DE3750106T2

DE3750106T2 - Rekombinanter B-Zell-Differenzierungsfaktor.

Info

Publication number: DE3750106T2
Application number: DE3750106T
Authority: DE
Inventors: Yukio C/O Ajinimoto Co. Inc. Kawasaki-Ku Kawasaki-Shi Kanagawa-Ken Akiyama; Toshio Ibaraki-Shi Osaka-Fu Hirano; Tadamitsu 5-31 Nakano 3 Chome Osaka-Fu Kishimoto; Hiroshi C/O Ajinomoto Co. Inc. Kawasaki-Ku Kawasaki-Shi Kanagawa-Ken Matsui; Akira C/O Ajinomo Co. Inc. Kawasaki-Ku Kawasaki-Shi Kanagawa-Ken Okano; Yoshiyuki C/O Ajinomoto Co. Inc. Kawasaki-Ku Kawasaki-Shi Kanagawa-Ken Takahara
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1986-08-06
Filing date: 1987-08-06
Publication date: 1995-03-16
Anticipated expiration: 2007-08-07
Also published as: EP0585957A1; US5362489A; EP0257406B1; EP0257406A3; EP0257406B2; EP0257406A2; DE3750106D1; US5541088A; DE3750106T3

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft B-Zell-Differenzierungsfaktor (nachstehend als "BCDF" bezeichnet) mit einer Aktivität bei Menschen, ein Gen, das dem menschlichen BCDF-Polypeptid entspricht, biotische Zellen, denen das Gen einverleibt wurde, ein Verfahren zur Herstellung von BCDF unter Verwendung der biotischen Zellen sowie eine immuntherapeutische Zusammensetzung, die humanen BCDF als wirksame Komponente umfaßt.

Stand der Technik

Reifer humaner BCDF ist ein Material, das erstmals in der vorliegenden Erfindung als diskrete Substanz aufgefunden wurde. Es kann in einem weiten Bereich als therapeutische Zusammensetzung für Immunschwächekrankheiten verwendet werden.
EP-0 220 574 beschreibt sog. Interferone mit einer Aminosäuresequenz, die zum BCDF der vorliegenden Erfindung in Beziehung steht. Das in EP-0 220 574 beschriebene Protein ist jedoch länger als reifer BCDF und enthält mindestens ein damit verknüpftes Signalpeptid. Die Struktur von reifem humanem BCDF wurde vor der vorliegenden Erfindung nicht erkannt. Außerdem weist das vorliegende Polypeptid im Gegensatz zum Polypeptid von EP-0 220 574 nicht die antivirale Aktivität auf, die in EP-0 220 574 beschrieben wird.
Durch Stimulation mit einem Antigen aktivierte reife B-Zellen werden mit Hilfe von T-Zellen zur Proliferation veranlaßt, es ist jedoch bekannt, daß eine oder mehrere aus T-Zellen stammende, die Differentiation induzierende Substanzen erforderlich sind, um schließlich eine Differentiation der B-Zellen zu erreichen und Antikörper bildende Zellen zu erhalten. Das Vorhandensein derartiger Substanzen wurde durch R. W. Dutton et al., Transplant. Rev., Bd. 23 (1975), S. 66, und A. Schimpl, E. Wecker et al., Nature N. Biol., Bd. 237 (1972), S. 15, belegt. Sie haben festgestellt, daß der Überstand nach der Kultivierung eines Mäuselymphozytengemisches oder der Überstand nach der Kultivierung von Mäuselymphozyten, die mit einem Antigen oder einem Mitogen stimuliert wurden, eine primäre Immunantwort der Mäuselymphozytenmasse, aus der Mäuse-T-Zellen entfernt wurden, oder von aus Nacktmäusen stammenden Lymphozyten gegenüber Schaf-Erythrozyten verstärken kann, und sie haben die Bezeichnung T-Zellen-Ersatzfaktor (TRF) für die aktive Substanz, die eine derartige Aktivität aufweist, verwendet. Seitdem wird TRF als ein Körperflüssigkeitsfaktor definiert, der auf B-Zellen ohne Haupt- Histokompatibilitätsgenkomplex-Restriktion (nachstehend einfach als MHC bezeichnet) einwirkt, der nicht-spezifisch für das Antigen ist, keine Proliferation von B-Zellen induziert, jedoch die Differentiation von B-Zellen zu Antikörper bildenden Zellen induziert.
Später sind dann Hinweise hinsichtlich der Funktion gesammelt worden, die das Vorhandensein eines derartigen B-Zell- Differenzierungsfaktors zeigen, und das Vorhandensein eines humanen Differenzierungsfaktors, der analog zu dem in Mäusen ist, ist vorgeschlagen worden. Gegenwärtig wird der Faktor, der wie vorstehend definiert ist und zur Differenzierung von B-Zellen zu Antikörper bildenden Zellen führt, zusammenfassend als BCDF bezeichnet.
BCDF als solcher spielt eine wichtige Rolle hinsichtlich der Funktion der Antikörperbildung von B-Zellen in vivo bei Menschen.
Lymphokine, die lösliche Proteine mit biologischer und pharmakologischer Aktivität sind, wirken so, daß sie die Immunantwortmechanismen des Körpers in vivo in Spurenmengen regulieren. Es wird eine Nützlichkeit von Lymphokinen als Antitumormittel, antivirale Mittel, antibakterielle Mittel, therapeutische Mittel bei Immunschwächen und therapeutische Mittel bei Autoimmunkrankheiten aufgrund der Beschaffenheit dieser immunaktiven Substanzen erwartet (Adv. in Immunopharm., (1980), S. 507. Erfindungsgemäßer BCDF ist ein Lymphokin, und unter diesem Gesichtspunkt ist zu erwarten, daß BCDF als Arzneimittel anwendbar ist.
Um BCDF zu erhalten, wird bisher ein Verfahren angewandt, das die Abtrennung von normalen T-Zellen aus menschlichem peripherem Blut und die Stimulierung der T-Zellen mit einem Mitogen zur Bildung von BCDF umfaßt. Gemäß diesem Verfahren treten viele Probleme dahingehend auf, daß es schwierig ist, T-Zellen in einer ausreichenden Menge zu erhalten; daß toxische Mitogene, die für BCDF schädlich sind, zu einer Kontamination führen, da Mitogene verwendet werden und es schwierig ist, sie zu entfernen; daß es erforderlich ist, Kulturen von T-Zellen mit Serumkomponenten, wie fötalem Rinderserum und dergl., zu ergänzen, und BCDF nicht in zufriedenstellender Weise von diesen zugesetzten Proteinen getrennt werden kann, so daß die Unmöglichkeit, reinen BCDF zu erhalten, ein Hindernis für die medizinische Verwendung von BCDF darstellt; und daß BCDF nicht in großtechnischem Maßstab hergestellt werden kann. Es wird auch über ein Verfahren berichtet, das die Zellfusion von menschlichen T-Zellen mit menschlichen Krebszellen unter Bildung von menschlichen T-Zell-Hybridomen und die Herstellung von BCDF unter Verwendung dieser Hybridome umfaßt (Okada et al., J. Exp. Med., Bd. 157 (1983), S. 583). Bei menschlichen Hybridomen besteht jedoch oftmals eine Tendenz zur Verringerung der Lymphokinbildung in der Kultur, so daß BCDF bildende menschliche Hybridome, die praktische Anwendungen überstehen, noch unbekannt sind.
In PNAS USA, Bd. 82 (1985), S. 5490-5494, werden die Isolierung von B-Zell-Differenzierungsfaktor aus Kulturüberständen von TCl-Na1-Zellen und seine Reinigung durch chromatographische Verfahren beschrieben. Der gemäß dem in dieser Druckschrift beschriebenen Verfahren isolierte und gereinigte Faktor stellt ein glycosyliertes Protein dar. Es wird ferner gezeigt, daß das Polypeptid die IgM-Absonderung in TESS-Zellen induziert.
EP-A-0 021 574, wobei es sich um eine nachveröffentlichte Druckschrift handelt, betrifft humanes Interferon β2A und Interferon β2B. Diese Polypeptide werden in gereinigter Form durch Klonierung in Säugerzellen mit der Sequenz des frühen SV40-Promotors hergestellt. Es wird berichtet, daß diese Polypeptide eine antivirale Aktivität zeigen.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, humanen BCDF, für den BCDF kodierende DNA, biotische Zellen mit derartiger DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen BCDF bereitzustellen. Für humanen BCDF kodierende DNA ist für die Herstellung von humanem BCDF durch Zellen von Prokaryonten oder Eukaryonten in großen Mengen erforderlich und unabdingbar.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

In der beigefügten Zeichnung
zeigt Fig. 1 die Konstruktion rekombinanter DNA für die Expression in Affenzellen;
zeigt Fig. 2 die BCDF-Aktivität von Kulturüberständen von Affenzellen (COS-7), in die pBSF 2-38-cDNA eingeführt wurde;
zeigt Fig. 3 die BCDF-Aktivität, die durch die reverse Plaque-Methode nachgewiesen wurde, des Kulturüberstands von Affenzellen (COS-7), in die pBSF 2-38-cDNA eingeführt wurde;
erläutert Fig. 4 die Analyse des Inserts b7 von pBSF 2-38 cDNA durch Northern-Blot-Technik;
zeigt Fig. 5 die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz von BCDF;
zeigt Fig. 6 eine Restriktionsenzymschnittstellenkarte; erläutert Fig. 7 die Konstruktion des Plasmids pT13S(Nco);
zeigt Fig. 8 die Nucleotidsequenz und die Restriktionsenzymschnittstellenkarte von synthetischem humanem Interleukin- 2 (HIL-2)
zeigt Fig. 9 die Konstruktion des Plasmids pTBCDF-01;
zeigt Fig. 10 die Konstruktion des Plasmids pTBCDF-02;
zeigt Fig. 11 die Konstruktion des Plasmids pTBCDF11;
zeigt Fig. 12 die Konstruktion des Plasmids pTBCDF12;
zeigt Fig. 13 die Konstruktion des Plasmids pTBCDF03; erläutert Fig. 14 die Antikörperbildung in der humanen B-Zellinie SKW6-CL4, die durch die Einführung von humanem Ala- BCDF oder humanem BCDF verstärkt wird;
erläutert Fig. 15, daß die Antikörperbildung in der humannen B-Zellinie SKW6-CL4 durch die Zugabe von humanem BCDF induziert wird;
erläutert Fig. 15 auch die Antikörperbildung durch Zugabe von humanem BCDF in Kombination mit humanem IL-2;
erläutert Fig. 16, daß die Antikörperbildung in Mäusemilzzellen DBA/2 durch die kombinierte Zugabe von humanem BCDF und humanem IL-2 verstärkt wird;
erläutert Fig. 17, daß die Antikörperbildung in Milzzellen von Balb/c-Nacktmäusen durch die kombinierte Zugabe von humanem BCDF und humanem IL-2 verstärkt wird;
erläutert Fig. 18, daß die Antikörperbildung gegen das immunisierende Antigen in vivo durch die kombinierte Gabe von humanem BCDF und humanem IL-2 verstärkt wird;
erläutert Fig. 19, daß das Wachstum von DBA/2-Mäuseknochenmarkszellen durch die kombinierte Zugabe von humanem Ala- BCDF und Mäuse-IL-3 verstärkt wird;
erläutert Fig. 20, daß das Wachstum von Knochenmarkszellen, die durch eine kombinierte Zugabe von humanem Ala-BCDF und Mäuse-IL-3 stimuliert wurden, durch die vorhergehende Verabreichung von Lentinan weiter verstärkt wird;
erläutert Fig. 21, daß humaner Ala-BCDF und Mäuse-IL-3 die Bildung von Kolonien und Clustern von DBA/2-Mäuseknochenmarkszellen stimulieren;
erläutert Fig. 22, daß die Bildung von Kolonien und Clustern von Knochenmarkszellen aus immundefizienten Mäusen (induziert durch Verabreichung eines immunsuppressiven Mittels) durch die kombinierte Zugabe von humanem Ala-BCDF und Mäuse-IL-3 verstärkt wird;
erläutert Fig. 23, daß humaner Ala-BCDF die Differenzierung von menschlichen myelomonozytischen Leukämiezellinien induziert;
zeigt Fig. 24, daß rekombinanter BCDF die Ig-Absonderung von PWM-stimulierten mononuklearen Zellen induziert;
zeigt Fig. 25, daß rekombinanter BCDF die Ig-Absonderung von PWM-stimulierten B-Blasten induziert;
zeigt Fig. 26 einen Anstieg der Zellzahlen von SRBC-spezifische Antikörper bildenden C3H/HeJ-Milzzellen (LPS, Maus mit schwacher Immunantwort) durch Zugabe von BCDF;
zeigt Fig. 27 einen Anstieg des Anti-SRBC-Ig-Titers im Serum bei Verabreichung von BCDF in vivo;
zeigt Fig. 28 eine Verstärkung der Milz-Hämatopoese durch Verabreichung von BCDF in vivo.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben bereits festgestellt, daß humane T-Zellen, die durch humanes T-Zell- Leukämievirus (nachstehend als "HTLV" bezeichnet) transformiert wurden, BCDF mit einem hohen Wirkungsgrad herstellen können, und sie haben ein authentisches Protein mit einer B-Zell-Differenzierungsfaktoraktivität von 5 · 10&sup6; Einheiten/ml oder mehr erhalten.
Die Herstellung einer humanen BCDF produzierenden humanen T-Zellinie kann wie folgt durchgeführt werden. Lymphozyten werden aus menschlichem peripherem Blut, Mandeln, Koronarblut oder dergl. durch Dichtegradientenzentrifugation oder dergl. unter Verwendung eines Ficollkissens oder dergl. abgetrennt, und die menschlichen T-Zellen werden unter Verwendung von HTLV in einer Weise ähnlich der von N. Yamamoto, Science, Bd. 217 (1982), S. 737, transformiert.
Zum Beispiel kann das folgende Verfahren angewandt werden: 1 · 10&sup7;/ml Viren bildende Zellen der Linie MT-2, die durch Röntgenbestrahlung (12 000 bis 14 000 rad) inaktiviert wurden, und 1 · 10&sup7;/ml menschliche Lymphozyten, die durch die vorstehend genannte Methode abgetrennt wurden, werden gemischt, auf RPMI 1640-Medium mit einem Gehalt an 20% FCS, 100 ug/ml Kanamycin, 2 ug/ml NaHCO&sub3; und 25 millimolar N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) in einer Petri-Schale aus Kunststoff (Falcon Nr. 3003) überimpft und anschließend bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; gezüchtet. Nach dem Züchten für 2 bis 3 Monate, wobei 2 mal die Woche die Hälfte des Mediums durch frisches Medium ersetzt wird, wird die Zellinie durch die Grenzverdünnungsmethode etabliert. Die BCDF-Aktivität des Überstands der etablierten Zellen wird gemessen, um eine Zellinie mit BCDF-Aktivität zu erhalten.
Als nach diesem Verfahren etablierte Zellen kann z. B. eine menschliche T-Zellinie mit der Bezeichnung VT-1 (IFO 50096) verwendet werden. Es gibt keine besonderen Bedingungen für die Züchtung von VT-1, herkömmliche Kulturbedingungen können jedoch in geeigneter Weise angepaßt werden. BCDF kann auch auf herkömmliche Weise hergestellt werden, es ist jedoch bevorzugt, die Herstellung in einem proteinfreien Medium durchzuführen.
Als für die Verstärkung des Wachstums von VT-1 am meisten geeignetes Medium wird ein Medium verwendet, das z. B. mit 1 bis 30% und vorzugsweise mit 20% FCS angereichert ist. Bei dem für die Herstellung von BCDF am besten geeigneten Medium kann es sich um das vorstehend genannte FCS-freie Medium handeln. Die Überlebensrate von VT-1 wird bei 70% oder mehr selbst nach 48-stündiger Kultur in einem FCS-freien kompletten synthetischen Medium gehalten.
In dem Fall, daß BCDF aus T-Zellen hergestellt wird, war es nach dem Stand der Technik von essentieller Bedeutung, Protein, wie FCS, oder ein Mitogen zu den Medien zu geben (vgl. T. Teranishi et al., J. Immunol., Bd. 128 (1982), S. 1093; A. Muraguchi et al., J. Immunol., Bd. 127 (1981), S. 412). Im Gegensatz dazu kann für den Fall, daß humaner BCDF unter Verwendung von VT-1 hergestellt wird, festgestellt werden, daß es weder erforderlich ist, Serum, wie FCS, Proteinkomponenten aus Blut oder andere proteinartige Komponenten, noch ein Mitogen für die T-Zellen oder B-Zellen zu den Medien zu geben. Daher kann BCDF nicht nur mit geringen Kosten ohne Verwendung des teuren FCS hergestellt werden, sondern es kann auch sicherer BCDF, der frei von heterogenen Proteinen und Mitogenen, die schädlich für den menschlichen Körper sind, in einfacher Weise erhalten werden.
Das vorstehend genannte Verfahren zur Herstellung von BCDF unter Verwendung von VT-l kann unter verschiedenen Umgebungsbedingungen durchgeführt werden. Die VT-l-Kultur sollte jedoch vorzugsweise in einer hinsichtlich der Feuchtigkeit eingestellten Luft mit einem Gehalt an ungefähr 5 bis 10% Kohlendioxid in einem Temperaturbereich von 35 bis 38ºC gehalten werden. Ferner sollte der pH-Wert des Mediums idealerweise in einem leicht alkalischen Bereich von ungefähr 7,0 bis 7,4 gehalten werden. VT-1 wird in verschiedene Typen von Inkubationsgefäßen, wie Rundboden-Mikrotiterplatten und dergl., in verschiedenen Volumina, wie 100 ul oder dergl., übertragen. Gewebekulturkolben, wie "Flask No. 3013" oder "Flask No.
3024", die von Falcon Labware, Div. Becton, Dickinson and Co., vertrieben werden, können ebenfalls verwendet werden. Bei einem weiteren Verfahren können auch Rollerflaschen, wie "Bottle No. 3027", die von der vorstehend genannten Firma Falcon Labware vertrieben werden, als Inkubationsgefäße verwendet werden.
Eine anfängliche Zelldichte für optimale Bedingungen zum Kultivieren und Züchten von VT-1 ist eine Zellenzahl von 1 · 10&sup4; bis 5 · 10&sup5; und vorzugsweise 2 · 10&sup5;. Wenn VT-1 unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen kultiviert werden, dann steigt die Zelldichte von ungefähr 5 · 10&sup5; auf 2 · 10&sup6; pro 1 ml des Mediums, und zwar im allgemeinen nach 2 bis 7 Tagen. Daher wird frisches Medium zugegeben, um die Zelldichte auf 1 · 10&sup4; bis 5 · 10&sup5; pro 1 ml des Mediums zu verringern, und die Inkubation wird erneut begonnen. Nach Fortsetzung der Inkubation von VT-1, um die gewünschte Zellenzahl zu erreichen, wie es vorstehend angegeben wurde, werden die Zellen durch Zentrifugation oder dergl. abgetrennt. Nachdem die Zellen mit proteinfreiem komplettem synthetischem Medium gespült wurden, werden sie in frisches komplettes synthetisches Medium überimpft. In diesem Fall wird es bevorzugt, wenn die anfängliche Zelldichte ungefähr 1 · 10&sup4; bis 1 · 10&sup7; pro 1 ml Medium und idealerweise 1 · 10&sup6; Zellen pro 1 ml Medium beträgt.
Die Menge an BCDF, die durch Kultivieren von VT-1 hergestellt wird, variiert im Verlauf der Zeit. Wenn VT-1 in RPMI 1640-Medium (mit einem Gehalt an 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 10 ug/ml Gentamycin und 16 millimolar NaHCO&sub3;) z. B. bei einer anfänglichen Zelldichte von 1 · 10&sup6;/ml kultiviert werden, dann erreicht die BCDF-Aktivität ihr Maximum nach 48 Stunden. Ferner nimmt die BCDF-Aktivität, die für die folgenden 24 Stunden vorhanden ist, geringfügig ab. Die optimale Inkubationszeit zur Herstellung von BCDF durch VT-1 in RPMI 1640-Medium beträgt daher ungefähr 24 bis 78 Stunden.
BCDF kann aus dem vorstehend genannten Kulturüberstand nach verschiedenen Verfahren, wie Aussalzen, Lyophilisieren, Ultrafiltration, Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Chromatofokussierung, Umkehrphasenchromatographie, fokussierende Elektrophorese, Gelelektrophorese und dergl., konzentriert und gereinigt werden.
Es geht nun um die Messung der BCDF-Aktivität, wobei die folgenden Verfahren genannt werden können.
Die BCDF-Aktivität wird unter Verwendung der menschlichen B-Zellinie CL4, die IgM als Antwort auf humanen BCDF bildet, gemessen (T. Hirano et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 82 (1985), S. 5490). Eine Probenlösung zur Untersuchung auf BCDF-Aktivität und 6 · 10³ CL4-Zellen werden zu 200 ul 10% FCS enthaltendes RPMI 1640-Medium (mit einem Gehalt an 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 10 ug/ml Gentamycin und 16 millimolar NaHCO&sub3;) gegeben. Das Gemisch wird 3 Tage bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen kultiviert, wobei die Menge an IgM im Überstand durch einen Enzymimmunoassay gemessen wird. Unter diesen Bedingungen wird die Aktivität von BCDF, die 50% der maximal gebildeten Menge an IgM (die höchste CL4-Reaktion) entspricht, als 1 Einheit/ml definiert.
Die BCDF-Aktivität kann auch durch die reverse PFC-Methode unter Verwendung der menschlichen B-Zellinie CL4, die IgM als Antwort auf humanen BCDF bildet, gemessen werden (O. Saiki et al., Eur. J. Immunol., Bd. 13 (1983), S. 31). Eine Probenlösung zur Untersuchung auf BCDF-Aktivität und 1 · 10&sup4; CL4-Zellen werden zu 200 ul 10% FCS enthaltendes RPMI 1640-Medium (mit den gleichen Additiven, die vorstehend beschrieben wurden) gegeben. Das Gemisch wird 3 Tage bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; in einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen kultiviert. Die Zellen der Kultur, Komplement, anti-Mensch-IgM-Antikörper und Protein A-gebundene Schaf-Erythrozyten werden mit Agarose, die in Hanks-Lösung gelöst ist, gemischt, und das Gemisch wird in einer Petri-Schale ausgestrichen und verfestigt. Nach einer Kultur über Nacht bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; wird die Anzahl der Zellen, die einer Differenzierung zu IgM bildenden Zellen durch die Einwirkung von BCDF unterliegt, durch die Anzahl der gebildeten hämolytischen Plaques gemessen.
Um das Gen, das für humanen BCDF kodiert, zu identifizieren und zu erhalten, wird RNA aus den VT-1-Zellen, die unter optimalen Bedingungen für die Bildung von BCDF, wie sie vorstehend beschrieben wurden, gezüchtet wurden, extrahiert und gewonnen, um eine cDNA-Bibliothek herzustellen, und für BCDF kodierende cDNA wird aus der Bibliothek kloniert. Daher haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung BCDF-cDNA, wie nachstehend in den Beispielen gezeigt wird, durch vollständige Reinigung von humanem BCDF, der durch VT-1-Zellen gebildet wurde, Bestimmung der Aminosäuresequenz des BCDF am N-Terminus und der Aminosäure-Teilsequenzen der Peptidfragmente, die durch eine partielle Spaltung mit Lysylendopeptidase erhalten wurden, Synthese von Oligonucleotiden, die den entsprechenden Peptiden entsprechen, und Absuchen nach Klonen aus der vorstehend genannten cDNA-Bibliothek, die komplementär mit einigen synthetischen Sonden unter Verwendung der auf diese Weise synthetisierten Oligonucleotidsonden hybridisierten, identifiziert. Die Basensequenz der auf diese Weise erhaltenen cDNA wurde auf herkömmliche Weise bestimmt, und das für BCDF kodierende Gen wurde gewonnen. Aus der Sequenz dieses Gens wurde festgestellt, daß humaner BCDF ein aus 184 Aminosäuren bestehendes Polypeptid ist. Gleichzeitig wurde, um die auf diese Weise erhaltene cDNA in eukaryontischen Zellen zu exprimieren, die cDNA mit einem Expressionsvektor verknüpft, und das Gen-wurde in Zellen eingeführt. BCDF kann im Überstand durch Inkubation der Zellen gebildet werden, und reiner humaner BCDF wird durch Reinigungsschritte erhalten. Rekombinanter humaner BCDF, der der genetischen Struktur von BCDF entspricht, wurde ebenfalls hergestellt, und es ist festgestellt worden, daß dieser BCDF die gleichen physikochemischen und biologischen Eigenschaften wie BCDF aus VT-1-Zellen oder humaner BCDF, der aus menschlichen Zellen erhalten wurde, aufweist. Ausgehend von ,den vorstehenden Befunden ist schließlich bewiesen worden, daß das identifizierte Gen für das humane BCDF-Protein kodiert.
Andererseits kann humaner BCDF auch in Prokaryonten hergestellt werden. Das für humanen BCDF kodierende Gen wird in Vektor-DNA zur Expression des Gens eingeführt, die auf diese Weise erhaltene rekombinante DNA wird in eine prokaryontische Wirtszelle eingeführt, und der erhaltene transformierte Mikroorganismus wird kultiviert.
Das für BCDF kodierende Gen weist mindestens die Aminosäuresequenz (I) oder eine Basensequenz, die einer teilweise modifizierten Struktur entspricht, auf. Prokaryontische Wirtszellen, in die die rekombinante DNA eingeführt wird, sind Escherichia coli, Bacillus subtilis und weitere Mikroorganismen, die für den Fachmann auf dem Gebiet der aktuellen Gentechnik offensichtlich sind.
Bei den Medien und Verfahren zur Kultivierung der transformierten Mikroorganismen (Prokaryonten) kann es sich um herkömmliche Medien und Verfahren handeln.
Für den Fall, daß der humane BCDF im transformierten Mikroorganismus angereichert wird, kann BCDF nach einem Verfahren, das der Fachmann ohne weiteres durchführen kann, gewonnen und gereinigt werden. Einfach gesagt können die Zellen durch Zentrifugation nach der Inkubation gesammelt und in einer Lösung mit einem Gehalt an Lysozym oder einer Lösung mit einem Gehalt an Detergens suspendiert werden. Nach Abschluß der Reaktion werden Einfrieren und Auftauen wiederholt, um den Zellextrakt zu erhalten, und der Extrakt kann nach dem vorstehend angegebenen Reinigungsverfahren und/oder auf einfache Weise, wie durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Säule mit immobilisierten anti-BCDF-Antikörpern, gereinigt werden.
Bis jetzt gibt es jedoch keinen Bericht über ein Verfahren zur Herstellung von BCDF durch Prokaryonten, wie Escherichia coli und dergl., d. h. ein Verfahren zur Herstellung von BCDF durch Prokaryonten, wobei das Verfahren das Einbringen einer für BCDF kodierenden DNA-Sequenz in einen prokaryontischen Vektor, die Replikation, Transkription und Translation der DNA-Sequenz in den prokaryontischen Zellen und die Herstellung von BCDF nach einem derartigen Verfahren umfaßt.
Als Ergebnis weiterer umfangreicher Untersuchungen, um die vorstehenden Probleme zu lösen, haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung die vorliegende Erfindung durch Kultivieren von prokaryontischen Zellen, die mit rekombinanter DNA transformiert wurden, die aus einem DNA-Vektor bestand, der zur Replikation des für das Polypeptid mit humaner BCDF Aktivität kodierende Gen in prokaryontischen Zellen imstande war, und durch Gewinnung des gebildeten humanen BCDF gemacht. Nachstehend wird die Erfindung ausführlich beschrieben.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben bereits ein für humanen BCDF kodierendes Gen identifiziert, wobei sie der Tatsache, daß VT-1-Zellen (IFO 50096) oder menschliche T-Zellen, die mit HTLV (humanes T-Zellen-Leukämievirus) transformiert wurden, humanen BCDF in großen Mengen bilden, Aufmerksamkeit geschenkt haben (japanische Patentanmeldung 184858/86) Einzelheiten des Klonierungsverfahrens des für humanen BCDF kodierenden Gens werden in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
Es geht nun um die Herstellung des humanen BCDF produzierenden Prokaryonten. Das für humanen BCDF kodierende Gen wird in einen DNA-Vektor, der zur Replikation in prokaryontischen Zellen imstande ist, eingeführt. In diesem Fall kann die für humanen BCDF kodierende DNA stromabwärts von einer Promotorsequenz des Expressionsvektors inseriert werden; alternativ dazu kann ein DNA-Fragment mit der Promotorsequenz vor oder nach der Insertion der cDNA des Expressionsvektors und stromaufwärts von der für humanen BCDF kodierenden DNA inseriert werden. In diesem Fall kodiert die für humanen BCDF kodierende cDNA für ein Polypeptid, das aus 212 Aminosäuren besteht, wie es in Fig. 5 gezeigt ist, wobei es sich bei der hydrophoben, N-terminalen, 28 Aminosäuren entsprechenden Region dieses Polypeptids jedoch um eine Signalsequenz handelt, die im Verlauf der Sekretion abgespalten wird. Dementsprechend wird es gewünscht, den cDNA-Abschnitt, der für das reife humane BCDF-Polypeptid, das ausgehend vom N-terminalen Pro aus 184 Aminosäuren besteht, kodiert, zu exprimieren.
Zur Konstruktion des Expressionsplasmids wird der Vektor mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten und, falls es erforderlich und gewünscht ist, mit einem geeigneten Linker oder einem Oligonucleotidadapter, die bei Kombination zum Annealen imstande sind, inseriert. Die auf diese Weise erhaltene doppelsträngige DNA wird mit einer Vektor-DNA gemischt, und das Gemisch wird unter Verwendung von Ligase ligiert.
Die auf diese Weise erhaltene rekombinante DNA wird in einen prokaryontischen Wirt eingeführt, und ein humanen BCDF produzierender Stamm kann unter den erhaltenen transformierten Mikroorganismen ausgewählt werden.
Als Prokaryonten können erfindungsgemäß Escherichia coli, Bacillus subtilis und dergl. eingesetzt werden; es wird bevorzugt, Escherichia coli zu verwenden.
Beispiele für Vektoren für Escherichia coli, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen Plasmidvektoren vom EK-Typ (stringenter Typ; pSC101, pRK353, pRK646, pRK248, pDF41 und dergl.), Plasmidvektoren vom EK-Typ (relaxierter Typ: ColE1, pVH51, pAC105, RSF2124, pCR1, pMB9, pBR313, pBR322, pBR324, pBR325, pBR327, pBR328, pKY2289, pKY2700, pKN80, pKC7, pKB158, pMK2004, pACYC1, pACYC184, du1 und dergl.), Phagenvektoren vom lambda gt-Typ: lambda gt.lambda c, lambda gt.lambda B, lambda WES, lambda C, lambda WES, lambda B, lambda ZJvir., lambda B', lambda ALO, lambda B, lambda WES.Ts622, lambda Dam und dergl.
Ferner können als Promotoren alle Promotoren, die in Escherichia coli ihre Funktion erfüllen, unter Einschluß des trp-, des lac-, des tac-, des tufB-, des β-Lactamase- und des lpp-Promotors, verwendet werden.
Zur Transformation von Wirtszellen unter Verwendung von rekombinanter DNA wird herkömmlicherweise das folgende Verfahren angewandt. Für den Fall, daß ein Prokaryont, wie Escherichia coli, der Wirt ist, können kompetente Zellen, die zur Aufnahme dieser DNA imstande sind, durch das bekannte CaCl&sub2;-Verfahren nach der Gewinnung von Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase transformiert werden. Das Vorhandensein von MgCl&sub2; oder RbCl in der Transformationsreaktionslösung verbessert den Transformationswirkungsgrad. Es ist auch möglich, die Transformation nach der Herstellung von Protoplasten der Wirtszellen durchzuführen.
Die auf diese Weise erhaltene rekombinante prokaryontische Zelle, in die das humane BCDF-Gen eingeführt wurde, kann auf herkömmliche Weise kultiviert werden.
Der auf diese Weise erhaltene BCDF kann aus dem vorstehend genannten Kulturüberstand nach verschiedenen Verfahren, wie Aussalzen, Lyophilisieren, Ultrafiltration, Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Chromatofokussierung, Umkehrphasenchromatographie, fokussierende Elektrophorese, Gelelektrophorese und dergl., konzentriert und gereinigt werden.
Für den Fall, daß humaner BCDF im transformierten Mikroorganismus angereichert wird, kann der BCDF nach herkömmlichen Verfahren gewonnen und gereinigt werden. Einfach gesagt werden die Zellen durch Zentrifugation nach der Inkubation gesammelt und in einer Lösung mit einem Gehalt an Lysozym oder einer Lösung mit einem Gehalt an Detergens suspendiert. Nach Abschluß der Reaktion werden Einfrieren und Auftauen wiederholt, um den Zellextrakt zu gewinnen, und der Extrakt kann nach dem vorstehend genannten Reinigungsverfahren und/oder in einfacher Weise, wie durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Säule mit immobilisierten anti-BCDF-Antikörpern, gereinigt werden.
Es geht nun um die Messung der BCDF-Aktivität, wobei die folgenden Verfahren genannt werden können.
Die BCDF-Aktivität wird unter Verwendung der menschlichen B-Zellinie CL4, die IgM als Antwort auf humanen BCDF bildet, gemessen (T. Hirano et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 82 (1985), S. 5490). Eine Probelösung zur Untersuchung auf BCDF- Aktivität und 6 · 10³ CL4-Zellen werden zu 200 ul 10% FCS enthaltendes RPMI 1640-Medium (mit einem Gehalt an 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 10 ug/ml Gentamycin und 16 millimolar NaHCO&sub3;) gegeben. Das Gemisch wird 3 Tage bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen kultiviert, wobei die Menge an IgM im Überstand durch einen Enzymimmunoassay gemessen wird. Unter diesen Bedingungen wird die BCDF-Aktivität, die 50% der maximal gebildeten Menge an IgM (die höchste CL4- Reaktion) entspricht, als 1 Einheit/ml definiert.
Die BCDF-Aktivität kann auch durch die reverse PFC-Methode unter Verwendung der menschlichen B-Zellinie CL4, die IgM als Antwort auf humanen BCDF bildet, gemessen werden (O. Saiki et al., Eur. J. Immunol., Bd. 13 (1983), S. 31). Eine Probelösung zur Untersuchung auf BCDF-Aktivität und 1 · 10&sup4; CL4-Zellen werden zu 200 ul 10% FCS enthaltendes RPMI 1640-Medium (mit den gleichen Additiven, wie sie vorstehend beschrieben wurden) gegeben. Das Gemisch wird 3 Tage bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen kultiviert. Die kultivierten Zellen, Komplement, anti- Mensch-IgM-Antikörper und Protein A-gebundene Schaf-Erythrozyten werden mit Agarose, die in Hanks-Lösung gelöst ist, gemischt, und das Gemisch wird in einer Petri-Schale verteilt und verfestigt. Nach Kultivieren über Nacht bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; wird die Anzahl der Zellen, die einer Differenzierung in IgM bildende Zellen durch Einwirkung von BCDF unterliegt, durch die Anzahl der gebildeten hämolytischen Plaques gemessen.
Wie auch für humane Interferongene bekannt ist, so zeigen eukaryontische Gene Polymorphismus (Taniguchi et al., Gene, Bd. 10 (1980), S. 11-15; Ohno und Taniguchi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77 (1981), S. 5305-5309; Gray et al., Nature, Bd. 295 (1981), S. 501-508). Als Folge des Polymorphismus können in einigen Fällen einige Aminosäuren des Proteinprodukts ersetzt sein, während in anderen Fällen kein Aminosäureaustausch beobachtet wird, obwohl sich die Basensequenz ändert. Dementsprechend umfaßt die vorliegende Erfindung auch Polypeptide, die durch Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren für eine oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von Fig. 5 erhalten wurden, und DNA, die für diese Polypeptide kodiert, solange sie humane BCDF-Aktivität besitzen. Zum Beispiel kann ein Cysteinrest durch eine neutrale Aminosäure ersetzt werden, wenn der Cysteinrest, der ersetzt wird, für die BCDF-Aktivität nicht erforderlich ist. Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung, wie in den Beispielen gezeigt wird, auch Polypeptide mit humaner BCDF-Aktivität, denen eine oder mehrere Aminosäuren fehlen, Polypeptide, an die eine oder mehrere Aminosäuren addiert sind, Polypeptide mit kombinierten Sequenzen davon (unter Einschluß des Ersatzes von Aminosäuren) und DNAs mit Basensequenzen, die für diese Polypeptide kodieren. Selbst wenn eine modifizierte Region mit einer zusätzlichen Aminosäuresequenz vorhanden ist, die die Polypeptidfunktion als humaner BCDF hemmt, können ein derartiges Polypeptid und ein derartiges Gen erfindungsgemäß verwendet werden, wenn die neu addierte Region ohne weiteres entfernt werden kann. In der vorliegenden Anmeldung wird nämlich jedes beliebige Polypeptid mit humaner BCDF-Aktivität als erfindungsgemäßer humaner BCDF beschrieben.
Die Anwendung des auf diese Weise hergestellten BCDF in der Klinik wird grob in drei Gebiete eingeteilt. Zuerst wird ein Anti-BCDF-Antikörper mit Hilfe des BCDF hergestellt; der Antikörper kann zur Analyse des immunologischen Status unter Verwendung eines Immunoassaysystems für BCDF mit BCDF und dem anti-BCDF-Antikörper verwendet werden, und gleichzeitig kann er zur Behebung einer funktionellen Anomalität von B-Zellen, die gelegentlich bei Autoimmunkrankheiten festgestellt werden, verwendet werden. Zweitens besteht eine weitere Anwendung in der Therapie verschiedener Erkrankungen. Zum Beispiel kann die Antikörper bildende Funktion durch Verabreichung von BCDF allein oder zusammen mit anderen Lymphokinen oder immuntherapeutischen Mitteln bei Patienten mit Immunschwäche aufgrund einer verringerten Antikörperbildungsaktivität von B-Zellen, die mit einer verringerten Helferfunktion von T-Zellen verbunden ist, normalisiert werden.
Ferner kann BCDF unter Beachtung der Differenzierungsaktivität von BCDF auch als Mittel gegen maligne Tumoren durch Differenzierung der malignen Tumorzellinie durch BCDF und Verursachung einer Wachstumshemmung verwendet werden.
Als weitere Anwendung von BCDF wird folgendes in Betracht gezogen. Es wird berichtet, daß normale B-Zellen über eine lange Zeitspanne durch Zugabe von B-Zellwachstumsfaktoren (BCGF) (K. Yoshizaki et al., J. Immunol., Bd. 130 (1983), S. 1241) und weiteren T-Zellfaktoren unter Einschluß von Lymphokinen zum Medium (vgl. B. Sredni et al., J. Exp. Med., Bd. 154 (1981), S. 1500) gezüchtet werden können. Indem man BCDF auf diese normalen gezüchteten B-Zellen oder mit dem EB-Virus transformierte B-Zellen für eine geeignete Zeitspanne einwirken läßt, können Antikörper in vitro erzeugt werden. Durch Klonierung von B-Zellen, die einen Antikörper bilden, der ein spezifisches Antigen erkennt, das auf der Oberfläche z. B. von pathogenen Bakterien, pathogenen Viren, pathogenen Protozoen, Krebszellen und dergl. vorhanden ist, und Züchten der klonierten normalen B-Zellen oder der durch das EB-Virus transformierten Zellen in Kombination mit BCDF und weiteren Lymphokinen können nützliche monoklonale Antikörper hergestellt werden. Diese Antikörper können zur Therapie und Diagnose von Infektionskrankheiten und Krebs verwendet werden.
Wie vorstehend erwähnt wurde, ist BCDF eine in einem überaus weiten Bereich wirksame Substanz.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine immuntherapeutische Zusammensetzung zur Therapie von primären und sekundären Immunschwächen, infektiösen Erkrankungen mit Bakterien, Pilzen, Viren, Protozoen und dergl., und Krebserkrankungen sowie zur Verstärkung der hämatopoetischen Funktion. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine immuntherapeutische Zusammensetzung, die humanen BCDF als einen Wirkstoff umfaßt.
Als solcher spielt BCDF eine wichtige Rolle hinsichtlich der Funktion der Antikörperbildung durch B-Zellen in vivo beim Menschen. Da humaner BCDF eine derartig wichtige Rolle spielt, haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, und sie waren erfolgreich bei der Bestimmung seiner DNA-Sequenz und seiner Aminosäuresequenz (JP-A-184858/86 und JP-A-200433/86) und bei der Herstellung von humanem BCDF unter Verwendung von Escherichia coli (JP-A-302699/86).
Es ist bisher jedoch nicht über die pharmakologischen Wirkungen dieses humanen BCDF gegen Krebs, Infektionskrankheiten, primäre Immunschwäche oder sekundäre Immunschwäche, z. B. gegen eine Verringerung der Anzahl der Leukozyten, die bei Chemotherapie und Strahlenbehandlung von Patienten mit malignen Tumoren beobachtet wird, berichtet worden.
Nachstehend werden Krebserkrankungen, Immunschwäche und Infektionskrankheiten in Verbindung damit, für die die humanen BCDF umfassende immuntherapeutische Zusammensetzung wirksam ist, kurz beschrieben, und gleichzeitig wird die gegenwärtig übliche Therapie kurz beschrieben.
In den letzten Jahren ist vorgeschlagen worden, humanen BCDF als BSF-2 (Nature, Bd. 324 (1986), S. 73) zu bezeichnen, in der vorliegenden Anmeldung wird jedoch der Ausdruck BCDF verwendet.
Immunschwächesyndrome bezeichnen zusammenfassend einen Zustand, in dem ein beliebiger Teil des Immunsystems geschwächt ist und die Abwehrfähigkeit des Körpers verringert ist.
Immunschwächesyndrome werden grob in zwei Klassen eingeteilt: primäre Immunschwäche, von der man annimmt, daß sie auf einer angeborenen Ursache basiert, und sekundäre Immunschwäche, von der man annimmt, daß sie durch eine äußere Ursache oder in Verbindung mit anderen Erkrankungen verursacht wird.
In den meisten Fällen sind Ursachen für primäre Immunschwächekrankheiten genetische Defekte von T-Zellen und/oder B-Zellen. Andererseits sind die Ursachen für sekundäre Immunschwächekrankheiten verschiedenartig, eine Hauptursache ist jedoch die Infektion mit Bakterien, Viren und dergl. Insbesondere AIDS, das durch ein bestimmtes Virus hervorgerufen wird, ist eine sekundäre Immunschwächekrankheit, die in neuerer Zeit zu einem sozialen Problem geworden ist.
Ferner werden sekundäre Immunschwächekrankheiten gelegentlich hervorgerufen, da die Anzahl der Leukozyten aufgrund der Verwendung von Antikrebsmitteln, der Radiotherapie und dergl. merklich verringert wird. Wenn man an Immunschwächekrankheiten leidet, dann ist die Abwehrfähigkeit des lebenden Körpers verringert, so daß Infektionskrankheiten häufig induziert werden. Die meisten Pathogene von Infektionskrankheiten sind vorher harmlos gewesen, zeigen jedoch eine pathogene Beschaffenheit aufgrund einer Veränderung im lebenden Körper; derartige Infektionskrankheiten werden als opportunistische Infektionen bezeichnet. Derartige Infektionskrankheiten werden mit großer Häufigkeit bei Verabreichung von Antikrebsmitteln, insbesondere bei der Chemotherapie akuter Leukämie, und bei der Transplantation von Knochenmark beobachtet, und die letale Rate ist hoch. Eine opportunistische Infektion ist die Carinii-Pneumonie, die durch Carinii-Protozoen induziert wird und im Endstadium von AIDS auftritt.
Diese primären und sekundären Immunschwächekrankheiten werden durch die folgenden drei Verfahren behandelt:
(1) Verabreichung von chemotherapeutischen Mitteln, wie Antibiotika, antiviralen Mitteln (z. B. AZT im Fall von AIDS);
(2) Verabreichung eines humanen Immunglobulins oder eines Vaccins;
(3) Anwendung einer Kombination dieser Maßnahmen.
Wenn jedoch die Immunfunktion verringert ist, dann zeigen die vorstehenden Behandlungen keine ausgeprägten Wirkungen. Darüber hinaus beinhalten die vorstehend beschriebenen therapeutischen Mittel ernsthafte Nachteile, die nachstehend erläutert werden.
Erstens ist die Verabreichung von Antibiotika und antiviralen Mitteln mit ernsthaften Nebenwirkungen verbunden. Im Fall von Antibiotika treten resistente Bakterien oder mikrobielle Substitutionen auf, so daß die Wirksamkeit beschränkt ist. Ferner ist im Fall von Immunglobulinzubereitungen die Menge an Antikörper gegen die fraglichen infektiösen Bakterien nur eine Spurenmenge, so daß die Wirkung gering ist.
Ferner wird bei Vaccinen die Wirkung in einem Immunschwächezustand kaum beobachtet.
Ferner haben als Beispiel für sekundäre Immunschwächekrankheiten bei Verabreichung von chemotherapeutischen Mitteln an einen Krebspatienten und der dabei eintretenden Verringerung der hämatopoetischen Funktion, so daß ohne weiteres ein infektiöser Zustand auftritt, die vorstehend genannten therapeutischen Mittel keinerlei Wirkung hinsichtlich der Wiederherstellung der verringerten hämatopoetischen Funktion oder der Differenzierung und Induzierung der Krebszellen selbst zu normalen Zellen. Dementsprechend ist eine grundlegende Behandlung unmöglich.
Daher besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, therapeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Krebserkrankungen, primären und sekundären Immunschwächekrankheiten sowie verschiedenen Infektionskrankheiten, die durch Immunschwächekrankheiten induziert sind, bereitzustellen, die gegenwärtig unbekannt sind und Kombinationswirkungen dahingehend zeigen, daß (1) Nebenwirkungen minimiert werden; (2) kein Problem des Auftretens resistenter Bakterien oder mikrobieller Substitutionen besteht; (3) die Bildung von spezifischen Antikörpern gegen das fragliche Antigen induziert und verstärkt wird; (4) die hämatopoetische Funktion wiederhergestellt wird; und (5) die Differenzierung und Induzierung von Krebszellen erzielt wird; und dergl.
Als Ergebnis umfangreicher Untersuchungen zur Lösung der vorstehenden Probleme haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung festgestellt, daß immuntherapeutische Zusammensetzungen, die humanen BCDF als Wirkstoff umfassen, wirksam bei Krebserkrankungen, primären und sekundären Immunschwächekrankheiten und verschiedenen dadurch induzierten Infektionskrankheiten sind, und sie haben auf diese Weise die vorliegende Erfindung abgeschlossen.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine immuntherapeutische Zusammensetzung, die humanen BCDF als Wirkstoff enthält.
Der erfindungsgemäße humane BCDF weist z. B. die nachstehend angegebene Aminosäuresequenz (I) auf:
PRO VAL PRO PRO GLY GLU ASP SER LYS ASP VAL
ALA ALA PRO HIS ARG GLN PRO LEU THR SER SER
GLU ARG ILE ASP LYS GLN ILE ARG TYR ILE LEU
ASP GLY ILE SER ALA LEU ARG LYS GLU THR CYS
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ALA LEU ALA GLU ASN ASN LEU ASN LEU PRO LYS
MET ALA GLU LYS ASP GLY CYS PHE GLN SER GLY
PHE ASN GLU GLU THR CYS LEU VAL LYS ILE ILE
THR GLY LEU LED GLU PHE GLU VAL TYR LEU GLU
TYR LEU GLN ASN ARG PHE GLU SER SER GLU GLU
GLN ALA ARG ALA VAL GLN MET SER THR LYS VAL
LEU ILE GLN PHE LEU GLN LYS LYS ALA LYS ASN
LEU ASP ALA ILE THR THR PRO ASP PRO THR THR
ASN ALA SER LEU LEU THR LYS LEU GLN ALA GLN,
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SER LEU ARG ALA LEU ARG GLN MET
Es ist jedoch nicht immer erforderlich, daß der erfindungsgemäß verwendete humane BCDF die durch die vorstehend angegebene Aminosäuresequenz (I) wiedergegebene Struktur annimmt.
BCDF mit einer Struktur, in der eine oder mehrere Aminosäuren an den N-Terminus und/oder den C-Terminus des natürlichen humanen BCDF addiert sind, und BCDF mit einer Struktur, in der eine oder mehrere Aminosäuren in der Struktur des natürlichen humanen BCDF durch andere Aminosäuren ersetzt sind, können ebenfalls erfindungsgemäß als humaner BCDF verwendet werden, sofern sie humane BCDF-Aktivität aufweisen. Natürlicher humaner BCDF wird vorzugsweise verwendet. Der Gehalt an humanem BCDF beträgt erfindungsgemäß 0,0001 bis 100 Gew.-% und vorzugsweise 0,1 bis 1,0 Gew.-%, bezogen auf die immuntherapeutische Zusammensetzung.
Die erfindungsgemäße, humanen BCDF als Wirkstoff enthaltende immuntherapeutische Zusammensetzung kann auch einen Stabilisator, wie Serumalbumin und dergl., sowie einen Arzneimittelträger, wie Mannit und dergl., enthalten. Außer humanem BCDF kann die erfindungsgemäße immuntherapeutische Zusammensetzung ferner mindestens einen der Bestandteile humanes IL-2, humanes IL-3, Lentinan und Mäuse-IL-3 als Hilfsstoffe enthalten.
Wenn ein derartiger Hilfsstoff einverleibt wird, dann steigt die Wirkung der immuntherapeutischen Zusammensetzung in synergistischer Weise. Es gibt zwar keine besondere Beschränkung hinsichtlich der einzuverleibenden Menge dieser Hilfsstoffe, im allgemeinen wird es jedoch bevorzugt, 0,0001 bis 200 000 Gew.-%, bezogen auf humanen BCDF als 100, einzuverleiben. Die Menge dieser Hilfsstoffe ist nicht auf den vorstehend angegebenen Bereich beschränkt, sondern sie kann ungefähr abhängig vom Zustand, Alter des Patienten und dergl. bestimmt werden.
Hilfsstoffe, wie humanes IL-2, humanes IL-3, Mäuse-IL-3 und Lentinan werden nicht immer gleichzeitig mit humanem BCDF in der gleichen Zusammensetzung gegeben. Diese Hilfsstoffe können nämlich auch in einem geeigneten Zeitraum vor oder nach der Verabreichung der humanen BCDF als Wirkstoff enthaltenden immuntherapeutischen Zusammensetzung verabreicht werden.
Natürlich können die erfindungsgemäßen immuntherapeutischen Zusammensetzungen auch in Kombination mit anderen chemotherapeutischen Mitteln, Antikrebsmitteln, antiviralen Mitteln, Antibiotika und dergl. verwendet werden. Die immuntherapeutische Zusammensetzung kann auch in Kombination mit einer Vaccintherapie zur Verstärkung der Wirkung verwendet werden. Die immuntherapeutische Zusammensetzung kann durch intravenöse Injektion, intramuskuläre Injektion oder subkutane Injektion verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann also in einer beliebigen Form der Injektion gegeben werden.
Erfindungsgemäß verwendeter humaner BCDF kann durch Züchten eines Stamms hergestellt werden, der durch Transformation eines geeigneten Wirts, wie Escherichia coli mit einem Gen, das für humanen BCDF kodiert, unter Verwendung eines geeigneten Vektors hergestellt wird, gefolgt von einer weiteren Reinigung. Im Hinblick auf die Herstellung von humanem BCDF wird in den Beispielen das Verfahren erneut erläutert.
Es ist klar, daß die erfindungsgemäße immuntherapeutische Zusammensetzung bei der Behandlung und Prophylaxe verschiedener Infektionskrankheiten (Carinii-Pneumonie und dergl., die durch AIDS induziert werden), die aus Immunschwächekrankheiten hervorgehen, wirksam ist. Zum Beispiel werden in dem Fall, daß Pathogene, wie Bakterien, Pilze, Protozoen, Viren und dergl., Infektionen verursachen, Antikörper dagegen gebildet, und anschließend schützen die Antikörper den lebenden Körper vor den Pathogenen durch 1) direkte Neutralisierung und Ausfällung; 2) Verstärkung der Phagocytose durch Phagocyten mittels Opsonifikation; 3) Lyse durch Aktivierung des Komplementsystems; 4) antikörperabhängige zellvermittelte Cytotoxizität und dergl.
Die erfindungsgemäße immuntherapeutische Zusammensetzung kann nämlich die Bildung spezifischer Antikörper durch den Patienten mit primären Immunschwächekrankheiten aufgrund genetischer Faktoren und dergl. und mit sekundären Immunschwächekrankheiten, bei denen die Immunfunktion durch Verabreichung von chemotherapeutischen Mitteln oder Verabreichung von immunsuppressiven Mitteln und viralen Infektionen und dergl. verringert ist, verstärken, wobei ein ohne weiteres infektiöser Zustand verbessert und behandelt werden kann.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben festgestellt, daß humane BCDFs nicht nur die Antikörperbildung verstärken, sondern auch das Wachstum von Knochenmarkszellen sowie die Induktion der Differenzierung von Tumorzellen beeinflussen. Ausgehend von diesen Wirkungen ist festgestellt worden, daß BCDF nicht nur für die Behandlung von Infektionskrankheiten aufgrund einer verstärkten Antikörperbildung beim Patienten mit primären Immunschwächekrankheiten oder mit sekundären Immunschwächekrankheiten wirksam ist, sondern auch die hämatopoetische Funktion beim Patienten mit Immunschwächekrankheiten verstärken kann und therapeutische Wirkungen bei einem Krebspatienten zeigt.
Es ist bereits bekannt, daß 1) IL-2 zur Verstärkung der Antikörperbildung imstande ist; 2) Kolonie-stimulierender Faktor (CSF) Wachstum von Knochenmarkszellen hervorruft; und 3) gamma-Interferon (gamma-IFN) eine Wirkung auf die Induktion der Differenzierung von Tumorzellen hat, es ist jedoch gegenwärtig keine Substanz bekannt, die die drei Funktionen (1) der Verstärkung der Antikörperbildung; (2) der Verstärkung des Wachstums von Knochenmarkszellen; und (3) der Induktion der Differenzierung von Tumorzellen in Kombination aufweist. Dementsprechend ist der erfindungsgemäße humane BCDF ein wichtiger Arzneistoff, der bisher unbekannt war.
Die erfindungsgemäße, humanen BCDF als Wirkstoff umfassende immuntherapeutische Zusammensetzung weist die drei Funktionen der (1) Verstärkung der Antikörperbildung; (2) der Verstärkung des Wachstums von Knochenmarkszellen; und (3) der Induzierung der Differenzierung von Tumorzellen in Kombination auf, so daß die immuntherapeutische Zusammensetzung wirksam bei der Behandlung von primären Immunschwächekrankheiten, sekundären Immunschwächekrankheiten, die Begleiterscheinungen von viralen Infektionen oder der Verabreichung von Antikrebsmitteln oder immunsuppressiven Mitteln sind, sowie von Krebspatienten ist.
Ferner ist bei einem Patienten mit Immunschwächekrankheiten die Antikörperbildung natürlich verringert, und verschiedene Infektionskrankheiten sind verursacht worden oder werden ohne weiteres aufgrund der verringerten hämatopoetischen Funktion verursacht. Die erfindungsgemäße immuntherapeutische Zusammensetzung, die humanen BCDF als Wirkstoff enthält, ist auch zur Behandlung und Prophylaxe dieser Infektionskrankheiten wirksam.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben die synergistische Wirkung von IL-2 oder IL-3 mit BCDF hinsichtlich der Antikörperbildung und insbesondere der Hämatopoese beschrieben. Die Cytokine, die eine synergistische Wirkung mit BCDF aufweisen, sind jedoch noch nicht auf IL-2 und IL-3 beschränkt. Dementsprechend nimmt man an, daß BCDF synergistisch mit weiteren Cytokinen, wie IL-1, IL-4, IL-5, BCGF, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, TNF, MAF und dergl. in vielen biologischen Funktionsassays wirkt. Zum Beispiel haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung Ergebnisse erhalten, die zeigen, daß IL-1 eine synergistische Wirkung mit BCDF bei der Differenzierung von Tumorzellen zeigt. Weitere Fälle sind nachstehend angegeben.
1) IL-4, IL-5 oder BCGF für die synergistische Verstärkung der Antikörperbildung.
2) IL-1 oder TNF für die synergistische Verstärkung der Differenzierung von Tumorzellen.
3) CSFs sowie IL-3 für die synergistische Verstärkung der Zellproliferation.
4) MAF sowie LNT (Lentinan) zur teilweisen Verstärkung der Abwehrmechanismen des Wirts.
Immuntherapeutische Zusammensetzungen, die BCDF oder ein oder mehrere Cytokine enthalten, eignen sich also auch für die Behandlung von Infektionen und dergl. durch Verstärkung der Abwehrmechanismen des Wirts.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie mit Bezug auf bestimmte spezielle Beispiele, die in die Anmeldung nur zum Zweck der Erläuterung aufgenommen wurden und die die Erfindung oder eine Ausführungsform davon nicht beschränken sollen, sofern nichts anderes angegeben ist, besser verstanden.

Beispiel 1

RPMI 1640-Medium (1 l) (Glutamin (2 millimolar), 2ME (5 · 10&supmin;&sup5; m), Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 ug/ml), Gentamycin (20 ug/ml), NaHCO&sub3; (16 millimolar)), das ferner 20% FCS enthielt, wurde in einen 2 l fassenden Kunststoff-Fermenter vom Rollertyp gegeben (Roller-Kulturflaschen) (Falcon Nr. 3027) (nachstehend als "Roller" bezeichnet). VT- 1-Zellen (2 · 10&sup5;/ml) wurden in das Medium im Roller überimpft und 3 Tage bei 37ºC und 8 U/min gezüchtet. Nach dem Züchten wurde das Kulturgemisch zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, die anschließend 2 mal mit RPMI 1640-Medium gewaschen wurden. Die auf diese Weise hergestellten VT-1-Zellen wurden bei einer Zellkonzentration von 1 · 10&sup6;/ml in RPMI 1640-Medium (1 l) in einem 2 l fassenden Roller suspendiert. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wurde 2 Tage bei 37ºC und 8 U/min gezüchtet. Nach dem Züchten wurde das Gemisch zentrifugiert,' um eine Überstandslösung zu erhalten.
Der vorstehend aus der Kultur von VT-1 hergestellte, BCDF enthaltende Überstand wurde in der nachstehend beschriebenen Weise behandelt, so daß BCDF in reiner Form isoliert wurde. So wurde der von den Zellen befreite Überstand (10 1) unter einem Druck von 4 kg/cm² unter einer Stickstoffatmosphäre durch eine Ultrafiltrationsvorrichtung (Amicon-Zelle Typ Nr. 2000 für die Behandlung im großen Maßstab (Massenbehandlung); Produkt von Amicon Corporation; Massachusetts, USA), die mit einer Ultrafiltrationsmembran (Amicon YM-10, Amicon Corporation, Produkt von Amicon Corporation; Massachusetts, USA) ausgestattet war, filtriert. Ein restliches Konzentrat (100 ml), das über der Ultrafiltrationsmembran zurückblieb, wurde erneut unter einem Druck von 4 kg/cm² in einer Stickstoffatmosphäre durch eine Ultrafiltrationsausrüstung (Amicon-Standardzelle Typ Nr. 52), die mit einer Ultrafiltrationsmembran Amicon YM-10 ausgestattet war, filtriert. Das restliche Konzentrat (5 ml) über der Ultrafiltrationsmembran wurde gesammelt.
Der eingeengte Überstand wurde einer Gelfiltration über eine Säule (LKB Producer, Schweden, 2,6 · 90 cm), die mit AcA-34-Gel, das zuvor mit PBS (0,01 m Phosphatpuffer (pH- Wert: 7,0) mit einem Gehalt an Natriumchlorid (0,15 m)) äquilibriert worden war, gefüllt war, unterworfen. Das AcA-34-Gel in der Säule wurde mit PBS eluiert, wobei das Eluat in Fraktionen von 5 ml fraktioniert wurde. Die BCDF-Aktivität dieser Fraktionen wurde untersucht. Es wurde festgestellt, daß die Fraktionen mit BCDF-Aktivität sich unter den Fraktionen befanden, die einem Molekulargewicht von 3,5 ± 0,5 · 10- Dalton entsprachen. Die Gelfiltrationssäule wurde durch Verwendung eines Molekulargewichtsmarkers (Produkt von Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) auf folgende Weise untersucht.
Fraktionen mit einem Gehalt an Blau-Dextran 200 (2 · 10&sup6;), Ferritin (4,5 · 10&sup5;), Aldolase (1,58 · 10&sup5;), Ovalbumin (4,5 · 10&sup4;), Chymotrypsinogen (2,5 · 10&sup4;) und Cytochrom C (1,17 · 10&sup4;) oder BCDF wurden gesammelt und vereinigt, und die Pufferlösung der vereinigten Fraktionen wurde in eine 25 millimolar Piperazin-HCl-Pufferlösung (pH-Wert: 6,3) auf einer Ultrafiltrationsausrüstung, die mit einer Ultrafiltrationsmembran (Amicon YM-10) ausgestattet war, umgewandelt. Die BCDF- Fraktionen, wie sie bei der AcA-34-Gel-Säulenchromatographie erhalten wurden, wurden durch eine Säule, die mit Mono P (Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) gefüllt und zuvor mit 25 millimolar Piperazin-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 6,3) äquilibriert worden war, geleitet. Die mit Mono P gefüllte Säule wurde mit 25 millimolar Piperazin-HCl-Pufferlösung gewaschen und anschließend mit 40 ml Poly-Puffer 74 (Pharmacia Fine Chemicals, Schweden), der 10-fach verdünnt und mit wäßriger HCl auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt worden war, eluiert. Die Elution wurde mit einer Durchflußgeschwindigkeit des Eluenten von 0,5 ml/min mittels "Fast Protein Liquid Chromatography" (FPLC) (Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) durchgeführt. Das Eluat wurde in Teile von 1 ml fraktioniert, für die die BCDF-Aktivität und der pH-Wert untersucht wurden.
Die BCDF-Aktivität wurde in den Fraktionen des Eluats mit einem pH-Wert von 4,9 bis 5,1 nachgewiesen. Die BCDF-aktive Fraktion, die bei der Chromatographie über die Säule mit Mono P erhalten wurde, wurde einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie auf einer Umkehrphasenchromatographiesäule Synchropak RPP (C18) (250 · 4,1 mm, Synchrom), die mit 0,1% wäßriger TFA (Trifluoressigsäure) gepuffert worden war, unterworfen. Die Säule wurde durch Gradientenelution mit einer ansteigenden Acetonitrilkonzentration von 0 bis 60% in 0,1% wäßriger TFA-Lösung (Elutionslösung) eluiert. Die Fraktion des Eluats, die bei einer Acetonitrilkonzentration von 50 bis 55% eluiert wurde, zeigte einen Absorptionspeak (OD 280), der deutlich von den anderen Absorptionspeaks (OD 280) getrennt war. Die BCDF-Aktivität wurde entsprechend und zusammenfallend mit dem Peak nachgewiesen. Diese Fraktion wurde anschließend lyophilisiert, um ein BCDF- Präparat zu erhalten.
Das BCDF-Präparat wurde einer Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamidgel (12%) unter reduzierenden Bedingungen unterworfen. Nach der Elektrophorese wurden die Gelfraktionen, die einem Molekulargewicht von 21 000 entsprachen, von anderen Gelfraktionen durch Ausschneiden getrennt. Die isolierten Fraktionen wurden mit SDS (0,05%) und NH&sub4;HCO&sub3; in einem Eppendorf-Röhrchen gemischt, und das Gemisch wurde bei 37ºC über Nacht gerührt, so daß BCDF extrahiert wurde. Der auf diese Weise erhaltene Extrakt wurde erneut einer HPLC über eine Umkehrphasenchromatographiesäule Synchropak RP-P (C18) (250 · 4,1 mm, Synchrom) unterworfen, die durch eine Gradientenelution mit einer ansteigenden Acetonitrilkonzentration von 0. bis 60% in einer wäßrigen 0,1%-igen TFA-Lösung eluiert wurde. Die Fraktion des Eluats, die bei einer Acetonitrilkonzentration von 50 bis 55% eluiert wurde, zeigte einen Absorptionspeak (OD 280), der deutlich von den anderen Peaks (OD 280) getrennt war. Es wurde festgestellt, daß dieser Peak der BCDF-Aktivität entsprach. Diese Fraktion wurde lyophilisiert, um ein gereinigtes BCDF-Präparat zu erhalten.
Zur Bestimmung der Aminosäuresequenz des BCDF-Proteins wurde der gereinigte BCDF (6 ug), der wie vorstehend erhalten worden war, in einen Proteinsequenzierer eingeführt (vgl. Applied Biosystem Co., Californien, Modell 470 A). Die Bestimmung der Aminosäuresequenz wurde gemäß dem in J. Biol. Chem., Bd. 193 (1951), S. 265-275, beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Aminosäuresequenz lautete ausgehend vom N- Terminus wie folgt
Pro Val Pro Pro Gly Glu
Asp Ser Lys Asp Val Ala
Ala

Beispiel 2

Eine gereinigte BCDF-Zubereitung (20 ug), die in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde in 5 millimolar Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert: 9,5) gelöst, und dazu wurde Lysylendopeptidase (Wako) gegeben (das molare Verhältnis von Lysylendopeptidase zum BCDF-Präparat betrug 1 : 200). Man ließ das Gemisch 6 Stunden bei 37ºC reagieren, so daß der BCDF in Fragmente zersetzt wurde. Die Reaktionslösung wurde einer HPLC über eine Umkehrphasensäule u-Bondo-Pack (0,21 · 30 cm) unterworfen, die durch eine Gradientenelution eluiert wurde, wobei die Acetonitrilkonzentration von 0 bis 60% in einer 0,06%-igen wäßrigen TFA-Lösung (Elutionsmittel) erhöht wurde, so daß die Fragmente getrennt voneinander eluiert wurden. Die Elutionspeaks mit den Nummern 1 bis 9 bei der HPLC wurden aufgefangen. Jedes der Eluate, das dem entsprechenden Peak von Nr. 1 bis Nr. 9 entsprach, wurde lyophilisiert, und das Lyophilisierungsprodukt wurde in den Proteinsequenzierer eingeführt (Applied Biosystem Co., Californien, Modell 4704). Die Aminosäuresequenzen wurden gemäß dem in J. Biol. Chem., Bd. 193 (1951), S. 265-275, beschriebenen Verfahren bestimmt.
Von den vorstehend genannten Fragmenten konnte die Aminosäuresequenz für die Fragmente Nr. 3, 8, 2 und 6 bestimmt werden. Die Aminosäuresequenzen lauteten wie folgt:

Fragment Nr. 3

Lys-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu

Fragment Nr. 8

Lys-Leu-X-Ala-Gln-Asn-Gln-Trp-Leu-Gln-Y-Met

Fragment Nr. 2

Pro-Val-Pro-Pro-Gly-Glu-X-Y-Lys

Fragment Nr. 6

Asp-Val-Ala-Ala-Pro-X Vorstehend bezeichnen X und Y Aminosäuren, die nicht bestimmt werden konnten. Die Fragmente Nr. 2 und 6 entsprechen der N-terminalen Aminosäuresequenz, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde.

Beispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Synthese eines Oligonucleotids, das die Aminosäuresequenz von BCDF kodiert, der in den Beispielen 1 und 2 erhalten wurde.
Das Oligonucleotid wurde durch eine Bindungsreaktion von Nucleotiden nach der Phosphorsäuretriester-Methode mit Siliciumdioxidgel als festem Träger unter Verwendung des DNA-Syntheseautomaten Modell 380 A (Applied Biosystem Co., Californien) synthetisiert. Nach Entfernung der Schutzgruppen auf herkömmliche Weise wurde das von den Schutzgruppen befreite Produkt einer HPLC auf einer Umkehrphasenchromatographiesäule Synchropak RP-P (C18) unterworfen, die durch Gradientenelution eluiert wurde, wobei die Acetonitrilkonzentration erhöht wurde, so daß die gewünschten Oligonucleotide in reiner Form erhalten wurden.

Fragment Nr. 3

Lys-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu
Sonde Nr.
(jedes von 64 Typen von Gemischen)

Fragment 8

Lys-Leu-X-Ala-Gln-Asn-Gln-Trp-Leu-Gln-Y-Met
Sonde Nr.
(jedes von 32 Typen von Gemischen) N-terminale Aminosäuresequenz
Sonde Nr.
(jedes von 32 Typen von Gemischen)
(jedes von 64 Typen von Gemischen)

Beispiel 4

(1) RPMI 1640-Medium (1 l) (Glutamin (2 millimolar), 2ME (5 · 10 5 m), Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 ug/ml), Gentamycin (20 ug/ml), NaHCO&sub3; (16 millimolar)), das ferner 20% FCS enthielt, wurde in einen 2 l fassenden Kunststoff-Fermenter vom Roller-Typ (Roller-Kulturflaschen) (Falcon Nr. 3027) (nachstehend einfach als Roller bezeichnet) gegeben. VT-1-Zellen (2 · 10 &sup5;/ml) wurden in das Medium im Roller überimpft und 3 Tage bei 37ºC bei 8 U/min gezüchtet.
Nach dem Züchten wurde das Kulturgemisch zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, die 2 mal mit PBS gewaschen wurden. Die Zellen (1,8 · 10&sup9;/ml) wurden anschließend in PBS-Lösung (800 ml) suspendiert und durch Zentrifugation gewaschen. Dieses Verfahren wurde 2 mal wiederholt, um die Zellen zu waschen. Die Zellen wurden in RSB-Lösung (Tris-HCl (pH-Wert: 7,5) (10 millimolar), NaCl (10 millimolar), MgCl&sub2; (1,5 millimolar)) (800 ml), die ferner einen Nucleaseinhibitor, nämlich einen Ribonucleosid-Vanadyl-Komplex (10 millimolar) enthielt, suspendiert. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wurde mit NP-40 (0,05%) gemischt und langsam gerührt. Das Gemisch wurde 5 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert, um die Zellbruchstücke, die die Kerne enthielten, niederzuschlagen und anschließend zu entfernen. Der erhaltene Überstand wurde mit SDS (Endkonzentration: 0,5%) und EDTA (Endkonzentration: 5 millimolar) gemischt. Es folgte eine Behandlung mit einem gleichen Volumen an Phenol, so daß cytoplasmatische RNA durch Extraktion gewonnen wurde. Die Extraktion mit Phenol wurde 3 mal wiederholt, und die auf diese Weise erhaltenen Extrakte wurden vereinigt und mit dem 2-fachen Volumen an Ethanol gemischt, um einen RNA-Niederschlag abzuscheiden, der durch Zentrifugation gewonnen und in Tris-HCl (10 millimolar; pH- Wert 7,5) gelöst wurde. Die RNA wurde aus den VT-1-Zellen in einer Ausbeute von 30 mg gewonnen.
mRNA wurde aus der RNA auf folgende Weise erhalten.
Die erhaltene RNA wurde einer chromatographischen Trennung über eine Säule, die mit Oligo-(dT)-Cellulose (P.L. Biochemicals, Typ 7) gefüllt war, unterworfen. Die RNA, die in einer Lösung mit einem Gehalt an Tris-HCl (20 millimolar; pH-Wert: 7,5)' NaCl (0,5 m), EDTA (1 millimolar) und SDS-Lösung (0,5 %) gelöst war, wurde durch die Säule geleitet, die wie vorstehend vorbereitet worden war, um eine Absorption zu erzielen, und die mit einer Pufferlösung (Tris-HCl (20 millimolar; pH-Wert: 7,5), NaCl (0,5 m), EDTA (1 millimolar)) gewaschen und anschließend alternierend mit Wasser und Tris-HCl (10 millimolar; pH-Wert: 7,5) eluiert wurde, so daß die mRNA eluiert wurde. Die Ausbeute der auf diese Weise eluierten mRNA betrug 576 ug.
(2) Aus der in der vorstehenden Stufe (1) hergestellten mRNA (5 ug) wurde doppelsträngige cDNA wie folgt hergestellt: Doppelsträngige cDNA wurde gemäß der Amersham-Anleitung unter Verwendung eines cDNA-Synthese-Reagenssatzes (Amersham) gemäß dem von U. Gubler und B. J. Hoffman, Gene, Bd. 25 (1983), S. 263, beschriebenen Verfahren hergestellt. Es wurde also reverse Transcriptase mit mRNA umgesetzt, um einzelstängige cDNA zu synthetisieren. Man ließ Ribonuclease H aus Escherichia coli auf das Hybrid aus mRNA und cDNA als Substrat einwirken, um Nicks und Zwischenräume im RNA-Strang zu erzeugen. Die mRNA wurde durch DNA durch eine Reaktion vom Nick-Translationstyp unter Verwendung von DNA-Polymerase I aus Escherichia coli ersetzt, so daß doppelsträngige DNA erhalten wurde. Die doppelsträngige DNA wurde durch Entfernen der kurzen überhängenden Sequenz am 3'-Terminus unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase modifiziert.
Man erhielt die doppelsträngige cDNA schließlich in einer Ausbeute von 1,08 ug.
(3) Die auf diese Weise erhaltene doppelsträngige cDNA (1, 08 ug) wurde durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation (Dichtegradient mit 5 bis 25% Saccharose in einer Lösung (pH-Wert: 7,5) mit einem Gehalt an Tris-HCl (50 millimolar) und EDTA (1 millimolar)) bei 40 000 U/min für 13 Stunden bei 4ºC fraktioniert. Einige der auf diese Weise fraktionierten Fraktionen wurden durch Autoradiogramme, die durch Agarosegel-Elektrophorese erhalten wurden, analysiert. Die Fraktionen, die doppelsträngiger cDNA mit einer Größe von mehr als 500 bp entsprachen, wurden vereinigt und mit Ethanol gemischt, um die doppelsträngige cDNA (etwa 0,6 ug) als Niederschlag zu gewinnen.
(4) Ein Gemisch von 0,1 m Kaliumkakodylat (auf einen pH- Wert von 7,2 mit Tris-Base eingestellt), DTT (10 millimolar), CoCl&sub2; (2 millimolar), ³²P-dCTP'(0,5 millimolar) (spezifische Aktivität: 1 · 106 cpm/nMol), doppelsträngiger cDNA (0,6 ug) und terminaler Desoxynucleotidyltransferase (BRL) wurde 20 Minuten bei 24ºC inkubiert und anschließend mit Phenol behandelt. Das Gemisch wurde über eine Säule, die mit Sephadex G- 50 gefüllt war, geleitet, und Fraktionen der cDNA wurden gesammelt. Die auf diese Weise gesammelten Fraktionen der cDNA wurden vereinigt und mit Ethanol gemischt, um die mit einem dC-Schwanz versehene cDNA (0,24 ug) abzuscheiden. Im cDNA-Molekül waren etwa 13 dCMP-Reste an die 3'-terminalen Sequenzen an beiden Seiten addiert.
(5) Ein cDNA-Expressionsvektor pQ, der in Affenzellen (COS-Zellen) seine Funktion erfüllt, kann aus pCEIL-2 (vgl. Nature, Bd. 302 (1983), S. 305) konstruiert werden, wie es in Fig. 1 gezeigt ist. Der pQ-Vektor kann cDNA auf beiden Seiten der Promotoren aufnehmen, um ein Peptid in den COS-Zellen zu exprimieren, das durch die cDNA kodiert wird. Der pQ-Vektor kann auch in Zellen von Escherichia coli repliziert werden, und er kann durch Zellen, die gegen Tetracyclin resistent sind, selektiert werden.
Der pQ-Vektor wurde mit PstI geschnitten, und daran wurden Schwänze (die aus etwa 13 dG bestanden) in der gleichen Weise addiert, wie die dC-Schwänze an den 3'-Terminus auf beiden Seiten der ds-cDNA addiert wurden.
Der mit einem dG-Schwanz versehene Vektor pQ (100 ng) wurde mit der mit dC-Schwänzen versehenen ds-cDNA (20 ng) in einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an Tris-HCl (50 millimolar; pH-Wert: 7,5), NaCl (0,1 m), EDTA (1 millimolar) gemischt, und das Gemisch wurde nacheinander 2 Minuten bei 65ºC, 60 Minuten bei 45ºC, 60 Minuten bei 37ºC und schließlich 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die auf diese Weise erhaltenen annealten DNA-Produkte wurden in kompetente Zellen von E. coli MC 1061 eingeführt. Die Herstellung der kompetenten Zellen von E. coli MC 1061 und die Einführung der annealten DNA in die vorbereiteten Zellen wurde auf folgende Weise durchgeführt.
Zellen von E. coli MC 1061 wurden in Psi-Medium (100 ml) (2% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% MgSO&sub4;·7H&sub2;O, pH-Wert: 7,6) überimpft und bei 37ºC unter Rühren gezüchtet, bis die Extinktion der Kulturlösung (optische Dichte) bei 550 nm einen Wert von etwa 0,3 bis 0,5 annahm. Nach dem Abschluß des Züchtens ließ man die Kulturlösung 5 Minuten bei 0ºC stehen, und anschließend erfolgte eine Zentrifugation, um die Zellen zu ernten, die dann in TfbI (40 ml) (Kaliumacetat (30 millimolar), RbCl (100 millimolar), CaCl&sub2; (10 millimolar), MnCl&sub2; (50 millimolar), Glycerin (15%), pH-Wert: 5,8) suspendiert wurden. Die Suspension wurde 5 Minuten bei 0ºC belassen.
Die Suspension wurde erneut zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, die dann in TfbII (40 ml) (10 millimolar MOPS oder PIPES, CaCl&sub2; (75 millimolar), RbCl (10 millimolar), Glycerin (10%), pH-Wert: 6,5) suspendiert und anschließend 15 Minuten bei 0ºC belassen wurden. Die auf diese Weise behandelte Suspension wurde in Portionen aufgeteilt, die bei -70ºC gehalten wurden.
Kompetente Zellen von E. coli MC 1061 (100 ul), die, wie vorstehend beschrieben, vorbereitet worden waren, wurden 15 Minuten bei 0ºC belassen. Das annealte Produkt (10 ul) aus dem mit einem dG-Schwanz versehenen pQ-Vektor und der mit einem dC-Schwanz versehenen cDNA sowie eine wäßrige Lösung (90 ul) mit einem Gehalt an MgCl&sub2; (10 millimolar) und CaCl&sub2; (10 millimolar) wurden zugegeben, und das erhaltene Gemisch wurde 20 Minuten bei 0ºC belassen. Das Lösungsgemisch wurde 60 Minuten auf 37ºC erwärmt und anschließend l bis 2 Minuten bei 0ºC gehalten. Dazu wurde Psi-Medium (1 ml) gegeben. Das Lösungsgemisch wurde 60 Minuten unter Rühren bei 37ºC kultiviert.
Die auf diese Weise erhaltene Kulturlösung wurde auf eine Agarplatte mit LB-Kulturlösung (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 0,1% Glucose), die ferner Tetracyclin (15 ug/ml) und Streptomycin (25 ug/ml) enthielt, ausgestrichen und bei 37ºC über Nacht inkubiert, um Kolonien darauf zu bilden.
(6) Die klonierten Transformantenstämme (etwa 150 000 Stämme) wurden einer Koloniehybridisierung unter Verwendung der Sonden 8-1 und 8-2 gemäß dem in "M. Grunstein et al., Methods in Enzymology, Bd. 68 (1979), S. 379" beschriebenen Verfahren unterworfen. Als Ergebnis wurden 10 Kolonien nachgewiesen, die mit der Sonde 8-1 hybridisierten. Die auf diese Weise erhaltenen Kolonien wurden einer erneuten Koloniehybridisierung unter Verwendung der Sonden aus 3-1 bis 3-6 in der vorstehend beschriebenen Weise unterworfen, wobei eine Kolonie erhalten wurde, die mit der Sonde 3-2 hybridisierte.
Plasmid-DNA, die der klonierte Stamm enthielt, wurde isoliert und auf herkömmliche Weise gereinigt. Die Plasmid-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym PstI geschnitten, und das Produkt wurde einer Agarose-Elektrophorese unterworfen; auf diese Weise wurde das cDNA-Insert vom pQ-Vektor getrennt.
Die Plasmid-DNA wurde einer Southern-Hybridisierung unter Verwendung der Sonden 8-1, 8-2, 3-1 bis 3-6 und N-1 bis N-7 unterworfen. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA mit 8-1, 3-2, N-2 und N-5 hybridisierte, daß sie jedoch nicht mit den anderen Sonden hybridisierte. Diese Plasmid-DNA wurde als pBSF 2-38 bezeichnet. Es ist auch offensichtlich, daß das cDNA-Insert, das die Plasmid-DNA (pBSF 2- 38) darin enthält, Nucleotidsequenzen aufweist, die einigen der in Beispiel 2 nachgewiesenen Aminosäure-Teilsequenzen entsprechen. Die cDNA wurde auf diese Weise als ein Gen identifiziert, das für BCDF kodiert.

Beispiel 5

Herstellung von Plasmid-DNA (pBSF 2-38) im großen Maßstab Zellen des E. coli-Stamms MC 1061 (FERM BP-1402), die das Plasmid pBSF 2-38 enthielten, wurden in Psi-Medium mit einem Gehalt an Tetracyclin (20 ug/ml) und Streptomycin (25 ug/ml) überimpft und unter Schütteln 5 bis 7 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Zur Kulturlösung wurde dann frisch hergestelltes Psi-Medium (100 ml) mit einem Gehalt an Chloramphenicol in einer Endkonzentration von 170 ug/ml gegeben, und das Züchten wurde über Nacht unter Schütteln fortgesetzt.
Die auf diese Weise amplifizierte Plasmid-DNA wurde wie folgt gereinigt. Die wie vorstehend erhaltene Kulturlösung wurde zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, die dann in einer Pufferlösung (5 ml) (50 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 7,5) suspendiert wurden. Die Suspension wurde bei -80ºC eingefroren und dann aufgetaut. Nach dem Auftauen wurde Lysozym zu der Suspension in einer Endkonzentration von 1 mg/l gegeben, und das Gemisch wurde 10 Minuten bei 0ºC belassen. Zu dem Gemisch wurde ferner EDTA in einer Endkonzentration von 0,1 m gegeben, und das Gemisch wurde 10 Minuten bei 0ºC belassen. Dem Gemisch wurde ferner EDTA in einer Endkonzentration von 0,1 M zugesetzt, und das Gemisch wurde 10 Minuten bei 0ºC belassen. Das Gemisch wurde dann mit Triton X-100 in einer Endkonzentration von 0,1% gemischt und 60 Minuten bei 0ºC belassen. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 30 000 U/min zentrifugiert, um eine Überstandslösung zu erhalten. Der Überstand wurde mit einem gleichen Volumen an Phenol, das mit Wasser gesättigt war, gemischt, und die abgetrennte wäßrige Schicht wurde mit einem gleichen Volumen an Chloroform gemischt. Zu der abgetrennten wäßrigen Schicht wurde eine RNase-Lösung mit einer Endkonzentration von 20 ug/ml gegeben, und das Lösungsgemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die inkubierte Lösung wurde mit 0,2 Volumina 5 m NaCl und 1/3 Volumen Polyethylenglykol gemischt, und das Lösungsgemisch wurde dann 60 Minuten bei 0ºC belassen. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation bei 10 000 U/min für 20 Minuten, um die DNA als Niederschlag zu gewinnen.
Der gewonnene Niederschlag wurde in Wasser (3,8 ml) gelöst, und dazu wurde CsCl (4 g) gegeben. Die erhaltene Lösung wurde mit 200 ul 10 mg/ml EtBr gemischt. Das Gemisch wurde bei 40 000 U/min für 16 Stunden bei 20ºC ultrazentrifugiert.
Die gewonnene Plasmid-DNA-Fraktion wurde nach der Ultrazentrifugation 4 mal mit 1 bis 2 Volumina n-Butanol, das mit Wasser gesättigt war, extrahiert, um das EtBr daraus zu entfernen. Die Lösung der Plasmid-DNA wurde gegen H&sub2;O dialysiert, um das CsCl zu entfernen, und die Lösung wurde mit 1/10 Volumen 3 m wäßriger Lösung von Natriumacetat (pH-Wert: 5,6) und dann mit 2 Volumina kaltem Ethanol gemischt. Das Gemisch wurde bei -20ºC über Nacht belassen, wobei sich ein Niederschlag abschied. Das Gemisch wurde zentrifugiert, um den Niederschlag zu gewinnen, der mit 80%-iger wäßriger Ethanollösung gewaschen und gründlich getrocknet wurde. Der auf diese Weise erhaltene Feststoff wurde in einer Pufferlösung (10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 7,5) (50 ul) gelöst.
(2) Transfektion des Plasmids in COS-7-Zellen von Affen COS-7-Zellen (1 · 10&sup5;/ml) wurden in RPMI mit einem Gehalt an FBS (fötales Rinderserum) (10%) suspendiert. Eine Portion von 3 ml der Suspension wurde in eine Schale (mit einem Durchmesser von 6 cm) gegeben und über Nacht bei 37ºC in einem Inkubator mit CO&sub2;-Gas (5%) kultiviert. Am nächsten Morgen wurde der Kulturüberstand entfernt, und frisch hergestelltes RPMI (3 ml) mit einem Gehalt an FBS (10%) wurde zu dem Rückstand gegeben. Anschließend wurde die Kultur 2 Stunden bei 37ºC in einem Inkubator mit CO&sub2;-Gas (5%) fortgesetzt. Nach dem Kultivieren wurde der Überstand entfernt, und die Zellen wurden einmal mit 2,5 ml TBS (Tris-HCl (25 millimolar), pH-Wert: 7,5, NaCl (130 millimolar), KCl (5 millimolar), Na&sub2;HPO&sub4; (0,6 millimolar)) gewaschen. Die anhaftenden COS-7-Zellen wurden mit einem Gemisch des Plasmids [TBS (+), nämlich TBS gemischt mit 0,7 millimolar CaCl&sub2; und 0,5 millimolar MgCl&sub2; (10 ml); Plasmid-DNA (2 gamma), DEAE-Dextran (10 mg/ml) (50 ul)] gemischt, und das Gemisch wurde 4 Stunden bei 37ºC in einem Inkubator mit CO&sub2;-Gas (5%) kultiviert. Nach der Entfernung des Überstands wurde die Kultur mit TBS (2,5 ml) gewaschen, und es wurde RPMI (2,5 ml) mit einem Gehalt an FBS (10%) und Chloroquin (150 mikromolar) zugegeben. Das Gemisch wurde 5 Stunden bei 37ºC in einem Inkubator mit CO&sub2;-Gas (5%) kultiviert. Nach Entfernen des beim Kultivieren auftretenden Überstands wurde die Kultur mit TBS (2,5 ml) gewaschen, und RPMI (2,5 ml) mit einem Gehalt an FBS (10%) und ferner Chloroquin (150 mikromolar) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 5 Stunden bei 37ºC in einem Inkubator mit CO&sub2;-Gas (5%) kultiviert. Nach der Entfernung des Überstands wurde die Kultur 2 mal mit jeweils 2,5 ml TBS gewaschen. Die Kultur wurde erneut mit RPMI (3 ml) mit einem Gehalt an FBS (10%) gemischt und über Nacht bei 37ºC in einem Inkubator mit CO&sub2;- Gas (5%) kultiviert. Nach Entfernung des Überstands wurde die Kultur erneut mit RPMI (3 ml) mit einem Gehalt an FBS (10 %) gemischt und 2 Tage bei 37ºC in einem Inkubator mit CO&sub2;- Gas (5%) kultiviert. Das Kulturgemisch wurde zentrifugiert, um den Überstand zu gewinnen, der als Probe für einen Assay auf die BCDF-Aktivität verwendet wurde.
Der Überstand der COS-Kultur wurde auf die BCDF-Aktivität unter Verwendung von CL4 untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Fig. 2 und 3 gezeigt.
Wie aus den Daten ersichtlich ist, zeigen COS-7-Zellen, in die Plasmid-DNA von pBSF 2-38 transfiziert worden war, eine höhere BCDF-Aktivität als die Kontrolle. Fig. 2 zeigt die Aktivität auf der Basis von IgM, das durch ELISA des Überstands von Affenzellen (COS-7) untersucht wurde, die mit cDNA von pBSF 2-38 transfiziert worden war. Fig. 2 zeigt die Aktivität von gereinigtem BCDF (1 Einheit/ml), der aus VT-1, 657-7, 8, 9 im Überstand der Kulturzellen (COS-7), in die BCDF-cDNA eingeführt worden war, erhalten wurde, und 657-1 ist der Überstand von Kulturzellen (COS-7), in die Lymphokin-cDNA eingeführt worden war.
Fig. 3 zeigt die BCDF-Aktivität des Überstands von Affenkulturzellen (COS-7), in die cDNA von pBSF 2-38 eingeführt worden war, wie sie durch eine reverse Plaque-Methode bestimmt wurde. In Fig. 3 ist o die BCDF-Aktivität des Überstands von Affenkulturzellen (COS-7), die ohne Additive kultiviert wurden. 657-1, 657-7, 8, 9 entsprechen der Definition in Fig. 2. BCDF mit einer Potenz von 50 Einheiten/ml wird als Standard verwendet.
Rekombinanter humaner BCDF, der in Eukaryontenzellen (COS- 7) hergestellt wurde, wie es vorstehend beschrieben wurde, wurde gereinigt, indem die Kulturlösung über eine Säule mit einem immobilisierten Antikörper gegen BCDF geleitet wurde und indem das Eluat einer Umkehrphasen-HPLC (Synchropak (C18)) unterworfen wurde. Es wurde festgestellt, daß der BCDF einen Saccharidanteil enthielt, der möglicherweise dem Vorhandensein einer N-Glycosylierungsstelle der Aminosäuresequenz, die durch die, cDNA kodiert wird, zuzuschreiben ist.
Der nun erhaltene BCDF stimmt hinsichtlich seiner physikochemischen Eigenschaften mit dem gereinigten BCDF, der aus dem Überstand der VT-l-Kultur nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten wurde, überein, wie nachstehend gezeigt wird:
(i) Molekulargewicht:
3,5 ± 0,5 · 10&sup4; Dalton (Untersuchung durch Gelfiltration)
2,2 ± 0,2 · 10&sup4; Dalton (Untersuchung durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese)
(ii) Isoelektrischer Punkt: pH 4,9-5,1

Beispiel 6

Das in Beispiel 5 hergestellte pBSF 2-38 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI geschnitten, wodurch das BCDF-cDNA-Insert erhalten wurde. Das auf diese Weise erhaltene BCDF-cDNA- Insert wurde als Sonde für die Untersuchung von BCDF-mRNA verwendet. Die verwendete mRNA wurde aus verschiedenen Zellen, wie VT-1-Zellen, die zur Bildung des fraglichen BCDF imstande waren; CESS, RPMI 1788, von denen angenommen wird, daß sie BCDF bilden; mit TPA stimulierte Mandelzellen; CL4, Jurkat und CEM, bei denen keine BCDF-Aktivität nachgewiesen wird; und menschliche Mandelzellen, die nicht stimuliert wurden, und zwar in der gleichen Weise wie in Beispiel 4, Stufe (1), hergestellt.
Ein Gemisch aus jeder mRNA (10 ug/3,6 ul), 5 · MOPS-Pufferlösung (0,1 m MOPS (pH-Wert: 7,0), 75 millimolar NaOAc, 5 millimolar EDTA) (6,0 ul), Formaldehyd (5,4 ul) und Formamid (15,0 ul) wurde 15 Minuten bei 60ºC inkubiert. Zu diesem Gemisch wurden 3 ul einer farbgebenden Lösung (80% wäßriges Glycerin mit einem Gehalt an 0,5% Bromphenol-Blau und 0,05% Xylolcyanol) gegeben. Das Gemisch wurde als die zu untersuchende Probe verwendet. Die auf diese Weise vorbereitete Probe wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel (1,6%) mit einem Gehalt an 1,8% Formaldehyd unter Verwendung von 1 · MOPS-Pufferlösung unterworfen. Die Übertragung auf Nitrocellulosefilter wurde auf herkömmliche Weise durchgeführt. Der Filter wurde 3 Stunden bei 80ºC wärmebehandelt. Der auf diese Weise vorbereitete Filter wurde in 3 · SSC mit einem Gehalt an 0,1% SDS eingetaucht und in 50 millimolar Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 6,5) mit einem Gehalt an 1 · Denhardt-Lösung, 50% Formaldehyd, 5 · SSC und 250 ug/ml Hering- DNA bei 42ºC über Nacht vorhybridisiert.
Die Hybridisierung wurde in 50 millimolar Natriumphosphatpuffer (pH-Wert: 6,5) mit einem Gehalt an 1 · Denhardt-Lösung, Formamid (50%), 5 · SSC und Hering-DNA (250 ug/ml) unter Verwendung eines mit ³²P-markierten pBSF 2-38-BamHI-cDNA- Inserts als Sonde bei 42ºC über Nacht durchgeführt.
Der auf diese Weise hybridisierte Filter wurde 4 mal für 5 Minuten bei 2 · SSC mit einem Gehalt an 0,2% SDS bei Raumtemperatur und 2 mal für 30 Minuten mit 0,1 · SSC mit einem Gehalt an 0,2% SDS bei 50ºC gewaschen. Der Filter wurde an der Luft getrocknet und anschließend einer Autoradiographie unterworfen. Auf diese Weise wurden Autoradiogramme erhalten. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß aus VT-1, CESS (BCDF- bildender Stamm), RPMI 1788 stammende mRNA an die pBSF 2-38- cDNA-Sonde hybridisierte, daß jedoch aus CL-4, Jurkat, CEM und CESS, die zur Bildung von BCDF nicht imstande sind, stammende mRNA nicht an die pBSF 2-38-cDNA-Sonde hybridisierte.
Die Größe von mRNA, die zur Hybridisierung mit der pBSF-2- 38-cDNA-Sonde imstande war, wurde zu 15 bis 16 S berechnet.
Fig. 4 zeigt einen Teil davon.
Fig. 4 ist also ein Autoradiogramm, das durch eine Northern-Blot-Technik erhalten wurde, wobei (a) mRNA von VT-1- Zellen ist, (b) mRNA von T-Lymphozyten ist, die durch Aktivierung menschlicher Mandelzellen (5 · 10&sup6;/ml) mit 0,1% PHA, 5 ng TPA für 40 Stunden hergestellt wurden, und (c) mRNA von menschlichen Mandelzellen ist, die keiner Behandlung zur Stimulierung unterzogen wurden.

Beispiel 7

MC1061, die pBSF 2-38 enthielten, wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 5, Stufe (1) behandelt, um Plasmid-DNA zu erhalten, die anschließend mit dem Restriktionsenzym BamHI geschnitten wurde. Auf diese Weise wurde BCDF-cDNA hergestellt. Die Restriktionsenzymkarte und die Nucleotidsequenz der BCDF-cDNA wurden untersucht. Die Nucleotidsequenz wurde nach dem chemischen Verfahren von Maxam-Gilbert (vgl. Meth. Enzym., Bd. 65 (1980), S. 499) und nach der Didesoxynucleotid-Kettenabbruch-Methode (vgl. F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5463) unter Verwendung des Phagen M13 (vgl. J. Messing et al., Gene, Bd. 19 (1982), S. 269) bestimmt. Die auf diese Weise bestimmte Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz sind in Fig. 5 gezeigt. Die Restriktionsenzymkarte ist in Fig. 6 gezeigt.
Die nun bestimmte Nucleotidsequenz von humanem BCDF enthält die gleiche Teilstruktur der Aminosäuresequenz, wie sie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben ist.

Beispiel 8

(1) Der Vektor, der für die Expression von humanen BCDF- Genen verwendet werden soll, wurde wie folgt konstruiert (vgl. Fig. 7):
Die DNA-Fragmente (a) bis (l), die die in Fig. 8 gezeigte Nucleotidsequenz enthielten, wurden nach der Festphasen-Phosphorsäuretriester-Methode synthetisiert. Die DNA-Fragmente mit Ausnahme von (a) und (g) wurden mit T4-Polynucleotidkinase und ATP behandelt, um den 5'-Terminus zu phosphorylieren.
Die DNA-Fragmente (a) bis (l) wurden vereinigt und annealt, und anschließend erfolgte eine Behandlung mit T4- DNA-Ligase, so daß doppelsträngige synthetische DNA (A) gebildet wurde. pT 9-11 (T. Sato et al., J. Biochem., Bd. 101 (1987), S. 525) wurde mit den Restriktionsenzymen HpaI und XbaI geschnitten, und die Produkte wurden einer Agarosegel- Elektrophorese unterworfen, so daß ein großes DNA-Fragment isoliert wurde. Das auf diese Weise erhaltene pT 9-11-Fragment wurde mit synthetischer DNA (A) (vgl. Fig. 8) gemischt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Die auf diese Weise erhaltene rekombinante DNA wurde in Zellen des Escherichia coli-Stamms HB101 eingeführt. Ein Ampicillin-resistenter Stamm wurde selektiert. Das aus dem selektierten Stamm erhaltene Plasmid wurde mit Restriktionsenzymen geschnitten, und die Restriktionsenzymkarte wurde untersucht. Als Ergebnis wurde ein Stamm selektiert, der das Plasmid pT 13 (Nco), das die synthetische HIL-2cDNA enthielt, einverleibt darin aufwies.
(2) Rekombinante DNA, die zur Expression von humanem BCDF imstande war, wurde unter Verwendung der Plasmide pT13S(Nco) und pBSF 2-38 konstruiert (vgl. Fig. 9 und 10):
(i) Das Plasmid pT13S(Nco) wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und XbaI geschnitten, und die Produkte wurden einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, so daß größere DNA- Fragmente in reiner Form isoliert wurden. Das Plasmid pBSF 2- 38 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI geschnitten, und das Produkt wurde einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen. Kleinere DNA-Fragmente, die das humane BCDF-cDNA-Insert enthielten, wurden gewonnen. Das humane BCDF-cDNA-Insert, das durch Schneiden unter Verwendung des Restriktionsenzyms BamHI wie vorstehend erhalten worden war, wurde anschließend vollständig durch Verdau mit dem Restriktionsenzym XbaI geschnitten, und anschließend erfolgte ein teilweises Schneiden mit dem Restriktionsenzym MvaI.
Sodann wurde ein DNA-Gemisch, das aus dem pT13S(Nco)-Fragment, das den Tryptophan-Promotor und -Operator (trp p/o) enthielt, und dem MvaI-XbaI-Fragment der humanen BCDF-cDNA bestand, mit einer synthetischen DNA (B) [5'CATGCCAGTACCACC3' und am 5'-Terminus phosphoryliertem 5'TGGTGGTACTGG3'] kombiniert. Das erhaltene Gemisch wurde unter Verwendung von T4- DNA-Ligase ligiert. Die auf diese Weise erhaltene rekombinante DNA wurde in Zellen von Escherichia coli HB101 eingeführt, und es wurden gegen Ampicillin resistente Stämme selektiert. Die auf diese Weise selektierten Stämme wurden durch Koloniehybridisierung abgesucht, um diejenigen Stämme zu selektieren, die DNA aufweisen, die mit der synthetischen DNA (B) hybridisiert. Plasmid-DNA wurde aus den auf diese Weise schließlich selektierten Stämmen isoliert. Die Plasmid DNA wurde einem Schneidetest mit Restriktionsenzymen unterworfen und auf die Nucleotidsequenz an der Bindungsstelle untersucht. Als Ergebnis wurde der Stamm, der pTBCDF-01 enthielt, selektiert. Dieser Stamm wurde als pTBCDF-01/HB101 bezeichnet.
(ii) Das Plasmid pBSF 2-38 wurde mit dem Restriktionsenzym BanI geschnitten, einer Behandlung mit DNA-Polymerase I (Klenow) unterworfen, mit dem Restriktionsenzym XbaI geschnitten und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, so daß DNA Fragmente mit etwa 150 Basenpaaren isoliert wurden.
(iii) Das vorstehend in (i) erhaltene pTBCDF-01 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI geschnitten, einer Behandlung mit DNA-Polymerase I (Klenow) unterworfen, mit dem Restriktionsenzym XbaI geschnitten und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, so daß größere DNA-Fragmente gewonnen wurden.
(iv) Die beiden in (ii) bzw. (iii) erhaltenen DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Die erhaltene rekombinante DNA wurde in Zellen von Escherichia coli HB101 eingeführt, die auf Stämme mit einer Resistenz gegen Ampicillin abgesucht wurden. Aus den auf diese Weise selektierten Stämmen wurde Plasmid-DNA isoliert, die mit Restriktionsenzymen verdaut wurde, um den Stamm zu erhalten, der pTBCDF-2 enthielt. Dieser Stamm wurde als pTBCDF-02/HB101 (FERM P-9061, FERM BP-1403) bezeichnet.
(v) Der Escherichia coli-Stamm HB101, der das Plasmid pTBCDF-01 oder pTBCDF-02 enthielt, wurde in L-Brühe (1% Bactotrypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 0,1% Glucose, pH- Wert: 7,5) (10 ml), die ferner Streptomycin (25 ug/ml) und Ampicillin (25 ug/ml) enthielt, bei 37ºC über Nacht kultiviert. Ein Anteil von 5 ml der Kultursuspension wurde in M9- Casaminsäure-Medium (0,6% Na&sub2;HPO&sub4;·12H&sub2;O, 0,3% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% NaCl, 0,1% NH&sub4;Cl, 0,05% MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,00147% CaCl&sub2;, 0,2% Glucose, 0,2% Casaminsäure, 0,02% L-Leucin, 0,02% L-Prolin, 0,0002% Thiaminhydrochlorid, 100 ug/ml Ampicillin, 25 ug/ml Streptomycin, pH-Wert: 7,4) überimpft und 3 Stunden bei 28ºC kultiviert. Anschließend wurde zu dem Kulturgemisch 3-Indolacetat (IAA) (25 ug/ml) gegeben, und das Kulturgemisch wurde weiter 21 Stunden bei 23ºC kultiviert. Das Kulturgemisch wurde zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, die mit 20 millimolar Tris-HCl-Puffer (pH-Wert: 7,5) und NaCl (30 millimolar) gewaschen und anschließend in einem Puffer der gleichen Zusammensetzung (8 ml) suspendiert wurden. Die auf diese Weise erhaltenen Zellen wurden mit Natriumdodecylsulfat (SDS) (1%) oder Lysozym (1 mg/ml) in Gegenwart von EDTA (50 millimolar) verdaut und anschließend beschallt (50 W, 30 Sekunden), so daß die Proteine aus den Zellen isoliert wurden.
Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, zeigten sowohl die isolierte Lösung, die aus der Kultur des als pTBCDF-01/HB101 bezeichneten Stamms hergestellt wurde, der einen teilweisen Defekt an der Stelle des 3'-Terminus aufweist, wobei mit der Stelle dieses Defekts ein Teil der humanen IL-2-cDNA verknüpft ist, als auch die Lösung, die aus der Kultur des als pTBCDF- 02/HB101 bezeichneten Stamms hergestellt wurde, der die BCDF- cDNA enthält, die für das ganze humane reife BCDF-Protein kodiert, BCDF-Aktivität, wie es nachstehend angegeben ist:

Tabelle 1:

BCDF-Aktivität (bestimmt nach der reversen Plaque-Methode) des Extrakts, der aus der Kultur des rekombinante DNA enthaltenden Stamms hergestellt wurde

Rekombinante DNA (Stamm) BCDF-Aktivität (Einheiten/ml)
pTBCDF-01/HB101 800
pTBCDF-02/HB101 28 000
Der rekombinante BCDF wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gereinigt und anschließend einer HPLC unter Verwendung von Synchropak RP-P (C18) unterworfen. Ein einziges Protein wurde bei einer Acetonitrilkonzentration von 50 bis 55% eluiert. Die Aminosäuresequenz des auf diese Weise isolierten Proteins wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 untersucht, wobei die Struktur der N-terminalen Sequenz bestätigt wurde.
Das von pTBCDF-02/HB101 gebildete Polypeptid weist also die folgende Aminosäuresequenz auf:
PRO VAL PRO PRO GLY GLU ASP SER LYS ASP VAL
ALA ALA PRO HIS ARG GLN PRO LEU THR SER SER
GLU ARG ILE ASP LYS GLN ILE ARG TYR ILE LEU
ASP GLY ILE SER ALA LEU ARG LYS GLU THR CYS
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ALA LEU ALA GLU ASN ASN LEU ASN LEU PRO LYS
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ASN GLN TRP LEU GLN ASP MET THR THR HIS LEU,
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Beispiel 9

Konstruktion einer rekombinanten DNA, die zur Bildung eines Fusionsproteins (Delta HIL-2-BCDF) von humanem BCDF mit humanem Interleukin-2 (HIL-2) imstande ist, unter Verwendung der Plasmide pT13S(Nco) (wie es in Beispiel 8 beschrieben wurde) und pBSF 2-38 (vgl. Fig. 11 und 12):
(i) Das Plasmid pT13S(Nco) wurde mit den Restriktionsenzymen BglII und XbaI geschnitten, und das Produkt wurde einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, so daß ein größeres DNA-Fragment isoliert wurde. Das Plasmid pBSF 2-38 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI geschnitten, und das Produkt wurde einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, so daß ein kleineres DNA-Fragment, das das humane BCDF-cDNA-Insert enthielt, isoliert wurde. Das auf diese Weise aus dem mit BamHI geschnittenen Plasmid erhaltene humane BCDF-cDNA-Insert wurde ferner mit dem Restriktionsenzym XbaI behandelt. Anschließend wurde es partiell mit MvaI geschnitten. Ein DNA- Gemisch, das aus dem pT13S(Nco)-Fragment, das den vorstehend erwähnten Promotor enthielt, und dem MvaI-XbaI-Fragment, das die humane BCDF-cDNA enthielt, bestand, wurde mit einer synthetischen DNA (C) [5'GATCTCTTCAGAGCCCCAGTACCCCC3') kombiniert. Das Gemisch wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert.
Die auf diese Weise erhaltene rekombinante DNA wurden in Zellen von Escherichia coli HB101 eingeführt, so daß gegen Ampicillin resistente Stämme selektiert wurden. Die Stämme wurden durch Koloniehybridisierung abgesucht, um einen Stamm mit DNA, die zur Hybridisierung mit der synthetischen DNA (C) imstande war, zu selektieren. Das aus den wie vorstehend selektierten Stämmen erhaltene Plasmid wurde mit einem Restriktionsenzym geschnitten. Auf dem Plasmid wurde die Nucleotidsequenz der Verknüpfungsstellen untersucht. Auf diese Weise wurde ein pTBCDF-11 enthaltender Stamm erhalten, der als pTBCDF-11/HB101 bezeichnet wurde.
(ii) Das Plasmid pBSF 2-38 wurde mit dem Restriktionsenzym BanI geschnitten, und das Spaltprodukt wurde einer Behandlung mit DNA-Polymerase I (Klenow) unterworfen, mit XbaI geschnitten und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, so daß ein DNA-Fragment von etwa 150 Basenpaaren isoliert wurde.
(iii) Das vorstehend unter (i) erhaltene pTBCDF-11 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI geschnitten, und das Produkt wurde einer Behandlung mit DNA-Polymerase I (Klenow) unterworfen, mit XbaI geschnitten und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, so daß ein größeres DNA-Fragment gewonnen wurde.
(iv) Die beiden unter (ii) bzw. (iii) erhaltenen DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Die auf diese Weise erhaltene rekombinante DNA wurde in Zellen von Escherichia coli HB101 eingeführt, aus denen die gegenüber Ampicillin resistenten Stämme selektiert wurden. Aus den auf diese Weise selektierten Stämmen wurde Plasmid-DNA isoliert und mit Restriktionsenzymen geschnitten. Auf diese Weise erhielt man den pTBCDF-12 enthaltenden Stamm, der als pTBCDF-12/HB101 (FERM-P9062, FERM BP-1404) bezeichnet wurde.
(v) Die Stämme von HB101, nämlich der das Plasmid pTBCDF- 11 enthaltende HB101-Stamm, worin der 5'-Terminus der BCDF- cDNA mit einem Teil der humanen IL-2-cDNA verknüpft ist und worin ein Defekt an der Stelle des 3'-Terminus mit humaner IL-2-cDNA verknüpft ist, und der das Plasmid pTBCDF-12 enthaltende HB101-Stamm, worin der 5'-Terminus der gesamten BCDF-cDNA, die das reife BCDF-Protein abdeckt, mit einer DNA- Sequenz verknüpft ist, die für die N-terminalen Aminosäuren des humanen IL-2-Proteins kodieren, wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 kultiviert. Die Kultur wurde auf herkömmliche Weise isoliert. Die von den beiden Arten von HB101- Stämmen isolierten Kulturlösungen zeigten eine BCDF-Aktivität, wie es in der nachstehenden Tabelle 2 angegeben ist.

Tabelle 2:

BCDF-Aktivität (bestimmt gemäß der reversen Plaque-Methode) von Kulturlösungen, die von Kulturen der Stämme, die die rekombinante DNA enthielten, isoliert wurden

Rekombinante DNA (Stamm) BCDF-Aktivität (Einheiten/ml)
pTBCDF-11/HB101 500
pTBCDF-12/HB101 > 25 600

Beispiel 10

Zellen von pTBCDF-12/HB101 (vgl. Beispiel 9) wurden gemäß Beispiel 8 kultiviert. Die Kultur wurde auf folgende Weise verarbeitet, um Einschlußkörper aus den Zellen zu isolieren.
So wurde die Kultur zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, die mit einer 10-fachen Zelldichte (im Vergleich mit der Kultur) in 20 millimolar Tris-HCl-Puffer (pH-Wert: 7,5) mit einem Gehalt an 30 millimolar NaCl suspendiert wurden. Dazu wurden Lysozym (1 mg/ml) und EDTA (0,05 m) gegeben. Anschließend wurde gerührt. Man beließ die Suspension 1 Stunde unter Eiskühlung. Dann wurde sie einer Beschallung unterworfen, um die Zellen auf zubrechen (abzubauen). Die auf diese Weise behandelte Suspension wurde 5 Minuten bei 10 000 U/min zentrifugiert, wobei die Einschlußkörper gewonnen wurden.
Die Einschlußkörper wurden durch Zugabe von 6 m Guanidinhydrochlorid solubilisiert, und die Lösung wurde auf eine Endkonzentration von 100 ug/ml an Delta HIL-2-BCDF und 2 m Guanidinhydrochlorid eingestellt. Die Suspension wurde mit oxidiertem Glutathion (1 millimolar) und reduziertem Glutathion (10 millimolar) gemischt, auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und 10 bis 16 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Die Suspension wurde anschließend einer Gelfiltration (Sephadex G-25) unterworfen, so daß das Guanidinhydrochlorid entfernt wurde, und die Fraktion, die Delta HIL-2-BCDF als eine Pufferlösung für eine Kallikrein-Lösung entsprach, erhalten wurde. Die Fraktion wurde einer SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese unterworfen. Das durch die Elektrophorese bestimmte Molekulargewicht stimmte nahezu mit dem auf der Basis der Aminosäurezusammensetzung berechneten Wert überein.
Die Untersuchung der N-terminalen Aminosäuresequenz mittels eines Proteinsequenzierers zeigte, daß sie derjenigen von HIL-2 entsprach.
Das Polypeptid mit der BCDF-Aktivität wird durch folgende Aminosäuresequenz wiedergegeben:
ALA PRO THR SER SER SER THR LYS LYS THR GLN
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(2) Spaltung mit Kallikrein

Delta HIL-2-BCDF (80 ug), wie er vorstehend erhalten wurde, wurde mit humanem Plasma-Kallikrein (73,5 ug) in 50 millimolar Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert: 7,8) mit einem Gehalt an NaCl (113 millimolar) bei 37ºC für 16 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Umkehrphasen-HPLC unterworfen, und die Fraktionen, die humanem Ala-BCDF entsprachen und bei einer Konzentration von etwa 55% im Hinblick auf Acetonitril und 0,1% im Hinblick auf TFA eluiert wurden, wurden gesammelt. Von der auf diese Weise erhaltenen Fraktion wurde die Aminosäuresequenz am N-Terminus unter Verwendung eines Proteinsequenzierers untersucht. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß Delta HIL-2-BCDF quantitativ in humanes Ala-BCDF-Protein übertragen (umgewandelt) worden war. Humaner Ala-BCDF wurde in einer Ausbeute von 18,03 mg (Ausbeute: 84%) gewonnen. Als "humaner Ala-BCDF" wird ein natürlicher humaner BCDF bezeichnet, bei dem der N-Terminus mit einem Alanin-Molekül verknüpft ist und der die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
ALA PRO VAL PRO PRO GLY GLU ASP SER LYS ASP
VAL ALA ALA PRO HIS ARG GLN PRO LEU THR SER
SER GLU ARG ILE ASP LYS GLN ILE ARG TYR ILE
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(3) Entfernung des N-terminalen Ala unter Verwendung von Aminopeptidase P

Die für diesen Zweck zu verwendende Aminopeptidase P wurde gemäß dem Verfahren gereinigt, das in Methods Enzymol., Bd. 19 (1970), S. 521, beschrieben ist.
Die vorstehend unter (2) erhaltene Lösung von humanem Ala- BCDF wurde einer Gelfiltration über eine Säule mit Sephadex G-25, die mit einer Tris-HCl-Pufferlösung (50 millimolar; pH- Wert: 8,0) mit einem Gehalt an MnCl&sub2; (0,4 millimolar) äquilibriert worden war, unterworfen, so daß Ala-BCDF-Fraktionen erhalten wurden. Die Fraktion von Ala-BCDF (50 ug) wurde mit Aminopeptidase P gemischt, und das Gemisch wurde 16 Stunden bei 37ºC umgesetzt. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch einer Umkehrphasen-HPLC unterworfen, so daß Fraktionen, die BCDF entsprachen, gesammelt wurden. Die N-terminale Aminosäuresequenz des Polypeptids der auf diese Weise erhaltenen Fraktionen wurde unter Verwendung eines Proteinsequenzierers untersucht. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß Ala-BCDF quantitativ in BCDF umgewandelt worden war. Die nachstehende Tabelle 3 zeigt die Aktivität von Ala-BCDF und BCDF.

Tabelle 3:

BCDF-Aktivität, die sich bei pTBCDF-12/HB101 zeigt (reverse Plaque-Methode)

gebildetes Protein BCDF-Aktivität (Einheiten/kg Protein)
Ala-BCDF 20 000
BCDF 20 000

Beispiel 11

Konstruktion einer rekombinanten DNA, die zur Expression von humanem BCDF imstande ist, dem der C-Terminus fehlt, wurde unter Verwendung der Plasmide pTBCDF-1 und pT9-11 hergestellt (vgl. Fig. 13):
(i) Das Plasmid pTBCDF-01 wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI geschnitten, das Produkt wurde einer Behandlung mit DNA- Polymerase I (Klenow) unterworfen, mit PvuI geschnitten und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, und ein kleineres DNA-Fragment, das trp p/o und humane BCDF-cDNA, der der 3'-Terminus fehlt, enthielt, wurde erhalten. Das Plasmid pT9- 11 wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und PvuI geschnitten, und das Produkt wurde einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, und es wurde ein größeres DNA-Fragment, das den trpA-Terminator enthielt, gewonnen.
Die beiden auf diese Weise hergestellten Arten von DNA- Fragmenten wurden mit der synthetischen DNA (c) [5'CCTAGCCCGGGTGAATGAAT3' und 5'GATCATTCATTCACCCGGGCTAGG3'] gemischt, und das Gemisch wurde unter Verwendung von T4-DNA- Ligase ligiert. Die auf diese Weise hergestellte rekombinante DNA wurde in Zellen von Escherichia coli HB101 eingeführt, und gegen Ampicillin resistente Stämme wurden selektiert. Aus den Stämmen wurde Plasmid-DNA isoliert, die anschließend mit Restriktionsenzymen geschnitten wurde. Die Nucleotidsequenz um die Verknüpfungsstelle herum wurde untersucht, und der Stamm, der pTBCDF-03 enthielt, wurde selektiert. Der Stamm wurde als pTBCDF-03/HB101 bezeichnet. Das Plasmid pTBCDF-03 enthält ein Gen, dem ein Teil des 3'-Terminus der BCDF-cDNA fehlt. Das aus pTBCDF-03/HB101 isolierte Polypeptid weist die folgende Aminosäuresequenz auf:
PRO VAL PRO PRO GLY GLU ASP SER LYS ASP VAL
ALA ALA PRO HIS ARG GLN PRO LEU THR SER SER
GLU ARG ILE ASP LYS GLN ILE ARG TYR ILE LEU
ASP GLY ILE SER ALA LEU ARG LYS GLU THR CYS
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ALA LEU ALA GLU ASN ASN LEU ASN LEU PRO LYS
MET ALA GLU LYS ASP GLY CYS PHE GLN SER GLY
PHE ASN GLU GLU THR CYS LEU VAL LYS ILE ILE
THR GLU LEU LEU GLU PHE GLU VAL TYR LEU GLU
TYR LEU GLN ASN ARG PHE GLU SER SER GLU GLU
GLN ALA ARG ALA VAL GLN MET SER THR LYS VAL
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(ii) pTBCDF-03/HB101 wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 behandelt, um eine isolierte Kulturlösung herzustellen. Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, zeigte die Kulturlösung von pTBCDF-03/HB101 BCDF-Aktivität.

Tabelle 4:

BCDF-Aktivität der Kulturlösung, die von dem Stamm isoliert wurde, der rekombinante DNA enthielt (reverse Plaque-Methode)

Stamm BCDF-Aktivität (Einheiten/ml)
pTBCDF-03/HB101 400

Beispiel 12

Die gleichen Verfahren wie in Beispiel 10, Stufen (1) bis (3), wurden angewandt, mit der Ausnahme, daß in Stufe (3) Ala-BCDF in einer Menge von 2,02 mg verwendet wurde.
Der humane BCDF wurde in einer Ausbeute von 2,0 mg gewonnen. Tabelle 5 zeigt die Aktivität von humanem BCDF und von humanem Ala-BCDF. Die Aktivität ist als Einheitswert ausgedrückt, der gemäß dem Verfahren von Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 5490, definiert ist. Tabelle 5: BCDF-Aktivität (Einheiten/ml) Spezifische Aktivität Humaner Ala-BCDF

(4) Formulierung von humanem BCDF

Die Lösung der durch HPLC erhaltenen Fraktionen, die humanen BCDF oder humanen Ala-BCDF enthielten, wurden bei -20ºC über Nacht belassen. Die untere Schicht der Lösung, die von der oberen Schicht (Acetonitril) getrennt wurde, wurde einer Gelfiltration über Sephadex G-25 oder einer Dialyse unterworfen, wobei das verbleibende Acetonitril und die verbleibende TFA in der unteren Schicht entfernt wurden, so daß die Lösung in eine PBS-Lösung umgewandelt wurde. Die auf diese Weise hergestellte Lösung wurde verdünnt und wahlweise mit fötalem Rinderserum (FBS) (10%) oder mit humanem Serumalbumin (0,1%) gemischt. Das Gemisch wurde zur Erzielung steriler Bedingungen filtriert und schließlich in pharmazeutisch geeignete Formen formuliert.

Beispiel 13

Der Einfluß von humanem BCDF oder humanem Ala-BCDF auf die Bildung eines spezifischen Antikörpers wurde wie folgt untersucht:
Die Zellen (1 · 10&sup4;) der humanen B-Zellinie SKW6-CL4 wurde in RPMI 1640-Medium (100 ul) mit einem Gehalt an 10% FBS suspendiert. Dazu wurden serielle Verdünnungen (2-fach) (100 ul) an humanem BCDF (79 ng/ml) oder humanem Ala-BCDF (57 ng/ml) gegeben. Die Suspension wurde auf einer Platte (96 Vertiefungen) (Corning Corp. 25860) bei 37ºC in 5% CO&sub2; für 3 Tage kultiviert. IgM im Überstand wurde gemäß dem ELISA-Verfahren (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 5490) untersucht.
Wie in Fig. 14 gezeigt ist, zeigten SKW6-CL4-Zellen, die zusammen mit humanem BCDF oder humanem Ala-BCDF kultiviert worden waren, eine signifikant erhöhte Bildung von Antikörpern (IgM) im Vergleich mit der Kontrolle. Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied hinsichtlich der Bildung von Antikörpern zwischen humanem BCDF und humanem Ala-BCDF beobachtet.
Humaner Ala-BCDF bekannter Aktivität, der nach dem IL-2- Fusionsprotein-Verfahren hergestellt wurde, wurde in Portionen (jeweils 100 Einheiten/ml) verdünnt, die als BCDF-Standard verwendet wurden.

Beispiel 14

Zellen von SKW6-CL4 wurden mit humanem BCDF (1 Einheit/ml) (200 ug/ml) und humanem rekombinantem IL-2 (50 000 Einheiten/ml) (1 ug/ml bis 0,32 ug/ml) unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 13 für 3 Tage kultiviert.
Die Anzahl der Zellen, die einer Differenzierung in Antikörper bildende Zellen unterlag, wurde durch die reverse PFC- Methode (Eur. J. Immunol., Bd. 13 (1983), S. 31) gezählt. Wie in Fig. 15 gezeigt ist, zeigten die Zellen von SKW6-CL4, wenn sie in Gegenwart von humanem BCDF und humanem IL-2, die gleichzeitig zugegeben wurden, kultiviert wurden, eine verstärkte Bildung von Antikörpern im Vergleich mit Zellen, die in Gegenwart von humanem BCDF oder humanem IL-2 allein kultiviert wurden. Die gleichen Ergebnisse wurden auch unter Verwendung eines ELISA-Assays beobachtet.

Beispiel 15

Milzzellen einer DBA/2-Maus (weiblich, 8 Wochen alt) wurden mit 0,9% NH&sub4;Cl auf herkömmliche Weise behandelt, um die Erythrozyten zu entfernen. Die Zellen wurden anschließend mit anti-Thy 1-Antikörper und Meerschweinchen-Komplement behandelt, um die T-Zellen zu entfernen, so daß man eine B-Zell- Fraktion in gereinigter Form erhielt.
Die auf diese Weise erhaltene B-Zellfraktion (7,5 · 10&sup5;) und Schaf-Erythrozyten (SRBC) (1 · 10&sup5;) wurden in RPMI 1640- Medium (200 ul) mit einem Gehalt ab FBS (5%) suspendiert. Die Suspension wurde auf einer Platte (96 Vertiefungen) (Corning Corp. 25860) bei 37ºC bei 5% CO&sub2; für 4 bis 5 Tage kultiviert. Während-der Kultivierung wurden humaner BCDF (125 Einheiten/ml; 50 ng/ml) und humanes IL-2 (400 Einheiten/ml; 8 ng/ml) in geeigneter Weise zu der Kultur zu verschiedenen Zeitpunkten gegeben.
Nach der Kultivierung wurden die Zellen, die zur Bildung von anti-SRBC-Antikörpern imstande waren, nach der PFC-Methode gezählt (The Method of Immunological Experiment, S. 479; Jap. Soc. Immunology).
Wie in Fig. 16 gezeigt ist, stimuliert humaner BCDF die Bildung von spezifischen Antikörpern in Milzzellen einer normalen Maus. Die Wirkung wurde noch verstärkt durch die kombinierte Anwendung von humanem BCDF und humanem IL-2. Die gleiche Wirkung wurde bei anderen Stämmen der Maus, z. B. bei Balb/c-Mäusen, beobachtet. Der Test von Milzzellen, die aus Balb/c-nu/nu-Mäusen stammten, die die T-Zellfunktion aufgrund des Fehlens eines Thymus verloren hatten, ergab ebenfalls das gleiche Ergebnis, wie in Fig. 17 gezeigt ist.

Beispiel 16

SRBC (1 · 10&sup8;) wurden als Antigen intravenös in den Schwanz einer DBA/2-Maus (weiblich, 8 Wochen alt) injiziert, so daß die DBA/2-Maus sensibilisiert wurde. 4 Tage später wurde der sensibilisierten Maus die Milz entnommen. Die Milz wurde gemäß dem in Beispiel 15 beschriebenen Verfahren behandelt, um sensibilisierte B-Zell-Fraktionen in gereinigter Form herzustellen. Die sensibilisierten B-Zellen (7,5 · 10&sup5;) und SRBC (1 · 10&sup5;) als Antigen wurden in RPMI 1640-Medium (200 ml) mit einem Gehalt an FBS (5%) suspendiert, und die Suspension wurde bei 37ºC in Gegenwart von humanem BCDF (50 ng/ml) und humanem IL-2 (8 ng/ml bis 80 ug/ml) in 5% CO&sub2; für 4 Tage kultiviert. Zellen, die zur Bildung von anti-SRBC-Antikörpern imstande waren, wurden direkt gemäß der PFC-Methode gezählt.
Wie in Fig. 18 gezeigt ist, verursacht die Zugabe von humanem BCDF einen statistisch signifikanten Anstieg der Bildung des spezifischen Antikörpers im Vergleich mit der Kontrolle (ohne Zugabe von humanem BCDF). Der Einfluß von humanem BCDF auf die Produktivität im Hinblick auf den spezifischen Antikörper wurde ferner durch Anwendung von humanem BCDF zusammen mit humanem IL-2 verstärkt.
In den folgenden Beispielen 17 bis 21 wurde Ala-BCDF als Beispiel verwendet, um die physiologischen Wirkungen von humanem BCDF zu zeigen.

Beispiel 17

(1) Verstärkung der Bildung des Antikörpers gegen das Antigen bei Sensibilisierung in vitro

Ein immunsuppressives Arzneimittel, nämlich Hydrocortison (HC) (Warenbezeichnung für eine wäßrige Suspension von Hydrocortisonacetat, Shuroson F., Japan Shering) (5 mg) wurde subkutan einer Balb/c-Maus (weiblich, 6 Wochen alt) injiziert, so daß die Maus immunsupprimiert war.
1, 2 und 7 Tage später wurde der immunsupprimierten Maus die Milz entnommen. Die Milz wurde mit 0,9% NH&sub4;Cl behandelt, um rote Blutzellen zu entfernen, so daß gereinigte Milzzellen hergestellt wurden.
Die auf diese Weise hergestellten Milzzellen (5 · 10&sup5;) und SRBC (1 · 10&sup5;) wurden in RPMI 1640-Medium (200 ul) mit einem Gehalt an FBS (5%) suspendiert, und die Suspension wurde auf einer Platte, (96 Vertiefungen) (Corning Corp. 25860) bei 37ºC in 5% CO&sub2; kultiviert. Zum Kulturmedium wurden humaner Ala-BCDF (25 Einheiten/ml; 4 ng/ml), humanes IL-2 (400 Einheiten/ml; 8 ng/ml) oder T-Zell-Faktor (TF; Kulturüberstand eines Hybridoms aus T-Zellen ,das mit Concanavalin A stimuliert wurde) (10%) als eine positive Kontrolle gegeben. Am 5. Tag der Kultivierung wurden die Zellen auf herkömmliche Weise gewonnen. Die anti-SRBC-Antikörper bildenden Zellen wurden direkt gemäß der PFC-Methode gezählt.
Wie in Tabelle 6 gezeigt ist, wurde die Produktivität im Hinblick auf den spezifischen Antikörper in der Maus, bei der die Bildung von PFC bei Zugabe von TF durch das verabreichte Hydrocortison im Vergleich mit der Kontrolle verringert worden war, durch die Zugabe von humanem Ala-BCDF, auch in Kombination mit humanem Il-2, verstärkt. Tabelle 6 Behandlung Lymphokin Milzzellen HC-unbehandelte Maus humanes IL-2 humaner Ala-BCDF humanes IL-2 + 1 Tag nach der HC-Behandlung

(2) Verstärkung der Bildung von Antikörpern gegen das Antigen bei Sensibilisierung in vivo

Hydrocortison (0,5 mg) wurde subkutan einer Balb/c-Maus (weiblich, 6 Wochen alt) injiziert, und 7 Tage später wurden SRBC (1 · 10&sup8;) intravenös in den Schwanz der Maus injiziert. Am 3. Tag nach der Injektion wurde die Milz aus der Maus entnommen, und die Milz wurde in der gleichen Weise wie vorstehend unter (1) behandelt, um Milzzellen herzustellen. Die spezifische anti-SRBC-Antikörper bildenden Zellen wurden direkt gemäß der PFC-Methode gezählt.
Die Milzzellen (5 · 10&sup5;) wurden zusammen mit SRBC (1 · 10&sup5;) in der gleichen Weise wie vorstehend unter (1) kultiviert. Humaner BCDF (100 Einheiten/ml; 20 ng/ml), humanes Il- 2 (400 Einheiten/ml; 8 ng/ml) oder T-Zell-Faktor (10%) wurden zu dem Kulturmedium gegeben. Am 4. Tag der Kultivierung wurden die Zellen gewonnen, und die anti-SRBC-Antikörper bildenden Zellen wurden direkt gemäß der PFC-Methode gezählt.
Wie in Tabelle 7 gezeigt ist, wurde durch Behandlung mit Hydrocortison die Bildung der Antikörper gegen das Antigen bei Sensibilisierung in vivo um etwa 60% supprimiert. Die auf diese Weise behandelten Milzzellen wurden in Gegenwart von Lymphokin und SRBC für 4 Tage kultiviert. Der Vergleich der Milzzellen der mit Hydrocortison behandelten Maus mit den Milzzellen der Maus ohne Behandlung mit Hydrocortison zeigt, daß die supprimierende Wirkung von Hydrocortison bei den Milzzellen der mit humanem Ala-BCDF behandelten Maus merklich (um etwa 20%) verringert ist. Es wurde kein statistisch signifikanter Einfluß von Hydrocortison auf die Milzzellen, die entweder mit TF oder mit humanem IL-2 behandelt worden waren, im Vergleich mit der Kontrolle beobachtet.
Die verstärkte Produktivität hinsichtlich der Antikörper bei Verwendung von BCDF bei der Maus, der Hydrocortison verabreicht worden war, zeigt, daß die Immunität und der Abwehrmechanismus des Wirts in wirksamer Weise durch BCDF bei einem immunsupprimierten Zustand aktiviert werden. Tabelle 7 Behandlung PFC/1·10&sup6; Milzzellen Suppression durch HC-Behandlung Balb/c HC-Behandlung [Lymphokin-Behandlung in vitro, PFC] in vitro SRBC-Lymphokin HC-unbehandelt SRBC-Verabreichung humanes IL-2 humaner Ala-BCDF humanes IL-2- + humaner Ala-BCDF

Beispiel 18

(Wachstum von Knochenmarkszellen, die mit humanem Ala-BCDF stimuliert werden)

Die hämatopoetische stimulierende Wirkung von humanem BCDF und humanem Ala-BCDF wurde mit Hilfe der folgenden Verfahren untersucht:
Einer DBA/2-Maus (weiblich, 8 Wochen alt) wurde der Oberschenkelknochen entnommen, aus dem Knochenmarkszellen unter sterilen Bedingungen auf herkömmliche Weise hergestellt wurden, wie es in "The Method of Immunological Experiment, S. 1305, Jap. Soc. Immunology", beschrieben wird. Die auf diese Weise erhaltenen Knochenmarkszellen (5 · 10&sup4;) wurden in RPMI 1640-Medium (100 ul) mit einem Gehalt an 10% FBS suspendiert, und dazu wurden 100 ul einer Lösung gegeben, die aus seriellen Verdünnungen (2-fach) von humanem Ala-BCDF (500 Einheiten/ml; 100 ng/ml) und Mäuse-IL-3 (5 Einheiten/ml; 1,25 Einheiten/ml) bestand. Die Suspension wurde auf einer Platte (96 Vertiefungen) (Corning 25860) bei 37ºC in 5% CO&sub2; kultiviert, und der Einfluß auf das Wachstum von Knochenmarkszellen wurde untersucht.
Mäuse-IL-3 wurde auf folgende Weise hergestellt. Das Plasmid, in das die Mäuse-IL-3-cDNA (vgl. Nature, Bd. 307 (1984), S. 233) integriert worden war (pQ-Vektor) (vgl. JP-A- 184858/1986), wurde in COS-Zellen auf herkömmliche Weise, wie es in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), S. 1070 beschrieben ist, transfiziert, und die COS-Zellen wurden für 3 Tage kultiviert. Der von der Kultur abgetrennte Überstand (IL-3-Aktivität: etwa 50 Einheiten/ml) wurde gegen RPMI 1640- Medium dialysiert und für das nachfolgende Verfahren verwendet. Am 4. Tag der Kultivierung wurde die Kultur von Knochenmarkszellen mit mit Tritium markiertem Thymidin (³H-TdR) (1 uCi/Vertiefung) gemischt und 18 Stunden belassen. Die Kultur wurde filtriert, um die Zellen zu sammeln, für die das eingebaute ³H-TdR mittels eines β-Scintillationszählers untersucht wurde.
Wie in Fig. 19 gezeigt ist, zeigte die Kultur von Knochenmarkszellen, die mit humanem Ala-BCDF kultiviert worden war, einen verstärkten ³H-TdR-Einbau durch die Knochenmarkszellen im Vergleich mit der Kontrolle. Wenn humaner Ala-BCDF in Kombination mit Knochenmarkszell-Wachstumsfaktor (Mäuse-IL-3) zugegeben wurde, dann wurde das Wachstum der Knochenmarkszellen weiter verstärkt.
Das gleiche Phänomen wurde auch für andere Stämme der Maus, wie Balb/c, c57Bl/6 und C3H/HeN, beobachtet.

Beispiel 19

Lentinan (10 mg/kg) wurde intravenös in den Schwanz einer DAB/2-Maus (weiblich, 8 Wochen alt) injiziert. 10, 7 und 5 Tage nach der Injektion wurde der Maus Knochenmark entnommen, und die Knochenmarkszellen wurden gemäß dem Verfahren, wie es vorstehend in Beispiel 18 beschrieben wurde, gewonnen.
Knochenmarkszellen wurden in Gegenwart von humanem Ala- BCDF (50 Einheiten/ml; 10 ng/ml) und Mäuse-IL-3 (5 Einheiten/ml) kultiviert. Der Einfluß von BCDF auf das Wachstum der Zellen wurde in der Kultur untersucht. So wurde die Kultur am 3., 4. und 5. Tag der Kultivierung mit ³H-TdR (1 uCi/Vertiefung) gemischt. Das Wachstum der Knochenmarkszellen wurde auf der Basis des Einbaus von ³H-TdR in die Zellen gemäß dem im vorstehenden Beispiel 18 beschriebenen Verfahren bewertet.
Es wurde also Lentinan an eine weibliche DBA/2-Maus verabreicht. 10, 7 und 5 Tage nach der Verabreichung wurden die behandelte DBA/2-Maus und diejenige, der kein Lentinan verabreicht worden war, in der gleichen Weise behandelt, um Knochenmarkszellen zu gewinnen. BCDF (50 ng/ml) und IL-3 (5 Einheiten/ml) wurden zu den Knochenmarkszellen gegeben. Die Wachstumsrate wurde auf der Basis des Einbaus von ³H-TdR am 3., 4. und 5. Tag nach der Zugabe von BCDF und IL-3 bewertet. LNT bedeutet Lentinan.
Wie in Fig. 20 gezeigt ist, wurde das Wachstum der Knochenmarkszellen der Maus, der Lentinan 5 oder 7 Tage vor der Entfernung des Knochenmarks verabreicht worden war, durch die kombinierte Verabreichung von humanem Ala-BCDF und Mäuse-IL-3 im Vergleich mit der Kontrolle verstärkt.

Beispiel 20

Knochenmarkszellen wurden aus einer DBA/2-Maus (weiblich, 8 Wochen alt) gemäß dem Verfahren des vorstehenden Beispiels 18 gewonnen. Die Kolonie-bildende Aktivität wurde unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Assaysystems bestimmt. DMEM-Medium mit einer 2-fachen Konzentration mit einem Gehalt an 20% FBS und 5 · 10&supmin;&sup5; m 2-Mercaptoethanol wurde mit 1% Agarlösung in einem Verhältnis von 7 : 3 gemischt und in einem Wasserbad zum Schmelzen des Agars erwärmt. Die vorstehend erwähnten Knochenmarkszellen (7,5 · 10&sup4;) wurden im vorstehend hergestellten wäßrigen Agarmedium suspendiert, und die Suspension wurde in einer 3,5 cm-Schale (Falcon 1008) halbverfestigt. Die Agarsuspension wurde bei 37ºC in 5% CO&sub2; für 7 Tage kultiviert, um Kolonien (mehr als 50 Zellen) und Cluster (bestehend aus 8 bis 50 Zellen) zu entwickeln. Die Anzahl der Kolonien und Cluster wurde mikroskopisch gezählt.
Das Agarsuspensionsmedium wurde mit humanem Ala-BCDF (50 bis 500 Einheiten/ml; 10 bis 100 ng/ml) und Mäuse-IL-3 (1,25 Einheiten/ml) gemischt und kultiviert. Bei dieser Kultur wurde die Bildung von Kolonien und Clustern untersucht.
Wie in Fig. 21 gezeigt ist, zeigt das Agarsuspensionsmedium mit humanem Ala-BCDF einen statistisch signifikanten Anstieg der Anzahl der Cluster im Vergleich mit der Kontrolle. Fig. 21 zeigt auch, daß die durch Mäuse-IL-3 induzierte Koloniebildung durch Zugabe von BCDF weiter verstärkt wird.
Das gleiche Phänomen wurde bei der immunsupprimierten Maus bei Verabreichung eines immunsupprimierenden Mittels, nämlich Hydrocortison, beobachtet. Hydrocortison (1 mg bis 5 mg) wurde also subkutan einer DBA/2-Maus (weiblich, 6 Wochen alt) injiziert. 5 Tage später wurden Knochenmarkszellen in der gleichen Weise, wie es vorstehend beschrieben wurde, gewonnen.
Humaner Ala-BCDF (200 ng/ml; 1000 Einheiten/ml) und Mäuse- IL-3 (0,6 Einheiten/ml) wurden zu DMEM-Medium mit einem Gehalt an 1% Methylcellulose, 20% FBS und 5 · 10&supmin;&sup5; m 2-Mercaptoethanol gegeben. Zu dem auf diese Weise hergestellten Medium wurden Knochenmarkszellen (2 · 10&sup4;) gegeben und für 7 Tage zur Entwicklung von Kolonien kultiviert. Wie in Fig. 22 gezeigt ist, wurde die Bildung von Clustern signifikant durch die Zugabe von humanem Ala-BCDF verstärkt. Durch die Verabreichung von Hydrocortison wurde die koloniebildende Fähigkeit selbst verstärkt, und die Bildung von Makrophagen-Lymphozyten-ähnlichen Kolonien wurde durch die Zugabe von humanem Ala-BCDF in Kombination mit Mäuse-IL-3 merklich verstärkt.
Daher wurde bestätigt, daß BCDF, der entweder allein oder in Kombination mit IL-3 verabreicht wird, die hämatopoetische Funktion bei immunsupprimierten Mäusen stimuliert.

Beispiel 21

Es wurde untersucht, ob humaner BCDF oder humaner Ala-BCDF zu einer Differenzierung von Tumorzellen führen können und eine Antitumoraktivität aufweisen.
Der Test wurde wie folgt durchgeführt:
Die humanen myelomonozytischen Leukämiezellinien THP-1 und KG-1 (jeweils 2 · 10&sup5;/ml) wurden in RPMI 1640-Medium mit einem Gehalt an 10% FBS suspendiert. Die Zellsuspension wurde in einer Menge von 1 ml/Vertiefung auf eine Platte (Corning Co., 25820) gegeben und bei 37ºC in CO&sub2; (5%) für 2 Tage kultiviert. Zu der Kultur wurde humaner Ala-BCDF (20 ng/ml bis 5 ug/ml) gegeben, und der Einfluß der Zugabe von humanem Ala-BCDF auf die Differenzierung der Tumorzellen wurde untersucht. Die Häufigkeit des Auftretens des Fc-Rezeptors in Tumorzellen am 2. Tag der Kultur wurde durch die Rosette-Bildungsmethode (vgl. Cancer Research, Bd. 44 (1984), S. 5127) unter Verwendung von sensibilisierten roten Blutzellen ("ox red blood cells") bestimmt. Der Wert für die Häufigkeit des Auftretens wurde als Index der Differenzierung herangezogen. Fig. 23 zeigt die Häufigkeit des Auftretens von Fc-Rezeptoren, wie sie für die Kultur von THP-1 und KG-1, die in einem Medium mit einem Gehalt an RPMI 1640 (2 · 10- /ml) und FBS (10%) für 2 Tage kultiviert worden waren, gemessen wurde. Die Häufigkeit des Auftretens wurde durch die Rosette- Bildungsmethode unter Verwendung von sensibilisierten roten Blutzellen bestimmt. Wie in Fig. 23 gezeigt ist, verstärkte humaner Ala-BCDF signifikant die Häufigkeit des Auftretens von Fc-Rezeptoren bei den myeolomonozytischen Leukämiezellinien THP-1 und KG-1. Daher ist es offensichtlich, daß BCDF die Differenzierung von Tumorzellen zu normalen Zellen stimulieren kann und daß BCDF eine Antitumoraktivität zeigt.

Beispiel 22

Mandeln wurden von Patienten erhalten, denen die Mandeln entfernt wurden. Die Mandeln wurden in RPMI 1640 zerkleinert. Nach der Entfernung von Bruchstücken wurden mononukleare Zellen durch Zentrifugation in LSM-Lösung (Ficoll-Natriumdiatrizoat) für 30 Minuten bei 400 ·g abgetrennt.
Mononukleare Mandelzellen (1-2 · 10&sup5;/200 ul RPMI 1640 + 10% FBS/Vertiefung) wurden mit mehreren Konzentrationen an PWM ("pokeweed mitogen") und verschiedenen Konzentrationen an BCDF stimuliert. Nach 7-tägiger Inkubation wurden die Konzentrationen an IgM, IgG und IgA in den Kulturüberständen quantitativ durch einen Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA) vom Sandwich-Typ bestimmt.
Die Ergebnisse zeigten, daß BCDF die Bildung verschiedener Antikörper verstärkte (Fig. 24).

Beispiel 23

Mandeln wurden von Patienten erhalten, denen die Mandeln entfernt wurden. Die Mandeln wurden in RPMI 1640 zerkleinert. Nach der Entfernung von Bruchstücken wurden die mononuklearen Zellen durch Zentrifugation in LSM-Lösung (Ficoll-Natriumdiatrizoat) bei 400 ·g für 30 Minuten abgetrennt.
T- und B-Zellen wurden nach der Rosette-Methode mit mit Neuramidase behandelten Schaf-Erythrozyten getrennt.
Die E-Rosette-negative Fraktion wurde in geeigneter Weise mit verdünntem anti-Leu-1 für 30 Minuten auf Eis behandelt. Die behandelten Zellen wurden mit den als Komplement verwendeten Seren neugeborener Kaninchen inkubiert. Mit PWM bei 0,25% aktivierte B-Zell-Blasten plus bestrahlte T-Zellen wurden verwendet.
Die B-Zell-Blasten (5 · 10&sup4; - 1 · 10&sup5;/200 ul RPMI 1640 + 10% FBS/Vertiefung) wurden mit verschiedenen Konzentrationen an BCDF für 5 Tage kultiviert.
Die Konzentrationen an IgG in den Kulturüberständen wurden quantitativ nach einem Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA) vom Sandwich-Typ bestimmt.
Die Ergebnisse zeigten, daß rekombinanter BSF-2 die Ig-Absonderung in PWM-stimulierten B-Blasten-Zellen induzierte (Fig. 25).

Beispiel 24

SRBC wurden intravenös in vivo C3H/Hej-Mäusen im Alter von 6 Wochen in einer Dosis von 1 · 10&sup8;/Kopf verabreicht, und die Milzzellen wurden 5 Tage später isoliert. Die Milzzellen (5 · 10&sup5;/Vertiefung) und SRBC (1 · 10&sup5;/Vertiefung) wurden 4 Tage zusammen mit BCDF bei der vorstehend genannten Konzentration inkubiert. Nach Abschluß der Inkubation wurden die Zellen gewonnen, und die Zahl der SRBC-spezifische Antikörper bildenden Zellen wurde nach der PFC-Methode unter Verwendung einer Cunningham-Kammer gemessen.
Wie in Fig. 26 gezeigt ist, verstärkte BCDF die Bildung der SRBC-spezifische Antikörper bildenden Zellen aus den mit SRBC sensibilisierten Milzzellen allein.

Beispiel 25

5FU wurde intravenös DBA/2-Mäusen in einer Dosis von 0,5 mg/Kopf an drei aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht, und SRBC wurde intravenös in vivo am 3. Tag in einer Dosis von 1 · 10&sup8;/Kopf verabreicht. BCDF wurde subkutan an drei aufeinanderfolgenden Tagen von 2 Tagen nach der Verabreichung von SRBC an in einer Dosis von 0,01 bis 1,0 ug/Kopf verabreicht. Seren wurden 5 Tage nach der Verabreichung von SRBC gewonnen. Die Konzentration an SRBC-spezifischem Antikörper im Serum wurde durch einen SRBC-Agglutinierungstest unter Verwendung einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen bestimmt. Als Agglutinierungstiter wurde-die reziproke Anzahl der Verdünnungsverstärkung herangezogen.
Wie in Fig. 27 gezeigt ist, beschleunigte die Verabreichung von BCDF in einer von der Dosis abhängigen Weise die Antikörperbildung, die durch die Verabreichung von 5-FU verringert worden war.

Beispiel 26

Cyclophosphamid (CY) wurde intraperitoneal 6 Wochen alten DBA/2-Mäusen in einer Dosis von 4 mg/Kopf (0. Tag) verabreicht. BCDF wurde anschließend subkutan und intraperitoneal jeden Tag (0. Tag bis 6. Tag) verabreicht. Am 7. Tag nach der CY-Verabreichung wurden die Milzzellen isoliert, und 7,5 · 10&sup4; der Zellen wurden in einem Weichagarmedium 6 Tage zusammen mit einem 10% PWM-stimulierten Milzzell-Überstand inkubiert. Auf diese Weise wurde die Anzahl an Clustern gemessen. Zur Kontrolle wurde Mäuseserumalbumin (MSA) verabreicht. Die Ergebnisse sind in Fig. 28 gezeigt.
Die Anzahl der Cluster von Milzzellen, die durch Zugabe des PWM-stimulierten Milzzell-Überstands gebildet wurden, stieg abhängig von der Dosis an BCDF und erreichte maximal das 4-fache in der Gruppe, der BCDF verabreicht wurde im Vergleich zu der Gruppe, der MSA verabreicht wurde.
Man nimmt an, daß die Verabreichung von BCDF in vivo das Wachstum der hämatopoetischen Stammzellen in der Milz stimuliert.
Zahlreiche Modifizierungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind im Licht der vorstehenden Lehre möglich. Daher ist darauf hinzuweisen, daß innerhalb des Schutzumfangs der beigefügten Patentansprüche die Erfindung auf andere Weise als der Weise, die speziell beschrieben wurde, ausgeführt werden kann.

Claims

1. Gereinigtes Polypeptid in nicht-glykosylierter Form, das Aktivität als humaner B-Zell-Differenzierungsfaktor hat und frei von dem natürlichen Signalpeptid am N-Terminus ist, wobei das Polypeptid Pro als N-terminale Aminosäure und Met als C-terminale Aminosäure enthält und durch prokaryontische Zellen produziert ist.

2. Durch prokaryontische Zellen produziertes, gereinigtes Polypeptid mit Aktivität als humaner B-Zell-Differenzierungsfaktor, das die folgende Aminosäuresequenz (I) aufweist:

PRO VAL PRO PRO GLY GLU ASP SER LYS ASP VAL

ALA ALA PRO HIS ARG GLN PRO LEU THR SER SER

GLU ARG ILE ASP LYS GLN ILE ARG TYR ILE LEU

ASP GLY ILE SER ALA LEU ARG LYS GLU THR CYS

ASN LYS SER ASN MET CYS GLU SER SER LYS GLU

ALA LEU ALA GLU ASN ASN LEU ASN LEU PRO LYS

MET ALA GLU LYS ASP GLY CYS PHE GLN SER GLY

PHE ASN GLU GLU THR CYS LEU VAL LYS ILE ILE

THR GLY LEU LEU GLU PHE GLU VAL TYR LEU GLU

TYR LEU GLN ASN ARG PHE GLU SER SER GLU GLU

GLN ALA ARG ALA VAL GLN MET SER THR LYS VAL

LEU ILE GLN PHE LEU GLN LYS LYS ALA LYS ASN

LEU ASP ALA ILE THR THR PRO ASP PRO THR THR

ASN ALA SER LEU LEU THR LYS LEU GLN ALA GLN

ASN GLN TRP LEU GLN ASP MET THR THR HIS LEU

ILE LEU ARG SER PHE LYS GLU PHE LEU GLN SER

SER LEU ARG ALA LEU ARG GLN MET.

3. Polypeptid mit Aktivität als humaner B-Zell-Differenzierungsfaktor, wobei das Polypeptid die folgende Aminosäuresequenz (II) hat:

4. Polypeptid mit Aktivität als humaner B-Zell-Differenzierungsfaktor, wobei das Polypeptid die folgende Aminosäuresequenz (III) hat:

5. Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 4, in welchem eine oder mehr Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt sind.

6. Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 oder 4, in dem eine oder mehr Aminosäuren fehlen.

7. Für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 6 codierende DNA-Sequenz.

8. Rekombinante DNA, welche die DNA-Sequenz nach Anspruch 7 und eine zur Replikation in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen befähigte Vektor-DNA enthält.

9. Rekombinante DNA, welche die DNA-Sequenz nach Anspruch 7 und eine zur Replikation in prokaryontischen Zellen befähigte Vektor-DNA enthält.

10. Mit einer rekombinanten DNA gemäß Anspruch 8 transformierte Zelle.

11. Mit einer rekombinanten DNA nach Anspruch 9 transformierte prokaryontische Zelle.

12. Transformierte Zelle nach Anspruch 11, wobei die prokaryontische Zelle eine Zelle von Escherichia coli oder Bacillus subtilis ist.

13. Verfahren zur Herstellung eines humanen B-Zell-Differenzierungsfaktors, welches das Züchten einer transformierten Zelle gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12 umfaßt.

14. Arzneimittelzusammensetzung, die einen humanen B-Zell- Differenzierungsfaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 als Wirkstoff enthält.

15. Arzneimittelzusammensetzung nach Anspruch 14, die zusätzlich mindestens eine aus der aus IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL- 5, BCGF, GM-CSF, G-CSF, MAF, TNF und Lentinan bestehenden Gruppe ausgewählte Substanz enthält.

16. Arzneimittelzusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15, die eine immuntherapeutische Zusammensetzung zur Erhöhung der Antikörperproduktion darstellt.

17. Arzneimittelzusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15, die eine immuntherapeutische Zusammensetzung zur Stimulation des Knochenmark-Wachstums darstellt.

18. Arzneimittelzusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15, die ein Antikrebsmittel darstellt.

19. Arzneimittelzusammensetzung nach Anspruch 18, die eine immuntherapeutische Zusammensetzung zur Differenzierung von Tumorzellen ist.

20. Verwendung von humanem B-Zell-Differenzierungsfaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung zur Erhöhung der Antikörperproduktion.

21. Verwendung von humanem B-Zell-Differenzierungsfaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung zur Stimulation des Knochenmark-Wachstums.

22. Verwendung von humanem B-Zell-Differenzierungsfaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung als Antikrebsmittel.

23. Verwendung von humanem B-Zell-Differenzierungsfaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung zur Differenzierung von Tumorzellen.