DD251785A5 - Verfahren zur Herstellung eines menschlichen, physiologisch aktiven Polypeptids mit Tnf-Aktivität - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen, physiologisch aktiven Polypeptids (menschlicher TNF) zur Verfuegung gestellt, das darin besteht, eine spezifische Aminosaeurensequenz von 155 Aminosaeureresten durch rekombinante DNS-Technik zu erzeugen, wobei dieses Verfahren es erlaubt, den menschlichen TNF mit hoher Ausbeute im technischen Massstab herzustellen. Erfindungsgemaess kann der menschliche TNF in Form eines Polypeptids hergestellt werden, das den menschlichen TNF und ein Praesequenz-Peptid, das an den N-Terminus des menschlichen TNF gebunden ist, enthaelt. Der menschliche TNF kann auch in Form eines verschmolzenen Peptids aus dem menschlichen TNF und einem Peptid, das von einem replizierbaren Expressionsvektor abgeleitet ist, erzeugt werden. Es wurde festgestellt, dass der so hergestellte menschliche TNF ausgezeichnet geeignet ist, Nekrosen von Tumoren ohne toxische Wirkung auf das normale Gewebe des lebenden Organismus zu induzieren.

Description

Darüber hinaus gibt es eine Anzahl druckschriftlicher Veröffentlichungen, die darüber berichten, daß Faktoren eine TNF-ähnliche Bioaktivität aufweisen oder eine Bioaktivität ähnlich der von TNF. Beispielsweise fanden Reed et al. einen derartigen Faktor in Makrophagen und dergleichen, die in menschlichem Blut vorhanden sind (J. Immunology, Bd. 115, S. 395 [1975]), Matthews et al. in leukämischen Zellen aus menschlichem peripheren BlutMonocyten oder von einem an myelogenermonocytischer Leukämie leidenden Patienten (Immunology, Bd.44, S. 135 [1981]), D.Barbara in menschlichen B-Zellen, die mit Epsein-barr Virus transformiert worden waren (Proc. Nat. Acad. Sei. USA, Bd.80, S. 5397 [1983]) und B.Bharat in der lymphoblastoiden Zellinie 1788. Die oben genannten Faktoren sind auch in den japanischen Offenlegungsschriften 58-15921 (1983); 58-21621 (1983); 58-107197 (1983) und 58-225024 (1983) sowie in den britischen Auslegeschriften 2106117 und 2117 385 beschrieben, die zu einer effektiven Produktion derartiger Faktoren in der Lage waren. Darüber hinaus gibt es im Hinblick auf derartige Faktoren einige Dinge aufzuklären, wie beispielsweise deren Strukturen und Eigenschaften.

In der japanischen Offenlegungsschrift 58-251817 (1983) sind von Ito Studien über Eigenschaften und Struktur von Kaninchen-TNF und Kaninchen-TNF-produzierenden Zellen vorgelegt worden. Als Ergebnis erhielt er Zellen, die eine Substanz mit cytotoxischer Wirksamkeit gegen L-Zellen produzieren konnten, durch Verabreichung einer Substanz, die das retikuioendotheliale System bei Kaninchen stimulieren konnten, gefolgt von einer Injektion eines von einem Bakterium abgeleiteten Endotoxins beim Kaninchen. Unter Verwendung jener Zellen erhielt man dann die Substanz. Er bestätigte auch, daß die Molekülmasse und die immunologischen Eigenschaften der Substanz mit cytotoxischer Wirksamkeit gegen L-Zelien, erhalten unter Verwendung der oben genannten Zellen, in Übereinstimmung mit jenen von TNF stehen, diemanaus Kaninchenserum erhalten hatte.

Mit dem Fortschritt der Gentechnik wurde es möglich, die Struktur eines Proteins zu bestimmen, das so lang wie eine DNA ist, die für das in isolierter Form erhaltene Protein kodiert. Dies wird möglich, da die Struktur der isolierten DNA bestimmt und anschließend auf die Struktur des Proteins aus der DNA-Struktur geschlossen werden kann. Darüber hinaus wurde es möglich, ein Protein aus einer für das Protein kodierenden DNA herzustellen unter Verwendung eines Mikroorganismus oder einer Zellkultur. Ito wandte die oben genannten gentechnischen Manipulationsverfahren auf die Zellen an, die in der Lage sind, eine Substanz mit cytotoxischer Wirksamkeit gegen L-Zellen zu produzieren. Als Ergebnis gelang es ihm, eine für Kaninchen-TNF kodierende DNA zu isolieren, die Strukturen der DNA und der Kaninchen-TNF zu bestimmen und unter Verwendung der DNA-Kaninchen-TNF herzustellen.

Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, daß von Ito ein großer Erfolg in der Herstellung von Kaninchen-TNF errungen wurde. Es sollte allerdings festgestellt werden, daß die Verabreichung von TNF an ein Lebewesen, das nicht der Ursprung der TNF ist, die Gefahr des anaphylaktischen Schocks mit sich bringt. Diese besteht, da TNF ein Polypeptid ist und folglich bei Verabreichung der TNF an ein Lebewesen, von dem die TNF nicht herrührt, die TNF als ein Antigen wirkt und einen Antikörper produziert. Aus diesem Grunde ist bei der Zielrichtung, TNF einem menschlichen Körper zu verabreichen, die Verwendung von aus menschlichem Körper herrührender TNF in höchstem Maße vorzuziehen. Jedoch ist die Struktur von menschlicher TNF noch nicht ausreichend aufgeklärt. Die Bestimmung der Struktur der DNA, die für menschliche TNF kodiert, ist somit ein notwendiges Erfordernis.

Von den Erfindern wurden extensive und intensive Studien über die für menschliche TNF kodierende DNA getrieben. Als Ergebnis wurde überraschenderweise gefunden, daß ein menschliches Polypeptidgen und ein Kaninchen-TNF-Gen unter Verwendung von Kaninchen-cDNAals Sonde kloniert werden kann, so daß die für menschliches Polypeptid kodierende DNA fachgemäß isoliert werden kann und deren Struktur durch Vergleich zwischen Kaninchen-TNF-Gen, menschlichem Polypeptidgen und Kaninchen-cDNA im Hinblick auf die Übereinstimmung ihrer Basensequenzen bestimmt werden kann. Weiterhin wurde gefunden, daß die Struktur der reinen DNA, die für menschliches Polypeptid kodiert, fachgemäß bestimmt werden kann und daß eine solche reine DNA erhalten werden kann, sowie daß ein menschliches Polypeptid, das unter Verwendung von für menschliches Polypeptid kodierender DNA hergestellt wird, eine cytotoxische Wirksamkeit gegen L-Zellen aufweist.

Die vorliegende Erfindung entstand auf der Grundlage dieser neuen Erkenntnisse.

In der Beschreibung werden für Aminosäuren und Peptide Abkürzungen benutzt (siehe unten), wie sie von der IUPAC-IUB-Kommission für Biochemische Nomenklatur (CBN) gebilligt wurden. Im Hinblick auf die Aminosäuren und gegebenenfalls Isomeren davon werden sie dementsprechend von den folgenden Abkürzungen erfaßt, wobei es sich um die I-Form handelt, wenn nichts anderes ausgeführt ist.

GIn: Glutaminrest

Asp: Asparaginsäurerest

Pro: Prolinrest

Tyr: Tyrosinrest

VaI: Valinrest

Lys: Lysinrest

GIu: Glutaminsäurerest

AIa: Alaninrest

Asn: Asparaginrest

Leu: Leucin rest

Phe: Phenylalaninrest

GIy: Glycinrest

His: Histidinrest

Ser: Serinrest

Thr: Threoninrest

He: Isoleucinrest

Trp: Tryptophanrest

Arg: Argininrest

Met: Methioninrest

Cys: Cysteinrest

Polydesoxyribonucleotide und Oligodesoxyribonucleotide werden durch Sequenzen der Desoxynucleotidreste dargestellt, deren Abkürzungen folgende sind:

A: 2'-Desoxyadenylsäurerest

C: 2'-Desoxycitidylsäurerest

G: 2'-Desoxyguanylsäurerest

T: Thymidylsäurerest

Wenn keine andere Angabe erfolgt, ist das linke Sequenzende der Desoxynucleotide das 5'-Ende.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, neue Substanzen zu entwickeln, die das retikuloendothiale System beeinflussen können, also in pharmakologisch wirksamen Zusammensetzungen mit Antitumoraktivität eingesetzt werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen, physiologisch wirksamen Polypeptids zu entwickeln, eine für menschliche TNF kodierende DNA bereitzustellen, insbesondere eine replikable rekombinante DNA, die aus einer für menschliche TNF kodierende DNA und einem replikablen Expressionsvehikel besteht sowie einen Mikroorganismus bereitzustellen oder eine Zelle, transformiert mit einer rekombinanten DNA der oben genannten Art und ein menschliches, physiologisch wirksames Polypeptid zu entwickeln.

Die vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen ein menschliches, physiologisch wirksames Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch die folgende Formel (I) dargestellt wird:

Das menschliche, physiologisch wirksame Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthält auch ein Polypeptid mit einer Aminosäure, an der Methionin am N-Ende der oben genannten Aminosäuresequenz gebunden ist und ein Zwischenprodukt mit einem partiellen oder vollständigen Signalpeptid für menschliche TNF, angefügt am N-Ende der oben genannten Aminosäuresequenz. Es ist möglich, einen Teil der Struktur der für ein Polypeptid kodierenden DNA durch natürliche oder künstliche Mutation ohne signifikante Aktivitätsänderung des Polypeptids zu ändern. Zu dem menschlichen, physiologisch wirksamen Polypeptid der vorliegenden Erfindung gehört ein Polypeptid mit einer Struktur, die der homologen Variante (s) des Polypeptids mit der oben genannten Aminosäuresequenz entspricht. Alle diese physiologisch aktiven Polypeptide sind hier als „menschliche TNF" bezeichnet.

Nach einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Desribonukleinsäure bereitgestellt, die eine Basensequenz hat, die für ein menschliches, physiologisch wirksames Polypeptid kodiert, wobei dieses menschliche, physiologisch wirksame Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die der folgenden Formel (I) entspricht:

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Desoxyribonukleinsäure, die zumindest eine Basensequenz enthält, die aus der Gruppe ausgewählt wurde, dieaus einer Basensequenz der folgenden Formel (II) besteht und einer komplementären Basensequenz zu dieser Basensequenz.

Ser

Ser

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He

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Lys

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He

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	CGA	ACC	CCG	AGT	GAC	AAG	CCT	GTA	GCC	-	-6- 251785
TCT	CCT	CAA	GCT	GAG	GGG	CAG	CTC	CAG	TGG	CAT	GTT
AAC	AAT	GCC	CTC	CTG	GCC	AAT	GGC	GTG	GAG	CTG	AAC
GCC	CTG	GTG	GTG	CCA	TCA	GAG	GGC	CTG	TAC	CTG	AGA
CAG	GTC	CTC	TTC	AAG	GGC	CAA	GGC	TGC	CCC	CTC	ATC
CAG	CTC	ACC	CAC	ACC	ATC	AGC	CGC	ATC	GCC	TCC	ACC
CTC	AAG	GTC	AAC	CTC	CTC	TCT	GCC	ATC	AAG	GTC	TCC
ACC	GAG	ACC	CCA	GAG	GGG	CCT	GAG	GCC	AAG	AGC	CCC
AGG	ATC	TAT	CTG	GGA	GGG	GTC	TTC	GAG	GTG	CCC	TGG
CCC	CTC	AGG	GCT	GAG	ATC	AAT	CGG	CCC	GAC	GAG	AAG
CGA	GAG	TCT	GGG	CAG	GTC	TAC	TTT	GGG	ATC	TAT	CTC
GCC									ATT	GCC

TCA TCT GTA GCA CGC CGG GAT AAC TAC TCC CAT GTG TAC CAG TGC CAG TAT GAG CCT GAC GAC TTT

und worin das linke Ende und das rechte Ende der Formel (H) entsprechend die 5'-Hydroxylgruppenseite und die 3'-Hydroxylgruppenseite darstellen.

Zur erfindungsgemäßen DNA gehört eine DNA, die eine Basensequenz mit ATG (A, T und G mit oben genannter Bedeutung) am 5'-Ende der oben genannten Basensequenz angefügt, um reife menschliche TNF mittels einer Mikroorganismen- oder Zellkultur herzustellen. Zur erfindungsgemäßen DNA gehört auch eine DNA mit einer 5'-flankierenden DNA, die für ein partielles oder vollständiges Signalpeptid menschlicher TNF kodiert.

Die Struktur einer DNA und die Struktur des davon abgeleiteten Polypeptids kann teilweise durch natürliche oder künstliche Mutation verändert werden, ohne daß dabei die Hauptaktivität des Polypeptids verändert wird. Deshalb kann die erfindungsgemäße DNA alternativ dazu eine Basensequenz aufweisen, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Struktur entsprechend der einer homologen Variante irgendeines der zuvor genannten Polypeptide hat.

In Übereinstimmung mit der Degeneration des genetischen Kodes ist es möglich, wenigstens eine Base der Basensequenz eines Gens durch eine andere Art von Base zu ersetzen, ohne daß die Aminosäuresequenz des vom Gen produzierten Polypeptids geändert wird. Deshalb kann die erfindungsgemäße DNA auch irgendeine Basensequenz haben, die durch Substituenten in Übereinstimmung mit der Degeneration des genetischen Kodes geändert worden ist. In diesem Fall ist die von der Basensequenz, die man durch die oben genannte Substitution enthält, abgeleitete Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz der Formel (I), wie sie oben definiert wurde, identisch.

Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine replikable rekombinante DNA bereitgestellt, die die oben genannte erfindungsgemäße Desoxyribonukleinsäure enthält und ein replikables Expressionsvehikel. Die rekombinante DNA ist in der Lage, in einen transformierten Mikroorganismus oder einer Zellkultur ein Polypeptid zu exprimieren, das die Aminosäuresequenz von menschlicher TNF enthält. Als geeignetes Vehikel können beispielsweise pHTNF-lacUV5-1, pHTNF-lacUV5-2 und pHtac4-Expressionsvehikel genannt werden.

Darüber hinaus ist die vorliegende Erfindung auf einen Mikroorganismus oder eine Zellkultur gerichtet, transformiert mit einer rekombinanten DNA, die in der Lage ist, ein Polypeptid zu exprimieren, das die Aminosäuresequenz von menschlicher TNF enthält. Beispiele derartiger Mikroorganismen oder Zellkulturen sind Escherichia coli, Bacillus subtilis. Hefen und höhere tierische Zellen.

Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des menschlichen, physiologisch wirksamen erfindungsgemäßen Polypeptids bereitgestellt, gekennzeichnet durch

(a) Ligieren der Desoxyribonukleinsäure der Formel (II), wie sie weiter oben definiert wurde, an ein replikables Expressionsvehikel, um eine replikable rekombinante DNA zu erhalten, die die Desoxyribonukleinsäure und das replikable Expressionsvehikel enthält;

(b) Transformieren von Zellen eines Mikroorganismus oder einer Zellkultur mit der replikablen rekombinanten DNA zur Bildung von Transformanten;

(c) Selektieren der Transformanten aus den Elternzellen des Mikroorganismus oder der Zellkultur;

(d) Inkubieren der Transformanten, Auslösen der Expression der Desoxyribonukleinsäure durch die Transformanten sowie Produzieren eines menschlichen, physiologisch wirksamen Polypeptids; und

(e) Isolieren des menschlichen, physiologisch wirksamen Polypeptids aus den inkubierten Transformanten.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die oben genannte erfindungsgemäße Polydesoxyribönukleinsäure an ein replikables Expressionsvehikel, wie ein Vektor, ligiert, um eine replikable rekombinante DNA zu erhalten, die die oben genannte Polydesoxyribönukleinsäure enthält. Ein Mikroorganismus oder eine Zellkultur wird mit der auf diese Weise erhaltenen replikablen rekombinanten DNA transformiert, um einen transformierten Mikroorganismus oder eine Zellkultur zu erhalten, die die rekombinante DNA enthält. Die auf diese Weise erhaltene Transformante wird aus dem Eiternmikroorganismus oder der Zellkultur mittels eines mit der DNA verliehenen phänotypischen Merkmals isoliert. Den auf diese Weise erhaltenen transformierten Mikroorganismus oder die Zellkultur läßt man wachsen, um die Expression der genetischen Information zu bewirken, die auf der oben genannten Desoxyribonukleinsäure einkodiert ist, wodurch ein erfindungsgemäßes physiologisch wirksames Polypeptid produziert wird.

Darüber hinaus ist die vorliegende Erfindung auf eine menschliche TNF in reifer Form gerichtet, abgesondert von den Wirtszellen als ein direktes Expressionsprodukt. Als Verfahren zum Erhalten einer solchen reifen, menschlichen TNF kann beispielsweise ein Verfahren dienen, bei dem eine DNA-Sequenz aufgebaut wird, die hinsichtlich einer Aminosäuresequenz, die als Signalpeptid bekannt ist, zusammengesetzt aus 15 bis 40 aus einem Mikroorganismus oder einem höheren tierischen Lebewesen herrührenden Aminosäuren, an den Terminus der Aminosäuresequenz der reifen TNF gebunden wird. Die menschliche TNF kann folgendermaßen erhalten werden:

1. Es wird eine Bakteriophagew/Kaninchengenombibliothek und eine BakteriophagenVMenschengenombibliothek verwendet, die von Prof.T. Maniatis, Abt. Biochemie und Molekularbiologie, Harvard Universität, 7 Divinity Avenue, Cambridge, Massachusetts 02138, USA, hergestellt wird. Diese Materialien können nachfolgenden Verfahrensweisen hergestellt werden (siehe Cell. 15, S. 687,1978)

(1) Kaninchen- oder menschliches Gewebe, beispielsweise Kaninchen- oder menschliches Pankreasgewebe wird zu einem gefrorenen Pulver reduziert und behandelt, um RNA und Proteinmaterialien zu verdauen und bei Fällung Kaninchen- oder menschliche DNA mit hoher Molekülmasse zu erhalten.

(2) Die DNA mit hoher Molekülmasse wird teilweise verdaut für das Randbeschneiden im Hinblick auf den Genort;

(3) die resultierenden DNA-Fragmente sind größenfraktioniert, sie ergeben 15 bis 20 Kilobasenpaar (kb)-Fragmente;

(4) die erhaltenen Fragmente von Stufe 3 werden kloniert unter Verwendung eines π Charon 4A Phagenvektors; und

(5) die erhaltenen Vektoren werden in vitro in infektiöse Phagenteilchen eingeschleust, die rDNA enthalten, um die oben genannte Kaninchen- oder menschliche Genbibliothek zu erhalten.

2. Die Kaninchen-TNFcDNA, die im Bezugsbeispiel 3 erhalten wird, ist ³²P-markiert durch P.W.J.Rigby etal's Nick-Translationsmethode (siehe J.Mol. Biol. 113, S.237 [1977]).

3. Sowohl die Bakteriophage η/Kaninchen-Genbibliothek als auch die Bakteriophage 77/Menschen-Genbibliothek wurden auf wesentliches Zusammenfließen auf einem Bakterienrasen ausplattiert und mit der ³²P-markierten Kaninchen-TNFcDNA auf Hybridisierung gescreent.

4. Aus den entsprechenden Klonen wurde die korrespondierende DNA isoliert, Restriktions-kartiert und analysiert durch Southern-Hybridisierung (siehe E. M.Southern, J. Mol. Biol., 98, S.503 [1976]).

Die die Kaninchen- oder menschlichen T.NF-Gene enthaltenden Restriktionsfragmente wurden in Plasmidvektoren subkloniert und dann sequenziert.

5. Die Basensequenz der Kaninchen-TNF cDNA wurde verglichen mit der des Kaninchen-TNF-Gens, um die Exons (gewisse Sequenzen der Basen, die für die Aminosäuresequenz von Kaninchen-TNF kodieren) und Introns (gewisse Basensequenzen, die nicht für die Aminosäuresequenz von Kaninchen-TNF kodieren) das Kaninchen-TNF-Gen zu bestimmen.

6. Danach wird die Basensequenz von menschlichem TN F-Gen mit der des Kaninchen-TNF-Gens verglichen, um die Exons und Introns des menschlichen TNF-Gens zu bestimmen.

7. Die Aminosäuresequenz von Kaninchen-TNF,.die von der Basensequenz abgeleitet worden ist, die man durch Deletion der Introns des Kaninchen-TNF-Gens und Kombinieren der Exons davon erhielt, wurde bestätigt, in Übereinstimmung mit der von der Basensequenz von Kaninchen-TNF-cDNA abgeleiteten.

8. Als nächstes wurde die Aminosäuresequenz von menschlicher TNF von der Bäsensequenz der DNA abgeleitet, die für menschliche TNF kodiert, erhalten durch Deletion der Introns vbn menschlichem TNF-Gen und Kombinieren der Exons davon. Die Aminosäuresequenz der menschlichen TNF wurde bestätigt als teilweise in Übereinstimmung mit der von Kaninchen-TNF.

9. Danach wurde die für menschliche TNF kodierende DNA in vitro für die Insertion in ein entsprechendes Expressionsvehikel zugeschnitten, um die rekombinante DNA zu bilden, die die kodierende DNA enthält. Die rekombinante DNA wurde dazu verwendet, eine entsprechende Wirtszelle zu transformieren, die man der Reihe nach in einer Kultur wachsen ließ und die gewünschte menschliche TNF zu exprimieren.

10. Die auf diese Weise hergestellte menschliche TNF hat 155 Aminosäurereste in ihrer reifen Form beginnend mit Serin. Wenn

sie in ihrer Pre-Sequenz ein Signalpeptid aufweist, ist das Signalpeptid vom Charakter her stark hydrophob, irnι bisher Beschriebenen wurde das Verfahren zum Erhalten des menschlichen TNF-Gens, der Basensequenz der DNA, die für menschliche TNF kodiert, und das Verfahren zur Herstellung der menschlichen TNF durch Verwendung der DNA offenbart. Diese Offenbarung sollte jedoch nicht so verstanden werden, daß damit die Erfindung eingeschränkt wird und naheliegende Veränderungen durch den Fachmann ohne Änderung der wesentlichen Charakteristika und damit das Grundkonzept der Erfindung vorgenommen werden können.

Wegen der variablen Verwendungsfrequenz eines Codons (genetischer Code), das mit jeder Aminosäure korrespondiert, und aus anderen Gründen, kann ein Teil oder der gesamte Abschnitt der Basensequenz der DNA, die für menschliche TNF kodiert, durch eine organisch-chemisch synthetisierte, künstliche DNA ersetzt werden, ohne daß die Aminosäuresequenz des daraus erhaltenen Polypeptide geändert wird.

Vermutlich wird die menschliche TNF intrazellulär in unreifer Form als ein Prepeptid oder Prepropeptid produziert, das über eine Zwischenform zu einer reifen TNF im Verfahrensstadium chemisch behandelt werden kann. Die unreife Form der menschlicher TN F kann von der Basensequenz des menschlichen TNF-Gens abgeleitet werden. Die TNF-DNA, die eine DNA enthält, die die TN F in unreifer oder in einer Zwischenform verschlüsselt, kann ebenfalls mit einer natürlichen oder künstlich hergestellten DNA rekombiniert werden.

Eine Anwendung dieser Technik ergibt sich durch Einbau des Methionincodons (ATG) in das 5'-Ende und Einbau von zumindest einem Stopcodon, das unter TAA, TAG und TGA ausgewählt wurde, in das3'-Ende der reifen oder des Zwischenproduktes odei der u η reif en TN F-ON A. Wegen des Vorhandensei ns des Methionincodons kann die reife TN F oder das Zwischen produkt oder die unreife TNF an der mRNA produziert werden, die mit Hilfe eines entsprechenden Promotors synthetisiert wurde. Allerdings wird der am N-Terminal der TNF angeordnete Methioninrest abgespalten oder nicht abgespalten, je nach Art der verwendeten Wirtszelle. Ziel des Einbaus des Stopcodons ist es, die Translation der von der TNF-DNA transskribierten mRNA an der entsprechenden Position zu stoppen (C-Terminal des Polypeptids der Formel I).

Eine andere Anwendung dieser Technik ergibt sich durch Anfügen einer stark hydrophoben Basensequenz, die als „Signalfrequenz" bekannt ist, an die DNA. Durch dieses Hinzusetzen wird es möglich, die TNF nach außerhalb der Wirtszelle abzusondern, oder im Falle eines gram-negativen Bakteriums, in den als „Periplasma" bekannten Raum. Falls ein Vektor mit einem darin enthaltenen Startcodon eingesetzt wird, kann ein fusioniertes Peptid hergestellt werden, das aus der menschlichen TNF und ein an den Vektor angefügtes Peptid besteht. In diesem Falle kann das fusionierte Peptid chemisch oder enzymatisch gespalten werden. Alternativ dazu kann das fusionierte Peptid so eingesetzt werden, wie es ist, wenn die Hauptaktivität der menschlichen TNF nicht entgegengesetzt beeinträchtigt wird.

Die menschliche TNF-DNA kann in ihrem Bereich oberhalb (stromaufwärts) des 5'-Endes an die Gensequenz eines Promotors gebunden werden, wodurch man eine TNF-DNA-Promotorsequenz erhält, die deren Replikation nicht behindert und keine entgegengesetzt beeinträchtigte Translation der erhaltenen RNA hervorruft. Die auf diese Weise erhaltene TNF-DNA-Promotorsequenz kann mit einem Vektor kombiniert werden, der in einem Bakterium oder einer Zelle eines höheren Organismus replikabel ist, um ein rekombinantes Gen zu erhalten. Das so erhaltene rekombinante Gen kann dazu benutzt werden, ein als Wirt verwendetes Bakterium oder eine Zelle eines höheren Organismus zu transformieren. Die derart erhaltene Transformante kann kultiviert werden, um die Expression des TNF-Gens zu bewirken, um die menschliche TNF zu produzieren.

Wenn Escherichia coli als oben genannter Wirt benutzt wird, so können als geeigneter Wirt verschiedene Mutantenstämme von E- coli K-12 benannt werden, wie HB 101 (ATCC 33694), C 600 K(ATCC 33955), D 12010, RRI (ATCC 31343), MC 1061, LE 392 (ATCC 33572), JM 101 (ATCC 33876), JM 83 (J. Vieira und J. Messing, Gene, 19, 259-268 [1982]), JM 103 (Ray Wu et al., Method in Enzymology, Bd. 101, Academic Press, New York) JM 83 und X¹⁷⁷⁶ (ATCC 31 244). Wenn ein E. coli-Wirt verwendet wird, können als geeigneter Vektor genannt werden Plasmide wie pBR 322, pBR 325, pBR 327, pUC 8, pUC 9, pMB 9 (ATCC 37019), pJB 8 (ATCC 37074) und ρKC 7 (ATCC 37084). R-Phagen_twie Rgt, RB und Charon 4A und der M13-Phage. Um TNF in der E. coli-ZelIe produziert zu erhalten, kann ein Promotor verwendet werden, der unter den Promotoren von E. coli und Phagen-Genen ausgewählt wird. Beispiele für geeignete Promotoren sind die Gene für das Lactoseabbauenzym (LAC), der UV5-Mutant davon, Penicillinase (BLA) und Tryptophansynthease der ein fusionierter Promoter von Tryptophansynthease und dem Lactoseabbauenzym darstellt.

Wenn als Wirt Bacillus subtilis verwendet wird, können als geeignete Wirte genannt werden: Der BD 170-Stamm (ATCC 33608), der BR 161-Stamm (ATCC 33677) und der Ml 112-Stamm (ATCC 33712). Fallsein Bacillus subtilis-Stamm verwendet wird, können als geeigneter Vektor genannt werden die Plasmide pC 194 (ATCC 37034), pUB 110 (ATCC 37015), pSA 2100 (ATCC 37014) und pE 194. Weiterhin können, wenn ein Bacillus subtillis-Wirt eingesetzt wird, als geeignete Promotoren die Gene für das Chloramphenikol-Acetylierungsenzym (CAT), Penicillinase und Anti-Erythromycin genannt werden. Wenn eine Hefe als Wirt verwendet wird, können als geeigneter Wirt genannt werden Stämme von Saccharomyces cerevisiae wie RH 218 (ATCC 44076), SHY 1 (ATCC 44769), SHY 3 (ATCC 44771), D 131 A, 483 und 830. Wenn der Hefewirt zum Einsatz kommt, können als geeignete Vektoren genannt werden Plasmide wie YEp 13 (ATCC 37115), YEp 6, YRp 7 und YIp 5. Weiterhin können, wenn ein Hefewirt verwendet wird, als geeignete Promotoren die Gene für saure Phosphatase, Alkoholdehydrogenase (ADHI), Tryptophansynthease (TRP), Phosphoglyceratkinase (PGK), Catochrom B (COB) und Actin genannt werden. Wenn eine Zellkultur eines höheren Organismus als Wirt eingesetzt wird, können als geeigneter Wirt die Zellkulturen der Affenniere, COS und Maus C 127 (ATCC 1616) genannt werden. Für den Fall, wo als Wirt eine Zellkultur eines höheren Organismus eingesetzt wird, können als geeignete Vektoren SV 40 Virus genannt werden. · Das neue menschliche, physiologisch wirksame Polypeptid der vorliegenden Erfindung ruft Nekrose von Tumoren ohne toxischen Effekt gegenüber dem Normalgewebe des lebenden Körpers hervor. Das wirksame Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann nach bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutische Zusammensetzungen herzustellen, die für die Inhibierung des Zellwachstums von z.B. malignem Tumorzeil wachstum nützlich sind. Das wirksame Polypeptid kann kombiniert im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägervehikel vorliegen. Eine wirksame Menge des erfindungsgemäßen aktiven Polypeptids kann mit einer geeigneten Menge des Vehikels vermischt werden, um pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen zu bilden, die für eine wirksame Verabreichung an den Rezipienten geeignet sind. Das physiologisch wirksame Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann als Injektion, Augentropfen, Nasentropfen, Inhaliermittel, Zubereitung zur äußeren Anwendung, orales Mittel, rektales Mittel oder Vaginaltablette an Patienten verabreicht werden, die eine Antitumor- oder antivirale Behandlung benötigen. Die Tagesdosis des erfindungsgemäßen Polypeptids kann pro Erwachsenen im allgemeinen zwischen 50 und 100000000 Einheiten liegon. Sie kann im Falle der lokalen Verabreichung vorzugsweise im Bereich von 50 bis 500000 Einheiten liegen, im Falle derallgemeinen Injektion wie intravenös und intramuskulär von 1 000 bis 1 000000 Einheiten und im Falle der oralen Verabreichung zwischen 10000 und 100000000 Einheiten. Die Tagesdosis kann erhöht oder verringert werden entsprechend der Gebrauchsanweisung und den Symptomen des Rezipienten.

Unter dem oben verwendeten Begriff „1 Einheit" ist eine Menge des erfindungsgemäßen, physiologisch wirksamen Polypeptids zu verstehen, bei der 50% von 1 χ 10^s Zellen/ml L-M-Zellen (American Type Culture Collection CCL 1,2) abgetötet werden. Die oben genannte Menge wird wie folgt gemessen. Als Kulturgefäße werden Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen eingesetzt, hergestellt von Flow Laboratories Inc. (USA), Die L-M-Zellen_;werden in Eagel's Minimalmedium kultiviert, das 1 % (Vol/Vol) fötales Rinderserum enthielt (die Zusammensetzung dieses Mediums ist beispielsweise beschrieben in Tissue Culture [Gewebekultur], Hrsg. Junnosuke Nakai et al., AsakuraShoten, Japan [1967]). Eine Probe (0,1 ml) reihenweise verdünnt mit dem Medium und der L-M-Zellsuspension (0,1 ml, 1 χ 10⁵ Zellen/ml) wurden in jeder Vertiefung der Platten vermischt, und die Platten wurden dann bei 37°C für 48 Stunden unter Luft, die 5% Kohlendioxid enthielt, inkubiert. Nach Beendigung der Kulturperiode wurden 20ml Glutaraldehyd hinzugesetzt, um die Zellen zu fixieren. Nach der Fixierung wurden die Platten mit destilliertem Wasser gewaschen und zum Trocknen stehengelassen. Dann setzte man 0,05%igen Methylenblau (0,1 ml) hinzu, um die lebenden Zellen anzufärben. Die Platten wurden gründlich¹ mit destilliertem Wasser gewaschen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen und zum Trocknen stehengelassen. 0,36 N Salzsäure wurde jeder Vertiefung hinzugegeben, um den Farbstoff aus den angefärbten Zellen zu entfernen. Die Absorptionsfähigkeit jeder Vertiefung wurde bei 665 nm mit einem Titertek Multiskan von Flow Laboratories Inc. gemessen. Die Absorptionsfähigkeit ist proportional der Anzahl der lebensfähigen Zellen. Die oben genannte Menge an erfindungsgemäßem physiologisch wirksamen Polypeptid, bei dem 50% von 1 χ 10⁶ Zellen/ml L-M abgetötet werden, erhält man durch Kurvenauswertung der Verdünnung gegen die Absorptionsfähigkeit in einer grafischen Darstellung.

Das physiologisch wirksame Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann geeignet parenteral verabreicht werden. In der parenteralen Zubereitung kann als Additiv ein Verdickungsmittel wie Saccharose, Glycerin, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder ähnliches und/oder ein pH-Wert einzustellendes Mittel wie verschiedene anorganische Salze hinzugegeben werden. Die Polypeptide können auch geeignet in Form von Tabletten verabreicht werden, in die Tablette kann als Additiv ein Vehikel wie Stärke, Lactose oder ähnliches eingearbeitet werden.

Als Ergebnis von Tierexperimenten wurden gefunden, daß ein Mäusetumor in den meisten Fällen durch nur ein oder zwei Injektionen vollständig geheilt wurde. Insbesondere wurde ein Aliquot künstlicher neoplastischer Zellen (Meth-A-Zellen) auf die Haut jeder Maustransplantiert. Als der Tumor beim Wachstum einen Durchmesser von 6 bis 7 mm erreicht hatte, wurden nur 0,6Mg des erfindungsgemäßen Polypeptids injiziert. Eine Woche später bildete sich Schorf. Zwei Wochen später begannen Haare zu wachsen, was die vollständige Heilung des Tumor bedeutete. Später wurde für die Maus prägnanter und erfolgreicher Nachwuchs beobachtet.

Die Mikroorganismen und die neuen Plasmide wurden bei der American Type Culture Collection in Rockville, USA am 6.4.1984 in Form von Proben der Mikroorganismen, die die Plasmide enthielten, hinterlegt. Der Mikroorganismus E. coli K12 Stamm JM83 (pRGE) erhielt die ATCC-Nummer 39655. Der Mikroorganismus E. coli K12 Stamm JM83 (pHGE) erhielt die ATCC-Nummer 39656.

Die vorliegende Erfindung wird detaillierter im Hinblick auf die folgenden Bezugsbeispiele und Arbeitsbeispiele in Verbindung mit den dazugehörigen Zeichnungen beschrieben, die aber nicht zur Beschränkung des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung dienen sollen

Es zeigen:

Fig. 1: die Restriktionskarten von Plasmideinlagen, die jeweils eine DNA enthalten, die für ein konventionelles, physiologisch

wirksames Kaninchenpolypeptid kodiert; Fig.2: ein Fließbild des Herstellungsverfahrens einer rekombinanten DNA (pTNF-lac-1), die für konventionelles, physiologisch

wirksames Kaninchenpolypeptid kodiert; Fig. 3: ein Fließbild des Herstellungsverfahrens einer anderen rekombinanten DNA (pTNF-lacUV5-1), die für konventionelles,

physiologisch wirksames Kaninchenpolypeptid kodiert; Fig. 4: die Restriktionskarte des Teiles eines Plasmids, das ein Gen für menschliches, physiologisch aktives Polypeptid der

vorliegenden Erfindung enthält; Fig. 5: die Restriktionskarte des Teiles eines Plasmids, das ein Gen für ein konventionelles, physiologisch wirksames Polypeptid

enthält; Fig. 6: ein Fließbild des Herstellungsverfahrens einer rekombinanten DNA (pHTNF-lacUV5-1), die für ein menschliches,

physiologisch wirksames Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert; und Fig.7: ein Fließbild des Herstellungsverfahrens einer anderen rekombinanten DNA (pHTNF-lacUV5-2), die für das menschliche, physiologisch wirksame Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert.

Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung erfolgen die Konstruktion einer rekombinanten DNA und der Einbau einer rekombinanten DNA in einen Mikroorganismus in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das in den folgenden Versuchsberichten (Literaturstellen [1] bis [4]) beschrieben worden ist, wenn nichts anderes angegeben ist.

(1) Yasutaka Takagi, Manual For Genetic Engineering. Kodan-aha, Tokio.

(2) Yasutaka Takagi, Experimental Method in Genetic Engineering, Kodan-aha, Tokio.

(3) T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sam Brock, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

(4) Ray Wu et al.. Method in Enzymology, Bd. 101, Academic Press, New York. Abkürzungen in den Bezugsbeispielen und Beispielen

MOPS: Morpholinpropansulfonsäure

LB-Medium: Luria-Bertani-Medium

DMSO: Dimethylsulfoxid

PFU: Plaque-bildende Einheit

EDTA: Ethylendiamin-Tetraessigsäure

SDS: Natriumdodecylsulfat

BRL: Bethesda Research Laboratories Inc.

DMT: Dimethoxytrityl

Iac: Lactose

Tris: Tris(hydroxymethyl)aminomethan

Xar-5: Röntgenfilm, hergestellt und vertrieben von der Eastman Kodak Comp., USA

IxSSC: 0,15MNaCI + 0,015MNatriumcitrat,pH7

2 χ SSC: 0,30 M NaCI+ 0,030 M Natriumeitrat, pH 7

3 x SSC: 0,45 M NaCI+ 0,045 M Natriumeitrat,pH 7

5 χ SSC: 0,75 M NaCI + 0,075 M Natriumeitrat, pH 7

6 χ SSC: 0,9 M NaCI+ 0,09 M Natriumeitrat, pH7

FDSS: 50%deionisiertes Formamid + 5 χ Denhardt's + 5 x SSPE + 0,1 %SDS + 100iig/ml denaturierte Kalbsthymus

-DNA

(SSPE : 0,18 M NaCI + 1OmM NaH₂PO₄ + 1 mMEDTA, pH 7,4) SM: Phagenaufbewahrungsmedium, das 5,8 g NaCI, 2 g MgSO₄ · 7 H₂0,50 ml 1 M Tris HCI (pH 7,5) und 5 ml 2%ige

Gelatine pro Liter enthält

NZ-Brühe: Medium,das 10g NZ-Amin,5g NaCI und2g MgSO₄'7 H₂Oenthält (NZ-Amin ist ein Typ-A-Hydrolysat von Casein, hergestellt und vertrieben von der Humko Sheffield Chemical

Division der Kraft Inc., USA)

IPTG: Isopropylthiogalactosid

X-gal: ö-brom^-chlor-S-indolylgalactosid

TAE: 0,04MTrisacetat(pH8,0)-0,002M EDTA, 5 χ Denhardt's Lösung: eine wäßrige Lösung, die pro Liter

1 OOOmgFicoll, 1 000 mg Polyvinylpyrrolidon und 1 000 mg BSAenthält bp: Basenpaar

Bezugsbeispiel 1

(Beurteilung der cytotoxischen Wirksamkeit gegen L-Zellen)

Die Beurteilung der cytotoxischen Wirksamkeit gegen L-Zellen der in den folgenden Bezugsbeispielen und Beispielen hergestellten physiologisch wirksamen Substanz erfolgt durch Messen von deren cytotoxischem Effekt auf L-929-Zellen (American Type Culture Collection CCL1) in Übereinstimmung mit der Methode von Ruff et al. (siehe Lymphokines, Bd. 2, hersg.

von E. Pick, Academic Press, N. Y. S. 235 [1980]) oder mit der im J. Immunol., 126, S. 1279 (1981) beschriebenen Methode. Das Verfahren zur Beurteilung der cytotoxischen Wirksamkeit der in den Beispielen hergestellten physiologisch wirksamen Substanz wird unten beschrieben.

Als Kulturbehälter wurden Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen eingesetzt, hergestellt von Flow Laboratories Inc. (USA). Die L-929-Zellen werden in Eagel's Minimalmedium kultiviert, das 1 % (Vol./Vol.) fötales Rinderserum und 5yng/ml (Endkonzentration) Actinomycin D enthielt (die Zusammensetzung dieses Mediums ist beispielsweise beschrieben in Tissue Culture (Gewebekultur), Hersg. JunnosukeNakai et al., AsakuraShoten, Japan [1967]). Eine Probe (0,1 ml) reihenweise verdünnt mit dem Medium und der L-929-Zellsuspension (0,1 ml, 1 x 10⁵ Zellen/ml) wurden in jeder Vertiefung der Platten vermischt, und die Platten wurden dann bei 37⁰C für 21 Stunden unter Luft, die 5% Kohlendioxid enthielt, inkubiert. Nach Beendigung der Kulturperiode wurden 20/xl Glutaraldehyd hinzugesetzt, um die Zellen zu fixieren. Nach der Fixierung wurden die Platten mit destilliertem Wasser gewaschen und zum Trocknen stehengelassen. Dann setzte man 0,05%igen Methylenblau (0,1 ml) hinzu, um die lebenden Zellen anzufärben. Die Platten wurden gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen und zum Trocknen stehengelassen. 0,36 N Salzsäure wurde jeder Vertiefung hinzugegeben, um den Farbstoff aus den angefärbten Zellen zu entfernen. Die Absorptionsfähigkeit jeder Vertiefung hinzugegeben, um den Farbstoff aus den angefärbten Zellen zu entfernen. Die Absorptionsfähigkeit jeder Vertiefung wurde bei 665 nm mit einem Titertek Multiskan von Flow Laboratories Inc. gemessen.'

Die Absorptionsfähigkeit ist proportional der Anzahl der lebensfähigen Zellen.

Die cytotoxische Wirksamkeit der physiologisch wirksamen Substanz, Einheit/ml, wurde ajs reziproke Verdünnung der physiologisch wirksamen Substanz definiert, die 50% Cytotoxizitat hervorruft, und kann durch Auswertung eines Diagramms erfolgen, bei dem die Verdünnung gegen die Absorptionsfähigkeit aufgetragen wurde.

Unter „1 Einheit", wie es in den Bezugsbeispielen verwendet wurde, ist eine Menge an Kaninchen-TNF zu verstehen, durch die 50% von 10⁵ Zellen/ml L-929-Zellen abgetötet wurden.

Andererseits wird die Proteinmenge durch ein Verfahren bestimmt, bei dem Coomassie Brilliantblau an Protein gebunden wird gemäß der Methode von Bradford et al. (siehe Anal. Biochem. Bd. 72, S. 248-254 [1976]).

Bezugsbeispiel 2

(Herstellung von TNF aus Kaninchenserum)

Weiblichen Kaninchen mit 2,5 bis 3 kg Masse wurden 50 mg in Formalin abgetöteten Propionibacteriumacnes(Corynebacterium parvum; Wellcome Research Laboratories, England) über die Ohrvene injiziert. Nach 8 Tagen wurden 100;u,g Endotoxin (Lipopolysaccharid ausEscherichiacoli 025:B6, hergestellt von Difoo Laboratories, USA) wiederum über die Ohrvene injiziert, und zwei Stunden später wurde das gesamte Blut aus dem Herzen gesammelt. Zu dem gesammelten Blut wurde Heparinnatrium in einer Menge von 100 Einheiten pro 100ml hinzugegeben. Das Blut wurde dann unter Kühlung bei 550U/min 30 Minuten zentrifugiert, um Blutzellen und unlösliche Feststoffe zu entfernen. Als Ergebnis erhielt man ein Plasma (2,4 Liter) von 40 Kaninchen mit einer cytotoxischen Aktivität der Serum-TNF von 3 x 10⁴ Einheiten/ml.

Stufe 2

(Teilweise Reinigung der TNF aus Kaninchenserum)

Zu dem in Stufe 1 erhaltenen Plasma (2,4 Liter) wurden 24g Cellit hinzugegeben. Das erhaltene Produkt wurde eine Stunde gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde mit 1,2 Litern 0,04 M Tris-HCI-Puffer (pH7,8) vermischt und anschließend auf eine Säule mit DEAE-Sepharose CL-6B (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Schweden) gegeben, ausreichend mit 0,04M Tris-HCI-Puffer (pH 7,8), der 0,1 M NaCI enthielt, ins Gleichgewicht gebracht. Die Säule wurde mit 0,04M Tris-HCI-Puffer gewaschen und die adsorbierende TNF mit 0,04 M Tris-HCI-Puffer (pH 7,2), der 0,18 M NaCI enthielt, eluiert. Die Fraktionen, die cytotoxische Aktivitäten gegen L-Zellen aufwiesen, wurden durch Ultrafiltration konzentriert. Das auf diese Weise erhaltene Konzentrat wurde auf eine Säule mit Sephacryl S-200 (hergestellt und vertrieben durch Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Schweden) gegeben, ausreichend mit 5mM Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gebracht und unter Einsatz des gleichen Puffers Gelfiltriert. Die aktiven Fraktionen wurden durch Ultrafiltration konzentriert, wobei eine gereinigte TNF mit einer Aktivität von 3,5 χ 10⁶ Einheiten und einer spezifischen Aktivität von 18 χ 10⁶ Einheiten/mg erhalten wurde.

Stufe 3

(Anti-TNF-Antikörper)

Die teilweise in Stufe 2 gereinigte Kaninchenserum-TNF wurde mit komplettem Freund-Adjuvans (1:1) vermischt und anschließend subkutan auf dem Rücken von 12 Wochen alten männlichen BALB/c-Mäusen injiziert. Die obige Verfahrensweise wurde 2 und 4 Wochen nach der anfänglichen Injektion wiederholt.

Eine Woche nach der letzten Injektion wurde das gesamte Blut gesammelt. Aus dem gesammelten Blut wurde ein Serum erhalten. Das so erhaltene Serum wurde in solchen Mengen zu dem Kulturmedium gegeben zur Beurteilung der cytotoxischen Aktivität von TNF gegen L-Zellen, daß es 500fach in der Endkonzentration vorlag. Die cytotoxische Wirksamkeit der Kaninchenserum-TNF gegen L-Zellen wurde in gleicherweise eingeschätzt wie im Bezugsbeispiel 1 beschrieben. Es wurde gefunden, daß die Kaninchenserum-TNF keine Cytotoxizitat gegen L-Zellen zeigt. Aus dem oben genannten Ergebnis kann geschlußfolgert werden, daß das in dieser Stufe erhaltene Mäuseserum einen Antikörper zur Kaninchenserum-TNF enthält (hier weiterhin als „Anti-TNF-Antikörper" bezeichnet).

Bezugsbeispiel 3

Stufe 1

(Herstellung von TNF-produzierenden Zellen)

Ein weibliches Kaninchen wurde intravenös mit Formalin abgetöteten Zellen von Propionibacterium acnes (Corpynebacterium parvum; Wellcome Research Laboratories, England) injiziert. Sieben Tage danach wurde das Kaninchen einer Tracheotomie unterzogen und die Lunge mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, wobei frei bewegliche (floating) Zellen erhalten wurden. Die so erhaltenen Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Unter Verwendung von RPM11640 (Flow Lab. Inc., USA) als Kulturmedium, das 10% Vol/Vol fötales Kalbsserum enthielt, wurden die Zellen bei 37⁰C unter Luft, die 5% Kohlendioxid enthielt, inkubiert. Die Zellkultur wurde in zwei Gruppen eingeteilt, und zu einer von beiden wurde Endotoxin von Escherichia coli (Lipopolysaccharid von Escherichia coli 026:86, hergestellt von Difoo Laboratories, USA) bei einer Konzentration von 10μς/ηιΙ gegeben. Die gleiche Menge an sterilem Wasser wurde zu der anderen gegeben. Das Überstehende der Zellkultur, zu der Endotoxin gegeben wurde, zeigt cytotoxische Wirksamkeit gegen L-Zellen, und die Aktivität erreicht den Maximalwert innerhalb von sieben Stunden. Eine solche Aktivität wurde durch die Anti-TNF-Antikörper zerstört, jedoch nicht durch normales Mäuseserum.

Andererseits zeigte das Überstehende der Zellkultur, zu dem kein Endotoxin gegeben worden war, keine Cytotoxizität gegen L-Zellen.

Stufe 2

(Molekülmasse von TNF)

Zu der in Stufe 1 hergestellten Zellkultur, zu der Endotoxin gegeben wurde, setzte man radioaktives L-[³⁵S]-Methionin (1 300Ci/ mmol, hergestellt von Amersham Ind. plc, England) hinzu. In Übereinstimmung mit dem Verfahren von Laemmli (siehe Laemmli,

U. K. [1970] Nature [London], Bd. 27, S. 680-685) wurde das Überstehende mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit ENHANCE® (Warenzeichen eines Produktes von New England Nuclear Inc., USA) behandelt und nach dem Trocknen auf einen Röntgenfilm (Fuji RX, hergestellt und vertrieben von Fuji Photo Film Co.

Ltd., Japan) sichtbar gemacht. In dem Überstehenden der Zellkultur mit endotoxin beobachtete man, daß sich eine Substanz mit einer Molekülmasse von etwa 17 500 gebildet hat.

Darüber hinaus wurde das Überstehende jeder in Stufe 1 hergestellten Zellkultur der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in gleicherweise wie oben beschrieben unterzogen. Danach wurde das Gel in 2,5% NP40® (oberflächenaktives Mittel von Calbiochem., USA) eine Stunde geschüttelt und danach in Wasser für zwei Stunden. Nach dem Schütteln wurde jede Migrationsspur durch Schneiden voneinander getrennt und in Streifen von 2 mm Stärke geschnitten in einer Richtung senkrecht zur Migrationsrichtung. In der Spur, in der sich das Überstehende der Endotoxin enthaltenden Zellkultur entwickelte, wurde Cytotoxizität gegen L-Zellen bei einer Position festgestellt, die der der Molekülmasse 17500 entsprach. Bei anderen Positionen wurde keine Cytotoxizität beobachtet.

Stufe 3

(Extraktion von mRNA)

Die in Stufe 1 hergestellte Zellkultur wurde zwei Stufen nach der Endotoxinzugabe inkubiert, gefolgt von einer Zentrifugierung, um Zellen zu erhalten. Die Extraktion von cytoplasmatischer RNA aus den gesammelten Zellen und Extraktion von mRNA aus der cytoplasmatischen RNA wurde bewirkt gemäß dem Verfahren von Chirgwin et al. (siehe Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry, Bd.18, S.5294 [1979]). 4ml einer4M Guanidinthiocyanatlösung wurden zu 3 x 10⁸ Zellen hinzugegeben und das Gemisch mittels Homogenisator (Modell AM-7, hergestellt und vertrieben von Nihon Seiki Seisakusho, Japan) pulverisiert. Die Reste wurden durch Zentrifugieren entfernt, und darin wurden 2,4g Cäsiumchlorid gelöst. Das Gemisch wurde behutsam in ein Polyallomerrohr gegossen, in dem 2,5ml 5,7M Cäsiumchlorid und 0,1 M EDTA-Lösung (pH7,5) vorgegeben waren. Dann wurde es bei 30000U/min 12 Stünden bei 20°C ultrazentrifugiert in einem Beckmann SW41-Rotor (hergestellt und vertrieben von Beckmann Instrument, USA). Nach der Entfernung des Überstehenden wurde das Pellet in 1 ml 1OmM Tris-HCI-Puffer (enthaltend 5mM EDTA und 2% Masse/Vol SDS) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit einem 4:1-Volumengemisch Chloroform und 1 -Butanol extrahiert. Zur wäßrigen Phase wurden 0,05 Volumen(teile) 2 N Natriumacetat und 2,5 Voiumen(teile) Ethanol gegeben und bei -2O⁰C 2 Stunden oder mehr stehengelassen, um die RNA auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt, getrocknet und dann in 500 μΙ sterilem Wasser gelöst. Als Ergebnis erhielt man eine cytoplasmatische RNA-Lösung.

Die oben genannte RNA-Lösung wurde bei 68⁰C 2 Minuten erhitzt und danach schnell gekühlt. 500μΙ doppelter Konzentration 10 mM Tris-EDTA-Puffer (pH 7,4) (enthaltend 1 mM EDTA, 0,1 % Masse/Vol SDS und 0,5 M Lithiumchlorid) wurden zu der Lösung gegeben, das Gemisch auf einer Säule mit 200 mg Oligo-DT-Zellulose (hergestellt und vertrieben von Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) und mit 10 ml des gleichen Puffers (einfache Konzentration) wie oben beschrieben gewaschen. Das in der Säule zurückgebliebene Material wurde mit 2 ml eines Eluierungspuffers, der 1OmM Tris-HCI-Puffer, pH 7,1,1 MM EDTA und 0,1 % Masse/Vol SDS enthielt, eluiert. Zu dem Eluat wurden 0,05 Volumen(teile) 2 M Natriumacetatlösung und 2,5 Volumen(teile) Ethanol gegeben und das Gemisch bei -2O⁰C gekühlt, um eine Fällung hervorzurufen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und auf die Oligo-dT-Zellulosesäule gegeben. Die auf der Oligo-dT-Zellulose adsorbierten Fraktionen wurden gesammelt. 85 μg mRNA wurde gewonnen, wie durch Ultraviolettspektrum-Analyse bestimmt wurde.

Stufe 4

(Größenfraktionierung der mRNA)

880μg mRNA, hergestellt nach der gleichen Methode wie in Stufe 3 beschrieben, wurden in 250μΙ Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung wurde auf einen 10ml 5—25% linearen Saccharosedichtegradienten als Schicht aufgebracht. Der Saccharosedichtegradient wurde mittels ISCO 570 Gradienter (hergestellt und vertrieben durch ISCO Inc., USA) hergestellt unter Verwendung von Trispufferlösungen (enthaltend 25mM Tris-HCI [pH7,2], 2mM EDTA und 1 % Masse/Vol SDS), die entsprechend 5% Saccharose und 25% Saccharose enthielten.

Unter Verwendung eines Beckmann SW 41-Rotors wurde mit 40000U/min 12 Stunden bei 4⁰C ultrazentrifugiert und Fraktionen von jeweisl 400μΙ mittels eines Gerätes zur Fraktionsgewinnung (hergestellt und vertrieben durch Beckmann Instrument, USA) abgenommen und dann Ethanol-präzipitiert. Die präzipitierten Fraktionen wurden zentrifugiert und in sterilem Wasser gelöst.

Stufe 5 .

(Versuch zur Translation von mRNA)

Die Translation von mRNA unter Verwendung von Oocyten von Xenopus laevis (biologische Lehrmaterialien von Hamamatsu) wurde entsprechend dem in den Versuchsberichten beschriebenen Verfahren durchgeführt (beispielsweise Hiroshi Toraoka, Mikio Itsuki und KentaroTanaka „Protein, Nucleic acid, Enzyme", Genetic engineering, Sonderausgabe, 1981, S.602). Xenopus laevis wurde aus Hamamatsu — biologischen Lehrmaterialien hergestellt. Die in Stufe 4 erhaltene fraktionierte mRNA wurde in sterilem Wasser gelöst, um zu einer Konzentration von Ί μg/μ\ zu gelangen, und die Lösung wurde in Oocyten in einer geringen Menge von 5OnI pro Zelle injiziert. Die Zellen wurden dann 24 Stunden in Barth's Lösung (enthaltend 7,5mM Tris-HCI [pH7,6], 88mM NaCI, 1 mM Kaliumchlorid, 0,33mM (Ca(NO₃I₂,0,41 mM CaCI₂,0,82mM Magnesiumsulfat, 2,4mM Natriumbicarbonat, 18E/ml Penicillin G und 18/x/ml Streptomycin) kultiviert, die 1 mg/ml Rinderserumalbumin enthielt. Mit Hilfe eines Glasstabes wurden die Oocyten in der Kulturflüssigkeit zerdrückt. Danach wurde die Kulturflüssigkeit zentrifugiert und das Überstehende für die cytotoxische Aktivität gegen L-Zellen ausgewertet.

mRNA, die translatiert wird, ergibt ein Polypeptid mit maximalen Aktivitätssedimenten von einer Größe von 16S. Diese Aktivität wurde durch den in Stufe 3 des Bezugsbeispiels 3 erhaltenen Anti-TNF-Antikörper aufgehoben, nicht jedoch durch normales Mäuseserum.

Stufe 6

(Herstellung des Transformanten)

Unter Verwendung von 5Mg der in Stufe 4 erhaltenen fraktionierten mRNA wurde eine doppelständige DNA gemäß der in der Literatur (1), Seite 96, beschriebenen Verfahrensweise hergestellt. Als reverse Transkriptase wurde ein Produkt von Life Science, Inc., USA eingesetzt. Diedoppelsträngige DNA wurde auf einem 3,5%igen Polyacrylamid-Gel größenfraktioniert, und man erhielt eine 330ng Fraktion von etwa 1000 bis2000bp.

Gemäß der in der Literatur (1) beschriebenen Verfahrensweise wurden 7 ng dieser Fraktion mit desoxy-C-Resten verlängert unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyltransferase (hergestellt und vertrieben durch Bethesda Research Lab., Inc., USA) und zusammengeschlossen (annealed) mit 56ng des Plasmids pBR322, das mitPstI verdaut und desoxy-C-Resten verlängert worden war. Das so ringgeschlossene Gemisch wurde in den E. coli HK12-Stamm (HB 101, ATCC33694) insertiert, um den Stamm zu transformieren. Als Ergebnis erhielt man 12000 Transformanten.

Stufe 7

(Teilaminosäuresequenz von Kaninchen-TNF)

Kaninchen-TNF, teilweise gereinigt gemäß Bezugsbeispiel 2 (Aktivität: 5 x 10⁷ Einheiten), wurde wie in Stufe 2 zwecks Reinigung einer SDS-Poiyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Ein Teil des Gels wurde mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt.

Ein Streifen bei der Position, die mit der Molekülmasse von 17000 übereinstimmt, wurde vom Gel abgetrennt und mit 1%igem Ammoniumbicarbonat extrahiert. Etwa 180/u.g der TNF wurden als Protein zurückgewonnen.

150μ.Ι der zurückgewonnenen TNF wurden in 75/u.g 1%igem Ammoniumbicarbonat gelöst und anschließend 3μ9 TPCK-Trypsin (hergestellt und vertrieben von Worthington Biochemical, USA) hinzugegeben. Das Gemisch wurde bei 37°C 4 Stunden inkubiert. Dann wurde das Gemisch mittels einer Hochleistungsflüssigchromatografiesäule, die Cosmosil 5 C8 als Packungsmaterial enthielt (hergestellt und vertrieben von Nakarai Chimical, Ltd., Japan), fraktioniert, wobei man mit Trypsin verdaute Fragmente erhielt.

Die hochgereinigte TNF und die Trypsin-verdauten Fragmente davon wurden anschließend unter Einsatz einer Sephadex G-25-Säule entsalzen und schließlich gefriergetrocknet. Nach dem Verfahren von R. M. Hewick et al. (siehe J. Bipl. Chem. Bd. 256,

S. 7990-7997,1981) wurden die gereinigte TNF und die Trypsin-verdauten Fragmente jeweils dem Edman-Abbau vom N-Terminal her unterworfen. Die in jeder Stufe freigesetzte PTH-Aminosäure wurde durch übliche Verfahren über einen Hochleistungs-Chromatografen SP 8100 (hergestellt und vertrieben von Spectra Physics, USA) unter Verwendung von Solpacks ODS (hergestellt und vertrieben von E. I. du Pont, USA) als Säule analysiert. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß die TNF die folgende N-terminale Aminosäuresequenz aufweist:

Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln-, Eines der Trypsin-verdauten Fragmente hat die folgende N-terminale Aminosäuresequenz:

Glu-Thr-Pro-Glu-Glu-Ala-Glu-Pro-Met-Ala.

Stufe 8

(Synthese der Oligodesoxynucleotid-Sonde)

Es wurden Oligodesoxynucleotide synthetisiert, die komplementär zur Basensequenz der mRNA waren, die von der Aminosäuresequenz von Kaninchen-TNF abgeleitet worden war, die man in Stufe 7 des Bezugsbeispiels 3 erhalten hatte, gemäß der verbesserten Phosphotriestermethode, über die vom Erfinder bereits berichtet wurde (H. ltoet al., Nucleic Acid Res. 10, 1755-1769,1982). Bei der Herstellung der Oligodesoxynucleotide wurden 128 Oligodesoxynucleotide vermutlich von der Aminosäuresequenz von Kaninchen-TNF in fünf Gruppen eingeordnet; es waren dies die Gruppen 16,16,32,32 und 32, und sie wurden als Gemisch von Oligodesoxynucleotiden der entsprechenden Gruppen synthetisiert. Die erhaltenen Oligodesoxynucleotide der entsprechenden Gruppen wurden nach üblichen Verfahren entschützt und gereinigt über Säulenchromatografie unter Verwendung von Sephadex G 50 (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Schweden) Elektrophorese auf einem 20 Ma.-%igem Polyacrylamidgel, das 7 M Harnstoff enthält und Säulenchromatografie unter Verwendung von DE52 (hergestellt und vertrieben von Whatman Ltd. USA). Die so erhaltenen Oligodesoxynucleotide der entsprechenden Gruppen wurden gegen 0,1 mM Tris-EDTA-Pufferlösung dialysiert.

Jedes der gereinigten Oligodesoxynucleotide der entsprechenden Gruppen wurde unter Verwendung von T₄-Polynucleotidkinase (hergestellt und vertrieben von Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) und y-³²-P-Adenosintriphosphat nach üblichen Methoden markiert und dann durch Säulenchromatografie unter Verwendung von DE 52 (hergestellt und vertrieben von Whatman Ltd., USA) gereinigt. Das radioaktive Material wurde in jedes der Oligodesoxynucleotide der entsprechenden Gruppen in einer Menge von etwa 3 x 10¹⁸cpm//ug eingebracht. Die Oligodesoxynucleotjdsonden, jeweils in Form eines Gemisches der entsprechenden Gruppe erhalten, sind wie aus Tabelle 1 zu entnehmen bezeichnet wurden.

Teil der Aminosäuresequenz der Kaninchen-TNF, der Basensequenz der mRNA, berechnet von der Aminosäuresequenz der Kaninchen-TNF und der Basensequenz der synthetischen Oligodesoxynucleotidsonden der entsprechenden Gruppen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Aminosäure- Sequenz	Carboxy- terminal...	AIa	Met	Pro	GIu	AIa	GIu	GIu...	Amino- terminal
mRNA	3'...	XCG	GTA	XCC	YAG	XCG	YAG	YAG...	5'

Sonde MH	5'	GC	CAT	MGG	MTC	GGC	MTC	MTC	3
Sonde Ml	5'	GC	CAT	NGG	MTC	GGC	MTC	MTC	3
Sonde MJ	5'	GC	CAT	ZGG	MTC	AGC	MTC	MTC	3
Sonde MK	5'	GC	CAT	ZGG	MTC	CGC	MTC	MTC	3
Sonde ML	5'	GC	CAT	ZGG	MTC	TGC	MTC	MTC	3

Bemerkung: X stellt einen Ribonucleinsäurerest von A, C, G oder U dar

Y stellt einen Ribonucleinsäurerest von A oder G dar

M stellt einen Desoxyribonucleinsäurerest von T oder C dar

N stellt einen Desoxyribonucleinsäurerest von A oder G dar

Z stellt einen Desoxyribonucleinsäurerest von A, C G oder T dar.

mRNA der zeilproduzierenden TNF, die man gemäß Stufe 3 des Bezugsbeispiels 3 erhielt, wurde mit einer Lösung, die 1 M Glyoxal, 1OmM NaH₂PO₄ und 50VoI.-% Dimethylsulfoxid enthielt, bei 50⁰C über 60 Minuten behandelt und danach der Fraktionierung durch Elektrophorese auf einem 1,1 Ma.-%igem Agarosegel unterworfen. Die fraktionierte mRNA wurde auf ein Filter eines Transferblotting-Elektrophoresegerätes (hergestellt und vertrieben von Bio Rad, USA) gemäß Handbuch des Herstellers übertragen. Danach wurde diemRNAauf dem Gerätefilter mit einer 5 χ Denhardt's-Lösung,dieeine5 χ SSC-Lösung und 150/xg/ml denaturierte Lachssamenzellen-DNA enthielt, bei 65⁰C zwei Stunden behandelt und anschließend mit einer 5 χ Denhardt's-Lösung, die 1 χ 10⁷cpm/ml der markierten Oligodesoxynucleotide und eine 5 χ SSC-Lösung enthielt, bei 5O⁰C fürzwei Stunden. Dasoben genannte Filterwurde miteiner6 χ SSC-Lösung nacheinanderviermal bei Zimmertemperatur,40°C, 50°C und 60°C gewaschen. Ein XAR-5 Röntgenfilm (hergestellt und vertrieben durch Eastman Kodak Comp., USA) wurde durch Strahlung vom Filter aus exponiert. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die mit Sonde MJ bezeichneten Oligodesoxynucleotide am stärksten mit der mRNA hybridisiert waren, wodurch gezeigt wurde, daß die Oligodesoxynucleotide mit einer Basensequenz, die zur mRNA vollständig komplementär ist, in den mit Sonde MJ bezeichneten Oligodesoxynucleotiden enthalten waren. Stufe 9

(Klonieren desTNF-Gens des Kaninchens)

Nach der Literaturverfahrensweise (2), Seite 162, wurden die in Stufe 6 des Bezugsbeispiels 3 erhaltenen Transformanten auf einen Zellulosefilter übertragen und die DNA ddr Transformanten mit dem markierten Oligodesoxynucleotid (Sonde MJ), das in Stufe 8 des Bezugsbeispiels 3 ausgewählt wurde, unter den gleichen Bedingungen wie in Stufe 8 des Bezugsbeispiels 3 hybridisiert (Koloniehybridisierung). In dem gerade genannten Verfahren wurden 39 Kolonien, die mit den markierten Oligodesoxynucleotiden (Sonde MJ) stark hybridisiert worden waren, ausgewählt und darüber hinaus auf ein anderes Nitrozellulosefilter fixiert. Anschließend wurde unter Verwendung von 49 Kolonien die weitere Hybridisierung durchgeführt, um neun Kolonien auszuwählen, die stärker mit den markierten Oligodesoxynucleotiden (Sonde MJ) hybridisiert waren. Gemäß dem Plasmid-Schnelltrennverfahren der Literaturstelle (1), Seite 6, erhielt man etwa 5//,g Plasm.id von jeder der neun Kolonien. Jedes der erhaltenen Plasmide wurde unter Einsatz der Restriktionsenzyme Pst I, Tac I, Rsa I und Pvu Il (jedes hergestellt und vertrieben von Bethesda Research Lab., Inc., USA) geschnitten nach der im Handbuch des Bearbeiters beschriebenen Verfahrensweise, woran sich eine Elektrophorese auf einem 1 Ma.-%igem Agarosegel anschloß. Danach wurden die durch das Schneiden mittels der entsprechenden Restriktionsenzyme erhaltenen Fragmente im Hinblick auf ihre Länge verglichen. i

Die Ergebnisse zeigen, daß alle neun Stämme, die den neun Kolonien entsprachen, die Basensequenz des Fragments aufwiesen, das man durch Schneiden mit Pvull und Rsal erhält, und aus etwa 50bp bestanden, und daß die meisten der neun Stämme die Basensequenz des Fragments hatte, das man durch Schneiden mit Rsal erhält, und aus etwa 200bp bestanden. Mit änderet? Worten zeigen die Ergebnisse, daß die neun Stämme teilweise übliche Basensequenzen aufwiesen. Die Ergebnisse der Analyse durch die Restriktionsenzyme sind in Fig. 1 aufgeführt.

Getrennt davon wurden sieben Stämme, die in Tabelle 2 bezeichnete Plasmide enthielten, im 2ml LB-Medium, das 10μg/ml Tetracyclin enthielt, kultiviert bis die optische Dichte der Lösungen die in Tabelle 2 aufgeführten Werte erreichte und anschließend zentrifugiert, um entsprechende Stämme zu erhalten. Jeder der erhaltenen Stämme wurde getrennt in 2ml physiologischer Kochsalzlösung gegeben und mittels Ultraschall zerschlagen. Die erhaltenen Lösungen wurden zentrifugiert und für das Überstehende die cytotoxische Wirksamkeit gegen L-Zellen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten aufgeführt. Als Kontrollversuch wurden die gleichen Verfahren wie oben genannt mit einem Stamm durchgeführt, der das Plasmid pBR322 enthielt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 2 unten aufgeführt.

Tabelle 2	Anzahl der	OD600	Cytotox. Aktiv.
	ringgeschlossenen	1,369	gegen L-Zellen
	Basenphase	1,605	(Einheiten/ml)
Plasmid	1400	1,364	35
PB 2-2	800	1,618	<10
pB2-3	1060	1,458	<10
pB2-7	1550	1,438	<10
pR9	1400	1,514	15
pR12	1850	1,677	<10
pR18	1350		<10
pR25	0	<10
ρ BR 322

Die cytotoxische Aktivität gegen L-Zellen wurde durch Anti-TN F-Antikörper aufgehoben, sie wu rde jedoch nicht durch normales Mäuseserum aufgehoben. Dies zeigt, daß alle der oben genannten neun Kolonien Plasmide aufweisen, die für TNF kodierende Oligodesoxynucleodide enthalten.

Stufe 10

(Bestimmung der Basensequenz der für Kaninchen-TNF kodierenden DNA)

Die Plasmide pB2-7 und pR 18enthaltende E. coli-Stämme wurden in einem Liter M9-Medium, dasinder Literatur (3), Seite 440 beschrieben wurde und das 10/xg/ml Tetracyclin enthielt, kultiviert. Danach wurde gemäß Verfahrensweise der Literaturstelle (3), Seite 90, jedes der Plasmide in einer Menge von etwa 150^g isoliert.

Die Basensequenz des Inserts eines jeden Plasmids wurde nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren bestimmt (Maxam et al. „Method in Enzymology", 55, S. 490,1980, Academic Press). Die auf diese Weise bestimmte Basensequenz stimmte mit den Teilaminosäuresequenzen überein, die in Stufe 7 des Bezugsbeispiels 3 bestimmt worden waren. Somit ist die gesamte Sequenz der TNF des Kaninchens als aufgeklärt zu betrachten.

Stufe 11

In dieser Stufe wurde die Konstruktion eines Plasmids durchgeführt unter Verwendung des rekombinanten Plasmids pR12, um eine direkte Expression von TNF in E. coli unter Einsatz von Iac als Promotor zu erhalten. Die Verfahrensabläufe sind in Fig. 2 erläutert. Zuerst wurden 10/ng Plasmid pR 12 mit 10 Einheiten Apa I (hergestellt und vertrieben von Bethesda Research Lab., Inc., USA) bei 37°Cüber2 Stunden verdaut und auf einem 4Ma.-%.igen Polyacrylamidgel elektrophoretisiert, um 630bp-Fragmente zu isolieren. Etwa 1 μg des Fragments wurde vom Gel durch Elektroeluierung isoliert. In gleicher Weise wie in Stufe 8 des Bezugsbeispiels 3 wurden zwei Oligodesoxynucleotide synthetisiert, die in Fig.2 aufgeführt sind, wobei es sich um 5'-GATCCATGTCAGCTTCTCGGGCc-S' und

5'-CGAGAAGCtCACATG-S' handelt. Danach wurde jedes 5'-Ende des Oligodesoxynucleotids (etwa lOOpmol) unter Verwendung von T₄-Polynucleotidkinase nach dem Verfahren der Literaturstelle (3), Seite 122, phosphoryliert. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit Phenol und danach mit Chloroform extrahiert. Die so erhaltenen synthetischen Oligomere wurden mit 0,5/xg des Apa I 630bp-Fragmente vermischt und Ethanol-gefällt. Das Fragment wurde mit den synthetischen Oligomeren ligiert bei 4⁰C über Nacht unter Einsatz von 10 Einheiten T₄-DNA-Ligase gemäß Verfahren der Literaturstelle (1), Seite 37. Nach vollständiger Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit 20 Einheiten BamHI bei 37⁰C drei Stunden verdaut, gefolgt von einer Elektrophorese auf einem 4Ma.-%igem Polyacrylamidgel, um durch Elektroeluierung ein 670bp-Fragment zu gewinnen.

Ein Mikrogramm kommerziell erhältlichen Plasmids pUC-8 (Katalog Nr.4916, hergestellt und vertrieben von P-L Biochemicals, Inc., USA) wurde mit BamHI verdaut und anschließend mit Phenol und danach mit Chloroform extrahiert, gefolgt von einer Ethanolfällung, um einen Vektor zu erhalten. 0,5/j.g des erhaltenen Vektors wurden mit dem oben genannten Fragment ligiert, das BamHI-Stellen an seinen beiden Enden aufwies und etwa 670 bp enthielt, die für TNF kodieren, unter Verwendung von T₄-DNA-Ligase. Gemäß dem in Literaturstelle (1), Seite 20, beschriebenen Verfahren wurde E. coli unter Einsatz des oben genannten Vektors transformiert und auf einem Agarmedium, das 1mM IPGT und 0,004% (Masse/Vol) X-gal enthielt, kultiviert, um etwa 200 weiße Kolonien zu erhalten. Plasmid-DNA wurde aus 100 dieser Transformanten hergestellt und mit BamHI verdaut. Als Ergebnis wurde gefunden, daß 15 Plasmide des BamHI-Zielfragment (etwa 670bp) enthielten. Um die Insertionsrichtung zu überprüfen, wurden die obigen 15 Plasmide mit EooRI, verdaut, das nur eine Erkennungsstelie an seiner pUC-8 hat, und mit Pvull, das nur eine Erkennungsstelle an seinem etwa 670 Basenpaarfragmentteil hat und auf einem 6Ma.-%igem Polyacrylamidgel elektrophoretisiert. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß 7 Plasmide das gesuchte Fragment enthielten, bestehend aus etwa 140 bp, und daß die Transkriptionsrichtung des lac-Promotors auf pUC-8 sich in Übereinstimmung mit der für TNF kodierenden Oligodesoxynucleotide befindet.

Die DNA-Sequenzanalyse zeigt, daß diese sieben Plasmide die gleiche Sequenz aufweisen und die gewünschte Nucleotidsequenzan den Verbindungen zwischen dem lac-Promotor, der synthetischen DNA und der cDNA haben.

Die Konstruktion weiterer Plasmide erfolgte unter Verwendung des rekombinanten Plasmids pR 17, um die direkte Expression von TNF in E. coli unter Einsatz von lac UV5 als Promotor zu erhalten. Zuerst wurden 10^g des Plasmids pR17 mit 10 Einheiten von Apa I (hergestellt und vertrieben von Bethesda Res. Labi., USA) bei 37°C über zwei Stunden verdaut und auf einem 4Ma.-%igen Polyacrylamidgel elektrophoretisiert, um ein Fragment zu isolieren, das aus etwa 630 bp bestand. Etwa ein Mikrogramm des Fragments wurde aus dem Gel durch Elektroeluierung isoliert. In gleicher Weise wie in Stufe 8 wurden zwei Oligodesoxynucleotide, die in Fig.3 aufgeführt sind, synthetisiert, nämlich

5'- AATTCATGTCAGCTTCTCGGGCC - 3'und

5' -CGAGAAGCTGACATG -3'. Danach wurde jedes 5'-Ende der beiden Oligodesoxynucleotide (etwa lOOpmol) unter Verwendung von T₄-Polynucleotidkinase nach dem Verfahren der Literaturstelle (3), Seite 122, phosphoryliert. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit Phenol und danach mit Chloroform extrahiert. Die so erhaltenen synthetischen Oligomere wurden mit 0,5/xg des vorher genannten Apal-Fragments (etwa 630bp), das aus dem Plasmid pR17 hergestellt

worden war, vermischt und Ethanol-gefällt. Das Fragment wurde mit den synthetischen Oligomeren ligiert bei 4⁰C über Nacht unter Einsatz von 10 Einheiten T₄-Ligase gemäß Verfahren der Literaturstelle (1), Seite 37. Nach vollständiger Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit 20 Einheiten EcoRI bei 37°C drei Stunden verdaut, gefolgt von einer Elektrophorese auf einem 4Ma.-%igen Polyacrylamidgel, um durch Elektroeluierung zu einem Fragment (etwa 670bp) zu gelangen.

Gemäß der von F. Fuller beschriebenen Verfahrensweise („Gene", 19, S. 42-54,1982) wurde das Plasmid pOP95-15 hergestellt.

Ein Mikrogramm pOP95-15 wurde mit EcoRI verdaut und mit Phenol und anschließend mit Chloroform extrahiert, gefolgt von einer Ethanolfällung, um einen Vektor zu erhalten. Unter Verwendung von T₄-DNA-Ligase wurden 0,5yu.g des erhaltenen Vektors mit dem Fragment (etwa 670 bp), das man durch Ligieren des synthetischen Oligonucleotid mit dem für TNF kodierenden Oligonucleotid erhalten hatte, ligiert. Nach der Verfahrensweise von Literaturstelle (4), Seite 20, wurde E. coli JM101 (ATCC33876) unter Einsatz des oben genannten Vektors transformiert und auf einem Medium kultiviert, das 1 mM IPTG und 0,004% (Masse/Vol) X-gal enthielt, um etwa 150"weiße Kolonien zu erhalten. Aus 100 dieser Kolonien wurde Plasmid-DNA hergestellt und mit EcoRI verdaut. Als Ergebnis wurde gefunden, daß 12 Plasmide das angestrebte EcoRI-Fragment (etwa 670bp) enthielten. Um die Insertionsrichtung zu überprüfen, wurden die 12 Plasmide mit Pvu Il und Pst I verdaut und auf einem 1,5Ma.-%igen Agarosegel elektrophoretisiert. Als Ergebnis wurde festgehalten, daß vier Plasmide die gewünschten Fragmente

(etwa 1 280bp und etwa 2600bp) hatten und daß dieTransskriptionsrichtung des lacUV5-Promotors sich in Übereinstimmung mit denfürTNF kodierenden Oligodesoxynucleotiden befanden.

Die Basensequenzanalyse zeigte, daß diese vier Plasmide die gleiche Sequenz hatten und daß derlacUV5-Promotordas synthetische Oligodesoxynucleotid und die cDNA sauber miteinander gekoppelt hatte. Die erhaltenen Plasmide wurden als pTNF-lacUV5-1 bezeichnet.

Stufe 12 «.

(Reinigung der von E. coli produzierten TNF)

E. coli-Stämme, die gemäß Stufe 11 erhaltene Plasmide enthielten, wurden in 50ml LB-Medium, das Ampicillin enthielt, kultiviert. Danach wurden die Stämme auf 5 Liter LB-Medium, das 100^g/ml Ampicillin enthielt, übertragen und bei 37°C drei Stunden kultiviert. Isopropyl-ß-D-thiolgalactopyranosid (hergestellt und vertrieben von Sigma Chem. Comp. Inc., USA) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugesetzt. Es wurde weitere 6 Stunden kultiviert und dann abgekühlt. Die Stämme wurden durch Zentrifugieren gesammelt. In gleicherweise wie in Stufe 11 beschrieben, wurden die Stämme in 5 Liter 0,04 M Tris- HCI-Pufferlösung (pH7,8) gegeben und durch Ultraschall zerstört, um zu einer Stammproteinlösung zu gelangen. Die erhaltene Lösung wies eine cytotoxische Aktivität gegen L-Zellen von 5 χ 10⁷ Einheiten/l auf.

Die erhaltene Lösung wurde in gleicher Weise wie in Stufe 2 von Bezugsbeispiel 2 gereinigt, wobei man 1,2 χ 10⁶ Einheiten TNF erhielt. Die spezifische Aktivität der TNF betrug 6 χ 10⁷ Einheiten/mg.

Stufe 13

(Auswertung bei der Maus unter Verwendung von transplantiertem Meth A-Sarcom) .

2 χ 10⁵ Meth A-Sarcomzellen wurden intradermal in die Abdominalfläche einer BALB/c-Maus transplantiert, und sieben Tage später wurden die Mäuse mit Tumoren von 7 bis 8 mm Durchmesser und mit keiner spontanen Zentralnekrose für die Auswertung ausgewählt. Eine Probe (0,2 ml) der in Stufe 12 von Bezugsbeispiel 3 erhaltenen TNF und mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt wurde über die Schwanzvene injiziert. Die Aktivität der Probe wurde nach 24 Stunden entsprechend den folgenden Kriterien eingeschätzt:

(—): keineÄnderung

(+): leichte hämorrhagische Nekrose

(++): mittlere hämorrhagische Nekrose (zentrale Nekrose, die sich über annähernd 50% der Tumoroberfläche erstreckte) (+ ++): auffallende hämorrhagische Nekrose (massive Nekrose mit nur einem schmalen lebensfähigen Rand an der Tumorperipherie).

20 Tage nach Injektion der Probe erfolgten Beobachtungen der Tumore hinsichtlich der Rückbildung, und die Erholungsrate wurde an Hand der folgenden Gleichung bestimmt

E h lunasrate= Anzahl der Mäuse, die sich vom Tumor vollständig erholen

Anzahl derfürdenTesteingesetzten Mäuse Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Injektionsmenge Anzahl der Auswertung der Erholungs-

von Kaninchen-TNF, f. den Test Probenaktivität rate

produziert eingesetzten (nach einem Tag) (nach

von E. coli Mäuse 20 Tagen)

Einheiten/Maus - + ++ + + +

2x105	5	0	0	1	4	5/5
Blindversuch
(Phys. Kochsalzlösung)	5	5	0	0	0	0/5

Beispiel 1

Stufe 1

(Transformation von E. coli K12, Stamm MC 1061 mit pR18-, pB 2-7-und pB2-2-Plasmiden) Kolonien von E. coli K12, Stamm Mc 1061, wurden mit jedem der Plasmide pR 18, pB2-7 und pB 2-2 transformiert, die im Bezugsbeispiel 3 nach den üblichen Verfahren erhalten worden waren. Insbesondere wurden die Kolonien von E. coli K12, Stamm M 1061 in LB-Medium kultiviert, bis die optische Dichte der Kulturbrühe 0,3 bei 550 nm betrug. 50 ml der gewachsenen E.coli-Kultur wurden gewonnen mit 25ml Gemisch gewaschen, das 1OmM MOPS (pH7,0) und 1OmM RbCI enthielt und dann in einem 25ml Gemisch resuspendiert, das 0,1 M MOPS (pH6,5), 5OmM CnCI₂ und 1OmM RbCI enthielt. Die erhaltene Suspension

wurde auf Eis 30 Minuten gekühlt, zentrifugiert und suspendiert in einem Gemisch von 2 ml des oben genannten Gemisches, das 0,1 M MOPS (pH 6,5), 5OmM GaCI₂ und 1OmM RbCI sowie 30μΙ DMSO enthielt.

Zu einem 200/xl Aliquot der erhaltenen Suspension wurde separat 10μ! von jeder der Plasmid-DNA-Lösungen gegeben. Jedes der erhaltenen Gemische wurde auf Eis 30 Minuten gekühlt und anschließend einem Wärmeschock bei 44⁰C für 50 Sekunden ausgesetzt. Unmittelbar danach wurden 5ml des bei 37⁰C vorgewärmten LB-Mediums zu jedem der erwärmten Gemische gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37⁰C für eine Stunde. Die erhaltenen Kulturbrühen wurden jeweils zentrifugiert, um Zellpellets zu erhalten. Das Überstehende wurde verworfen, und zu jedem der Zellpellets wurde LB-Medium gegeben und gerührt, um diese zu resuspendieren. Jede der erhaltenen Suspensionen wurde auf einer LB-Agarplatte, die 30/u.g/ml Tetracyclin enthielt, beimpft. Als Ergebnis wurden Kolonien tetracyclinresistenter Transformanten erhalten, transformiert jeweils mit pR 18-, pB2-7- und pB2-2-Plasmiden.

Stufe 2

(Herstellung der pB2-7- und pR 18-Plasmid-DNA's)

Jede der Transformanten, entsprechend mit pB 2-7- und pR 18-Plasmiden, die in Stufe (1) erhalten worden waren, transformiert, wurde folgenden Arbeitsgängen unterworfen:

(1) Wachstum der Transformante und Amplifizierung des Plasmids;

(2) Ernten und Lysis der Transformante und (3) Reinigung der Plasmid-DNA gemäß der Verfahrensweise, wie sie auf S. 88-96 von T. Maniatis, E. F. Fritsch und J.Sambrock in „Molecular Cloning" (publ. von Cold Spring Harbor Laboratory, USA) beschrieben wurde.

Dabei wurde jede der Transformanten in LB-Medium das 30^g/ml Tetracyclin enthält beimpft und bei 37"C unter starkem Schütteln inkubiert. Dieser Schritt wurde wiederholt, um das Wachstum der Transformante und die Amplifizierungen des Plasmids zu erreichen. Das Transformantenkultur wurde durch Zentrifugieren bei 4000g für 10 Minuten bei 4⁰C gewonnen.

Das Überstehende wurde verworfen. Das erhaltene Pellet wurde in 100 ml eiskaltem STE 0,1 M NaCI, 10mMTris-CI (pH 7,8) und 1 mM EDTA gewaschen und der Lysis durch Kochen in einer Lösung von 20 mg/ml Lysozym in 10mMTris-CI, pH 8,0 unterworfen.

Das viskose Produkt wurde in ein Ultrazentrifugenrohr übertragen und bei 25000 U/min 30 Minuten bei 4⁰C zentrifugiert, um eine DNA-Lösung zu erhalten. Das Volumen der DNA-Lösung wurde gemessen. Für jeden Milliliter wurde genau 1 g festes Cäsiumchlorid hinzugegeben und mäßig gemischt, bis das gesamte Salz gelöst ist. 0,8ml einer Lösung von Ethidiumbromid (10 mg/ml in H₂O) wurden auf jede 10 ml Cäsiumchloridlösung hinzugegeben. Die endgültige Dichte der Lösung betrug 1,55 g/ml und die Konzentration von Ethidiumbromid annähernd 600/u.g/ml. Die Cäsiumchloridlösugn wurde in ein für das Zentrifugieren geeignetes Röhrchen übertragen, und der restliche Teil des Röhrchens wurde mit Leichtparaffinöl gefüllt. Das Zentrifugieren wurde bei 45OOOU/min über 36 Stunden bei 20°C durchgeführt, um zwei DNA-Zonen zu erhalten, wobei die obere Zone aus der linearen bakteriellen DNA und eingeschnürter ringförmiger Plasmid-DNA bestand und die untere Zone aus geschlossener ringförmiger Plasmid-DNA. Die untere Zone der DNA wurde in ein Glasröhrchen abgezogen über eine Subkutankanüle, die in der Seite des Röhrchens eingesetzt worden war. Das Ethidiumbromid wurde entfernt und die wäßrige Phase gegen TAE dialysiert.

Die Plasmid-DNA-Lösung wurde mit RNase behandelt und mit einem gleichen Volumen im Gleichgewicht befindlichen Phenol extrahiert. Die wäßrige Phase wurde auf eine Säule von BioGel A150 geschichtet, ins Gleichgewicht gebracht in TAE (pH 8,0) und 0,1 % SDS. Die DNA in der Säule wurde gewaschen, und es wurde ein Reservoir an TE mi-t 0,1 % SDS eingesetzt, um Fraktionen zu sammeln. Die Fraktionen wurden mit Ethanol gefällt, um eine reine Plasmid-DNA zu erhalten.

Bei Durchführung der obigen Verfahrensschritte erhielt man 250 /xg reiner pB2-7-Plasmid-DNA und 134/xg reiner pR18-Plasmid-

Stufe 3 . .

(Einschnürungstranslation von reinen pB2-7-und pR18-DNA-Plasmid-DNA's) Von der reinen pB2-7-Plasmid-DNA, die in der Stufe 2 erhalten wurde, wurden 40ju.g genommen, mit Pstl-Restriktionsenzym verdaut und einer Elektrophorese durch 4% Acrylamidgel unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde die DNA angefärbt und der gewünschte Streifen herausgeschnitten, um ein Pstl-Insert zu isolieren.

Unter Verwendung von 500ng des isolierten Pstl-Inserts würde die Abschnürungstranslation in der Weise durchgeführt, wie es von Maniatis, t. et al. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72,1184 (1975) beschrieben wurde. Für die Einschnürungstranslation wurde Einschnürungstranslationskitt eingesetzt, hergestellt und vertrieben von Bethesda Research Lab., Inc., USA sowie 80pmol fadioaktives dCTP in einem 25μΙ Reaktionssystem (bei 400Ci/mmol). Zu einem Gemisch^bestehend aus:

2,5|il Lösung A (dNTP's-Lösung)

2,5μΙ Lösung B (500ng Test-DNA, nämlich Pstl-Insert)

5/il heißes dCTP (3200Ci/mmol)

1,3μΙ kaltes dCTP (65pmol, 50pmol/ul dCTP)

11,2/xl (Lösung E H₂O)

22,5μΙ (gesamt)

wurden 2,5μΙ Lösung C (DNase I, DNA-PoIymerase I) gegeben und bei 15°Cfür 60 Minuten umgesetzt. Danach wurde Lösung D (Stop-Puffer) zu dem erhaltenen Gemisch zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Weiterhin wurde Träger-tRNA hinzugesetzt, zweimal mit Ethanol gefüllt, und in 500μΙ Wasser gelöst. Die spezifische Aktivität pro μg DNA betrug 9,3 x 10⁷cpm.

Im Hinblick auf die reine pR18-Plasmid-DNA, die in Stufe 2 erhalten wurde, wurden ebenfalls die oben beschriebenen Verfahrensschritte durchgeführt, um die Einschnürungstranslation zu bewirken. Die spezifische Aktivität pro μg DNA beträgt

Stufe 4

(Herstellung des Rsal-Insertfragments der pR18-Plasmid-DNA)

80μg der pR 18-Plasmid-DNA wurden mit Rsal-Restriktionsenzym verdaut und der Elektrophorese durch 4% Polyacrylamidgel unterworfen. Die folgenden gewünschten Insertstreifen wurden herausgeschnitten und mittels der BND-Säule gereinigt:

etwa640bp ZJTμ^ (Erholung 52%)

etwa175bp 1,77μρ (Erholung 50%)

Das oben genannte etwa 640 bp-lnsert wurde als3'-Fragment von pR18 bezeichnet (womit der 3'-untranslatierte Bereich von pR 18 gemeint ist) und das oben genannte etwa 175pb-lnsert als pR18-cfr (womit der kodierende Bereich von pR 18 gemeint

Darüber hinaus wurden die oben genannten Verfahrensschritte wiederholt unter Verwendung von Pstl und Mstll-Restriktionsenzymen anstelle des Rsal-Restriktionsenzym, um den folgenden Streifen zu erhalten:

etwa 450 bp 3,65 ,ug (Erholung 60%)

Das oben gennante Insert wurde als 5'-Fragment von pR18 bezeichnet.

Stufe 5

(Isolierung des menschlichen genomischen TNF-Gens)

Das in Stufe 3 von Beispiel 1 erhaltene ³²-P-markierte Piasmid-pB2-7-lnsert wurde als Hybridisierungssonde eingesetzt, um 10⁶-Plaques der Bakteriophage Charon 4 A/menschliche Genbibliothek zu screenen, hergestellt durch Insertion in die Charon 4 A EcoRI-Ligationsstelle (Blattneretal., Science, 196,161 [1977]) von klassierten Fragmenten als teilweise verdauter menschlicher DNA (Maniatiset al., Cell, 15, 687 [1978]). Das Plaquehybridisierungsverfahren von Benton und Davis (Benton und Davis, Science, 196,180 [1977]) wurde benutzt. Da nicht alles des Bakteriophagen in der Startkultur das nötige genetische Material für die Herstellung menschlicher TNF enthält, wurde eine Sonde mit der Basensequenz eingesetzt, die dem Kaninchen-TNF-Gen komplementär ist. Die DNA der Phagenplaques mit dem gewünschten genetischen Material enthielt die radioaktive Sonde und wurde durch ihre Radioaktivität identifiziert. Aus der Bibliothek wurden neue Hybridisierungsplaques isoliert.

Die benutzten Verfahrensabläufe und Bedingungen waren folgende:

1) Anzahl der Plaques:

~1 x 10⁶ Plaques (~ 4 χ 10⁴ Plaques/0150 mm Platte χ 25)

2) Transfer auf Nitrocellulosefilter: ' (siehe Benton und Davis, Science, 196,186 [1977]) :

3) Hybridisierung:

Zusatz von 1,25 x 10⁵cpm/ml der pB2-7-lnsertsonde, hergestellt in Stufe 3 von Beispiel 1,42°C, 19,5 Stunden

4) Waschen

2 x SSC - 0,1 % SDS bei Zimmertemperatur Immersion 10 Minuten x 4

1 x SSC-0,1% SDS bei 50°C Immersion 30 Minuten χ 2

5) Exponieren

XAR-5 (Eastman Kodak Comp., USA)

-80°C, 2 sich verstärkende Screens, 39 Stunden.

In das oben genannte Screening wurden 12 Stämme mitein bezog en. In gleicher Weise wie oben genannt₍wurde ein zweites Screening durchgeführt, bei dem man neun Stämme erhielt, die das gesuchte Fragment aufwiesen. Unter Verwendung dieser Stämme wurde ein drittes Screening in gleicher Weise wie oben aufgeführt vorgenommen, um neun Stämme mit dem gesuchten Fragment zu erhalten. Ein viertes Screening unter Verwendung der erhaltenen Stämme bestätigte, daß die neun Stämme das gesuchte Fragment enthielten. Die erhaltenen neun Bakteriophagen, die das gesuchte Fragment enthielten, wurden als HG-1 bis HG-9 bezeichnet

Stufe 6

(Isolierung des Kaninchen-genomischen TNF-Gens)

Es wurde im wesentlichen die gleiche in Stufe 5 von Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise wiederholt, mit der Ausnahme, daß 10⁶ Plaques der Bakteriophage Charon 4A/Kaninchengenombibliothek verwendet wurde, die unter Einsatz von verdauter Kaninchen-DNA (Maniatis et al., Cell, 15,687, [1978]) anstelle von verdauter menschlicher DNA hergestellt worden war, 6,7 x 10¹⁵ Plaques der Bakteriophage Charon 4A/Kaninchengenombibliothek wurden verwendet anstelle von 10⁶ Plaques der Bakteriophage Charon 4A/menschliche Genombibliothek. Somit erhält man zwei Bakteriophagenstämme (RG-1 und RG-2), die das Kaninchen-genomische TNF-Gen enthielten

Stufe 7

(Southern Blot-Analyse menschlicher Klone)

Unter Verwendung der Bakteriophagen HG-3, HG-6 und HG-7, die in Stufe 5 des Beispiels 1 erhalten wurden, erhält man DNA von jedem Bakteriophagen nach den folgenden Verfahrensschritten.

6 χ 10¹⁰ZellenvonE.coliLE392(Wirtszelle)wurdenin18miSMsuspendiertund3 x 10⁹PFU des Bakteriophagen hinzugesetzt, wodurch E. coli bei 37°Cfür 20 Minuten infiziert wurde. Danach wurde das erhaltene Gemisch in 3 Liter NZ-Brühe gegeben und die Kultur bei 37°C23 Stunden geschüttelt. Dann wurden 60ml CHCI₃ dem Gemisch zugesetzt und weitere 30 Minuten geschüttelt. Schließlich wurde das Gemisch mit NaCI bis zu einer Endkonzentration von 1 M versetzt, es wurde 15 Minuten stehengelassen und anschließend zentrifugiert, um das Überstehende zu erhalten. Danach wurde dem Gemisch Polyethylenglykol (Molekülmasse etwa 6000) zugegeben, so daß die Konzentration von Polyethylenglykol 10% (Masse/Vol.) betrug, und es wurde 22 Stunden bei 4°C stehengelassen. Durch Zentrifugieren wurden Bakteriophagen gesammelt. Die erhaltenen Bakteriophagen wurden in 28 ml SM suspendiert und ein gleiches Volumen CHCI₃ hinzugesetzt. Nach dem Rühren mittels Vortex für 30 Sekunden wurde das Gemisch zentrifugiert, um eine wäßrige Phase tii erhalten. Der wäßrigen Phase wurde SM bis zur Erreichung einer Gesamtmenge von 30 ml zugegeben. Zu dem erhaltenen Gemisch wurden 26,4g CaCI gegeben und allmählich gelöst, gefolgt von einer Ultrazentrifugierung (45000 U/min; 20 Stunden), um Bakteriophagen in Form einer Zone zu erhalten. Das erhaltene Gemisch mit den Bakteriophagen wurde gegen 1OmM NaCI-50mMTris(pH8) — 1OmM MgCI₂dialysiert. Danach wurden EDTA, ProteinaseKund SDS dem Gemisch zugesetzt, so daß deren Konzentration entsprechend 20mM,50/j,g/l und 0,5% (Masse/Vol.) betrug. Anschließend wurde das Gemisch bei 65⁰C eine Stunde lang behandelt und mit Phenol, einem Gemisch von Phenol und CHCI₃ (1:1, bezogen auf Volumenteile), und dann mit CHCI₃ extrahiert. Die erhaltene wäßrige Phase wurde gegen 1OmM Tris (pH8)- 1 mM EDTA dialysiert. Die Messung der UV-Absorption der erhaltenen wäßrigen Phase zeigte, daß man reine DNA des Bakteriophagen HG-3 erhalten hatte.

Im wesentlichen die gleichen Verfahrensschritte wie für die Darstellung der DNA des Bakteriophagen HG-3 beschrieben wurden wiederholt, um die DNA's der Bakteriophagen HG-6 und HG-7 zu erhalten

Man erhielt auf diese Weise 2910/xg HG-3,1100^g HG-6 und 819^g HG-7.

Gemäß der Southem-Methode (E. M. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503 [1975]) wurde die Southern Blot-Analyse der erhaltenen DNA's durchgeführt. Verfahren und Bedingungen waren folgende:

1) DNA

HG-3 825ng jeweils HG-6 935ng jeweils HG-7 685 ng jeweils

2) Verdauung mit verschiedenen Restriktionsenzymen: 10 Einheiten BamHI, 10 Einheiten EcoRI,

10 Einheiten BamHI + 10 Einheiten EcoRI

10 Einheiten Hindlll

10 Einheiten Hindlll + 10 Einheiten EcoRI

10 Einheiten Pvull

37⁰C, 3 Stunden

3) Elektrophorese: · · 0,8%Agarose-Gel

TAE 28 V,_15¹/2 Stunden

4) Transfer auf Nitrocellulosefilter:

(siehe E. M.Southern, J..Mol. Biol. 98, 503 [1975])

5) Pre-Hybridisierung: «? 30ml FD55

42⁰C, 6 Stunden

6) Hybridisierung:

5'-Fragment(1 x 10⁵cpm/ml von pR18 {hergestellt in Stufe 4 von Beispiel 1) 42⁰C, 14 Stunden

7) Waschen:

2 x SSC - 0,1 % SDS bei Zimmertemperatur Immersion 10 Minuten x 4

i

1 x SSC - 0,1 % SDS bei 50°C; Immersion 30 Minuten χ

8) Exponieren

XAR-5 (Eastman Kodak Company, USA) -8O⁰C, 2 sich verstärkende Screens, 14 Stunden Die Ergebnisse der Hybridisierung sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Tabelle 4

Enzym Klon Hybridisierungsfragmentgröße

(Bakteriophage) Sonde (pR 18)

5'-Ende 3'-Ende

Hg-3 6,7 kb

BamHI -6 11,2kb

-7 9,2 kb

BAMHI HG-3 2,9 kb

+ -6 2,9

EcoRI -7 2,9 kb

HG-3 2,9 kb

EcoRI -6 2,9 kb

-7 2,9 kb

HlNDIII HG-3 2,9 kb

+ -6 2,9 kb

EcoRI -7 2,9 kb

HG-3 9,7 kb

HINDIII -6 - 4,1 kb

-7 9,7 kb

HG-3 2,2 kb 0,9 kb

Pvull -6 1,9 kb 0,9 kb

-7 2,2 kb 0,9 kb

Bemerkung: Das Symbol „«-" bedeutet dasselbe Fragment hybridisiert.

Stufe 8

(Southern-Blot-Analyse von Kaninchenklonen)

Es wurden im wesentlichen die gleichen Verfahrensschritte wie in Stufe 7 von Beispiel 1 wiederholt mit der Ausnahme, daß jeder der Bakteriophagen RG-1 und RG-2 verwendet wird anstelle jedes der Bakteriophagen HG-3, HG-6und HG-7. Derart wurde die Southern-Blot-Analyse durchgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß das pR 18 5'-Fragment durch ein einziges Streifenfragment hybridisiert ist, von Fragmenten, die man durch Schneiden von RG-1 und RG-2 mit jedem der Enzyme BamHI, EcoRI, BgII, Hindlll und BamHI + EcoRI erhielt.

Stufe 9

(Konstruktion der bakteriellen Klone, die das menschliche Genom-TNF-Gen enthalten) Die Methode von Landy et al. (Biochemistry, Bd. 13,2134 [1974]) wurde eingesetzt, um DNA zu erhalten von HG-3, erhalten gemäß obiger Stufe 5.33 μg der daraus resultierenden HG-3-DNA wurde mit 80 Einheiten EcoRI bei 37°C über 3 Stunden verdaut.

Das Verdauungsprodukt wurde über 1%igem niedrigschmelzendem Agarosegel elektrophoretisiert (Bedingungen: 1 x TAE, 20 V, 14,5 Stunden). Der2,9kb-Streifen wurde von Agarosegel isoliert nach der von T. Maniatis (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S.377, [1982]) beschriebenen Methode. Speziell das herausgeschnittene Gel des 2,9kb Streifenteiles wurde bei 65⁰C über 15 Minuten erhitzt. Das EcoRI-herausgeschnittene HG-3-Fragment mit einer Länge von 2,9 kb (nachfolgend öfter als „HG-3/EcoRI 2,9kb-Fragment" bezeichnet) wurde aus dem geschmolzenen Gel durch dreimaliges Extrahieren mit Phenol und anschließendem dreimaligem Extrahieren mit einem anderen Extraktionslösungsmittel und Fällung mit ammoniumacetathaltigem Ethanol zurückgewonnen. Auf diese Weise erhielt man 637 ng (Ausbeute: etwa 30%) des HG-3/EcoRI 2,9kb-Fragmentes.

255ng des oben genannten Fragments wurden zu 56,5ng EcoRI-geschnittenem pUC13 (J.Messing, Methode in Enzymology, Bd.101, 20 [1983]) ligiert unter Verwendung von 2,5 Einheiten T₄-Ligase bei 4⁰CfUr 20 Stunden.

E. coli K12-Stamm JM 83 wurde unter Einsatz des oben genannten Ligierungsproduktes transformiert. Speziell E. coli K12 Stamm JM83 wurde in LB-Medium kultiviert bis die optische Dichte der Kulturbrühe 0,3 bei 550nm betrug. 50ml der gewachsenen E. coli K12 Stamm JM83-Kultur wurden gesammelt, mit 25ml 1OmM MOPS (pH 7,0) - 1OmM RbCI gewaschen und in 25ml 0,1 M MOPS (pH 6,5) - 5OmM CaCI₂ - 10 mM RbCI resuspendiert. Die Suspension wurde auf Eis 30 Minuten gekühlt, zentrifugiert und in einem Gemisch von 2ml 0,1 M MOPS (pH 6,5) - 5OmM CaCI₂ - 1OmM RbCI und30/u.l DMSO resuspendiert. Zu 203/zl der Suspension wurden 10μΙ einer wäßrigen Ligierungsproduktlösung gegeben, die 10ng des Ligierungsproduktes enthielt. Das Gemisch wurde auf Eis 30 Minuten gekühlt und anschließend bei 40⁰C 60 Sekunden erwärmt.

Unmittelbar danach wurden 5ml auf 37°C vorgewärmte LB-Brühezu dem erwärmten Gemisch gegeben, gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei 37°C. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert und das Überstehende entfernt. Zu dem resultierenden Zellpellet wurde ein LB-Medium gegeben und anschließend auf einer LB-Platte, die 30^g/ml Ampicillin und 40//.g/ml X-gal enthielt, beimpft. E. coli K12 Stamm JM 83 enthaltende Kolonien, bei dem dieser mit den das Insert aufweisenden Plasm iden transformiert worden ist, sind weiß, während jene mit E. coli K12 Stamm J M 83, der mit dem Plasm id allein transformiert worden ist, blau sind. Die erhaltenen weißen Kolonien wurden nochmals auf einer LB-Platte, die 30μg/ml Ampicillin und 40μg/ml X-gal enthielt, zum Zwecke der Bestätigung beimpft.

Von den oben genannten weißen Kolonien wurden 10 Kolonien (bakterielle Klone) ausgewählt und gescreent unter Einsatz einer mini-prep-Technik.

Speziell wurde jede Kolonie über Nacht in LB-Medium, das 30^g/ml Ampicillin enthielt, kultiviert. Die gewachsenen Zellen wurden gesammelt und in einer Lösung die 2mg/ml Lysozym enthält 5OmM G!ucose-10mM EDTA-25mM Tris-HCI (pH 8,0) suspendiert. Die Suspension ließ man 5 Minuten bei Zimmertemperatur stehen und setzte danach 200μΙ 0,2 N NaOH - 1 % SDS hinzu. Nach langsamem Rühren ließ man die Suspension 2 Minuten bei Zimmertemperatur stehen. Danach wurden 150μΙ 3Μ Natriumacetat (pH 5,2) hinzugegeben, 10 Minuten bei -20°C stehengelassen und anschließend 15 Minuten zentrifugiert, um das sich ergebende Überstehende zurückzugewinnen.

Zu dem Überstehenden wurden 900μΙ kaltes Ethanol gegeben und danach 5 Minuten zentrifugiert, um den resultierenden Niederschlag zu gewinnen. Der erhaltene Niederschlag wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und getrocknet, um zu einer Plasmid-DNA zu gelangen. Mit dem oben genannten Verfahren wurden zehn Plasmid-DNA's erhalten.

Jede Plasmid-DNA wurde in 10mMTris-0,1 mM EDTA (pH 8,0) gelöst, mit EcoRI verdaut und einer Elektrophorese für die Restriktionsanalyse unterworfen. Die Bedingungen für Verdauung und Elektrophorese waren folgende:

Verdauung: Plasmid-DNA-Lösung, ein Fünftel der oben hergestellten Menge; EcoRI, 3 Einheiten; 37°C; IV2 Stunden Elektrophorese: 1 % Agarosegel; 1 x TAE; 120V; 2 Stunden

Die obige Restriktionsanalyse zeigte, daß acht der zehn Klone positiv sind. Das beweist, daß acht Klone das 2,9 kb-Fragment aufwiesen. Von den acht positiven Klonen wurde ein Klon ausgewählt und bezeichnet als E. coli K12 Stamm JM83 (pHGE) (ATCC 39656).

Im wesentlichen die gleichen Verfahrensschritte wie in der obigen Stufe 2 wurden wiederholt, um 1,89mg pHGE-DNA herzustellen, mit der Ausnahme, daß E. coli K12 Stamm JM 83 (pHGE) verwendet wurde anstelle von E. coli als Wirt von pB2-7 und pR18.

Stufe 10

(Subklonieren von EcoRI-geschnittenem RG-D

3Of^g RG-1, hergestellt in der obigen Stufe 6, wurde mit EcoRI verdaut. Aus dem erhaltenen Fragmentgemisch wurde das Fragment mit der Länge von 3,5 kb gewonnen, im wesentlichen in gleicher Weise wie in Stufe 9 beschrieben, mit der Ausnahme, daß das oben hergestellte Fragmentgemisch und 0,8% niedrig schmelzendes Agarosegel verwendet wurde. Auf diese Weise erhielt man 0,1 μg EcoRI-geschnittenes RG-1-Fragment'(etwa 3,5kb). Das oben erhaltene EcoRI-geschnittene RG-1-Fragment (3,5 kb) wurde zu EcoRI-verdautem pUC 13 !!giert — im wesentlichen in dergleichen Weise wie in der obigen Stufe 9, mit der Ausnahme, daß das oben erhaltene EcoRI-geschnittene Fragment (3,5 kb) verwendet wurde anstelle des EcoRI-geschnittenen HG-3-Fragmentes (2,9kb).

Die Transformation von E. coli K12 Stamm JM 83, das Screening der bakteriellen Klone, die Verdauung der Klone und die Elektrophorese wurden im wesentlichen in gleicher Weise wie in der obigen Stufe 9 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das oben genannte Ligierungsprodukt verwendet wurde. Der erhaltene Klon wurde bezeichnet als E. coli K12 Stamm JM 83 (PRGE) (ATCC 39655).

Im wesentlichen die gleichen Verfahrensschritte wie in der obigen Stufe 2 wurden wiederholt, um 1,70mg pRGE-DNA herzustellen, wobei anstelle von pB2-7 und pR 18 der E. coli K12 Stamm JM 83 (pRGE) verwendet wurde.

Stufe 11

(Restriktionsenzymanalyse der pHGE-Plasmid-DNA) Die Restriktionsenzymanalyse der pHGE-Plasmid-DNA, die in der obigen Stufe 9 erhalten worden war, erfolgt nach der von Maniatis (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 98 [1982]) beschriebenen Methode.

Die Verfahrensschritte und eingesetzten Bedingungen waren folgende:

1) Verdauung von pHGE mit EcoRI: 18,6,xgpHGE-DNA 64 Einheiten EcoR! 37⁰C, 2 Stunden

2) Ethanolfällung: Niederschlag

3) Zusatz von destilliertem Wasser zum Niederschlag: Herstellung von 1 μg/μ\ EcoRI-geschnittener pHGE-Lösung

4) Verdauung mit verschiedenen Restriktionsenzymen: VgpHGE/EcoRI Restriktionsenzym: 5 Einheiten Pvull, 5 Einheiten Pvull + 10 Einheiten Rsal, 10 Einheiten Rsal, 4 Einheiten Mstll, 3 Einheiten Aval, 9 Einheiten Pstl 37⁰C, 2 Stunden

5) Elektrophorese: 2%Agarosegel, 1 x TAE, 28 V, 14V2 Stunden

6) Transfer auf Nitrocellulosefilter:

(siehe E.M.Southern, J.Mol. Biol. 98, 503 [1975])

7) Erste Pre-Hybridisierung: 30 ml FDSS

42⁰C, 6 Stunden

8) Erste Hybridisierung:

5'-Fragment (5 χ 10⁴cpm/ml) von pR18 (hergestellt in obiger Stufe 4) 42⁰C, 14 Stunden

9) Waschen:

2 χ SSC - 0,1 % SDS bei Zimmertemperatur Immersion 10 Minuten x4 ,

1 χ SSC - 0,1 % SDS bei 5O⁰C Immersion.30 Minuten x 2

10) Exponieren:

XAR-5 (Eastman Kodak Company, USA) -80°C, 2 sich verstärkende Screens, 17¹/2 Stunden

11) Auswaschen:

0,5 M NaOH - 1,5 M NaCI (Immersion: 1 Minute) 0,5 M Tris -τ 1,5 M NaCI (Immersion: 1 Minute) 3 x SSC (Immersion: 1 Minute)

12) Exponieren:

In gleicher Weise wie bei 10), Expositionszeit aber 19 Stunden

13) Zweite Pre-Hybridisierung: in gleicher Weise wie bei 7)

14) Zweite Hybridisierung:

pB2-7 Insert (hergestellt in obiger Stufe 3) 42⁰C, 16Vi Stunden

15) Waschen:

in gleicher Weise wie bei 9)

16) Exponieren:

in gleicher Weise wie bei 10), Expositionszeit aber 19V2 Stunden

17) Auswaschen:

in gleicher Weise wie bei 11)

18) Exponieren:

in gleicher Weise wie bei 10), Expositionszeit aber 19V2 Stunden

19) Dritte Pre-Hybridisierung: in gleicher Weise wie bei 7)

20) Dritte Hybridisierung:

3'-Fragment (4,5 x 10⁵cpm/ml) von pR18 (hergestellt in obiger Stufe 4), 42°C, 15 Stunden

21) Waschen:

in gleicher Weise wie bei 9)

22) Exponieren:

in gleicher Weise wie bei 10)

Die Ergebnisse der Restriktionsenzymanalyse sind in Fig.4 aufgeführt. Stufe 12 ' »

(Restriktionsenzymanalyse der pRGE-Plasmid-DNA)

Im wesentlichen in gleicherweise wie in der obigen Stufe 11 erfolgte die Restriktionsenzymanalyse der pRGE-Plasmid-DNA, die in Stufe 10 hergestellt worden war, mit der Ausnahme, daß pRGE-Plasmid-DNA anstelle von pHGE-Plasmid-DNA eingesetzt wurde. Die Restriktionskarte des erhaltenen pRGE-DNA-lnserts ist in Fig.5 gezeigt.

Stufe 13

(Bestimmung der Basensequenz von Kaninchen-TNF-Gen und menschlichem TNF-Gen) Es wurden im wesentlichen die gleichen Verfahrensschritte wie in der obigen Stufe 2 wiederholt, mit der Ausnahme, daß E. coli K12 Stamm JM 83 (pHGE), erhalten in obiger Stufe 10, und E. coli K12 Stamm JM 83 (pRGE), erhalten in obiger Stufe 10, verwendet werden anstelle von E. coli K12 Stamm MC 1061 mit pB 2-7 und E. coli K12 Stamm MC 1061 mit pR18. Man erhielt jeweils 150^g der pRGE-Plasmid-DNA und pHGE-Plasmid-DNA.

Die Basensequenzen von pRGE und pHGE wurden nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren bestimmt (Maxam et al., Methods in Enzymology, Bd. 55,490 [1980], publ. von Academic Press).

Die im Bezugsbeispiel 3 bestimmte Basensequenz von pR-18 wurde mit der oben bestimmten pRGE verglichen, um die Struktur einschließlich Exon und Intron des Kaninchen-TNF-Gens aufzuklären. Die Struktur.des pRGE-DNA-lnserts ist in Fig. 5 aufgeführt.

Danach wurde die Basensequenz von pRGE mit der von pHGE verglichen, um die Homologie- und Übereinstimmungssequenz um die Grenze zwischen Intron und Exon herum zu überprüfen. Damit wurde die Struktur des menschlichen TNF-Gens einschließlich Exon und Intron aufgeklärt. Die Struktur des menschlichen TNF-Gens ist in Fig.4 aufgeführt.

Die oben genannte Basensequenz, die für Kaninchen-TNF und für menschliche TNF kodiert, wird unten aufgeführt. In den Basensequenzen zeigt die obere Reihe die Basensequenz, die für Kaninchen-TNF kodiert (R) und die untere Reihe die Basensequenz, die für menschliche TNF kodiert (H).

R TCA GCTTCT CGG GCC CTG AGT GAC AAG CCT CTA GCC CAC GTA GTA

H TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA

R GCA AAC CCG CAA GTG GAG GGC CAG CTC CAG TGG CTG AGC CAG CGT HGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGG R GCG AAC GCC CTG CTG CGC AAC GGC ATG AAG CTC ACG GAC AAC CAG H GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG R CTG GTG GTG CCG GCC GAC GGG CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTT

H CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC

R CTC TTC AGC GGT CAA GGC TGC CGC TCC ... TAC GTG CTC CTC ACT

H CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC

R CAC ACT GTC AGC CGC TTC GCC GTC TCC TAC CCG AAC AAG GTC AAC

H CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTG AAC

R CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAC CGG GAG ACC CCC GAG

H CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG

R GAG GCT GAG CCC ATG GCC TGG TAC GAG CCC ATC TAC CTG GGC GGC H GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG R GTC TTC CAG TTG GAG AAG GGT GAC CGG CTC AGC ACC GAG GTC AAC R CAG CCT GAG TAC CTG GAC CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC TTT

H CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT

R GGG ATC ATT GCC CTG

HGGGATCATTGCCCTG

Bemerkung: das Symbol „..." bedeutet, daß dieser Teil in der Basensequenz der DNA, die für Kaninchen-TNF kodiert, Null ist

Stufe 14

(Synthese von Oligodesoxynucleotiden)

In einen δΟΟμΙ-Behälter aus rostfreiem Stahl mit rostfreien Stahlfiltern an jedem Ende wurden 20 mg Polystyrolharz gegeben, an das ein Nucleotid (2,0/xM) übereine Succinatbindung gekoppelt wurde. Das Harz wurde mitZinkbromid (1 M) in Dichlormethan-Isopropanol (85:15) behandelt, um die Dimethoxytrityl (DMT)-Schutzgruppe zu entfernen. Es wurde mit Dimethylformamid, Pyridin und Acetonitril gewaschen, und unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Zu dem getrockneten Harz wurde eine Lösung von DMT-Nucleotid (20/xM) und Mesitylensulfonylnitrotriazol (60μΜ) in 200μΙ Pyridin gegeben. Die Kupplungsreaktion erfolgte bei 45⁰C über 20 Minuten. Dieser Zyklus des Abspaltens der Schutzgruppe und Kuppeln wurde für die nacheinanderfolgenden Nucleotide wiederholt bis das gewünschte Oligodesoxynucleotid am Harz aufgebaut war. Dann wurde das Harz behandelt, um das Oligodesoxynucleotid davon abzutrennen, und gereinigt nach der von Ito, Ike, Ikuta und Itakura (Nuc. Ac. Res. 10: 1755 [1982]) beschriebenen Methode. Auf diese Weise erhielt man die folgenden Oligodesoxynucleotide.

1) 5'-AATTCATGTCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAa-S'

2) 3'-GTACACTAGAAGAGCTTGGGGCTCaCTGTTGGG-S'

3) 5'-GCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGc-S'

4) 3'-ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACt-S' Stufe 15

(Konstruktion von M 13mp9-HGE, das das menschliche Minigen für TNF enthält) Plasmid-pHGE (10/xg) wurden mit EcoRI (20 Einheiten) verdaut. Nach der Elektrophorese auf einem 1 % niedrig schmelzenden Agarosegel wurde das 2,9kb-Fragment eluiert. Dieses Fragment wurde in das EcoRI-Fragment der replikativen Form des M13mp9-Phagen isertiert. Der M13mp9-Phage wurde ausgewählt, da er für die Aufnahme von Abschnitten der DNA besonders geeignet ist. Das Produkt transferiert (transfects) zu E. coli JM 103 (BRL [Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) User Manual/M13mp7 Cloning/„Dideoxy" sequencing, 1980). Das Produkt wurde als M 13mp9-HGE bezeichnet.

Stufe 16

(Deletion des Introns 3 unter Verwendung von M13mp9-HGE einzelsträngiger DNA und des Deleters E3-4) Die einzelsträngige DNA von M13mp9-HGE wurde nach dem Verfahren des BRL; User Manual/M13mp7 cloning/„Dideoxy" sequencing, 1980 hergestellt

Das in Stufe 14 hergestellte Oligodesoxynucleotid 4) 3'-ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACt-B'

wurde als Deleter für das Intron 3 eingesetzt. Der Deleter für das Intron 3 wurde als „E 3-4" bezeichnet. Der Deleter E 3-4 wies eine Basensequenz auf, die komplementär ist zu der Basensequenz der Basen vor (Exon 3) und nach (Exon 4) dem Intron 3, das zu deletieren ist. Die Deletierung erfolgte gemäß der Lehre von Wallace et al., Science 209 : 1396 (1980) wie folgt. E 3-4 (164ng, 15pmol) wurde unter Verwendung von T₄-Kinase und ATP (3mM) phosphoryliert und zu einer Schablonen-M13mp9-HGE (1,65μg, 0,5pmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 65°C erhitzt für 5 Minuten, auf Zimmertemperatur abgekühlt und schließlich in Eiswasser gekühlt. Zu dATP, dCTP, dGTP, dTTP und ATP (0,4mM) wurde das Klenow-Fragment (5 Einheiten), T₄-Ljgase (10 Einheiten) in Hin-Puffer [Wallace et al., Nuc.Ac. Res.9,3647 (1981)], 1OmM Tris HCI (pH 7,2), 2mM MgCI₂ und 1 mM /3-Mercaptoethanol gegeben. Das Reaktionsgemisch (Endvolumen 50 μΙ) wurde für 30 Minuten bei 4°C inkubiert und anschließend für 30 Minuten bei Zimmertemperatur. Die DNA aus der Oligonucleotid-geprimten Reaktion wurde dazu verwendet, E.coli gemäß der Methode BRL User Manual/M13mp7 cloning/„Dideoxy" sequencing, 1980 zu transferieren (transfect). Aus diese Weise erhaltene Plaques wurden auf YT-Platten [J.H.Miller, S.433, Experiments in Molecular Genetics, Gold Spring Habor Lab. (1972)] gegeben. Die erhaltenen Kolonien wurden bei 55°C2 Stunden mit ³²P-mackiertem E3-4 hybridisiert. Für diesen Schritt wurde der Deleter als Sonde verwendet, um Sequenzen der DNA zu identifizieren, bei denen die entsprechende komplementäre Basensequenz nach dem Intron deletiert worden ist. Von solchen Kolonien, die mit dem Deleter hybridisieren, wurden Phagen isoliert.

Die erhaltene Phage wurde ausplattiert und Plaques auf YT-Platten gebracht. Man ließ die Klone bei 55⁰C für 2 Stunden mit ³²P-markiertem E3-4 hybridisieren. Man erhielt positive Klone, und die Phagen-DNA wurde sequenziert, um jene Phagen auszuwählen, in denen das Intron 3 vollständig deletiert war. Eine dieser Phagen wurde als mp9-HGEA3-1 bezeichnet. Stufe 17

(Konstruktion von pHTNF-lacUV5-2)

Die replikative Form von mp9-HGEA3-1 wurde mit EcoRI verdaut. Das EcoRI-Fragment wurde isoliert und an EcoRI-geschnittenes pBR327 kloniert, um das Plasmid pHGEA3-1 zu erhalten.

Die Konstruktion von weiterem Plasmid wurde unter Einsatz des Plasmids pHGEA3—1 durchgeführt, um solches PlasmidA3-1 zu erhalten, das TNF in E.coli direkt exprimiert unter Verwendung von lacUV5 als Promotor. Die Verfahrensweise ist in Fig.7 anschaulich dargestellt.

Zuerst wurden 10μg des Plasmids pHGEA3-1 mit 10 Einheiten Aval und EcoRI bei 37°Cfür 2 Stunden verdaut und dann auf einem 4Ma.-% Polyacrylamid-Gel elektrophoretisiert, um Fragmente zu isolieren. Durch Elektroeluierung wurde etwa ^ μg des Fragments aus dem Gel isoliert. In gleicherweise wie in Stufe 14 wurden zwei in Fig.7 aufgeführte Fragmente synthetisiert, nämlich

5'-AATTCATGTCATCTTCTCCGAACc-S' und 5'-TCGGGGTTCGAGAAGATGACATg-S'.

Danach wurde jedes 5'-Ende der beiden Oligodesoxynucleotide (etwa lOOpmol) unter Verwendung von T₄-PoIyηucleotidkinase nach in der Literatur (3), Seite 122, beschriebenen Verfahren phosphoryliert.

Nach Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit Phenol extrahiert und anschließend mit Chloroform. Die so erhaltenen synthetischen Oligomeren wurden mit 0,5^g des vorher erhaltenen Aval-EcoRI-Fragments des Plasmids pHGEA3-1 vermischt und Ethanol-gefällt. Diese Fragmente wurden bei 4⁰C über Nacht unter Einsatz von 10 Einheiten T₄-Ligase ligiert gemäß dem in der Literatur (1), Seite 37, beschriebenen Verfahren. Nach Abschluß der Reaktion wurde das Gemisch Ethanolgefällt und anschließend elektrophoretisiert auf einem 4Ma.-% Polyacrylamid-Gel, um durch Elektroeluierung ein Fragment zu erhalten.

Nach dem von F. Fuller in Gene 19, S.42-54 (1982) beschriebenen Verfahren wurde das Plasmid pOP95-15 hergestellt, Ein/xg pOP95-15 wurde mit EcoRI verdaut, dann mit Phenol und danach mit Chloroform extrahiert und anschließend mit Ethanol gefällt, um einen Vektor zu erhalten. Unter Verwendung von T₄-DN A-Ligase wurden 0,5/xg des erhaltenen Vektors mit dem oben genannten Fragment ligiert. Gemäß dem in der Literatur (4), Seite 20, beschriebenen Verfahren wurde E.coli JM 101 (ATCC 33876) unter Einsatz des oben genannten Vektors transformiert und auf einem Agarmedium, 1 mM IPGT und 0,004% (Masse/Vol.) X-gal, kultiviert, wobei man etwa 100 weiße Kolonien erhielt.

Aus diesen Transformanten wurde die DNA der Plasmide hergestellt und mit EcoRI verdaut, um jene Plasmide zu identifizieren, die das gewünschte EcoRI-Fragment enthielten.

Umdielnsertionsrichtungzu überprüfen, wurden jene Plasmide mit Pvull und Pstl verdaut und auf einem 1,5Ma.-%Agarosegel elektrophoretisiert. Es wurden die Plasmide ausgewählt, die Fragmente von etwa 1 280 Basenpaaren und etwa 2600 Basenpaaren ergaben und damit angaben, daß die Transkriptionsrichtung des lacUV5-Promotors in Übereinstimmung mit jenen Oligodesoxynucleotiden ist, die für TNF kodieren.

Die Basensequenzanalyse zeigte, daß diese 2 Plasmide dieselbe Sequenz haben und daß der lacUV5-Prornotor, das synthetisierende Oligodesoxynucleotid und die DNA einwandfrei miteinander kombiniert worden sind. Das erhaltene Plasmid wurde als pHTNF-lacUV5-2 bezeichnet.

pHTNF-lacUV5-2 enthaltendes E. coli wurde in einem üblichen Nährmedium kultiviert. Die Bioassay des Produktes für die TNF-Aktivität zeigte nahezu die gleiche Aktivität, die man mit einem Plasmid pTNF-lacUV5-1, das das Kaninchen-TNF-Gen enthält, unter Steuerung des lac-Promotors erhält.

Beispiel 2

Unter Verwendung des Plasmids pHGE und den Oligodesoxynucleotiden 1) bis 4), die nach der Verfahrensweise der Stufen 1 bis 14 Beispiel 1 erhalten worden waren, wurde pHTNF-lacUV5-1 gemäß dem in Fig. 6 wiedergegebenen Verfahren hergestellt.

Beispiel 3

Stufe 1 (Konstruktion von Plasmid pHTNF-SD zur Expression in Hefe)

1,78mg gemischter DNS der Hefe Saccharomyces cerevisae AH-22 (erhalten durch Dr.Toh-e, Faculty of Engineering, Osaka University, Osaka, Japan) werden aus einem Liter kultivierter Hefebrühe nach der Methode von Cryer et al.. Method in Cell Biology 12, 39-^-4, Academic Press, New York (1975), erhalten. Die so erhaltene genomische DNS wird mit Hindill gespalten auf der Grundlage der Restriktions-Endonucleasen-Spaltungskarte nach Hitzmann et al., Nucleic Acids Research 10 (23), 7791—7808 (1982). Die Spaltprodukte werden in 3,5% Polyacrylamidgel durch Elektrophorese aufgetrennt. Nach Abschluß der Elektrophorese wird ein DNS Fragment mit einer molekularen Länge von etwa 3,1 kb vom Gel isoliert. Das so erhaltene DNS-Fragment wird mit Hindlll gespalten. Die so hergestellten Spaltprodukte werden mit einem Plasmid pBR327, das mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt worden war, ligiert und so Rekombinanten erzeugt. Indem jede der erhaltenen Rekombinanten einzeln verwendet wird, werden Zellen von E.coli MC1061 (H.J.Casadaban und S. N.Cohen, J.Mol. Biol. 138 [1980], S. 179-207) transformiert, um Transformanten zu bilden. Die so gebildeten Transformanten werden unter Verwendung der folgenden, aus 25 Basen bestehenden Sonde der Hybridisation unterworfen: pGK-1: 5'-CAGATCATCAAGGAAGTaATTATCT-S'

Von ungefähr 13000 Kolonien der Transformanten hybridisieren? Kolonien (Bakterienclone) mit der Sonde pGK-1. Einer der Clone wird ausgewählt. Von diesem ausgewählten Clone wird ein rekombinantes Plasmid isoliert. Das isolierte Plasmid wird mit pGK327 bezeichnet.

Unter Verwendung des isolierten Plasmids pGK327 und eines Plasmids YEpI 3 (ATCC37115), das von Dr.Toh-e, Faculty of Engineering, Osaka University, Osaka, Japan, zur Verfugung gestellt wurde, wurde ein Sandwich-Expressionsvektor nach der Methode von Mellor et al., Gene 24,1-14(1983) konstruiert. Zunächst werden 20/j.g des Plasmids pGK327 nacheinander mit Hincll und Ba 131 gespalten. Zu den so erhaltenen Spaltprodukten wird ein synthetisierter Linker, pGK (5'-CAAAAGATCI I I I G-3', 14mer), ligiert und danach mit BgIII und Hindlll gespalten. Auf diese Weise werden 500ng eines Hindlll-Bglll-Fragments (Fragment I) erhalten.

Getrennt davon werden 20,ug des Plasmids pGK327 mit BgIII und Sail gespalten und so 5/xg eines Bglll-Sall-Fragments (Fragment II) hergestellt.

10 jag des Plasmids YEpI 3 werden mit Hindlll gespalten und danach mit Sail teilweise gespalten, um Spaltprodukte zu erhalten. Von den Spaltprodukten wird ein DNS-Fragment mit einer Moleküllänge von ungefähr 10,1 kb durch Elektrophorese abgetrennt. Auf diese Weise wird 1 ^g eines DNS-Fragments (Fragment III) erhalten.

500ng des o.g. Fragments I, 500ng des Fragments Il und 1 μg des Fragments III werden zu einer Lösung aus 5OmMoI Tris-HCI (pH 8,0), 1OmMoI MgCI₂, 2OmMoI Dithiothreitol und 1 mMol ATP gegeben und inkubiert, um die Fragmente zu ligieren. Unter Verwendung der so hergestellten Ligierungslösung werden Zellen von E.coli MC1061 transformiert, um Transformanten herzustellen. Die so erzeugten Transformanten werden einem Screening unterworfen, wobei die synthetisierte Sonde pGK3 (S'-ATGGGAGATCI I I TGG I I I I-3') verwendet wird. Von ungefähr 300 Transformanten hybridisierten 20 Transformanten mit der Sonde. Von jedem der hybridisierten Transformanten wird das Plasmid isoliert und im Hinblick auf die Spaltstellen der Restriktions-Endonuclease analysiert. Im Ergebnis dessen wird festgestellt, daß 15 Transformanten den gewünschten Sandwich-Expressionsvektor enthalten. 10/zg des Plasmids pHTNF-lacUV5-1, wie es in Beispiel 2 hergestellt worden ist, werden mitEcoRI gespalten. Diekohäsiven Enden der so erhaltenen Spaltprodukte werden unter Verwendung von Klenow-Fragmenten aufgefüllt. An die so hergestellten Fragmente wird der BamHI-Linker ligiert, danach erfolgt die Spaltung mit BamHI, wodurch 1 μg eines DNS-Fragments mit einer Moleküllänge von ungefähr 900bp erhalten wird.

100 ng des so erhaltenen DNS-Fragments mit einer Moleküllänge von ungefähr 900 bp werden mit 200 ng des o.g. Sandwich-Expressionsvektors ligiert, um ein rekombinantes Plasmid zu erzeugen. Danach werden Zellen von E. coli MC1061 mit dem oben erhaltenen rekombinanten Plasmid transformiert, um dadurch Transformanten zu erhalten. Die Transformanten werden getrennt kultiviert, um Clone zu erhalten. Von diesen Clonen werden 12 Clone ausgewählt und von jedem Clone wird ein rekombinantes Plasmid isoliert und unter Verwendung der mini-prep-Technik analysiert. Im Ergebnis dessen wird festgestellt, daß 4 rekombinante Plasmide den gewünschten Sandwich-Expressionsvektor darstellen und eine Basensequenz aufweisen, die für das physiologisch aktive Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert. Eines der rekombinanten Plasmide wird ausgewählt und als pHTNF-SD bezeichnet.

Stufe 2 (Herstellung menschlichen TNF unter Verwendung von pHTNF-SD)

Ein Hefe-Stamm MT302/1 C (J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, CoidSpring Harbor, N. Y., 1972, S. 433) wird mit dem Plasmid pHTNF-SD nach der Methode von Hinnen et al. (Proc.Natl.Acad. Sei. USA 75,1929-1933, 1978) transformiert, um Transformanten zu erzeugen. Der so erzeugte Transformant wird als pYTNF-SD bezeichnet. Der ρ YTNF-SD wird in einem künstlichen Medium kultiviert, das kein Leucin enthält, wobei die Zellkonzentration auf 1-7 χ 10⁶ Zellen/ml eingestellt wird. Die Zellen von pYTNF-SD werden abgetrennt und mit einen Phosphatpuffer (25 mM, pH 7,0) gewaschen. Danach werden die Zellen mit einem Vortex-Rührer in Gegenwart von Glasperlen zerstört und zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand abgetrennt und zur Bestimmung der cytotoxischen Aktivität gegen L-Zellen verwendet. Im Ergebnis dessen wird festgestellt, daß der Überstand eine cytotoxische Aktivität gegen L-Zellen von 850 Einheiten/ml aufweist.

Claims (12)

1. Verfahren zur Herstellung eines physiologisch aktiven humanen Polypeptids mit TNF-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß ein Transformant eines Mikroorganismus oder einer Zellkultur, welcher mit einer replizierbaren rekombinierenden DNS transformiert wurde, die ihrerseits aus einer ersten DNS besteht, welche ein physiologisch aktives humanes Polypeptid mit TNF-Aktivität codiert, und einer zweiten DNS, die von einem replizierbaren Expressionsvektor abgeleitet ist, vorgelegt wird, der genannte Transformant kultiviert wird, wodurch der genannte Transformant die genannte DNS exprimiert und dabei ein physiologisch aktives humanes Polypeptid erzeugt wird und das gebildete physiologisch aktive humane Polypeptid aus der Kultur des Transformanten isoliert wird; dabei wird der genannte Mikroorganismus oder die Zellkultur aus der Gruppe Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefen und Zellen höherer Tiere ausgewählt; und daß der genannte replizierbare Expressionsvektor aus der Gruppe Plasmidvektoren und Phagenvektoren ausgewählt wird.

2. Verfahren gemäß Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte physiologisch aktive humane Polypeptid mit TNF-Aktivität eine Aminosäurensequenz enthält, die durch die folgende Formel (I) dargestellt wird:

worin GIn einen Glutaminrest, Asp einen Asparaginsäurerest, Pro einen Prolinrest, Tyr einen Tyrosinrest, VaI einen Valinrest, Lys einen Lysinrest, GIu einen Glutaminsäurerest, AIa einen Alaninrest, Asn einen Asparaginrest, Leu einen Leucinrest, Phe einen Phenylalaninrest, GIy einen Glycinrest, His einen Histidinrest, Ser einen Serinrest, Thr einen Threoninrest, lie einen Isoleucinrest, Trp einen Tryptophanrest, Arg einen Argininrest, Met einen Methioninrest und Cys einen Cysteinrest bedeutet, oder eine Aminosäuresequenz, die einer homologen Variante des Polypeptids mit der durch die Formel (I) dargestellten Aminosäuresequenz entspricht.

3. Verfahren gemäß Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste DNS eine DNS ist, die mindestens eine Basensequenz enthält, die aus der Gruppe gewählt wird, welche durch die nachfolgende Formel (II) dargestellt wird und einer zu der genannten Basensequenz komplementären Basensequenz besteht:

TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG

worin A einen Desoxyadenylsäurerest, G einen Desoxyguanylsäurerest, C einen Desoxycytidylsäurerest und T einen Thymidylsäurerest bedeuten und worin das linke Ende der Formel (II) die 5'-Hydroxygruppenseite und das rechte Ende die 3'-Hydroxygruppenseite bedeutet, oder eine DNS mit einer Basensequenz, die durch Substitution mindestens einer Base der genannten mindestens einen Basensequenz durch Degeneration des genetischen Codes erhalten wird,

4. Verfahren gemäß Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Transformant erhalten wird durch Bindung der genannten ersten DNS an die genannte zweite DNS, wobei eine replizierbare rekombinierende DNS erhalten wird, die die genannte erste DNS und die genannte zweite DNS umfaßt, Transformation von Zellen eines Mikroorganismus oder einer Zellkultur mit der genannten replizierbaren rekombinierenden DNS zu einem Transformanten und Auslesen des genannten Transformanten aus den Stammzellen des Mikroorganismus oder der Zellkultur.

5. Verfahren gemäß Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte replizierbare rekombinierende DNS außerdem eine dritte DNS enthält, welche ein Peptid codiert und an das 5'-Ende der genannten ersten DNS gebunden ist, und ein Transformant, der mit der genannten replizierbaren rekombinierenden DNS kultiviert wird, wobei der genannte Transformant die genannte erste DNS an der genannten dritten DNS exprimiert, wobei ein Polypeptidprodukt entsteht, das mindestens einen Aminosäuresequenzanteil enthält, der einem physiologisch aktiven humanen Polypeptid mit TNF-Aktivität entspricht, worin die C-terminale Aminosäure des genannten Aminosäuresequenzanteils mit der C-terminalen Aminosäure des genannten Polypeptidprodukts übereinstimmt.

6. Verfahren gemäß Punkt 5, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Polypeptidprodukt einen Aminosäuresequenzanteil enthält, der dem genannten physiologisch aktiven humanen Polypeptid entspricht, und daran an seinem N-Ende gebunden einen Aminosäuresequenzanteil des genannten Peptids, das von der genannten dritten DNS abgeleitet ist, und daß das genannte Polypeptidprodukt aus dem gezüchteten Transformanten isoliert wird und chemisch und enzymatisch gespalten wird, so daß das genannte physiologisch aktive humane Polypeptid und das genannte Peptid, das aus der genannten dritten DNS gebildet wird, erhalten werden, und daß das genannte physiologisch aktive humane Polypeptid von dem genannten Peptid, das aus der genannten dritten DNS erhalten wird, abgetrennt wird.

7. Verfahren gemäß Punkt 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte dritte DNS aus der folgenden Gruppe gewählt wird:

— eine DNS, die ein Signalpeptid codiert, welches aus einem Mikroorganismus gebildet wird und eine Aminosäuresequenz aus 15 bis 40 Aminosäuren enthält;

— eine DNS, die ein Signalpeptid codiert, welches aus einem höheren Tier gebildet wird und eine Aminosäuresequenz aus 15 bis 40 Aminosäuren enthält und

— eine DNS, die ein Peptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die einem Teil einer intermediären Form des genannten physiologisch aktiven humanen Polypeptids entspricht, worin der genannte Teil der Rest der genannten intermediären Form ist, von der das genannte physiologisch aktive humane Polypeptid entfernt wird.

8. Verfahren gemäß Punkt 5, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Transformant dadurch erhalten wird, daß an die genannte zweite DNS eine DNS gebunden wird, die eine erste DNS enthält, welche an ihrem 5'-Ende mit der genannten dritten DNS verknüpft ist, um eine replizierbare rekombinierende DNS zu erhalten, welche die genannte erste DNS, die genannte zweite DNS und die genannte dritte DNS enthält, daß Zellen eines Mikroorganismus oder einer Zellkultur mit der genannten replizierbaren rekombinierenden DNS transformiert werden, wobei ein Transformant gebildet wird, und daß der genannte Transformant aus den Stammzellen des Mikroorganismus oder der Zellkultur ausgelesen wird.

9. Verfahren gemäß Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte zweite DNS eine DNS enthält, welche ein vorherbestimmtes Peptid codiert und geeignet ist, die genannte erste DNS und die genannte DNS, die das genannte vorherbestimmte Peptid codiert, zu exprimieren, und ein Transformant, der mit der genannten replizierbaren rekombinierenden DNS transformiert wurde, kultiviert wird, wobei der genannte Transformant die genannte erste DNS und die genannte DNS, die das genannte vorherbestimmte Peptid codiert, exprimiert, wobei ein verknüpftes Peptid gebildet wird, das das genannte physiologisch aktive humane Polypeptid und das genannte vorherbestimmte Peptid enthält.

10. Verfahren gemäß Punkt 9, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte verknüpfte Peptid aus dem kultivierten Transformanten isoliert wird und chemisch oder enzymatisch gespalten wird, wobei das genannte physiologisch aktive humane Polypeptid und das genannte vorherbestimmte Peptid erhalten werden und das genannte physiologisch aktive humane Polypeptid von dem genannten vorherbestimmten Peptid abgetrennt wird.

11. Verfahren gemäß Punkt 9, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Transformant erzeugt wird, indem die genannte erste DNS an die genannte zweite DNS gebunden wird, welche eine DNS enthält, die ein vorherbestimmtes Peptid codiert und geeignet ist, die genannte erste DNS und die genannte DNS, die das genannte vorherbestimmte Peptid codiert, zu exprim'ieren, dadurch eine replizierbare rekombinierende DNS zu erhalten, die Zellen eines Mikroorganismus oder einer Zellkultur mit der genannten replizierbaren rekombinierenden DNS zu einem Transformanten zu transformieren und den genannten Transformanten aus den Stammzellen des Mikroorganismus oder der Zellkultur auszulesen.

12. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Transformant so kultiviert wird, daß der genannte Transformant vermehrt wird und schließlich der genannte Transformant dazu gebracht wird, die genannte DNS zu exprimieren und ein physiologisch aktives humanes Polypeptid mitTNF-Aktivitätzu erzeugen.

Hierzu 7 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Desoxyribonukleinsäure (weiterhin als „DNA" bezeichnet), die für ein neues menschliches, physiologisch aktives Polypeptid kodiert. Die Erfindung betrifft auch eine replikable rekombinante DNA, die die DNA, einen Mikroorganismus oder Zelle enthält, die mit der replikablen rekombinanten DNA transformiert wurde, weiterhin ein menschliches, physiologisch aktives Polypeptid, das durch Expression der DNA erhalten wird, ferner ein im wesentlichen reines menschliches, physiologisch aktives Polypeptid mit der hier beschriebenen Aminosäuresequenz, pharmazeutische Zusammensetzungen, die als wirksamen Bestandteil das physiologisch aktive Polypeptid enthalten sowie ein Verfahren zur Hersteilung des menschlichen, physiologisch aktiven Polypeptids. Insbesondere befaßt sich die vorliegende Erfindung mit einer DNA, die für die menschliche TNF {Tumor-Nekrose-Faktor) kodiert, wobei die TNF eine Aminosäuresequenz aufweist, die von der Basensequenz der DNA abgeleitet ist sowie ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem TNF aus der DNA unter Einsatz der rekombinanten DNA-Technologie und die Verwendung des durch das Verfahren erhaltenen Produktes.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es sind verschiedene Substanzen bekannt geworden, die in der Lage sind, das retikuloendothiale System zu stimulieren, beispielsweise pharmakologisch wirksame Substanzen mit Antitumoraktivität, die durch verschiedene gram-positive Bakterien und Endotoxine hervorgerufen werden. Insbesondere Carswell et al. haben entdeckt, daß das Serum von der CD-1, Schweizer Maus, die mit Bacillus Calmette-Guerin (BCG) infiziert und nach zwei Wochen mit einer intravenösen Endotoxininjektion behandelt worden war, cytotoxische Wirksamkeit gegen kultivierte L-Zellen aufwies. Sie stießen auch auf das Phänomen, daß das Serum eine hämorrhagische Nekrose von transplantiertem Meth A-Sarcom in der (BALB/c χ C57 BL/6) Fi-Maus hervorrief. Sie gaben derwirksamen Substanz den Namen TNF (TumornekrosefaktorMProc, Nat.Acad.Sci. USA, Bd.72[Nr.9], S.3666-3670 [1975]). Danach berichteten Ruffetal., daß die Kaninchen-TNF, hergestellt nach dem oben genannten, von Carswell et al. vorgeschlagenen Verfahren, gegenüber dem Serum auf etwa das 2 OOOfache gereinigt wurde (J. Immunol., Bd. 125, Nr. 4, S. 1671-1677 [1980]). Weiterhin berichteten Matthews et al., daß die Kaninchen-TNF gegenüber dem Serum auf etwa das 10OOfache gereinigt worden war (Br. J. Cancer, Bd. 42, S. 416-422 [1980]). Allerdings bestätigten Ruffetal, und Matthews et al. den Tumornekroseeffekt im Hinblick auf die gereinigte TNF im Tierexperiment nicht. Die japanische Offenlegungsschrift 57-140725 (1982) offenbart ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung einer proteinhaltigen physiologisch wirksamen Substanz mit Antitumoraktivität, die hervorgerufen wird durch Verabreichung an Säugetiere wie Maus, Kaninchen oder Guineaschwein von einer Substanz zur Stimulierung des retikuloendothelialen Systemsund anschließender Injektion von Endotoxin eines gram-negativen Bakteriums in dasSäugetier, oder durch Hinzusetzen des Endotoxins aus einem gram-negativen Bakterium zu einer Gewebekultur, die aktivierte Makrophagen eines Säugetiers enthielt. In dieser japanischen Offenlegungsschrift ist auch die Molekülmasse und der isoelektrische Punkt der gereinigten, proteinhaltigen, physiologisch wirksamen Substanz offenbart (Molekülmasse 39000 + 5000, gemessen durch Gelfiltration und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese; isoelektrischer Punkt pH 3,9 ± 0,3, gemessen durch isoelektrische Fokussierung), jedoch in keiner Weise eine detaillierte Struktur der proteinhaltigen, physiologisch wirksamen Substanz. Inzwischen berichtete Matthews, daß man eine Substanz erhalten habe, die cytotoxische Wirksamkeit gegen L-Zellen aufweist, mit Hilfe eines Verfahrens, bei dem BCG in ein Kaninchen injiziert wird und zwei Wochen nach der Injektion mononucleare Phagozyten aus verschiedenen Kaninchengeweben erhalten werden, gefolgt von einer Zugabe von Endotoxin zur Zellkultur der mononuclearen Phagozyten (Br. J. Cancer, Bd. 44 [3], S. 418^424 [1981]). Allerdings ist in diesem Bericht die detaillierte Struktur der erhaltenen Substanz nicht erhalten, und weiterhin'gibt es keinen Anhaltspunkt, daß die erhaltene Substanz mit der im Serum gefundenen TNF identisch ist.