JPS60252496A - 新規なヒト生理活性ポリペプチド - Google Patents
新規なヒト生理活性ポリペプチドInfo
- Publication number
- JPS60252496A JPS60252496A JP60071283A JP7128385A JPS60252496A JP S60252496 A JPS60252496 A JP S60252496A JP 60071283 A JP60071283 A JP 60071283A JP 7128385 A JP7128385 A JP 7128385A JP S60252496 A JPS60252496 A JP S60252496A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- residue
- leu
- ser
- dna
- pro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/828—Cancer
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は新規生理活性ポリペプチドの遺伝情報を有する
ポリデオキシリボ核酸（以下ＤＮＡと略する）に関する
。 本発明は又、該ＤＮＡを含む複製可能な組換ＤＮＡ及び
該複製可能な組換ＤＮＡで形質転換された微生物または
細胞に関し、更に又、該ＤＮＡが有する遺伝情報を発現
して得られる新規生理活性ポリペプチド、後述するアミ
ノ酸配列を有する実質的に純粋なヒト生理活性ポリペプ
チド、該生理活性ポリペプチドを有効成分として含有す
る医薬組成物および該ヒト生理活性ポリペプチドの製造
方法に関する。更に詳しくは、本発明はヒトＴＮＦ （
Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）をコー
ドするＤＮＡ、該ＤＮＡの塩基配列から演絆されるアミ
ノ酸配列を有するヒトＴＮＦ、組換えＤＮＡ技術を用い
て該ＤＮＡからヒトＴＮＦを製造する方法および該方法
によって得られる産生物の用途に関するものである。 本明細書において、アミノ酸、ペプチドはＩＵＰＡＣ−
ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）−？？採用された略
記法により表示され、例えば下記の略号が使用される。 なお、アミノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は
、特に明示しなければＬ体を示すものとする。 Ｇ］、ｎ ：グルタミン残基 Ａｓｐ ：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ ニブロリン残基 Ｔｙｒ ：チロシン残基 Ｖａｌ ：バリン残基 Ｌｙｓ ：リジン残基 Ｇｌｕ ：グルタミン酸残基 Ａｌａ ：アラニン残基 Ａｓｎ ：アスパラギン残基 Ｌｅｕ ：ロイシン残基 Ｐｈｅ ：フェニルアラニン残基 Ｇｌａｙ ニゲリシン残基 Ｈｉｓ ニゲリシン残基 Ｓｅｒ ：セリン残基 Ｔｈｒ ：スレオニン残基 １１ｅ ：イソロイシン残基 Ｔｒｐニトリブトファン残基 Ａｒｇ ：アルギニン残基 Ｎｅｔ ：メチオニン残基 Ｃｙｓ ニジスティン残基 また、ポリデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチドは下記の如き略号で表されるデオキシリボヌク
レオチドの配列により表記する。 Ａ ： ２２−デオキシアデニル酸残基Ｃ：２′−デオ
キシシチジル酸残基 Ｇ：２２−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 特にことわらない限り、デオキシリボヌクレオチド配列
の左端は５′端である。
ポリデオキシリボ核酸（以下ＤＮＡと略する）に関する
。 本発明は又、該ＤＮＡを含む複製可能な組換ＤＮＡ及び
該複製可能な組換ＤＮＡで形質転換された微生物または
細胞に関し、更に又、該ＤＮＡが有する遺伝情報を発現
して得られる新規生理活性ポリペプチド、後述するアミ
ノ酸配列を有する実質的に純粋なヒト生理活性ポリペプ
チド、該生理活性ポリペプチドを有効成分として含有す
る医薬組成物および該ヒト生理活性ポリペプチドの製造
方法に関する。更に詳しくは、本発明はヒトＴＮＦ （
Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）をコー
ドするＤＮＡ、該ＤＮＡの塩基配列から演絆されるアミ
ノ酸配列を有するヒトＴＮＦ、組換えＤＮＡ技術を用い
て該ＤＮＡからヒトＴＮＦを製造する方法および該方法
によって得られる産生物の用途に関するものである。 本明細書において、アミノ酸、ペプチドはＩＵＰＡＣ−
ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）−？？採用された略
記法により表示され、例えば下記の略号が使用される。 なお、アミノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は
、特に明示しなければＬ体を示すものとする。 Ｇ］、ｎ ：グルタミン残基 Ａｓｐ ：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ ニブロリン残基 Ｔｙｒ ：チロシン残基 Ｖａｌ ：バリン残基 Ｌｙｓ ：リジン残基 Ｇｌｕ ：グルタミン酸残基 Ａｌａ ：アラニン残基 Ａｓｎ ：アスパラギン残基 Ｌｅｕ ：ロイシン残基 Ｐｈｅ ：フェニルアラニン残基 Ｇｌａｙ ニゲリシン残基 Ｈｉｓ ニゲリシン残基 Ｓｅｒ ：セリン残基 Ｔｈｒ ：スレオニン残基 １１ｅ ：イソロイシン残基 Ｔｒｐニトリブトファン残基 Ａｒｇ ：アルギニン残基 Ｎｅｔ ：メチオニン残基 Ｃｙｓ ニジスティン残基 また、ポリデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチドは下記の如き略号で表されるデオキシリボヌク
レオチドの配列により表記する。 Ａ ： ２２−デオキシアデニル酸残基Ｃ：２′−デオ
キシシチジル酸残基 Ｇ：２２−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 特にことわらない限り、デオキシリボヌクレオチド配列
の左端は５′端である。
【従来の技術および発明が解決しようとする問題点】網
内系賦活化作用を有する種々の物質、例えば、各種ダラ
ム陽性菌やエンドトキシンにより誘導され、抗腫瘍細胞
能力などの生理活性を有する物質の存在は多数報告され
ている。例えばＣａ ｒ ｓ ｖ ｅ ］、１らは、Ｃ
Ｄ−Ｉ ５ｗ１ｓｓマウスにバチルス・カルメッテ・グ
エリン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅ
ｒｉｎ （Ｂ ＣＧ））を投与し、その２週間後にエン
ドトキシンを静脈内注射して得られる該マウスの血清が
、培養り細胞に対して殺細胞作用を有すること、および
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ Ｘ Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ、に移
植したメスＡザルコーマ（１＋１６１；１１ Ａ ｓａ
ｒｃｏｍａ）を出血性壊死に至らしめる現象を見出し、
Ｔ Ｎ Ｆ （Ｔｕｍｏｒ ＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔ
ｏｒ）と名づけだ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、 Ｕ Ｓ Ａ７２巻（Ｎａ ９ ）３６６６〜３６
７０頁（１９７５年）〕。 その後、Ｒｕｆｆら（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １２５
巻（Ｎａ ４ ）１６７１〜１６７７頁（１９８０年）
〕およびＭａｔｔｈｅｗｓら（Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ
４２巻４１６〜４２２頁（１９８０年）〕は、前記Ｃａ
ｒｓｗｅｌｌらの方法に準じて調製したウサギ血清から
ＴＮＦの精製を試みて、それぞれ原血清に比べて約２０
００倍および約１０００倍精製されたものを得ている。 しかし、いずれの場合にも精製されたものに関しては動
物実験において抗腫瘍効果を確認していなし１゜ 特開昭５７−１４０７２５号は、網内系賦活化作用を有
する物質の１種または２種以上を哺乳動物（マウス、ウ
サギ、モルモット等）に投与し、次いでグラム陰性菌由
来のエンドトキシンを注射することによって、または哺
乳動物由来の活性化マクロファージを含む組織培養系に
グラム陰性菌由来のエンドトキシンを加えることによっ
て誘発される制癌作用を有する蛋白性生理活性物質の単
離精製方法を開示している。更に、その物質の分子量は
、ゲル濾過法および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法では３９，０００±５，０００、等電点はＰ
Ｈ３、９±０．３（等電点電気泳動法）である、と開示
しているが、その詳細な構造は開示されていない。 一方Ｍａｔｔｈｅｗｓ ［Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ４４
巻（３）４１８〜４２４頁（１９８１年）］はＢＣＧを
注射投与し２週間を経過したウサギの各種組織から単核
型食細胞を得、その細胞培養液へエンドトキシンを添加
することによりＬ細胞障害性物質が得られることを示し
ている。しかし、この物質の詳細な構造は示されておら
ず、また血清中に見出されるＴＮＦと同一物質であると
いう証拠も示されていない。 更に、ＴＮＦ様生物活性即ちＴＮＦの生物活性と同様の
生物活性を有する因子に関する多くの報文がある。例え
ば、 Ｒｅｅｄらはヒト末梢血中のマクロファージ等の
中にそのような因子を見出した（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙｌ １５巻３９５頁（１９７５年）〕。 Ｍａｔｔｈｅｖｓらはヒト末梢血単球由来のまたは骨髄
性単球性白血病患者由来の白血病細胞中にそのような因
子を見出した［Ｍａｔｔｈｅｖｓ ｅｔ ａｌ、 Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ４４巻１３５頁（１９８１年）］。ま
た、Ｂａｒｂａｒａらはニブシュタイン・バー・ウィル
ス（Ｅｐｓｔａｉｎ−ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）により形
質転換されたヒトＢ細胞中に（Ｄ、 Ｂａｒｂａｒａ
ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ８０巻５３９７頁（１９８３年）〕、
また、Ｂｈａｒａｔらはリンパ芽球１７８８細胞株中に
それぞれＴＮＦ様生理活性物質を見出している。 上記した様な因子はまた、特開昭５８−１５９２１．５
８−２１６２１．５８−１０７１９７．５８−２２５０
２４号、英国特許出願公開番号２，１０６，１１７及び
２，１１７，３８５号にも記載されている。しかしなが
ら、このような因子を効率的に生産する細胞または細胞
株は、見出されていない。更に、これらの因子の構造や
物性に関して、はとんど知見が得られていない。 伊東はウサギＴＮＦの構造及び特性、およびウウギＴＮ
Ｆ産生細胞について研究を行なった〔特願昭５８−２５
１８１７号］、、その結果、ウサギに網内系賦活化作用
を有する物質を投与後、細菌由来のエンドトキシンを注
射投与することにより、Ｌ細胞障害活性を有する物質の
産生能を有する細胞を得、さらにＬ細胞を用いてその物
質を得た。伊東はさらに上記の通り得られた細胞を用い
て得られたＬ細胞障害活性を有する物質の分子量と、免
疫学的特性がウサギ血清から得られたＴＮＦのものと一
致することを確認した。一方、遺伝子操作技術の進歩に
より、ある蛋白質をコードするＤＮＡを単離できれば、
その蛋白質の構造を決定することが可能となった。なぜ
ならば、単離され、たＤＮＡの構造は決定することがで
き、次に蛋白質の構造はそのＤＮＡの構造から演鐸する
ことができるからである。更に、微生物又は培養細胞を
利用しである蛋白質をコードするＤＮＡからその蛋白質
を製造することができるようになった。伊東は上記遺伝
子操作技術をＬ細胞障害活性を有する物質を産生ずるこ
とのできる細胞に応用し、その結果、ウサギＴＮＦをコ
ードするＤＮＡを単離し、該ＤＮＡとウサギＴＮＦの構
造を決定し、そして該ＤＮＡを用いてウサギＴＮＦを製
造することに成功した。 上述の通り、伊東はウサギＴＮＦを製造す２ることに大
きな成功を納めたが、ＴＮＦの由来する動物とは異なる
動物にＴＮＦを投与するとアナフィラキシ−シミツクを
起す可能性がある。なぜならば、ＴＮＦはポリペプチド
であるので＋ ＴＮＦが該ＴＮＦの由来ではない動物に
投与されるとＴＮＦは抗原として働き、抗体を産生せし
めるからである。この理由から、ＴＮＦを人体に投与し
ようとするならば、ヒト由来のＴＮＦの使用が非常に好
ましい。しかしながら、ヒ￥ＴＮＦの構造すら十分に解
明されていなかった。それ故、ヒトＴＮＦをコードする
ＤＮＡの構造の決定が強く望まれていた。
内系賦活化作用を有する種々の物質、例えば、各種ダラ
ム陽性菌やエンドトキシンにより誘導され、抗腫瘍細胞
能力などの生理活性を有する物質の存在は多数報告され
ている。例えばＣａ ｒ ｓ ｖ ｅ ］、１らは、Ｃ
Ｄ−Ｉ ５ｗ１ｓｓマウスにバチルス・カルメッテ・グ
エリン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅ
ｒｉｎ （Ｂ ＣＧ））を投与し、その２週間後にエン
ドトキシンを静脈内注射して得られる該マウスの血清が
、培養り細胞に対して殺細胞作用を有すること、および
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ Ｘ Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ、に移
植したメスＡザルコーマ（１＋１６１；１１ Ａ ｓａ
ｒｃｏｍａ）を出血性壊死に至らしめる現象を見出し、
Ｔ Ｎ Ｆ （Ｔｕｍｏｒ ＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔ
ｏｒ）と名づけだ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、 Ｕ Ｓ Ａ７２巻（Ｎａ ９ ）３６６６〜３６
７０頁（１９７５年）〕。 その後、Ｒｕｆｆら（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １２５
巻（Ｎａ ４ ）１６７１〜１６７７頁（１９８０年）
〕およびＭａｔｔｈｅｗｓら（Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ
４２巻４１６〜４２２頁（１９８０年）〕は、前記Ｃａ
ｒｓｗｅｌｌらの方法に準じて調製したウサギ血清から
ＴＮＦの精製を試みて、それぞれ原血清に比べて約２０
００倍および約１０００倍精製されたものを得ている。 しかし、いずれの場合にも精製されたものに関しては動
物実験において抗腫瘍効果を確認していなし１゜ 特開昭５７−１４０７２５号は、網内系賦活化作用を有
する物質の１種または２種以上を哺乳動物（マウス、ウ
サギ、モルモット等）に投与し、次いでグラム陰性菌由
来のエンドトキシンを注射することによって、または哺
乳動物由来の活性化マクロファージを含む組織培養系に
グラム陰性菌由来のエンドトキシンを加えることによっ
て誘発される制癌作用を有する蛋白性生理活性物質の単
離精製方法を開示している。更に、その物質の分子量は
、ゲル濾過法および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法では３９，０００±５，０００、等電点はＰ
Ｈ３、９±０．３（等電点電気泳動法）である、と開示
しているが、その詳細な構造は開示されていない。 一方Ｍａｔｔｈｅｗｓ ［Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ４４
巻（３）４１８〜４２４頁（１９８１年）］はＢＣＧを
注射投与し２週間を経過したウサギの各種組織から単核
型食細胞を得、その細胞培養液へエンドトキシンを添加
することによりＬ細胞障害性物質が得られることを示し
ている。しかし、この物質の詳細な構造は示されておら
ず、また血清中に見出されるＴＮＦと同一物質であると
いう証拠も示されていない。 更に、ＴＮＦ様生物活性即ちＴＮＦの生物活性と同様の
生物活性を有する因子に関する多くの報文がある。例え
ば、 Ｒｅｅｄらはヒト末梢血中のマクロファージ等の
中にそのような因子を見出した（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙｌ １５巻３９５頁（１９７５年）〕。 Ｍａｔｔｈｅｖｓらはヒト末梢血単球由来のまたは骨髄
性単球性白血病患者由来の白血病細胞中にそのような因
子を見出した［Ｍａｔｔｈｅｖｓ ｅｔ ａｌ、 Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ４４巻１３５頁（１９８１年）］。ま
た、Ｂａｒｂａｒａらはニブシュタイン・バー・ウィル
ス（Ｅｐｓｔａｉｎ−ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）により形
質転換されたヒトＢ細胞中に（Ｄ、 Ｂａｒｂａｒａ
ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ８０巻５３９７頁（１９８３年）〕、
また、Ｂｈａｒａｔらはリンパ芽球１７８８細胞株中に
それぞれＴＮＦ様生理活性物質を見出している。 上記した様な因子はまた、特開昭５８−１５９２１．５
８−２１６２１．５８−１０７１９７．５８−２２５０
２４号、英国特許出願公開番号２，１０６，１１７及び
２，１１７，３８５号にも記載されている。しかしなが
ら、このような因子を効率的に生産する細胞または細胞
株は、見出されていない。更に、これらの因子の構造や
物性に関して、はとんど知見が得られていない。 伊東はウサギＴＮＦの構造及び特性、およびウウギＴＮ
Ｆ産生細胞について研究を行なった〔特願昭５８−２５
１８１７号］、、その結果、ウサギに網内系賦活化作用
を有する物質を投与後、細菌由来のエンドトキシンを注
射投与することにより、Ｌ細胞障害活性を有する物質の
産生能を有する細胞を得、さらにＬ細胞を用いてその物
質を得た。伊東はさらに上記の通り得られた細胞を用い
て得られたＬ細胞障害活性を有する物質の分子量と、免
疫学的特性がウサギ血清から得られたＴＮＦのものと一
致することを確認した。一方、遺伝子操作技術の進歩に
より、ある蛋白質をコードするＤＮＡを単離できれば、
その蛋白質の構造を決定することが可能となった。なぜ
ならば、単離され、たＤＮＡの構造は決定することがで
き、次に蛋白質の構造はそのＤＮＡの構造から演鐸する
ことができるからである。更に、微生物又は培養細胞を
利用しである蛋白質をコードするＤＮＡからその蛋白質
を製造することができるようになった。伊東は上記遺伝
子操作技術をＬ細胞障害活性を有する物質を産生ずるこ
とのできる細胞に応用し、その結果、ウサギＴＮＦをコ
ードするＤＮＡを単離し、該ＤＮＡとウサギＴＮＦの構
造を決定し、そして該ＤＮＡを用いてウサギＴＮＦを製
造することに成功した。 上述の通り、伊東はウサギＴＮＦを製造す２ることに大
きな成功を納めたが、ＴＮＦの由来する動物とは異なる
動物にＴＮＦを投与するとアナフィラキシ−シミツクを
起す可能性がある。なぜならば、ＴＮＦはポリペプチド
であるので＋ ＴＮＦが該ＴＮＦの由来ではない動物に
投与されるとＴＮＦは抗原として働き、抗体を産生せし
めるからである。この理由から、ＴＮＦを人体に投与し
ようとするならば、ヒト由来のＴＮＦの使用が非常に好
ましい。しかしながら、ヒ￥ＴＮＦの構造すら十分に解
明されていなかった。それ故、ヒトＴＮＦをコードする
ＤＮＡの構造の決定が強く望まれていた。
【問題点を解決するための手段および作用】本発明者ら
はヒトＴＮＦをコードするＤＮＡの構造について鋭意研
究を行なった。その結果。 意外にも、ヒトポリペプチド遺伝子及びウサギＴＮＦ遺
伝子をウサギｃＤＮＡをプローブとして利用することに
よりクローンすることができること、ヒトポリペプチド
をコードする粗なりＮＡを巧く単離することができ、そ
の構造が塩基配列の相同性に関してウサギＴＮＦ遺伝子
、ヒトポリペプチド遺伝子及びウサギｃＤＮＡを比較す
ることにより決定できること、ヒトポリペプチドをコー
ドする純粋なりＮＡの構造も巧く決定することができ、
その純粋なりＮＡを得ることができること、およびヒト
ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて得られたヒト
ポリペプチドがＬ細胞障害活性を有することを本発明者
らは発見した。 本発明は、これらの新しい知見に基づき完成された。 即ち１本発明の目的はヒト生理活性ポリペプチドを提供
することにある。 本発明の他の目的は、ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡを
提供することにある。 また１本発明の目的は、ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡ
と複製可能な発現ベクターとからなる複製可能な組換Ｄ
ＮＡを提供することにある。 更にまた５本発明の目的は、上述のような組換ＤＮＡで
形質転換された微生物又は細胞を提供することにある。 更にまた、本発明の目的は、上述のヒト生理活性ポリペ
プチドの製造方法を提供することにある。 前述したこと及び本発明の他の諸口的、諸特徴及び諸利
益は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な記載から
明らかとなろう。 本質的には本発明によれば、次式（１）％式％ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｎ、Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ ＡｓｎＧｉｎ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇ］、ｙ
Ｌｅｕ Ｔｙｒ ＬｅｕＩ］、ｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｎ ＧｌｙＣｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｈｉｓ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ ）Ｉｊｓ Ｔｈｒ
ｌｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓ
ｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ ＬｙｓＶａｌ Ａｓｎ
！、ｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｒｙ
ｓ Ｓｅｒ Ｐｒｏ ＣｙｓＧｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｐｒｎ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｈａ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ ＬｙｓＰｒｏ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ＶａｌＰ
ｈｅ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ＬｙＳ Ｇｌｙ Ａｓ
ｐ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ＡｌａＧｌｕ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａ
ｓｐ Ｐｈｅ ＡｌａＧｌｕ Ｓｅｒ Ｇｕｙ Ｇ］、
ｎ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｉｌｅ
Ａｌａ ｅ ｕ （式中、Ｇ］、ｎはグルタミン残基、Ａｓｐはアスパラ
ギン酸残基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｔｙｒは、チロシ
ン残基、Ｖａｌはバリン残基−Ｌｙｓはリジン残基、Ｇ
］、ｕはグルタミン酸残基−Ａｈａはアラニン残基、
Ａｓｎはアスパラギン残基、１、ｅｕはロイシン残基、
Ｐｈｅはフェニルアラニン残基、ＧＪｙはグリシン残基
、Ｉｒ１ｓはヒスチジン残基、Ｓｅｒはセリン残基、Ｔ
ｈｒはスレオニン残基、Ｉ］、ｅはイソロイシン残基、
Ｔｒｐはトリプトファン残基、Ａｒｇはアルギニン残基
、Ｍｅｔはメチオニン残基及びＣｙｓはシスティン残基
を表わす）で表されるアミノ酸配列を含有するヒト生理
活性ポリペプチドが提供される。 本発明のヒト生理活性ポリペプチドはまた上記アミノ酸
配列のＮ末端にメチオニンが結合したポリペプチドおよ
び上記アミノ酸配列のＮ末端にヒトＴＮＦのためのシグ
ナルペプチドの部分もしくは全部が結合した中間体も包
含する。自然の変異によりまたは人工の変異により、ポ
リペブチ下の主たる活性に変化を与えることなく、ポリ
ペプチドをコードするＩ） Ｎ Ａの構造の一部を変化
させることが可能である。本発明のヒト生理活性ポリペ
プチドは、前記アミノ酸配列を有するポリペプチドの相
同変異体（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔ）に
相当する構造を有するポリペプチドも包含する。これら
の生理活性ポリペプチドはすべて以下“ヒトＴ Ｎ Ｆ
”と称する。 本発明のもう一つの態様によれば、次式（１）％式％ （ （式中、 Ｇｌｎ はグルタミン残基、Ａｓｐはアスパ
ラギン酸残基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｔｙｒはチロシ
ン残基、Ｖａｌ はバリン残基、Ｌｙｓはリジン残基、
Ｇｌｕはグルタミン酸残基、Ａｌａはアラニン残基、Ａ
ｓｎはアスパラギン残基、Ｌｅｕはロイシン残基、Ｐｈ
ｅはフェニルアラニン残基％Ｇｌｙはグリシン残基、Ｈ
ｊｓはヒスチジン残基、Ｓｅｒはセリン残基、Ｔｈｒは
ス１，７オニン残基、ＩＩｓはインロイシン残基、Ｔｒ
ｐはトリプトファン残基、Ａｒｇはアルギニン残基、Ｎ
ｅｔはメチオニン残基及びＣｙｓはシスティン残基を表
わす）で表されるアミノ酸配列を含有するヒト生理活性
ポリペプチドをコードする塩基配列を含有するデオキシ
リボ核酸が提供される。 更にまた、本発明によれば１次式（ＩＩ）で表される塩
基配列 ＴＣＡ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＣＣＣＣＧ ＡＧ
Ｔ ＧＡＣＡＡＧ ＣＣＴ ＧＴＡＧＣＣＣＡＴ ＧＴ
Ｔ ＧＴＡ ＧＣＡ ＡＡＣＣＣＴ ＣＡＡ ＧＣＴ
ＧＡＧ ＧＧＧＣＡＧ ＣＴＣＣＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ
ＡＡＣＣＧＣＣＧＧ ＧＣＣＡＡＴ ＧＣＣＣＴＣＣ
ＴＧ ＧＣＣＡＡＴ ＧＧＣＧＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ
ＡＧＡ ＧＡＴ ＡＡＣＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＴ
Ｇ ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＡＧ ＧＧＣＣＴＧ ＴＡＣＣ
ＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧ ＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡ
ＡＧ ＧＧＣＣＡＡ ＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣ
ＣＡＴ ＧＴＧ ＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＴ
ＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧ
ＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ ＧＣ
ＣＡＴＣＡＡＧ ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧ ＡＧＧ
ＧＡＧ ＡＣＣＣＣＡ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＡ
Ｇ ＧＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧ ＴＡＴ ＧＡＧ ＣＣ
ＣＡＴＣＴＡＴ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＴＣＴ丁
ＣＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＴ ＧＡＣＣ
ＧＡ ＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＧ ＡＴＣＡＡＴ ＣＧ
Ｇ ＣＣＣＧＡＣＴＡＴ ＣＴＣＧＡＣＴＴＴ ＧＣＣ
ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ
ＧＧＧ ＡＴＣＡＴＴ ＧＣＣＴＧ （式中、Ａはデオキシアデニル酸残基、Ｇはデオキシグ
アニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸残基及びＴはチ
ミジル酸残基を表わし、式（Ｈ）の左端および右端はそ
れぞれ５′−水酸基側および３′−水酸基側を表わす） および該塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選
ばれる少なくとも１つの塩基配列を含有するデオキシリ
ボ核酸が提供される。 本発明のＤＮＡは、微生物や培養細胞によって成熟ヒト
ＴＮＦを生産するために、前記塩基配列の５′末端にＡ
ＴＧ （Ａ−ＴおよびＧは前述の通り）が結合した塩基
配列からなるＤＮＡを包含する。 本発明のＤＮＡはまた、ヒトＴＮＦのシグナルペプチド
の部分または全部をコードする５′−フランキングＤＮ
Ａを含むＤＮＡも包含する。 自然の変異によりまたは人工的変異により、主たる活性
に変化を与えることなく、ＤＮＡの構造及びそれから演
絆されるポリペプチドの構造の一部を変異せしめること
が可能である。従って本発明のＤＮＡは、前述のすべて
のポリペプチドの相同変異体に相当する構造を有するポ
リペプチドをコードする塩基配列を含有することも可能
である。 遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産されるポリペプ
チドのアミノ酸配列を変えることなくその遺伝子の塩基
配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の塩基に置換す
ることができる。従って、本発明のＤＮＡはまた、遺伝
暗号の縮重に基づく置換によって変化された塩基配列を
含有することも可能である。この場合、上記置換により
得られた塩基配列から演課されるアミノ酸配列は前に定
義した式（Ｉ）のアミノ酸配列と一致する。 更にまた、本発明によれば、前記デオキシリボ核酸と複
製可能な発現ベクターとからなる複製可能な組換ＤＮＡ
が提供される。該組換ＤＮＡは、それによって形質転換
された微生物または細胞中で、ヒトＴＮＦのアミノ酸配
列を含有するポリペプチドを発現することができる。適
したベクターとしては、例えば、ｐＨＴＮＦ−１ａｃυ
ｖ５−１及びｐＨＴＮＦ−１ａｃＵＶ５−２発現ベクタ
ーが挙げられる。 更に本発明はまた、ヒトＴＮＦのアミノ酸配列を含有す
るポリペプチドを発現し得る複製可能な組換ＤＮＡで形
質転換された微生物または細胞に係る。このような微生
物または細胞として、大腸菌、枯草菌、酵母、高等動物
細胞が挙げられる。 更に本発明の他の態様によれば、 （ａ） 前記式（ＴＩ）で定義されるデオキシリボ核酸
を複製可能な発現ベクター４二連結して該デオキシリボ
核酸と該複製可能な発現ベクターとからなる複製可能な
組換ＤＮＡを得、 （ｂ）該複製可能な組換ＤＮＡで微生物または細胞を形
質転換させて形質転換体を形成せしめ、（ｃ）該形質転
換体を該微生物または細胞の親細胞から選別し、 （ｄ） 該形質転換体を培養して、該形質転換体に該デ
オキシリボ核酸を発現させてヒト生理活性ポリペプチド
を産生せしめ、そして （ｅ） 該ヒト生理活性ポリペプチドを培養した形質転
換体から単離する ことを含む本発明のヒト生理活性ポリペプチドの製造方
法が提供される。 本発明の方法によれば、前述の本発明のＤＮＡを複製可
能なベクターに組入れて該ＤＮＡを有する複製可能な組
換ＤＮＡを得、得られた該組換ＤＮＡで微生物または細
胞を形質転換させて該組換ＤＮＡを含有する形質転換体
を得る。得られた形質転換体は、該ＤＮＡに与えられた
表現型によって微生物又は培養細胞の親細胞から単離さ
れる。 得られた形質転換体を培養して前記デオキシリボ核酸の
有する遺伝情報を発現させて本発明の生理活性ポリペプ
チドを製造する。 更に本発明は直接発現産物として成熟形で宿主細胞から
分泌されるヒｈ Ｔ Ｎ Ｆに係る。そのような成熟ヒ
ｌ−Ｔ Ｎ Ｆを得る方法として、例えば、シグナルペ
プチドとして知られる１５〜４０アミノ酸よりなる微生
物または高等生物由来のアミノ酸配列を、前述の成熟Ｔ
ＮＦのアミノ酸配列のアミノ端に結合するべくＤＮＡ配
列を構成することにより達成される。 ヒトＴＮＦは次のようにして得られる。 １、バタテリオファージλ／ウサギ染色体遺伝子ライブ
ラリーとバクテリオファージ入／ヒト染色体遺伝子ライ
ブラリーは、バーバード大学生化学および分子生物学部
（７Ｄｉｖｉｎｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ。 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
０２１３８．Ｕ、Ｓ、Ａ ）のＴ。 Ｍａｎｉａｔｉｓ教授により調製されたものを用いる。 これらのライブラリーは次の方法によって作ることがで
きる。（Ｃａｌｌ、１５． ｐ、６８７ （１９７８）
参照〕 （１）ウサギあるいはヒトの組織、たとえばウサギある
いはヒトのすい臓を凍結粉末にし、ＲＮＡと蛋白成分を
分解処理し、沈澱によってウサギあるいはヒトの高分子
ＤＮＡを得る。 （２）この高分子ＤＮＡは遺伝子座位をランダムに切る
ために、部分的に分解する。 （３）得られたＤＮＡ断片から分子量分画によって、１
５から２０キロ塩基対（Ｋｂ）の大きさの断片を得る。 （４）工程３で得られたＤＮＡ断片をλ シャロン４Ａ
ファージベクターを用いてクローン化する。 （５）得られたベクターを、ｒＤＮＡを含む感染性のフ
ァージ粒子にｉｎ ｖｉｔｒｏで組み入れ、上記のウサ
ギあるいはヒトの染色体遺伝子ライブラリーを得る。 ２、参考例３で得られたウサギＴＮＦの ｃＤ、ＮＡは
、Ｐ、 ｖ、 Ｊ、 Ｒｉｇｂｙらのニックトランスレ
ーション法（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｒｉｏｔ、エユ３ｐ、２
３７（１９７７）参照〕によってａｍｐでラベル化する
。 ３、バクテリオファージλ／ウサギ染色体遺伝子ライブ
ラリーとバクテリオファージ入／ヒト染色体遺伝子ライ
ブラリーのそれぞれを、バクテリアの均一層の上に密に
プラークができるように植えつけ、３ｆｆｉｐでラベル
したウサギＴＮＦのｃ Ｄ Ｎ Ａとハイブリダイズさ
せてスクリーニングする。 ４、適合するクローンより、対応するＤＮＡを単離し、
制限酵素地図を作り、５ｏｕｔｈｅｒｎハイブリダイズ
法［８，Ｍ、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、 Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、、９８ 。 ｐ、５０３ （１９７５）参照］によって解析する。 ウサギＴＮＦとヒトＴＮＦの遺伝子を含む制限酵素分解
された断片を、プラスミドベクター中に導入し、サブク
ローンした後、塩基配列を解析する。 ５、ウサギＴＮＦのｃＤＮＡとウサギＴＮＦ遺伝子の塩
基配列を比較して、ウサギＴＮＦ遺伝子のエクソン（ウ
サギＴＮＦのアミノ酸配列をコードする塩基配列）と、
イントロン（ウサギＴＮＦのアミノ酸配列をコードしな
い塩基配列）を決定する。 ６、そして、ウサギＴＮＦ遺伝子とヒトＴＮＦの遺伝子
を比較して、ヒトＴＮＦ遺伝子のエクソンとイントロン
を決定する。 ７、ウサギＴＮＦ遺伝子のイントロンを削除しエクソン
を結合することによって得られた塩基配列より決められ
るウサギＴＮＦのアミノ酸配列は。 ウサギＴＮＦのｃ Ｄ Ｎ Ａの塩基配列より決められ
るアミノ酸配列と一致することが確認される。 ８、次に、ヒトＴＮＦ遺伝子のイントロンを削除し、エ
クソンを結合することによって得られた塩基配列よりヒ
トＴＮＦのアミノ酸配列が決められる。ヒトＴＮＦのア
ミノ酸配列は、ウサギＴＮＦのアミノ酸配列と部分的に
一致することが確認される。 ９、その後、ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡを江ｖｉｔ
ｒｏで修飾し、適当な発現ベクターに導入し、そのＤＮ
Ａを含む組換ＤＮＡを作製する。組換ＤＮＡは適当な宿
主に導入し、これを培養液中で増殖せしめて所望のヒト
ＴＮＦを発現せしめる。 １０、このようにして得られるヒトＴＮＦは成熟形でセ
リンから始まる１５５個のアミノ酸残基からなる。それ
がプレシーケンスにシグナルペプチドを有している場合
、シグナルペプチドは非常に疎水性の性質を有する。 以上は、ヒトＴＮＦ遺伝子およびヒトＴＮＦをコードす
るＤＮＡの取得方法および該ＤＮＡを用いるヒトＴＮＦ
の製造方法を示したものである。 しかし上記の記載は本発明を限定するものではなく、本
発明の本質的な特徴及び基本概念を変えることなく当業
者によって明らかな変換を行なうことができる。 各アミノ酸に対応するコドン（遺伝暗号）の使用頻度が
異る等の理由により、アミノ酸配列を変えることなく、
ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡの塩基配列の一部または
全部を、有機化学的に合成された人工のＤＮＡに置換え
ることも可能である。 おそらく、ヒトＴＮＦは、プレペプチド又はプレプロペ
プチドとして未成熟形で細胞内に産生され、プロセシン
グ段階でプロセスされて中間体を経て、成熟ＴＮＦを形
成するものと考えられる。 ヒトＴＮＦの未成熟形はヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列か
ら演鐸される。未成熟又は中間体のＴＮＦをコードする
ＤＮＡからなるＴＮＦ ＤＮＡは、また天然又は人工合
成のＤＮＡと組換えることができる。 これらの方法の応用形態の１つは、メチオニンコドン（
ＡＴＧ）を成熟あるいは未成熟あるいは中間体ＴＮＦ遺
伝子の５′端に導入し、そして３′端にＴＡＡもしくは
ＴＡＧもしくはＴＧＡの終止コドンと呼ばれるトリプレ
ットを、少なくとも１個導入することである。メチオニ
ンコドンが存在することにより、適当なプロモータによ
って合成されるｍＲＮＡから成熟あるいは未成熟あるい
は中間体ＴＮＦが産生される。この様にＴＮＦの末端に
付加されたメチオニン残基は、宿主によっては自然に除
去される。終止コドンを挿入する目的はＴＮＦ ＤＮＡ
から転写されたｍ ＲＮ Ａからの翻訳を適当な位置〔
式（Ｉ）のポリペプチドのＣ末端〕で止めることである
。 また別の形態としては、′シグナル配列″と呼ばれる疎
水性に富んだ配列を付加することにより、宿主細胞の外
またはグラム陰性細菌においては、１′ペリプラズム”
と呼ばれる部分へ、分泌させることも可能である。 また、開始コドンを組込んであるベクターの場合は、ベ
クターから由来する々ブチドとＴＮＦとの融合ペプチド
を形成するが、この場合は化学的または酵素的に切断す
るか、もしくはＴＮＦの主たる活性に変化がなければ、
そのまま用いることができる。 ヒトＴＮＦ遺伝子を、正しく転写し、それによって得ら
れるｍ ＲＮ Ａからの翻訳が正しく行われるような配
列において、プロモーター等の５′領域の遺伝子配列に
接続し、得られたＴＮＦ ＤＮＡ−プロモーター配列を
細菌または高等生物細胞中で複製可能なベクターと接続
した組換遺伝子を得、この組換遺伝子によって宿主とし
て細菌または高等生物細胞を形質転換し、この形質転換
体を増殖せしめ、ＴＮＦ遺伝子を発現せしめることによ
りＴＮＦを得ることができる。 宿主として大腸菌〔エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ−
ｒｉｃｈｉａ−並旦）〕（以下″大腸菌″と記載する）
を用いる場合は好適には大腸菌に１２株の種々の変異株
、例えばＨＢ ｉ Ｏ１（ＡＴＣＣ３３６９４）、Ｃ６
００Ｋ（ＡＴＣＣ３３９５５）、Ｄ１２１０、ＲＲＩ
（ＡＴＣＣ３１３４３）、ＭＣ１０６１、Ｌ Ｅ ３９
２ （ＡＴＣＣ３３５７２） 、 Ｊ Ｍｌ ０１ （
ＡＴＣＣ３３８７６）、ｚ １７７６ （ＡＴＣ（：
３１２４４）などが用いられる。 大腸菌を宿主とする場合のベクターとしては、ｐＢＲ３
２２、ｐＢＲ３２５、ＰＢＩ’１３２７、ｐＵＣ８、ｐ
ＵＣ９、ｐＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０１９） 、ｐＪＢ８
（ＡＴＣＣ３７０７４）、ＰＫＣ７（ＡＴＣＣ３７０
８４）等のプラスミドあるいはλｇｔ、λＢ、シャロン
４Ａのようなλファージ、Ｍ１３ファージなどが用いら
れる。 大腸菌の菌体中に、該生理活性ポリペプチドを産生させ
るために、大腸菌の遺伝子またはファージ遺伝子のプロ
モーターが使用される。このようなプロモーターとして
、好適にはラフ１〜−ス分解酵素（ＬＡＣ）のプロモー
ター及びそのＵＶ５変異、ペニシリナーゼ（ＢＬＡ）、
トリプトファン合成酵素（ＴＲＰ）のプロモーター、λ
ファージのＰＬプロモーターあるいはトリプトファン合
成酵素と、ラクトース分解酵素の融合プロモーターであ
るｔａｃプロモーター等が用いられる。 枯草菌〔バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５
ｕｂ−ｔｉｌｊｓ） ） （以下″枯草菌″と記載する
）を宿主とする場合には、ＢＤ１７０株（ＡＴＣＣ３３
６０８） 。 ＢＲ１５１株（ＡＴＣＣ３３６７７） 、 Ｍ Ｉ １
１２株（ＡＴＣＣ３３７１２）などが用いられ、ベクタ
ーとしてはｐｃ１９４（ＡＴＣＣ３７０３４）、ρＵＢ
ＩＩＯ（、ＡＴＣＣ３７０１５） 、 ｐｓＡ２１００
（ＡＴＣＣ３７０１４）、ｐＥ１９４などのプラスミド
が用いられる。 枯草菌を宿主とする場合のプロモーターとしては、クロ
ラムフェニコールアセチル化酵素（ＣＡＴ）やペニシリ
ナーゼ、エリスロマイシン耐性等の遺伝子のプロモータ
ーが用いられる。 酵母を宿主とする場合は、サツカロマイセス・セレビシ
ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａ
ｅ ）のＲ８２１８株（ＡＴＣＣ４４０７６）、ＳＨＹ
１株（ＡＴＣＣ４４７６９）、ＳＨＹ ３株（ＡＴＣ
Ｃ４４７７１）、Ｄ１３１Ａ株、４８３株、８３０株な
どが用いられ、そのベクターとしてはＹＥｐｌ ３ （
ＡＴＣＣ３７１１５）、 ＹＥｐ６、ＹＲＰ ７、ＹＩ
ｐ ５等のプラスミドが用いられる。 酵母を宿主とする場合、プロモーターとしては酸性ホス
ファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ）
、トリプトファン合成酵素（ＴＲＰ）、ホスホグリセ
レートキナーゼ（ＰＧＫ）、チトクロームＢ （ＣＯＢ
）、アクチン等の遺伝子のプロモーターが用いられる。 高等生物の培養細胞を宿主とする場合は、サル腎細胞、
ＣＯ５細胞、マウスＣ１２７細胞（ＡＴＣＣ１６１６）
などが用いられ、そのベクターとしては５ｖ４０、ウシ
ポリオーマウィルス等を用いることができる。 本発明の新規生理活性ポリペプチドは生体の正常組織は
傷つけず、腫瘍の壊死を引きおこす。本発明の活性ポリ
ペプチドは公知の方法によって調剤して悪性腫瘍細胞増
殖のような細胞増殖を阻害するのに有効な医薬組成物を
調製することができる。本発明の活性ポリペプチドは薬
剤として使用可能な担体と混合することもできる。本発
明の活性ポリペプチドの有効量を適当な量の担体と混ぜ
て、Ａ者に効果的に投与するのに適した医薬組成物を調
製することができる。 本発明の生理活性ポリペプチドは、抗腫瘍治療または抗
ウイルス治療の必要な患者に注射剤１点眼剤、点鼻剤、
吸入剤、外用にノ、経口投与用剤。 直腸投与用剤、膣内投与用剤などにして投与することが
できる。 本発明のポリペプチドの成人１日当りの治療量は、一般
に５０単位〜１００，０００，０００単位であり、さら
に好ましくは局所適用においては５０〜５００，０００
単位、静脈注射、筋肉注射などの全身注射においては、
１ 、０００〜１，０００，０００単位、経口投与にお
いては、１０，０００〜１００，０００，０００単位で
あり、用法あるいは症状に応じて適宜増減することがで
きる。 上記において用いた“１単位”はＬ−Ｍ細胞ＣＡＴＣＣ
ＣＣＬｌ、２）ＩＸＩＯｓ個／ｍＱの５０％を殺す本発
明の生理活性物質の量を意味する。 上述の量は次のようにして測定する。培養容器として９
６穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・ラボトリ
ー社、米国）を用い、Ｌ−Ｍ細胞を１ ｖｉｖ％のウシ
胎児血清を含むイーグルのミニマム・エッセンシャル培
地（その組成は、たとえば、「組織培養」中井準之助他
編集、朝食書店、１９６７年に記載されている）中で培
養する。順次培地で希釈した該生理活性ポリペプチド試
料０ 、１ ｍ Ｑと１０’個／ｍρの濃度のＬ−Ｍ細
胞の培地懸濁液０．１ｍｇをプレートの各穴の中で混合
し、マイクロプレートを５％の炭酸ガスを含む空気中、
３７℃で４８時間培養する。培養終了後、２０％グルタ
ルアルデヒド水溶液２０μΩを加え細胞を固定する。固
定後、マイクロプレートを蒸溜°水で洗浄。 乾燥して、０．０５％メチレンブルー溶液を０ 、１
ｍ Ｑ加え、生き残った細胞を染色する。余分なメチレ
ンブルーを洗い流し乾燥した後、残ったメチレンブルー
を０．３６Ｎ塩酸溶液で抽出し、その６６５ｎｍにおけ
る吸光度をタイターチック・マルチスキャン（フロー・
ラボラトリ−社、米国）で測定する。 この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。上記の本
発明の生理活性ポリペプチドのｌＸｌ０”個のＬ−Ｍ細
胞の５０％を殺す量は希釈率と吸光度をグラフ上にプロ
ットすることによってめることができる。 本発明の生理活性ポリペプチドは、非経口的に適用する
ことができる。非経口投与用の調剤にあたっては、アル
ブミン、ゼラチン、グロブリン、プロタミン、プロタミ
ン塩などの安定化剤、ショ糖、グリセリン、メチルセル
ロース、カルボキシメチルセルロースなどの増粘剤、各
種無機塩のｐＨ調整剤などを添加剤として加えることが
できる。 また、本発明の生理活性ポリペプチドは、錠剤の形で投
与することもできる。錠剤の調製の際に用いられる添加
物の例としては、上述の安定化剤に加えて、デンプン、
乳糖などの賦形剤を挙げることができる。 具体的には、動物実験の結果、マウスの腫瘍も大半か−
、二回の注射投与で完治する。たとえば、マウスの皮膚
に人工の腫瘍（メスＡ細胞）を移植、直径６〜７ミリに
なった段階で本発明の新規生理活性ポリペプチドをわず
か０．６マイクログラム注射すると、−週間後にかさぶ
た状になり、二週間後には再び毛が生え始めて完治、そ
の後、妊娠、出産する。 以下に参考例および実施例によって本発明を詳細に記す
が、本発明はこれに限定されるものではない。 本発明の実施にあたり、組換ＤＮＡの作製、組換体の微
生物への導入は、特に断らない限り下記の実験書（１）
〜（４）に従って実施する。 （１）高木康敬編著 遺伝子操作マニュアル、講談社 （２）高木康敬編著 遺伝子操作実験法、講談社（３）
Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｅ、 Ｆ、 Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ、 Ｊ、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ。 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（１
９８２年米国）（４） Ｒａｙ Ｗｕら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１巻Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ （米国）刊参考例および 施例中で
用いられる略号ＭＯＰＳ ：モリフォリノプロパンスル
ホン酸ＬＢ培地：ルリアーベルタニ培地 ＤＭＳＯニジメチルスルフオキシド ＰＦＵ ：プラーク・フォーミング単位ＥＤ、ＴＡ ニ
エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ ニドデシル硫酸ナトリ
ウム ＢＲＬ ：ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社、米国 ＤＭＦ ニジメチルホルムアミド Ｑａｃ ：ラクトース Ｔｒｉｓ ニドリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ＸＡＲ−５：Ｘ線フィルム（イーストマン・コダック社
、米国） Ｉ Ｘ５ｓＣ： ０．１５Ｍ塩化ナト’Ｊ ’ｌ’ ム
＋ ０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ＰＨ７ ２Ｘ５ＳＣ： ０．３０Ｍ塩化ナトリウム＋ ０．０３
０Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ３Ｘ５ＳＣ： ０．４５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０４５
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ５Ｘ５ＳＣ： ０．７５Ｍ塩化ナトリウＡ十０．０７５
Ｍクエン酸ナトリウム、ＰＨ７ ６Ｘ５ＳＣ： ０．９０Ｍ塩化ナトリウム＋０．０９０
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ＦＤＳＳ ： ５０％脱イオン化フォルムアミド＋５
ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ十５ Ｘ５ＳＰＥ＋ ０ 、１
％ＳＤＳ−１１００ｔＬｇ／ｍｆｌ変性ウシ胸腺ＤＮＡ
５ＳＰＥ ： ０．１８Ｍ塩化ナトリウム＋１０ｍＭリ
ン酸二水素ナトリウム＋１ ｍＷ ＥＤＴＡ、ｐＨ７，
４５Ｍ ： １Ω中に塩化ナトリウム５．８ｇ、硫酸マ
グネシウム・７水和物２ｇ、ＩＭ Ｔｒｉｓ、・Ｃｇ（ｐＨ７，５）５０ｍｇと２％ゼラチ
ン５ｍＱを含むファージ保存培 地 ＮＺブロス：１０中にＮＺアミン（カゼインのタイプＡ
水解物オフムコ・シェフイールド・ケミカル・デビイジ
ョン・オブ・クラフト社、米国）１０ｇ、塩化ナトリウ
ム５ｇと硫酸マグネシウム・７水和物２ｇを含む培地Ｉ
ＰＴＧ ：イソプロビルチオガラクトシドＸ、−ｇａｌ
：５−ジブロモ−４−クロロ−３−インドリルガラクト
シド ＴＡＲ： ０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ８，０）
−０，００２Ｍ ＥＤＴＡ ５ｘデンハルト溶液：ＩＱ中にフィコール（Ｆｉｃｏｌ
ｌ）１０００ ｌｌ１ｇ、ポリビニルピロリドン１００
０ｍｇ＋及びウシ血清アルブミン１０００＋ｎｇを含む
水溶液 ｂｐ：塩基対
はヒトＴＮＦをコードするＤＮＡの構造について鋭意研
究を行なった。その結果。 意外にも、ヒトポリペプチド遺伝子及びウサギＴＮＦ遺
伝子をウサギｃＤＮＡをプローブとして利用することに
よりクローンすることができること、ヒトポリペプチド
をコードする粗なりＮＡを巧く単離することができ、そ
の構造が塩基配列の相同性に関してウサギＴＮＦ遺伝子
、ヒトポリペプチド遺伝子及びウサギｃＤＮＡを比較す
ることにより決定できること、ヒトポリペプチドをコー
ドする純粋なりＮＡの構造も巧く決定することができ、
その純粋なりＮＡを得ることができること、およびヒト
ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて得られたヒト
ポリペプチドがＬ細胞障害活性を有することを本発明者
らは発見した。 本発明は、これらの新しい知見に基づき完成された。 即ち１本発明の目的はヒト生理活性ポリペプチドを提供
することにある。 本発明の他の目的は、ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡを
提供することにある。 また１本発明の目的は、ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡ
と複製可能な発現ベクターとからなる複製可能な組換Ｄ
ＮＡを提供することにある。 更にまた５本発明の目的は、上述のような組換ＤＮＡで
形質転換された微生物又は細胞を提供することにある。 更にまた、本発明の目的は、上述のヒト生理活性ポリペ
プチドの製造方法を提供することにある。 前述したこと及び本発明の他の諸口的、諸特徴及び諸利
益は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な記載から
明らかとなろう。 本質的には本発明によれば、次式（１）％式％ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｎ、Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ ＡｓｎＧｉｎ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇ］、ｙ
Ｌｅｕ Ｔｙｒ ＬｅｕＩ］、ｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｎ ＧｌｙＣｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｈｉｓ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ ）Ｉｊｓ Ｔｈｒ
ｌｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓ
ｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ ＬｙｓＶａｌ Ａｓｎ
！、ｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｒｙ
ｓ Ｓｅｒ Ｐｒｏ ＣｙｓＧｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｐｒｎ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｈａ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ ＬｙｓＰｒｏ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ＶａｌＰ
ｈｅ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ＬｙＳ Ｇｌｙ Ａｓ
ｐ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ＡｌａＧｌｕ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａ
ｓｐ Ｐｈｅ ＡｌａＧｌｕ Ｓｅｒ Ｇｕｙ Ｇ］、
ｎ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｉｌｅ
Ａｌａ ｅ ｕ （式中、Ｇ］、ｎはグルタミン残基、Ａｓｐはアスパラ
ギン酸残基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｔｙｒは、チロシ
ン残基、Ｖａｌはバリン残基−Ｌｙｓはリジン残基、Ｇ
］、ｕはグルタミン酸残基−Ａｈａはアラニン残基、
Ａｓｎはアスパラギン残基、１、ｅｕはロイシン残基、
Ｐｈｅはフェニルアラニン残基、ＧＪｙはグリシン残基
、Ｉｒ１ｓはヒスチジン残基、Ｓｅｒはセリン残基、Ｔ
ｈｒはスレオニン残基、Ｉ］、ｅはイソロイシン残基、
Ｔｒｐはトリプトファン残基、Ａｒｇはアルギニン残基
、Ｍｅｔはメチオニン残基及びＣｙｓはシスティン残基
を表わす）で表されるアミノ酸配列を含有するヒト生理
活性ポリペプチドが提供される。 本発明のヒト生理活性ポリペプチドはまた上記アミノ酸
配列のＮ末端にメチオニンが結合したポリペプチドおよ
び上記アミノ酸配列のＮ末端にヒトＴＮＦのためのシグ
ナルペプチドの部分もしくは全部が結合した中間体も包
含する。自然の変異によりまたは人工の変異により、ポ
リペブチ下の主たる活性に変化を与えることなく、ポリ
ペプチドをコードするＩ） Ｎ Ａの構造の一部を変化
させることが可能である。本発明のヒト生理活性ポリペ
プチドは、前記アミノ酸配列を有するポリペプチドの相
同変異体（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔ）に
相当する構造を有するポリペプチドも包含する。これら
の生理活性ポリペプチドはすべて以下“ヒトＴ Ｎ Ｆ
”と称する。 本発明のもう一つの態様によれば、次式（１）％式％ （ （式中、 Ｇｌｎ はグルタミン残基、Ａｓｐはアスパ
ラギン酸残基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｔｙｒはチロシ
ン残基、Ｖａｌ はバリン残基、Ｌｙｓはリジン残基、
Ｇｌｕはグルタミン酸残基、Ａｌａはアラニン残基、Ａ
ｓｎはアスパラギン残基、Ｌｅｕはロイシン残基、Ｐｈ
ｅはフェニルアラニン残基％Ｇｌｙはグリシン残基、Ｈ
ｊｓはヒスチジン残基、Ｓｅｒはセリン残基、Ｔｈｒは
ス１，７オニン残基、ＩＩｓはインロイシン残基、Ｔｒ
ｐはトリプトファン残基、Ａｒｇはアルギニン残基、Ｎ
ｅｔはメチオニン残基及びＣｙｓはシスティン残基を表
わす）で表されるアミノ酸配列を含有するヒト生理活性
ポリペプチドをコードする塩基配列を含有するデオキシ
リボ核酸が提供される。 更にまた、本発明によれば１次式（ＩＩ）で表される塩
基配列 ＴＣＡ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＣＣＣＣＧ ＡＧ
Ｔ ＧＡＣＡＡＧ ＣＣＴ ＧＴＡＧＣＣＣＡＴ ＧＴ
Ｔ ＧＴＡ ＧＣＡ ＡＡＣＣＣＴ ＣＡＡ ＧＣＴ
ＧＡＧ ＧＧＧＣＡＧ ＣＴＣＣＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ
ＡＡＣＣＧＣＣＧＧ ＧＣＣＡＡＴ ＧＣＣＣＴＣＣ
ＴＧ ＧＣＣＡＡＴ ＧＧＣＧＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ
ＡＧＡ ＧＡＴ ＡＡＣＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＴ
Ｇ ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＡＧ ＧＧＣＣＴＧ ＴＡＣＣ
ＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧ ＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡ
ＡＧ ＧＧＣＣＡＡ ＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣ
ＣＡＴ ＧＴＧ ＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＴ
ＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧ
ＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ ＧＣ
ＣＡＴＣＡＡＧ ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧ ＡＧＧ
ＧＡＧ ＡＣＣＣＣＡ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＡ
Ｇ ＧＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧ ＴＡＴ ＧＡＧ ＣＣ
ＣＡＴＣＴＡＴ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＴＣＴ丁
ＣＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＴ ＧＡＣＣ
ＧＡ ＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＧ ＡＴＣＡＡＴ ＣＧ
Ｇ ＣＣＣＧＡＣＴＡＴ ＣＴＣＧＡＣＴＴＴ ＧＣＣ
ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ
ＧＧＧ ＡＴＣＡＴＴ ＧＣＣＴＧ （式中、Ａはデオキシアデニル酸残基、Ｇはデオキシグ
アニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸残基及びＴはチ
ミジル酸残基を表わし、式（Ｈ）の左端および右端はそ
れぞれ５′−水酸基側および３′−水酸基側を表わす） および該塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選
ばれる少なくとも１つの塩基配列を含有するデオキシリ
ボ核酸が提供される。 本発明のＤＮＡは、微生物や培養細胞によって成熟ヒト
ＴＮＦを生産するために、前記塩基配列の５′末端にＡ
ＴＧ （Ａ−ＴおよびＧは前述の通り）が結合した塩基
配列からなるＤＮＡを包含する。 本発明のＤＮＡはまた、ヒトＴＮＦのシグナルペプチド
の部分または全部をコードする５′−フランキングＤＮ
Ａを含むＤＮＡも包含する。 自然の変異によりまたは人工的変異により、主たる活性
に変化を与えることなく、ＤＮＡの構造及びそれから演
絆されるポリペプチドの構造の一部を変異せしめること
が可能である。従って本発明のＤＮＡは、前述のすべて
のポリペプチドの相同変異体に相当する構造を有するポ
リペプチドをコードする塩基配列を含有することも可能
である。 遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産されるポリペプ
チドのアミノ酸配列を変えることなくその遺伝子の塩基
配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の塩基に置換す
ることができる。従って、本発明のＤＮＡはまた、遺伝
暗号の縮重に基づく置換によって変化された塩基配列を
含有することも可能である。この場合、上記置換により
得られた塩基配列から演課されるアミノ酸配列は前に定
義した式（Ｉ）のアミノ酸配列と一致する。 更にまた、本発明によれば、前記デオキシリボ核酸と複
製可能な発現ベクターとからなる複製可能な組換ＤＮＡ
が提供される。該組換ＤＮＡは、それによって形質転換
された微生物または細胞中で、ヒトＴＮＦのアミノ酸配
列を含有するポリペプチドを発現することができる。適
したベクターとしては、例えば、ｐＨＴＮＦ−１ａｃυ
ｖ５−１及びｐＨＴＮＦ−１ａｃＵＶ５−２発現ベクタ
ーが挙げられる。 更に本発明はまた、ヒトＴＮＦのアミノ酸配列を含有す
るポリペプチドを発現し得る複製可能な組換ＤＮＡで形
質転換された微生物または細胞に係る。このような微生
物または細胞として、大腸菌、枯草菌、酵母、高等動物
細胞が挙げられる。 更に本発明の他の態様によれば、 （ａ） 前記式（ＴＩ）で定義されるデオキシリボ核酸
を複製可能な発現ベクター４二連結して該デオキシリボ
核酸と該複製可能な発現ベクターとからなる複製可能な
組換ＤＮＡを得、 （ｂ）該複製可能な組換ＤＮＡで微生物または細胞を形
質転換させて形質転換体を形成せしめ、（ｃ）該形質転
換体を該微生物または細胞の親細胞から選別し、 （ｄ） 該形質転換体を培養して、該形質転換体に該デ
オキシリボ核酸を発現させてヒト生理活性ポリペプチド
を産生せしめ、そして （ｅ） 該ヒト生理活性ポリペプチドを培養した形質転
換体から単離する ことを含む本発明のヒト生理活性ポリペプチドの製造方
法が提供される。 本発明の方法によれば、前述の本発明のＤＮＡを複製可
能なベクターに組入れて該ＤＮＡを有する複製可能な組
換ＤＮＡを得、得られた該組換ＤＮＡで微生物または細
胞を形質転換させて該組換ＤＮＡを含有する形質転換体
を得る。得られた形質転換体は、該ＤＮＡに与えられた
表現型によって微生物又は培養細胞の親細胞から単離さ
れる。 得られた形質転換体を培養して前記デオキシリボ核酸の
有する遺伝情報を発現させて本発明の生理活性ポリペプ
チドを製造する。 更に本発明は直接発現産物として成熟形で宿主細胞から
分泌されるヒｈ Ｔ Ｎ Ｆに係る。そのような成熟ヒ
ｌ−Ｔ Ｎ Ｆを得る方法として、例えば、シグナルペ
プチドとして知られる１５〜４０アミノ酸よりなる微生
物または高等生物由来のアミノ酸配列を、前述の成熟Ｔ
ＮＦのアミノ酸配列のアミノ端に結合するべくＤＮＡ配
列を構成することにより達成される。 ヒトＴＮＦは次のようにして得られる。 １、バタテリオファージλ／ウサギ染色体遺伝子ライブ
ラリーとバクテリオファージ入／ヒト染色体遺伝子ライ
ブラリーは、バーバード大学生化学および分子生物学部
（７Ｄｉｖｉｎｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ。 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
０２１３８．Ｕ、Ｓ、Ａ ）のＴ。 Ｍａｎｉａｔｉｓ教授により調製されたものを用いる。 これらのライブラリーは次の方法によって作ることがで
きる。（Ｃａｌｌ、１５． ｐ、６８７ （１９７８）
参照〕 （１）ウサギあるいはヒトの組織、たとえばウサギある
いはヒトのすい臓を凍結粉末にし、ＲＮＡと蛋白成分を
分解処理し、沈澱によってウサギあるいはヒトの高分子
ＤＮＡを得る。 （２）この高分子ＤＮＡは遺伝子座位をランダムに切る
ために、部分的に分解する。 （３）得られたＤＮＡ断片から分子量分画によって、１
５から２０キロ塩基対（Ｋｂ）の大きさの断片を得る。 （４）工程３で得られたＤＮＡ断片をλ シャロン４Ａ
ファージベクターを用いてクローン化する。 （５）得られたベクターを、ｒＤＮＡを含む感染性のフ
ァージ粒子にｉｎ ｖｉｔｒｏで組み入れ、上記のウサ
ギあるいはヒトの染色体遺伝子ライブラリーを得る。 ２、参考例３で得られたウサギＴＮＦの ｃＤ、ＮＡは
、Ｐ、 ｖ、 Ｊ、 Ｒｉｇｂｙらのニックトランスレ
ーション法（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｒｉｏｔ、エユ３ｐ、２
３７（１９７７）参照〕によってａｍｐでラベル化する
。 ３、バクテリオファージλ／ウサギ染色体遺伝子ライブ
ラリーとバクテリオファージ入／ヒト染色体遺伝子ライ
ブラリーのそれぞれを、バクテリアの均一層の上に密に
プラークができるように植えつけ、３ｆｆｉｐでラベル
したウサギＴＮＦのｃ Ｄ Ｎ Ａとハイブリダイズさ
せてスクリーニングする。 ４、適合するクローンより、対応するＤＮＡを単離し、
制限酵素地図を作り、５ｏｕｔｈｅｒｎハイブリダイズ
法［８，Ｍ、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、 Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、、９８ 。 ｐ、５０３ （１９７５）参照］によって解析する。 ウサギＴＮＦとヒトＴＮＦの遺伝子を含む制限酵素分解
された断片を、プラスミドベクター中に導入し、サブク
ローンした後、塩基配列を解析する。 ５、ウサギＴＮＦのｃＤＮＡとウサギＴＮＦ遺伝子の塩
基配列を比較して、ウサギＴＮＦ遺伝子のエクソン（ウ
サギＴＮＦのアミノ酸配列をコードする塩基配列）と、
イントロン（ウサギＴＮＦのアミノ酸配列をコードしな
い塩基配列）を決定する。 ６、そして、ウサギＴＮＦ遺伝子とヒトＴＮＦの遺伝子
を比較して、ヒトＴＮＦ遺伝子のエクソンとイントロン
を決定する。 ７、ウサギＴＮＦ遺伝子のイントロンを削除しエクソン
を結合することによって得られた塩基配列より決められ
るウサギＴＮＦのアミノ酸配列は。 ウサギＴＮＦのｃ Ｄ Ｎ Ａの塩基配列より決められ
るアミノ酸配列と一致することが確認される。 ８、次に、ヒトＴＮＦ遺伝子のイントロンを削除し、エ
クソンを結合することによって得られた塩基配列よりヒ
トＴＮＦのアミノ酸配列が決められる。ヒトＴＮＦのア
ミノ酸配列は、ウサギＴＮＦのアミノ酸配列と部分的に
一致することが確認される。 ９、その後、ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡを江ｖｉｔ
ｒｏで修飾し、適当な発現ベクターに導入し、そのＤＮ
Ａを含む組換ＤＮＡを作製する。組換ＤＮＡは適当な宿
主に導入し、これを培養液中で増殖せしめて所望のヒト
ＴＮＦを発現せしめる。 １０、このようにして得られるヒトＴＮＦは成熟形でセ
リンから始まる１５５個のアミノ酸残基からなる。それ
がプレシーケンスにシグナルペプチドを有している場合
、シグナルペプチドは非常に疎水性の性質を有する。 以上は、ヒトＴＮＦ遺伝子およびヒトＴＮＦをコードす
るＤＮＡの取得方法および該ＤＮＡを用いるヒトＴＮＦ
の製造方法を示したものである。 しかし上記の記載は本発明を限定するものではなく、本
発明の本質的な特徴及び基本概念を変えることなく当業
者によって明らかな変換を行なうことができる。 各アミノ酸に対応するコドン（遺伝暗号）の使用頻度が
異る等の理由により、アミノ酸配列を変えることなく、
ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡの塩基配列の一部または
全部を、有機化学的に合成された人工のＤＮＡに置換え
ることも可能である。 おそらく、ヒトＴＮＦは、プレペプチド又はプレプロペ
プチドとして未成熟形で細胞内に産生され、プロセシン
グ段階でプロセスされて中間体を経て、成熟ＴＮＦを形
成するものと考えられる。 ヒトＴＮＦの未成熟形はヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列か
ら演鐸される。未成熟又は中間体のＴＮＦをコードする
ＤＮＡからなるＴＮＦ ＤＮＡは、また天然又は人工合
成のＤＮＡと組換えることができる。 これらの方法の応用形態の１つは、メチオニンコドン（
ＡＴＧ）を成熟あるいは未成熟あるいは中間体ＴＮＦ遺
伝子の５′端に導入し、そして３′端にＴＡＡもしくは
ＴＡＧもしくはＴＧＡの終止コドンと呼ばれるトリプレ
ットを、少なくとも１個導入することである。メチオニ
ンコドンが存在することにより、適当なプロモータによ
って合成されるｍＲＮＡから成熟あるいは未成熟あるい
は中間体ＴＮＦが産生される。この様にＴＮＦの末端に
付加されたメチオニン残基は、宿主によっては自然に除
去される。終止コドンを挿入する目的はＴＮＦ ＤＮＡ
から転写されたｍ ＲＮ Ａからの翻訳を適当な位置〔
式（Ｉ）のポリペプチドのＣ末端〕で止めることである
。 また別の形態としては、′シグナル配列″と呼ばれる疎
水性に富んだ配列を付加することにより、宿主細胞の外
またはグラム陰性細菌においては、１′ペリプラズム”
と呼ばれる部分へ、分泌させることも可能である。 また、開始コドンを組込んであるベクターの場合は、ベ
クターから由来する々ブチドとＴＮＦとの融合ペプチド
を形成するが、この場合は化学的または酵素的に切断す
るか、もしくはＴＮＦの主たる活性に変化がなければ、
そのまま用いることができる。 ヒトＴＮＦ遺伝子を、正しく転写し、それによって得ら
れるｍ ＲＮ Ａからの翻訳が正しく行われるような配
列において、プロモーター等の５′領域の遺伝子配列に
接続し、得られたＴＮＦ ＤＮＡ−プロモーター配列を
細菌または高等生物細胞中で複製可能なベクターと接続
した組換遺伝子を得、この組換遺伝子によって宿主とし
て細菌または高等生物細胞を形質転換し、この形質転換
体を増殖せしめ、ＴＮＦ遺伝子を発現せしめることによ
りＴＮＦを得ることができる。 宿主として大腸菌〔エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ−
ｒｉｃｈｉａ−並旦）〕（以下″大腸菌″と記載する）
を用いる場合は好適には大腸菌に１２株の種々の変異株
、例えばＨＢ ｉ Ｏ１（ＡＴＣＣ３３６９４）、Ｃ６
００Ｋ（ＡＴＣＣ３３９５５）、Ｄ１２１０、ＲＲＩ
（ＡＴＣＣ３１３４３）、ＭＣ１０６１、Ｌ Ｅ ３９
２ （ＡＴＣＣ３３５７２） 、 Ｊ Ｍｌ ０１ （
ＡＴＣＣ３３８７６）、ｚ １７７６ （ＡＴＣ（：
３１２４４）などが用いられる。 大腸菌を宿主とする場合のベクターとしては、ｐＢＲ３
２２、ｐＢＲ３２５、ＰＢＩ’１３２７、ｐＵＣ８、ｐ
ＵＣ９、ｐＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０１９） 、ｐＪＢ８
（ＡＴＣＣ３７０７４）、ＰＫＣ７（ＡＴＣＣ３７０
８４）等のプラスミドあるいはλｇｔ、λＢ、シャロン
４Ａのようなλファージ、Ｍ１３ファージなどが用いら
れる。 大腸菌の菌体中に、該生理活性ポリペプチドを産生させ
るために、大腸菌の遺伝子またはファージ遺伝子のプロ
モーターが使用される。このようなプロモーターとして
、好適にはラフ１〜−ス分解酵素（ＬＡＣ）のプロモー
ター及びそのＵＶ５変異、ペニシリナーゼ（ＢＬＡ）、
トリプトファン合成酵素（ＴＲＰ）のプロモーター、λ
ファージのＰＬプロモーターあるいはトリプトファン合
成酵素と、ラクトース分解酵素の融合プロモーターであ
るｔａｃプロモーター等が用いられる。 枯草菌〔バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５
ｕｂ−ｔｉｌｊｓ） ） （以下″枯草菌″と記載する
）を宿主とする場合には、ＢＤ１７０株（ＡＴＣＣ３３
６０８） 。 ＢＲ１５１株（ＡＴＣＣ３３６７７） 、 Ｍ Ｉ １
１２株（ＡＴＣＣ３３７１２）などが用いられ、ベクタ
ーとしてはｐｃ１９４（ＡＴＣＣ３７０３４）、ρＵＢ
ＩＩＯ（、ＡＴＣＣ３７０１５） 、 ｐｓＡ２１００
（ＡＴＣＣ３７０１４）、ｐＥ１９４などのプラスミド
が用いられる。 枯草菌を宿主とする場合のプロモーターとしては、クロ
ラムフェニコールアセチル化酵素（ＣＡＴ）やペニシリ
ナーゼ、エリスロマイシン耐性等の遺伝子のプロモータ
ーが用いられる。 酵母を宿主とする場合は、サツカロマイセス・セレビシ
ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａ
ｅ ）のＲ８２１８株（ＡＴＣＣ４４０７６）、ＳＨＹ
１株（ＡＴＣＣ４４７６９）、ＳＨＹ ３株（ＡＴＣ
Ｃ４４７７１）、Ｄ１３１Ａ株、４８３株、８３０株な
どが用いられ、そのベクターとしてはＹＥｐｌ ３ （
ＡＴＣＣ３７１１５）、 ＹＥｐ６、ＹＲＰ ７、ＹＩ
ｐ ５等のプラスミドが用いられる。 酵母を宿主とする場合、プロモーターとしては酸性ホス
ファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ）
、トリプトファン合成酵素（ＴＲＰ）、ホスホグリセ
レートキナーゼ（ＰＧＫ）、チトクロームＢ （ＣＯＢ
）、アクチン等の遺伝子のプロモーターが用いられる。 高等生物の培養細胞を宿主とする場合は、サル腎細胞、
ＣＯ５細胞、マウスＣ１２７細胞（ＡＴＣＣ１６１６）
などが用いられ、そのベクターとしては５ｖ４０、ウシ
ポリオーマウィルス等を用いることができる。 本発明の新規生理活性ポリペプチドは生体の正常組織は
傷つけず、腫瘍の壊死を引きおこす。本発明の活性ポリ
ペプチドは公知の方法によって調剤して悪性腫瘍細胞増
殖のような細胞増殖を阻害するのに有効な医薬組成物を
調製することができる。本発明の活性ポリペプチドは薬
剤として使用可能な担体と混合することもできる。本発
明の活性ポリペプチドの有効量を適当な量の担体と混ぜ
て、Ａ者に効果的に投与するのに適した医薬組成物を調
製することができる。 本発明の生理活性ポリペプチドは、抗腫瘍治療または抗
ウイルス治療の必要な患者に注射剤１点眼剤、点鼻剤、
吸入剤、外用にノ、経口投与用剤。 直腸投与用剤、膣内投与用剤などにして投与することが
できる。 本発明のポリペプチドの成人１日当りの治療量は、一般
に５０単位〜１００，０００，０００単位であり、さら
に好ましくは局所適用においては５０〜５００，０００
単位、静脈注射、筋肉注射などの全身注射においては、
１ 、０００〜１，０００，０００単位、経口投与にお
いては、１０，０００〜１００，０００，０００単位で
あり、用法あるいは症状に応じて適宜増減することがで
きる。 上記において用いた“１単位”はＬ−Ｍ細胞ＣＡＴＣＣ
ＣＣＬｌ、２）ＩＸＩＯｓ個／ｍＱの５０％を殺す本発
明の生理活性物質の量を意味する。 上述の量は次のようにして測定する。培養容器として９
６穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・ラボトリ
ー社、米国）を用い、Ｌ−Ｍ細胞を１ ｖｉｖ％のウシ
胎児血清を含むイーグルのミニマム・エッセンシャル培
地（その組成は、たとえば、「組織培養」中井準之助他
編集、朝食書店、１９６７年に記載されている）中で培
養する。順次培地で希釈した該生理活性ポリペプチド試
料０ 、１ ｍ Ｑと１０’個／ｍρの濃度のＬ−Ｍ細
胞の培地懸濁液０．１ｍｇをプレートの各穴の中で混合
し、マイクロプレートを５％の炭酸ガスを含む空気中、
３７℃で４８時間培養する。培養終了後、２０％グルタ
ルアルデヒド水溶液２０μΩを加え細胞を固定する。固
定後、マイクロプレートを蒸溜°水で洗浄。 乾燥して、０．０５％メチレンブルー溶液を０ 、１
ｍ Ｑ加え、生き残った細胞を染色する。余分なメチレ
ンブルーを洗い流し乾燥した後、残ったメチレンブルー
を０．３６Ｎ塩酸溶液で抽出し、その６６５ｎｍにおけ
る吸光度をタイターチック・マルチスキャン（フロー・
ラボラトリ−社、米国）で測定する。 この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。上記の本
発明の生理活性ポリペプチドのｌＸｌ０”個のＬ−Ｍ細
胞の５０％を殺す量は希釈率と吸光度をグラフ上にプロ
ットすることによってめることができる。 本発明の生理活性ポリペプチドは、非経口的に適用する
ことができる。非経口投与用の調剤にあたっては、アル
ブミン、ゼラチン、グロブリン、プロタミン、プロタミ
ン塩などの安定化剤、ショ糖、グリセリン、メチルセル
ロース、カルボキシメチルセルロースなどの増粘剤、各
種無機塩のｐＨ調整剤などを添加剤として加えることが
できる。 また、本発明の生理活性ポリペプチドは、錠剤の形で投
与することもできる。錠剤の調製の際に用いられる添加
物の例としては、上述の安定化剤に加えて、デンプン、
乳糖などの賦形剤を挙げることができる。 具体的には、動物実験の結果、マウスの腫瘍も大半か−
、二回の注射投与で完治する。たとえば、マウスの皮膚
に人工の腫瘍（メスＡ細胞）を移植、直径６〜７ミリに
なった段階で本発明の新規生理活性ポリペプチドをわず
か０．６マイクログラム注射すると、−週間後にかさぶ
た状になり、二週間後には再び毛が生え始めて完治、そ
の後、妊娠、出産する。 以下に参考例および実施例によって本発明を詳細に記す
が、本発明はこれに限定されるものではない。 本発明の実施にあたり、組換ＤＮＡの作製、組換体の微
生物への導入は、特に断らない限り下記の実験書（１）
〜（４）に従って実施する。 （１）高木康敬編著 遺伝子操作マニュアル、講談社 （２）高木康敬編著 遺伝子操作実験法、講談社（３）
Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｅ、 Ｆ、 Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ、 Ｊ、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ。 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（１
９８２年米国）（４） Ｒａｙ Ｗｕら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１巻Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ （米国）刊参考例および 施例中で
用いられる略号ＭＯＰＳ ：モリフォリノプロパンスル
ホン酸ＬＢ培地：ルリアーベルタニ培地 ＤＭＳＯニジメチルスルフオキシド ＰＦＵ ：プラーク・フォーミング単位ＥＤ、ＴＡ ニ
エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ ニドデシル硫酸ナトリ
ウム ＢＲＬ ：ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社、米国 ＤＭＦ ニジメチルホルムアミド Ｑａｃ ：ラクトース Ｔｒｉｓ ニドリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ＸＡＲ−５：Ｘ線フィルム（イーストマン・コダック社
、米国） Ｉ Ｘ５ｓＣ： ０．１５Ｍ塩化ナト’Ｊ ’ｌ’ ム
＋ ０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ＰＨ７ ２Ｘ５ＳＣ： ０．３０Ｍ塩化ナトリウム＋ ０．０３
０Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ３Ｘ５ＳＣ： ０．４５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０４５
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ５Ｘ５ＳＣ： ０．７５Ｍ塩化ナトリウＡ十０．０７５
Ｍクエン酸ナトリウム、ＰＨ７ ６Ｘ５ＳＣ： ０．９０Ｍ塩化ナトリウム＋０．０９０
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ＦＤＳＳ ： ５０％脱イオン化フォルムアミド＋５
ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ十５ Ｘ５ＳＰＥ＋ ０ 、１
％ＳＤＳ−１１００ｔＬｇ／ｍｆｌ変性ウシ胸腺ＤＮＡ
５ＳＰＥ ： ０．１８Ｍ塩化ナトリウム＋１０ｍＭリ
ン酸二水素ナトリウム＋１ ｍＷ ＥＤＴＡ、ｐＨ７，
４５Ｍ ： １Ω中に塩化ナトリウム５．８ｇ、硫酸マ
グネシウム・７水和物２ｇ、ＩＭ Ｔｒｉｓ、・Ｃｇ（ｐＨ７，５）５０ｍｇと２％ゼラチ
ン５ｍＱを含むファージ保存培 地 ＮＺブロス：１０中にＮＺアミン（カゼインのタイプＡ
水解物オフムコ・シェフイールド・ケミカル・デビイジ
ョン・オブ・クラフト社、米国）１０ｇ、塩化ナトリウ
ム５ｇと硫酸マグネシウム・７水和物２ｇを含む培地Ｉ
ＰＴＧ ：イソプロビルチオガラクトシドＸ、−ｇａｌ
：５−ジブロモ−４−クロロ−３−インドリルガラクト
シド ＴＡＲ： ０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ８，０）
−０，００２Ｍ ＥＤＴＡ ５ｘデンハルト溶液：ＩＱ中にフィコール（Ｆｉｃｏｌ
ｌ）１０００ ｌｌ１ｇ、ポリビニルピロリドン１００
０ｍｇ＋及びウシ血清アルブミン１０００＋ｎｇを含む
水溶液 ｂｐ：塩基対
参考例Ｉ Ｌ細胞障害活性評価
以下の参考例及び実施例においてＬ細胞を用いる活性評
価は、Ｒｕｆｆ等（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ ２巻Ｅ、
Ｐｉｃｋ編集、ＡｃａｄｅＩＩｌｉｃ Ｐｒｅｓｓ
２３５頁（１９８０））あるいは［Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、１２６巻２３５頁（１９８１年）］の方法に準じ、
本発明による生理活性物質がＬ９２９細胞（ＡＴＣＣＣ
ＣＬｌ）を殺す効果を測定するものである。すなわち、
順次培地で希釈した試料０．１ｍΩと、ＪＯ５個／ ｍ
ｆｌの濃度のＬ細胞の培地懸濁液０ 、１ ｍ Ｑを
、９６穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・ラボ
ラトリ−社、米国）に加える。培地はｌｖ／ｖ％の及び
最終濃度５μｇ／ｍＱのアクチノマイシンＤを含むイー
グルのミニマム・エッセンシャル培地（その組成は、た
とえば、「組織培養」中井準之助他編集、朝食書店、１
９６７年に記載されている）を用いる。マイクロプレー
トを５％の炭酸ガスを含む空気中、３７℃で２１時間培
養する。培養終了後、２０％グルタルアルデヒド水溶液
２０μＱを加え、細胞を固定する。固定後、マイクロプ
レートを洗浄、乾燥して、０．０５％メチレンブルー溶
液を０．１ｍ＋２加え、生き残った細胞を染色する。余
分なメチレンブルーを洗い流し乾燥した後。 残ったメチレンブルーを０．３６Ｎ塩酸溶液で抽出し、
その６６５ｎｍにおける吸光度をタイターチック・マル
チスキャン（フロー・ラボラトリ−社、米国）で測定す
る。この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。Ｌ９
２９細胞の５０％を殺すために必要な生理活性量を１単
位／ ｍ Ｑと定義し、試料を加えない対照の吸光度の
５０％の値に相当する試料の希釈率を、グラフあるいは
計算によってめ、その希釈率の逆数を試料の生理活性量
（単位／ｍ１２で表記する）とする。参考例において用
いる１１単位”は、１０５個／ ｍ ＱのＬ９２９細胞
の５０％を殺すウサギＴＮＦの量を意味する。 一方、蛋白質量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄらの方法（Ａｎａ
ｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ７２巻２４８〜２５４頁（１９７６
年）〕により、クーマシー・プリリブント・ブルーＧ２
５０を用いる色素結合法から算出する。 参考例２ 工程１（ウサギ血清ＴＮＦの取得） 雌ウサギ（体重２．５〜３．０ｋｇ）にホルマリンにて
死菌処理したプロピオニバクテリウム・アクネス（な」
伏匹ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ胚μ狙）〔コリネバクテリウ
ム・パーバム（Ｃｏｒ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ■■
叩）、ウェルカム社、英国）５０＋ｎｇを耳静脈より注
射する。 該ウサギに８日後再度１００μｇのエンド１−キシン〔
大腸菌０２６ ： Ｂ６由来のりボポリサッカライド、
ディフコ社製、米国〕を耳静脈より注射し、２時間後に
心臓より全採血する。採取した血液に１００ｍＲ当り１
００単位のヘパリンナトリウムを加えた後、５ ｒ Ｏ
ＯＯｒｐｍで３０分間冷却遠心操作を行ない、血球およ
び不溶固型物を除去する。 ４０羽のウサギより、血清ＴＮＦ３Ｘ１０４単位／ｍＱ
の活性を有する血漿２．４Ｑが得られる。 工程２（血清Ｔ Ｎ’Ｆの部分精製） 工程１で得た血漿２．４Ｑにセライト２４ｇを加え、１
時間攪拌した後濾過する。濾液に１．２Ｑの０．０４．
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７、８）を力■えた後、０
．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．９４Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，８）で充分しこ平衡イヒしたＤＥＡＥセ
ファロースＣＬ−６Ｂ（７７１１７２７社、スウェーデ
ン）のカラムに添加する。０．０４Ｍトリス−塩酸緩衝
液で洗浄後、０．、ｔ８Ｍ塩イしナトリウムを含む０．
０４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ）１７．２）を用いて溶
出する。Ｌ細胞障害活性を示す両分を、限外濾過により
濃縮する。次し１で５ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したセ
ファクリルＳ−２０００（ファルマシア社、スウェーデ
ン）のカラムに該濃縮液を添加し、同緩衝液にてゲル濾
過を行なう。活性画分は限外濾過により濃縮し３．５×
１０′′単位を回収する。比活性は１８ Ｘ １０’単
イ立／ ｒｒ＋ ｇである。 工程３（抗ＴＮＦ抗体） 血清より得たＴＮＦを工程２の如く部分精製しフロイン
トの完全アジュバントを１：１で混合し１２週令の雄Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下しこ注射する。２週後、及
び４週後にこの操作を繰返し、更に１週後に全採血し、
その血清を取得する。 この血清をＬ細胞障害活性を測定する培地中に終濃度５
００倍希釈となるように添加し、ウサギ血清から得たＴ
ＮＦのＬ細胞障害活性を参考例１に示す方法で測定する
と、Ｌ細胞障害活性は認められない。ここに得られるマ
ウス血清は、ウサギ血清ＴＮＦに対する抗体（抗ＴＮＦ
抗体と称する）を含むものと結論できる。 参考例３ 工程１ （ＴＮＦ産生細胞取得） 雌ウサギにホルマリンにて死菌処理したプロピオニバク
テリウム・アクネス（汀丑隈ｊα＋ｃｔｅ■憇ａｃｎｅ
ｓ） （コリネバクテリウム・パーバム（Ｃｏｒｙｎｅ
−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、ウェルカム社
、英国〕を静脈内投与し、７日後に気管切開し、肺を生
理食塩水で洗浄することにより浮遊性細胞を得る。この
細胞を生理食塩水で洗浄後、１０％ウシ胎児血清（フロ
ー・ラボラトリ−社、米国）を含むＲＰＭ１１６４０（
フロー・ラボラトリ−社、米国）を培地とし、炭酸ガス
５％含有空気を雰囲気とする炭酸ガスインキュベーター
にて、３７℃で培養する。 培養器を２コに分け、一方には大腸菌由来のエンドトキ
シン〔大腸菌０２６ ： Ｂ６由来のりボボリサッカラ
イド、ディフコ社、米国〕を１０μｇ／ｍΩとなるよう
に添加し、一方には同量の滅菌水を添加する。エンドト
キシンを添加した培養上清にＬ細胞障害活性が出現し７
時間で最高値に達する。 この活性は抗ＴＮＦ抗体で消去されるが、正常マウス血
清では消去されない。 一方、エンド１−キシンを添加しない細胞培養上清には
Ｌ細胞障害活性は認められない。 工程２（”Ｉ’ＮＦの分子量） 工程１における細胞培養においてエンドトキシンと共に
放射性Ｌ−（”Ｓ）メチオニン（１３００Ｃｉ／ｍｍｏ
Ｑ ｅ、アマージャム社、英国）を１＋ｏＣｉ／ｍＱ
となるように添加して培養を行う。培養上清をＬａｅｍ
ｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｕ、 Ｋ、 （１９
７０年）Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ２２７巻６
８０−６８５頁〕に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により解析する。ゲル濃度は１２．５％とな
るように調製する。泳動後エンハンス（ＥＮＨＡ、ＮＣ
Ｅ■）（二ニー・イングランド・ヌクレアー社、米国）
により処理し、乾燥後、Ｘ線フィルム（フジＲＸ、、富
士写真フィルム）に密着露光せしめる。エンドトキシン
存在下に培養した培養上清に、分子量約１７５００の物
質の生成が認められる。 また工程１における細胞培養の上滑を上記と同様にＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、２．５
％ＮＰ４０■ （カルビオケム社、米国）で１時間、水
中で２時間振どう後、各泳動レーンを切断分離し、泳動
方向に直角に２ｍｍ巾にスライスする。各スライス断片
をＬ細胞と共に培養することにより、Ｌ細胞障害活性を
調べる。エンドトキシン存在下に培養上清を展開したレ
ーンの分子量約１７５００の位置にＬ細胞障害活性が認
められ、その他の位置には細胞障害活性は認められない
。 工程３（ｍＲＮＡの取得） 工程１と同様な細胞培養においてエンドトキシンを添加
後２時間培養したのち、遠心分離にて細胞（ウサギ肺洗
浄細胞）を集める。細胞質ＲＮＡおよびその中からのｍ
ＲＮ Ａの抽出は下記の如くＣｈｉｒｇｗｉｎらの条
件（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、 Ｊ、 Ｍ、 ａｔ ａｌ、。 Ｂｊ、ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８巻５２９４頁（１９
７９年）〕に従って行なう。細胞３ Ｘ １０！１個に
対して４ｍＱの４Ｍグアニジンチオシアネート溶液を加
え、ホモジナイザー（ＡＭ−７、日本精機製作所）にて
破砕する。残金を遠心除去後、２．４ｇの塩化セシウム
を溶解し、あらかじめ２．５ｍＲの５．７Ｍ塩化セシウ
ム、０ 、３． Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７、５）を入
れであるポリアロマ−チューブへ静かに重層する。 ベックマン５Ｗ４１０−ター（ベックマン社、米国）を
用いて２０℃３００００ｒｐｍにて１２時間、超遠心分
離を行った後、上清を除き、ペレットを１．０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（５ｍＭ ｈＤＴＡ。 １ ｗ／ｖ％ＳＤＳを含有する）１ｍＱにて溶解する。 この溶液を１ ｍ Ｑのクロロホルムと１−ブタノール
の混液（容積比４：１）で抽出し、水層に０．０５容積
の２Ｍ酢酸ナトリウムと、２．５容積のエタノールを加
え、−２０℃で２時間以上放置してＲＮＡを沈澱させる
。遠心にて沈澱を集め、乾燥させたのち滅菌水５００μ
Ｑに溶解して、細胞質ＲＮＡ溶液を得る。 上記細胞質ＲＮＡ溶液を６８℃、２分間加熱後急冷し、
５００μａの２倍濃度の１１０１１ＩトリスＥＤＴＡ緩
衝液ｐＨ７，４（１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．１ｗ／ｖ％
ＳＤＳ及び０．５Ｍ塩化リチウムを含む）を加え、２
００■のオリゴ（ｄＴ）−セルロース（ＢＲＬ社、米国
）カラムに展開、Ｊ１１倍濃の上記ノベツファー１０
ｍ Ｑで洗浄、溶出緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ
７，４，１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｗ／ｖ％ｓＤｓを含
む）２ ｍ Ａで溶出する。溶出液に０．０５容積の酢
酸ナトリウム、２．５容積のエタノールを加えて一２０
℃に冷却して沈澱せしめる。沈澱を遠心にて集め、再度
同様にオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着する画分
を集める。紫外吸収スペクトル分析により、８５μｇの
ｒｎ ＲＮ Ａを回収する。 （以下余白） 工程４（ｍＲＮＡのサイズ分画） 工程３と同様にして得られるｍＲＮＡ８８０μｇを２５
０μ悲の水に溶解し、５−２５％直線シヨ糖密度勾配置
０ｍΩに重層する。シ目糖密度勾配は、５および２５％
のショ糖を各々含むトリス緩衝液（２５ｍＭトリス塩酸
ｐ）Ｉ ７ 、２．２鱈ＥＤＴＡ、１ ｗ／ｖ％ＳＤＳ
を含有する）を用い、ｌ５ＣＯ５７０グラジエンター（
イスコ社、米国）により作製する６ベツクマン５Ｗ４１
０−ターを用い、４℃４００００ｒｐｍ、１２時間の超
遠心を行ったのち分画回収装置（ベックマン社、米国）
により各４００μαの分画を回収する。各分画はエタノ
ール沈澱し、遠心機滅菌水に溶解する。 工程５（ｍＲＮＡの翻訳実験） アフリカッメガエル卵母細胞によるｍ ＲＮ Ａの翻訳
は、実験書（例えば寺岡宏、五木幹男、国中兼太部、蛋
白質、核酸、酵素、臨時増刊、遺伝子操作、６０２頁１
９８１年）に依る。アフリカッメガエルは、浜松生物教
材より得る。工程４で得り分画ｍ ＲＮ Ａを１μｇ／
μ塁になるように滅菌水に溶解し、卵母細胞１個あたり
、５０ｎｆｌずつを微量注入し、１ ｍ ｇ ／ ｍ
Ｑのウシ血清アルブミンを含有するＢａｒｔｈ溶液（７
，５ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７，６，８８ｍＭ塩化ナトリ
ウム、 １ｍＭ塩化カリ、０．３３ｍＭ硝酸カルシウム
、０．４１ｍＭ塩化カルシウム、０．８２ｍＭ硫酸マグ
ネシウム、２．４ｍＭ重炭酸ナトリウム、１８０／ｍΩ
ペニシリンＧ、１８μｇ／ ｍ Ｄ、ストレプトマイシ
ンを含有する）中で２４時間培養する。培養液のまま卵
母細胞をガラス棒でつぶし、遠心後、上清のＬ細胞障害
活性を測定する。沈降定数１６Ｓ付近において、Ｌ細胞
障害活性が最高値を与える。またこの活性は参考例２工
程３で得た抗ＴＮＦ抗体により消去されるが正常マウス
血清では消去されない。 工程６（形質転換体の取得） 工程４で得た分画ｍＲＮＡ ５μｇを用い、実験書（１
）９６頁以降に従って二重鎖ＤＮＡを調製する。逆転写
酵素はライフサイエンス社（米国）のものを使用する。 二重鎖ＤＮＡを３．５％ゲル濃度のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にて分画し、長さ約１０００−２０００ｂ
ｐの画分３３０ｎｇを得る。 この両分７ｎｇを用い同上の実験書に従い、ターミナル
デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ＢＲＬ社
、米国）を用いてデオキシＣ鎖をつなぎ、同様にＰｓｔ
Ｉ部位にデオキシＧ鎖をつないだプラスミドｐＢＲ３
２２５６ｎｇとアニールせしめる。 アニール後の混合物を用いて大腸菌に一１２株（ＨＢ
１０１ 、 ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換し、２０
００株の形質転換体を得る。 工程７（ウサギＴＮＦの部分アミノ酸配列）参考例２で
部分精製するＴＮＦを、工程２トこおけると同様にＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する。一
部をクマシー・ブリリアント・ブルー染色し、分子量約
１７０００の位置に対応するバンドをゲルから切出し、
１％重炭酸アンモニウムにより抽出する。５ Ｘ １０
’単位のＴＮＦを使用し、蛋白として約１８０μ＆回収
する。 このうち１５０μｇを１％重炭酸アンモニウム７５μｇ
に溶解、ＴＰＣＫ トリプシン（ワーシントン・バイオ
ケミカル社、米国）３μｇを添加し、３７℃、４時間イ
ンキュベートする。反応液をコスモシル５Ｃ８（牛丼化
学）を担体とする高速液体クロマトグラフィーにより分
画し、トリプシン消化断片を得る。 上記の如く高純度に精製したＴＮＦおよびそのトリプシ
ン消化断片は、次に、セファデックスＧ２５のカラムで
脱塩し、凍結乾燥する。Ｒ，Ｍ。 Ｈｅｗｉｃｋらの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２
５６巻７９９０−７９９７頁、１９８１年）に準じて、
Ｎ末端よりエドマン分解を行なう。各ステップにおいて
遊離してくるフェニルチオヒダントインアミノ酸は、高
速液体クロマトグラフィー、モデル５Ｐ８１００（スペ
クトラフィジックス社、米国）を用い、ゾ′ルバックス
○ＤＳ（デュポン社、米国）をカラムとして、常法によ
り分析する。この結果、ＴＮＦのＮ末端側からのアミノ
酸配列は下記の通りである。 Ｓａｒ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−５
ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉ
ｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ
−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−
トリプシン消化断片のうちの１つは、そのＮ末端より下
記のアミノ酸配列をもつ。 Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇ
ｌｕ Ｐｒｏ Ｍｅｔｌａ 工程８（オリゴＤＮＡプローブの合成）参考例３工程７
で得たＴＮＦのアミノ酸配列から推定されるｍ ＲＮ
Ａの塩基配列に対し、相補的な、オリゴＤＮＡを合成す
る。合成方法は、伊東らが既に発表している改良リン酸
トリエステル法（Ｈ，Ｉｔｏ ａｔ ａｌ、 Ｎｕｃｌ
ｓｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １０巻１７５５〜１７
６９頁、１９８２年）により行う。 アミノ酸配列から推定される１２８種類のオリゴＤＮＡ
を５グループに分け、各々１６．１６゜３２．３２．３
２種類の混合物として合成する。 各々を常法に従って脱保護し、Ｇ−５０（ファルマシア
社、スウェーデン）を用いるカラムクロマトグラフィー
、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動及び、ＤＥ５２（ワットマン社、米国）カラムクロマ
トグラフィーにより精製し、０．１ｍＭトリス−ＥＤＴ
Ａ緩衝液に対し透析する。 各々の精製オリゴＤＮＡを常法によりＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（ベセスダリサーチラボラトリーズ社、米
国）およびγ−３２Ｐ−アデノシントリリン酸を用いて
放射性ラベルし、ＤＥ５２カラム（ワットマン社、米国
）により精製する。各々、約３ Ｘ １０８ｃｐｍ／μ
ｇの放射能が導入される。 各グループの混合物の形で得られたオリゴＤＮＡプロー
ブを第１表に示すように命名する。 第１表にウサギＴＮＦのアミノ酸配列の一部とウサギＴ
ＮＦのアミノ酸配列から推定されるｍＲＮＡ塩基配列、
およびこれに基づく各グループの合成オリゴＤＮＡのプ
ローブの塩基配列を示す。 （以下余白） 参考例３工程３に従って得たＴＮＦ産生細胞のｍ ＲＮ
Ａを１ ｍｏｌｅグリオキザール、５０容量％ジメチ
ルスルホキシド及び１０ ＋＋＋ｍｏｌｅ ＮａＨ２Ｐ
Ｏ，の存在下に５０℃６０分間処理したのち、１．１重
量％アガロースゲル電気泳動により分画する。分画後の
ｍ ＲＮ Ａを、電気泳動式トランスファープロティン
グ装置（バイオラッド社、米国）を用いて、メーカーの
マニュアルに従い、移動せしめる。次いで、この膜上の
ｍ ＲＮ Ａと、５ＸＳＳＣ及び１５０μｇ／ｍΩの変
性サケ精子ＤＮＡを含む５×デンハルト溶液で６５℃、
２時間処理したのち、放射性標識したオリゴＤＮＡをＩ
Ｘ １０７ｃｐｍ／ ｍ Ｑ、５ＸＳＳＣ溶液を含む
５×デンハルト溶液で５０℃、２時間処理する。次いで
この膜を６ＸＳＳＣで室温、４０℃、５０℃、６０℃で
順次洗浄し、Ｘ線フィルムＭＡＲ−５（イーストマン・
コダック社、米国）に対し露光せしめる。この結果、ｌ
！１ＲＮＡと最も強くハイブリダイズするオリゴＤＮＡ
はＭＪであって、ＭＪ混合物中にｍ ＲＮ Ａと完全に
相補的な配列を有するオリゴＤＮＡが含まれていること
が判明する。 工程９（ウサギＴＮＦ遺伝子のクローニング）参考例３
工程６で得られる形質転換体を実験書（２）１６２頁め
方法に従ってセルロースフィルター上に移し、そのＤＮ
Ａと、参考例３工程８で選択される放射性標識オリゴＤ
ＮＡ （ＭＪ）とを参考例３工程８と同様の条件でハイ
ブリダイズせしめる（コロニー・ハイブリダイゼーショ
ン）。強くハイブリダイズする株４９個を選び更にフィ
ルター上に固定して再度コロニーハイブリダイゼーショ
ンを実施し、標識オリゴＤＮＡ （プローブＭ Ｊ ）
により強くハイブリダイズする９個を選ぶにの９個の株
から、実験書（１）の６頁の迅速プラスミド分離法に従
って各々約５μｇのプラスミドを取得する。このプラス
ミドを制限酵素Ｐｓｔ Ｉ 、 Ｔａｇ Ｉ、シ咀Ｔ
、 Ｐｓッ■（いずれもＢ Ｒ，Ｌ社、米国）を用い、
メーカーのマニュアルに従って切断し、１重量％アガロ
ースゲル電気泳動で、各々の酵素による切断片の長さを
比較する。 この結果、９株すべてが、約５０ｂｐのＰｖｕ ＩＩと
Ｒｓａ Ｉによる断片を有し、９株のほとんどがＲｓａ
Ｉによる約２ｏｏｂｐの断片を有し、部分的に共通の
配列を有することが示唆される。第１図に＃限酵素によ
る解析結果を図示する。 また、このうち７株をｌＯμｇ ／ ｍρのテトラサイ
クリンを含む２ ｍ ＡのＬＢ培地中で吸光度が第２表
に示す値になるまで培養し、遠心にて集めた菌体を２ｍ
Ａの生理食塩水中で超音波により破砕し、遠心上清のＬ
細胞障害活性を測定すると、第２表に示す如く、Ｌ細胞
障害活性を示す。対照実験としてプラスミドＰ、ＢＲ３
２２を含有する株を用いて同様の操作を繰返して行なう
。結果を第２表に示す。 （以下余白） 第２表 またこの活性は抗ＴＮＦ抗体により消去され、正常マウ
ス血清では消去されない。従ってこの９株すべてがＴＮ
Ｆ遺伝子を含むプラスミドを有していることが示される
。 工程１０（ウサギＴＮＦ遺伝子の塩基配列の決定）プラ
スミドｐＢ２−７、およびｐＲ１８を含有する大腸菌株
を、１０μｇ ／ ｍ Ｑのテトラサイクリンを含有す
るＭ９培地〔実験書（３）４４０頁〕１Ω中で培養した
後、実験書（３）９０頁の方法に従ってプラスミドを単
離し、各々約１５０μｇを得る。 各々の塩基配列ｒｅ Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌ、ｂｅｒｔ法
（Ｍａｘａｍ ｅｔａｌ、 Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、５５巻４９０頁、１９８０年、Ａｃ
ａｄｅＩｏｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に従って決定する。また
、この塩基配列と参考例３工程７で決定された部分アミ
ノ酸配列の一致により、ウサギＴＮＦ蛋白の全構造が解
明される。 工程１１ プラスミドｐＲ１２の組換体を用いて大腸菌内でｌａｃ
をプロモーターとしてＴＮＦを発現させることを目的に
プラスミドの構築を行なう。第２図に示す様に１０μｇ
のプラスミドｐＲ１２を１０ユニツトのＡｐａＩ（ＢＲ
Ｌ社）で３７℃で２時間消化し、４％のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で約６１、 Ｏｂ ｐ断片を単離する
。約１μｇの断片がゲルから電気泳動溶出する。参考例
３工程８と同様の方法によって第２図に示す２個デオキ
シオリゴヌクレオチド即ち、５’ −ＧＡＴＣＣＡＴＧ
ＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＧＧＧＣＣ−３’ と５ ’ −
ＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＴＧ−３’ とを合成し、
実験書（３） １２２頁に従って約１００ ｐｍｏｌｅ
の各デオキシオリゴヌクレオチドの５′末端をＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化する。 反応終了後、反応混合物をフェノールを用いて抽出し、
さらにクロロフォルムを用いて抽出した後、オリゴマー
を０．５μｇの約６１０塩基対のね翌工断片と合せてエ
タノール沈澱させる。実験書（１）３７頁に従って１０
ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼで前記の断片を４℃で１
−夜反応させ結合する。 反応終了液をエタノール沈澱後、２０ユニツトのＢａｍ
ＨＩで３７℃３時間消化し、４％のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ、約６７０ｂｐの断片を電気泳動溶
出により回収する。市販のプラスミドｐｕｃ−８（Ｐ−
Ｌバイオケミカル社、カタログ番号４９１６、米国）１
μｇをＢａｍＨＩで消化してフェノール抽出、クロロフ
ォルム抽出、エタノール沈澱をして調製したベクター０
．５μｇに約６７０ｂ ｐ、のＴＮＦの構造遺伝子を含
む両端に膿１１１サイトを持った断片をＴ４ＤＮＡ″Ｉ
ノガーゼを用いて結合する。実験書（４）、２０頁に従
って、大腸菌ＪＭ１０１株を形質転換して］、ｍＭＩＰ
ＴＧ及び０．００４％（１１／Ｖ）Ｘ −ｇａ １を含
む寒天培地で培養して約２ｏＯ個の透明プラークを得る
。これらの形質転換体１００個からプラスミドＤＮＡを
調製し、Ｂａｍ）ＩＩで消化したところ、１５個が目的
の約６７０ｂｐのＢａｍＨＩ断片を含んでいる。さらに
、挿入の方向を調べるために、上記１５個のプラスミド
をＰＬＩＣ−８上に１ケ所しか認識部位がないＥｃｏＲ
ＩとＰｖｕ ＩＩ（約６７０ｂｐの断片上にＬ！＆識部
位がある）を用いて消化し、６重量％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を用いて調べることにより、７個のプラ
スミドから目的の約１４０ｂＰの断片が確認され、ｐｕ
ｃ −ｓ上のｌａｃプロモーターから順方向であること
が判明する。 塩基配列の解析により、この７個のプラスミドは同一で
、ｌａｃプロモーター、合成りＮＡ及びｃ Ｄ Ｎ Ａ
間の結合部に所望のヌクレオチド配列を有することが確
認される。 プラスミドＰＲ１７を用いて、大腸菌内で１ａｃＵＶ５
をプロモーターとしてｒＮＦを直接発現させることを目
的にプラスミドの構築を行なう。第３図に示す様に１０
μｇのプラスミドｐＲ１７を１０ユニツトの幻已Ｉ （
Ｂ’ＲＬ社）で３７℃２時間消化し、４％のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で約６３０ｂｐの断片を単離する
。約１μｇの断片がゲルから電気泳動溶出する。工程８
と同様の方法によって第３図の２個のデオキシオリゴヌ
クレオチド即ち、 ５ ’ −ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡ
ＧＣＴＴＣＴＣＧＧＧＣＣ−３’ と５ ’ −ＣＧＡ
ＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＴＧ −３’ とを合成し、実験
書（３） １２２頁に従って約１００ ｐ＋ｅｏｌｅの
上記２種のデオキシオリゴヌクレオチドの５′末端をＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化する。 反応終了液をフェノールを用いて抽出し、さらにクロロ
フォルム抽出した後、先に得たｐＲ１７のｍＩ消化断片
（約６３０ ｂ ｐ） ０．５μｇと合わせてエタノー
ル沈澱する。実験書（１）３７頁に従って１０ユニツト
のＴ、リガーゼで４℃−夜反応させ、結合せしめる。反
応後、反応液をエタノール沈殿し、２０ユニツトのＥｃ
ｏＲＩで３′７℃３時間消化し。 ４％のポリアクリルアミドゲル電気泳動により約６７０
ｂｐの断片を回収する。 プラスミドｐＯＰ９５−１５は、フラーの方法（Ｆ。 Ｆｕｌｌｅｒ、 Ｇｅｎｅ、 １９巻４２頁〜５４頁、
１９８２年）に従って調製する。 ｐＯＰ９５−１５の１μｇをＥｅｏＲＩで消化してフェ
ノール抽出、クロロフォルム抽出、エタノール沈澱をし
てベクターを調製する。ベクター０．５μｇは、上記の
如く合成デオキシオリゴヌクレオチドと、ＴＮＦをコー
ドするＤＮＡを結合して得ら九る約６７０ｂＰの断片に
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合される。実験書（４
）、２０頁に従って、゛大腸菌Ｊ Ｍ １０１ （ＡＴ
ＣＣ３３８７６）を形質転換して１ｍＭＩＰＴＧ及び０
．００４％（ｗ／ｖ）ｘ −ｇ ａ ｌを含む寒天培地
上に約１５０個の白色コロニーを得る。 こわらのコロニー１００個からプラスミドＤＮＡを調製
し、ＥｃｏＲＩで消化したところ１２個が、目的の約６
７０ｂｐのＥｃｏＲＩ断片を有している。 さらに挿入の方向を調べるために上記１２個のプラスミ
ドをハｔｕＴ１とＰｓｔ Ｉを用いて消化し、１．５重
量％アガロースゲル電気泳動を用いて調べると４個のプ
ラスミドから目的の約１２８０ｂｐ及び２６００ｂｐの
断片が確認され、１ａｃＵＶ５プロモーターから順方向
にＴＮＦ遺伝子が接続されていることが判明する。 塩基配列の解析により、この４個のプラスミドは同一で
、１ａｃＵＶ、５プロモーター、合成デオキシオリゴヌ
クレオチド、及びｃＤＮＡが正しく結合されていること
が確認される。得られるプラスミドをｐＴＮＦ−１ａ
ｃＵＶ５−１と命名する。 工程１２（大腸菌が産生ずるＴＮＦの精製）工程１１で
得られたプラスミドを含有する大腸菌株を１００μｇ
／ ｍ Ｑのアンピシリンを含有するＬＢ培地に５０ｍ
Ω中３７℃で１夜培養し、５Ｑの同上の培地に移して更
に３時間培養する。イソプロピルβ−ローチオガラクト
ピラノシド（シグマ社米国）を終濃度１ ｍＭになる様
に添加し更に、６時間培養を続けたのち冷却し、遠心分
離により菌株を集める。工程１１におけると同様に菌体
を０．０４Ｍト’ＪＸ−塩酸緩衝液’（ｐＨ７，８）５
ｆｉ中で超音波破砕し、菌体蛋白溶液を得る。 この溶液は５ Ｘ １０７単位／ｍΩのＬ細胞障害活性
を示す。 この溶液を参考例２工程２と同様に精製し１．２×１０
６単位のＴＮＦを得る。このものの比活性は６．８×１
０７単位／ｍｇである。 工程１３〔メスＡザルコーマ（阿６ｔｈＡ ３ａｒｃｏ
ｍａ）担癌マウスを用いる活性評価〕 ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部及内に２ Ｘ １０’個のメ
スＡザルコーマ（Ｍｅｔｈ Ａ ｓａｒｃｏｍａ）細胞
を移植する。 ７日後、移植した腫瘍の大きさが直径７〜８ｍｍとなり
、出血性壊死などがなく良好な血行状態にあるマウスを
選び、尾静脈より生理食塩水で希釈した０ 、 ５ ｍ
Ｑの参考例３工程１２で得られるＴＮＦ試料を注射し
、２４時間後に次の判定基準により判定を行なう。 （−）：変化なし く＋）：かすかな出血性壊死 （廿）：中程度の出血性壊死（移植筒表面の真中から５
０％以上にわたって壊死） （＋）：顕著な出血性壊死（移植筒の中央部が重度に壊
死し、周囲の癌組織がわ ずかに残った状態） また、試料投与後２０日目に癌が完全に退縮したかどう
かを観察し完治率をめる。 以上の方法により測定し、大腸菌の生産するＴＮＦの活
性を第３表に示す。 実験マウス数 工程１ （プラスミドｐＲ１８、ｐＨ２，−７、ＰＢ２
−２の大腸菌に１２．ＭＣ１０６１株への形質転換）参
考例３で得られる上記３種のプラスミドを常法に従って
大腸菌に１２ＭＧ１０６１株へ形質転換する。詳しくは
大腸菌に’ｌ’２ＭＣ１０６１株のコロニーをＬＢ培地
を用いて、５５０ｎｍの吸光度が０．３になるまで培養
する。該培養物５０ ｍ ｍを集め、２５ｍＱの１０ｍ
Ｍ ＲｂＣＱを含む１０ｍＭＭ０ＰＳ （ＰＨ’７ 、
０ ）溶液で洗浄し１次いで５０ ｍＭＣａＣｌ、、１
０ｍＭ ＲｂＣＱを含む０．１Ｍ ＭＯＰＳ （ｐＨ６
，５）に再び懸濁する。 該懸濁液を３０分間氷冷し、遠心後、上清を除去し、３
０ｐＱのＤＭＳＯおよび５０ ｍＷ ＣａＣ１，と１０
ｍＭＲｂｃＱを含む０．１Ｍ ＭＯＰＳ （ｐＨ６，５
）の混合液中に懸濁させる。該懸濁液を２００μ℃ずつ
分注し、前述のプラスミドＤＮＡ溶液１０μａをそれぞ
れに加える。 該混合液をそれぞれ３０分間氷冷した後、４４℃で６０
秒ヒートショックを与え、ただちに、あらかじめ３７℃
に温めておいた５ ｍ ＱのＬ Ｂ培地を加える。この
溶液を３７℃で１時間培養した後、それぞれの溶液を遠
心し、上清を除去し、細胞ペレットを得る。該細胞ペレ
ットにＬＢ培地を加え、攪拌した後、懸濁液とする。該
懸濁液を３０μｇ／ ｍ Ｑのテトラサイクリンを含む
ＬＢ寒天プレートにまき、３７℃で１夜培養を行なう。 その結果。 プラスミドｐＲ１８、ＰＢ２−７とＰＢ２−２からそれ
ぞれテ１−ラサイクリン耐性形質転換菌のコロニーが得
られる。 工程２（ｐＨ２−７とｐＨ１８プラスミドＤＮＡのｍ１
ｌｌ） 工程１で得られるプラスミドｐＢ２−７とｐＨ１８の形
質転換体を下記の報文の方法に従って培養し。 プラスミドを増幅させる。次いで得られる形質転換体を
集菌し、破砕したのち、プラスミドＤＮＡを精製する。 〔実験書（３）、８８−９６頁〕すなわち、ＬＢ培地に
、それぞれの形質転換体を植菌し、激しく振とうしなが
ら３７℃で培養する。 次いで、この工程をくりかえして形質転換体を増殖させ
、更にプラスミドを増幅させる６次に。 得られる形質転換体の培養液を４℃に冷却しながら、４
０００ｇで１０分間遠心を行ない、上清を除去する。 氷冷５ＴＥ（０，１Ｍ塩化ナトリウム、１０ａＭトリス
ー塩酸緩衝液（ｐＨ７、８）と１ｍＭ ＩＥＤＴＡ ）
の１００ ｍ Ｑを用いて洗浄し、続いて１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、０）の中に２Ｑｍｇ／ｍｆｌ
のリゾチームを含む水溶液を用いて細胞を煮沸溶菌する
。得られる粘性液体を超遠心チューブに移し入れ２５．
０００ｒｐｍ３０分間４℃で遠心を行なってＤＮＡ溶液
を得る。 該ＤＮＡ溶液の容量を測った後、該溶液１ ｍ Ｑ当り
に、固体の塩化セシウム１ｇを加え、塩化セシウムが完
全に溶けるまで、ゆっくりと注意深く攪拌する。該塩化
セシウム水溶液の１０ ｍ Ｑ毎に。 １０ ｍｇ／ ｍ ＋２のエチジウムブロマイド水溶液
０．８ｍＱを加える。この結果、該溶液の最終比重は１
．５５ｇ／ｍｕ、エチジウムブロマイドの最終濃度は約
６００μｇ／ｍＱとなる。 該塩化セシウム水溶液を適当な遠心チューブに移し、空
隙に軽パラフィンオイルを加え、２０℃で３６時間、４
５’、 ００ Ｑｒｐ＋ｉの遠心を続けると上層に鎖状
の微生物由来ＤＮＡとニックの入った環状プラスミドＤ
ＮＡと、下層に閉環状プラスミドＤＮＡがくる。下部の
ＤＮＡのバンドをチューブの横に注射針をさしこんで採
取しガラスチューブに移す、エチジウムブロマイドを除
去し、水層をＴＡＥ緩衝液に透析する。プラスミドＤＮ
Ａ溶液をＲＮａｓｅ処理し、等量の飽和フェノール溶液
で抽出する。水層をあらかじめ０．１％ＳＤＳを含むＴ
ＡＥ緩衝液（ｐＨ８、０）で平衡化したバイオゲル（Ｂ
ｉｏｇｅｌ） Ａ １５０に付す、ＤＮＡを洗い込み、
活性画分を取得する為に０．１％ＳＤＳを含むＴＡＥ緩
衝液で溶出する。分画液をエタノールで沈殿させ、精製
したプラスミドＤＮＡを得る。 上記の方法により、精製ｐＨ２−７プラスミドＤＮＡが
２５０μｇ、ｐ８１８プラスミドＤＮＡが１３４μｇ得
られる。 工程３（精製ｐＢ２−７とＰＲ１８プラスミドＤＮＡの
ニックトランスレーション） 工程２で得られる精製プラスミドＤＮＡ４０μｇを制限
酵素Ｐｓｔ ｒで消化分解し、次いで４％アクリルアミ
ドゲル電気泳動にかける。 電気泳動後、染色を行ない目的とするバンドを切出して
ＰｓｔＩインサートを単離する。５００ｎｇの該す杏エ
インサートを用いて、Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ らの方
法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＬＩＳＡ、、ｚｌ、 １１８４（１９７４）） に従っ
てニックトランスレーションを行なった。ニックトラン
スレーションは市販キット（ＢＲＬ社）を用いる。 ２５μｇの反応系中で放射化したｄＣＴＰを８０μｍｏ
ｌｅ用いる（４００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌｅの場合）。 まず下記混合溶液を調製する。 ２．５ ｐ １２ 溶液Ａ （ｄＮＴＰ溶液）２．５
μｆｌ 溶液Ｂ（５００ｎｇのＤＮＡ、すなわち均佳Ｉ
インサート） ５μΩ 放射性ｄ ＣＴＰ （３２００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌｅ ） １．３μＱ、ｄｃＴＰ （６５μｍｏｌｅ、５０ｐｍｏ
１．ｅ／μｇ ｄＣＴＰ） 上ユニζＬｌ 溶液Ｅ （Ｈ２Ｏ） 計２２．５μ２ この２２．５μΩの溶液に、２．５μＱの溶液Ｃ（ＤＮ
ａｓｅ Ｉ 、ＤＮＡポリメラーゼ■）を加え。 １５℃６０分反応させる。 次いで、溶液Ｄ（停止緩衝液）を加え、停止させる。更
に、キャリアーｔＲＮＡを加えエタノール沈澱を２回行
ない、次いで５００μμの水に溶解する。 比活性は、９ 、３ Ｘ １０’ｃｐｍ／ μｇＤ Ｎ
Ａである。 工程２で得られる精製ｐＲ１８を用いて、同様に上記の
方法に従ってニックトランスレーションを行なう。比活
性は７ Ｘ １０７ｃｐｍ／ μｇＤＮＡである。 工程４（ＰＲ１８プラスミドＤＮＡのＲｓａ ｉ断片取
得） ８０μｇのｐＲ１８プラスミドＤＮＡを制限酵素Ｒｓａ
Ｉで消化し、４％アクリルアミドゲル電気泳動に付す
。下記の目的とするインサートのバンドを切出しＢＮＤ
カラムを用いて精製する。 約６４０ｂｐ ３．７７μｇ （回収率５２％）約１７
５ｂｐ １．７７μｇ （回収率５０％）この約６４０
ｂｐのインサートをＰＨ１０の３′断片（ＰＨ１０の３
′側の翻訳されない部分を意味する）、約１７’５ｂｐ
のインサートをｐＲ１８−ｃｆｒ（ｐＲ１８のコード部
分）と命名する。 更に上記に於いて助狙１の代わりにＰｓｔ ＩとＭｓｔ
ＩＩを用いて消化して、約４５０ｂＰの断片３．６５μ
ｇ（回収率６０％）を得る。このインサートはＰＨ１０
の５′断片と命名する。 工程５（ヒト染色体ＴＮＦ遺伝子の単離）実施例１工程
３で得られる３２Ｐラベル化プラスミドｐＢ２−フィン
サートをハイブリダイズ用プローブとして用い、シャロ
ン ４ＡのＥｃｏＲＩ切断サイト（Ｂｌａｔｔｎｅｒら
の方法５ｃｉｅｎｃｅ １９６ 、 １６１（１９７７
））にヒトＤＮＡを部分消化しサイズ分画した断片（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ １５゜６
８７ （１９７８）） を組込んで作成したバクテリオ
ファージシャロン ４Ａ／ヒト染色体遺伝子ライブラリ
ーの１０Ｇコのプラークをスクリーニングする。その方
法として（Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ。 ５ｃｉｅｎｃｅ、１９６ １８０ （１９７７） ）を
用いる。 出発培養液中のバクテリオファージの総てが、該生理活
性物質を作成する為に必要な遺伝子材料を含んでいると
は限らないので、ウサギＴＮＦの遺伝子に相補的な配列
を持つプローブを用いる。 目的とする遺伝子を含むファージプラークは、放射活性
を有するプローブとハイブリダイズし、その放射能活性
により見つけることができる。このようにして９つのハ
イブリダイズプラークが、該ライブラリーから得られる
。 方法と条件は次の通りである。 １）プラーク数二〜Ｉ Ｘ Ｉ Ｑ’プラーク（〜４×
１０’プラーク／φ１５０ｍ＋ｍプレート×２５）２）
ニトロセルロースフィルターへの転写：［Ｂｅｎｔｏｎ
ａｎｄ Ｄａｖｉｓ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 １９６
、１８０（１９７７）参照］ ３）ハイブリダイズ： １．２５Ｘ１０ｃｐｍ／ｍｕの
実施例１工程３で得たｐＲ２−フィンサートプローブの
添加、４２℃、１９．５時間 ４）洗い：２ＸｓｓＧ−０．１％ｓＤｓを用いて室温で
１０分間洗いを４回、続いて１ｘｓｓｃ−０，１％ＳＤ
Ｓを用いて５０℃で３０分間洗いを２回 ５）露光：ＸＡＲ−５，−８０’Ｃ１２枚の増感紙。 ３９時間 上記スクリーニングで１２の候補株が得られる。 上述と同様の方法で二次スクリーニングを行ない所望の
断片を有する９個の株を得る。これらの株を用いて上述
と同様の方法で三次スクリーニングを行ない所望の断片
を有する９個の株を得る。この９個の株について上述と
同様の方法で４次スクリーニングを行ない、９個の株が
所望の断片を含むことを確認する。所望の断片を含む９
個のバクテリオファージを、それぞれＨＧＩ〜ＨＧ ９
と命名する。 工程６（ウサギ染色体ＴＮＦ遺伝子の単離）消化ヒトＤ
ＮＡの代りに消化ウサギＤＮＡ［ＭａｎｉａＬＬｓ ｅ
ｔ ａｌ、 Ｃｅ１ｌ、上５． ６８７（１９７８））
を用いて調製した１０’個のバクテリオファージシャロ
ン４Ａ／ウサギ染色体遺伝子ライブラリーのプラークを
用いる以外は実施例１工程５と実質的に同様の操作を行
なう。６．７×１０５個のバクテリオファージシャロン
４Ａ／ウサギ染色体遺伝子ライブラリーのプラークを
１０’個のバクテリオファージシャロン ４Ａ／ヒト染
色体遺伝子ライブラリーのプラークの代わりに用いる。 ウサギ染色体遺伝子を含む２つのバクテリオファージ（
ＲＧ−１、ＲＧ−２）が得られる。 工程７（ヒト遺伝子クローンのサザンプロット解析） 実施例１工程５で得られたＨＧ−３、ＨＧ−６、ＨＧ−
７のバクテリオファージを用いて、それぞれＤＮＡを次
の方法に従って得る。 ６ Ｘ １０”個の大腸菌ＬＥ３９２ （宿主）を１８
ｍ ＱのＳＭ中に懸濁し、そこにバクテリオファージ
ＨＧ−３の３Ｘ１０”ＰＦＵを加え、３７℃で２０分間
感染させる。次いで得られる混合液を３ＱのＮＺブロス
に加え、３７℃、２３時間攪拌培養する。次いで６０
ｍ Ａのクロロホルムを該混合液に加えて３０分間攪拌
する。最終濃度ＩＭとなるように混合液中に更に塩化ナ
トリウムを加えた後１５分間放置する６次いで遠心操作
を行なって上滑を得る。次いで得られる上清に分子量約
６０００のポリエチレングリコールをポリエチレングリ
コールの濃度が１０％（ｗ／ｖ）になるように加えて、
４℃、２２時間放置する。次いでバクテリオファージを
遠心操作を行なって採取する。 得られるバクテリオファージをＳＭの２８ｍΩに懸濁し
、次いでクロロホルムを等量加える。ポルテックスミキ
サーで３０秒間混合した後、遠心して水層を集め、その
全量をＳＭで３０ ｍ （ｌにする。 これに２６．４ｇの塩化セシウムを加え、静かに溶解し
た後、超遠心（４５０００ｒｐｍ、２０時間）でファー
ジのバンドを採取する。１０＋ｎＭ塩化ナトリウムと１
０ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（
ｐＨ８，０）に透析した後、それぞれの最終濃度が２０
１１１Ｍ、５０μｇ／ｍ１２．０．５％となルヨうニＥ
Ｄ Ｔ Ａ、プロテイナーゼに、ＳＤＳ。 を加え６５℃で１時間処理する。次にフェノール、フェ
ノール：クロロホルム＝１：１（容積比）、クロロホル
ムで各１回ずつ抽出し、得られる水層を１＋ｎＭＥＤＴ
Ａを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８，０）で透析す
る。この溶液の紫外線吸光度を測定すると、バクテリオ
ファージＨＧ−３の純粋なりＮＡが得られることが確認
される。 バクテリオファージＨＧ−３のＤＮＡを調製するために
用いられる方法と実質的に同じ方法を応用することによ
り、バクテリオファージＨＧ−６とＨＧ−７のＤＮＡを
得る。 このようにしてＨＧ−３、ＨＧ−６、ＨＧ−７１７１Ｄ
ＮＡを各々２９２０１ｔｇ、１ｌ１００ｕ、８１９μｇ
を得る。次いで５ｏｕｔｈａｒｎ法［ＩＥ、 Ｍ、５ｏ
ｕｔｈｅｒｎ。 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、９８．５０３ （１９７５）
）に従って、以下の実験条件でこれらのＤＮＡのサザン
ブロッティングを行なう。 １）ＤＮＡ： ＨＧ−３８２５ｎｇ ＨＧ−６９３５ｎｇ ＨＧ−７６８５ｎｇ ２）各種制限酵素による分解ニ ジ猥Ｈ１１０単位、４巴ＲＩ １０単位、地υＨ１１０
単位十均虚Ｒ１１０単位、肛岨ＩＩＩ １０単位。 肛吋ＩＩＩ １０単位十馳旦ＲＩ １０単位、む凹ｎ
１０単位 ３７℃ ３時間 ３）電気泳動： ０．８％アガロースゲル ＡＥ ２８Ｖ、１５．５時間 ４）ニトロセルロースフィルターへの転写：（Ｅ、 Ｍ
、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、
、 ９８ 。 ５０３ （１９７５）参照） ５）プレハイブリダイズ： ３０ｍＱ ＦｐＳＳ ４２℃ ６時間 ６）ハイブリダイズ： ＰＨ１０の５′−断片（Ｉ Ｘ １０’ｃｐｍ／ ｍ
Ｑ、実施例１工程４にて調製したもの）を含む４２℃、
１４時間 ７）洗い： ２ＸＳＳＣ−０，１％ＳＤＳを用いて室温で１０分間洗
いを４回、続いてｌＸ５ＳＣ−０，１％ＳＤＳを用いて
５０℃で３０分間洗いを２回 ８）露光： ＸＡＲ−５（イーストマン・コダック社、米国）−８０
℃、２枚の増感紙 １４時間ハイブリダイズの結果は、第４表に示す。 （以下余白） 第４男 ←は況と同じＩｖｒバーかハイブリダイズしたことを示
す。 工程８（ウサギ遺伝子クローンのサザンプロット解析） 実施例１工程７において、ＨＧ−３，ＨＧ−６、ＨＧ−
７のかわりにＲＧ−１、ＲＧ−２のバクテリオファージ
のそれぞれを用いる以外は、実質的に同様の操作によっ
てサザンプロット解析を行なう。その結果、ＰＨ１０の
５′断片はＲＧ−１およびＲＧ−２を捏ｉｍＨＩ、影副
訂、韮Ｉ１．Ｈｉ皿■およびＢａｍＨＩ ＋ＥｃｏＲＩ
のそれぞれで分解して得られる断片の、単一バンドにハ
イブリダイズすることがわかる。これは、ｐＲ１８の５
′断片とハイブリダイズする各断片がＴＮＦをコードす
る全塩基配列を含むことを示唆する。 工程９ （ヒト染色体のＴＮＦ遺伝子を含むバクテリア
クローンの構築） 工程５において得られたＨＧ−３のＤＮＡを、Ｌａｎｄ
ｙらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ユ３．ｐ、２
１３４（１９７４））によって得る。このＨＧ−３のＤ
ＮＡ３３μｇをＥｃｏＲＩの８０単位によって３７℃で
３時間分解する。分解物は１％低融点アガロースゲル（
条件：ＩＸＴＡＥ、２０Ｖ、１４．５時間）にて電気泳
動する。２．９ｋｂのバンドをアガロースゲルより、Ｔ
、Ｍａｎｉａｔｉｓ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、ｐ、 ３７７ （１９８２） ］の方
法で単離する。詳しくは、２ 、９ ｋｂのバンド部位
を切り出したゲルを６５℃で１５分間加熱する。 さらに、この２ 、９ ｋｂの長さを持っＥｃｏＲＩ分
解ＨＧ−３断片（以降、これをｒＨＧ −３／ＥｃｏＲ
Ｉ ２．９ｋｂ断片」と略することが多い）を、溶けた
ゲルよりフェノールで３回、エタノールで３回抽出、酢
酸アンモニウムを含むエタノールで沈澱して回収する。 このようにして、６３７μｇ（収率約３０％）のＨＧ−
３／は通ＲＩ ２．９ｋｂ断片を得る。 上記断片２５５ｎｇとＥｃｏＲＩ分解ｐＵｃ１３（Ｊ、
Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ＋ １０１ ＋ｒ＋、２０（１９８３））を
、２．５単位のＴ４リガーゼを用いて結合する。 大腸菌に１２ ＪＭ８３株を上で得られる結合生成物を
用いて形質転換する。詳しくは、大腸菌に１２ ＪＭ８
３株をＬＢ培地中で、培養プロスの５５０ｎｍにおける
吸光度が０．３になるまで培養する。５０ｍｌ１の増殖
した大腸菌に１２ ＪＭ８３株を集め、２５ｍｆｌの１
０ ｍＭ Ｍ、ＯＰ ５（ｐＨ７，０） −１０ｍＭ
ＲｂＣ１で洗い、２５ｍＱの０．１ ’ ＭＯＰＳ （
ｐＨ６，５）−５０ｒｎＭ ＣａＣ１゜１０ ｍ ｂｚ
ＲｂＣ１中に懸濁する。この懸濁液２０３μａに、Ｌ
ｏｎｇの上記結合生成物を含む１０μ０の水溶液を加え
る。この混合物を水中にて３０分間冷却し、４０℃で６
０秒間加熱する。その後すぐに、あらかじめ３７℃にし
ておいたＬＢブロス５ｍＱに、加熱した混合物を加え、
３７℃で１時間培養する。得られる培養ブロスを遠心し
上清を除去する。遠沈した細胞にＬＢ培地を加えて、３
０μｇ／ｍＪ＋のアンピシリンと４０μｇ ／ ｍ Ｑ
のｘ−ｇａｌを含むＬＢプレートに植菌する。インサー
トを含むプラスミドが導入された大腸菌に１２ＪＭ８３
株のコロニーは白色であるが、プラスミドのみが導入さ
れた株のコロニーは青色である。 得られる白色コロニーは再び、３０μｇ／ｍＱのアンピ
シリンと４０μｇ／ｍＱのｘ −ｇａｌ を含むＩ、Ｂ
プレートに確認のため植菌する。 上で得られる白色コロニーより、１０個のコロニー（バ
クチリアルクローン）を選び、ＨｏｌｍｅｓとＱｕｉｇ
ｌｅｙの迅速法（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １
１４ 、 ｐ、１９３（１９８１））を用いてスクリー
ニングする。 詳しくは、それぞれのコロニーを３０μｇ／ｍＱのアン
ピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養する。 増殖した細胞を集め、２ｍｇ／ｍＱリゾチームー５Ｑ
ｍ Ｍグルコース−１０ｍＭ ＥＤＴＡ−２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ ＨＣＱ （ｐＨ８、０）中に懸濁する。この懸
濁液を室温で５分間おき、これに２００μａの０．２Ｎ
ＮａＯＨ１％ＳＤＳを加える。ゆっくり攪拌したのち、
この懸濁液を２分間室温におく。続いて、１５０μΩの
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５、２）を加え、１０分間−
２０℃におき、１５分間遠心してその上清を得る。この
上清に９００ｍＡの冷エタノールを加え、５分間遠心し
てその沈澱を得る。得られる沈澱を７０％エタノールで
洗い乾燥してプラスミドＤＮＡを得る。この方法を用い
て１０個のプラスミドを得る。 それぞれのプラスミドＤＮＡを、１０ ｍ Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−０，１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）に溶かし、
ＥｃｏＲＩで消化し、制限酵素消化のために電気泳動に
供でる。消化と電気泳動の条件は以下の通りである。 消化ニブラスミドＤＮＡ溶液＝上で得られたものの５分
の１量、３単位の狗丑Ｒ１，３７℃、１．５時間電気泳
動：１％アガロースゲル、ＩＸＴＡＥ、１２０Ｖ、２時
間 上記の制限酵素解析によって、１０種のクローンのうち
８種が目的のものであることが示される。 すなわち、この８種のクローンは２ 、９ ｋｂの断片
を持っている。８種の目的のクローンのうち、１つを選
び大腸菌に１２ＪＭ８３ （ｐＨＧＥ）株（ＡＴＣＣ，
３９６５６）と名づける。 続いて、ｐＨ２−７とＰＲＩ ８を有する大腸菌のかわ
りに大腸菌に１２のＪ Ｍ ８３ （ｐ ＨＧ Ｅ ）
株を用いる以外は工程２と同じ操作によって、１．８９
ｍｇのｐＨＧＥ ＤＮＡを得る。 工程１０（ＥｃｏＲＩ分解ＲＧ−１のサブクローニング
） 工程６において得られる３０μｇのＲＧ−１をＥｃｏＲ
Ｉにより消化する。得られる各種断片の混合物より、上
記各種断片の混合物と０．８％の低融点アガロースゲル
を用いる以外は工程９と実質的に同じ操作によって、約
３ 、５ ｋｂの長さを持つ断片を回収し、１．０μｇ
のＢｃｏＲＩ分解ＲＧ−１断片（３，５ｋｂ）を得る。 この断片とＥｃｏＲＩで消化したｐＵｃ１３を、Ｅｃｏ
ＲＩ分解ＨＧ−３断片（２、９ｋｂ）のかわりに上記も
副ＲＩ分解断片（３、５ｋｂ）を用いる以外は工程９と
実質的に同じ操作によって、連結する。 大腸菌に１２ ＪＭ８３株への形質転換、バクテリアク
ローンのスクリーニング、クローンＤＮＡの分解と電気
泳動は、上記結合ＤＮＡ断片を用いる以外は上記工程９
と実質的に同じ操作によって行なう。得られるクローン
は大腸菌に１２ＪＭ８３ （ＰＲＧＥ）株（ＡＴＣＣ３
９６５５）と名づける。 続いて、大腸菌に１２ＪＭ８３（ＰＲＧＥン株をＰＢ２
−７とＰＲ−１８のかわりに用いる以外は工程２と実質
的に同じ操作によって、Ｐ ＲＧＥＤＮＡを１．７Ｑｍ
ｇ調製する。 工程１１（ｐＨＧＥプラスミドＤＮＡの制限酵素解析） 工程９で得られるｐＨＧＥ ＤＮＡの制限酵素解析を、
Ｍａｎｉａｔｉｓの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ。 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、 ９８頁（１９８２））によって行なう。 その方法と条件は以下の通りである。 １）諺１’ｌＩによるｐＨＧＥ ＤＮＡの分解：１８．
６μｇのｐ ＨＧ Ｅ、６４単位の駐旦Ｒ１，３７℃２
時間 ２）エタノール沈！Ｒ＝沈殿物 ３）溶解： ＥｃｏＲＩ分解ｐ、ＨＧＥが’Ｊ−ｆｉｇ
／ｍＱの溶液になるように蒸留水を加える。 ４）各種制限酵素による消化＝１μｇの上記ＥｃｏＲＩ
分解ｐＨＧＥ、制限酵素＝５５単のハ！■、５単位の旦
■■＋１０単位のＲｓａ Ｉ、１０単位の助■Ｉ、４単
位の１四■、３単位ハ１１．９単位のＰｓｔ Ｉ、３７
℃、２時間 ５）電気泳動；２％アガロースゲル、ＩＸＴＡＥ２８Ｖ
、１４．５時間 ６）ニトロセルロースフィルターへの転写：〔Ｅ。 Ｍ、 ５ｏｕｔｈａｒｎ、 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、
９旦、Ｐ、５０３（１９７５）参照〕 ７）第一回プレハイブリダイズ：３０ｍＱＦＤＳＳ、４
２℃、６時間 ８）第一回ハイブリダイズ： ｐＲ１８の５′断片（工
程４で得られるもの、 ５ Ｘ １０’ｃｐｍ／ ｍ
Ｑ ）４２℃、１４時間 ９）洗い： ２ＸＳＳＣ−０，１％ＳＤＳを用いて室温
で１０分間洗いを４回、続いてｌＸ５ＳＣ−０，１％Ｓ
ＤＳを用いて５０℃で３０分間洗いを２回 １０）露光：ＸＡＲ−５（イーストマン・コダック社、
米国）、−８０℃、２枚の増感紙、１７．５時間 １１）洗い： ０．５Ｍ ＮａＯＨ−１，５Ｍ ＮａＣ
１で１分間、０ 、５ ＭＴｒｉｓ −１、５Ｍ Ｎａ
Ｃ１で１分間、３ＸＳＳＣで１分間 １２）露光：露光時間を１９時間とする以外は、上記１
０）と同じ操作 １３）第２回プレハイブリダイズ：７）と同じ操作１４
）第２回ハイブリダイズ： ｐＢ２−フィンサート（工
程３で得られるもの）、４２℃、１６．５時間 １５）洗い＝９）と同じ操作 １６）露光：露光時間を１９．５時間とした以外は、上
記１０）と同じ操作 １７）洗い：１１）と同じ操作 １８）露光：露光時間を２０時間とした以外は、上記１
０）と同じ操作 １９）第３回プレハイブリダイズ：７）と同じ操作２０
）第３回ハイブリダイズ： ｐＲ１８の３′断片（工程
４で得られるもの、 ４．５ Ｘ １０’ｃｐｍ／ｍＱ
）、４２℃、１５時間 ２１）洗い：９）と同じ操作 ２２）露光：１０）と同じ操作 制限酵素地図解析の結果を第４図に示す。 工程１２ （ｐＲＧＥプラスミドＤＮＡの制限酵素解析
） ｐＨＧＥプラスミドＤＮＡのがわりにＰ ＲＧＥプラス
ミドＤＮＡを用いる以外は工程１１と実質的に同じ方法
により工程１ｏで得られるｐＲＧＥプラスミドＤＮＡの
制限酵素解析を行なう。得られるｐＲＧＥ ＤＮＡイン
サートの制限酵素地図を第５図に示す。 工程１３（ウサギＴＮＦ遺伝子とヒトＴＮＦ遺伝子の塩
基配列の決定） 工程９で得られる大腸菌に１２ＪＭ８３（ｐＨＧＥ）株
と工程１ｏで得られる大腸菌に１２ＪＭ８３ （ｐＲＧ
Ｅ）株をｐＢ２−７を有する大腸菌に１２ＭＣ１０６１
株とｐＲ１８を有する大腸菌に１２ＭＣ１０６１株の代
わりに用いる以外は前記工程２と実質的に同じ操作を行
なう。そして、それぞれ１５０μｇ（７）ｐＲＧＥプラ
スミドＤＮＡとｐ ＨＧＥプラスミドＤＮＡを得る。 ＰＲＧＥとｐ ）−（Ｇ Ｅの塩基配列はＭａｘａｍ
−Ｇ１１ｂ−ｅｒｔ法（Ｍａｘａｍ ｅｔ、 ａｌ、、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、ｏｇｙｙ５
５巻４．９０頁（１９８０年） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ）によって決定する。 参考例３で決定したＰＲ−１８の塩基配列と、上で決定
したｐＲＧＥの塩基配列を比較して、ウサギＴＮＦ遺伝
子の構造（エクソンとイントロンを含む）を解明する。 ｐＲＧＥ ＤＮＡインサートの構造は第５図に示す。続
いて、ＰＲＧＥとｐＨＧＥの塩基配列を比較して、類似
性とイントロン・エクソン境界付近の相同配列を調べる
。このようにしてヒトＴＮＦ遺伝子の構造（エクソンと
イントロンを含む）を解明する。ヒトＴＮＦ遺伝子の構
造を第４図に示す。 このようにして得られるウサギＴＮＦとヒトＴＮＦをコ
ードする塩基配列を下に示す。この塩基配列において、
上の行はウサギＴ Ｎ Ｆをコードする塩基配列（Ｒ）
を、下の行はヒトＴＮＦをコードする塩基配列（Ｈ）を
示す。 ＨＧＴＡ ＧＣＣＣＡＴ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＣＡ Ａ
ＡＣＣＣＴ ＣＡＡ ＧＣＴＲＡＴＣＡＴＴ ＧＣＣＣ
ＴＧ るＤＮＡの塩基配列中にこの部分は存在しないことを意
味し、従ってこの記号の両端に隣接する２つのコドンは
直接つながっている。 工程１４（オリゴデオキシヌクレオチドの合成）コハク
酸残基を介して２．０μＭのデオキシヌクレオシドが結
合しているポリスチレン樹脂２０ｍｇを、上下にステン
レススチール製のフィルターのついた５００μρ容量の
反応容器に装填する。 樹脂は１μＭ臭化亜鉛ジクロルメタンーイソプロパツー
ル溶液（８５：１５）で処理してジメトキシトリチル（
ＤＭＴ）保護基を除き、ジクロルメタン−イソプロパツ
ール（８５：１．５）、次いでジメチルフォルムアミド
、ピリジン、更にアセトニトリルで洗浄し、窒素気流で
乾燥する。次いでＤＭＴ−ヌクレオチド（２０μＭ）お
よび、メシチレンスルフォニルニトロトリアゾールμＭ
）の乾燥ピリジン溶液２００μΩを加える。 ４５℃で２０分間反応せしめた後、反応液を除去し、乾
燥ピリジンで樹脂を洗浄後、ピリジン中の無水酢酸で未
反応の残基を保護する。この、脱保護及び縮合のサイク
ルを繰り返して、所望のオリゴデオキシヌクレオチドが
樹脂上に合成される。 次に樹脂をとり出し、オリゴヌクレオチドを樹脂から分
離して、精製を行う。上記のオリゴデオキシヌクレオチ
ドの合成および精製は伊東ら（Ｎｕｃ。 Ａｃ、 Ｒｅｓ、 １０巻、１７５５頁（１９８２））
の方法に従って実施する。このようにして下記の如きオ
リゴデオキシヌクレオチドが得られる。 １ ） ５ ’ −ＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴ
ＣＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡ−３’２ ） ３
’ −ＧＴＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧＧ
ＣＴＣＡＣＴＧＴＴＣＧＧ−５’３ ） ５ ’ −Ｇ
ＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＡＡＡＣＣ
ＣＴＣＡＡＧ −３’４ ） ３ ’ −ＡＣＡＴＣＧ
ＧＧＴＡＣＡＡＣＡＴＣＧＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＣＧＡ
ＣＴ−５’工程１５（ヒトＴＮＦのミニ遺伝子を含むＭ
１３ ｍ ｐ ９− ＨＧ Ｅの調製） プラスミドｐＨＧＥ （１０μｇ）を貼至Ｒ１（２０単
位）で消化し、１％の低融点アガロースゲル電気泳動の
後、２．９ｋｂのフラグメントを切出し溶出する。この
フラグメントはＭ １３ ｍ、 ｐ ９フアージの複製
型の成立ＲＩフラグメン１〜中へ挿入する。 ＥｃｏＲＩフラグメン１−を挿入されたＤＮＡはＢＲＬ
社の手り１書（Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ／ Ｍ １３
ｍ ｐ ７Ｃ１ｏｎｉｎｇ／ ’ Ｄｉｄｅｏｘｙ’
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、 １．９８０ ）に従い、大腸
菌ＪＭ１０３を形質転換する。生成物をＭ１３ｍ ｐ
９− ＨＧ Ｅと命名する。 工程１６ （Ｍ １３ ｍ ｐ ９−ＨＧＥ−重鎖ＤＮ
ＡとプリーターＥ３−４を用いるイントロン３の除去） Ｍ １３ ｍ ｐ ９− ＨＧ Ｅ−重鎖ＤＮＡはＢ
ＲＴ−社の手引書（Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ／ Ｍ １
３ ｍ ｐ ７ Ｃ］、ｏｎｉｎｇ／’ Ｄｉｄｅｏｘ
ｙ’ ５ｅｑｕｅｎｃｉｒ＋４．１９８０ ）に従って
調製される。 工程１４で調製されたオリゴデオキシヌクレオチド４
） ３ ’ −ＡＣＡＴＣＧＧＧＴＡＣＡＡＣＡＴＣＧ
ＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＣＧＡＣＴ−５’がイントロン３
のプリーターとして用いられる。 イントロン３のプリーターは” Ｅ ３−４”と命名す
る。 プリーターＥ３−４は、除去されるべきイントロン３の
前方（即ちエクソン３）、及び後方（即ちエクソン４）
に対し相補的な配列を有している。 イントロン３の除去はＷａｌｌａｃｅらの方法〔５ｃｉ
ｅｎｃｅ２０９巻１３９６頁（１９８０年）〕に従い、
次の如く行う。 Ｅ３−４ （１０４ｎｇ、１５ｐｍｏ１．ｅ）は、Ｔ４
キナーゼ（１０８単位）およびＡＴＰ（３ｍＭ）を用い
てリン酸化され、鎚型Ｍ １３ ｍ ｐ ９− ＨＧ
Ｅ（１、６５μｚ、 ０ 、５ｐｍｏｌｅ）に加えられ
る。反応混合物は６５°Ｃ１６５分間加熱し、５分間室
温に冷却し、更に氷水中で冷却する。各０．４ｍＭのｄ
Ａ、ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、’ｄＴＴＰおよびＡＴ
Ｐ溶液に対し、クレノーフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗｆ
ｒａｇｍｅｎｔ） ５単位、Ｔ４リガーゼ１０単位を含
むＨｉ ｎ緩衝液（Ｗａｌｌａｃｅら、Ｎｕｃ、Ａｃ、
Ｒｅｓ、 ９巻３６４７頁（１９８１年）〕、即ち１０
ｍ Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７，２）、２ｍＭ塩化マ
グネシウム及び１ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む
液、を加える。反応混合物（最終容量５０μ℃）は４℃
で３０分間及び室温で３０分間、インキュベートする。 オリゴヌクレオチドをプライマーとして二重鎖合成され
たＤＮＡはＢＲＬ社の手り１書（ＵｓｅｒＭａｎｕａｌ
／ Ｍ １３ ｍ ｐ ７ Ｃｌｏｎｉｎｇ／ ’ Ｄ
ｉｄｅｏｘｙ ’５ｅｑｕｅｎｃｊ、ｎｇ、 １９８０
）に従って、大腸菌ＪＭ１０３株に感染せしめる。こ
のようにして得られるプラークは、ＹＴプレート（Ｊ、
）１．Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｊ、ｎ
Ｍｏ１ｅｃｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ｆ（ａｒｂｏｒ Ｌａ−ｂｏｒａｔｏｒ
ｙ （１９７２年）４３３頁〕に移す。得られるコロニ
ーは、”Ｐで標識されたＥ３−４と５５℃２時間の条件
でハイブリダイズされる。イントロン除去工程の結果得
られる各種生成物の内から。 所望の配列を有するＤＮＡを得るためのプローブとして
、ここでは、プリーターＥ３−４それ自身を利用する。 かくしてプリーターＥ３−４とハイブリダイズするコロ
ニーを得、更にファージを取得する。 得られるファージをプレートにまき、得られるプラーク
をＹＴプレートに移すにこで再び３″Ｐで放射ラベルし
たＥ３−４と５５℃２時間の条件でハイブリダイズせし
める。強くハイブリダイズするクローンから、ファージ
ＤＮＡを取得し、塩基配列を解析し、イントロン３が完
全に除去されているファージを選別する。このようなフ
ァージの１つをｒｒ）ｐ９ ＨＧＥΔ３−１と命名する
。 工程１７ （ｐ ＨＴ Ｎ Ｆ −Ｑ ａ ｃ Ｕ Ｖ
５−２の構築） ｍ ｐ ９− ＨＧ Ｅ△３−１の複製型をＥｃｏＲＴ
で消化し、電気泳動により単離する。この断片をＥｃｏ
ＲＩで切断したｐＢＲ３２７に挿入し、プラスミドｐ、
ＨＧＥへ３−１を得る。 次にプラスミドＰＨＧＥΔ３−１を用い、１肥ＵＶ５を
プロモーターとしてＴＮＦを大腸菌中で、直接発現させ
ることのできるプラスミドを構築する。この構築方法は
第７図に示される。 まず１０μｇのプラスミドｐ ＨＧ Ｅ△３−１を１０
単位（ｉ）ＡｖａＩとＥｃｏＲＩ （ＢＲＬ社、米国）
で３７℃２時間消化し、４重量％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により目的フラグメントを単離する。約１μ
区の断片が電気泳動溶出によりゲルから回収される。工
程１４と同じように第７図に示される２種のオリゴデオ
キシヌクレオチド即ち５ ’ −ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣ
ＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＡＣＣ−３’及び５’−ＴＣＧＧ
ＧＣｉＴＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＡＴＧ−３’ を
合成する。次いで文献（３） １２２頁の方法に従いこ
の２本のオリゴヌクレオチド（約１００ ｐｍｏｌｅ）
の５′端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン
酸化する。 反応後、フェノールで次いでクロロホルムで抽出する。 かくして得られる合成オリゴマーと、上記で得られるＰ
ＨＧＥ△３−１のハ１■−均逓Ｒ１断片０．５μｇとを
混合し、エタノール沈澱した後、文献（１，）３７頁の
方法に従って１０単位のＴ４リガーゼを用い４℃−夜で
結合せしめる。反応終了後、混合物はエタノール沈澱し
、４重量％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により目的
断片を単離する。 プラスミドＰＯＰ９５−１５はＦ、Ｆｕｌｌｅｒの方法
［Ｇｅｎｅ１９巻、４２−５４頁（１９８２年）〕によ
り調製する。 ｐＯＰ９５−１５の１μｇを駐ユＲＩで消化してフェノ
ール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈澱をして調
製したベクター０．５μｇと、上記の如く得た断片を、
Ｔ、ＤＮＡリガーゼを用いて結合する。実験書（４）、
２０頁に従って、得られるベクターテ大腸菌ＪＭＩＯ１
株（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換して１ｍＭ ＩＰ
ＴＧ及び０．００４％（ｗ／ｖ） ｘ−ｇａｌを含む寒
天培地上に約１００個の白色コロニーを得る。 これらの形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、Ｅ
ｃｏＲＩで消化し、目的のＥｃｏＲＩ断片を有するプラ
スミドを同定する。更にＤＮＡの挿入の方向を調べるた
めにこれらのプラスミドをＰｖｕ Ｕとｂ匹■消化して
１．５重量％アガロースゲル電気泳動を行った結果約１
２８０ｂｐ及び約２６００ｂｐの断片を有し、１ａｃＵ
Ｖ５プロモーターの下流に正しくＴＮＦをコードするＤ
ＮＡが接続されているプラスミドを選別する。 塩基配列を決定すると、２コのプラスミドは同じ塩基配
列を有し、合成オリゴヌクレオチド及び染色体由来のｃ
Ｄ Ｎ Ａが正しく接続されていることが示される。 得られるプラスミドをＰＨＴＮＦ−１ａｃＵＶ５ ２と
命名する。 ｐＨＴＮＦ−１ａｃＵＶ５−２を含有する大腸菌を１通
常の栄養培地で培養する。生成物のＴＮＦ活性を測定す
ると、ｌａｃプロモーターによって制御されるウサギＴ
ＮＦ遺伝子を有するｐＴＮＦ−１ａｃ Ｕ Ｖ ５−１
を含有する大腸菌の生産物とほとんど同様の活性を示す
。 実施例２ 実施例１における工程ｌから１４に従って調製されるプ
ラスミドｐＨＧＥとオリゴヌクレオチド１） −４）を
用いて、 ｐ ＨＴ Ｎ Ｆ −１ａｃＵ Ｖ ５−１
を調製する。その調製方法を第６図に示す。 本発明の一部を構成する新規な微生物および培養細胞は
ヒトＴＮＦを産生ずる能力があるために重要であり新規
であることが理解されよう、従って、以上の記載に従っ
て調製される形質転換微生物および培養細胞に加えて、
本発明は更に、ＴＮＦ産生において強い活性を示すよう
なそれらの変異株や突然変異体をも包含するものである
。 微生物及び新規プラスミドは、該プラスミドを含有する
微生物の試料を寄託することにより、アメリカ合衆国、
メリーランド、ロックビル（Ｒｏｃｋ−ｖｊ、１１ｅ、
Ｍａｒｙｌａｎｄ、 Ｕ、Ｓ、Ａ）のアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｊ、ｃａｎ
ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に
１９８４年４月６日イ寸で寄託されている。微生物大腸
菌に一１２ＪＭ８３（ｐＲＧＥ）株にはＡＴＣＣ寄託番
号第３９６５５号が、大腸菌に一１２ＪＭ８３ （ｐＨ
ＧＥ）株にはＡＴＣＣ寄託番号第３９６５６号が与えら
れている。 以上本発明について述べたように、本発明は様々な方法
で達成することができる。そのような変化は本発明の精
神と範囲からはずれるものと見なすべきではなく、当業
者にとって明らかであるそのような全ての変化は本願の
特許請求の範囲に含まれるものである。
価は、Ｒｕｆｆ等（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ ２巻Ｅ、
Ｐｉｃｋ編集、ＡｃａｄｅＩＩｌｉｃ Ｐｒｅｓｓ
２３５頁（１９８０））あるいは［Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、１２６巻２３５頁（１９８１年）］の方法に準じ、
本発明による生理活性物質がＬ９２９細胞（ＡＴＣＣＣ
ＣＬｌ）を殺す効果を測定するものである。すなわち、
順次培地で希釈した試料０．１ｍΩと、ＪＯ５個／ ｍ
ｆｌの濃度のＬ細胞の培地懸濁液０ 、１ ｍ Ｑを
、９６穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・ラボ
ラトリ−社、米国）に加える。培地はｌｖ／ｖ％の及び
最終濃度５μｇ／ｍＱのアクチノマイシンＤを含むイー
グルのミニマム・エッセンシャル培地（その組成は、た
とえば、「組織培養」中井準之助他編集、朝食書店、１
９６７年に記載されている）を用いる。マイクロプレー
トを５％の炭酸ガスを含む空気中、３７℃で２１時間培
養する。培養終了後、２０％グルタルアルデヒド水溶液
２０μＱを加え、細胞を固定する。固定後、マイクロプ
レートを洗浄、乾燥して、０．０５％メチレンブルー溶
液を０．１ｍ＋２加え、生き残った細胞を染色する。余
分なメチレンブルーを洗い流し乾燥した後。 残ったメチレンブルーを０．３６Ｎ塩酸溶液で抽出し、
その６６５ｎｍにおける吸光度をタイターチック・マル
チスキャン（フロー・ラボラトリ−社、米国）で測定す
る。この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。Ｌ９
２９細胞の５０％を殺すために必要な生理活性量を１単
位／ ｍ Ｑと定義し、試料を加えない対照の吸光度の
５０％の値に相当する試料の希釈率を、グラフあるいは
計算によってめ、その希釈率の逆数を試料の生理活性量
（単位／ｍ１２で表記する）とする。参考例において用
いる１１単位”は、１０５個／ ｍ ＱのＬ９２９細胞
の５０％を殺すウサギＴＮＦの量を意味する。 一方、蛋白質量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄらの方法（Ａｎａ
ｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ７２巻２４８〜２５４頁（１９７６
年）〕により、クーマシー・プリリブント・ブルーＧ２
５０を用いる色素結合法から算出する。 参考例２ 工程１（ウサギ血清ＴＮＦの取得） 雌ウサギ（体重２．５〜３．０ｋｇ）にホルマリンにて
死菌処理したプロピオニバクテリウム・アクネス（な」
伏匹ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ胚μ狙）〔コリネバクテリウ
ム・パーバム（Ｃｏｒ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ■■
叩）、ウェルカム社、英国）５０＋ｎｇを耳静脈より注
射する。 該ウサギに８日後再度１００μｇのエンド１−キシン〔
大腸菌０２６ ： Ｂ６由来のりボポリサッカライド、
ディフコ社製、米国〕を耳静脈より注射し、２時間後に
心臓より全採血する。採取した血液に１００ｍＲ当り１
００単位のヘパリンナトリウムを加えた後、５ ｒ Ｏ
ＯＯｒｐｍで３０分間冷却遠心操作を行ない、血球およ
び不溶固型物を除去する。 ４０羽のウサギより、血清ＴＮＦ３Ｘ１０４単位／ｍＱ
の活性を有する血漿２．４Ｑが得られる。 工程２（血清Ｔ Ｎ’Ｆの部分精製） 工程１で得た血漿２．４Ｑにセライト２４ｇを加え、１
時間攪拌した後濾過する。濾液に１．２Ｑの０．０４．
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７、８）を力■えた後、０
．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．９４Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，８）で充分しこ平衡イヒしたＤＥＡＥセ
ファロースＣＬ−６Ｂ（７７１１７２７社、スウェーデ
ン）のカラムに添加する。０．０４Ｍトリス−塩酸緩衝
液で洗浄後、０．、ｔ８Ｍ塩イしナトリウムを含む０．
０４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ）１７．２）を用いて溶
出する。Ｌ細胞障害活性を示す両分を、限外濾過により
濃縮する。次し１で５ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したセ
ファクリルＳ−２０００（ファルマシア社、スウェーデ
ン）のカラムに該濃縮液を添加し、同緩衝液にてゲル濾
過を行なう。活性画分は限外濾過により濃縮し３．５×
１０′′単位を回収する。比活性は１８ Ｘ １０’単
イ立／ ｒｒ＋ ｇである。 工程３（抗ＴＮＦ抗体） 血清より得たＴＮＦを工程２の如く部分精製しフロイン
トの完全アジュバントを１：１で混合し１２週令の雄Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下しこ注射する。２週後、及
び４週後にこの操作を繰返し、更に１週後に全採血し、
その血清を取得する。 この血清をＬ細胞障害活性を測定する培地中に終濃度５
００倍希釈となるように添加し、ウサギ血清から得たＴ
ＮＦのＬ細胞障害活性を参考例１に示す方法で測定する
と、Ｌ細胞障害活性は認められない。ここに得られるマ
ウス血清は、ウサギ血清ＴＮＦに対する抗体（抗ＴＮＦ
抗体と称する）を含むものと結論できる。 参考例３ 工程１ （ＴＮＦ産生細胞取得） 雌ウサギにホルマリンにて死菌処理したプロピオニバク
テリウム・アクネス（汀丑隈ｊα＋ｃｔｅ■憇ａｃｎｅ
ｓ） （コリネバクテリウム・パーバム（Ｃｏｒｙｎｅ
−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、ウェルカム社
、英国〕を静脈内投与し、７日後に気管切開し、肺を生
理食塩水で洗浄することにより浮遊性細胞を得る。この
細胞を生理食塩水で洗浄後、１０％ウシ胎児血清（フロ
ー・ラボラトリ−社、米国）を含むＲＰＭ１１６４０（
フロー・ラボラトリ−社、米国）を培地とし、炭酸ガス
５％含有空気を雰囲気とする炭酸ガスインキュベーター
にて、３７℃で培養する。 培養器を２コに分け、一方には大腸菌由来のエンドトキ
シン〔大腸菌０２６ ： Ｂ６由来のりボボリサッカラ
イド、ディフコ社、米国〕を１０μｇ／ｍΩとなるよう
に添加し、一方には同量の滅菌水を添加する。エンドト
キシンを添加した培養上清にＬ細胞障害活性が出現し７
時間で最高値に達する。 この活性は抗ＴＮＦ抗体で消去されるが、正常マウス血
清では消去されない。 一方、エンド１−キシンを添加しない細胞培養上清には
Ｌ細胞障害活性は認められない。 工程２（”Ｉ’ＮＦの分子量） 工程１における細胞培養においてエンドトキシンと共に
放射性Ｌ−（”Ｓ）メチオニン（１３００Ｃｉ／ｍｍｏ
Ｑ ｅ、アマージャム社、英国）を１＋ｏＣｉ／ｍＱ
となるように添加して培養を行う。培養上清をＬａｅｍ
ｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｕ、 Ｋ、 （１９
７０年）Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ２２７巻６
８０−６８５頁〕に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により解析する。ゲル濃度は１２．５％とな
るように調製する。泳動後エンハンス（ＥＮＨＡ、ＮＣ
Ｅ■）（二ニー・イングランド・ヌクレアー社、米国）
により処理し、乾燥後、Ｘ線フィルム（フジＲＸ、、富
士写真フィルム）に密着露光せしめる。エンドトキシン
存在下に培養した培養上清に、分子量約１７５００の物
質の生成が認められる。 また工程１における細胞培養の上滑を上記と同様にＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、２．５
％ＮＰ４０■ （カルビオケム社、米国）で１時間、水
中で２時間振どう後、各泳動レーンを切断分離し、泳動
方向に直角に２ｍｍ巾にスライスする。各スライス断片
をＬ細胞と共に培養することにより、Ｌ細胞障害活性を
調べる。エンドトキシン存在下に培養上清を展開したレ
ーンの分子量約１７５００の位置にＬ細胞障害活性が認
められ、その他の位置には細胞障害活性は認められない
。 工程３（ｍＲＮＡの取得） 工程１と同様な細胞培養においてエンドトキシンを添加
後２時間培養したのち、遠心分離にて細胞（ウサギ肺洗
浄細胞）を集める。細胞質ＲＮＡおよびその中からのｍ
ＲＮ Ａの抽出は下記の如くＣｈｉｒｇｗｉｎらの条
件（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、 Ｊ、 Ｍ、 ａｔ ａｌ、。 Ｂｊ、ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８巻５２９４頁（１９
７９年）〕に従って行なう。細胞３ Ｘ １０！１個に
対して４ｍＱの４Ｍグアニジンチオシアネート溶液を加
え、ホモジナイザー（ＡＭ−７、日本精機製作所）にて
破砕する。残金を遠心除去後、２．４ｇの塩化セシウム
を溶解し、あらかじめ２．５ｍＲの５．７Ｍ塩化セシウ
ム、０ 、３． Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７、５）を入
れであるポリアロマ−チューブへ静かに重層する。 ベックマン５Ｗ４１０−ター（ベックマン社、米国）を
用いて２０℃３００００ｒｐｍにて１２時間、超遠心分
離を行った後、上清を除き、ペレットを１．０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（５ｍＭ ｈＤＴＡ。 １ ｗ／ｖ％ＳＤＳを含有する）１ｍＱにて溶解する。 この溶液を１ ｍ Ｑのクロロホルムと１−ブタノール
の混液（容積比４：１）で抽出し、水層に０．０５容積
の２Ｍ酢酸ナトリウムと、２．５容積のエタノールを加
え、−２０℃で２時間以上放置してＲＮＡを沈澱させる
。遠心にて沈澱を集め、乾燥させたのち滅菌水５００μ
Ｑに溶解して、細胞質ＲＮＡ溶液を得る。 上記細胞質ＲＮＡ溶液を６８℃、２分間加熱後急冷し、
５００μａの２倍濃度の１１０１１ＩトリスＥＤＴＡ緩
衝液ｐＨ７，４（１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．１ｗ／ｖ％
ＳＤＳ及び０．５Ｍ塩化リチウムを含む）を加え、２
００■のオリゴ（ｄＴ）−セルロース（ＢＲＬ社、米国
）カラムに展開、Ｊ１１倍濃の上記ノベツファー１０
ｍ Ｑで洗浄、溶出緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ
７，４，１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｗ／ｖ％ｓＤｓを含
む）２ ｍ Ａで溶出する。溶出液に０．０５容積の酢
酸ナトリウム、２．５容積のエタノールを加えて一２０
℃に冷却して沈澱せしめる。沈澱を遠心にて集め、再度
同様にオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着する画分
を集める。紫外吸収スペクトル分析により、８５μｇの
ｒｎ ＲＮ Ａを回収する。 （以下余白） 工程４（ｍＲＮＡのサイズ分画） 工程３と同様にして得られるｍＲＮＡ８８０μｇを２５
０μ悲の水に溶解し、５−２５％直線シヨ糖密度勾配置
０ｍΩに重層する。シ目糖密度勾配は、５および２５％
のショ糖を各々含むトリス緩衝液（２５ｍＭトリス塩酸
ｐ）Ｉ ７ 、２．２鱈ＥＤＴＡ、１ ｗ／ｖ％ＳＤＳ
を含有する）を用い、ｌ５ＣＯ５７０グラジエンター（
イスコ社、米国）により作製する６ベツクマン５Ｗ４１
０−ターを用い、４℃４００００ｒｐｍ、１２時間の超
遠心を行ったのち分画回収装置（ベックマン社、米国）
により各４００μαの分画を回収する。各分画はエタノ
ール沈澱し、遠心機滅菌水に溶解する。 工程５（ｍＲＮＡの翻訳実験） アフリカッメガエル卵母細胞によるｍ ＲＮ Ａの翻訳
は、実験書（例えば寺岡宏、五木幹男、国中兼太部、蛋
白質、核酸、酵素、臨時増刊、遺伝子操作、６０２頁１
９８１年）に依る。アフリカッメガエルは、浜松生物教
材より得る。工程４で得り分画ｍ ＲＮ Ａを１μｇ／
μ塁になるように滅菌水に溶解し、卵母細胞１個あたり
、５０ｎｆｌずつを微量注入し、１ ｍ ｇ ／ ｍ
Ｑのウシ血清アルブミンを含有するＢａｒｔｈ溶液（７
，５ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７，６，８８ｍＭ塩化ナトリ
ウム、 １ｍＭ塩化カリ、０．３３ｍＭ硝酸カルシウム
、０．４１ｍＭ塩化カルシウム、０．８２ｍＭ硫酸マグ
ネシウム、２．４ｍＭ重炭酸ナトリウム、１８０／ｍΩ
ペニシリンＧ、１８μｇ／ ｍ Ｄ、ストレプトマイシ
ンを含有する）中で２４時間培養する。培養液のまま卵
母細胞をガラス棒でつぶし、遠心後、上清のＬ細胞障害
活性を測定する。沈降定数１６Ｓ付近において、Ｌ細胞
障害活性が最高値を与える。またこの活性は参考例２工
程３で得た抗ＴＮＦ抗体により消去されるが正常マウス
血清では消去されない。 工程６（形質転換体の取得） 工程４で得た分画ｍＲＮＡ ５μｇを用い、実験書（１
）９６頁以降に従って二重鎖ＤＮＡを調製する。逆転写
酵素はライフサイエンス社（米国）のものを使用する。 二重鎖ＤＮＡを３．５％ゲル濃度のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にて分画し、長さ約１０００−２０００ｂ
ｐの画分３３０ｎｇを得る。 この両分７ｎｇを用い同上の実験書に従い、ターミナル
デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ＢＲＬ社
、米国）を用いてデオキシＣ鎖をつなぎ、同様にＰｓｔ
Ｉ部位にデオキシＧ鎖をつないだプラスミドｐＢＲ３
２２５６ｎｇとアニールせしめる。 アニール後の混合物を用いて大腸菌に一１２株（ＨＢ
１０１ 、 ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換し、２０
００株の形質転換体を得る。 工程７（ウサギＴＮＦの部分アミノ酸配列）参考例２で
部分精製するＴＮＦを、工程２トこおけると同様にＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する。一
部をクマシー・ブリリアント・ブルー染色し、分子量約
１７０００の位置に対応するバンドをゲルから切出し、
１％重炭酸アンモニウムにより抽出する。５ Ｘ １０
’単位のＴＮＦを使用し、蛋白として約１８０μ＆回収
する。 このうち１５０μｇを１％重炭酸アンモニウム７５μｇ
に溶解、ＴＰＣＫ トリプシン（ワーシントン・バイオ
ケミカル社、米国）３μｇを添加し、３７℃、４時間イ
ンキュベートする。反応液をコスモシル５Ｃ８（牛丼化
学）を担体とする高速液体クロマトグラフィーにより分
画し、トリプシン消化断片を得る。 上記の如く高純度に精製したＴＮＦおよびそのトリプシ
ン消化断片は、次に、セファデックスＧ２５のカラムで
脱塩し、凍結乾燥する。Ｒ，Ｍ。 Ｈｅｗｉｃｋらの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２
５６巻７９９０−７９９７頁、１９８１年）に準じて、
Ｎ末端よりエドマン分解を行なう。各ステップにおいて
遊離してくるフェニルチオヒダントインアミノ酸は、高
速液体クロマトグラフィー、モデル５Ｐ８１００（スペ
クトラフィジックス社、米国）を用い、ゾ′ルバックス
○ＤＳ（デュポン社、米国）をカラムとして、常法によ
り分析する。この結果、ＴＮＦのＮ末端側からのアミノ
酸配列は下記の通りである。 Ｓａｒ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−５
ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉ
ｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ
−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−
トリプシン消化断片のうちの１つは、そのＮ末端より下
記のアミノ酸配列をもつ。 Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇ
ｌｕ Ｐｒｏ Ｍｅｔｌａ 工程８（オリゴＤＮＡプローブの合成）参考例３工程７
で得たＴＮＦのアミノ酸配列から推定されるｍ ＲＮ
Ａの塩基配列に対し、相補的な、オリゴＤＮＡを合成す
る。合成方法は、伊東らが既に発表している改良リン酸
トリエステル法（Ｈ，Ｉｔｏ ａｔ ａｌ、 Ｎｕｃｌ
ｓｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １０巻１７５５〜１７
６９頁、１９８２年）により行う。 アミノ酸配列から推定される１２８種類のオリゴＤＮＡ
を５グループに分け、各々１６．１６゜３２．３２．３
２種類の混合物として合成する。 各々を常法に従って脱保護し、Ｇ−５０（ファルマシア
社、スウェーデン）を用いるカラムクロマトグラフィー
、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動及び、ＤＥ５２（ワットマン社、米国）カラムクロマ
トグラフィーにより精製し、０．１ｍＭトリス−ＥＤＴ
Ａ緩衝液に対し透析する。 各々の精製オリゴＤＮＡを常法によりＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（ベセスダリサーチラボラトリーズ社、米
国）およびγ−３２Ｐ−アデノシントリリン酸を用いて
放射性ラベルし、ＤＥ５２カラム（ワットマン社、米国
）により精製する。各々、約３ Ｘ １０８ｃｐｍ／μ
ｇの放射能が導入される。 各グループの混合物の形で得られたオリゴＤＮＡプロー
ブを第１表に示すように命名する。 第１表にウサギＴＮＦのアミノ酸配列の一部とウサギＴ
ＮＦのアミノ酸配列から推定されるｍＲＮＡ塩基配列、
およびこれに基づく各グループの合成オリゴＤＮＡのプ
ローブの塩基配列を示す。 （以下余白） 参考例３工程３に従って得たＴＮＦ産生細胞のｍ ＲＮ
Ａを１ ｍｏｌｅグリオキザール、５０容量％ジメチ
ルスルホキシド及び１０ ＋＋＋ｍｏｌｅ ＮａＨ２Ｐ
Ｏ，の存在下に５０℃６０分間処理したのち、１．１重
量％アガロースゲル電気泳動により分画する。分画後の
ｍ ＲＮ Ａを、電気泳動式トランスファープロティン
グ装置（バイオラッド社、米国）を用いて、メーカーの
マニュアルに従い、移動せしめる。次いで、この膜上の
ｍ ＲＮ Ａと、５ＸＳＳＣ及び１５０μｇ／ｍΩの変
性サケ精子ＤＮＡを含む５×デンハルト溶液で６５℃、
２時間処理したのち、放射性標識したオリゴＤＮＡをＩ
Ｘ １０７ｃｐｍ／ ｍ Ｑ、５ＸＳＳＣ溶液を含む
５×デンハルト溶液で５０℃、２時間処理する。次いで
この膜を６ＸＳＳＣで室温、４０℃、５０℃、６０℃で
順次洗浄し、Ｘ線フィルムＭＡＲ−５（イーストマン・
コダック社、米国）に対し露光せしめる。この結果、ｌ
！１ＲＮＡと最も強くハイブリダイズするオリゴＤＮＡ
はＭＪであって、ＭＪ混合物中にｍ ＲＮ Ａと完全に
相補的な配列を有するオリゴＤＮＡが含まれていること
が判明する。 工程９（ウサギＴＮＦ遺伝子のクローニング）参考例３
工程６で得られる形質転換体を実験書（２）１６２頁め
方法に従ってセルロースフィルター上に移し、そのＤＮ
Ａと、参考例３工程８で選択される放射性標識オリゴＤ
ＮＡ （ＭＪ）とを参考例３工程８と同様の条件でハイ
ブリダイズせしめる（コロニー・ハイブリダイゼーショ
ン）。強くハイブリダイズする株４９個を選び更にフィ
ルター上に固定して再度コロニーハイブリダイゼーショ
ンを実施し、標識オリゴＤＮＡ （プローブＭ Ｊ ）
により強くハイブリダイズする９個を選ぶにの９個の株
から、実験書（１）の６頁の迅速プラスミド分離法に従
って各々約５μｇのプラスミドを取得する。このプラス
ミドを制限酵素Ｐｓｔ Ｉ 、 Ｔａｇ Ｉ、シ咀Ｔ
、 Ｐｓッ■（いずれもＢ Ｒ，Ｌ社、米国）を用い、
メーカーのマニュアルに従って切断し、１重量％アガロ
ースゲル電気泳動で、各々の酵素による切断片の長さを
比較する。 この結果、９株すべてが、約５０ｂｐのＰｖｕ ＩＩと
Ｒｓａ Ｉによる断片を有し、９株のほとんどがＲｓａ
Ｉによる約２ｏｏｂｐの断片を有し、部分的に共通の
配列を有することが示唆される。第１図に＃限酵素によ
る解析結果を図示する。 また、このうち７株をｌＯμｇ ／ ｍρのテトラサイ
クリンを含む２ ｍ ＡのＬＢ培地中で吸光度が第２表
に示す値になるまで培養し、遠心にて集めた菌体を２ｍ
Ａの生理食塩水中で超音波により破砕し、遠心上清のＬ
細胞障害活性を測定すると、第２表に示す如く、Ｌ細胞
障害活性を示す。対照実験としてプラスミドＰ、ＢＲ３
２２を含有する株を用いて同様の操作を繰返して行なう
。結果を第２表に示す。 （以下余白） 第２表 またこの活性は抗ＴＮＦ抗体により消去され、正常マウ
ス血清では消去されない。従ってこの９株すべてがＴＮ
Ｆ遺伝子を含むプラスミドを有していることが示される
。 工程１０（ウサギＴＮＦ遺伝子の塩基配列の決定）プラ
スミドｐＢ２−７、およびｐＲ１８を含有する大腸菌株
を、１０μｇ ／ ｍ Ｑのテトラサイクリンを含有す
るＭ９培地〔実験書（３）４４０頁〕１Ω中で培養した
後、実験書（３）９０頁の方法に従ってプラスミドを単
離し、各々約１５０μｇを得る。 各々の塩基配列ｒｅ Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌ、ｂｅｒｔ法
（Ｍａｘａｍ ｅｔａｌ、 Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、５５巻４９０頁、１９８０年、Ａｃ
ａｄｅＩｏｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に従って決定する。また
、この塩基配列と参考例３工程７で決定された部分アミ
ノ酸配列の一致により、ウサギＴＮＦ蛋白の全構造が解
明される。 工程１１ プラスミドｐＲ１２の組換体を用いて大腸菌内でｌａｃ
をプロモーターとしてＴＮＦを発現させることを目的に
プラスミドの構築を行なう。第２図に示す様に１０μｇ
のプラスミドｐＲ１２を１０ユニツトのＡｐａＩ（ＢＲ
Ｌ社）で３７℃で２時間消化し、４％のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で約６１、 Ｏｂ ｐ断片を単離する
。約１μｇの断片がゲルから電気泳動溶出する。参考例
３工程８と同様の方法によって第２図に示す２個デオキ
シオリゴヌクレオチド即ち、５’ −ＧＡＴＣＣＡＴＧ
ＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＧＧＧＣＣ−３’ と５ ’ −
ＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＴＧ−３’ とを合成し、
実験書（３） １２２頁に従って約１００ ｐｍｏｌｅ
の各デオキシオリゴヌクレオチドの５′末端をＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化する。 反応終了後、反応混合物をフェノールを用いて抽出し、
さらにクロロフォルムを用いて抽出した後、オリゴマー
を０．５μｇの約６１０塩基対のね翌工断片と合せてエ
タノール沈澱させる。実験書（１）３７頁に従って１０
ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼで前記の断片を４℃で１
−夜反応させ結合する。 反応終了液をエタノール沈澱後、２０ユニツトのＢａｍ
ＨＩで３７℃３時間消化し、４％のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ、約６７０ｂｐの断片を電気泳動溶
出により回収する。市販のプラスミドｐｕｃ−８（Ｐ−
Ｌバイオケミカル社、カタログ番号４９１６、米国）１
μｇをＢａｍＨＩで消化してフェノール抽出、クロロフ
ォルム抽出、エタノール沈澱をして調製したベクター０
．５μｇに約６７０ｂ ｐ、のＴＮＦの構造遺伝子を含
む両端に膿１１１サイトを持った断片をＴ４ＤＮＡ″Ｉ
ノガーゼを用いて結合する。実験書（４）、２０頁に従
って、大腸菌ＪＭ１０１株を形質転換して］、ｍＭＩＰ
ＴＧ及び０．００４％（１１／Ｖ）Ｘ −ｇａ １を含
む寒天培地で培養して約２ｏＯ個の透明プラークを得る
。これらの形質転換体１００個からプラスミドＤＮＡを
調製し、Ｂａｍ）ＩＩで消化したところ、１５個が目的
の約６７０ｂｐのＢａｍＨＩ断片を含んでいる。さらに
、挿入の方向を調べるために、上記１５個のプラスミド
をＰＬＩＣ−８上に１ケ所しか認識部位がないＥｃｏＲ
ＩとＰｖｕ ＩＩ（約６７０ｂｐの断片上にＬ！＆識部
位がある）を用いて消化し、６重量％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を用いて調べることにより、７個のプラ
スミドから目的の約１４０ｂＰの断片が確認され、ｐｕ
ｃ −ｓ上のｌａｃプロモーターから順方向であること
が判明する。 塩基配列の解析により、この７個のプラスミドは同一で
、ｌａｃプロモーター、合成りＮＡ及びｃ Ｄ Ｎ Ａ
間の結合部に所望のヌクレオチド配列を有することが確
認される。 プラスミドＰＲ１７を用いて、大腸菌内で１ａｃＵＶ５
をプロモーターとしてｒＮＦを直接発現させることを目
的にプラスミドの構築を行なう。第３図に示す様に１０
μｇのプラスミドｐＲ１７を１０ユニツトの幻已Ｉ （
Ｂ’ＲＬ社）で３７℃２時間消化し、４％のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で約６３０ｂｐの断片を単離する
。約１μｇの断片がゲルから電気泳動溶出する。工程８
と同様の方法によって第３図の２個のデオキシオリゴヌ
クレオチド即ち、 ５ ’ −ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡ
ＧＣＴＴＣＴＣＧＧＧＣＣ−３’ と５ ’ −ＣＧＡ
ＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＴＧ −３’ とを合成し、実験
書（３） １２２頁に従って約１００ ｐ＋ｅｏｌｅの
上記２種のデオキシオリゴヌクレオチドの５′末端をＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化する。 反応終了液をフェノールを用いて抽出し、さらにクロロ
フォルム抽出した後、先に得たｐＲ１７のｍＩ消化断片
（約６３０ ｂ ｐ） ０．５μｇと合わせてエタノー
ル沈澱する。実験書（１）３７頁に従って１０ユニツト
のＴ、リガーゼで４℃−夜反応させ、結合せしめる。反
応後、反応液をエタノール沈殿し、２０ユニツトのＥｃ
ｏＲＩで３′７℃３時間消化し。 ４％のポリアクリルアミドゲル電気泳動により約６７０
ｂｐの断片を回収する。 プラスミドｐＯＰ９５−１５は、フラーの方法（Ｆ。 Ｆｕｌｌｅｒ、 Ｇｅｎｅ、 １９巻４２頁〜５４頁、
１９８２年）に従って調製する。 ｐＯＰ９５−１５の１μｇをＥｅｏＲＩで消化してフェ
ノール抽出、クロロフォルム抽出、エタノール沈澱をし
てベクターを調製する。ベクター０．５μｇは、上記の
如く合成デオキシオリゴヌクレオチドと、ＴＮＦをコー
ドするＤＮＡを結合して得ら九る約６７０ｂＰの断片に
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合される。実験書（４
）、２０頁に従って、゛大腸菌Ｊ Ｍ １０１ （ＡＴ
ＣＣ３３８７６）を形質転換して１ｍＭＩＰＴＧ及び０
．００４％（ｗ／ｖ）ｘ −ｇ ａ ｌを含む寒天培地
上に約１５０個の白色コロニーを得る。 こわらのコロニー１００個からプラスミドＤＮＡを調製
し、ＥｃｏＲＩで消化したところ１２個が、目的の約６
７０ｂｐのＥｃｏＲＩ断片を有している。 さらに挿入の方向を調べるために上記１２個のプラスミ
ドをハｔｕＴ１とＰｓｔ Ｉを用いて消化し、１．５重
量％アガロースゲル電気泳動を用いて調べると４個のプ
ラスミドから目的の約１２８０ｂｐ及び２６００ｂｐの
断片が確認され、１ａｃＵＶ５プロモーターから順方向
にＴＮＦ遺伝子が接続されていることが判明する。 塩基配列の解析により、この４個のプラスミドは同一で
、１ａｃＵＶ、５プロモーター、合成デオキシオリゴヌ
クレオチド、及びｃＤＮＡが正しく結合されていること
が確認される。得られるプラスミドをｐＴＮＦ−１ａ
ｃＵＶ５−１と命名する。 工程１２（大腸菌が産生ずるＴＮＦの精製）工程１１で
得られたプラスミドを含有する大腸菌株を１００μｇ
／ ｍ Ｑのアンピシリンを含有するＬＢ培地に５０ｍ
Ω中３７℃で１夜培養し、５Ｑの同上の培地に移して更
に３時間培養する。イソプロピルβ−ローチオガラクト
ピラノシド（シグマ社米国）を終濃度１ ｍＭになる様
に添加し更に、６時間培養を続けたのち冷却し、遠心分
離により菌株を集める。工程１１におけると同様に菌体
を０．０４Ｍト’ＪＸ−塩酸緩衝液’（ｐＨ７，８）５
ｆｉ中で超音波破砕し、菌体蛋白溶液を得る。 この溶液は５ Ｘ １０７単位／ｍΩのＬ細胞障害活性
を示す。 この溶液を参考例２工程２と同様に精製し１．２×１０
６単位のＴＮＦを得る。このものの比活性は６．８×１
０７単位／ｍｇである。 工程１３〔メスＡザルコーマ（阿６ｔｈＡ ３ａｒｃｏ
ｍａ）担癌マウスを用いる活性評価〕 ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部及内に２ Ｘ １０’個のメ
スＡザルコーマ（Ｍｅｔｈ Ａ ｓａｒｃｏｍａ）細胞
を移植する。 ７日後、移植した腫瘍の大きさが直径７〜８ｍｍとなり
、出血性壊死などがなく良好な血行状態にあるマウスを
選び、尾静脈より生理食塩水で希釈した０ 、 ５ ｍ
Ｑの参考例３工程１２で得られるＴＮＦ試料を注射し
、２４時間後に次の判定基準により判定を行なう。 （−）：変化なし く＋）：かすかな出血性壊死 （廿）：中程度の出血性壊死（移植筒表面の真中から５
０％以上にわたって壊死） （＋）：顕著な出血性壊死（移植筒の中央部が重度に壊
死し、周囲の癌組織がわ ずかに残った状態） また、試料投与後２０日目に癌が完全に退縮したかどう
かを観察し完治率をめる。 以上の方法により測定し、大腸菌の生産するＴＮＦの活
性を第３表に示す。 実験マウス数 工程１ （プラスミドｐＲ１８、ｐＨ２，−７、ＰＢ２
−２の大腸菌に１２．ＭＣ１０６１株への形質転換）参
考例３で得られる上記３種のプラスミドを常法に従って
大腸菌に１２ＭＧ１０６１株へ形質転換する。詳しくは
大腸菌に’ｌ’２ＭＣ１０６１株のコロニーをＬＢ培地
を用いて、５５０ｎｍの吸光度が０．３になるまで培養
する。該培養物５０ ｍ ｍを集め、２５ｍＱの１０ｍ
Ｍ ＲｂＣＱを含む１０ｍＭＭ０ＰＳ （ＰＨ’７ 、
０ ）溶液で洗浄し１次いで５０ ｍＭＣａＣｌ、、１
０ｍＭ ＲｂＣＱを含む０．１Ｍ ＭＯＰＳ （ｐＨ６
，５）に再び懸濁する。 該懸濁液を３０分間氷冷し、遠心後、上清を除去し、３
０ｐＱのＤＭＳＯおよび５０ ｍＷ ＣａＣ１，と１０
ｍＭＲｂｃＱを含む０．１Ｍ ＭＯＰＳ （ｐＨ６，５
）の混合液中に懸濁させる。該懸濁液を２００μ℃ずつ
分注し、前述のプラスミドＤＮＡ溶液１０μａをそれぞ
れに加える。 該混合液をそれぞれ３０分間氷冷した後、４４℃で６０
秒ヒートショックを与え、ただちに、あらかじめ３７℃
に温めておいた５ ｍ ＱのＬ Ｂ培地を加える。この
溶液を３７℃で１時間培養した後、それぞれの溶液を遠
心し、上清を除去し、細胞ペレットを得る。該細胞ペレ
ットにＬＢ培地を加え、攪拌した後、懸濁液とする。該
懸濁液を３０μｇ／ ｍ Ｑのテトラサイクリンを含む
ＬＢ寒天プレートにまき、３７℃で１夜培養を行なう。 その結果。 プラスミドｐＲ１８、ＰＢ２−７とＰＢ２−２からそれ
ぞれテ１−ラサイクリン耐性形質転換菌のコロニーが得
られる。 工程２（ｐＨ２−７とｐＨ１８プラスミドＤＮＡのｍ１
ｌｌ） 工程１で得られるプラスミドｐＢ２−７とｐＨ１８の形
質転換体を下記の報文の方法に従って培養し。 プラスミドを増幅させる。次いで得られる形質転換体を
集菌し、破砕したのち、プラスミドＤＮＡを精製する。 〔実験書（３）、８８−９６頁〕すなわち、ＬＢ培地に
、それぞれの形質転換体を植菌し、激しく振とうしなが
ら３７℃で培養する。 次いで、この工程をくりかえして形質転換体を増殖させ
、更にプラスミドを増幅させる６次に。 得られる形質転換体の培養液を４℃に冷却しながら、４
０００ｇで１０分間遠心を行ない、上清を除去する。 氷冷５ＴＥ（０，１Ｍ塩化ナトリウム、１０ａＭトリス
ー塩酸緩衝液（ｐＨ７、８）と１ｍＭ ＩＥＤＴＡ ）
の１００ ｍ Ｑを用いて洗浄し、続いて１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、０）の中に２Ｑｍｇ／ｍｆｌ
のリゾチームを含む水溶液を用いて細胞を煮沸溶菌する
。得られる粘性液体を超遠心チューブに移し入れ２５．
０００ｒｐｍ３０分間４℃で遠心を行なってＤＮＡ溶液
を得る。 該ＤＮＡ溶液の容量を測った後、該溶液１ ｍ Ｑ当り
に、固体の塩化セシウム１ｇを加え、塩化セシウムが完
全に溶けるまで、ゆっくりと注意深く攪拌する。該塩化
セシウム水溶液の１０ ｍ Ｑ毎に。 １０ ｍｇ／ ｍ ＋２のエチジウムブロマイド水溶液
０．８ｍＱを加える。この結果、該溶液の最終比重は１
．５５ｇ／ｍｕ、エチジウムブロマイドの最終濃度は約
６００μｇ／ｍＱとなる。 該塩化セシウム水溶液を適当な遠心チューブに移し、空
隙に軽パラフィンオイルを加え、２０℃で３６時間、４
５’、 ００ Ｑｒｐ＋ｉの遠心を続けると上層に鎖状
の微生物由来ＤＮＡとニックの入った環状プラスミドＤ
ＮＡと、下層に閉環状プラスミドＤＮＡがくる。下部の
ＤＮＡのバンドをチューブの横に注射針をさしこんで採
取しガラスチューブに移す、エチジウムブロマイドを除
去し、水層をＴＡＥ緩衝液に透析する。プラスミドＤＮ
Ａ溶液をＲＮａｓｅ処理し、等量の飽和フェノール溶液
で抽出する。水層をあらかじめ０．１％ＳＤＳを含むＴ
ＡＥ緩衝液（ｐＨ８、０）で平衡化したバイオゲル（Ｂ
ｉｏｇｅｌ） Ａ １５０に付す、ＤＮＡを洗い込み、
活性画分を取得する為に０．１％ＳＤＳを含むＴＡＥ緩
衝液で溶出する。分画液をエタノールで沈殿させ、精製
したプラスミドＤＮＡを得る。 上記の方法により、精製ｐＨ２−７プラスミドＤＮＡが
２５０μｇ、ｐ８１８プラスミドＤＮＡが１３４μｇ得
られる。 工程３（精製ｐＢ２−７とＰＲ１８プラスミドＤＮＡの
ニックトランスレーション） 工程２で得られる精製プラスミドＤＮＡ４０μｇを制限
酵素Ｐｓｔ ｒで消化分解し、次いで４％アクリルアミ
ドゲル電気泳動にかける。 電気泳動後、染色を行ない目的とするバンドを切出して
ＰｓｔＩインサートを単離する。５００ｎｇの該す杏エ
インサートを用いて、Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ らの方
法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＬＩＳＡ、、ｚｌ、 １１８４（１９７４）） に従っ
てニックトランスレーションを行なった。ニックトラン
スレーションは市販キット（ＢＲＬ社）を用いる。 ２５μｇの反応系中で放射化したｄＣＴＰを８０μｍｏ
ｌｅ用いる（４００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌｅの場合）。 まず下記混合溶液を調製する。 ２．５ ｐ １２ 溶液Ａ （ｄＮＴＰ溶液）２．５
μｆｌ 溶液Ｂ（５００ｎｇのＤＮＡ、すなわち均佳Ｉ
インサート） ５μΩ 放射性ｄ ＣＴＰ （３２００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌｅ ） １．３μＱ、ｄｃＴＰ （６５μｍｏｌｅ、５０ｐｍｏ
１．ｅ／μｇ ｄＣＴＰ） 上ユニζＬｌ 溶液Ｅ （Ｈ２Ｏ） 計２２．５μ２ この２２．５μΩの溶液に、２．５μＱの溶液Ｃ（ＤＮ
ａｓｅ Ｉ 、ＤＮＡポリメラーゼ■）を加え。 １５℃６０分反応させる。 次いで、溶液Ｄ（停止緩衝液）を加え、停止させる。更
に、キャリアーｔＲＮＡを加えエタノール沈澱を２回行
ない、次いで５００μμの水に溶解する。 比活性は、９ 、３ Ｘ １０’ｃｐｍ／ μｇＤ Ｎ
Ａである。 工程２で得られる精製ｐＲ１８を用いて、同様に上記の
方法に従ってニックトランスレーションを行なう。比活
性は７ Ｘ １０７ｃｐｍ／ μｇＤＮＡである。 工程４（ＰＲ１８プラスミドＤＮＡのＲｓａ ｉ断片取
得） ８０μｇのｐＲ１８プラスミドＤＮＡを制限酵素Ｒｓａ
Ｉで消化し、４％アクリルアミドゲル電気泳動に付す
。下記の目的とするインサートのバンドを切出しＢＮＤ
カラムを用いて精製する。 約６４０ｂｐ ３．７７μｇ （回収率５２％）約１７
５ｂｐ １．７７μｇ （回収率５０％）この約６４０
ｂｐのインサートをＰＨ１０の３′断片（ＰＨ１０の３
′側の翻訳されない部分を意味する）、約１７’５ｂｐ
のインサートをｐＲ１８−ｃｆｒ（ｐＲ１８のコード部
分）と命名する。 更に上記に於いて助狙１の代わりにＰｓｔ ＩとＭｓｔ
ＩＩを用いて消化して、約４５０ｂＰの断片３．６５μ
ｇ（回収率６０％）を得る。このインサートはＰＨ１０
の５′断片と命名する。 工程５（ヒト染色体ＴＮＦ遺伝子の単離）実施例１工程
３で得られる３２Ｐラベル化プラスミドｐＢ２−フィン
サートをハイブリダイズ用プローブとして用い、シャロ
ン ４ＡのＥｃｏＲＩ切断サイト（Ｂｌａｔｔｎｅｒら
の方法５ｃｉｅｎｃｅ １９６ 、 １６１（１９７７
））にヒトＤＮＡを部分消化しサイズ分画した断片（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ １５゜６
８７ （１９７８）） を組込んで作成したバクテリオ
ファージシャロン ４Ａ／ヒト染色体遺伝子ライブラリ
ーの１０Ｇコのプラークをスクリーニングする。その方
法として（Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ。 ５ｃｉｅｎｃｅ、１９６ １８０ （１９７７） ）を
用いる。 出発培養液中のバクテリオファージの総てが、該生理活
性物質を作成する為に必要な遺伝子材料を含んでいると
は限らないので、ウサギＴＮＦの遺伝子に相補的な配列
を持つプローブを用いる。 目的とする遺伝子を含むファージプラークは、放射活性
を有するプローブとハイブリダイズし、その放射能活性
により見つけることができる。このようにして９つのハ
イブリダイズプラークが、該ライブラリーから得られる
。 方法と条件は次の通りである。 １）プラーク数二〜Ｉ Ｘ Ｉ Ｑ’プラーク（〜４×
１０’プラーク／φ１５０ｍ＋ｍプレート×２５）２）
ニトロセルロースフィルターへの転写：［Ｂｅｎｔｏｎ
ａｎｄ Ｄａｖｉｓ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 １９６
、１８０（１９７７）参照］ ３）ハイブリダイズ： １．２５Ｘ１０ｃｐｍ／ｍｕの
実施例１工程３で得たｐＲ２−フィンサートプローブの
添加、４２℃、１９．５時間 ４）洗い：２ＸｓｓＧ−０．１％ｓＤｓを用いて室温で
１０分間洗いを４回、続いて１ｘｓｓｃ−０，１％ＳＤ
Ｓを用いて５０℃で３０分間洗いを２回 ５）露光：ＸＡＲ−５，−８０’Ｃ１２枚の増感紙。 ３９時間 上記スクリーニングで１２の候補株が得られる。 上述と同様の方法で二次スクリーニングを行ない所望の
断片を有する９個の株を得る。これらの株を用いて上述
と同様の方法で三次スクリーニングを行ない所望の断片
を有する９個の株を得る。この９個の株について上述と
同様の方法で４次スクリーニングを行ない、９個の株が
所望の断片を含むことを確認する。所望の断片を含む９
個のバクテリオファージを、それぞれＨＧＩ〜ＨＧ ９
と命名する。 工程６（ウサギ染色体ＴＮＦ遺伝子の単離）消化ヒトＤ
ＮＡの代りに消化ウサギＤＮＡ［ＭａｎｉａＬＬｓ ｅ
ｔ ａｌ、 Ｃｅ１ｌ、上５． ６８７（１９７８））
を用いて調製した１０’個のバクテリオファージシャロ
ン４Ａ／ウサギ染色体遺伝子ライブラリーのプラークを
用いる以外は実施例１工程５と実質的に同様の操作を行
なう。６．７×１０５個のバクテリオファージシャロン
４Ａ／ウサギ染色体遺伝子ライブラリーのプラークを
１０’個のバクテリオファージシャロン ４Ａ／ヒト染
色体遺伝子ライブラリーのプラークの代わりに用いる。 ウサギ染色体遺伝子を含む２つのバクテリオファージ（
ＲＧ−１、ＲＧ−２）が得られる。 工程７（ヒト遺伝子クローンのサザンプロット解析） 実施例１工程５で得られたＨＧ−３、ＨＧ−６、ＨＧ−
７のバクテリオファージを用いて、それぞれＤＮＡを次
の方法に従って得る。 ６ Ｘ １０”個の大腸菌ＬＥ３９２ （宿主）を１８
ｍ ＱのＳＭ中に懸濁し、そこにバクテリオファージ
ＨＧ−３の３Ｘ１０”ＰＦＵを加え、３７℃で２０分間
感染させる。次いで得られる混合液を３ＱのＮＺブロス
に加え、３７℃、２３時間攪拌培養する。次いで６０
ｍ Ａのクロロホルムを該混合液に加えて３０分間攪拌
する。最終濃度ＩＭとなるように混合液中に更に塩化ナ
トリウムを加えた後１５分間放置する６次いで遠心操作
を行なって上滑を得る。次いで得られる上清に分子量約
６０００のポリエチレングリコールをポリエチレングリ
コールの濃度が１０％（ｗ／ｖ）になるように加えて、
４℃、２２時間放置する。次いでバクテリオファージを
遠心操作を行なって採取する。 得られるバクテリオファージをＳＭの２８ｍΩに懸濁し
、次いでクロロホルムを等量加える。ポルテックスミキ
サーで３０秒間混合した後、遠心して水層を集め、その
全量をＳＭで３０ ｍ （ｌにする。 これに２６．４ｇの塩化セシウムを加え、静かに溶解し
た後、超遠心（４５０００ｒｐｍ、２０時間）でファー
ジのバンドを採取する。１０＋ｎＭ塩化ナトリウムと１
０ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（
ｐＨ８，０）に透析した後、それぞれの最終濃度が２０
１１１Ｍ、５０μｇ／ｍ１２．０．５％となルヨうニＥ
Ｄ Ｔ Ａ、プロテイナーゼに、ＳＤＳ。 を加え６５℃で１時間処理する。次にフェノール、フェ
ノール：クロロホルム＝１：１（容積比）、クロロホル
ムで各１回ずつ抽出し、得られる水層を１＋ｎＭＥＤＴ
Ａを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８，０）で透析す
る。この溶液の紫外線吸光度を測定すると、バクテリオ
ファージＨＧ−３の純粋なりＮＡが得られることが確認
される。 バクテリオファージＨＧ−３のＤＮＡを調製するために
用いられる方法と実質的に同じ方法を応用することによ
り、バクテリオファージＨＧ−６とＨＧ−７のＤＮＡを
得る。 このようにしてＨＧ−３、ＨＧ−６、ＨＧ−７１７１Ｄ
ＮＡを各々２９２０１ｔｇ、１ｌ１００ｕ、８１９μｇ
を得る。次いで５ｏｕｔｈａｒｎ法［ＩＥ、 Ｍ、５ｏ
ｕｔｈｅｒｎ。 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、９８．５０３ （１９７５）
）に従って、以下の実験条件でこれらのＤＮＡのサザン
ブロッティングを行なう。 １）ＤＮＡ： ＨＧ−３８２５ｎｇ ＨＧ−６９３５ｎｇ ＨＧ−７６８５ｎｇ ２）各種制限酵素による分解ニ ジ猥Ｈ１１０単位、４巴ＲＩ １０単位、地υＨ１１０
単位十均虚Ｒ１１０単位、肛岨ＩＩＩ １０単位。 肛吋ＩＩＩ １０単位十馳旦ＲＩ １０単位、む凹ｎ
１０単位 ３７℃ ３時間 ３）電気泳動： ０．８％アガロースゲル ＡＥ ２８Ｖ、１５．５時間 ４）ニトロセルロースフィルターへの転写：（Ｅ、 Ｍ
、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、
、 ９８ 。 ５０３ （１９７５）参照） ５）プレハイブリダイズ： ３０ｍＱ ＦｐＳＳ ４２℃ ６時間 ６）ハイブリダイズ： ＰＨ１０の５′−断片（Ｉ Ｘ １０’ｃｐｍ／ ｍ
Ｑ、実施例１工程４にて調製したもの）を含む４２℃、
１４時間 ７）洗い： ２ＸＳＳＣ−０，１％ＳＤＳを用いて室温で１０分間洗
いを４回、続いてｌＸ５ＳＣ−０，１％ＳＤＳを用いて
５０℃で３０分間洗いを２回 ８）露光： ＸＡＲ−５（イーストマン・コダック社、米国）−８０
℃、２枚の増感紙 １４時間ハイブリダイズの結果は、第４表に示す。 （以下余白） 第４男 ←は況と同じＩｖｒバーかハイブリダイズしたことを示
す。 工程８（ウサギ遺伝子クローンのサザンプロット解析） 実施例１工程７において、ＨＧ−３，ＨＧ−６、ＨＧ−
７のかわりにＲＧ−１、ＲＧ−２のバクテリオファージ
のそれぞれを用いる以外は、実質的に同様の操作によっ
てサザンプロット解析を行なう。その結果、ＰＨ１０の
５′断片はＲＧ−１およびＲＧ−２を捏ｉｍＨＩ、影副
訂、韮Ｉ１．Ｈｉ皿■およびＢａｍＨＩ ＋ＥｃｏＲＩ
のそれぞれで分解して得られる断片の、単一バンドにハ
イブリダイズすることがわかる。これは、ｐＲ１８の５
′断片とハイブリダイズする各断片がＴＮＦをコードす
る全塩基配列を含むことを示唆する。 工程９ （ヒト染色体のＴＮＦ遺伝子を含むバクテリア
クローンの構築） 工程５において得られたＨＧ−３のＤＮＡを、Ｌａｎｄ
ｙらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ユ３．ｐ、２
１３４（１９７４））によって得る。このＨＧ−３のＤ
ＮＡ３３μｇをＥｃｏＲＩの８０単位によって３７℃で
３時間分解する。分解物は１％低融点アガロースゲル（
条件：ＩＸＴＡＥ、２０Ｖ、１４．５時間）にて電気泳
動する。２．９ｋｂのバンドをアガロースゲルより、Ｔ
、Ｍａｎｉａｔｉｓ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、ｐ、 ３７７ （１９８２） ］の方
法で単離する。詳しくは、２ 、９ ｋｂのバンド部位
を切り出したゲルを６５℃で１５分間加熱する。 さらに、この２ 、９ ｋｂの長さを持っＥｃｏＲＩ分
解ＨＧ−３断片（以降、これをｒＨＧ −３／ＥｃｏＲ
Ｉ ２．９ｋｂ断片」と略することが多い）を、溶けた
ゲルよりフェノールで３回、エタノールで３回抽出、酢
酸アンモニウムを含むエタノールで沈澱して回収する。 このようにして、６３７μｇ（収率約３０％）のＨＧ−
３／は通ＲＩ ２．９ｋｂ断片を得る。 上記断片２５５ｎｇとＥｃｏＲＩ分解ｐＵｃ１３（Ｊ、
Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ＋ １０１ ＋ｒ＋、２０（１９８３））を
、２．５単位のＴ４リガーゼを用いて結合する。 大腸菌に１２ ＪＭ８３株を上で得られる結合生成物を
用いて形質転換する。詳しくは、大腸菌に１２ ＪＭ８
３株をＬＢ培地中で、培養プロスの５５０ｎｍにおける
吸光度が０．３になるまで培養する。５０ｍｌ１の増殖
した大腸菌に１２ ＪＭ８３株を集め、２５ｍｆｌの１
０ ｍＭ Ｍ、ＯＰ ５（ｐＨ７，０） −１０ｍＭ
ＲｂＣ１で洗い、２５ｍＱの０．１ ’ ＭＯＰＳ （
ｐＨ６，５）−５０ｒｎＭ ＣａＣ１゜１０ ｍ ｂｚ
ＲｂＣ１中に懸濁する。この懸濁液２０３μａに、Ｌ
ｏｎｇの上記結合生成物を含む１０μ０の水溶液を加え
る。この混合物を水中にて３０分間冷却し、４０℃で６
０秒間加熱する。その後すぐに、あらかじめ３７℃にし
ておいたＬＢブロス５ｍＱに、加熱した混合物を加え、
３７℃で１時間培養する。得られる培養ブロスを遠心し
上清を除去する。遠沈した細胞にＬＢ培地を加えて、３
０μｇ／ｍＪ＋のアンピシリンと４０μｇ ／ ｍ Ｑ
のｘ−ｇａｌを含むＬＢプレートに植菌する。インサー
トを含むプラスミドが導入された大腸菌に１２ＪＭ８３
株のコロニーは白色であるが、プラスミドのみが導入さ
れた株のコロニーは青色である。 得られる白色コロニーは再び、３０μｇ／ｍＱのアンピ
シリンと４０μｇ／ｍＱのｘ −ｇａｌ を含むＩ、Ｂ
プレートに確認のため植菌する。 上で得られる白色コロニーより、１０個のコロニー（バ
クチリアルクローン）を選び、ＨｏｌｍｅｓとＱｕｉｇ
ｌｅｙの迅速法（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １
１４ 、 ｐ、１９３（１９８１））を用いてスクリー
ニングする。 詳しくは、それぞれのコロニーを３０μｇ／ｍＱのアン
ピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養する。 増殖した細胞を集め、２ｍｇ／ｍＱリゾチームー５Ｑ
ｍ Ｍグルコース−１０ｍＭ ＥＤＴＡ−２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ ＨＣＱ （ｐＨ８、０）中に懸濁する。この懸
濁液を室温で５分間おき、これに２００μａの０．２Ｎ
ＮａＯＨ１％ＳＤＳを加える。ゆっくり攪拌したのち、
この懸濁液を２分間室温におく。続いて、１５０μΩの
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５、２）を加え、１０分間−
２０℃におき、１５分間遠心してその上清を得る。この
上清に９００ｍＡの冷エタノールを加え、５分間遠心し
てその沈澱を得る。得られる沈澱を７０％エタノールで
洗い乾燥してプラスミドＤＮＡを得る。この方法を用い
て１０個のプラスミドを得る。 それぞれのプラスミドＤＮＡを、１０ ｍ Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−０，１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）に溶かし、
ＥｃｏＲＩで消化し、制限酵素消化のために電気泳動に
供でる。消化と電気泳動の条件は以下の通りである。 消化ニブラスミドＤＮＡ溶液＝上で得られたものの５分
の１量、３単位の狗丑Ｒ１，３７℃、１．５時間電気泳
動：１％アガロースゲル、ＩＸＴＡＥ、１２０Ｖ、２時
間 上記の制限酵素解析によって、１０種のクローンのうち
８種が目的のものであることが示される。 すなわち、この８種のクローンは２ 、９ ｋｂの断片
を持っている。８種の目的のクローンのうち、１つを選
び大腸菌に１２ＪＭ８３ （ｐＨＧＥ）株（ＡＴＣＣ，
３９６５６）と名づける。 続いて、ｐＨ２−７とＰＲＩ ８を有する大腸菌のかわ
りに大腸菌に１２のＪ Ｍ ８３ （ｐ ＨＧ Ｅ ）
株を用いる以外は工程２と同じ操作によって、１．８９
ｍｇのｐＨＧＥ ＤＮＡを得る。 工程１０（ＥｃｏＲＩ分解ＲＧ−１のサブクローニング
） 工程６において得られる３０μｇのＲＧ−１をＥｃｏＲ
Ｉにより消化する。得られる各種断片の混合物より、上
記各種断片の混合物と０．８％の低融点アガロースゲル
を用いる以外は工程９と実質的に同じ操作によって、約
３ 、５ ｋｂの長さを持つ断片を回収し、１．０μｇ
のＢｃｏＲＩ分解ＲＧ−１断片（３，５ｋｂ）を得る。 この断片とＥｃｏＲＩで消化したｐＵｃ１３を、Ｅｃｏ
ＲＩ分解ＨＧ−３断片（２、９ｋｂ）のかわりに上記も
副ＲＩ分解断片（３、５ｋｂ）を用いる以外は工程９と
実質的に同じ操作によって、連結する。 大腸菌に１２ ＪＭ８３株への形質転換、バクテリアク
ローンのスクリーニング、クローンＤＮＡの分解と電気
泳動は、上記結合ＤＮＡ断片を用いる以外は上記工程９
と実質的に同じ操作によって行なう。得られるクローン
は大腸菌に１２ＪＭ８３ （ＰＲＧＥ）株（ＡＴＣＣ３
９６５５）と名づける。 続いて、大腸菌に１２ＪＭ８３（ＰＲＧＥン株をＰＢ２
−７とＰＲ−１８のかわりに用いる以外は工程２と実質
的に同じ操作によって、Ｐ ＲＧＥＤＮＡを１．７Ｑｍ
ｇ調製する。 工程１１（ｐＨＧＥプラスミドＤＮＡの制限酵素解析） 工程９で得られるｐＨＧＥ ＤＮＡの制限酵素解析を、
Ｍａｎｉａｔｉｓの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ。 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、 ９８頁（１９８２））によって行なう。 その方法と条件は以下の通りである。 １）諺１’ｌＩによるｐＨＧＥ ＤＮＡの分解：１８．
６μｇのｐ ＨＧ Ｅ、６４単位の駐旦Ｒ１，３７℃２
時間 ２）エタノール沈！Ｒ＝沈殿物 ３）溶解： ＥｃｏＲＩ分解ｐ、ＨＧＥが’Ｊ−ｆｉｇ
／ｍＱの溶液になるように蒸留水を加える。 ４）各種制限酵素による消化＝１μｇの上記ＥｃｏＲＩ
分解ｐＨＧＥ、制限酵素＝５５単のハ！■、５単位の旦
■■＋１０単位のＲｓａ Ｉ、１０単位の助■Ｉ、４単
位の１四■、３単位ハ１１．９単位のＰｓｔ Ｉ、３７
℃、２時間 ５）電気泳動；２％アガロースゲル、ＩＸＴＡＥ２８Ｖ
、１４．５時間 ６）ニトロセルロースフィルターへの転写：〔Ｅ。 Ｍ、 ５ｏｕｔｈａｒｎ、 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、
９旦、Ｐ、５０３（１９７５）参照〕 ７）第一回プレハイブリダイズ：３０ｍＱＦＤＳＳ、４
２℃、６時間 ８）第一回ハイブリダイズ： ｐＲ１８の５′断片（工
程４で得られるもの、 ５ Ｘ １０’ｃｐｍ／ ｍ
Ｑ ）４２℃、１４時間 ９）洗い： ２ＸＳＳＣ−０，１％ＳＤＳを用いて室温
で１０分間洗いを４回、続いてｌＸ５ＳＣ−０，１％Ｓ
ＤＳを用いて５０℃で３０分間洗いを２回 １０）露光：ＸＡＲ−５（イーストマン・コダック社、
米国）、−８０℃、２枚の増感紙、１７．５時間 １１）洗い： ０．５Ｍ ＮａＯＨ−１，５Ｍ ＮａＣ
１で１分間、０ 、５ ＭＴｒｉｓ −１、５Ｍ Ｎａ
Ｃ１で１分間、３ＸＳＳＣで１分間 １２）露光：露光時間を１９時間とする以外は、上記１
０）と同じ操作 １３）第２回プレハイブリダイズ：７）と同じ操作１４
）第２回ハイブリダイズ： ｐＢ２−フィンサート（工
程３で得られるもの）、４２℃、１６．５時間 １５）洗い＝９）と同じ操作 １６）露光：露光時間を１９．５時間とした以外は、上
記１０）と同じ操作 １７）洗い：１１）と同じ操作 １８）露光：露光時間を２０時間とした以外は、上記１
０）と同じ操作 １９）第３回プレハイブリダイズ：７）と同じ操作２０
）第３回ハイブリダイズ： ｐＲ１８の３′断片（工程
４で得られるもの、 ４．５ Ｘ １０’ｃｐｍ／ｍＱ
）、４２℃、１５時間 ２１）洗い：９）と同じ操作 ２２）露光：１０）と同じ操作 制限酵素地図解析の結果を第４図に示す。 工程１２ （ｐＲＧＥプラスミドＤＮＡの制限酵素解析
） ｐＨＧＥプラスミドＤＮＡのがわりにＰ ＲＧＥプラス
ミドＤＮＡを用いる以外は工程１１と実質的に同じ方法
により工程１ｏで得られるｐＲＧＥプラスミドＤＮＡの
制限酵素解析を行なう。得られるｐＲＧＥ ＤＮＡイン
サートの制限酵素地図を第５図に示す。 工程１３（ウサギＴＮＦ遺伝子とヒトＴＮＦ遺伝子の塩
基配列の決定） 工程９で得られる大腸菌に１２ＪＭ８３（ｐＨＧＥ）株
と工程１ｏで得られる大腸菌に１２ＪＭ８３ （ｐＲＧ
Ｅ）株をｐＢ２−７を有する大腸菌に１２ＭＣ１０６１
株とｐＲ１８を有する大腸菌に１２ＭＣ１０６１株の代
わりに用いる以外は前記工程２と実質的に同じ操作を行
なう。そして、それぞれ１５０μｇ（７）ｐＲＧＥプラ
スミドＤＮＡとｐ ＨＧＥプラスミドＤＮＡを得る。 ＰＲＧＥとｐ ）−（Ｇ Ｅの塩基配列はＭａｘａｍ
−Ｇ１１ｂ−ｅｒｔ法（Ｍａｘａｍ ｅｔ、 ａｌ、、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、ｏｇｙｙ５
５巻４．９０頁（１９８０年） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ）によって決定する。 参考例３で決定したＰＲ−１８の塩基配列と、上で決定
したｐＲＧＥの塩基配列を比較して、ウサギＴＮＦ遺伝
子の構造（エクソンとイントロンを含む）を解明する。 ｐＲＧＥ ＤＮＡインサートの構造は第５図に示す。続
いて、ＰＲＧＥとｐＨＧＥの塩基配列を比較して、類似
性とイントロン・エクソン境界付近の相同配列を調べる
。このようにしてヒトＴＮＦ遺伝子の構造（エクソンと
イントロンを含む）を解明する。ヒトＴＮＦ遺伝子の構
造を第４図に示す。 このようにして得られるウサギＴＮＦとヒトＴＮＦをコ
ードする塩基配列を下に示す。この塩基配列において、
上の行はウサギＴ Ｎ Ｆをコードする塩基配列（Ｒ）
を、下の行はヒトＴＮＦをコードする塩基配列（Ｈ）を
示す。 ＨＧＴＡ ＧＣＣＣＡＴ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＣＡ Ａ
ＡＣＣＣＴ ＣＡＡ ＧＣＴＲＡＴＣＡＴＴ ＧＣＣＣ
ＴＧ るＤＮＡの塩基配列中にこの部分は存在しないことを意
味し、従ってこの記号の両端に隣接する２つのコドンは
直接つながっている。 工程１４（オリゴデオキシヌクレオチドの合成）コハク
酸残基を介して２．０μＭのデオキシヌクレオシドが結
合しているポリスチレン樹脂２０ｍｇを、上下にステン
レススチール製のフィルターのついた５００μρ容量の
反応容器に装填する。 樹脂は１μＭ臭化亜鉛ジクロルメタンーイソプロパツー
ル溶液（８５：１５）で処理してジメトキシトリチル（
ＤＭＴ）保護基を除き、ジクロルメタン−イソプロパツ
ール（８５：１．５）、次いでジメチルフォルムアミド
、ピリジン、更にアセトニトリルで洗浄し、窒素気流で
乾燥する。次いでＤＭＴ−ヌクレオチド（２０μＭ）お
よび、メシチレンスルフォニルニトロトリアゾールμＭ
）の乾燥ピリジン溶液２００μΩを加える。 ４５℃で２０分間反応せしめた後、反応液を除去し、乾
燥ピリジンで樹脂を洗浄後、ピリジン中の無水酢酸で未
反応の残基を保護する。この、脱保護及び縮合のサイク
ルを繰り返して、所望のオリゴデオキシヌクレオチドが
樹脂上に合成される。 次に樹脂をとり出し、オリゴヌクレオチドを樹脂から分
離して、精製を行う。上記のオリゴデオキシヌクレオチ
ドの合成および精製は伊東ら（Ｎｕｃ。 Ａｃ、 Ｒｅｓ、 １０巻、１７５５頁（１９８２））
の方法に従って実施する。このようにして下記の如きオ
リゴデオキシヌクレオチドが得られる。 １ ） ５ ’ −ＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴ
ＣＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡ−３’２ ） ３
’ −ＧＴＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧＧ
ＣＴＣＡＣＴＧＴＴＣＧＧ−５’３ ） ５ ’ −Ｇ
ＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＡＡＡＣＣ
ＣＴＣＡＡＧ −３’４ ） ３ ’ −ＡＣＡＴＣＧ
ＧＧＴＡＣＡＡＣＡＴＣＧＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＣＧＡ
ＣＴ−５’工程１５（ヒトＴＮＦのミニ遺伝子を含むＭ
１３ ｍ ｐ ９− ＨＧ Ｅの調製） プラスミドｐＨＧＥ （１０μｇ）を貼至Ｒ１（２０単
位）で消化し、１％の低融点アガロースゲル電気泳動の
後、２．９ｋｂのフラグメントを切出し溶出する。この
フラグメントはＭ １３ ｍ、 ｐ ９フアージの複製
型の成立ＲＩフラグメン１〜中へ挿入する。 ＥｃｏＲＩフラグメン１−を挿入されたＤＮＡはＢＲＬ
社の手り１書（Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ／ Ｍ １３
ｍ ｐ ７Ｃ１ｏｎｉｎｇ／ ’ Ｄｉｄｅｏｘｙ’
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、 １．９８０ ）に従い、大腸
菌ＪＭ１０３を形質転換する。生成物をＭ１３ｍ ｐ
９− ＨＧ Ｅと命名する。 工程１６ （Ｍ １３ ｍ ｐ ９−ＨＧＥ−重鎖ＤＮ
ＡとプリーターＥ３−４を用いるイントロン３の除去） Ｍ １３ ｍ ｐ ９− ＨＧ Ｅ−重鎖ＤＮＡはＢ
ＲＴ−社の手引書（Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ／ Ｍ １
３ ｍ ｐ ７ Ｃ］、ｏｎｉｎｇ／’ Ｄｉｄｅｏｘ
ｙ’ ５ｅｑｕｅｎｃｉｒ＋４．１９８０ ）に従って
調製される。 工程１４で調製されたオリゴデオキシヌクレオチド４
） ３ ’ −ＡＣＡＴＣＧＧＧＴＡＣＡＡＣＡＴＣＧ
ＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＣＧＡＣＴ−５’がイントロン３
のプリーターとして用いられる。 イントロン３のプリーターは” Ｅ ３−４”と命名す
る。 プリーターＥ３−４は、除去されるべきイントロン３の
前方（即ちエクソン３）、及び後方（即ちエクソン４）
に対し相補的な配列を有している。 イントロン３の除去はＷａｌｌａｃｅらの方法〔５ｃｉ
ｅｎｃｅ２０９巻１３９６頁（１９８０年）〕に従い、
次の如く行う。 Ｅ３−４ （１０４ｎｇ、１５ｐｍｏ１．ｅ）は、Ｔ４
キナーゼ（１０８単位）およびＡＴＰ（３ｍＭ）を用い
てリン酸化され、鎚型Ｍ １３ ｍ ｐ ９− ＨＧ
Ｅ（１、６５μｚ、 ０ 、５ｐｍｏｌｅ）に加えられ
る。反応混合物は６５°Ｃ１６５分間加熱し、５分間室
温に冷却し、更に氷水中で冷却する。各０．４ｍＭのｄ
Ａ、ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、’ｄＴＴＰおよびＡＴ
Ｐ溶液に対し、クレノーフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗｆ
ｒａｇｍｅｎｔ） ５単位、Ｔ４リガーゼ１０単位を含
むＨｉ ｎ緩衝液（Ｗａｌｌａｃｅら、Ｎｕｃ、Ａｃ、
Ｒｅｓ、 ９巻３６４７頁（１９８１年）〕、即ち１０
ｍ Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７，２）、２ｍＭ塩化マ
グネシウム及び１ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む
液、を加える。反応混合物（最終容量５０μ℃）は４℃
で３０分間及び室温で３０分間、インキュベートする。 オリゴヌクレオチドをプライマーとして二重鎖合成され
たＤＮＡはＢＲＬ社の手り１書（ＵｓｅｒＭａｎｕａｌ
／ Ｍ １３ ｍ ｐ ７ Ｃｌｏｎｉｎｇ／ ’ Ｄ
ｉｄｅｏｘｙ ’５ｅｑｕｅｎｃｊ、ｎｇ、 １９８０
）に従って、大腸菌ＪＭ１０３株に感染せしめる。こ
のようにして得られるプラークは、ＹＴプレート（Ｊ、
）１．Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｊ、ｎ
Ｍｏ１ｅｃｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ｆ（ａｒｂｏｒ Ｌａ−ｂｏｒａｔｏｒ
ｙ （１９７２年）４３３頁〕に移す。得られるコロニ
ーは、”Ｐで標識されたＥ３−４と５５℃２時間の条件
でハイブリダイズされる。イントロン除去工程の結果得
られる各種生成物の内から。 所望の配列を有するＤＮＡを得るためのプローブとして
、ここでは、プリーターＥ３−４それ自身を利用する。 かくしてプリーターＥ３−４とハイブリダイズするコロ
ニーを得、更にファージを取得する。 得られるファージをプレートにまき、得られるプラーク
をＹＴプレートに移すにこで再び３″Ｐで放射ラベルし
たＥ３−４と５５℃２時間の条件でハイブリダイズせし
める。強くハイブリダイズするクローンから、ファージ
ＤＮＡを取得し、塩基配列を解析し、イントロン３が完
全に除去されているファージを選別する。このようなフ
ァージの１つをｒｒ）ｐ９ ＨＧＥΔ３−１と命名する
。 工程１７ （ｐ ＨＴ Ｎ Ｆ −Ｑ ａ ｃ Ｕ Ｖ
５−２の構築） ｍ ｐ ９− ＨＧ Ｅ△３−１の複製型をＥｃｏＲＴ
で消化し、電気泳動により単離する。この断片をＥｃｏ
ＲＩで切断したｐＢＲ３２７に挿入し、プラスミドｐ、
ＨＧＥへ３−１を得る。 次にプラスミドＰＨＧＥΔ３−１を用い、１肥ＵＶ５を
プロモーターとしてＴＮＦを大腸菌中で、直接発現させ
ることのできるプラスミドを構築する。この構築方法は
第７図に示される。 まず１０μｇのプラスミドｐ ＨＧ Ｅ△３−１を１０
単位（ｉ）ＡｖａＩとＥｃｏＲＩ （ＢＲＬ社、米国）
で３７℃２時間消化し、４重量％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により目的フラグメントを単離する。約１μ
区の断片が電気泳動溶出によりゲルから回収される。工
程１４と同じように第７図に示される２種のオリゴデオ
キシヌクレオチド即ち５ ’ −ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣ
ＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＡＣＣ−３’及び５’−ＴＣＧＧ
ＧＣｉＴＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＡＴＧ−３’ を
合成する。次いで文献（３） １２２頁の方法に従いこ
の２本のオリゴヌクレオチド（約１００ ｐｍｏｌｅ）
の５′端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン
酸化する。 反応後、フェノールで次いでクロロホルムで抽出する。 かくして得られる合成オリゴマーと、上記で得られるＰ
ＨＧＥ△３−１のハ１■−均逓Ｒ１断片０．５μｇとを
混合し、エタノール沈澱した後、文献（１，）３７頁の
方法に従って１０単位のＴ４リガーゼを用い４℃−夜で
結合せしめる。反応終了後、混合物はエタノール沈澱し
、４重量％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により目的
断片を単離する。 プラスミドＰＯＰ９５−１５はＦ、Ｆｕｌｌｅｒの方法
［Ｇｅｎｅ１９巻、４２−５４頁（１９８２年）〕によ
り調製する。 ｐＯＰ９５−１５の１μｇを駐ユＲＩで消化してフェノ
ール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈澱をして調
製したベクター０．５μｇと、上記の如く得た断片を、
Ｔ、ＤＮＡリガーゼを用いて結合する。実験書（４）、
２０頁に従って、得られるベクターテ大腸菌ＪＭＩＯ１
株（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換して１ｍＭ ＩＰ
ＴＧ及び０．００４％（ｗ／ｖ） ｘ−ｇａｌを含む寒
天培地上に約１００個の白色コロニーを得る。 これらの形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、Ｅ
ｃｏＲＩで消化し、目的のＥｃｏＲＩ断片を有するプラ
スミドを同定する。更にＤＮＡの挿入の方向を調べるた
めにこれらのプラスミドをＰｖｕ Ｕとｂ匹■消化して
１．５重量％アガロースゲル電気泳動を行った結果約１
２８０ｂｐ及び約２６００ｂｐの断片を有し、１ａｃＵ
Ｖ５プロモーターの下流に正しくＴＮＦをコードするＤ
ＮＡが接続されているプラスミドを選別する。 塩基配列を決定すると、２コのプラスミドは同じ塩基配
列を有し、合成オリゴヌクレオチド及び染色体由来のｃ
Ｄ Ｎ Ａが正しく接続されていることが示される。 得られるプラスミドをＰＨＴＮＦ−１ａｃＵＶ５ ２と
命名する。 ｐＨＴＮＦ−１ａｃＵＶ５−２を含有する大腸菌を１通
常の栄養培地で培養する。生成物のＴＮＦ活性を測定す
ると、ｌａｃプロモーターによって制御されるウサギＴ
ＮＦ遺伝子を有するｐＴＮＦ−１ａｃ Ｕ Ｖ ５−１
を含有する大腸菌の生産物とほとんど同様の活性を示す
。 実施例２ 実施例１における工程ｌから１４に従って調製されるプ
ラスミドｐＨＧＥとオリゴヌクレオチド１） −４）を
用いて、 ｐ ＨＴ Ｎ Ｆ −１ａｃＵ Ｖ ５−１
を調製する。その調製方法を第６図に示す。 本発明の一部を構成する新規な微生物および培養細胞は
ヒトＴＮＦを産生ずる能力があるために重要であり新規
であることが理解されよう、従って、以上の記載に従っ
て調製される形質転換微生物および培養細胞に加えて、
本発明は更に、ＴＮＦ産生において強い活性を示すよう
なそれらの変異株や突然変異体をも包含するものである
。 微生物及び新規プラスミドは、該プラスミドを含有する
微生物の試料を寄託することにより、アメリカ合衆国、
メリーランド、ロックビル（Ｒｏｃｋ−ｖｊ、１１ｅ、
Ｍａｒｙｌａｎｄ、 Ｕ、Ｓ、Ａ）のアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｊ、ｃａｎ
ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に
１９８４年４月６日イ寸で寄託されている。微生物大腸
菌に一１２ＪＭ８３（ｐＲＧＥ）株にはＡＴＣＣ寄託番
号第３９６５５号が、大腸菌に一１２ＪＭ８３ （ｐＨ
ＧＥ）株にはＡＴＣＣ寄託番号第３９６５６号が与えら
れている。 以上本発明について述べたように、本発明は様々な方法
で達成することができる。そのような変化は本発明の精
神と範囲からはずれるものと見なすべきではなく、当業
者にとって明らかであるそのような全ての変化は本願の
特許請求の範囲に含まれるものである。
第１図は従来のウサギ生理活性ポリペプチドをコードす
るＤＮＡを各々含有するプラスミドの制限酵素地図であ
る。第２図は従来のウサギ生理活性ポリペプチドをコー
ドする組換ＤＮＡ（ＰＴＮＦ−１ａｃ−１）の調製方法
を示すフローシートである。 第３図は従来のウサギ生理活性ポリペプチドをコードす
るもう一つの組換Ｄ Ｎ Ａ （ｐＴ Ｎ Ｆ−１ａｃ
ＵＶ５−１）の調製方法を示すフローシートである。第
４図は本発明のヒト生理活性ポリペプチドの遺伝子を含
有するプラスミドの一部分の制限酵素地図である。第５
図は従来のウサギ生理活性ポリペプチドの遺伝子を含有
するプラスミドの一部分の制限酵素地図である。第６図
は本発明のヒト生理活性ポリペプチドをコードする組換
ＤＮＡ（ｐＨＴＮＦ−１ａｃＵＶ５−１）の調製方法を
示すフローシートである。第７図は本発明のヒト生理活
ポリペプチドをコードするもう一つの組換ＤＮＡ （ｐ
ＨＴＮＦ−１ａｃＵＶ５−２）の調製方法を示すフロー
シートである。 特許出願人 旭化成工業株式会社 手続補正書（自発） 昭和６０年７月２１日 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第０７１２８３号 ２、発明の名称 新規なヒト生理活性ポリペプチド ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 〒５３０ 大阪府大阪市北区堂島浜１丁目２番６号優先権証明書（
訳文）及び正式図面 ５、補正の内容 別紙の通り
るＤＮＡを各々含有するプラスミドの制限酵素地図であ
る。第２図は従来のウサギ生理活性ポリペプチドをコー
ドする組換ＤＮＡ（ＰＴＮＦ−１ａｃ−１）の調製方法
を示すフローシートである。 第３図は従来のウサギ生理活性ポリペプチドをコードす
るもう一つの組換Ｄ Ｎ Ａ （ｐＴ Ｎ Ｆ−１ａｃ
ＵＶ５−１）の調製方法を示すフローシートである。第
４図は本発明のヒト生理活性ポリペプチドの遺伝子を含
有するプラスミドの一部分の制限酵素地図である。第５
図は従来のウサギ生理活性ポリペプチドの遺伝子を含有
するプラスミドの一部分の制限酵素地図である。第６図
は本発明のヒト生理活性ポリペプチドをコードする組換
ＤＮＡ（ｐＨＴＮＦ−１ａｃＵＶ５−１）の調製方法を
示すフローシートである。第７図は本発明のヒト生理活
ポリペプチドをコードするもう一つの組換ＤＮＡ （ｐ
ＨＴＮＦ−１ａｃＵＶ５−２）の調製方法を示すフロー
シートである。 特許出願人 旭化成工業株式会社 手続補正書（自発） 昭和６０年７月２１日 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第０７１２８３号 ２、発明の名称 新規なヒト生理活性ポリペプチド ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 〒５３０ 大阪府大阪市北区堂島浜１丁目２番６号優先権証明書（
訳文）及び正式図面 ５、補正の内容 別紙の通り
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） 次式（Ｉ） Ｓａｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓ
ｅｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ ＶａｌＡｌａ Ｈｉｓ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ
Ａｌａ Ｇｌｕ ＧｌｙＧｉｎ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｔｒ
ｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ
ＡｌａＬｅｕ Ｌｓｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖ
ａＬ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ ＡｓｎＧｌｎ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕｌｌｅ Ｔｙｒ Ｓｅ
ｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｇｉｎ ＧｌｙＣｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｈ
ｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｈ
ｒｌｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｉｎ Ｔｈｒ ＬｙｓＶａｌ Ａｓ
ｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ｓａｒ Ｐｒｏ ＣｙｓＧｉｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔ
ｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌ
ａ ＬｙｓＰｒｏ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ＶａｌＰｈ
ｅ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇ１．ｙ Ａｓ
ｐ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ＡｌａＧｌｕ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａ
ｓｐ Ｐｈｅ ＡｌａＧｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ
Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ ＩＩｓ
ＡｌａＬｅｕ （式中、 Ｇｉｎはグルタミン残基、Ａｓｐはアスパラ
ギン酸残基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｔｙｒはチロシン
残基、Ｖａｌはバリン残基、Ｌｙｓはリジン残基、Ｇｌ
ｕはグルタミン酸残基、Ａｌａはアラニン残基、Ａｓｎ
はアスパラギン残基、Ｌｅｕはロイシン残基、 Ｐｈ
ｅはフェニルアラニン残基、Ｇｌｙはグリシン残基、
Ｈｉｓはヒスチジン残基、Ｓｅｒはセリン残基、 Ｔｈ
ｒはスレオニン残基、 Ｉｌｅはイソロイシン残基、Ｔ
ｒｐはトリプトファン残基、Ａｒｇはアルギニン残基、
Ｍｅｔ はメチオニン残基及びＣｙｓはシスティン残
基を表わす）で表されるアミノ酸配列を含有するヒト生
理活性ポリペプチド。 （２） 次式（１） ％式％ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｈｊｓ Ｖａｌ Ｌ
ｃｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ ）Ｉｉｓ Ｔｈｒｌｌｅ Ｓｅ
ｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｎ、Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ｇｉｎ Ｔｈｒ １．、ｙｓＶａｌ Ａｓｎ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ ＣｙｓＧ、ｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａ］、ａ Ｌ
ｙｇＰｒｏ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇ］、ｙ ＶａｌＰｈｅ
Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａ
ｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａ、ＬａＧｌｕ Ｉｌｅ Ａｓ
ｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｐｈｅ ＡｌａＧｌｕ Ｓｅｒ Ｇｕｙ Ｇｉｎ Ｖ
ａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔ］、ｅ Ａ
ｌａｅｕ （式中、Ｇｉｎ はグルタミン残基、Ａｓｐはアスパラ
ギン酸残基、 Ｐｒｏはプロリン残基、Ｔｙｒはチロシ
ン残基、Ｖａｌはバリン残基、１．、ｙ ｓはりジン残
基、Ｇｌｕはグルタミン酸残基、Ａｌａはアラニン残基
、Ａｓｎ はアスパラギン残基、Ｌｃｕはロイシン残基
、Ｐｈｅ はフェニルアラニン残基、Ｇ ］、ｙはグリ
シン残基、 Ｈｉｓ はヒスチジン残基、Ｓｅｒはセリ
ン残基、Ｔｈｒはスレオニン残基、１１．ｅはイソロイ
シン残基、Ｔｒｐはトリジ１−ファン残基、Ａｒｇはア
ルギニン残基、Ｍｅｔ はメチオニン残基及びＣｙｓは
システィン残基を表わす）で表されるアミノ酸配列を含
有するヒト生理活性ポリペプチドをコードする塩基配列
を含有するデオキシリボ核酸、 （３）次式（ＩＩ）で表される塩基配列ＴＣＡ ＴＣＴ
ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＣＣＣＣＧ ＡＧＴ ＧＡＣＡＡ
Ｇ ＣＣＴ ＧＴＡＧＣＣＣＡＴ ＧＴＴ ＧＴＡ Ｇ
ＣＡ ＡＡＣＣＣＴ ＣＡＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＧＧ
ＣＡＧ ＣＴＣＣＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ ＡＡＣＣＧＣ
ＣＧＧ Ｇ（’：ＣＡＡＴ ＧＣＣＣＴＣＣＴＧ ＧＣ
ＣＡＡＴ ＧＧＣＧＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＧＡ Ｇ
ＡＴ ＡＡＣＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＣＣＡ
ＴＣＡ ＧＡＧ ＧＧＣＣＴＧ ＴＡＣＣＴＣＡＴＣ
ＴＡＣＴＣＣＣＡＧ ＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧ ＧＧ
ＣＣＡＡ ＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＴ Ｇ
ＴＧ ＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣ、ＡＣＣＡＴＣＡＧＣ
ＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧ ＡＣＣ
ＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ ＧＣＣＡＴＣ
ＡＡＧ ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧ ＡＧＧ ＧＡＧ
Ａｃｅ ＣＣＡ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＡＧ Ｇ
ＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧ ＴＡＴ ＧＡＧ ＣＣＣＡＴ
ＣＴＡＴ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＴＣＴＴＣＣＡ
Ｇ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＴ ＧＡＣＣＧＡ
ＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＧ ＡＴＣＡＡＴ ＣＧＧ Ｃ
ＣＣＧＡＣ，ＴＡＴ ＣＴＣＧＡＧ 丁ＴＴ ＧＣＣＧ
ＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ
ＧＧＧ ＡＴＣＡＴＴ ＧＣＣＣＴＣ （式中、Ａはデオキシアデニル酸残基、Ｇはデオキシグ
アニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸残基及びＴはチ
ミジル酸残基を表わし、式（ＩＩ）の左端および右端は
イれぞオシ５′−水酸基側および３゛−水酸基側を表わ
す） および該塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選
ば九る少なくとも１つの塩基配列な含有するデオキシリ
ボ核酸。 （４） 遺伝子のコードの縮重に基き、特許請求の範囲
第（３）項に記載のデオキシリボ核酸の少なくとも１つ
の塩基配列の少なくとも］つの塩基を置換して得られる
塩基配列を含有するデオキシリボ核酸。 （５） 特許請求の範囲第（２）項に記載のデオキシリ
ボ核酸と複製可能な発現ベクターとを含有する複製可能
な組換ＤＮＡ。 （６） 特許請求の範囲第（５）項に記載の複製可能な
組換Ｄ Ｎ Ａで形質転換された微生物または細胞。 （７）（ａ） 特許請求の範囲第（２）項に記載のデオ
キシリボ核酸を複製可能な発現ベクターに連結して該デ
オキシリボ核酸と該複製可能な発現ベクターとを含有す
る複製可能な組換ＤＮＡを得、（ｂ） 該複製可能な組
換ＤＮＡで微生物または細胞を形質転換させて、形質転
換体を形成せしめ、 （ｃ） 該形質転換体を該微生物または細胞の親細胞か
ら選別し、 （ｄ） 該形質転換体を培養して、該形質転換体に該デ
オキシリボ核酸を発現させてヒト生理活性ポリペプチド
を産生せしめ、そして （ｅ） 該ヒト生理活性ポリペプチドを培養した形質転
換体から単離する ことを含む特許請求の範囲第（１）項記載のヒト生理活
性ポリペプチドの製造方法。 （８） 特許請求の範囲第（１）項に記載のアミノ酸配
列を有する実質的に純粋なヒト生理活性ポリペプチド。 （９） ヒＩ−Ｔ Ｎ Ｆ活性を有する実質的に純粋な
ヒト生理活性ポリペプチド （］０） ヒトＴ Ｎ Ｆ活性を有するポリペプチドを
コードする塩基配列を含有する実質的に純粋なデオキシ
リボ核酸。 （１１） 特許請求の範囲第（３）項に記載の塩基配列
を含有する実質的かＪ純粋なデオキシリボ核酸。 （１２） ヒトＴＮＦ活性を有するポリペプチドをコー
ドする塩基配列を含有するプラスミド又はバクテリオフ
ァージトランスファーベクター。 （１３） 特許請求の範囲第（１）項に記載のポリペプ
チドをコードする塩基配列を金石するプラスミド又はバ
クテリオファージトランスファーベクター。 （１４）特許請求の範囲第（１２）項に記載のトランス
ファーベクターで形質転換された微生物又は細胞及びそ
れらの突然変異体又は変異細胞。 （１５）特許請求の範囲第（１３）項に記載のトランス
ファーベクターで形質転換された微生物又は細胞及びそ
れらの突然変異体又は変異細胞。 （１６） 大腸両片？とり一１Ｋ−１２株 Ｊ Ｍ ８
３ （ｐＨＧＥミ）（１７）太腸菌隘すエ↓に一１２株
Ｊ Ｍ ８３ （ｐＨＧＥ）（１８） プラスミド ｐ
ＲＧＥ （１９）プラスミド ｐＨＧＥ （２０） 抗腫瘍又は抗つ・イルス作用に有効な量の特
許請求の範囲第（９）項に記載のポリペプチドと少なく
とも１種の薬剤としυ投−ｑ・可能な担体、希釈剤また
は賦形剤を含有する医薬組成物。 （２１） 抗腫瘍又は抗ウィルス作用に有効な量の特許
請求の範囲第（１）項に記載のポリペプチドと少なくと
も１種の薬剤とし・て投与可能な担体、希釈液または賦
形剤を含有する医薬組成物。 （２２）抗腫瘍に有効な量の特許請求の範囲第（９）項
に記載のポリペプチドを腫瘍患者に投与することによる
腫瘍の治療方法。 （以下余白）
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/597,372 US4879226A (en) | 1984-04-06 | 1984-04-06 | Novel human physiologically active polypeptide |
| US597372 | 1984-04-06 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1164061A Division JPH0272122A (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | ヒトｔｎｆを有効成分として含有する医薬組成物 |
| JP16406089A Division JPH0242986A (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | 新規なヒト生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60252496A true JPS60252496A (ja) | 1985-12-13 |
| JPH025760B2 JPH025760B2 (ja) | 1990-02-05 |
Family
ID=24391235
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60071283A Granted JPS60252496A (ja) | 1984-04-06 | 1985-04-05 | 新規なヒト生理活性ポリペプチド |
Country Status (39)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4879226A (ja) |
| EP (2) | EP0354592A1 (ja) |
| JP (1) | JPS60252496A (ja) |
| KR (1) | KR920007399B1 (ja) |
| AR (1) | AR240475A1 (ja) |
| AU (2) | AU595480B2 (ja) |
| BE (1) | BE902119A (ja) |
| BG (1) | BG43355A3 (ja) |
| BR (1) | BR8501624A (ja) |
| CA (1) | CA1341348C (ja) |
| CH (2) | CH672790A5 (ja) |
| DD (1) | DD251785A5 (ja) |
| DK (1) | DK151985A (ja) |
| EG (1) | EG17965A (ja) |
| ES (1) | ES8704976A1 (ja) |
| FI (1) | FI86992C (ja) |
| FR (1) | FR2564097B1 (ja) |
| GB (1) | GB2158829B (ja) |
| GR (1) | GR850836B (ja) |
| HK (1) | HK102192A (ja) |
| HU (1) | HUT37813A (ja) |
| IE (1) | IE58833B1 (ja) |
| IL (1) | IL74804A (ja) |
| IN (1) | IN163653B (ja) |
| IT (1) | IT1218469B (ja) |
| JO (1) | JO1365B1 (ja) |
| LU (1) | LU85835A1 (ja) |
| MA (1) | MA20402A1 (ja) |
| MT (1) | MTP963B (ja) |
| MY (1) | MY101887A (ja) |
| NO (1) | NO174473C (ja) |
| NZ (2) | NZ231317A (ja) |
| OA (1) | OA07983A (ja) |
| PL (1) | PL156392B1 (ja) |
| PT (1) | PT80239B (ja) |
| RO (1) | RO93650B (ja) |
| SG (1) | SG77892G (ja) |
| YU (1) | YU57885A (ja) |
| ZA (1) | ZA852563B (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60228297A (ja) * | 1984-04-24 | 1985-11-13 | 株式会社 東京タツノ | 給油装置 |
| JPS6140221A (ja) * | 1984-07-05 | 1986-02-26 | ジエネンテク，インコ−ポレイテツド | 腫瘍壊死因子 |
| JPS6150923A (ja) * | 1984-08-17 | 1986-03-13 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
| JPS62500631A (ja) * | 1984-10-15 | 1987-03-19 | カイロン コーポレイション | ヒト腫瘍壊死因子 |
| US7056695B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-06-06 | Xencor | TNF-α variants |
| US7101974B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-09-05 | Xencor | TNF-αvariants |
| US7244823B2 (en) | 2000-03-02 | 2007-07-17 | Xencor | TNF-alpha variants proteins for the treatment of TNF-alpha related disorders |
| US7446174B2 (en) | 2001-03-02 | 2008-11-04 | Xencor, Inc. | Protein based TNF-α variants for the treatment of TNF-α related disorders |
| US7662367B2 (en) | 2000-03-02 | 2010-02-16 | Xencor, Inc. | Pharmaceutical compositions for the treatment of TNF-α related disorders |
| US7687461B2 (en) | 2000-03-02 | 2010-03-30 | Xencor, Inc. | Treatment of TNF-α related disorders with TNF-α variant proteins |
Families Citing this family (62)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0695939B2 (ja) * | 1983-12-02 | 1994-11-30 | 大日本製薬株式会社 | ウサギ癌壊死因子をコ−ドするクロ−ン化ｄνａ |
| DE3582183D1 (de) * | 1984-03-06 | 1991-04-25 | Dainippon Pharmaceutical Co | Dns den menschlichen tumornekrosisfaktor kodierend und das menschliche tumornekronisfaktor-polypeptid. |
| US5288852A (en) * | 1984-03-06 | 1994-02-22 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Human tumor necrosis factor polypeptides |
| US4965199A (en) * | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
| US6686455B1 (en) * | 1984-07-05 | 2004-02-03 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor |
| US5672347A (en) * | 1984-07-05 | 1997-09-30 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor antagonists and their use |
| AU589919B2 (en) * | 1984-10-15 | 1989-10-26 | Cetus Corp | Human tumor necrosis factor |
| US4959314A (en) | 1984-11-09 | 1990-09-25 | Cetus Corporation | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
| JPS61124392A (ja) * | 1984-11-22 | 1986-06-12 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の精製法 |
| IL73883A (en) * | 1984-12-20 | 1990-12-23 | Yeda Res & Dev | Monoclonal antibodies against tnf-alpha,hybridomas producing them and method for the purification of tnf-alpha |
| EP0368367A1 (en) * | 1984-12-21 | 1990-05-16 | Biogen, Inc. | Purification, production and use of tumor necrosis factors |
| JPS6248634A (ja) * | 1985-07-23 | 1987-03-03 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 新規アミノ酸組成物、その製造方法及び該アミノ酸組成物を含有する医療組成物 |
| US5059530A (en) * | 1985-09-30 | 1991-10-22 | Suntory Ltd. | Expression vector for human TNF |
| JPH0698004B2 (ja) * | 1985-09-30 | 1994-12-07 | サントリー株式会社 | Ｔｎｆ発現用新規プラスミド |
| US4677197A (en) * | 1985-10-30 | 1987-06-30 | Cetus Corporation | Purification method for tumor necrosis factor |
| US4894439A (en) * | 1986-05-22 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | N-terminal derivatives of tumor necrosis factor purified by microporous PTFE membranes |
| US4828830A (en) * | 1986-01-24 | 1989-05-09 | Genentech, Inc. | Method and composition for prophylaxis and treatment of viral infections |
| US5425940A (en) * | 1986-04-09 | 1995-06-20 | Cetus Oncology Corporation | Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor |
| CA1310924C (en) * | 1986-04-24 | 1992-12-01 | Francis P. Mccormick | Infective drug delivery system |
| PT84869B (pt) * | 1986-07-31 | 1990-11-07 | Genentech Inc | Metodo para a profilaxia e tratamento de infeccoes por retrovirus e processo para a preparacao de composicoes para esse fim, contendo factor de necrose tumoral |
| DE3716513A1 (de) * | 1987-05-16 | 1988-11-24 | Basf Ag | Proteine mit tnf-wirkung |
| GB2217325B (en) * | 1988-04-08 | 1991-11-20 | British Bio Technology | Synthetic gene for tumour necrosis factor alpha. |
| US5071834A (en) * | 1988-09-16 | 1991-12-10 | Genentech, Inc. | Purified activin B composition |
| CA2003981C (en) * | 1988-12-27 | 2000-06-13 | Hiroshi Ishimaru | Pharmaceutical compositions and use thereof in the treatment of psoriasis |
| US5342613A (en) * | 1988-12-27 | 1994-08-30 | Health Research Inc. | Pharmaceutical compositions and use thereof in the treatment of psoriasis |
| ATE148171T1 (de) * | 1989-02-21 | 1997-02-15 | Univ Washington | Modifizierte formen von fortpflanzungshormonen |
| US5998378A (en) * | 1989-08-16 | 1999-12-07 | Chiron Corporation | Compositions for the inhibition of TNF hormone formation and uses thereof |
| US6586222B1 (en) | 1989-08-16 | 2003-07-01 | Chiron Corporation | Recombinant PR-3 and compositions thereof |
| US5843693A (en) * | 1989-08-16 | 1998-12-01 | Chiron Corporation | Assay method for screening for inhibitors of proTNF conversion |
| DE69029970T2 (de) | 1989-08-16 | 1997-06-19 | Chiron Corp | Zusammensetzungen zur hemmung der bildung von proteinhormon und deren verwendungen |
| ATE199398T1 (de) * | 1989-10-24 | 2001-03-15 | Chiron Corp | Sekretion vom mit gamma-interferon signalpeptid gebundenen humänen protein |
| US5653974A (en) * | 1990-10-18 | 1997-08-05 | Board Of Regents,The University Of Texas System | Preparation and characterization of liposomal formulations of tumor necrosis factor |
| US5420019A (en) * | 1993-02-02 | 1995-05-30 | Xoma Corporation | Stable bactericidal/permeability-increasing protein muteins |
| KR970005042B1 (ko) * | 1993-02-09 | 1997-04-11 | 한일합성섬유공업 주식회사 | 종양괴사인자-알파 뮤테인 |
| DE69420137T2 (de) | 1993-06-03 | 1999-12-23 | Therapeutic Antibodies Inc | Herstellung von antikörperfragmenten |
| US6551623B1 (en) | 1993-09-09 | 2003-04-22 | Lorus Therapeutics Inc. | Immunomodulating compositions from bile |
| JPH10504441A (ja) | 1994-03-07 | 1998-05-06 | カイロン コーポレイション | Ｔｎｆ形成阻害のための組成物およびその使用 |
| CA2215339C (en) | 1995-03-16 | 1999-01-19 | Imutec Pharma Inc. | Immunomodulating compositions from bile for the treatment of immune system disorders |
| US6001812A (en) * | 1995-04-28 | 1999-12-14 | Societe L'oreal S.A. | Modulating body/cranial hair growth with derivatives of the α-type melanocyte-stimulating hormone |
| FR2733421B1 (fr) * | 1995-04-28 | 1997-06-06 | Oreal | Utilisation de derives de l'hormone stimulatrice des melanocytes de type alpha pour stimuler ou induire la pousse des cheveux et/ou stopper leur chute |
| US6617171B2 (en) * | 1998-02-27 | 2003-09-09 | The General Hospital Corporation | Methods for diagnosing and treating autoimmune disease |
| US6599710B1 (en) | 1999-03-10 | 2003-07-29 | The General Hospital Corporation | Treatment of autoimmune disease |
| US20070172449A1 (en) * | 2000-03-02 | 2007-07-26 | Xencor, Inc. | TNF-alpha VARIANT FORMULATIONS FOR THE TREATMENT OF TNF-alpha RELATED DISORDERS |
| US6579522B1 (en) * | 2000-06-27 | 2003-06-17 | Genvec, Inc. | Replication deficient adenoviral TNF vector |
| EP1399140A1 (en) * | 2001-06-20 | 2004-03-24 | Lorus Therapeutics Inc. | Biological response modifier composition and uses thereof |
| US20030086903A1 (en) * | 2001-11-02 | 2003-05-08 | Genvec, Inc. | Therapeutic regimen for treating cancer |
| US7582313B2 (en) | 2002-06-27 | 2009-09-01 | The General Hospital Corporation | Methods of organ regeneration using Hox 11-expressing pluripotent cells |
| US7628988B2 (en) * | 2002-06-27 | 2009-12-08 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for treating type 1 diabetes |
| AU2003290948A1 (en) * | 2002-11-15 | 2004-06-15 | The General Hospital Corporation | Screening methods to identify treatments for autoimmune disease |
| CN100434440C (zh) | 2002-12-02 | 2008-11-19 | 阿布格尼克斯公司 | 针对肿瘤坏死因子的抗体及其用途 |
| US7101978B2 (en) * | 2003-01-08 | 2006-09-05 | Applied Molecular Evolution | TNF-α binding molecules |
| CA2545815A1 (en) * | 2003-11-14 | 2005-06-09 | Genvec, Inc. | Adenoviral vectored tnf-a and chemoradiation to treat cancer |
| US7435799B2 (en) * | 2004-01-08 | 2008-10-14 | Applied Molecular Evolution | TNF-α binding molecules |
| US20080102054A1 (en) * | 2005-01-18 | 2008-05-01 | Faustman Denise L | Compositions Containing Agm Cells And Methods Of Use Thereof |
| US9605844B2 (en) * | 2009-09-01 | 2017-03-28 | Cree, Inc. | Lighting device with heat dissipation elements |
| WO2013025248A1 (en) | 2011-08-12 | 2013-02-21 | Mello Biotechnology, Inc. | Inducable expression from the eukaryotic pol -2 promoter in prokaryotes |
| US10196662B2 (en) | 2012-08-10 | 2019-02-05 | Mello Biotechnology, Inc. | Composition for producing microRNA precursors as drugs for enhancing wound healing and production method of the microRNA precursors |
| PT2953634T (pt) | 2013-02-07 | 2021-09-02 | Massachusetts Gen Hospital | Métodos de expansão ou depleção das células t reguladoras |
| WO2016187068A1 (en) | 2015-05-15 | 2016-11-24 | The General Hospital Corporation | Antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor superfamily antibodies |
| EP3355914B1 (en) | 2015-09-29 | 2024-03-06 | The General Hospital Corporation | A composition comprising bcg for reducing cholesterol. |
| KR102410778B1 (ko) | 2016-05-13 | 2022-06-21 | 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 | 길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체 |
| NZ754407A (en) | 2016-11-09 | 2023-01-27 | Philogen Spa | Il2 and tnf mutant immunoconjugates |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5821621A (ja) * | 1981-07-31 | 1983-02-08 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ヒトツモア・ネクロシス・ファクタ−を含有する悪性腫瘍治療剤 |
| JPS5943617Y2 (ja) * | 1983-08-26 | 1984-12-25 | 株式会社潤工社 | 広い周波数帯域において均一な特性を有する伝送線路用導体 |
| JPS60120990A (ja) * | 1983-12-02 | 1985-06-28 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ウサギ癌壊死因子をコ−ドするクロ−ン化ｄνａ |
| JPS60185799A (ja) * | 1984-03-06 | 1985-09-21 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4309418A (en) * | 1980-03-25 | 1982-01-05 | Sloan-Kettering Research Institute For Cancer | Anti-tumor agent from human serum and process |
| US4359415A (en) * | 1981-06-03 | 1982-11-16 | University Of Tennessee Research Corporation | Isolation of an antineoplastic protein fraction and an antineoplastic peptide fraction from human urine |
| FR2513124B1 (fr) * | 1981-07-21 | 1989-11-17 | Hayashibara Biochem Lab | Production et applications du facteur de lyse des cellules-cibles |
| JPS6011890B2 (ja) * | 1981-12-21 | 1985-03-28 | 株式会社林原生物化学研究所 | ツモアネクロシスフアクタ−の製造方法 |
| JPS57140725A (en) * | 1981-12-28 | 1982-08-31 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | Physiologically active substance having carcinostatic action |
| JPS58141785A (ja) * | 1982-02-16 | 1983-08-23 | Nippon Shinyaku Co Ltd | 抗腫瘍物質の製法 |
| US4481137A (en) * | 1982-02-26 | 1984-11-06 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Glycoproteins and processes for their production |
| US4447355A (en) * | 1982-04-07 | 1984-05-08 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for stabilizing a tumor necrosis factor and a stable aqueous solution or powder containing the same |
| JPS591288A (ja) * | 1982-06-29 | 1984-01-06 | Sato :Kk | 連続値札印字装置 |
| WO1984001288A1 (en) * | 1982-10-06 | 1984-04-12 | Takeshi Makitsubo | Process for extracting tumor necrosis factor from macrophage |
| JPS59169492A (ja) * | 1983-03-15 | 1984-09-25 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ヒト融合細胞からの生理活性物質の産生方法 |
| CA1265444A (en) * | 1983-06-27 | 1990-02-06 | Lloyd J. Old | Effect of human tumor necrosis factor and human interferon on human cancer cells and methods |
| JPS6019719A (ja) * | 1983-07-15 | 1985-01-31 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 抗腫瘍活性を有する蛋白質 |
| JPS60112718A (ja) * | 1983-11-21 | 1985-06-19 | Kyorin Pharmaceut Co Ltd | 抗腫瘍作用を示す蛋白性物質及びその製造方法 |
| DE3582183D1 (de) * | 1984-03-06 | 1991-04-25 | Dainippon Pharmaceutical Co | Dns den menschlichen tumornekrosisfaktor kodierend und das menschliche tumornekronisfaktor-polypeptid. |
| JPS60260522A (ja) * | 1984-06-07 | 1985-12-23 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 遺伝子組換体が生産する生理活性物質の安定化法 |
| DE3423234A1 (de) * | 1984-06-23 | 1986-02-06 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Synergistische mischungen von interferonen und tumor-nekrose-faktor |
| JPS61124392A (ja) * | 1984-11-22 | 1986-06-12 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の精製法 |
-
1984
- 1984-04-06 US US06/597,372 patent/US4879226A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-02-21 IN IN125/CAL/85A patent/IN163653B/en unknown
- 1985-04-02 AR AR299944A patent/AR240475A1/es active
- 1985-04-02 RO RO118239A patent/RO93650B/ro unknown
- 1985-04-02 NZ NZ231317A patent/NZ231317A/xx unknown
- 1985-04-02 EG EG209/85A patent/EG17965A/xx active
- 1985-04-02 NZ NZ211666A patent/NZ211666A/en unknown
- 1985-04-03 DK DK151985A patent/DK151985A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-04-03 CA CA000478300A patent/CA1341348C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-03 ES ES541920A patent/ES8704976A1/es not_active Expired
- 1985-04-03 NO NO851400A patent/NO174473C/no unknown
- 1985-04-03 JO JO19851365A patent/JO1365B1/en active
- 1985-04-03 FI FI851336A patent/FI86992C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-04-03 IL IL74804A patent/IL74804A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-04-03 LU LU85835A patent/LU85835A1/fr unknown
- 1985-04-03 HU HU851278A patent/HUT37813A/hu unknown
- 1985-04-03 GR GR850836A patent/GR850836B/el unknown
- 1985-04-04 CH CH1497/85A patent/CH672790A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-04-04 IE IE86385A patent/IE58833B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-04-04 PT PT80239A patent/PT80239B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-04-04 OA OA58559A patent/OA07983A/xx unknown
- 1985-04-04 EP EP89116531A patent/EP0354592A1/en not_active Withdrawn
- 1985-04-04 AU AU40882/85A patent/AU595480B2/en not_active Expired
- 1985-04-04 BE BE0/214792A patent/BE902119A/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-04-04 DD DD27489385A patent/DD251785A5/de not_active IP Right Cessation
- 1985-04-04 GB GB8508864A patent/GB2158829B/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-04 EP EP85104109A patent/EP0158286A3/en not_active Withdrawn
- 1985-04-04 ZA ZA852563A patent/ZA852563B/xx unknown
- 1985-04-04 MT MT963A patent/MTP963B/xx unknown
- 1985-04-05 IT IT20242/85A patent/IT1218469B/it active
- 1985-04-05 FR FR8505283A patent/FR2564097B1/fr not_active Expired
- 1985-04-05 BG BG8569607A patent/BG43355A3/xx unknown
- 1985-04-05 MA MA20624A patent/MA20402A1/fr unknown
- 1985-04-05 JP JP60071283A patent/JPS60252496A/ja active Granted
- 1985-04-05 PL PL1985252807A patent/PL156392B1/pl unknown
- 1985-04-06 KR KR1019850002321A patent/KR920007399B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1985-04-08 BR BR8501624A patent/BR8501624A/pt unknown
- 1985-04-18 YU YU00578/85A patent/YU57885A/xx unknown
-
1987
- 1987-04-16 MY MYPI87000492A patent/MY101887A/en unknown
-
1989
- 1989-04-04 CH CH2391/89A patent/CH675423A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1989-08-23 AU AU40162/89A patent/AU637054B2/en not_active Expired
-
1992
- 1992-07-30 SG SG778/92A patent/SG77892G/en unknown
- 1992-12-17 HK HK1021/92A patent/HK102192A/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5821621A (ja) * | 1981-07-31 | 1983-02-08 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ヒトツモア・ネクロシス・ファクタ−を含有する悪性腫瘍治療剤 |
| JPS5943617Y2 (ja) * | 1983-08-26 | 1984-12-25 | 株式会社潤工社 | 広い周波数帯域において均一な特性を有する伝送線路用導体 |
| JPS60120990A (ja) * | 1983-12-02 | 1985-06-28 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ウサギ癌壊死因子をコ−ドするクロ−ン化ｄνａ |
| JPS60185799A (ja) * | 1984-03-06 | 1985-09-21 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60228297A (ja) * | 1984-04-24 | 1985-11-13 | 株式会社 東京タツノ | 給油装置 |
| JPS6140221A (ja) * | 1984-07-05 | 1986-02-26 | ジエネンテク，インコ−ポレイテツド | 腫瘍壊死因子 |
| JPH07291997A (ja) * | 1984-07-05 | 1995-11-07 | Genentech Inc | 腫瘍壊死因子の突然変異体 |
| JPH0928387A (ja) * | 1984-07-05 | 1997-02-04 | Genentech Inc | 腫瘍壊死因子の突然変異体をコードするｄｎａ |
| JPS6150923A (ja) * | 1984-08-17 | 1986-03-13 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
| JPS62500631A (ja) * | 1984-10-15 | 1987-03-19 | カイロン コーポレイション | ヒト腫瘍壊死因子 |
| US7056695B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-06-06 | Xencor | TNF-α variants |
| US7101974B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-09-05 | Xencor | TNF-αvariants |
| US7244823B2 (en) | 2000-03-02 | 2007-07-17 | Xencor | TNF-alpha variants proteins for the treatment of TNF-alpha related disorders |
| US7662367B2 (en) | 2000-03-02 | 2010-02-16 | Xencor, Inc. | Pharmaceutical compositions for the treatment of TNF-α related disorders |
| US7687461B2 (en) | 2000-03-02 | 2010-03-30 | Xencor, Inc. | Treatment of TNF-α related disorders with TNF-α variant proteins |
| US7446174B2 (en) | 2001-03-02 | 2008-11-04 | Xencor, Inc. | Protein based TNF-α variants for the treatment of TNF-α related disorders |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS60252496A (ja) | 新規なヒト生理活性ポリペプチド | |
| KR940010865B1 (ko) | 종양 괴사 인자의 생산 방법 및 종양 괴사 인자의 수율을 증가시키는 방법 | |
| KR940000542B1 (ko) | 재조합 dna 기술에 의해 제조된 생리적 활성물질의 정제방법 | |
| EP0148311A1 (en) | A novel physiologically active polypeptide | |
| JPH0866194A (ja) | ヒト腫瘍壊死因子ミューテインをコードする遺伝子 | |
| CA1335360C (en) | Recombinant natural killer cell activator | |
| KR930000187B1 (ko) | Dna 재조합 기술에 의해 제조된 생리적 활성물질의 안정화 방법 및 상기 물질을 함유하는 안정화 수용액 또는 분말의 제조방법 | |
| JPH0157955B2 (ja) | ||
| JP2675294B2 (ja) | ヒト腫瘍壊死因子 | |
| JPS61293924A (ja) | 生理活性物質の受容タンパク | |
| JPS63270698A (ja) | 組み換え型ヒトリンホトキシン | |
| JPH066066B2 (ja) | 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の熱処理法 | |
| JPH0242986A (ja) | 新規なヒト生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａ | |
| JPS60166696A (ja) | 新規生理活性ポリペプチドのｄνａ | |
| JPS60221092A (ja) | 新規生理活性ポリペプチドのｄｎａ | |
| JPS60137292A (ja) | 新規生理活性ポリペプチドの遺伝情報を有するポリデオキシリボ核酸、該ポリデオキシリボ核酸を含む複製可能な組換ｄνａ、該複製可能な組換ｄνａで形質転換された微生物または細胞、新規生理活性ポリペプチド及びその製造方法 | |
| JPH07102151B2 (ja) | 新規なポリペプチドの製造法 | |
| JPH03277284A (ja) | 遺伝子及びその製造法 | |
| JPH0272122A (ja) | ヒトｔｎｆを有効成分として含有する医薬組成物 | |
| JPS61293994A (ja) | ラベル化された生理活性タンパク及びその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |