn ("Sense")-Primer mit einer Restriktionsstelle am 5'- Ende und einer modifizierten Nukleotidsequenz und ein Anti sinn ("Antisense")-Primer (im folgenden als Anti-Primer be zeichnet) mit einer Restriktionsstelle am 5'-Ende werden che misch synthetisiert; anschließend wird eine PCR durchgeführt, wobei die für Wildtyp-TNF-α codierende DNA als Matrize und die Primer verwendet werden, um die DNA zu präparieren, die für das TNF-Mutein codiert.

Das erfindungsgemäße hTNF-Mutein kann hergestellt werden, indem man die wie oben erhaltene modifizierte DNA nach Verdau mit Restriktionsendonucleasen, die an beiden Enden der DNA Restriktionsschnitte erzeugen, in einen Expressionsvektor inseriert, eine Wirtszelle mit dem resultierenden Vektor transformiert und die Tranformanten unter Bedingungen, die die Expression des modifizierten DNA-Fragments erlauben, kultiviert.

Insbesondere läßt sich ein Expressionsvektorsystem zur Pro duktion der erfindungsgemäßen TNF-Muteine herstellen, indem man ein für das TNF-Mutein codierendes DNA-Fragment präpa riert, das außerdem am 5'-Ende ein Translationsinitiations codon, ATG, und am 3'-Ende ein Terminationscodon besitzt, an dieses DNA-Fragment einen geeigneten Promotor (z. B. lac, trp, tac, pL, T3, SP6, T7, SV40, lambda(pL/pR)) und eine Ribosomenbindungsstelle (RBS) ligiert und dann das resultie rende DNA-Fragment in einen Vektor, beispielsweise ein Plas mid (z. B. pBR322), einen Phagen (z. B. ein Derivat eines lambda-Phagen) oder ein Virus (z. B. SV40), inseriert.

Die Transformanten können durch Transformation eines geeigne ten Wirts, beispielsweise E. coli, mit dem resultierenden Ex pressionsvektor erhalten werden, beispielsweise nach Cohen et al. [Cohen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)].

Anschließend werden die Transformanten unter Bedingungen, die zur Expression des modifizierten Polynukleotids, das für das TNF-Mutein codiert, geeignet sind, kultiviert. Die kultivier ten Zellen werden beispielsweise einem Verdau mit Lysozym oder einer Behandlung mit Frieren und Tauen, mit Ultraschall oder mit "French press" unterworfen, und dann zentrifugiert oder filtriert, um einen Extrakt mit dem gewünschten Mutein zu erhalten.

Das gewünschte Mutein kann aus dem Extrakt durch übliche Reinigungsverfahren wie Ultrafiltration, Dialyse, Ionenaus tauscherchromatographie, Gelfiltration, Elektrophorese und Affinitätschromatographie isoliert werden. Die Konzentration des gereinigten TNF-Muteins kann beispielsweise nach dem Verfahren von Bradford [Bradford, M. Anal. Biochem. 72, 248 ( 1976)] gemessen werden.

Die Antitumor-Aktivität in vitro kann als unmittelbare zell tötende Wirkung (Zytotoxizität) unter Verwendung einer TNF- sensitiven murinen Fibrosarcom-Zellinie L-929 (ATCC CCL1) [Ruff, M. R. & Gifford, G. E.: Lymphokines, (ed. Edgar Pick) 2, 235 (1981), Academic Press, New York] wie folgt bestimmt werden:

3 bis 4 × 10⁴ L-929-Zellen (150 µl) pro Vertiefung werden in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit einem modifi zierten Dulbecco-Medium mit 2% fötalem Kälberserum angeimpft. Die Mikrotiterplatte wird gut geschüttelt und dann bei 37°C in einem Thermostaten, der 5% CO₂ enthält, inkubiert. Nach 24 Stunden wird das Medium entfernt und ein frisches Medium, das 2 µg/ml Actinomycin D enthält, wird in einer Menge von 100 µl pro Vertiefung auf die Mikrotiterplatte gegeben. Jede der TNF-Proben, hergestellt durch eine zweifache Reihenverdün nung, wird 30 min mit ultraviolettem Licht behandelt und auf eine Mikrotiterplatte gegeben, die 100 µl L-929-Zellen pro Vertiefung enthält. Die Zellen werden bei 37°C in einem Ther mostaten, der 5% CO₂ enthält, 18 Stunden lang weiterinkubiert und dann 15 bis 20 min mit einer Kristallviolett-Lösung mit 0,5 g/l Kristallviolett, 112 ml/l Ethanol, 101 ml/l Formalin (gesättigt mit CaCO₃) und 786 ml/l distilliertem Wasser ange färbt. Die Mikrotiterplatte wird gründlich mit Leitungswasser gewaschen und getrocknet. Die Absorption der Mikrotiterplatte wird bei 540 nm unter Verwendung eines Molecular Devices "Mikroplate-Reader" gemessen.

Die Zytotoxizität eines jeden Muteins wird aus der Absorption (Abs.) wie folgt gemessen:

* Als Kontrolle werden L-929-Zellen verwendet, die nicht mit irgendeinem TNF behandelt wurden.

Eine Einheit wird als die Menge TNF definiert, die benötigt wird, um 50% der Zellen zu töten.

TNF oder die erfindungsgemäßen TNF-Muteine können zur Verab reichung in Form von Einheits- oder Mehrfachdosen nach übli chen Methoden formuliert werden, beispielsweise durch Mischen mit physiologisch annehmbaren Trägerstoffen, z. B. Wasser, Puffern, Ringer-Lösung, Dextrose-Lösung oder 5%-igem humanem Serumalbumin. Die Formulierung kann außerdem Antioxidantien wie Ascorbinsäure, Polypeptide niederen Molekulargewichts, Proteine, Aminosäuren oder Kohlehydrate wie Glucose oder Dextrin enthalten.

Die pharmazeutische Zusammensetzung kann intravenös, intrape ritoneal, intramuskulär oder intraläsional, d. h. durch di rekte Injektion in stabile Tumoren. Gegebenenfalls können TNF oder TNF-Muteine in Kombination mit anderen antineoplasti schen Mitteln wie Cysplatin, Actinomycin D oder Adriamycin, mit Immunmodulatoren wie Immunoglobulinen, beispielweise gamma-Globulin, oder mit Interferonen verabreicht werden. Eine typische Formulierung umfaßt TNF und gamma-Interferon in einer Menge, daß das Aktivitätsverhältnis TNF : Interferon einer Einheit im Bereich von ungefähr 0,1 : 1 bis 200 : 1 liegt.

Die Dosierungsmenge von TNF oder TNF-Mutein liegt bevorzugt in einem Bereich von 5 bis 20 µg/kg/Tag und kann abhängig vom der Verabreichungsroute und der Häufigkeit der Verabreichung und abhängig und vom Zustand des jeweiligen Patienten vari iert werden.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1: Herstellung von Human-TNF-Polypeptiden 1-A. Konstruktion eines Plasmids mit cDNA von Human-TNF Schritt 1: Konstruktion von Plasmid pGHH-TNF

Ein DNA-Fragment, das eine Nukleotidsequenz [2] umfaßt, die für Wildtyp-hTNF-α codiert, wurde mittels PCR präpariert, wobei als Matrize eine cDNA-Bank von Human-Monozyten, herge stellt aus der Zellinie U937, verwendet wurde (Clontech). Die Nukleotidsequenzen der verwendeten Primer sind wie folgt:

Die präparierten PCR-Produkte wurden mit den Restriktions endonucleasen NcoI und BamHI verdaut, um eine doppelsträngige DNA ("Fragment 1") mit kohäsiven Enden herzustellen. Als Expressionsvektorsystem wurde pGEMEX-1 (Promega) mit dem Expressionssystem von T7 verwendet; um die Expression des TNF-Gens als Fusionsprotein mit dem Protein von Gen 10 von T7 zu verhindern, wurde das System so modifiziert, daß es eine NcoI-Stelle anstatt einer NdeI-Restriktionsschnittstelle auf wies; anschließend wurde mit Restriktionsendonuclease BamHI verdaut. Das resultierende lineare Plasmid wurde mit Restrik tionsendonuclease BglII verdaut.

Inzwischen wurde das folgende PCR-Produkt mit dem T7-Promotor und den Restriktionsstellen NcoI am 5'-Ende und BglII am 3'- Ende mittels PCR präpariert, wobei das durch Verdau mit BamHI erzeugte lineare Plasmid als Matrize verwendet wurde. Die unterstrichene Nukleotidsequenz zeigt die Promotor-Region von T7.

Zur Präparation des obigen PCR-Produkts wurden die folgenden Primer verwendet:

Nach Verdau des PCR-Produkts mit den Restriktionsendonu cleasen BglII und NcoI wurde das resultierende Fragment mit Fragment 1, das das TNF-Gen enthielt, mittels T4-DNA-Ligase ligiert. Anschließend wurde das kombinierte DNA-Fragment in den Vektor pGEMEX-1, der mit den Restriktionsendonucleasen BamHI und BglII verdaut war, inseriert, um das Expressions plasmid pGHH-TNF herzustellen. Das Verfahren ist in Fig. 1 dargestellt.

Schritt 2: Konstruktion von Plasmid pT7-TNF

Ein DNA-Fragment, das eine für Wildtyp hTNF-α codierende Nu kleotidsequenz [2] umfaßt, wird mittels PCR präpariert, wobei als Matrize eine cDNA-Bank von Human-Monozyten verwendet wird (Clontech), die aus der Zellinie U937 hergestellt wurde. Die Nukleotidsequenzen der verwendeten Primer sind wie folgt:

Das resultierende PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendo nucleasen NdeI und BamHI verdaut, um eine NdeI-Restriktions stelle am 5'-Ende und eine BamHI-Restriktionsstelle am 3'- Ende zu erhalten ("Fragment 2"). Als Expressionsvektorsystem wurde der Vektor pT7-7 [Stanley Tabor & Charles C. Richard son, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 1074-1078 (1985); er halten vom Department of Biological Chemistry, Harvard Medi cal School] verwendet; der Vektor wurde mit den Restriktions endonucleasen BamHI und NdeI verdaut. Anschließend wurde das DNA-Fragment mit dem TNF-Gen mit T4-DNA-Ligase in den oben präparierten Vektor unter Bildung des Expressionsplasmids pT7-TNF inseriert. Das Verfahren ist in Fig. 2 dargestellt.

1-B. Expression von Human-TNF

E. coli JM109 wurde mit den Expressionsplasmiden pGHH-TNF und pT7-TNF nach dem bei Hanahan beschriebenen Verfahren [Ha nahan, D., DNA Cloning 1 (Ed. D. M. Glover), 109-135 (1985), IRS Press] transformiert. Anschließend wurden Ampicillin resistente Kolonien auf LB/Ampicillin-Agarplatten (enthaltend 50 µg/ml Ampicillin) selektioniert und in 1 ml LB-Medium, das Ampicilllin enthielt, angeimpft. Nach Inkubation jeder der Kulturen über Nacht bei 37°C wurde 2 min bei 8000 × g zen trifugiert, um die Zellen zu erhalten. Das Plasmid wurde aus dem Pellet von E. coli mittels alkalischer Lyse isoliert und gereinigt. Nach Lösen des Plasmid in 50 µl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) wurden 0,1 µg Plasmidlösung mit 2 µm 10 × One-for-all-Puffer (100 mM Tris-Acetat, 100 mM Magnesiumacetat, und 500 mM Kaliumacetat), 1 Einheit NcoI und 5 Einheiten BamHI (im Fall von Plasmid pGHH-TNF) oder 1 Ein heit NdeI und 5 Einheiten BamHI (im Fall von Plasmid pT7- TNF) gemischt und man gab distilliertes Wasser hinzu, um das Endvolumen auf 10 µm zu bringen. Die Lösung wurde 2 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend einer Elektrophorese auf einem 1%-igen Agarosegel unterworfen, um die Insertion des gewünschten DNA-Fragments in das Plasmid zu bestätigen. Der Expressionswirt E. coli JM109 (DE3) wurde mit dem Plasmid mit dem gewünschten Insert nach obigem Verfahren transformiert und anschließend wurden Ampicillin-resistente Kolonien selek tioniert.

Mit pGHH-TNF bzw. pT7-TNF transformierter E. coli JM109 (DE3) wurde beim Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) am 28. Januar 1993 hinterlegt (E. coli JM109 (DE3 + pGHH-TNF): Hinterlegungsnummer KCCM-10021; E. coli JM109 (DE3 + pT7- TNF): Hinterlegungsnummer KCCM-10020).

1-C. Reinigung von Human-TNF

Die unter 1-B erhaltenen Transformanten mit den Plasmiden pGHH-TNF bzw. pT7-TNF wurden in 1 ml LB-Medium angeimpft und bei 37°C über Nacht kultiviert. 50 ml LB-Medium mit Ampicil lin wurden mit der Kultur inokuliert; als die Absorption der Kultur bei 600 nm einen Wert von 0,1 bis 0,4 erreicht hatte, wurde IPTG (Isopropylthiogalactopyranosid) zu einer Endkon zentration von 1 mM zugegeben. Nach 4 Stunden Inkubation der Kultur unter Schütteln bei 200 Upm wurde 2 min bei 8000 × g zentrifugiert, um Pellets von E. coli zu erhalten. Die Zellen wurden in 5 ml 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4) suspen diert und die Suspension wurde mit Ultraschall behandelt, um die Zellen aufzubrechen.

Der Überstand wurde durch 30 min Zentrifugation bei 15000 × g und 4°C von den aufgebrochenen Zellen abgetrennt und einer quantitativen Bestimmung der Gesamtmenge an Proteinen nach dem Verfahren von Bradford unterzogen. Anschließend wurde der Überstand auf eine Proteinkonzentration von 10 mg/ml verdünnt und dann mittels eines FPLC-Systems von Pharmacia und einer Mono-Q-Ionenaustauschersäule gereinigt. Das gewünschte Poly peptid wurde mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,5 M NaCl in 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4) eluiert und die Fraktionen, die ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 17 kD enthielten, wurden aufge fangen und gesammelt. Die Menge an erhaltenem TNF betrug jeweils ungefähr 0,7 bis 0,8 mg bei einer Reinheit von mehr als 95%.

Beispiel 2: Produktion von Human-TNF-Muteinen 2-A. Konstruktion eines Plasmids mit cDNA für Human-TNF- Muteine Schritt 1: Konstruktion eines pGHH-TNF-Mutein-Plasmids

Plasmid pGHH-TNF wurde mit der Restriktionsendonuclease NcoI verdaut und das resultierende lineare Plasmid wurde mit der Restriktionsendonuclease Hindill verdaut; das DNA-Fragment, das für TNF codierte ("TNF-DNA1") wurde isoliert. Ein DNA- Fragment, das eine für das TNFR2-1-Mutein codierende Nukleo tidsequenz umfaßte, wurde wie folgt präpariert:

Unter Verwendung der TNF-DNA1 als Matrize und der Primermu tanten mit den zu mutierenden Nukleotidsequenzen und von P1- Primern wurde eine Reihe von PCRs durchgeführt. Folgende Primermutanten wurden verwendet:

Außerdem wurden auch P1-Primer, die komplementär zum 5'-Ende bzw. 3'-Ende der TNF-DNA1 sind, eingesetzt.

Zuerst wurde eine PCR unter Verwendung des R2-1-Sinn-Pri mers, des P1-Anti-Primers und der TNF-DNA1 als Matrize durch geführt; als zweites wurde eine PCR unter Verwendung des R2- 1-Anti-Primers, des P1-Sinn-Primers und der TNF-DNA1 durch geführt. Die PCR-Produkte wurden zusammengegeben und reasso ziieren gelassen.

Dann wurde die DNA für das TNFR2-1-Mutein mit den Restrik tionsstellen NcoI am 5'-Ende und HindIII am 3'-Ende unter Verwendung der Primer (P1) mittels PCR amplifiziert.

Das resultierende PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendo nucleasen NcoI und HindIII verdaut, um ein DNA-Fragment mit Restriktionsstellen an beiden Enden zu präparieren. Anschlie ßend wurde das DNA-Fragment für das TNFR2-1-Mutein mit dem linearen Plasmid mit den Restriktionsstellen NcoI und Hin dIII, das durch Verdau des Plasmids pGHH-TNF mit NcoI und HindIII präpariert worden war, mittels T4-DNA-Ligase ligiert, um das Plasmid pGHH-TNFR2-1 zu erzeugen.

Plasmide mit DNA-Fragmenten, die für andere TNF-Muteine co dieren, wurden ebenfalls nach dem oben dargestellten Verfah ren präpariert, außer daß die R2-1-Primer durch die nachfol gend aufgeführten Primer ersetzt wurden. Zur Amplifikation aller Mutein-DNAs wurden die P1-Primer verwendet.

Schritt 2: Konstruktion eines pT7-TNF-Mutein-Plasmids Konstruktion der Mutein-Plasmide pT7-TNFR1-1 bis R1-6

Plasmid pT7-TNF wurde mit der Restriktionsendonuclease NdeI verdaut und das resultierende lineare Plasmid wurde mit der Restriktionsendonuclease HindIII verdaut; das DNA-Fragment, das für TNF codierte ("TNF-DNA2") wurde isoliert. Mittels PCR wurde unter Verwendung der TNF-DNA2 als Matrize und von Pri mermutanten, die die zu mutierenden Nukleotidsequenzen ent hielten, ein DNA-Fragment mit einer für das TNFR1-1-Mutein codierenden Nukleotidsequenz präpariert. Die folgenden Pri mermutanten wurden verwendet:

Das resultierende PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendo nucleasen NdeI und HindIII verdaut, um ein DNA-Fragment mit Restriktionsstellen an beiden Enden zu präparieren. An schließend wurde das DNA-Fragment für das TNFR1-1-Mutein mit dem linearen pT7-TNF-Plasmid, das durch Verdau mit den Re striktionsendonucleasen NdeI und HindIII präpariert worden war, mittels T4-DNA-Ligase ligiert.

Nach demselben Verfahren wie oben beschrieben wurden Plasmide mit DNA-Fragmenten hergestellt, die für andere TNFR1-Muteine codierten. Die folgenden Primer wurden verwendet:

Konstruktion der Mutein-Plasmide pT7-TNFM1 und M2

Mittels PCR wurde unter Verwendung der TNF-DNA2 als Matrize und Primern, die die zu mutierenden Nukleotidsequenzen ent hielten, ein DNA-Fragment mit einer für das TNFM1-Mutein codierenden Nukleotidsequenz präpariert. Die folgenden Pri mermutanten wurden verwendet:

Das resultierende PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendo nucleasen NdeI und HindIII verdaut, um ein DNA-Fragment mit Restriktionsstellen an jedem Ende zu präparieren. Anschlie ßend wurde das DNA-Fragment für das TNFM1-Mutein mit dem linearen Plasmid pT7-TNF, das durch Verdau mit den Restrik tionsendonucleasen NdeI und HindIII präpariert worden war, mittels T4-DNA-Ligase ligiert.

Nach demselben Verfahren wie oben beschrieben wurde das Plas mid pT7-TNFM2 präpariert, das ein DNA-Fragment enthält, das für das TNFM2-Mutein codiert. Die folgenden Primermutanten wurden verwendet:

Konstruktion von Mutein-Plasmid pT7-TNFM3

Ein DNA-Fragment mit einer Nukleotidsequenz, die für das TNFM3-Mutein codiert, wurde nach dem in Schritt 1 von Bei spiel 2-A beschriebenen Verfahren hergestellt, außer daß TNF- DNA2 als Matrize und die folgenden M3-Primer und P2-Primer anstelle der R2-1- bzw. der P1-Primer verwendet wurden.

Das resultierende PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendo nucleasen NdeI und HindIII verdaut, um ein DNA-Fragment mit diesen Restriktionsstellen an beiden Enden zu präparieren. Anschließend wurde das DNA-Fragment für das TNFM3-Mutein mit dem linearen Plasmid pT7-TNF, das durch Verdau mit den Re striktionsendonucleasen NdeI und HindIII präpariert worden war, mittels T4-DNA-Ligase ligiert.

Nach demselben Verfahren wie oben beschrieben wurden Plas mide präpariert, die DNA-Fragmente enthalten, die für die mutierten Proteine TNFM4, TNFM5 und TNFM6 codieren, wobei folgende Primermutanten verwendet wurden:

Konstruktion von pT7-TNFR-Mutein-Plasmiden

Weitere Plasmide mit DNA-Fragmenten, die für die Muteine TNFR2 bis R5 codieren, ausgenommen das oben beschriebene Plasmid pT7-TNFR1, wurden wie folgt konstruiert.

Ein DNA-Fragment mit einer Nukleotidsequenz, die für das TNFR2-1-Mutein codiert, wurde nach dem in Schritt 1 von Bei spiel 2-A beschriebenen Verfahren hergestellt, außer daß TNF- DNA2 als Matrize und die folgenden R2-1- und P3-Primer an stelle der R2-1- bzw. der P1-Primer verwendet wurden.

Das resultierende PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendo nucleasen NdeI und HindIII verdaut, um ein DNA-Fragment mit diesen Restriktionsstellen an beiden Enden zu präparieren. Anschließend wurde das DNA-Fragment für das TNFR2-1-Mutein mit dem linearen Plasmid pT7-TNF, das durch Verdau mit den Restriktionsendonucleasen NdeI und HindIII präpariert worden war, mittels T4-DNA-Ligase ligiert.

Nach demselben Verfahren wie oben beschrieben wurden Plas mide präpariert, die DNA-Fragmente enthalten, die für andere TNFR2- bis R5-Muteine codieren, wobei folgende Primermutanten anstelle der R2-1-Primer verwendet wurden:

Konstruktion der Mutein-Plasmide pT7-TNFR(D7)

Plasmid pT7-TNFR2-5 wurde mit Restriktionsendonuclease NdeI verdaut und das resultierende lineare Plasmid wurde mit Re striktionsendonuclease HindIII verdaut; das für das TNFR2- 5-Mutein codierende DNA-Fragment ("TNFR2-5-DNA") wurde iso liert. Unter Verwendung der TNFR2-5-DNA als Matrize und von Primern, die die zu mutierende Sequenz enthielten, wurde mittels PCR ein DNA-Fragment mit einer für das TNFR2-5(D7)- Mutein codierenden Nukleotidsequenz präpariert. Für die PCR- Amplifikation wurden die M1-Primer verwendet.

Das resultierende PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendo nucleasen NdeI und HindIII verdaut, um ein DNA-Fragment mit Restriktionsstellen an beiden Enden zu präparieren. Anschlie ßend wurde das DNA-Fragment für das TNFR2-5(D7)-Mutein mit den linearen Plasmiden pT7-TNFR2-5 oder pT7-TNF, die durch Verdau mit den Restriktionsendonucleasen NdeI und HindIII präpariert worden waren, mittels T4-DNA-Ligase ligiert.

Nach demselben Verfahren wie oben beschrieben wurden mittels PCR Plasmide präpariert, die DNA-Fragment enthalten, die für andere TNFR(D7)-Muteine, nämlich TNFR3-1(D7), TNFR3-2(D7), TNFR4-3(D7), TNFR4-4(D7) und TNFR4-5(D7), codieren, wobei TNFR3-1, TNFR3-2, TNFR4-3, TNFR4-4 bzw. TNFR4-5 als Matrize verwendet wurden. Zur PCR-Amplifikation wurden die obigen M1- Primer verwendet.

2-B. Expression und Reinigung von Human-TNF-Muteinen

E. coli JM109(DE3) wurde nach dem in Beispiel 1-B beschriebe nen Verfahren mit jedem der Expressionsplasmide transfor miert, die ein für ein TNF-Mutein codierendes DNA-Fragment enthielten. Anschließend wurden Ampicillin-resistente Kolo nien wie in Beispiel 1-B selektioniert und in 50 ml LB-Medi um, das Ampicillin enthielt, kultiviert; die E. coli-Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert.

Nach Aufbrechen der Zellen durch Ultraschallbehandlung wurden TNF-Muteine mit einer Größe von ungefähr 17 kD durch Reini gung nach dem in Beispiel 1-C beschriebenen Verfahren erhal ten. Die Menge jedes TNF-Muteins variierte im Bereich von 70 µg bis 1 mg, was eine große Schwankung abhängig von der Art des Muteins zeigte. Die in den Beispielen präparierten TNF- Muteine sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

Human-TNF-Muteine und ihre mutierte(n) Aminosäure(n)

2-C. Zytotoxizitäts-Test

Die zytotoxische Wirkung der Muteine wurde auf TNF-sensitiven murinen Fibrosarcom-Zellen der Linie L929 (ATCC CCL1) nach oben erwähnter Methode ausgewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2

Charakterisierung von gereinigtem reifen hTNF und seinen Muteinen

2-D. Akute Lethal-Toxizität

ICR-Mäuseweibchen wurden von Myungjin (Seoul, Korea) erhal ten. Für die Lethalitätstests wurden acht Wochen alte Mäuse mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 33 g verwen det. Mehrere Dosen von Wildtyp-TNF oder TNF-Muteinen in 500 µl Kochsalzlösung mit 30 mg D-Galactosamin wurden intraperi toneal (ip.) verabreicht.

Die Lethalität wurde 24 Stunden nach der Verabreichung von TNF oder TNF-Muteinen geprüft und die Lethal-Toxizität wurde als 50% Lethaldosis (LD50) ausgedrückt.

Tabelle 3 Akute Lethaltoxizität von Wildtyp-TNF und ausgewählten Muteinen in D-Galactosamin-sensibilisierten ICR-Mäusen

TNFs
LD50 (µg/kg)
Wildtyp-TNF	12
M2	85
M3	3
M4	30
M5	5
M6	21
R1-5	42
R4-3(D7)	21
R4-4(D7)	8
R4-5(D7)	3

Versuchsergebnisse

Um die Beziehung zwischen der in vitro Antitumor-Aktivität (Zy totoxizität) und der in vivo Antitumor-Aktivität herauszufinden, wurden am Tiermodell die folgenden in vivo Antitumor-Tests durchgeführt:

Alle in vivo Antitumor-Tests wurden nach dem Verfahren von Wata nabe et al. (J. Biol. Resp. Modif., 7, 24-31 (1988)) durchge führt. Als Tumore in den Experimenten wurden Meth A-Sarkome und MH134-Hepatome verwendet. Es wurden männliche BALB/c-Mäuse (My ungjin, Seoul) im Alter von 8 Wochen und einem Gewicht von je weils ungefähr 20 g eingesetzt. Die Tumorgröße, die nach der Formel V = ab²/2 berechnet wurde, worin "a" der maximale (Längs)- Durchmesser des Tumors und "b" der maximale Durchmesser senk recht zu "a" ist, wurde für Tag 0 bis Tag 30 täglich mit einer Schieblehre gemessen.

Die Antitumor-Aktivitäten der TNF-Muteine der vorliegenden Er findung und von Wildtyp-TNF wurden mit Hilfe von Meth A-Zellen, die in BALB/c-Mäuse transplantiert worden waren, d. h. 10⁶ Meth A-Zellen wurden intradermal (id) in die seitliche Bauchwand implantiert, verglichen. Nachdem die Tumoren einen Durchmesser von 6-8 mm erreicht hatten (Tag 0), wurden jeweils 10 µg der Muteine oder von Wildtyp-TNF in phophatgepufferter physiologi scher Kochsalzlösung (PBS) intraperitoneal (ip) verabreicht. Anschließend wurde die gleiche Dosis TNF an den Tagen 2, 4, 6 und 8 verabreicht. Die Kontrollmäuse erhielten PBS entsprechend dem Schema, wie es für die Mäuse für das Experiment angewandt wurde. Fig. 1 zeigt die Änderungen im Tumorvolumen nach der er sten Verabreichung eines jeden TNF-Typs. Alle Muteine hemmten bei gleicher Dosis das Tumorwachstum effizienter als Wildtyp- TNF. Verglichen mit den Kontrollmäusen wurden für die Gruppe, die mit den Muteinen behandelt war, signifikant höhere Überle bensraten beobachtet, während die Wildtyp-TNF-Gruppe nur wenig Verlängerung zeigte. In den verschiedenen mit Muteinen behandel ten Gruppen würden unter den 5 Mäusen 1 oder 2 mit vollständiger Tumorregression beobachtet, während in der mit Wildtyp-TNF be handelten Gruppe oder in der Kontrollgruppe keine Regression beobachtet wurde. Ähnliche in vivo Antitumor-Tests wurden mit ausgewählten TNF-Muteinen oder mit Wildtyp-TNF an MH134-Hepato men durchgeführt, die in BALB/c-Mäuse transplantiert worden waren (identisches Verfahren wie oben). Nachdem die Tumoren einen Durchmesser von 6-8 mm erreicht hatten (Tag 0), wurden jeweils 2 µg Mutein oder Wildtyp-TNF in PBS intraperitoneal (ip) verabreicht. Anschließend wurde die gleiche Dosis TNF an den Tagen 3, 6, 9 und 12 verabreicht. Das Tumorwachstum wurde 24 Tage lang in allen Gruppen beobachtet. Wie im Fall der Meth A- Sarkome zeigten alle Muteine eine bessere Aktivität bezüglich der Hemmung des Tumorwachstums als Wildtyp-TNF.

Die Versuchsergebnisse sind in den anliegenden Fig. 3 und 4 gezeigt.

Claims

1. TNF-Muteine mit der Aminosäuresequenz
in der mindestens einer der folgenden Aminosäureaustausche erfolgt ist:
Austausch der Aminosäure in Position Nr.:
4 Serin durch Arginin;
5 Serin durch Arginin;
6 Arginin durch Alanin;
7 Threonin durch Lysin;
38 Alanin durch Asparaginsäure;
39 Asparagin durch Asparaginsäure, Lysin oder Valin;
40 Glycin durch Asparaginsäure, Lysin oder Valin;
41 Valin durch Serin;
52 Serin durch Isoleucin;
54 Glycin durch Asparaginsäure;
56 Thyrosin durch Glutaminsäure;
85 Valin durch Glutaminsäure oder Arginin;
86 Serin durch Leucin, Lysin, Glutaminsäure oder Aspara ginsäure;
87 Tyrosin durch Glutaminsäure oder Arginin;
88 Glutamin durch Glutaminsäure;
127 Glutaminsäure durch Alanin, Valin oder Lysin;
128 Lysin durch Alanin, Valin oder Glutaminsäure;
129 Glycin durch Glutaminsäure, Lysin oder Valin;
156 Alanin durch Asparaginsäure; und
157 Leucin durch Phenylalanin.
wobei gegebenenfalls eine oder mehrere der Aminosäuren 1 bis 7 des N-Terminus der Sequenz deletiert sein können.

2. TNF-Mutein nach Anspruch 1, worin die Serine in Position 4 und 5 jeweils durch Arginin ersetzt sind und die ersten drei aufeinanderfolgenden Aminosäuren des N-Terminus dele tiert sind.

3. TNF-Mutein nach Anspruch 1, worin die ersten sieben Amino säuren des N-Terminus deletiert sind.

4. TNF-Mutein nach Anspruch 3, worin Prolin in Position 8, Serin in Position 9, Asparaginsäure in Position 10 und Leucin in Position 157 durch Arginin, Lysin, Arginin und Phenylalanin ersetzt sind.

5. TNF-Mutein nach Anspruch 3, worin Serin in Position 52 durch Isoleucin und Thyrosin in Position 56 durch Phenyl alanin ersetzt sind.

6. TNF-Mutein nach Anspruch 3, worin Serin in Position 52 und Alanin in Position 156 durch Isoleucin und Asparaginsäure ersetzt und Tyrosin in Position 56 und Leucin in Position 157 durch Phenylalanine ersetzt sind.

7. TNF-Mutein nach Anspruch 3, worin Serin in Position 86 durch Lysin ersetzt ist.

8. TNF-Mutein nach Anspruch 3, worin Tyrosin in Position 87 durch Glutaminsäure ersetzt ist.

9. TNF-Mutein nach Anspruch 3, worin Serin in Position 86 und Glutamin in Position 88 jeweils durch Glutaminsäure ersetzt sind.

10. TNF-Mutein nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, worin an den N-Terminus der Aminosäuresequenz Methionin angehängt ist.

11. Polynucleotid kodierend für ein TNF-Mutein nach einem der Ansprüche 1 bis 10.

12. Vektor, enthaltend ein Polynukleotid nach Anspruch 11.

13. Vektor nach Anspruch 12, worin das DNA-Fragment, das in Plasmid pT7-TNF oder pGHH-TNF für TNF kodiert, durch ein DNA-Fragment ersetzt ist, das für ein TNF-Mutein nach einem der Ansprüche 1 bis 10 kodiert.

14. Mikroorganismus, der mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 12 oder 13 transformiert ist.

15. Mikroorganismus nach Anspruch 14, worin der Mikroorganismus Escherichia coli ist.

16. Verfahren zur Herstellung eines TNF-Muteins nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise den Mikroorganismus gemäß Anspruch 14 oder 15 kultiviert und das resultierende TNF-Mutein aus der Kultur isoliert.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein TNF-Mutein nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon enthält.