CH675423A5 - - Google Patents

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Description

La présente invention se rapporte à un polypeptide physiologiquement actif sensiblement pur humain ayant la séquence d'acides aminés décrite ici, des compositions pharmaceutiques contenant le polypeptide physiologiquement actif en tant qu'ingrédient efficace, et un procédé actif humain. Le polypeptide de la présente invention a une activité de FNT humain (Factum de Nécrose de la Tumeur). Sa séquence d'acides aminés est déduite de la séquence de base d'un acide désoxyribonucleique (ADN).

Dans la présente description, les acides aminés et les peptides sont représentés en utilisant des abré-vations, comme indiquées ci-dessous, approuvées par la Commission IUPAC-IUB sur la Nomenclature Biochimique (CBN). Par ailleures, pour les acides aminés et analogues ayant des isomères, ceux représentés par les abréviations qui suivent sont de la configuration L à moins que cela ne soit spécifié autrement.

Gin: résidu de glutamine

Asp: résidu d'acide aspartique

Pro: résidu de proline

Tyr: résidu de tyrosine

Val: résidu de valine

Lys: résidu de lysine

Glu: résidu de l'acide glutamique

Ala: résidu d'alanine

Asn: résidu d'asparagine

Leu: résidu de leucine

Phe: résidu de phénylalanine

Gly: résidu de glycine

His: résidu d'histidine

Ser: résidu de sérine

Thr: résidu de thréonine

Ile: résidu d'isoleucine

Trp: résidu de tryptophane

Arg: résidu d'arginine

Met: résidu de méthionine

Cys: résidu de cystéine.

Les polydésoxyribonucléotides et oligodésoxyribonucléotides sont représentés par les séquences des résidus de désoxynucléotide qui ont les abréviations qui suivent:

A: résidu d'acide 2'-désoxyadénylique C: résidu d'acide 2'-désoxycytidylique G: résidu d'acide 2'-désoxyguanylique T: résidu d'acide thymidylique

A moins que cela ne soit spécifié autrement, l'extrémité gauche de la séquence des désoxynucléotides est l'extrémité 5'.

On connaît diverses substances ayant la capacité de stimuler le système réticulo-endothélial, par exemple, les substances physiologiquement actives ayant une activité anti-tumeur qui sont induites par diverses bactéries Gram positif et endotoxines. Plus particulièrement, Carswell et autres ont découvert que le sérum de la souris suisse CD-1 infectée du bacilles de Calmette-guérin (BCG) et au bout de deux semaines, avec ensuite injection intraveineuse d'endotoxine, avait une activité cytotoxique contre les cellules L en culture et ont également découvert un phénomène selon lequel il induisait la nécrose hémorragique du sarcome Meth A transplanté chez la souris (BALB/c x C57BL/6)Fi. Ils ont donné le nom de FNT (facteur de nécrose de tumeur) à la substance active dans le sérum [Proc. Nat. Acad. Sci. EUA , Vol. 72 (N° 9), pages 3666-3670 (1975)]. Ensuite, Ruff et autres ont rapporté que le FNT du lapin préparé selon la méthode ci-dessus mentionnée proposée par Carswell et autres était purifié environ 2000 fois par rapport au sérum (J. Immunol., Vol. 125 (N° 4), pages 1671-1677 (1980)). Par ailleurs, Matthews et autres ont rapporté que le FNT du lapin était purifié à environ 1000 fois par rapport au sérum [Br. J. Cancer, Vol. 42, pages 416-422 (1980)]. Cependant, dans les ouvrages de Ruff et autres et de Matthews et autres, l'effet de nécrose de la tumeur par rapport à FNT purifié n'est pas confirmé dans des expériences sur animaux.

La divulgation du brevet japonais N° 57-140 725 (1982) révèle un procédé pour isoler et purifier une substance physiologiquement active protéinée ayant une activité antitumeur, qui est induite en administrant à un mammifère tel qu'une souris, un lapin ou un cobaye, au moins une substance ayant la capacité de stimuler le système réticulo-endothélial puis en injectant l'endotoxine d'une bactérie Gram négatif au mammifère, ou en ajoutant l'endotoxine d'une bactérie Gram négatif à une culture de tissus contenant les macrophages activés d'un mammifère. Dans cette description de brevet japonais, sont également révélés le poids moléculaire et le point isoélectrique de la substance physiologiquement active protéinée purifiée (poids moléculaire, 39 000 ± 5000 en mesurant par filtration sur gel et électrophorèse au gel de poly-acrylamide-SDS; point isoélectrique, pH 3,9 ± 0,3 en mesurant par focalisation isoélectrique) mais aucune structure détaillée de la substance physiologiquement active protéinée.

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Par ailleurs, Matthews a rapporté que l'on obtenait une substance ayant une activité cytotoxique con-treles cellules L par un procédé où l'on injecte BCG à un lapin et des phagocytes mononucléaires de divers tissus du lapin sont obtenus deux semaines après l'injection, avec ensuite addition d'endotoxine à la culture des cellules des phagocytes mononucléaires [Br. J. Cancer, Vol. 44 (3), pages 418-424 (1981 )]. Cependant, dans son rapport, la structure détaillée de la substance obtenue n'est pas révélée et par ailleurs, il n'y a aucune évidence montrant que la substance obtenue est identique à FNT que l'on trouve dans le sérum.

Par ailleurs, il y a un certain nombre de publications imprimées rapportant des facteurs avant une bioactivité ressemblant à FNT, ou une bio-activité semblable à celle de FNT. Par exemple, Reed et autres ont trouvé un tel facteur dans des macrophages et analogues présents dans le sang périphérique humain [J. Immunology, Vol. 115, page 395 (1975)], Matthews et autres dans des cellules de leucémie dérivées des monocytes du sang périphérique humain ou d'un patient souffrant de leucémie monocytique myélogène [immunology, Vol. 44, page 135 (1981)], D. Barbara dans les cellules humaines B transformées par le virus de Epstein-barr [Proc. Nat. Acad. Sci. EUA , Vol. 80, page 5397 (1983)], et B. Bharat dans la ligne de cellules de lymphoblastoïdes 1788. Les facteurs ci-dessus mentionnés sont également révélés dans les descriptions de brevets japonais Nos 58-15 921 (1983), 58-21 621 (1983), 58-107197 (1983) et 58-225 024 (1983) et les descriptions de brevets britanniques N°s 2 106 117 et 2117 385. Cependant, les cellules ou lignes de cellules pouvant efficacement produire de tels facteurs n'ont pas encore été trouvées. Par ailleurs, en ce qui concerne ces facteurs, il y a de nombreux points à élucider, comme leur structure et leurs propriétés.

Ito [Brevet japonais N° 58-251 817 (1983)] a effectué des études sur les propriétés et la structure de FNT du lapin et des cellules produisant FNT du lapin. Par suite, il a obtenu des cellules capables de produire une substance ayant une activité cytotoxique contre les cellules L en administrant une substance ayant la capacité de stimuler le système réticulo-endothélial à un lapin, avec ensuite injection d'endotoxine dérivée d'une bactérie dans le lapin, et a obtenu ensuite une telle substance en utilisant les cellules L. Il a également affirmé que le poids moléculaire et les propriétés immunologiques de la substance ayant une activité cytotoxique contre ces cellules-là obtenue en utilisant les cellules obtenues ci-dessus étaient en accord avec ceux de FNT obtenu du sérum du lapin. Par ailleurs, avec la progression des techniques de manipulation génétique, il est devenu possible de déterminer la structure d'une protéine tant qu'un ADN codant la protéine est obtenu sous forme isolée. Cela est ainsi parce que la structure de l'ADN isolé peut être déterminée et alors, la structure de la protéine peut être déduite de la structure de l'ADN. Par ailleurs, il est devenu possible de produire une protéine à partir d'un ADN codant la protéine en utilisant une culture de micro-organismes ou de cellules. Ito a appliqué les techniques de manipulation génétique ci-dessus mentionnées aux cellules capables de produire une substance ayant une activité cytotoxique contre les cellules L. Par suite, il a réussi à isoler un ADN codant le FNT du lapin, à déterminer les structures de l'ADN et du FNT du lapin et à produire le FNT du lapin en utilisant l'ADN.

Comme cela est apparent par ce qui précède, Ito a bien réussi dans la production de FNT du lapin. Cependant, il faut noter que l'administration de FNT à un animal qui n'est pas l'origine de FNT présente un danger de provoquer un choc anaphylactique. Cela est ainsi parce que FNT est un polypeptide et par conséquent lorsque l'on administre FNT à un animal qui n'est pas l'origine de FNT, FNT fonctionne en tant qu'antigène pour produire un anticorps. Pour cette raison, lorsque FNT est destiné à être administré à un corps humain, l'utilisation de FNT dérivé d'êtres humains est tout à fait préférable. Cependant, même la structure de FNT humain n'a pas encore été élucidée avec succès. Par conséquent, la détermination de la structure de l'ADN codant FNT humain est fortement nécessaire.

Les présents inventeurs ont effectué des études intensives sur la structure de l'ADN codant FNT humain. Par suite, les présents inventeurs ont trouvé de manière surprenante qu'un gène de polypeptide humain et un gène de FNT de lapin peuvent être clonés en utilisant ADNc ou lapin comme échantillon, que l'ADN codant le polypeptide humain peut être isolé avec soin et que sa structure peut être déterminée par comparaison entre le gène de FNT du lapin, le gène de polypeptide humain et l'ADNc du lapin par rapport à Phomologie de leurs séquences de base, que la structure de l'ADN pur codant le polypeptide humain peut être déterminée soigneusement et un tel ADN pur peut être obtenu et qu'un polypeptide humain produit en utilisant l'ADN codant le polypeptide humain a une activité cytotoxique contre les cellules L.

La présente invention est basée sur ces nouvelles découvertes.

Par conséquent, la présente invention a pour objet un polypeptide humain physiologiquement actif.

La présente invention a pour autre objet un procédé de production d'un polypeptide physiologiquement actif du type ci-dessus décrit.

L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant plusieurs modes de réalisation de l'invention et dans lesquels:

- la figure 1 illustre les cartes de restriction des insertions de plasmide, contenant chacune un ADN codant un polypeptide physiologiquement actif conventionnel du lapin;

- la figure 2 illustre l'organigramme du procédé de préparation d'un ADN recombinant (pFNT-lac-1 ) codant le polypeptide physiologiquement actif du lapin conventionnel;

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- la figure 3 montre l'organigramme du procédé de préparation d'un autre ADN recombinant (pFNT-1acUV5-1) codant le polypeptide physiologiquement actif conventionnel du lapin;

- la figure 4 montre la carte de restriction de la portion d'un plasmide contenant un gène pour un polypeptide physiologiquement actif humain de la présente invention;

- la figure 5 illustre la carte de restriction de la portion d'un plasmide contenant un gène pour un polypeptide physiologiquement actif de lapin conventionnel;

- la figure 6 montre l'organigramme du procédé de préparation d'un ADN recombinant (pHFNT-1acUV5-1) codant un polypeptide physiologiquement actif humain de la présente invention; et

- la figure 7 montre l'organigramme du procédé de préparation d'un autre ADN recombinant (pHFNT-1acUV5-2) codant le polypeptide physiologiquement actif humain de la présente invention.

Essentiellement, selon la présente invention, on prévoit un polypeptide physiologiquement actif humain ayant une séquence d'acides aminés représentée par la formule (I) qui suit Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu où Gin indique un résidu de glutamine, Asp un résidu d'acide aspartique, Pro un résidu de proline, Tyr un résidu de tyrosine, Val un résidu de valine, Lys un résidu de lysine, Glu un résidu d'acide glutamique, Ala un résidu d'alanine, Asn un résidu d'asparagine, Leu un résidu de leucine, Phe un résidu de phényl-alanine, Gly un résidu de glycine, His un résidu d'histidine, Ser un résidu de sérine, Thr un résidu de thréonine, Ile un résidu d'isoleucine, Trp un résidu de tryptophane, Arg un résidu d'arginine, Met un résidu de méthionine et Cys un résidu de cystéine.

Le polypeptide physiologiquement actif humain de la présente invention comprend également un polypeptide ayant un acide aminé méthionine attaché au terminus N de la séquence ci-dessus mentionnée d'acides aminés et un intermédiaire ayant un signal partiel ou entier de peptide pour FNT humain attaché au terminus N de la séquence ci-dessus mentionnée d'acides aminés. Il est possible de changer une partie de la structure d'un ADN codant un polypeptide par mutation naturelle ou artificielle sans changement significatif de l'activité du polypeptide. Le polypeptide physiologiquement actif humain de la présente invention comprend un polypeptide ayant une structure correspondant à la ou aux variantes homologues du polypeptide ayant la séquence ci-dessus mentionnée des acides aminés. Tous ces polypeptides physiologiquement actifs seront appelés ci-après «FNT humain».

Ledit polypeptide physiologiquement actif humain ayant une séquence d'acides aminés représentée par la formule (I) qui suit:

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu où Gin indique un résidu de glutamine. Asp un résidu d'acide aspartique, Pro un résidu de proline, Tyr un résidu de tyrosine, Val un résidu de valine, Lys un résidu de lysine, Glu un résidu d'acide glutamique, Ala un résidu d'alanine, Asn un résidu d'asparagine, Leu un résidu de leucine, Phe un résidu de phényl-alanine, Gly un résidu de glycine, His un résidu d'histidine, Ser un résidu de sérine, Thr un résidu de thréonine, Ile un résidu d'isoleucine, Trp un résidu de tryptophane, Arg un résidu d'arginine, Met un résidu de méthionine et Cys un résidu de cystéine.

L'acide désoxyribonucléique codant le polypeptide selon l'invention comprends au moins une séquence de base choisie dans le groupe consistant en une séquence de base représentée par la formule (II) qui suit et une séquence de base complémentaire de ladite séquence de base:

TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG

où A indique un résidu d'acide désoxyadénylique, G un résidu d'acide désoxyguanylique, C un résidu d'acide désoxycytidylique et T un résidu d'acide thymidylique et où l'extrémité gauche et l'extrémité droite de la formule (II) représentent le côté du groupe 5'-hydroxyle et le côté du groupe 3'-hydroxyle respecti4

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vement.

L'ADN codant le polypeptide de la présente invention comprend un ADN comprenant une séquence de base ayant ATG (A, T et G sont tels que mentionnés ci-dessus) attaché à l'extrémité 5' de la séquence de base ci-dessus mentionnée afin de produire du FNT humain mûr au moyen d'une culture d'un micro-organisme ou d'une cellule. L'ADN de la présente invention comprend également un ADN ayant un ADN à côté de la position 5' codant un signal partiel ou entier de peptide de FNT humain.

La structure d'un ADN et la structure du polypeptide qui en est déduite peuvent être partiellement changées par mutation naturelle ou artificielle sans provoquer un changement de l'activité principale du polypeptide. Par conséquent, l'ADN de la présente invention peut alternativement avoir une séquence de base qui code un polypeptide ayant une structure correspondant à celle d'une variante homologue de l'un des polypeptides ci-dessus.

Selon la dégénération du code génétique, il est possible de substituer au moins une base de la séquence de base d'un gène par une autre sorte de base sans forcer la séquence des acides aminés du polypeptide produit à partir du gène à changer. Par conséquent, l'ADN codant le polypeptide de la présente invention peut également avoir toute séquence de base qui a été changée par substitution selon la dégénération du code génétique. Dans ce cas, la séquence des acides aminés déduite de la séquence de base obtenue par la substitution ci-dessus mentionnée est identique à la séquence des acides aminés de formule (I) telle que définie précédemment.

L'ADN recombinant est capable, dans une culture de cellule ou de micro-organisme transformée, d'exprimer un polypeptide selon l'invention comprenant la séquence des acides aminés de FNT humain. Comme véhicule approprié, on peut mentionner, par exemple, les véhicules d'expression pHFNT-1acUV5-1 et pHFNT-1 acUV5-2.

Le polypeptide de la présente invention peut être exprimé par une culture d'un micro-organisme ou d'une cellule transformée par un ADN recombinant capable. Des exemples d'une telle culture de microorganisme ou de cellule comprend Escherichia coli. Bacillus subtilis. des levures et des cellules animales supérieures.

Selon un autre aspect de l'invention, on prévoit un procédé de production du polypeptide physiologiquement actif humain de la présente invention qui comprend:

(a) la liaison de l'acide désoxyribonucléique de la formule (II) ci-dessus définie à un véhicule d'expression replicable pour obtenir un ADN recombinant réplicable comprenant ledit acide désoxyribonucléique et ledit véhicule d'expression replicable;

(b) la transformation de cellules d'une culture de micro-organisme ou de cellule par ledit ADN recombinant replicable pour former des transformants;

(c) le choix desdits transformants de cellules parentes de la culture de micro-organisme ou de cellule;

(d) l'incubation desdits transformants, forçant lesdits transformants à exprimer ledit acide désoxyribonucléique et à produire un polypeptide physiologiquement actif humain; et

(e) l'isolement dudit polypeptide physiologiquement actif humain des transformants incubés.

Selon le procédé de la présente invention, l'acide polydésoxyribonucléique ci-dessus décrit de la présente invention est lié à un véhicule d'expression réplicacable entant que vecteur pour obtenir un ADN recombinant réplicable contenant l'acide polydésoxyribonucléique ci-dessus mentionné. Une culture de micro-organisme ou de cellule est transformée par l'ADN recombinant réplicable ainsi obtenu pour obtenir une culture de micro-organisme ou de cellule transformée contenant l'ADN recombinant. Le transformant ainsi obtenu est isolé de la culture de microorganisme ou de cellule parente au moyen d'un trait phé-notypique imparti avec l'ADN. On fait croître la culture transformée ainsi obtenue de micro-organisme ou de cellule pour effectuer l'expression de l'information génétique qui est codée sur l'acide désoxyribonucléique ci-dessus mentionné, pour ainsi produire un polypeptide physiologiquement actif selon la présente invention.

Un FNT humain sous forme mûre est sécrété de cellules hôtes en tant que produit d'expression directe. Comme procédé pour obtenir un tel FNT humain mûr, on peut mentionner par exemple un procédé consistant à construire une séquence d'ADN afin de lier une séquence d'acides aminés connue comme un peptide signal, composée de 15 à 40 acides aminés qui est dérivée d'un micro-organisme ou anima) supérieur au terminus de la séquence d'acides aminés du FNT mûr.

Le FNT humain peut être obtenu comme suit:

1. On a utilisé une génothèque bactériophage A/lapin et une génothèque bactériophage A/humain préparées par le Professeur T. Maniatis, Département de Biochimie et Biologie Moléculaires, Université de Harvard, 7 Divinity Avenue, Cambridge, Massachusetts 02138, E. U. A. Ces matériaux peuvent être préparés selon les processus qui suivent [voir Cell, 15, page 687 (1978)]:

1. des tissus de lapin ou humains, par exemple du tissu de pancréas de lapin ou humain, sont réduits en poudre gelée et traités pour digérer l'ARN et des matériaux de protéine et donnent, à la précipitation,

de l'ADN de lapin ou humain de fort poids moléculaire;

2. l'ADN de fort poids moléculaire est partiellement digéré pour une coupe statistique par rapport au lieu du gène;

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3. les fragments résultants d'ADN sont fractionnés pour donner des fragments de 15 à 20 kilo paires de bases (kb);

4. Les fragments résultants de l'étape 3 sont clonés en utilisant un vecteur phagique A. Charon 4A; et

5. les vecteurs résultants sont conditionnés in vitro en particules phagiques infectieuses contenant

ADNr pour obtenir la génothèque de lapin ou humaine ci-dessus mentionnée.

2. L'ADNc de FNT du lapin que l'on obtient à l'exemple de référence 3 est marqué 32p par la méthode de translation de P.W.J. Rigby et autres [voir J. Mol. Bio!. 113, page 237 (1977)].

3. Chacune des génothèques bactériophage A/lapin et bactériophage A/humain est plaquée à une confluence virtuelle sur un tamis de bactéries et l'hybridation est examinée avec l'ADNc de FNT du lapin marqué 32p.

4. A partir des clones appropriés, l'ADN correspondant est isolé, mis en carte de restriction et analysé par hybridation de Southern [voir E.M. Southern, J. Mol. Biol. 98, page 503 (1975)].

Des fragments de restriction contenant des gènes de FNT de lapin ou humains sont sous-clonés en vecteurs plasmidiques puis séquencés.

5. La séquence de base de l'ADNc de FNT du lapin est comparée à celle du gène de FNT du lapin pour déterminer les exons (certaines séquences de bases qui codent la séquence d'acides aminés du FNT du lapin) et introns (certaines séquences de bases qui ne codent pas la séquence d'acides aminés du FNT du lapin) du gène de FNT du lapin.

6. Ensuite, la séquence de bases du gène de FNT humain est comparée à celle du gène de FNT du lapin pour déterminer les exons et les introns du gène de FNT humain.

7. La séquence des acides aminés du FNT du lapin qui a été déduite de la séquence de bases obtenue en laissant les introns du gène du FNT du lapin et en combinant ses exons est affirmée comme étant en accord avec celle déduite de la séquence de base de l'ADNc de FNT du lapin. Ensuite, la séquence des acides aminés de FNT humain est déduite de la séquence de bases de l'ADN codant FNT humain obtenue en laissant les introns du gène de FNT humain et en combinant ses exons. La séquence des acides aminés de FNT humain est affirmée comme étant partiellement en accord avec celle du FNT du lapin.

9. Alors, l'ADN codant le FNT humain est déterminé in vitro pour insertion dans un véhicule d'expression approprié pour reformer l'ADN recombinant contenant l'ADN de codage. L'ADN recombinant est utilisé pour transformer une cellule hôte appropriée qu'à son tour, on laisse croître dans une culture et pour exprimer le FNT humain souhaité.

10. Le FNT humain ainsi produit a 155 résidus d'acide aminé sous sa forme mûre, commençant par la sérine. Lorsqu'il a un signal peptide dans sa préséquence, le signal peptide est de caractère très hydrophobe.

Ce qui précède révèle les processus pour obtenir le gène de FNT humain, la séquence de base de l'ADN codant le FNT humain et le procédé de production du FNT humain en utilisant l'ADN. Cependant, on comprendra que ce qui précède n'est pas destiné à limiter l'invention et que des changements évidents peuvent être apportés par ceux qui sont compétents en la matière sans changer les caractéristiques essentielles et le concept de base de l'invention.

Du fait de la fréquence variable d'utilisation d'un codon (code génétique) correspondant à chaque acide aminé et pour d'autres raisons, une partie partielle ou totale de la séquence de base de l'ADN codant le FNT humain peut être substituée par un ADN artificiel organique chimiquement synthétisé sans forcer la séquence des acides aminés du polypeptide qui en est obtenu à changer.

On suppose que le FNT humain peut être procédé intracellulairement sous forme immature en tant que prépeptide ou prépropeptide, que l'on peut faire croître par une forme intermédiaire en un FNT mûr au stade de traitement. Là forme immature du FNT humain peut être déduite de la séquence de base du gène de FNT humain. L'ADN de FNT comprenant un ADN codant le FNT sous forme immature ou intermédiaire peut également être recombiné à un ADN naturel ou artificiellement synthétisé.

Une application de cette technique peut être atteinte en insérant le codon méthionine (ATG) dans l'extrémité 5' et en insérant au moins un codon d'arrêt choisi parmi TAA. TAG et TGA à l'extrémité 3' de l'ADN de FNT mûr ou intermédiaire ou immature. Du fait de la présence du codon de méthionine, le FNT mûr ou intermédiaire ou immature peut être produit sur le ARNm synthétisé à l'aide d'un promoteur approprié. Cependant, le résidu de méthionine attaché au terminus N du FNT est scindé ou non scindé selon la sorte de la cellule hôte employée. L'insertion du codon d'arrêt a pour but d'arrêter la translation de l'ARNm transcrit de l'ADN du FNT en une position appropriée (terminus C du polypeptide de formule I).

Une autre application de cette technique peut être atteinte en a joutant , à l'ADN, une séquence de base très hydrophobe connue par «séquence du signal». Par cette addition, il peut devenir possible de sécréter le FNT vers l'extérieur de la cellule hôte, ou dans le cas d'une bactérie Gram-négatif, dans l'espace connu par «périplasme».

Lorsqu'un vecteur où un codon de départ est incorporé est employé, un peptide fondu peut être produit qui comprend le FNT humain et un peptide attribué au vecteur. Dans ce cas, le peptide fondu peut être scindé chimiquement ou enzymatiquement. Alternativement, le peptide fondu, si l'activité principale du FNT humain n'est pas affectée de manière néfaste, peut être utilisé tel qu' il est.

L'ADN de FNT humain peut être connecté, à sa région en amont de l'extrémité 5', à la séquence génétique d'un promoteur pour ainsi obtenir une séquence promoteur-ADN de FNT qui ne gêne pas sa réplica-

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tion et n'affecte pas de manière néfaste la translation de l'ARN résultant. La séquence promoteur-ADN de FNT ainsi obtenue peut être combinée à un vecteur qui est réplicable dans une bactérie ou une cellule d'organisme supérieur pour obtenir un gène recombinant. Le gène recombinant ainsi obtenu peut être utilisé pour transformer une bactérie ou une cellule d'organisme supérieur utilisée comme hôte. Le transformant ainsi obtenu peut être mis en culture pour effectuer l'expression du gène de FNT afin de produire le FNT humain.

Lorsque l'on utilise Escherichia coli comme hôte ci-dessus mentionné, on peut mentionner, comme hôte approprié, diverses souches mutantes de E. coli K-12 comme HB101 (ATCC33694), C600K (ATCC33955), D1210, RRI (ATCC31343), MC1061, LE392 (ATCC33572), JM101 (ATCC33876), JM83 et X 1776 (ATCC 31244). Lorsque l'on emploie E. coli comme hôte, on peut mentionner, comme vecteur approprié, des plasmides comme pBR322 pBR325, pBR327, pUC8, pUC9, pMB9 (ATCC37019), pJB8 (ATCC37074) et pKC7 (ATCC37084), des X phages comme X gt, X B et Charon 4A, et M13 phage. Pour que FNT soit produit dans la cellule de E. coli, un promoteur choisi parmi les promoteurs des gènes de E. coli et phagiques peut être employé. Des exemples d'un promoteur approprié comprennent les gènes pour l'enzyme de la dégradation du lactose (LAC), son mutant UV5, la pénicillinase (BLA) et la tryptophane synthétase (TRP), le promoteur de X phage Pl. et le promoteur tac qui est un promoteur fondu de tryptophane synthétase et de l'enzyme de dégradation du lactose.

Lorsque l'on utilise Bacillus subtilis comme hôte, on peut mentionner, comme hôte approprié, la souche BP170 (ATCC33608), la souche BR151 (ATCC33677) et la souche MI112 (ATCC33712). Lorsque l'on emploie l'hôte Bacillus subtilis. on peut mentionner, comme vecteur approprié, les plasmides pC194 (ATCC37034), pUB110 (ATCC37015), pSA2100 (ATCC37014) et pE194. Par ailleurs, lorsque l'on emploie l'hôte Bacillus subtilis. on peut mentionner, comme promoteur approprié, les gènes pour l'enzyme de l'acé-tylation du chloramphénicol (CAT), la pénicillinase et l'anti-érythromycine.

Lorsqu'une levure est utilisée comme l'hôte, on peut mentionner, comme hôte approprié, des souches de Saccharomvces cerevisiae comme RH218 (ATCC44076), SHY1 (ATCC44769), SHY3 (ATCC44771), D131A, 483 et 830.

Lorsque la levure hôte est employée, on peut mentionner, comme vecteur approprié, des plasmides comme YEp13 (ATCC37115), YEp6, YRp7 et Ylp5. Par ailleurs, lorsque la levure hôte est employée on peut mentionner, comme promoteur approprié, les gènes pour la phosphatase acide, l'alcool déshydrogé-nase (ADHI), la tryptophane synthétase (TRP), la phosphoglycérate kinase (PGK), le cytochrome B (COB) et l'actine.

Lorsqu'une culture de cellule d'un organisme supérieur est utilisée pour l'hôte, on peut mentionner, comme hôte approprié, les cultures de cellule du rein du singe, COS et la souris C127 (ATCC1616). Lorsque l'hôte de culture de cellule d'organisme supérieur est employé, on peut mentionner, comme vecteur approprié, le virus SV40 et le virus du polyome du bovin.

Le nouveau polypeptide physiologiquement actif humain selon la présente invention induit la nécrose des tumeurs sans effet toxique sur les tissus normaux du corps vivant. Le polypeptide actif de la présente invention peut être formulé selon des méthodes connues pour préparer des compositions pharmaceutiques qui sont utiles pour l'inhibition de la prolifération des cellules, comme la prolifération des cellules de tumeur maligne. Le polypeptide actif peut être combiné en mélange avec un véhicule de support acceptable en pharmacie. Une quantité efficace du polypeptide actif de la présente invention peut être mélangée à une quantité appropriée d'un véhicule afin de préparer des compositions pharmaceutique-ment acceptables appropriées à une administration effective au destinataire.

Le polypeptide physiologiquement actif de la présente invention peut être administré, à des sujets nécessitant un traitement anti-tumeur ou antiviral, sous la forme d'une injection, de gouttes oculaires, de gouttes nasales d'un agent d'inhalation, d'une préparation externe, d'une administration orale, d'une administration rectale ou d'un comprimé vaginal. La dose quotidienne du polypeptide de la présente invention par adulte peut généralement être comprise entre 50 et 100 000 000 d'unités. Elle peut être préférable entre 50 et 500 000 unités dans le cas d'une administration locale, entre 1000 et 1 000 000 d'unités dans le cas d'une injection générale comme une injection intraveineuse et une injection intramusculaire, et entre 10 000 et 100 000 000 d'unités dans le cas d'une administration orale. La dose quotidienne peut être accrue ou diminuée selon la direction d'utilisation et les symptômes du destinataire.

La terminologie «l'unité» utilisée ci-dessus signifie une quantité du polypeptide physiologiquement actif de la présente invention par laquelle 50% de 1 x 105 cellules/ml de cellules L-M (American Type Culture Collection CCL 1,2) sont tuées. La quantité ci-dessus mentionnée est mesurée comme suit. Comme récipients de culture, on emploie des plaques de microtitrage à 96 puits, produites par Flow Laboratories, Inc. (E.U.A.) et des cellules L-M sont mises en culture dans un milieu essentiel minimum de Eagle contenant 1 v\v % de sérum fœtal bovin [la composition de ce milieu est décrite par exemple dans Tissue Culture, édité par Junnosuke Nakai et autres, Asakura Shoten, Japon (1967)]. Un échantillon (0,1 ml) dilué en série avec le milieu et la suspension de cellules L-M (0,1 ml, 1 x 105 cellules/ml) sont mélangés dans chaque puits des plaques et les plaques sont incubées à 37°C pendant 48 heures dans de l'air contenant 5% de gaz carbonique. A la fin de la période de culture, on ajoute 20 ni de glutaraldéhyde pour fixer les cellules. Après fixation, les plaques sont lavées avec dè l'eau distillée et on les laisse sécher, et l'on ajoute 0,05% de bleu de méthylène (0,1 ml) pour teinter les cellules viables. Les plaques sont totalement

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lavées avec de l'eau distillée pour retirer le colorant en excès et on les laisse sécher. On ajoute de l'acide chlorhydrique à 0,36 N, à chaque puits, pour extraire le colorant des cellules teintées. L'absorbance de chaque puits à 665 nm est mesurée avec Titertek Multiskan produit par Flow Laboratories, Inc. L'absorbance est proportionnelle au nombre de cellules viables. La quantité ci-dessus mentionnée du polypeptide physiologiquement actif de la présente invention par laquelle 50% de 1 x 105 cellules/ml de L-M sont tuées est obtenue en représentant la dilution en fonction de l'absorbance sur un graphique.

Le polypeptide physiologiquement actif de la présente invention peut être avantageusement administré par voie parentérale. Dans la préparation parentérale, on peut incorporer, comme additif, un agent épaississant comme du saccharose, de la glycérine, de la méthylcellulose, de la carboxyméthylcellulose ou analogue et/ou un agent d'ajustement du pH comme divers sels inorganiques. Le polypeptide peut également être administré de manière appropriée sous la forme d'un comprimé. Dans le comprimé, on peut incorporer, comme additif, un véhicule comme de l'amidon, du lactose ou analogue.

Par suite d'expériences sur animaux, on a trouvé qu'une tumeur de souris était totalement guérie par une ou deux injections seulement, dans la plupart des cas. En particulier, une portion des cellules néoplastiques artificielles (cellules Meth-A) a été transplantée à la peau de chaque souris. Lorsque la tumeur a cru pour avoir un diamètre de 6 à 7 mm, on a injecté une quantité aussi faible que 0,6 ng du polypeptide de la présente invention. Une semaine plus tard, il est apparu une croûte. Deux semaines plus tard, des poils ont commencé à pousser, ce qui signifie une guérison complète de la tumeur. Ultérieurement, une gestation et une naissance réussie sont observées pour les souris.

La présente invention sera décrite en plus de détail en se référant aux exemples de référence et exemples d'utilisation qui suivent, qui ne doivent pas être considérés comme limitant le cadre de la présente invention.

Dans la mise en pratique de la présente invention, la construction d'un ADN recombinant et l'insertion d'un ADN recombinant à un micro-organisme a été effectué selon le processus décrit dans les rapports expérimentaux qui suivent [Littératures (1) à (4)], à moins que cela ne soit indiqué autrement.

(1) Yasutaka Takagi, Manual ForGenetic Engineering, Kodan-sha. Tokyo.

(2) Yasutaka Takagi, Expérimental Method In Genetic Engineering, Kodan-sha, Tokyo.

(3) T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sam Brook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

(4) Ray Wu et autres, Method in Enzymology, Volume 101, Académie Press, New York.

Abréviations utilisées dans les exemples de référence et les exemples:

MOPS: acide morpholinopropanesulfonique milieu LB: milieu de Luria-Bertani

DMSO: diméthylsulfoxyde

PFU: unité formant une plaque

EDTA: acide éthylènediaminetétraacétique

SDS: dodécyl sulfate de sodium

BRL: Bethesda Research Laboratories Inc.

DMT: diméthoxytrityle lac: lactose

Tris:tris(hydroxyméthyl)aminométhane

XAR-5: film aux rayons X fabriqué et vendu par Eastman Kodak Company, E.U.A.

1 x SSC : 0,15 M NaCl + 0,015 citrate de sodium, pH7

2 x SSC : 0,30 M NaCl + 0,030 M citrate de sodium, pH7

3 x SSC : 0,45 M NaCl + 0,045 M citrate de sodium, pH7

5 x SSC : 0,75 M NaCl + 0,075 M citrate de sodium, pH7

6 x SSC : 0,9 M NaCl + 0,09 M citrate de sodium, pH7

FDSS: 50% de formamide désionisé + 5 x Denhardt + 5 x SSPE + 0,1 % SDS + 100 ng/ml d'ADN de thymus de veau dénaturé.

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SSPE : 0,18 M NaCl + 10 mM NaH2P04 +

^ 1 mM EDTA, pH7.4

SM: mlieu de stockage de phages qui contient 5,8 g de NaCl, 2g de MgS0<r7H20, 50 ml de 1M Tris.Ci (pH7,5) et 5 mi de 2% de gélatine par litre bouillon NZ: milieu qui contient 10 g d'amine NZ, 5 g de NaCl et 2 g de MgS04-7H20 (l'amine NZ est un hydrolysat du type A de caséine fabriqué et vendu par Humko Sheffield Chemical Division de Kraft, Ine, E.U.A.)

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IPTG: isopropyl thiogalactoside x-gal: 5-bromo-4-chloro-3-indolylgalactoside

TAE: 0,04 M tris-acétate (pH8,0)-0,002 M EDTA solution de 5 x Denhardt: une solution aqueuse contenant Ficoll, 1.000 mg, polyvinylpyrrolidone 1.000 mg et BSA 1.000 mg par litre bp: paire de bases.

EXEMPLE REFERENTIEL 1

(Evaluation de l'activité cytotoxique contre les cellules L)

L'évaluation de l'activité cytotoxique de la substance physiologiquement active préparée dans les exemples référentiels et exemples qui suivent contre les cellules L est effectuée en mesurant son effet cytotoxique sur les cellules L929 (American Type Culture Collection CCL1), selon la méthode de Ruff et autres [voir Lymphognes, volume 2, édité par E. Pick. Academic Press, New York, page 235 (1980)] ou la méthode décrite dans J. Immunol., 126, page 1279 (1981). La méthode d'évaluation de l'activité cytotoxique de la substance physiologiquement active préparée dans les exemples sera expliquée ci-après.

Comme récipients de culture, on emploie des plaques de microtitrage à 96 puits, produites par Flow Laboratories, Inc. (E.U.A.) et des cellules L929 sont mises en culture dans le milieu essentiel minimum de Eagle contenant 1 v/v% de sérum de veau fœtal et 5 ng/ml (concentration finale) d'actinomycine D [la composition de ce milieu est décrite par exemple dans Tissue Culture édité par Junnosuke Nakai et autres, Asakura Shoten, Japon (1967)]. Un échantillon (0,1 ml) dilué en série avec le milieu et la suspension de cellules L929 (0,1 ml, 1 x 105 cellules) sont mélangés dans chaque puits des plaques et les plaques sont incubées à 37°C pendant 21 heures dans de l'air contenant 5% de gaz carbonique. A la fin de la durée de culture, on ajoute 20 ni d'une solution aqueuse à 20% de glutaraldéhyde pour fixer les cellules. Après fixation, les plaques sont lavées avec de l'eau distillée et on les laisse sécher, et on ajoute 0,05% de bleu de méthylène (0,1 ml) pour colorer les cellules viables. Les plaques sont totalement lavées avec de l'eau distillée pour retirer le colorant en excès et on les laisse sécher. On ajoute 0,36 N d'acide chlo-rhydrique, à chaque puits pour extraire le colorant des cellules teintées. L'absorbance de chaque puits à 665 nm est mesurée avec Titertek Multiskan produit par Flow Laboratories, Inc., E.U.A. L'absorbance est proportionnelle au nombre de cellules viables. L'activité cytotoxique de la substance physiologiquement active, unité/ml, est définie comme la dilution réciproque de la substance physiologiquement active qui provoque 50% de cytotoxicité, et on peut l'obtenir en représentant la dilution en fonction de l'absorbance sur un graphique. L'«unité 1 » utilisée dans les exemples référentiels signifie une quantité du FNT du lapin par laquelle 50% de 105 cellules/ml de cellules L929 sont tuées.

Par ailleurs, la quantité de protéine est déterminée par une méthode dans laquelle du bleu brillant de coomassie G250 est lié à la protéine, selon l'enseignement de Bradford et autres [voir Anal. Biochem. Volume 72, pages 248-254 (1976)].

EXEMPLE REFERENTIEL 2

Etape 1

(Préparation de FNT du sérum du lapin)

Des lapins femelles, pesant 2,5 à 3 kg, reçoivent une injection de 50 mg de Propionibacterium acnes tué à la formaline (Corvnebacterium oarvum. Wellcome Research Laboratories, Angleterre) par la veine auriculaire. Huit jours plus tard, on injecte de nouveau 100 jxg d'endotoxine (lipopolysaccharide de Escherichia coli 026:B6, produit par Difco Laboratories, E.U.A.), à travers la veine auriculaire et 2 heures après le sang entier est recueilli du cœur. Au sang recueilli, on ajoute de l'héparine sodium en une quantité de 100 unités pour 100 ml. Le sang est alors centrifugé tout en le refroidissant à 5.000 t/mn pendant 30 minutes pour retirer les cellules du sang et les solides insolubles. Par suite, on obtient un plasma (2,4 litres) ayant une activité cytotoxique de FNT du sérum de 3 x 104 unités/ml, des 40 lapins.

Etape 2

(Purification partielle de FNT du sérum du lapin)

Au plasma (2,4 litres) obtenu à l'étape 1, on ajoute 24 g de cellite. Le résultat est agité pendant 1 heure puis est soumis à une filtration. Le filtrat est mélangé à 1,2 litres de 0,04 M de tampon tris-HCI (pH 7,8) puis est appliqué à une colonne de DEAE-Sepharose CL-6B (fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals, Ine, Suède) suffisamment équilibrée avec 0,04 M de tampon tris-HCI (pH 7,8). La colonne est lavée avec 0,04 M de tampon tris-HCI contenant 0,1 M de NaCl, et le FNT adsorbé est élué avec 0,04 M de tampon tris-HCI (pH 7,2) contenant 0,18 M de NaCl. Les fractions présentant des activités cytoto-xiques contre les cellules L sont concentrées par Ultrafiltration. Le concentré ainsi obtenu est appliqué à une colonne de Sephacryl S-200 (fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals, Ine, Suède) suffisamment équilibrée avec 5 M de tampons de phosphate et filtré sur gel en utilisant le même tampon. Les fractions actives sont concentrées par Ultrafiltration, et on obtient ainsi un FNT purifié ayant une activité de 3,5 x 106 unités et une activité spécifique de 18 x 103 unités/mg.

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Etape 3

(Anticorps anti-FNT)

Le FNT du sérum du lapin partiellement purifié à l'étape 2 est mélangé à l'adjuvant complet de Freund (1:1), puis est injecté par voie sous-cutanée au dos d'une souris mâle BALB/cde 12 semaines. L'opération ci-dessus est répétée 2 et 4 semaines après l'injection initiale. Une semaine après la dernière injection, le sang entier est recueilli. Du sang recueilli, un sérum est obtenu.

Le sérum ainsi obtenu est ajouté au milieu de culture pour évaluation de l'activité cytotoxique de FNT contre les cellules L en une quantité telle qu'il soit dilué 500 fois à la concentration finale. L'activité cytotoxique du FNT du sérum du lapin contre les cellules L est évaluée de la même façon qu'on l'a décrit à l'exemple référentiel 1. On trouve que le FNT du sérum du lapin ne présente aucune cytotoxicité contre les cellules L. Par le résultat ci-dessus, on peut en conclure que le sérum de la souris obtenu dans cette étape contient un anticorps au FNT du sérum du lapin que l'on appellera ci-après «anticorps anti-FNT»).

EXEMPLE REFERENTIEL 3

Etape 1

(Préparation de cellules produisant FNT)

Un lapin femelle reçoit une injection intraveineuse de cellules tuées à la formaline de Propionibacterium acnes ( Corvnebacterium parvum. Wellcome Research Laboratories, Angleterre). Sept jours plus tard, le lapin est soumis à une trachéotomie, et le poumon est lavé avec une solution saline physiologique, et on obtient ainsi des cellules flottantes. Les cellules ainsi obtenues sont lavées avec une solution saline physiologique. En utilisant, comme milieu de culture, RPMI 1640 (Flow Laboratories Ine, E.U.A.) contenant 10 v/v% de sérum fœtal de veau, les cellules sont incubées à 37°C dans de l'air contenant 5% de gaz carbonique. La culture de cellules est divisée en deux groupes, et à l'un d'entre eux on ajoute, à une concentration de 10 g/ml, l'endotoxine dérivée de Escherichia coli (lipopolysaccharide de Escherichia coli 026:B6 produit par Difco Laboratories, E.U.A.). La même quantité d'eau stérile est ajoutée à l'autre. Le liquide surnageant de la culture de cellules où l'endotoxine est ajoutée présente une activité cytotoxique contre les cellules L et l'activité atteint la valeur maximum en 7 heures. Cette activité est dissipée par l'anticorps anti-FNT, mais n'est pas dissipée par le sérum normal de souris.

Par ailleurs, le liquide surnageant de la culture de cellules où aucune endotoxine n'est ajoutée ne présente pas de cytotoxicité contre les cellules L.

Etape 2

(Poids moléculaire de FNT)

A la culture de cellules préparée à l'étape 1 où l'on a ajouté l'endotoxine, on ajoute encore de la L-[35S] méthionine radioactive (1300 Ci/mmole, produite par Amersham Industries pic, Angleterre) (1 mCi/ml).

Selon la méthode de Laemmli [voir Laemmli. U.K. (1970), Nature (Londres), volume 227, pages 680-685], le liquide surnageant est analysé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS. La concentration du gel est ajustée à 12,5% en poids. Après Pélectrophorèse, le gel est traité avec ENHANCE® (dénomination commerciale d'un produit de New England Nuclear Inc. E.U.A.), et après séchage, il est exposé à un filmaux rayons X (Fuji RX, fabriqué et vendu par Fuji Photo Film Co., Ltd. Japon). Dans le liquide surnageant de la culture de cellules en présence d'endotoxine, on observe qu'une substance avant un poids moléculaire d'environ 17 500 se forme.

Par ailleurs, le liquide surnageant de chaque culture de cellules préparée à l'étape 1 est soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS de la même facon qu'on l'a décrit ci-dessus. Ensuite, l'on agite le gel dans 2,5% de NP 40® (agent tensio-actif vendu par Calbiochem, E.U.A.) pendant 1 heure puis ensuite dans l'eau pendant 2 heures. Après agitation, chaque voie de migration est séparée en coupant, et on coupe en bandes de 2 mm de large dans une direction perpendiculaire à la direction de migration. Chaque bande est mise en culture avec des cellules L, et on évalue l'activité cytotoxique contre les cellules L. Dans la voie sur laquelle le liquide surnageant de la culture de cellules contenant l'endotoxine se développe, la cytotoxicité contre les cellules L est observée en une position correspondant au poids moléculaire de 17 500. Aucune cytotoxicité n'est observée aux autres positions.

Etape 3

(Extraction de ARNm)

La culture de cellules préparée à l'étape 1 est incubée pendant 2 heures après addition d'endotoxine, avec ensuite centrifugation pour recueillir les cellules. L'extraction de TARN cytoplasmique des cellules recueillies et l'extraction de ARNm de l'ARN cytoplasmique sont effectuées selon la méthode de Chirgwin et autres [voir Chirgwin, J.M. et autres, Biochemistry, volume 18, page 5294 (1979)]. On ajoute 4 ml d'une solution à 4 M de thiocyanate de guanidine à 3 x 108 cellules, et le mélange est pulvérisé au moyen

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d'un homogénéiseur (modèle: AM-7, fabriqué et vendu par Nihon Seiki Seisakusho, Japon). Les résidus sont retirés par oentrifugation et on y dissout 2,4 g de chlorure de césium. Le mélange est versé avec soin dans un tube en polyallomère où l'on avait introduit à l'avance 2,5 ml d'une solution à 5,7 M de chlorure de césium et 0,1 M de EDTA (pH 7,5), et ensuite on soumet à une ultracentrifugation à 30.000 t/mn pendant 12 heures à 20°C en utilisant un rotor Beckman SW41 (fabriqué et vendu par Beckman Instrument, E.U.A.). Après enlèvement du liquide surnageant, la boulette est dissoute dans 1 ml d'un tampon tris-HCI à 10 mM (contenant 5 mM de EDTA et 1 poids/volume % de SDS). La solution résultante est extraite avec un mélange à 4:1 en volume de chloroforme et de 1 -butanol. Dans la phase aqueuse, on ajoute 0,05 volume d'acétate de sodium à 2 M et 2,5 volumes d'éthanol, et on laisse au repos à -20°C pendant 2 heures ou plus pour ainsi précipiter l'ARN. Le précipité est recueilli par oentrifugation, séché, puis dissous dans 500 p.l d'eau stérile. Par suite, on obtient une solution d'ARN cytoplasmique.

La solution d'ARN ci-dessus obtenue est chauffée à 68°C pendant 2 minutes et ensuite est rapidement refroidie. On ajoute, dans la solution, 500 |il d'une concentration à 2 fois d'un tampon tris-EDTA à 10 mM (pH 7,4) (contenant 1 mM d'EDTA, 0,1 poids/volume % de SDS et 0,5 de chlorure de lithium), et le mélange est appliqué à une colonne de 200 mg d'oligo dT-cellulose (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories. Ine, E.U.A) et lavé avec 10 ml du même tampon (concentration une fois) que ci-des-sus décrit. Le matériau retenu par la colonne est élué avec 2 ml d'un tampon d'élution contenant 10 mM d'un tampon tris-HCI pH 7,4,1 mM de EDTA et 0,1 poids/volume % SDS. A l'éluat, on ajoute 0,05 volume d'une solution d'acétate de sodium et 2,5 volumes d'éthanol, et on refroidit le mélange à -20°C pour précipiter. Le précipité est recueilli par filtration et appliqué à la colonne d'oligo dT-cellulose, et les fractions adsorbées sur l'oligo dT-cellulose sont recueillies. On récupère 85 g d'ARNm en déterminant par analyse du spectre ultraviolet.

Etape 4

(Fractionnement de ARNm)

On dissout 880 |ig de ARNm préparé par la même méthode qu'à l'étape 3, dans 250 jil d'eau et la solution résultante est disposée en couche sur un gradient de densité linéaire de saccharose de 10 ml à 5-25%. Le gradient de densité de saccharose est préparé au moyen de l'appareil ISCO 570 (fabriqué et vendu par ISCO Inc., E.U.A) en utilisant des solutions de tampons tris [contenant 25 mM de tris-HCI (pH 7,2), 2 mM de EDTA et 1 poids/volume % de SDS] respectivement contenant 5% de saccharose et 25% de saccharose.

En utilisant un rotor Beckman SW41, une ultracentrifugation est effectuée à 40.000 t/mn pendant 12 heures à 4°C et des fractions, chacune de 400 ni, sont récupérées par un dispositif de récupération de fractions (fabriqué et vendu par Beckman Instrument, E.U.A. ) puis précipitées dans l'éthanol. Les fractions précipitées sont centrifugées et dissoutes dans l'eau stérile.

Etape 5

(Expérience sur la translation de ARNm)

La translation de ARNm en utilisant des oocytes de Xenopus laevis (matériau d'enseignement biologique de Hamamatsu) est entreprise selon le processus décrit dans les rapports expérimentaux (par exemple Hiroshi Teraoka, Mikio Itsuki et Kentaro Tanaka «Protein, Nucleic acid, Enzyme», Genetic Engineering, extra édition., 1981, page 602). Xenopus laevis provient des matériaux d'enseignement biologique de Hamamratsu. Le ARNm fractionné obtenu à l'étape 4 est dissous dans l'eau stérile pour avoir une concentration de 1 ng/nl et la solution est injectée à des oocytes en une quantité si faible que 50 ni par cellule. Les cellules sont alors mises en culture pendant 24 heures dans une solution de Barth [contenant 7,5 mM de tris-HCI (pH 7,6 ), 88 mM de NaCl, 1 mM de chlorure de potassium, 0,33 mM de nitrate de calcium, 0,41 mM de chlorure de calcium, 0,82 mM de sulfate de magnésium, 2,4 mM de bicarbonate de soude, 18 U/ml de pénicilline G et 18 ng/ml de streptomycine] qui contient 1 mg/ml d'albumine de sérum bovin. Les oocytes sont écrasés, dans le liquide de culture, au moyen d'une barre en verre. Le liquide de culture est alors centrifugé et le liquide surnageant est évalué pour l'activité cytotoxique contre les cellules L. ARNm qui sera translaté pour donner un polypeptide ayant une activité maximum se sédimente sous forme de 16 S en dimension. Cette activité est éliminée par l'anticorps anti-FNT obtenu à l'étape 3 de l'exemple référentiel 2, mais n'est pas éliminée par le sérum normal de la souris.

Etape 6

(Préparation des transformants)

En utilisant 5 ng de ARNm fractionné obtenu à l'étape 4, on prépare un ADN à deux brins selon le processus décrit dans la littérature (1 ), à partir de la page 96. Pour la transcriptase inverse, on utilise un produit de Life Science, Ine, E.U.A. L'ADN à deux brins est fractionné sur un gel de Polyacrylamide à 3,5% et on obtient des fractions de 330 ng d'environ 1.000 à 2.000 bp. Selon le processus décrit dans la littérature (1 ), on étend 7 ng de cette fraction avec des résidus désoxyC en utilisant la désoxynucléotidyl transférase terminale (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, Ine, E.U.A.) et on re11

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cuit avec 56 ng de plasmide pBR322 ayant été digéré avec Pstl et étendu avec les résidus de désoxyG. Le mélange ainsi recuit est inséré dans la souche E. coli K-12 (HB101, ATCC 33694) pour transformer la souche. Par suite, on obtient 12.000 transformants.

Etape 7

(Séquence d'acides aminés partiels du FNT du lapin)

Du FNT de lapin partiellement purifié à l'exemple référentiel 2 (activité: 5 x 107 unités) est soumis à un électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS pour une purification comme à l'étape 2. Une partie du gel est teintée avec le bleu brillant de Coomassie. Une bande à la position correspondant au poids moléculaire de 17.000 est découpée du gel, et est extraite avec 1% de bicarbonate d'ammonium. On récupère, sous forme de protéine, environ 180 ng de FNT.

On dissout 150 ng du FNT récupéré dans 75 ni de 1% de bicarbonate d'ammonium, avec ensuite addition de 3 ng de trypsine TPCK (fabriquée et vendue par Worthington Biochemical, E.U.A.). Le mélange est incubé à 37°C pendant 4 heures. Le mélange est alors fractionné au moyen d'une colonne de Chromatographie liquide très rapide comprenant Cosmosil 5C8 (fabriqué et vendu par Nakarai Chemical Ltd, Japon) en tant que matériau de garniture, pour ainsi obtenir les fragments digérés avec la trypsine.

Le FNT très purifié et ses fragments digérés à la trypsine sont alors soumis à un dessalage au moyen d'une colonne de Sephadex G-25 puis lyophilisés. Selon la méthode de R.M. Hewick et autres (voir J. Biol. Chem., volume 256, pages 7990-7997, 1981), le FNT purifié et les fragments digérés à la trypsine sont soumis à une dégradation de Edman à partir du terminal N. L'acide aminé-PTH libéré à chaque étape est analysé par la méthode habituelle au moyen d'une Chromatographie très rapide modèle SP8100 (fabriqué et vendu par Spectra physics, E.U.A. ) en utilisant Solpacks ODS(fabriqué et vendu par E.I. Du Pont, E.U.A.), comme colonne. Par suite, on trouve que le FNT a la séquence d'acides aminés suivante au terminal N: Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln-

L'un des fragments digérés à la trypsine a la séquence N terminale d'acides aminés qui suit.

Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met Ala

Etape 8

(Synthèse d'échantillon d'oligodésoxynucléotide)

Des oligodésoxynucléotides complémentaires de la séquence des bases de ARNm que l'on déduit de la séquence des acides aminés du FNT du lapin obtenue à l'étape 7 de l'exemple référentiel 3 sont synthétisés selon la méthode perfectionnée du phosphotriester qui a déjà été rapportée par le présent inventeur dans H. Ito et autres «Nucleic Acid Res.» 10, 1755-1769 (1982). Pour préparer les oligodésoxynucléotides, 128 oligodésoxynucléotides estimés à partir de la séquence des acides aminés du FNT du lapin sont répartis en cinq groupes, c'est-à-dire des groupes de 16, 16, 32, 32 et 32 et sont synthétisés sous forme de mélanges d'oligodésoxynucléotides des groupes respectifs. Les oligodésoxynucléotides obtenus des groupes respectifs sont déprotégés selon la méthode habituelle et purifiés par Chromatographie en colonne en utilisant Sephadex G-50 (fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals Ine, Suède), électrophorèse sur un gel de Polyacrylamide à 20% en poids contenant 7 M d'urée et Chromatographie en colonne en utilisant DE52 (fabriqué et vendu par Whatman Ltd, E.U.A.). Les oligodésoxynucléotides des groupes respectifs ainsi obtenus sont dialysés par rapport à une solution tampon à 0,1 mM de tris-EDTA.

Chacun des oligodésoxynucléotides purifiés des groupes respectifs est marqué en utilisant la poly-nucléotide kinase T4 (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, Inc. E.U.A.) et le t32-P-adénosine triphosphate selon la méthode habituelle et ensuite on purifie par Chromatographie en colonne en utilisant DE52 (fabriqué et vendu par Whatman Ltd, E.U.A. La matière radioactive est incorporée dans chacun des oligodésoxynucléotides des groupes respectifs en une quantité d'environ 3x108cpm/ng. Les oligodésoxynucléotides échantillons obtenus sous la forme d'un mélange du groupe respectif sont désignés comme cela est montré au tableau 1.

Une partie de la séquence des aminoacides du FNT du lapin, de la séquence de base de ARNm estimée à partir de la séquence des aminoacides du FNT du lapin et des séquences des bases des oligodésoxynucléotides synthétiques échantillons des groupes respectifs sont montrées au tableau 1.

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Tableau 1

Séquence

Carboxyle

Ala

Met

Pro

Glu

Ala

Glu

Glu..

Amino d'acides aminés terminal...

terminal

ARNm

3'

XCG

GTA

XCC

YAG

XCG

YAG

YAG..

5'

MH échantillon

5'

GC

CAT

MGG

MTC

GGC

MTC

MTC

3'

Ml échantillon

5'

GC

CAT

NGG

MTC

GGC

MTC

MTC

3'

MJ échantillon

5'

GC

CAT

ZGG

MTC

AGC

MTC

MTC

3'

MK échantillon

5'

GC

CAT

ZGG

MTC

CGC

MTC

MTC

3'

ML échantillon

5'

GC

CAT

ZGG

MTC

TGC

MTC

MTC

3'

Note:

X représente un résidu d'acide ribonucléique de A, C, G ou U. Y représente un résidu d'acide ribonucléique de A ou G. M représente un résidu d'acide désoxyribonucléique de T ou C. N représente un résidu d'acide désoxyribonucléique de A ou G.

Z représente un résidu d'acide désoxyribonucléique de A, C, G ou T.

ARNm des cellules produisant FNT que l'on obtient selon l'étape 3 de l'exemple référentiel 3 est traité avec une solution contenant 1M de glyoxal, 10 mM de NaHaPCW et 50% en volume de diméthyl sulfoxyde à 50°C pendant 60 minutes puis est soumis à un fractionnement en utilisant une électrophorèse sur un gel agarose à 1/1% en poids. Le ARNm fractionné est transféré sur un filtre d'un dispositif de transfert du type électrophorèse (fabriqué et vendu par Bio Rad, E.U.A.) selon le manuel du fabricant. Alors, le ARNm sur le filtre du dispositif est traité avec une solution à 5 x Denhardt contenant une solution de 5xSSC et 150 ng/ml d'ADN de spermatozoïdes de saumon dénaturé à 65°C pendant 2 heures et ensuite on traite avec une solution à 5 x Denhardt contenant 1 x 107 cpm/ml des oligodésoxynucléotides marqués et une solution à 5 x SSC à 50°C pendant 2 heures. Le filtre obtenu ci-dessus est lavé avec une solution à 6 x SSC en succession quatre fois à la température ambiante, 40°C, 50°C et 60°C. Un film aux rayons X XAR-5 (fabriqué et vendu par Eastman Kodak Company, E.U.A.) est exposé au rayonnement du filtre. Par suite, on trouve que les oligodésoxynucléotides désignés par MJ échantillon sont plus fortement hy-bridés avec le ARNm, montrant que Poligodésoxynucléotide ayant une séquence de base qui est totalement complémentaire de ARNm est contenu dans les oligodésoxynucléotides désignés par Mg échantillon.

Etape 9

(Clonage du gène de FNT du lapin)

Selon le processus décrit dans la littérature (2), page 162, les transformants obtenus à l'étape 6 de l'exemple référentiel 3 sont transférés à un filtre de cellulose et l'ADN des transformants est hybridé avec l'oligodésoxynucléotide marqué (MJ échantillon) choisi à l'étape 8 de l'exemple référentiel 3 dans les mêmes conditions qu'à l'étape 8 de l'exemple référentiel 3 (hybridation des colonies). Dans le processus ci-dessus, 49 colonies qui sont fortement hybridées avec les oligodésoxynucléotides marqués (MJ échantillon) sont choisies et encore fixées sur un autre filtre de nitrocellulose. Alors, en utilisant 49 colonies, une plus ample hybridation est effectuée pour choisir 9 colonies qui sont plus fortement hybridées par les oligodésoxynucléotides marqués (MJ échantillon).

Selon le processus rapide de séparation des plasmides décrit dans la littérature (1 ) page 6, on obtient environ 5 ng de plasmide de chacune des 9 colonies. Chacun des plasmides obtenus est scindé en utilisant des enzymes de restriction, Pstl, Taol. Rsal et Pvull (chacun étant fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, Ine, E.U.A.) selon le processus décrit dans le manuel du fabricant, avec ensuite électrophorèse effectuée sur un gel agarose à 1% en poids. Alors, les fragments obtenus par scission par les enzymes de restriction respectifs sont comparés par rapport à leur longueur.

Les résultats suggèrent que les 9 souches correspondant aux 9 colonies ont la séquence des bases du fragment obtenu par scission par Pvull et Rsal et consistant en environ 50 bp et que la plus grande partie des 9 souches ont la séquence des bases du fragment obtenu par scission par Rsal et consistant en environ 200 bp. En d'autres termes, les résultats suggèrent que les 9 souches ont des séquences des bases partiellement communes. Les résultats d'analyse par les enzymes de restriction sont montrés à la figure 1.

Sept souches contenant des plasmides désignés au tableau 2 ci-dessous sont mises séparément en culture dans 2 ml d'un milieu LB contenant 10 ng/ml de tétracycline jusqu'à ce que la densité optique des solutions montre les valeurs indiquées au tableau 2 ci-dessous, avec ensuite oentrifugation pour obtenir les souches respectives. Chacune des souches obtenues est séparément ajoutée dans 2 ml d'une solution saline physiologique et rompue par sonication. Les solutions obtenues sont soumises à une centri-

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fugation et l'activité cytotoxique contre les cellules L des liquides surnageants obtenus et déterminée. Les résultats sont montrés au tableau 2 ci-dessous. Comme essai blanc, les mêmes processus que ceux mentionnés ci-dessus sont répétés en utilisant une souche contenant le plasmide pBR322. Les résultats sont également montrés au tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2

Plasmide

Nombre de paires de bases recuites

OD600

Adtivité cytotoxique contre les cellules L (unité/ml) •

pB2—2

1400

1,369

35

pB2—3

800

1,605

<10

pB2-7

1060

1,364

<10

pR9

1550

1,618

<10

pR 12

1400

1,458

15

pR 18

1850

1,438

<10

pR25

1350

1,514

<10

pBR 322

0

1,677

<10

L'activité cytotoxique contre les cellules L est éliminée par l'anticorps anti-FNT mais n'est pas éliminée par le sérum normal de souris. Cela montre que toutes les neuf colonies ci-dessus mentionnées ont des plasmides qui contiennent des oligodésoxynucléotides codant FNT.

Etape 10

(Détermination de la séquence des bases de l'ADN codant le FNT du lapin)

Des souches de E. coli contenant les plasmides pB2-7 et pR 18 sont mises en culture dans 1 litre du milieu M9 décrit dans la littérature (3), page 440 et contenant 10 ng/ml de tétracycline. Alors, selon le processus décrit dans la littérature (3), page 90, chacun des plasmides est isolé en une quantité d'environ 50 ng.

La séquence des bases de l'insertion de chaque plasmide est déterminée selon le processus chimique de Maxam-Gilbert décrit dans Maxam et autres «Méthod in Enzymology», 55, page 490 (1980), Academic Press. La séquence des bases ainsi déterminée se révèle être en accord avec les séquences partielles d'acides aminés déterminées à l'étape 7 de l'exemple référentiel 3. Ainsi, la séquence complète du FNT du lapin est considérée comme étant élucidée.

Etape 11

Dans cette étape, la construction d'un plasmide est effectuée en utilisant le plasmide recombinant pR12 pour obtenir l'expression directe de FNT dans E. coli en utilisant ]aç comme promoteur. Les processus sont montrés à titre d'exemple sur la figure 2. D'abord, 10 ng du plasmide pR12 sont digérés avec 10 unités de Aoal (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, Ine, E.U.A.) à 37°C pendant

2 heures et on électrophorèse sur un gel de Polyacrylamide à 4% en poids pour isoler des fragments de 630 bp. On isole environ 1 ng du fragment, du gel, par électroélution. De la même façon qu'à l'étape 8 de l'exemple référentiel 3, deux oligodésoxynucléotides montrés sur la figure 2, c'est-à-dire 5'-GATCCA-TGTCAGCTTCTCGGGCC-3' et 5'-CGAGAAGCTGACATG-3' sont synthétisés. Alors, chaque extrémité 5' des oligodésoxynucléotides (environ 100 pmoles est phosphorylée en utilisant la polynucléotide ki-nase T4 selon la méthode décrite dans la littérature (3), page 122. Après accomplissement de la réaction, le mélange réactionnel est extrait avec du phénol puis avec du chloroforme. Alors, les oligomères de synthèse obtenus sont mélangés à 0,5 ng du fragment de 630 bp de Aoal et précipités à l'éthanol. Le fragment est lié avec les oligomères synthétiques à 4°C pendant une nuit en utilisant 10 unités d'ADN li-gase T4 selon le processus décrit dans la littérature (1) page 37. Après accomplissement de la réaction, le mélange réactionnel est précipité dans l'éthanol et digéré avec 20 unités de BamHI à 37°C pendant

3 heures avec ensuite électrophorèse effectuée sur un gel de Polyacrylamide à 4% en poids pour récupérer un fragment de 670 bp par électroélution 1 n9 d'un plasmide commercialisé pUC-8 (catalogue N° 4916, fabriqué et vendu par P-L Biochemicals, Ine, E.U.A) et digéré avec BamHI et extrait avec du phénol puis avec du chloroforme, avec ensuite précipitation dans l'éthanol pour obtenir un vecteur. On lie 0,5 ng du vecteur ainsi obtenu au fragment ci-dessus obtenu ayant des sites de BamHI à ses deux extrémités et contenant environ 170 bp codant FNT en utilisant l'ADN ligase T4. Selon le processus décrit dans la littérature (4), page 20, E. coli est transformé en utilisant le vecteur ci-dessus obtenu et mis en culture sur un milieu d'agar contenant 1 mM de IPTG et 0,004% (poids/volume) de X-gal pour obtenir en14

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viron 200 colonies blanches. L'ADN plasmidique est préparé à partir de ces transformants et est digéré avec BamHI. Par suite, on trouve que 15 plasmides contiennent le fragment BamHI roulu (environ 670 bp). Afin d'examiner la direction d'insertion, les 15 plasmides ci-dessus sont digérés avec EcoRI n'ayant qu'un site de reconnaissance sur son pUC-8 et Pvull n'ayant qu'un site de reconnaissance sur sa partie de fragment d'environ 670 paires de bases et on électrophorèse sur un gel à 6% en poids de Polyacrylamide. Par suite, on détermine que 7 plasmides ont le fragment voulu consistant en environ 140 bp et que la direction de transcription du promoteur Jaç sur pUC-8 est en accord avec celle des oligodésoxynucléotides codant FNT.

L'analyse de la séquence de l'ADN montre que ces sept plasmides ont la même séquence et ont la séquence souhaitée des nucléotides aux jonctions entre le promoteur Jaç, l'ADN de synthèse et ADNc.

La construction d'autres plasmides est effectuée en utilisant le plasmide recombinant pR17 afin d'obtenir l'expression directe de FNT dans E. coli en utilisant Jaç UV5 comme promoteur. Les processus sont montrés à titre d'exemple sur la figure 3. D'abord, 10 ng du plasmide pR17 sont digérés avec 10 unités de Apal (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, Ine, E.U.A.) à 37°C pendant 2 heures et on électrophorèse sur un gel de Polyacrylamide à 4% en poids pour isoler un fragment consistant en environ 630 bp. On isole environ 1 ng du fragment, du gel, par électroélution. De la même façon qu'à l'étape 8, on fait la synthèse des oligodésoxynucléotides montrés sur la figure 3, c'est-à-dire 5'-AATTCATGT-CAGCTTCTCGGGCC-3' et 5'-CGAGAAGCTGACATG-3'. Alors, chaque extrémité 5' des deux oligodésoxynucléotides (environ 100 pmoies) est phosphorylée en utilisant la polynucléotide kinase T4 selon la méthode décrite dans la littérature (3), page 122. Après accomplissement de la réaction, le mélange réactionnel est extrait avec du phénol puis avec du chloroforme. Alors, les oligomères de synthèse sont mélangés à 0,5 ng du fragment Apal précédemment obtenu (environ 630 bp) préparé à partir du plasmide pR17 et précipités à l'éthanol. Le fragment est lié avec les oligomères de synthèse à 4°C pendant une nuit en utilisant 10 unités de ligase T4 selon le processus décrit dans la littérature (1) page 37. Après accomplissement de la réaction, le mélange réactionnel est précipité dans l'éthanol et digéré avec 20 unités de EcoRI à 37°C pendant 3 heures, avec ensuite électrophorèse effectuée sur un gel de Polyacrylamide à 4% en poids pour récupérer un fragment (environ 670 bp) par électroélution.

Selon le processus décrit par F. Fulier «Gene», 19, pages 42-54 (1982), on prépare le plasmide pOP95—15.

1 ng de pOP95-15 est digéré avec EcoRI et extrait avec du phénol puis avec du chloroforme, avec ensuite précipitation dans l'éthanol pour obtenir un vecteur. En utilisant l'ADN ligase T4, on lie 0,5 ng du vecteur obtenu avec le fragment (environ 670 bp) obtenu par liaison de Poligonucléotide de synthèse avec l'oligonucléotide codant FNT. Selon le processus décrit dans la littérature (4), page 20, E. coli JM101 (ATCC 33876) est transformé en utilisant le vecteur obtenu ci-dessus et mis en culture sur un milieu contenant 1mM de IPTG et 0,004% (poids/volume) de X-gal pour obtenir environ 150 colonies blanches. L'ADN plasmidique est préparé à partir de 100 de ces colonies et digéré avec EçoRI. Par suite, on trouve que 12 plasmides contiennent le fragment voulu de EçoRI (670 bp). Afin d'examiner la direction d'insertion, les 12 plasmides ci-dessus sont digérés avec Pvull et Pstl et on électrophorèse sur un gel agarose à 1,5% en poids. Par suite, on détermine que quatre plasmides ont les fragments souhaités (environ 1280 bp et environ 2600 bp) et que la direction de transcription du promoteur Jaç UV5 est en accord avec celle des oligodésoxynucléotides codant FNT.

L'analyse des séquences des bases montre que ces 4 plasmides ont la même séquence et que le promoteur Jaç UV5, Poligodésoxynucléotide de synthèse et ADNc sont bien combinés les uns aux autres. Les plasmides obtenus sont désignés par pFNT-lacUV5-1.

Etape 12

(Purification du FNT produit par E. coin

Des souches de E. coli contenant des plasmides obtenus à l'étape 11 sont mises en culture dans 50 ml du milieu LB contenant d'ampicilline à 37°C pendant une nuit. Alors, les souches sont transférées à 5 litres de milieu LB contenant 100 ng/ml d'ampicilline et de plus mises en culture à 37°C pendant 3 heures. On ajute de l'isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, Ine, E.U.A.), jusqu'à une concentration finale de 1 mM. Une plus ample mise en culture est effectuée pendant 6 heures, avec ensuite refroidissement. Les souches sont recueillies par centrifugation. De la même façon qu'on l'a décrit à l'étape 11, les souches sont ajoutées à 5 litres d'une solution à 0,04 M de tampon tris-HCI (pH 7,8) et brisées par sonication pour obtenir une solution de protéine des souches. La solution obtenue a une activité cytotoxique contre les cellules L de 5 x 107 unités/l.

La solution obtenue est purifiée de la même façon qu'à l'étape 2 de l'exemple référentiel 2 pour obtenir 1,2 x 106 unités de FNT. L'activité spécifique de FNT est de 6,8 x 107 unités/mg.

Etape 13

(Evaluation en utilisant le sarcome Meth A transplanté à la souris).

2 x 105 cellules de sarcome Meth A sont transplantées intradermiquement dans la zone abdominale d'une souris BALB/c et, 7 jours plus tard, des souris ayant des tumeurs de 7 à 8 mm de diamètre et sans

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nécrose centrale spontanée sont choisies pour une évaluation. Un échantillon (0,2 ml) du FNT obtenu à l'étape 12 de l'exemple référentiel 3 et dilué avec une solution saline physiologique est injecté à travers la veine de la queue. L'activité de l'échantillon est évaluée au bout de 24 heures selon les critères suivants.

(-): pas de changement

(+): légère nécrose hémorragique

(++): nécrose hémorragique modérée -{nécrose centrale s'étendant sur environ 50% de la surface de la tumeur)

(+++): nécrose hémorragique marquée (nécrose massive laissant un petit bourrelet viable sur le pourtour de la tumeur).

20 jours après l'injection de l'échantillon, des observations sont faites concernant la dégénération des tumeurs et le taux de rétablissement est déterminé selon l'expression qui suit.

Nombre de souris qui se sont totalement rétablies de

.. . -, • _ la tumeur Taux de rétablissement = — — —

Nombre de souris utilisées pour l'essai

Les résultats sont montrés au tableau 3.

Tableau 3

Quantité injectée de FNT

Nombre de

Evaluation de l'activité des échantil

Taux de rétablisse du lapin produit par E. coli souris utilisées lons (au bout d'un jour)

ment (au bout de unité/souris pour l'essai

— + +

+++

20 jours)

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Référence

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(saline physiologique)

EXEMPLE 1 Etape 1

(Transformation de la souche MC1061 de E. coli K12 par les plasmides pR18, pB2-7 et pB2-2)

Des colonies de la souche MC1061 de E. coli K12 sont transformées avec chacun des plasmides pR18, pB2—7 et pB2—2, que l'on obtient à l'exemple référentiel 3, selon les processus habituels. Plus particulièrement, des colonies de la souche MC1061 de E.coli K12 sont mises en culture dans le milieu LB jusqu'à ce que la densité optique du bouillon de culture devienne de 0,3 à 550 nm. On recueille 50 ml de la culture de E. coii. on lave avec un mélange de 25 ml contenant 10 mM de MOPS (pH 7,0) et 10 mM de RbCI, et on remet en suspension dans 25 ml d'un mélange contenant 0,1 M de MOPS (pH 6,5), 50 mM de CaCte et 10 mM de RbCI. La suspension résultante est refroidie sur de la glace pendant 30 minutes, centrifugée et mise en suspension dans un mélange de 2 ml du mélange ci-dessus mentionné contenant 0,1 M de MOPS (pH 6,5), 50 mM de CaCfe et 10 mM de RbCI et 30 ni de DMSO. A une portion de 200 ni de la suspension résultante, on ajoute séparément 10 ni de chacune des solutions d'ADN plasmidique. Chacun des mélanges résultants est refroidi sur de la glace pendant 30 minutes puis subit un choc thermique à 44°C pendant 60 secondes. Immédiatement après, 5 ml du milieu LB préchauffé à 37°C sont ajoutés à chacun des mélanges chauffés avec ensuite incubation à 37°C pendant 1 heure. Chacun des bouillons de culture obtenus est soumis à une oentrifugation pour former des boulettes de cellules. Le liquide surnageant est évacué et le milieu LB est ajouté et agité pour remettre chacune des boulettes de cellules en suspension. Chacune des suspensions résultantes est inoculée à une plaque d'agar LB contenant 30 ng/ml de tétra-cycline, avec ensuite incubation à 37°C pendant une nuit. Par suite, on obtient des colonies de transformants résistant à la tétracyciine, chacun étant transformé par les plasmides pR18, pB2-7 et pB2-2.

Etape 2

(Préparation d'ADN plasmidiques pB2-7 et pR18)

Chacun ces transformants respectivement transformés avec les plasmides pB2-7 et pR18 que l'on obtient à l'étape 1 est soumis à (1) une croissance du transformant et une amplification du plasmide; (2) une récolte et une lyse du transformant et (3) une purification de l'ADN plasmidique, selon les processus dé16

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crits aux pages 88-96 de T. Maniatis, E.F. Fritsch et J. Sambrook, «Molecular cloning», publié par Cold Spring Harbor Laboratory, E.U.A. A titre d'exemple, chacun des transformants est inoculé dans le milieu LB 30 ng/ml téhacycline et incubé à 37°C sous agitation vigoureuse. Cette étape est répétée pour atteindre une croissance du transformant une amplification du plasmide. La culture de transformant est recueillie par oentrifugation à 4.000g pendant 10 minutes à 4°C. Le liquide surnageant est rejeté. La boulette résultante est lavée dans 100 ml de STE froid-glace [0,1 M de NaCl, 10 mM de Tris.CI (pH 7,8) et 1 mM de EDTA] et est soumise à une lyse par ébullition en utilisant 20 mg/ml de lysozyme 10 mM de Tris-Cl, pH 8,0. Le produit visqueux est transféré à un tube d'ultracentrifugeuse et on centrifuge à 25.000 t/mn pendant 30 minutes à 4°C pour obtenir une solution d'ADN. Le volume de la solution d'ADN est mesuré. Pour chaque millilitre, on ajoute exactement 1 g de chlorure de césium et on mélange doucement jusqu'à ce que tout le sel soit dissous. On ajoute 0,8 ml d'une solution de bromure d'éthidium (10 mg/ml dans H2O), pour 10 ml de la solution de chlorure de césium. La densité finale de la solution est de 1,55 g/ml et la concentration du bromure d'éthidium est d'environ 600 ng/ml. La solution de chlorure de césium est transférée à un tube approprié à la oentrifugation, et le restant du tube est rempli d'huile de paraffine légère. La oentrifugation est entreprise à 45.000 t/mn pendant 36 heures à 20°C pour obtenir deux bandes d'ADN, sa bande supérieure consistant en ADN bactérien linéaire et ADN plasmidique circulaire entaillé et sa bande inférieure consistant en ADN plasmidique circulaire fermé. La bande inférieure d'ADN est recueillie dans un tube en verre par une aiguille hypodermique insérée dans le coté du tube. Le bromure d'éthidium est retiré, et la phase aqueuse est dialysée par rapport à TAE. La solution d'ADN plasmidique est traitée avec RNase, et extraite avec un volume égal de phénol équilibré. La phase aqueuse est mise en couche sur une colonne de Bio-Gel A-150 équilibrée dans TAE (pH 8,0) et 0.1% de SDS. L'ADN dans la colonne est lavé et un réservoir de TE avec 0,1% de SDS est appliqué pour recueillir les fractions. Les fractions sont précipitées avec l'éthanol pour obtenir un ADN plasmidique pur.

En entreprenant les processus ci-dessus, on obtient 250 ng d'ADN plasmidique pB2-7 pur et 134 ng d'ADN plasmidique pR18 pur.

Etape 3

(Translation de l'entaille des ADN plasmidiques pB2-7 et pR18 purs)

De l'ADN plasmidique pB2-7 pur obtenu à l'étape 2, on prend 40 ng que l'on digère avec l'enzyme de restriction Pstl et on soumet à une électrophorèse à travers 4% de gel d'acrylamide. Après l'éiectropho-rèse, l'ADN est teinté et la bande souhaitée est découpée pour isoler une insertion de Pstl.

En utilisant 500 ng de l'insertion isolée de Pstl, la translation d'entaille est effectuée à la façon décrite dans Maniatis, T. et autres, proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 72, 1184 (1975). Pour la translation d'entaille, l'appareil de translation d'entaille produit et vendu par Bethesda Research Laboratories. Ine, E.U.A., est employé, et on applique 80 pmoles de dCTP radioactif dans un système réactionnel de 25 ni (à 400 Ci/mmoles). A un mélange consistant en:

2,5 ni de la solution A (solutions de dNTP)

2,5 ni de la solution B (500 ng d'ADN d'essai par rapport à l'insertion de Pstl)

5 n' de dCTP chaud (3200 Ci/mmole)

I,3 ng de CTP froid (65 pmoles, 50 pmoles/nl de dCTP)

II,2 ni de la solution E (H2O)

22,5 ni (total)

on ajoute 2,5 ni de la solution C (DNase I, ADN Polymérase I), et on fait réagir à 15°C pendant 60 minutes. Alors, la solution D (tampon d'arrêt) est ajoutée au mélange résultant pour arrêter la réaction. D'autre part ARNt de support est ajouté, on soumet deux fois à une précipitation dans l'éthanol et oh dissout dans 500 ni d'eau. L'activité spécifique par ng d'ADN est de 9,3 x 107 cpm.

Pour l'ADN plasmidique pR18 pur obtenu à l'étape 2, les processus ci-dessus décrits sont également mis en œuvre pour effectuer la translation de l'entaille. L'activité spécifique par ng d'ADN de 7 x 107 cpm.

Etape 4

(Préparation du fragment d'insertion Rsal de l'ADN plasmidique pR18)

80 ng de l'ADN plasmidique pR18 sont digérés avec l'enzyme de restriction Rsal. et on soumet à une électrophorèse à travers 4% de gel de Polyacrylamide. Les bandes souhaitées d'insertions qui suivent sont découpées et purifiées au moyen de la colonne BND:

environ 640 bp 3,77 ng (récupération 52%)

environ 175 bp 1,77 ng (récupération 50%)

L'insertion ci-dessus d'environ 640 bp est désignée par le fragment 3' de pR18 (ce qui signifie la région 3' non translatée de pR18), et l'insertion ci-dessus d'environ 175 bp est désignée par pR18-cfr (ce qui signifie la région de codage de pR18).

Par ailleurs, les processus ci-dessus sont répétés en utilisant les enzymes de restriction Pstl et Mstll au lieu de l'enzyme de restriction Rsal pour obtenir la bande qui suit:

17

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CH 675 423 A5

environ 450 bp 3,65 ng (récupération 60%)

L'insertion ci-dessus est désignée comme le fragment 5' de pR18.

Etape 5

(Isolement du gène de FNT génomique humain)

L'insertion de plasmide pB2-7 marqué 32p que l'on obtient à l'étape 3 de l'exemple 1 est utilisée comme échantillon d'hybridation pour sélectionner 10B plaques de génothèque de bactériophage Charon 4A/humain préparées par insertion dans le site de liaison de EcoRI de Charon 4A [Blattner et autres «Science» 196. 161 (1977)] de fragments dimensionnés à partir d'ADN humain partiellement digéré [Maniatis et autres «Cell» 15, 687 (1978)]. La méthode d'hybridation des plaques de Benton et Davis [Benton et Davis «Science», 196: 180 (1977)] est utilisée. Comme tout le bactériophage de la culture de départ ne contient pas la matière génétique nécessaire pour la préparation du FNT humain, un échantillon qui a une séquence de bases complémentaire du gène de FNT du lapin est utilisée. L'ADN des plaques de phage ayant la matière génétique souhaitée incorpore l'échantillon radioactif et on les identifie par leur radioactivité. Neuf plaques hybridantes sont isolées de la génothèque.

Les processus et conditions utilisés sont comme suit:

1) Nombre de plaques:

environ 1 x 106 plaques (environ 4 x 104 plaques/ plaque 0 150 mm x 25)

2) Transfert à des filtres de nitrocellulose:

[voir Benton et Davis, Science, 196.186 (1977)]

3) Hybridation:

addition de 1,25 x 105 cpm/ml d'échantillon d'insertion p B2-7 préparé à l'étape 3 de l'exemple 1, 42°C 19,5 heures

4) Lavage:

2 x SSC - 0,1 % SDS à la température ambiante

Immersion 10 minutes x 4 J.

1 xSSC— 01% SDS à 50°C Immersion 30 minutes x 2

5) Exposition:

XAR-5 (Eastman Kodak Company E.U.A.)

-80°C, 2 écrans d'intensification, 39 heures.

Dans la sélection ci-dessus, on obtient 12 souches candidates. De la même façon qu'on l'a mentionné ci-dessus, une seconde sélection est effectuée pour obtenir 9 souches contenant le fragment voulu. En utilisant ces souches, une troisième sélection est effectuée de la même façon qu'on l'a mentionné ci-dessus pour obtenir 9 souches contenant le fragment voulu. En utilisant les souches obtenues, une quatrième sélection est effectuée pour confirmer que les 9 souches contiennent le fragment voulu. Les 9 bactériophages obtenus contenant le fragment voulu sont désignés par HG-I à HG-9, respectivement.

Etape 6

(Isolement du gène FNT génomique du lapin)

On répète sensiblement le même processus que décrit à l'étape 5 de l'exemple 1 à l'exception que l'on utilise 6,7 x 105 plaques de génothèque de bactériophage Charon 4A/lapin, que l'on prépare en utilisant l'ADN du lapin digéré [Maniatis et autres, Cell, 15, 687 (1978)] au lieu d'ADN humain digéré, au lieu des 106 plaques de la génothèque bactériophage Charon 4A/humaine. Ainsi, on obtient deux souches de bactériophage (RG-1 et RG-2) contenant le gène FNT génomique du lapin.

Etape 7

(Analyse de maculage de Southern de clones humains)

En utilisant les bactériophages HG-3, HG-6 et HG-7 obtenus à l'étape 5 de l'exemple 1, on obtient l'ADN de chaque bactériophage selon les processus qui suivent.

On met 6 x 101° cellules de E. coli LE392 (cellule hôte) en suspension dans 18 ml de SM et on ajoute 3 x 109 PFU de bactériophage HG-3,mpermettant ainsi à E. coli d'être infecté à 37°C pendant 20 minutes. Alors, le mélange obtenu est ajouté à 3 litres de bouillon NZ et est soumis à une culture sous agitation à 37°C pendant 23 heures. On ajoute 60 ml de CHCI3 au mélange et on soumet encore à une culture sous agitation pendant 30 minutes. NaCl est ajouté au mélange jusqu'à une concentration finale de 1 M, on laisse le mélange au repos pendant 15 minutes avec ensuite oentrifugation pour obtenir le liquide surnageant. Alors, on ajoute du polyéthylène glycol (poids moléculaire: environ 6.000) au mélange de façon que la concentration de polyéthylène glycol soit de 10% (poids/volume) et on laisse au repos pendant 22 heures à 4°C. Les bactériophages sont recueillis par oentrifugation. Les bactériophages obtenus

18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 675 423 A5

sont mis en suspension dans 28 ml de SM et on ajoute un volume égal de CHCI3. Après agitation au moyen d'un appareil Vortex pendant 30 secondes, le mélange est soumis à une oentrifugation pour obtenir une phase aqueuse. On ajoute SM à la phase aqueuse de facon que la quantité totale soit de 30 ml. On ajoute 26,4 g de CsCI au mélange obtenu et on dissout doucement, avec ensuite ultracentrifugation (45.000 t/mn, 20 heures) pou obtenir les bactériophages sous la forme d'une bande. Le mélange obtenu contenant les bactériophages est par rapport à 10 mM de NaCI-50 mM de tris(pH 8)-10 mM de MgC^. Alors, on ajoute EDTA, la protéinase K et SDS au mélange de façon que leurs concentrations soient de 20 mM, 50 (xg/ml et 0,5% (poids/volume), respectivement. Alors le mélange est traité à 65°C pendant 1 heure et est extrait avec du phénol, un mélange de phénol et de CHCI3 (1:1 en volume) puis avec CHCI3. La phase aqueuse ainsi obtenue est dialysée par rapport à 10 mM de Tris (pH 8)-1 mM EDTA. La mesure d'absorption ultraviolette de la phase aqueuse obtenue montre que l'on obtient ADN pur du bactériophage HG-3.

On répète sensiblement les mêmes processus que décrits par rapport à la préparation d'ADN du bactériophage HG-3 pour obtenir les ADN des bactériophages HG-6 et HG-7.

Ainsi, on obtient 2.920 ng de HG-3,1.100 ng de HG-6 et 819 ng de HG-7.

Selon la méthode de Southern [E.M. Southern, J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)], l'analyse de maculage de Southern des ADN obtenus est accomplie. Les processus et conditiors sont comme suit.

1) ADN:

HG-3 825 ng chacun HG-6 935 ng chacun HG-7 685 ng chacun

2) Digestion avec divers enzymes de restriction:

10 unités BamHI. 10 unités EcoRI

3510 unités BamHI + 10 unités EcoRI 10 unités Hindlll.

10 unités Hindlll + 10 unités EcoRI 10 unités Pvull 37°C, 3 heures

3) Electrophorèse:

0,8% gel agarose TAE

28 V, 15,5 heures

4) Transfert à des filtres de nitrocellulose

[voir E. M. Southern, J.Mol.Biol., 98 503 (1975)]

5) Pré-Hybridation:

30 ml de FDSS 42 °C, 6 heures

6) Hybridation:

fragment 5' (1 x 105 cpm/ml) de pR18 (préparé à l'étape 4 de l'exemple 1)

42°C,14 heures

7) Lavage:

2 x SSC - 0,1 % SDS à la température ambiante Immersion 10 minutes x 4

i

1 x SSC - 0,1% SDS à 50°C Immersion 30 minutes x 2

8) Exposition:

XAR-5 (Eastman Kodak Company, E.U.A.)

-80°C, 2 écrans d'intensification, 14 heures

Les résultats de l'hybridation sont montrés au tableau 4.

19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CH675 423 A5

Tableau 4

Enzyme Clone Dimension de fragment d'hybridation bactériophage) avec échantillon (PR18)

Extrémité 5' Extrémité 3'

BamHI

HG-3

6,7 kb

<-

-6

11,2 kb

<-

-7

9,2 kb

<-

BamHI +EölRl

HG-3

2,9 kb

<-

-6

2,9 kb

■e—

-7

2,9 kb

«-

EcoRI

HG-3

2,9 kb

<-

-6

2,9 kb

«-

-7

2,9 kb

■e-

Hindlll + EcoRI

HG-3

2,9 kb

<-

-6

2,9 kb

«-

-7

2,9 kb

<—

Hindlll

HG 3

9,7 kb

^—

-6

4,1 kb

<-

-7

9,7 kb

<-

Pvull

HG-3

2,2 kb

0,9 kb

-6

1,9 kb

0,9 kb

-7

2,2 kb

0,9 kb

Note: Le symbole «<-» signifie que le même fragment s'hybride.

Etape 8

(Analyse de maculage de Southern des clones du lapin)

On répète sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 7 de l'exemple 1 à l'exception que chacun des bactériophages RG-1 et RG-2 est utilisé au lieu de chacun des bactériophages HG-3, HG-6 et HG-7. Ainsi, on accomplit l'analyse de maculage de Southern. Par suite, on trouve que le fragment 5' de pR18 est hybridé avec un seul fragment d'une bande de fragments que l'on obtient par scission de RG-1 et RG-2 avec chacun de BamHI. EçoRI, Bglll, Hindlll et BamHI + EcoRI. séquence des bases codant FNT.

Etape 9

(Construction des clones bactériens contenant le gène FNT génomique humain).

La méthode de Landy et autres [Biochemistry, volume 13. 2134 (1974)] est utilisée pour obtenir l'ADN de HG-3 comme on l'obtient à l'étape 5 ci-dessus. 33 ng de l'ADN HG-3 résultant sont digérés avec 80 unités de EcoRI à 37°C pendant 3 heures. Le condensé subit une électrophorèse sur 1% de gel agarose à faible point de fusion (conditions: 1 x TAE, 20 V, 14,5 heures). La bande de 2,9 kb est isolée du gel agarose comme décrit par T. Maniatis [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, page 377 (1982)]. Plus particulièrement, le gel découpé de la partie de bande de 2,9 kb est chauffé à 65°C pendant 15 minutes. Le fragment de HG-3 scindé par EcoRI ayant une longueur de 2,9 kb (souvent appelé ci-après «fragment de 2,9 kb de HG-3/EçoRI») est récupéré du gel fondu par extraction trois fois avec du phénol puis trois fois avec un autre solvant d'extraction avec ensuite précipitation avec de l'éthanol contenant de l'acétate d'ammonium. Ainsi, on obtient 637 ng (rendement: environ 30%) de fragment de 2,9 kb de HG-3/EcoRI.

On lie 255 ng du fragment ci-dessus obtenu à 56,5 ng de pUC 13 scindé par EcoRI [J. Messing, Methods in Enzymology, volume 101, 20 (1983)] en utilisant 2,5 unités de ligase T* à 4°C pendant 20 heures.

La souche JM83 de E. coli K12 est transformée en utilisant le produit de liaison ci-dessus obtenu. Plus particulièrement, la souche JM83 de E. coli K12 est mise en culture dans le milieu LB jusqu'à ce que la densité optique du bouillon de culture soit de 0,3 à 550 nm. On recueille 50 ml de la culture de la souche JM83 de E. coli K12. on lave avec 25 ml mM de MOPS (pH 7,0) 10 mM de RbCI et on remet en suspension dans 25 ml de 0,1 M de MOPS (pH 6,5)-5 mM CaCl2-10 mM RbCI. La suspension est refroidie sur de la glace pendant 30 minutes, centrifugée et remise en suspension dans un mélange de 2 ml de 0,1 M MOPS

20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

CH 675 423 A5

(pH 6.5) -50 mM CaCfe-IO mM RbCI et 30 ni de DMSO. A 203 ni de la suspension. On ajoute 10 ni d'une solution aqueuse d'un produit de liaison contenant 10 ng du produit de liaison. Le mélange est refroidi sur de la glace pendant 30 minutes puis est chauffé à 40°C pendant 60 secondes. Immédiatement après, on ajoute, au mélange chauffé, 5 ml de bouillon LB préchauffé à 37°C, avec ensuite incubation à 37°C pendant 1 heure. Le bouillon de culture obtenu est soumis à une oentrifugation et le liquide surnageant est retiré. Un milieu LB est ajouté à la boulette résultante de cellules, puis on inocule sur une plaque de LB contenant 30 ng/ml d'ampicilline et 40 ng/ml de X-gal. Des colonies contenant la souche JM83 de E. coli K12, qui ont été transformées avec les plasmides ayant l'insertion sont blanches, tandis que celles contenant la souche JM 83 de E. coli K12 qui ont été transformées avec le plasmide seul sont bleues. Les colonies blanches obtenues sont inoculées de nouveau une plaque LB contenant 30 ng/ml d'ampicilline et 40 ng/ml de X-gal dans le but d'une confirmation.

Des colonies blanches ci-dessus obtenues, on choisit 10 colonies (clones bactériens) et on sélectionne en utilisant une technique «mini-prep».

Plus particulièrement, chaque colonie est mise en culture pendant une nuit dans le milieu LB contenant 30 ng/ml d'ampicilline. Les cellules en croissance sont recueillies et mises en suspension dans 2 mg/ml d'une solution comprend de lysozyme-50 mM de glucose-10 mM de EDTA-25 mM de tris HCl (pH 8,0). On laisse la suspension au repos à la température ambiante pendant 5 minutes, avec ensuite addition de 200 ni de 0,2 N NaOH-1% SDS. Après lente agitation, on laisse la suspension au repos à la température ambiante pendant 2 minutes. Ensuite, on ajoute 150 ni d'acétate de sodium à 3 M (pH 5,2), et on laisse au repos à -20°C pendant 10 minutes avec ensuite oentrifugation pendant 15 minutes pour récupérer le liquide surnageant résultant. Au liquide surnageant, on ajoute 900 ni d'éthanol froid avec ensuite oentrifugation pendant 5 minutes pour obtenir le précipité résultant. Le précipité obtenu est lavé avec 70% d'éthanole et séché pour obtenir un ADN plasmidique. Dans la méthode ci-dessus mentionnée, 10 ADN plasmidique sont obtenus. Chaque ADN plasmidique est dissous dans 10 mM de Tris-0,1 mM de EDTA (pH 8,0), digéré avec EcoRI et est soumis à une électrophorèse pour une analyse par restriction. Les conditions de digestion et d'électrophorèse sont comme suit.

Digestion: solution d'ADN plasmidique, un cinquième de la quantité préparée ci-dessus;

EcoRI. 3 unités, 37°C, 1,5 heures

Electrophorèse: 1% de gel agarose; 1 x TAE; 120 U; 2 heures.

L'analyse par restriction ci-dessus montre que huit des dix clones sont positifs. En effet, les huit clones ont un fragment de 2,9 kb. Des huit clones positifs, un clone est choisi et est désigné par souche JM83 (pHGE) de E. coli K12 (ATCC 39 656).

On répète sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 2 ci-dessus pour préparer 1,89 mg d'ADN de pHGE,à l'exception que l'on utilise la souche JM83 (pHGE) de E. coli K12 au lieu de E. coli récoltant pB2-7etpR18.

Etape 10

(Sous-clonage de RG-1 scindé par EçoRI)

On digère 30 ng de RG-1 tel que préparé à l'étape 6 ci-dessus avec EcoRI. Du mélange de fragments résultant, le fragment ayant une longueur d'environ 3,5 kb est récupéré sensiblement de la même manière qu'à l'étape 9 ci-dessus, à l'exception que l'on utilise le mélange de fragments ci-dessus préparé et 0,8% de gel agarose à faible point de fusion. On obtient 1,0 n9 du fragment RG-1 scindé par EcoRI (environ 3,5 kb). Le fragment de RG-1 scindé par EcoRI (3,5 kb) ci-dessus obtenu est lié à pUC13 digéré par EçoRI sensiblement de la même façon qu'à l'étape 9 ci-dessus à I' exception que le fragment scindé par EcoRI (3,5 kb) ci-dessus obtenu est utilisé au lieu du fragment HG-3 scindé par EcoRI (2,9 kb).

La transformation de la souche JM83 de E. coli K12, a sélection des clones bactériens, la digestion des clones et l'électrophorèse sont effectuées sensiblement de la même façon qu'à l'étape 9 ci-dessus à l'exception que le produit de liaison ci-dessus obtenu est utilisé. Le clone obtenu est désigné par souche JM83 (pRGE) de E. coli K12 (ATCC 39 655).

On répète sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 2 ci-dessus pour préparer 1,70 mg d'ADN de pRGE, à l'exception que l'on utilise la souche JM83 (pRGE) de E. coli K12 au lieu de pB2-7 et PR-18.

Etape 11

(Analyse de l'enzyme de restriction de l'ADN du plasmidique pHGE)

L'analyse de l'enzyme de restriction de l'ADN de pHGE obtenu à l'étape 9 ci-dessus est effectuée selon la méthode décrite dans Maniatis [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 98 (1982)].

Les processus et conditions utilisés sont comme suit.

1) Digestion de l'ADN de pHGE avec EcoRI:

18,6 ng d'ADN de pHGE

64 unités de EcoRI

37°C, 2 heures

2) Précipitation dans l'éthanol: précipite

21

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CH 675 423 A5

3) Addition d'eau distillée au précipité:

Préparation de 1 |ig/ml d'une solution de pHGE scindé par EcoRI

4) Digestion avec divers enzymes de restriction:

1 ng de PHGE/ECORI

Enzyme de restriction: 5 unités de Pvull. 5 unités de Pvull + 10 unités de Rsal. 10 unités de Rsal. 4 unités de Mstll. 3 unités de Aval, 9 unités de Pstl.

37°C, 2 heures

5) Electrophorèse

2% gel agarose, 1 x TAE 28 V 14,5 heures

6) Transfert au filtre de nitrocellulose:

[voir E.M. Southern , J. Mol. Biol., 98,503 (1975 )]

7) Première pré-hybridation:

30 ml de FDSS

42°C, 6 heures

8) Première hybridation fragment 5' (5 x 104 cpm/ml) de pR18 (préparé à l'étape 4 ci-dessus) 42°C, 14 heures

9) Lavage:

2 x SSC - 0,1 % SDS à la température ambiante Immersion 10 minutes x 4

4-

1 x SSC - 0,1% SDC à 50°C Immersion 30 minutes x 2

10) Exposition:

XAR-5 (Eastman Kodak Company, E.U.A.)

—80°C, 2 écrans d'intensification, 17,5 heures

11) Rinçage:

0,5 M NaOH -1,5 M NaCl (Immersion: 1 minute)

0,5 M Tris- 1,5 M NaCl (Immersion: 1 minute)

l

3 x SSC (Immersion: 1 minute)

12) Exposition:

Effectuée de la même façon qu'en 10) ci-dessus, à l'exception que le temps d'exposition est de 19 heures

13) Seconde pré-hybridation:

De la même façon qu'en 7) ci-dessus

14) Seconde hybridation:

Insertion pB2-7 (préparée à l'étape 3) ci-dessus 42°C, 16,5 heures)

15) Lavage:

De la même façon qu'en 9) ci-dessus

16) Exposition

De la même façon qu'en 10) ci-dessus à l'exception que la durée d'exposition est de 19,5 heures

17) Rinçage:

De la même façon qu'en 11) ci-dessus

18) Exposition:

De la même façon qu'en 10) ci-dessus à l'exception que la durée d'exposition est de 20 heures

19) Troisième pré-hybridation

De la même façon qu'en 7) ci-dessus

20) Troisième hybridation

Fragment 3' (4,5 x 105 cpm/ml) de pR18 (préparé à l'étape 4 ci-dessus), 42°C, 15 heures

21) Lavage:

De la même manière qu'à l'étape 9) ci-dessus

22) Exposition

De la même façon qu'à l'étape 10) ci-dessus.

Les résultats de l'analyse de l'enzyme de restriction sont montrés sur la figure 4.

Etape 12

(Analyse de l'enzyme de restriction de l'ADN du plasmidique pRGE)

Sensiblement de la même facon qu'à l'étape 11 ci-dessus, l'analyse de l'enzyme de restriction de l'ADN plasmidique pRGE préparé à l'étape 10 ci-dessus est effectuée, à l'exception que l'on utilise l'ADN plasmidique pRGE au lieu de l'ADN plasmidique de pHGE. La carte de restriction de l'insertion d'ADN de pRGE obtenue est montrée sur la figure 5.

22

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CH 675 423 A5

Etape 13

(Détermination des séquences de base du gène de FNT du lapin et du gène de FNT humain).

On répète sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 2 ci-dessus à l'exception que l'on utilise la souche JM83 (pHGE) de E. coli K12 obtenue à l'étape 9 ci-dessus et la souche JM83 (pRGE) de E. coli K12 obtenue à l'étape 10 ci-dessus au lieu de la souche MC1061 de E. coli K12 ayant pB2-7 et la souche MC 1061 de E. coli K12 ayant pR 18. Ainsi, on obtient 150 ng de chacun des ADN plasmidique pRGE et plasmidique pHGE.

Les séquences de base de pRGE et pHGE sont déterminées selon la méthode de Maxam-Gilbert [Maxam et autres, Methods in enzymology, volume 55,490 (1980) publiée par Academic Press].

La séquence des bases de pR18 déterminée dans l'exemple référentiel 3 est comparée à celle de pRGE déterminée ci-dessus pour élucider la structure, comprenant l'exon et l'intron, du gène de FNT du lapin. La structure de l'insertion d'ADN de pRGE est montrée sur la figure 5. Subséquemment, la séquence des bases de pRGE est comparée à celle de pHGE pour rechercher l'homologie et la séquence de consensus autour de la limite entre l'intron et l'exon. Ainsi, la structure, comprenant l'exon et l'intron, du gène de FNT humain est élucidée. La structure du gène de FNT humain est montrée sur la figure 4.

La séquence des bases ci-dessus obtenue codant pour le FNT du lapin et le FNT humain sera montrée ci-après. Dans les séquences des bases la rangée supérieure montre la séquence de bases codant pour le FNT du lapin (R) et la rangée inférieure la séquence de bases codant pour le FNT humain (H).

R

TCA

GCT

TCT

CGG

GCC

CTG

AGT

GAC

AAG

CCT

CT A

GCC

CAC

GTA

GTA

H

TCA

TCT

TCT

CGA

ACC

CCG

AGT

GAC

AAG

CCT

GTA

GCC

CAT

GTT

GTA

R

GCA

AAC

CCG

CAA

GTG

GAG

prr but-

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

AGC

CAG

CGT

H

GCA

AAC

CCT

CAA

GCT

GAG

GGG

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

AAC

CGC

CGG

R

GCG

AAC

GCC

CTG

CTG

CGC

AAC

GGC

ATG

AAG

CTC

ACG

GAC

AAC

CAG

H

GCC

AAT

GCC

CTC

CTG

GCC

AAT

GGC

GTG

GAG

CTG

AGA

GAT

AAC

CAG

R

CTG

GTG

GTG

CCG

GCC

GAC

GGG

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTT

H

CTG

GTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTC

R

CTC

TTC

AGC

GGT

CAA

GGC

TGC

CGC

TCC

TAC

GTG

CTC

CTC

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CTC

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GGC

CAA

GGC

TGC

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GTG

CTC

CTC

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GAC

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GCC

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TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

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GGG

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ATT

GCC

CTG

H

GGG

ATC

ATT

GCC

CTG

Note: le symbole «...» signifie que cette partie dans la séquence de bases de l'ADN codant le FNT du lapin est nulle et par conséquent deux codons adjacents à ce symbole de ses deux côtés sont directement connectés.

Etape 14

(Synthèse des oligodésoxynucléotides).

Dans un récipient réactionnel en acier inoxydable de 500 ni avec des filtres en acier inoxydable à chaque extrémité, on ajoute 20 mg d'une résine de polystyrène à laquelle un nucléoside (2,0 nM) est connecté par une liaison succinate. La résine est traitée avec du bromure de zinc (1 nM) dans le dichloromé-thane isopropanol (85:15) pour retirer le groupe protecteur de diméthoxytrityle (DMT),est lavée avec du diméthylformamide, de la pyridine et de l'acétonitrile et est séchée avec un courant d'azote. A la résine séchée, on ajoute une solution de DMT-nucléotide (20 nM) et de mésitylènesulfonylnitrotriazole (60 nM)

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dans 200 (il de pyridine. On laisse la réaction de couplage se passer à 45°C pendant 20 minutes. Ce cycle de suppression de la protection et de couplage est répété pour des nucléotides successifs jusqu'à ce que Poligodésoxynucléotide souhaité soit assemblé sur la résine. La résine est alors traitée pour retirer i'oligodésoxynucléotide et est purifiée comme décrit par Ito, Ike, Ikuta, et Itakura (Nue. Ac. Res., 10:1755 (1982)).

Ainsi on obtient les oligodésoxynucléotides qui suivent. 1 ) 5'-AATTCATGTCATCTTCTCGAACCCCGAGTG ACAA-3'

2) 3'-GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCTCACTGTTCGG-5'

3) 5'-GCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGC-3'

4) 3'-ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5'

Etape 15

(Construction de M13mp9-HGE contenant le minigène humain pour FNT)

Le plamide pHGE (10 ng) est digéré avec EcoRI (20 unités). Après électrophorèse sur un gel agarose à 1% à faible point de fusion, le fragment de 2,9 kb est élué. Ce fragment est inséré dans le fragment de EcoRI de la forme reproductive de M13mp9 phage. Le M13mp9 phage est choisi parce qu'il est particulièrement adapté à la réception de sections de l'ADN. Le produit est transféré à E. coli JM103 [BRL (Bethesda Research Laboratories, Inc., E. U. A.) Manuel de Putilisateur/M13mp7 Cloning/«Dideoxy» se-quencing, 1980]. Le produit est désigné par M13mp9-HGE.

Etape 16

(Délétion d'Intron 3, en utilisant l'ADN à un seul brin de M13mp9-HGE et le délétère E3-4)

L'ADN à un seul brin de M13mp9-HGE est préparé par la méthode de BRL Manuel de l'utilisa-teur/M13mp7 cloning/«Dideoxy» sequencing, 1980.

On utilise I'oligodésoxynucléotide 4)

3'-ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5'

préparé à l'étape 14, comme délétère de l'intron 3. Le délétère de l'intron 3 est désigné par «E3-4".

Le délétère E3-4 a une séquence de bases qui est complémentaire de la séquence de bases des bases avant (Exon 3) et après (Exon 4) l'intron 3 qui doit être délaissé. La délétion de l'intron 3 est effectuée, selon l'enseignement de Wallace et autres, Science 209:1396 (1980), comme suit.

E3-4 (164 ng, 15 pmoles) est phosphorylé en utilisant la kinase T4 et ATP (3 mM) et on ajoute à l'étalon M13mp9-HGE (1,65 ng, 0,5 pmole). Le mélange réactionnel est chauffé à 65°C refroidi à la température ambiante pendant 5 minutes et enfin refroidi dans de l'eau glacée. A dATP, dCTP, dGTP, dTTP et ATP (0,4 mM), on ajoute un fragment de Klenow (5 unités), la ligase T4 (10 unités) dans un tampon Hin [Wallace et autres, Nue. Ac. Res. 9; 3647 (1981)] 10 mM de Tris HCl (pH 7,2), 2 mM de MgCfe et 1 mM de p-mercaptoéthanol. Le mélange réactionnel (volume final 50 nO est incubé pendant 30 minutes à 4°C puis pendant 30 minutes à la température ambiante. L 'ADN de la réaction amorcée par l'oligonucléotide est utilisé pour transférer E. coli JM103 selon le processus de BRL Manuel de I'utilisateur/M13mp7 clo-ning/«Dideoxy» sequencing, 1980. Les plaques obtenues de cette façon sont piquées à des plaques YT [J.H. Miller, page 433, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)]. Les colonies obtenues sont hybridées à 55°C pendant 2 heures avec E3-4 marqué 32. Pour cette étape, le délétère est utilisé comme échantillon pour identifier les séquences de l'ADN ayant la séquence de bases complémentaire correspondante après avoir laissé l'intron. Les phages sont isolés de ces colonies qui s'hybrident avec le délétère.

Les phages résultants sont mis en plaques et les plaques sont piquées à des plaques de YT. On laisse les clones s'hybrider à 55°C pendant 2 heures avec E3-4 marqué 32 P. Les clones positifs sont obtenus et l'ADN phage est mis en séquence pour choisir les phages où l'intron 3 est totalement laissé. Un tel phage est désigné par mp9-HGE a3-1 .

Etape 17

(Construction de pHFNT-lacUV5-2)

La forme réplicative de mp9-HGE A3-1 est digérée avec EcoRI. Le fragment de EcoRI est isolé et clo-né à pBR327 scindé par EcoRI pour donner le plasmide pHGE A3-1.

La construction d'un autre plasmide est effectuée en utilisant le plasmide pHGE A3-1 afin d'obtenir un tel plasmide A3-1 pouvant exprimer directement FNT dans E. coli en utilisant Jaç UV5 comme promoteur. Les processus sont illustrés à titre d'exemple sur la figure 7. D'abord, 10 ng du plasmide pHGE A3-1 sont digérés avec 10 unités de Aval et EcoRI ( fabriqués et vendus par Bethesda Research Laboratories, Ine, E.U.A. ) à 37°C pendant 2 heures et subissent une électrophorèse sur un gel de Polyacrylamide à 4% en poids pour isoler les fragments. On isole, du gel, environ 1 ng du fragment, par électroélution. De la même façon qu'à l'étape 14, deux oligodésoxynucléotides montrés sur la figure 7, c'est-à-dire 5'-AATTCATGTCATCTTCTCGAACC-3' et 5'-TCGGGGTTCGAGAAGATGACATG-3' sont synthétisés. Alors, 5 chaque extrémité 5' des deux oligodésoxynucléotides (environ 100 pmoles) est phospho-

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rylée en utilisant la polynucléotide kinase T4 selon la méthode décrite dans la littérature (3) page 122. Après accomplissement de la réaction, le mélange réactionnel est extrait avec du phénol puis avec du chloroforme. Alors, les oligomères de synthèse ainsi obtenus sont mélangés avec 0,5 ng du fragment précédemment obtenu de Aval-EcoRl du plasmide pHGE A3-1 et précipités dans l'éthanol. Ces fragments sont liés à 4°C pendant une nuit en utilisant 10 unités de ligase T4 selon le processus décrit dans la littérature 1) page 37. Après accomplissement de la réaction, le mélange est précipité dans l'éthanol, avec ensuite électrophorèse effectuée sur un gel de Polyacrylamide à 4% en poids pour récupérer le fragment par électroélution.

Selon le processus décrit dans F. Fuller, «Gene», 19, pages 42-54 (1982). on prépare le plasmide POP95-15.

1 ng de pOP95-15 est digéré avec EcoRI et extrait avec du phénol puis avec du chloroforme, avec ensuite précipitation dans l'éthanol pour obtenir un vecteur. En utilisant l'ADN T4 ligase, 0,5 ng du vecteur obtenu est lié au fragment ci-dessus obtenu. Selon le processus décrit dans la littérature (4), page 20, on transforme E. coli JMIOl (ATCC 33 876) en utilisant le vecteur ci-dessus obtenu puis on met en culture sur un milieu d'agar contenant 1 mM de IPTG et 0.004 poids/volume % de x-gal pour obtenir environ 100 colonies blanches.

L'ADN plasmidique est préparé à partir de ces transformants et est digéré avec EçoRI pour identifier les plasmides contenant le fragment voulu de Eco-RI. Afin d'examiner la direction de l'insertion, ces plasmides sont digérés avec Pvull et Pstl et subissent une électrophorèse sur un gel d'agarose à 1,5% en poids pour choisir les plasmides donnant des fragments d'environ 1280 paires de bases et environ 2600 paires de bases Indiquant que la direction de transcription du promoteur Jaç UV5 est en accord avec celle des oligodésoxynucléotides codant FNT.

L'analyse de la séquence de bases montre que ces deux plasmides ont la même séquence et que le promoteur Jaç UV5, I'oligodésoxynucléotide synthétisé et l'ADN sont bien combinés les uns avec les autres. Le plasmide obtenus sont désignés par pHFNT-lacUV5-2.

On met E. coli contenant pHFNT-lacUV5-2 en culture dans un milieu nutritif conventionnel. La bio-détermination du produit pour l'activité de FNT indique presque la même activité que l'on obtient avec un plasmide pFNT-lacUV5-1 contenant le gène du FNT du lapin sous le contrôle du promoteur lac.

EXEMPLE 2

En utilisant le plasmide pHGE et les oligodésoxynucléotides 1 à 4) obtenus par le processus décrit aux étapes 1 à 14 de l'exemple 1, on prépare pHFNT-lacUV5-1 selon le processus illustré sur la figure 6.

Les micro-organismes et les nouveaux plasmides ont été placés en dépôt à l'American Type Culture Collection, (12 301, Parklawn Drive Rockviile, Maryland 20 862, E.U.A., le 6 Avril 1984 en déposant des échantillons des micro-organismes contenant les plasmides. La souche JM83 (pRGE) du micro-organis-me E. coli K-12 a reçu le numéro d'accession ATCC 39 655. La souche JM83 (pHGE) du micro-organisme E. coli K12 a reçu le numéro d'accession ATCC 39 656.

L'invention ayant été ainsi décrite, il sera évident qu'elle peut être modifiée de nombreuses façons. De telles variations ne doivent pas être considérées comme s'écartant du cadre et de l'esprit de l'invention et toutes les modifications évidentes à toute personne compétente en la matière sont incorporées dans le cadre de celle-ci.

Claims (7)

Revendications

1. Polypeptide physiologiquement activ humain, caractérisé en ce qu'il a une séquence d'acides aminés représentée par la formule (I):

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu où Gin inciqe un résidu de glutamine, Asp un résidu d'acide aspartique, Pro un résidu de proline, Tyr un résidu de tyrosine, Val un résidu de valine, Lys un résidu de lysine, Glu un résidu d'acide glutamique, Ala un résidu d'alanine, Asn un résidu d'asparagine, Leu un résidu de leucine, Phe un résidu de phénylala-nine, Gly un résidu de glycine, His un résidu d'histidine, Ser un résidu de sérine, Thr un résidu de thréonine, Ile un résidu d'isoleucine, Trp un résidu de tryptophane, Arg un résidu d'arginine, Met un résidu de méthionine et Cys un résidu de cystéine.

2. Polypeptide selon la revendication 1, ayant une efficacité anti-tumeur.

3. Polypeptide selon la revendication 1, ayant une activité de FNT humaine.

4. Polypeptide selon la revendication 1, étant sensiblement pur.

5. Procédé de production d'un polypeptide physiologiquement actif humain, selon la revendication 1, ayant une activité de FNT, caractérisé en ce qu'il comprend:

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(a) la liaison à un véhicule d'expression replicable d'un acide désoxyribonucléique comprenant une séquence de bases codant un polypeptide physiologiquement actif humain, ledit polypeptide physiologiquement actif humain ayant une sequence d'acides aminés représentée par la formule (I) qui suit

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Giù Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu où Gin indique un résidu de glutamine, Asp un résidu d'acide aspartique, Pro un résidu de proline, Tyr un résidu de tyrosine, Val un résidu de valine, Lys un résidu de lysine, Glu un résidu d'acide glutamique, Ala un résidu d'alanine, Asn un résidu d'asparagine, Leu un résidu de leucine, Phe un résidu de phénylalanine, Gly un résidu de glycine, His un résidu d'histidine, Ser un résidu de sérine, Thr un résidu de thréonine, Ile un résidu d'isoleucine, Trp un résidu de tryptophane, Arg un résidu d'arginine, Met un résidu de méthionine et Cys un résidu de cycstéine pour obtenir un ADN recombinant réplicable comprenant ledit acide désoxyribonucléique et ledit véhicule d'expression réplicable;

(b) la transformation des cellules d'un micro-organisme ou d'une culture de cellule avec ledit ADN recombinant réplicable pour former des transformants;

(c) le choix desdits transformants à partir de cellules parentes du micro-organisme ou de la culture de cellule;

(d) l'incubation desdits transformants, forçant lesdits transformants à exprimer ledit acide désoxyribonucléique et à produire un polypeptide physiologiquement actif humain; et

(e) l'isolement dudit polypeptide physiologiquement actif humain des transformants incubés.

6. Procédé pour la production d'un polypeptide selon la revendication 1 ayant une activité de facteur de nécrose de tumeur, caractérisé en ce qu'il comprend la cultivation d'un microorganisme ou d'une culture de cellules transformée avec l'acide désoxyribonucléique qui comprend au moins une séquence des bases conplémentaires de ladite séquence de bases:

TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG

où A indique un résidu d'acide 2'-désoxyadénylique, G un résidu d'acide 2'-désoxyguanylique, C un résidu d'acide 2'-désoxycytidylique, et T un résidu d'acide thymidylique, et en ce que l'extrémité gauche et l'extrémité droite de la formule (II) représentent le côté du groupe 5-hydroxyle et le côté du groupe 3'-hydroxyle, respectivement, ou comprend une séquence de bases qui est obtenue en substituant au moins une base de ladite séquence selon la dégénération du code génétique.

7. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité efficace anti-tumeur ou antivirale d'un polypeptide selon la revendication 1, et au moins un véhicule, diluant ou excipient acceptable en pharmacie.

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