JPH025760B2 - - Google Patents

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JPH025760B2
JPH025760B2 JP60071283A JP7128385A JPH025760B2 JP H025760 B2 JPH025760 B2 JP H025760B2 JP 60071283 A JP60071283 A JP 60071283A JP 7128385 A JP7128385 A JP 7128385A JP H025760 B2 JPH025760 B2 JP H025760B2
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ala
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Buruusu Uooresu Robaato
Hirataka Ito
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Asahi Chemical Industry Co Ltd
Original Assignee
Asahi Chemical Industry Co Ltd
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Publication date
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Publication of JPH025760B2 publication Critical patent/JPH025760B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828—Cancer

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】 本発明は新規生理活性ポリペプチドの遺伝情報
を有するポリデオキシリボ核酸（以下DNAと略
する）に関する。 本発明は又、該DNAを含む複製可能な組換
DNA及び該複製可能な組換DNAで形質転換され
た微生物または細胞に関し、更に又、該DNAが
有する遺伝情報を発現して得られる新規生理活性
ポリペプチド、後述するアミノ酸配列を有する実
質的に純粋なヒト生理活性ポリペプチド、該生理
活性ポリペプチドを有効成分として含有する医薬
組成物および該ヒト生理活性ポリペプチドの製造
方法に関する。更に詳しくは、本発明はヒト由来
の腫瘍壊死因子（Human Tumor Necrosis
Factor）（以下、ヒトTNFと称す）をコードする
DNA、該DNAの塩基配列から演繹されるアミノ
酸配列を有するヒトTNF、組換えDNA技術を用
いて該DNAからヒトTNFを製造する方法および
該方法によつて得られる産生物の用途に関するも
のである。 本明細書において、アミノ酸、ペプチドはアイ
ユーピーエーシー−アイユービー生化学命名委員
会（IUPAC−IUB CBN）で採用された略記法
により表示され、例えば下記の略号が使用され
る。なお、アミノ酸などに関し光学異性体があり
得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。 Gln：グルタミン残基 Asp：アスパラギン酸残基 Pro：プロリン残基 Tyr：チロシン残基 Val：バリン残基 Lys：リジン残基 Glu：グルタミン酸残基 Ala：アラニン残基 Asn：アスパラギン残基 Leu：ロイシン残基 Phe：フエニルアラニン残基 Gly：グリシン残基 His：ヒスチジン残基 Shr：セリン残基 Thr：スレオニン残基 Ile：イソロイシン残基 Trp：トリプトフアン残基 Arg：アルギニン残基 Met：メチオニン残基 Cys：システイン残基 また、ポリデオキシリボヌクレオチドおよびオ
リゴヌクレオチドは下記の如き略号で表されるデ
オキシリボヌクレオチドの配列により表記する。 Ａ：2′−デオキシアデニル酸残基 Ｃ：2′−デオキシシチジル酸残基 Ｇ：2′−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 特にことわらない限り、デオキシリボヌクレオ
チド配列の左端は5′端である。 【従来の技術および発明が解決しようとする問題
点】 網内系賦活性作用を有する種々の物質、例え
ば、各種グラム陽性菌やエンドトキシンにより誘
導され、抗腫瘍細胞能力などの生理活性を有する
物質の存在は多数報告されている。例えば（カー
スウエル（Carswell）らは、CD−１スイス
（Swiss）マウスにバチルス・カルメツテ・グエ
リン〔Bacillus Calmette Guerin（BCG）〕を投
与し、その２週間後にエンドトキシを静脈内注射
して得られる該マウスの血清が、培養Ｌ細胞に対
して殺細胞作用を有すること、およびマウス
（BALB／ｃ×C57BL／６）F1に移植したメスＡ
ザルコーマ（Meth Ａ sarcoma）を出血性壊死
に至らしめる現象を見出し、腫瘍壊死因子
（Tumor Necrosis Factor）（以下、ヒトTNFと
称す）と名づけたプロク．ナト．アカド．サイ．
アメリカ合衆国（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）72
巻（No.９）3666〜3670頁（1975年）〕。その後、ラ
フ（Ruff）らジエイ・イムノル〔J.Immunol.125
巻（No.４）1671〜1677頁（1980年）〕およびマシ
ユーズ（Matthews）ら〔ブル．ジエイ．キヤン
サー（Br.J.Cancer）42巻416〜422頁（1980年）〕
は、前記カースウエル（Carswell）らの方法に
準じて調製したウサギ血清からTNFの精製を試
みて、それぞれ原血清に比べて約2000倍および約
1000倍精製されたものを得ている。しかし、いず
れの場合にも精製されたものに関しては動物実験
において抗腫瘍効果を確認していない。 特開昭57−140725号は、網内系賦活化作用を有
する物質の１種または２種以上を哺乳動物（マウ
ス、ウサギ、モルモツト等）に投与し、次いでグ
ラム陰性菌由来のエンドトキシンを注射すること
によつて、または哺乳動物由来の活性化マクロフ
アージを含む組織培養系にグラム陰性菌由来のエ
ンドトキシンを加えることによつて誘発される制
癌作用を有する蛋白性生理活性物質の単離精製方
法を開示している。更に、その物質の分子量は、
ゲル濾過法およびSDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法では39000±5000、等電点はPH3.9±
0.3（等電点電気泳動法）である、と開示している
が、その詳細な構造は開示されていない。 一方マシユーズ（Mattews）〔ブル．ジエイ．
キヤンサー（Br.J.Cancer）44巻(3)418〜424頁
（1981年）〕はBCGを注射投与し２週間を経過し
たウサギの各種組織から単核貧食細胞を得、その
細胞培養液へエンドトキシンを添加することによ
りＬ細胞障害性物質が得られることを示してい
る。しかし、この物質の詳細は構造は示されてお
らず、また血清中に見出されるTNFと同一物質
であるという証拠も示されていない。 更に、TNF様生物活性即ちTNFの生物活性と
同様の生物活性を有する因子に関する多くの報文
がある。例えば、リード（Reed）らはヒナ末梢
血中のマクロフアージ等の中にそのような因子を
見出した〔ジエイ．イムノロジー（J.
Immunology）115巻395頁（1975年）〕。マシユー
ズ（Matthews）らはヒト末梢血単球由来のまた
は骨髄性単球性白血病患者由来の白血病細胞中に
そのような因子を見出した〔マシユーズら
（Matthews et al），イムノロジー
（Immunology）44巻135頁（1981年）〕。また、バ
ーバラ（Barbara）らはエプシユタイン・バー・
ウイルス（Epstein−barr ViruS）により形質転
換されたヒトＢ細胞中に〔デイー．バーバラ
（D.Barbara et al）、プロク．ナト．アカド．サ
イ．アメリカ合衆国（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）
80巻5397頁 （1983年）〕、また、Bharatらはリ
ンパ芽球1788細胞株中にそれぞれTNF様生理活
性物質を見出している。 上記した様な因子はまた、特開昭58−15921、
58−21621、58−107197、58−225024号、英国特
許出願公開番号2106117及び2117385号にも記載さ
れている。しかしながら、このような因子を効率
的に生産する細胞または細胞株は、見出されてい
ない。更に、これらの因子の構造や物性に関し
て、ほとんど知見が得られていない。 伊東はウサギTNFの構造及び特性、およびウ
サギTNF産生細胞について研究を行なつた〔特
願昭58−251817号〕。その結果、ウサギに網内系
賦活化作用を有する物質を投与後、細菌由来のエ
ンドトキシンを注射投与することにより、Ｌ細胞
障害活性を有する物質の産生能を有する細胞を
得、さらにＬ細胞を用いてその物質を得た。伊東
はさらに上記の通り得られた細胞を用いて得られ
たＬ細胞障害活性を有する物質の分子量と、免疫
学的特性がウサギ血清から得られたTNFのもの
と一致することを確認した。一方、遺伝子操作技
術の進歩により、ある蛋白質をコードするDNA
を単離できれば、その蛋白質の構造を決定するこ
とが可能となつた。なぜならば、単離された
DNAの構造は決定することができ、次に蛋白質
の構造はそのDNAの構造から演繹することがで
きるからである。更に、微生物又は培養細胞を利
用してある蛋白質をコードするDNAからその蛋
白質を製造することができるようになつた。伊東
は上記遺伝子操作技術をＬ細胞障害活性を有する
物質を産生することのできる細胞に応用し、その
結果、ウサギTNFをコードするDNAを単離し、
該DNAとウサギTNFの構造を決定し、そして該
DNAを用いてウサギTNFを製造することに成功
した。 上述の通り、伊東はウサギTNFを製造するこ
とに大きな成功を納めたが、TNFの由来する動
物とは異なる動物にTNFを投与するとアナフイ
ラキシ−シヨツクを起す可能性がある。なぜなら
ば、TNFはポリペプチドであるので、TNFが該
TNFの由来ではない動物に投与されるとTNFは
抗原として働き、抗体を産生せしめるからであ
る。この理由から、TNFを人体に投与しようと
するならば、ヒト由来のTNFの使用が非常に好
ましい。しかしながら、ヒトTNFの構造すら十
分に解明されていなかつた。それ故、ヒトTNF
をコードするDNAの構造の決定が強く望まれて
いた。 【問題点を解決するための手段および作用】 本発明者らはヒトTNFをコードするDNAの構
造について鋭意研究を行なつた。その結果、意外
にも、ヒトポリペプチド遺伝子及びウサギTNF
遺伝子をウサギcDNAをプローブとして利用する
ことによりクローンすることができること、ヒト
ポリペプチドをコードするDNAを巧く単離する
ことができ、その構造が塩基配列の相同性に関し
てウサギTNF遺伝子、ヒトポリペプチド遺伝子
及びウサギcDNAを比較することにより決定でき
ること、ヒトポリペプチドをコードする純粋な
DNAの構造も巧く決定することができ、その純
粋なDNAを得ることができること、およびヒト
ポリペプチドをコードするDNAを用いて得られ
たヒトポリペプチドがＬ細胞障害活性を有するこ
とを本発明者らは発見した。 本発明は、これらの新しい知見に基づき完成さ
れた。 即ち、本発明の目的はヒト生理活性ポリペプチ
ドを提供することにある。 本発明の他の目的は、ヒトTNFをコードする
DNAを提供することにある。 また、本発明の目的は、ヒトTNFをコードす
るDNAと複製可能な発現ベクターとからなる複
製可能な組換DNAを提供することにある。 更にまた、本発明の目的は、上述のような組換
DNAで形質転換された微生物又は細胞を提供す
ることにある。 更にまた、本発明の目的は、上述のヒト生理活
性ポリペプチドの製造方法を提供することにあ
る。 前述したこと及び本発明の他の諸目的、諸特徴
及び諸利益は、添付の図面を参照しながら以下の
詳細な記載から明らかとなろう。 本質的には本発明によれば、次式（） 【表】 （式中、Glnはグルタミン残基、Aspはアスパ
ラギン酸残基、Proはプロリン残基、Tyrはチロ
シン残基、Valはバリン残基、Lysはリジン残基、
Gluはグルタミン酸残基、Alaはアラニン残基、
Asnはアスパラギン残基、Leuはロイシン残基、
Pheはフエニルアラニン残基、Glyはグリシン残
基、Hisはヒスチジン残基、Serはセリン残基、
Thrはスレオニン残基、Ileはイソロイシン残基、
Trpはトリプトフアン残基、Argはアルギニン残
基、Metはメチオニン残基及びCysはシステイン
残基を表わす） で表されるアミノ酸配列を含有するヒト生理活性
ポリペプチドが提供される。 本発明のヒト生理活性ポリペプチドはまた上記
アミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが結合したポ
リペプチドおよび上記アミノ酸配列のＮ末端にヒ
トTNFのためのシグナルペプチドの部分もしく
は全部が結合した中間体も包含する。自然の変異
によりまたは人工の変異により、ポリペプチドの
主たる活性に変化を与えることなく、ポリペプチ
ドをコードするDNAの構造の一部を変化させる
ことが可能である。本発明のヒト生理活性ポリペ
プチドは、前記アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドの相同変異体（Homologous variant）に相当
する構造を有するポリペプチドも包含する。これ
らの生理活性ポリペプチドはすべて以下“ヒト
TNF”と称する。 本発明のもう一つの態様によれば、次式（） 【表】 （式中、Glnはグルタミン残基、Aspはアスパ
ラギン酸残基、Proはプロリン残基、Tyrはチロ
シン残基、Valはバリン残基、Lysはリジン残基、
Gluはグルタミン酸残基、Alaはアラニン残基、
Asnはアスパラギン残基、Leuはロイシン残基、
Pheはフエニルアラニン残基、Glyはグルシン残
基、Hisはヒスチジン残基、Serはセリン残基、
Thrはスレオニン残基、Ileはイソロイシン残基、
Trpはトリプトフアン残基、Argはアルギニン残
基、Metはメチオニン残基及びCysはシステイン
残基を表わす） で表されるアミノ酸配列を含有するヒト生理活性
ポリペプチドをコードする塩基配列を含有するデ
オキシリボ核酸が提供される。 更にまた、本発明によれば、次式（）で表さ
れる塩基配列 【表】 （式中、Ａはデオキシアデニル酸残基、Ｇはデ
オキシグアニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸
残基及びＴはチミジル酸残基を表わし、式（）
の左端および右端はそれぞれ5′−水酸基側および
3′−水酸基側を表わす） および該塩基配列に相補的な塩基配列からなる
群から選ばれる少なくとも１つの塩基配列を含有
するデオキシリボ核酸が提供される。 本発明のDNAは、微生物や培養細胞によつて
成熟ヒトTNFを生産するために、前記塩基配列
の5′末端にATG（Ａ、ＴおよびＧは前述の通り）
が結合した塩基配列からなるDNAを包含する。
本発明のDNAはまた、ヒトTNFのシグナルペプ
チドの部分または全部をコードする5′−フランキ
ングDNAを含むDNAも包含する。 自然の変異によりまたは人工的変異により、主
たる活性に変化を与えることなく、DNAの構造
及びそれから演繹されるポリペプチドの構造の一
部を変異せしめることが可能である。従つて本発
明のDNAは、前述のすべてのポリペプチドの相
同変異体に相当する構造を有するポリペプチドを
コードする塩基配列を含有することも可能であ
る。 遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産される
ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくそ
の遺伝子の塩基配列の少なくとも１つの塩基を他
の種類の塩基に置換することができる。従つて、
本発明のDNAはまた、遺伝暗号の縮重に基づく
置換によつて変化された塩基配列を含有すること
も可能である。この場合、上記置換により得られ
た塩基配列から演繹されるアミノ酸配列は前記に
定義した式（）のアミノ酸配列と一致する。 更にまた、本発明によれば、前記デオキシリボ
核酸と複製可能な発現ベクターとからなる複製可
能な組換DNAが提供される。該組換DNAは、そ
れによつて形質転換された微生物または細胞中
で、ヒトTNFのアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドを発現することができる。適したベクター
としては、例えば、PHTNF−lacUV5−１及びPH
TNF−lacUV5−２発現ベクターが挙げられる。 更に本発明はまた、ヒトTNFのアミノ酸配列
を含有するポリペプチドを発現し得る複製可能な
組換DNAで形質転換された微生物または細胞に
係る。このような微生物または細胞として、大腸
菌、枯草菌、酵母、高等動物細胞が挙げられる。 更に本発明の他の態様によれば、 (a) 前記式（）で定義されるデオキシリボ核酸
を複製可能な発現ベクターに連結して該デオキ
シリボ核酸と該複製可能な発現ベクターとから
なる複製可能な組換DNAを得、 (b) 該複製可能な組換DNAで微生物または細胞
を形質転換させて形質転換体を形成せしめ、 (c) 該形質転換体を該微生物または細胞の親細胞
から選別し、 (d) 該形質転換体を培養して、該形質転換体に該
デオキシリボ核酸を発現させてヒト生理活性ポ
リペプチドを産生せしめ、そして (e) 該ヒト生理活性ポリペプチドを培養した形質
転換体から単離する ことを含む本発明のヒト生理活性ポリペプチドの
製造方法が提供される。 本発明の方法によれば、前述の本発明のDNA
を複製可能なベクターに組入れて該DNAを有す
る複製可能な組換DNAを得、得られた該組換
DNAで微生物または細胞を形質転換させて該組
換DNAを含有する形質転換体を得る。得られた
形質転換体は、該DNAに与えられた表現型によ
つて微生物又は培養細胞の親細胞から単離され
る。得られた形質転換体を培養して前記デオキシ
リボ核酸の有する遺伝情報を発現させて本発明の
生理活性ポリペプチドを製造する。 更に本発明は直接発現産物として成熟形で宿主
細胞から分泌されるヒトTNFに係る。そのよう
な成熟ヒトTNFを得る方法として、例えば、シ
グナルペプチドとして知られる15〜40アミノ酸よ
りなる微生物または高等生物由来のアミノ酸配列
を、前述の成熟TNFのアミノ酸配列のアミノ端
に結合するべくDNA配列を構成することにより
達成される。 ヒトTNFは次のようにして得られる。 １ バクテリオフアージλ／ウサギ染色体遺伝子
ライブラリーとバクテリオフアージλ／ヒト染
色体遺伝子ライブラリーは、ハーバード大学生
化学および分子生物学部（〔アメリカ合衆国、
マサチユーセツツ02138、ケンブリツジ、デイ
ビニテイ アベニユー７、（７ Divinity
Avenue，Cambridge，Massachusetts 02138，
U.S.A.）〕）のテイ．マニアテイス（T.
Maniatis）教授により調製されたものを用い
る。これらのライブラリーは次の方法によつて
作ることができる。〔セル（Cell）、15巻、687
頁（1978年）参照〕 (1) ウサギあるいはヒトの組織、たとえばウサ
ギあるいはヒトのすい臓を凍結粉末にし、
RNAと蛋白成分を分解処理し、沈澱によつ
てウサギあるいはヒトの高分子DNAを得る。 (2) この高分子DNAは遺伝子座位をランダム
に切るために、部分的に分解する。 (3) 得れれたDNA断片から分子量分画によつ
て、15から20キロ塩基対（Kb）の大きさの
断片を得る。 (4) 工程３で得られたDNA断片をλシヤロン
4Aフアージベクターを用いてクローン化す
る。 (5) 得られたベクターを、rDNAを含む感染性
のフアージ粒子にin Vitroで組み入れ、上記
のウサギあるいはヒトの染色体遺伝子ライブ
ラリーを得る。 ２ 参考例３で得られたウサギTNFのcDNAは、
ピー．ダブリユー．ジエイ．リグビー（P.W.
J，Rigby）らのニツクトランスレーシヨン法
〔ジエイ．モル．バイオル（J.Mol.Biol.）113
巻，237頁（1977年）参照〕によつて32Pでラベ
ル化する。 ３ バイテリオフアージλ／ウサギ染色体遺伝子
ライブラリーとバクテリオフアージλ／ヒト染
色体遺伝子ライブラリーのそれぞれを、バクテ
リアの均一層の上に密にプラークができるよう
に植えつけ、32PでラベルしたウサギTNFの
cDNAとハイブリダイズさせてスクリーニング
する。 ４ 適合するクローンより、対応するDNAを単
離し、制限酵素地図を作り、サザーン
（Southern）ハイブリダイズ法〔イー．エム．
サザーン（E.M.Southern）、ジエイ．モル．バ
イオル（J.Mol.Biol.），98巻，503頁（1975年）
参照〕によつて解析する。 ウサギTNFとヒトTNFの遺伝子を含む制限
酵素分解された断片を、プラスミドベクター中
に導入し、サブクローンした後、塩基配列を解
析する。 ５ ウサギTNFのcDNAとウサギTNF遺伝子の
塩基配列を比較して、ウサギTNF遺伝子のエ
クソン（ウサギTNFのアミノ酸配列をコード
する塩基配列）と、イントロン（ウサギTNF
のアミノ酸配列をコードしない塩基配列）を決
定する。 ６ そして、ウサギTNF遺伝子とヒトTNFの遺
伝子を比較して、ヒトTNF遺伝子のエクソン
とイントロンを決定する。 ７ ウサギTNF遺伝子のイントロンを削除しエ
クソンを結合することによつて得られた塩基配
列より決められるウサギTNFのアミノ酸配列
は、ウサギTNFのcDNAの塩基配列より決め
られるアミノ酸配列と一致することが確認され
る。 ８ 次に、ヒトTNF遺伝子のイントロンを削除
し、エクソンを結合することによつて得られた
塩基配列よりヒトTNFのアミノ酸配列が決め
られる。ヒトTNFのアミノ酸配列は、ウサギ
TNFのアミノ酸配列と部分的に一致すること
が確認される。 ９ その後、ヒトTNFをコードするDNAをin
vitroで修飾し、適当な発現ベクターに導入し、
そのDNAを含む組換DNAを作製する。組換
DNAは適当な宿主に導入し、これを培養液中
で増殖せしめて所望のヒトTNFを発現せしめ
る。 10 このようにして得られるヒトTNFは成熟形
でセリンから始まる155個のアミノ酸残基から
なる。それがプレシーケンスにシグナルペプチ
ドを有している場合、シグナルペプチドは非常
に疎水性の性質を有する。 以上は、ヒトTNF遺伝子およびヒトTNFをコ
ードするDNAの取得方法および該DNAを用いる
ヒトTNFの製造方法を示したものである。しか
し上記の記載は本発明を限定するものではなく、
本発明の本質的な特徴及び基本概念を変えること
なく当業者によつて明らかな変換を行なうことが
できる。 各アミノ酸に対応するコドン（遺伝暗号）の使
用頻度が異る等の理由により、アミノ酸配列を変
えることなく、ヒトTNFをコードするDNAの塩
基配列の一部または全部を、有機化学的に合成さ
れた人工のDNAに置換えることも可能である。 おそらく、ヒトTNFは、プレペプチド又はプ
レプロペプチドとして未成熟形で細胞内に産生さ
れ、プロセシング段階でプロセスされて中間体を
経て、成熟TNFを形成するものと考えられる。
ヒトTNFの未成熟形はヒトTNF遺伝子の塩基配
列から演繹される。未成熟又は中間体のTNFを
コードするDNAからなるTNF DNAは、また天
然又は人工合成のDNAと組換えることができる。 これらの方法の応用形態の１つは、メチオニン
コドン（ATG）を成熟あるいは未成あるいは中
間体TNF遺伝子の5′端に導入し、そして3′端に
TAAもしくはTAGもしくはTGAの終止コドン
と呼ばれるトリプレツトを、少なくとも１個導入
することである。メチオニンコドンが存在するこ
とにより、適当なプロモータによつて合成される
mRNAから成熟あるいは未成熟あるいは中間体
TNFが産生される。この様にTNFの末端に付加
されたメチオニン残基は、宿主によつては自然に
除去される。終止コドンを挿入する目的はTNF
DNAから転写されたmRNAからの翻訳を適当な
位置〔式（）のポリペプチドのＣ末端〕で止め
ることである。 また別の形態としては、“シグナル配列”と呼
ばれる疎水性に富んだ配列を付加することによ
り、宿主細胞の外またはグラム陰性細菌において
は、“ペリプラズム”と呼ばれる部分へ、分泌さ
せることも可能である。 また、開始コドンを組込んであるベクターの場
合は、ベクターから由来するペプチドとTNFと
の融合ペプチドを形成するが、この場合は化学的
または酵素的に切断するか、もしくはTNFの主
たる活性に変化がなければ、そのまま用いること
ができる。 ヒトTNF遺伝子を、正しく転写し、それによ
つて得られるmRNAからの翻訳が正しく行われ
るように配列において、ペロモーター等の5′領域
の遺伝子配列に接続し、得られたTNF DNA−
プロモーター配列を細菌または高等生物細胞中で
複製可能なベクターと接続した組換遺伝子を得、
この組換遺伝子によつて宿主として細菌または高
等生物細胞を形質転換し、この形質転換体を増殖
せしめ、TNF遺伝子を発現せしめることにより
TNFを得ることができる。 宿主として大腸菌〔エシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）〕（以下“大腸菌”と記載す
る）を用いる場合は好適には大腸菌K12株の種々
の変異株、例えばHB101（ATCC 33694）、
C600K（ATCC33955）、D1210、RRI（ATCC
31343）、MC1061、LE392（ATCC 33572）、
JM101（ATCC 33876）、JM83、x1776（ATCC
31244）などが用いられる。 大腸菌を宿主とする場合のベクターとしては、
pBR322、pBR325、pBR327、pUC8、pUC9、
pMB9（ATCC 37019）、pJB8（ATCC 37074）、
pKC7（ATCC 37084）等のプラスミドあるいは
λgt、λB、シヤロン4Aのようなλフアージ、
M13フアージなどが用いられる。 大腸菌の菌体中に、該生理活性ポリペプチドを
産生させるために、大腸菌の遺伝子またはフアー
ジ遺伝子のプロモーターが使用される。このよう
なプロモーターとして、好適にはラクトース分解
酵素（LAC）のプロモーター及びそのUV5変異、
ペニシリナーゼ（BLA）、トリプトフアン合成酵
素（TRP）のプロモーター、λフアージのPLプ
ロモーターあるいはトリプトフアン合成酵素と、
ラクトース分解酵素の融合プロモーターである
tacプロモーター等が用いられる。 枯草菌〔バチルス・サブチリス（Bacillus
subtilis）〕（以下“枯草菌”と記載する）を宿主
とする場合には、BD170株（ATCC 33608）、
BR151株（ATCC 33677）、MI112株（ATCC
33712）などが用いられ、ベクターとしては
pC194（ATCC 37034）、pUB110（ATCC 37015）、
pSA2100（ATCC 37014）、pE194などのプラスミ
ドが用いられる。 枯草菌を宿主とする場合のプロモーターとして
は、クロラムフエニコールアセチル化酵素
（CAT）やペニシリナーゼ、エリスロマイシン耐
性等の遺伝子のプロモーターが用いられる。 酵母を宿主とする場合は、サツカロマイセス・
セレビシエ（Saccharomyces cereviseae）の
RH218株（ATCC 44076）、SHY １株（ATCC
44769）、SHY ３株（ATCC 44771）、D131A株、
483株、830株などが用いられ、そのベクターとし
てはYEp13（ATCC 37115）、YEp6、YRp7、
YIp5等のプラスミドが用いられる。 酵母を宿主とする場合、プロモーターとしては
酸性ホスフアターゼ、アルコールデヒドロゲナー
ゼ（ADH1）、トリプトフアン合成酵素（TRP）、
ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）、チトクロ
ームＢ（COB）、アクチン等の遺伝子のプロモー
ターが用いられる。 高等生物の培養細胞を宿主とする場合は、サル
腎細胞、COS細胞、マウスC127細胞
（ATCC1616）などが用いられ、そのベクターと
してはSV40ウイルス、等を用いることができる。 本発明で得られる新規生理活性ポリペプチドの
分子量をレムリ（Laemmli）の方法［レムリ
（Laemmli）英国（1970）ネーチヤーNature（ロ
ンドン第227巻、680−685頁］に従つてSDSポリ
アクリルアミド電気泳動（SDS PAGE）で測定
すると、約17000を示す。なお、その際、マーカ
ーとしては、ホスホリラーゼｂ（分子量94k）、ウ
シ血清アルブミン（分子量68k）、オボアルブミ
ン（分子量43k）、カルボニツクアンヒドラーゼ
（分子量30k）、大豆トリプシンインヒビター（分
子量20.1k）とα−ラクトアルブミン（分子量
14.4k）を用いる。 本発明の新規生理活性ポリペプチドは生体の正
常組織は傷つけず、腫瘍の壊死を引きおこす。本
発明の活性ポリペプチドは公知の方法によつて調
剤して悪性腫瘍細胞増殖のような細胞増殖を阻害
するのに有効な医薬組成物を調製することができ
る。本発明の活性ポリペプチドは薬剤として使用
可能な担体と混合することもできる。本発明の活
性ポリペプチドの有効量を適当な量の担体と混ぜ
て、患者に効果的に投与するのに適した医薬組成
物を調製することができる。 本発明の生理活性ポリペプチドは、抗腫瘍治療
または抗ウイルス治療の必要な患者に注射剤、点
眼剤、点鼻剤、吸入剤、外用剤、経口投与用剤、
直腸投与用剤、腟内投与用剤などにして投与する
ことができる。 本発明のポリペプチドの成分１日当りの治療量
は、一般に50単位〜100000000単位であり、さら
に好ましくは局所適用においては50〜500000単
位、静脈注射、筋肉注射などの全身注射において
は、1000〜1000000単位、経口投与においては、
10000〜100000000単位であり、用法あるいは症状
に応じて適宜増減することができる。 上記において用いた“１単位”はＬ−Ｍ細胞
（ATCC CCL1.2）１×105個／mlの50％を殺す本
発明の生理活性物質の量を意味する。上述の量は
次のようにして測定する。培養容器として96穴の
組織培養用マイクロプレート（フロー・ラボトリ
ー社、米国）を用い、Ｌ−Ｍ細胞を1v／ｖ％の
ウシ胎児血清を含むイーグルのミニマム・エツセ
ンシヤル培地（その組成は、たとえば、「組織培
養」中井準之助他編集、朝倉書店、1967年に記載
されている）中で培養する。順次培地で希釈した
該生理活性ポリペプチド試料0.1mlと105個／mlの
濃度のＬ−Ｍ細胞の培地懸濁液0.1mlをプレート
の各穴の中で混合し、マイクロプレートを５％の
炭酸ガスを含む空気中、37℃で48時間培養する。
培養終了後、20％グルタルアルデヒド水溶液20μ
を加え細胞を固定する。固定後、マイクロプレ
ートを蒸溜水で洗浄、乾燥して、0.05％メチレン
ブルー溶液を0.1ml加え、生き残つた細胞を染色
する。余分なメチレンブルーを洗い流し乾燥した
後、残つたメチレンブルーを0.36N塩酸溶液で抽
出し、その665nmにおける吸光度をタイターテツ
ク・マルチスキヤン（フロー・ラボラトリー社、
米国）で測定する。この吸光度は、生き残つた細
胞数に比例する。上記の本発明の生理活性ポリペ
プチドの１×105個のＬ−Ｍ細胞の50％を殺す量
は希釈率と吸光度をグラフ上にプロツトすること
によつて求めることができる。 本発明の生理活性ポリペプチドは、非経口的に
適用することができる。非経口投与用の調剤にあ
たつては、アルブミン、ゼラチン、グロブリン、
プロタミン、プロタミン塩などの安定化剤、シヨ
糖、グリセリン、メチルセルロース、カルボキシ
メチルセルロースなどの増粘剤、各種無機塩のPH
調整剤などを添加剤として加えることができる。
また、本発明の生理活性ポリペプチドは、錠剤の
形で投与することもできる。錠剤の調製の際に用
いられる添加物の例としては、上述の安定化剤に
加えて、デンプン、乳糖などの賦形剤を挙げるこ
とができる。 具体的には、動物実験の交果、マウスの腫瘍も
大半が一，二回の注射投与で完治する。たとえ
ば、マウスの皮膚に人工の腫瘍（メスＡ細胞）を
移植、直径６〜７ミリになつた段階で本発明の新
規生理活性ポリペプチドをわずか0.6マイクログ
ラム注射すると、１週間後にかさぶた状になり、
二週間後には再び毛が生え始めて完治、その後、
妊娠、生産する。 以下に参考例および実施例によつて本発明を詳
細に記すが、本発明はこれに限定されるものでは
ない。 本発明の実施にあたり、組換DNAの作製、組
換体の微生物への導入は、特に断らない限り下記
の実験書(1)〜(4)に従つて実施する。 (1) 高木康敬編著 遺伝子操作マニユアル、講談
社 (2) 高木康敬編著 遺伝子操作実験法、講談社 (3) テイー．マニアテイス（T.Maniatis）、イ
ー．エフ．フリツチユ（E.F.Fritsch）、ジエ
イ．サムブルツク（J.Sambrook）、モレキユ
ラー クローニング（Molecular Cloning）、
コールド スプリング ハーバー ラボラトリ
ー（Cold Spring Harbor Laboratory）刊
（1982年米国） (4) レイ ウ（Ray wu）ら、メソツド イン
エンザイモロジー（Method in
Enzymology）、101巻、アカデミツク プレス
（Academic Press）（米国）刊 参考例および実施例中で用いられる略号 MOPS：モリフオリノプロパンスルホン酸 LB培地：ルリアーベルタニ培地 DMSO：ジメチルスルフオキシド PFU：プラーク・フオーミング単位 EDTA：エチレンジアミン四酢酸 SDS：ドデシル硫酸ナトリウム BRL：ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー社、
米国 DMF：ジメチルホルムアミド lac：ラクトース トリス（Tris）：トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン XAR−５：Ｘ線フイルム（イーストマン・コダ
ツク社、米国） １×SSC：0.15M塩化ナトリウム＋0.015Mクエン
酸ナトリウム、PH７ ２×SSC：0.30M塩化ナトリウム＋0.030Mクエン
酸ナトリウム、PH７ ３×SSC：0.45M塩化ナトリウム＋0.045Mクエン
酸ナトリウム、PH７ ５×SSC：0.75M塩化ナトリウム＋0.075Mクエン
酸ナトリウム、PH７ ６×SSC：0.90M塩化ナトリウム＋0.090Mクエン
酸ナトリウム、PH７ FDSS：50％脱イオン化フオルムアミド＋５×デ
ンハルト（Denhardt's）＋５×SSPE＋0.1％
SDS＋100μｇ／ml変性ウシ胸腺DNA SSPE：0.18M塩化ナトリウム＋10mMリン酸二
水素ナトリウム＋1mMEDTA，PH7.4 SM：１中に塩化ナトリウム5.8ｇ、硫酸マグネ
シウム・７水和物２ｇ、1M トリス−Cl
（Tris・Cl（PH7.5）50mlと２％ゼラチン５ml
を含むフアージ保存培地 NZブロス：１中にNZアミン（カゼインのタイ
プＡ水解物，フムコ・シエフイールド・ケミ
カル・デビイジヨン・オブ・クラフト社、米
国）10ｇ、塩化ナトリウム５ｇと硫酸マグネ
シウム・７水和物２ｇを含む培地 IPTG：イソプロピルチオガラクトシド Ｘ−gal：５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リルガラクトシド TAE：0.04M Tris（トリス）−酢酸（PH8.0）−
0.002M EDTA ５×デンハルト溶液：１中にフイコール
（Ficoll）1000mg、ポリビニルピロリドン 1000mg、及びウシ血清アルブミン 1000mgを含む水溶液 bp：塩基対 【実施例】 参考例 １ Ｌ細胞障害活性評価 以下の参考例及び実施例においてＬ細胞を用い
る活性評価は、ラフ（Ruff）等〔リンホカイン
ズ（Lymphokines）２巻 イー．ピツク（E.
Pick）編集、アカデミツク プレス（Academic
Press）235頁（1980）〕あるいは〔ジエイ．イム
ノル（J.Immunol.）126巻1279頁（1981年）〕の
方法に準じ、本発明による生理活性物質がL929
細胞（ATCC CCL1）を殺す効果を測定するも
のである。すなわち、順次培地で希釈した試料
0.1mlと、105個／mlの濃度のＬ細胞の倍地懸濁液
0.1mlを、96穴の組織培養用マイクロプレート
（フロー．ラボラトリー社、米国）に加える。培
地は1v／ｖ％のウシ胎児血清の及び最終濃度5μ
ｇ／mlのアクチノマイシンＤを含むイーグルのミ
ニマム・エツセンシヤル培地（その組成は、たと
えば、「組織培養」中井準之助他編集、朝倉書店、
1967年に記載されている）を用いる。マイクロプ
レートを５％の炭酸ガスを含む空気中、37℃で21
時間培養する。培養終了後、20％グルタルアルデ
ヒド水溶液20μを加え、細胞を固定する。固定
後、マイクロプレートを洗浄、乾燥して、0.05％
メチレンブルー溶液を0.1ml加え、生き残つた細
胞を染色する。余分なメチレンブルーを洗い流し
乾燥した後、残つたメチレンブルーを0.36N塩酸
溶液で抽出し、その665nmにおける吸光度をタイ
ターテツク・マルチスキヤン（フロー・ラボラト
リー社、米国）で測定する。この吸光度は、生き
残つた細胞数に比例する。L929細胞の50％を殺
すために必要な生理活性量を１単位／mlと定義
し、試料を加えない対照の吸光度の50％の値に相
当する試料の希釈率を、グラフあるいは計算によ
つて求め、その希釈率の逆数を試料の生理活性量
（単位／mlで表記する）とする。参考例において
用いる“１単位”は、105個／mlのL929細胞の50
％を殺すウサギTNFの量を意味する。 一方、蛋白質量は、ブラツドフオード
（Bradford）らの方法〔アナル．バイオケム．
（Anal.Biochem.）72巻248〜254頁（1976年）〕に
より、クーマシー・ブリリアント・ブルーG250
を用いる色素結合法から算出する。 参考例 ２ 工程１ （ウサギ血清TNFの取得） 雌ウサギ（体重2.5〜3.0Kg）にホルマリンにて
死菌処理したプロピオニバクテリウム・アクネス
（Propionibacterium acnes）〔コリネバクテリ
ウム・パーバム（Corynebacterium parvum）、
ウエルカム社、英国〕50mgを耳静脈より注射す
る。該ウサギに８日後再度100μｇのエンドトキ
シン〔大腸菌026：B6由来のリポポリサツカライ
ド、デイフコ社製、米国〕を耳静脈より注射し、
２時間後に心臓より全採血する。採取した血液に
100ml当り100単位のヘパリンナトリウムを加えた
後、5000rpmで30分間冷却遠心操作を行ない、血
球および不溶固型物を除去する。40羽のウサギよ
り、血清TNF3×104単位／mlの活性を有する血
漿2.4が得られる。 工程２ （血清TNFの部分精製） 工程１で得た血漿2.4にセライト24ｇを加え、
１時間撹拌した後濾過する。濾液に1.2の
0.04Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.8）を加えた後、
0.1M塩化ナトリウムを含む0.04Mトリス−塩酸
緩衝液（PH7.8）で充分に平衡化したDEAEセフ
アロースCL−6B（フアルマシア社、スウエーデ
ン）のカラムに添加する。0.04Mトリス−塩酸緩
衝液で洗浄後、0.18M塩化ナトリウムを含む
0.04Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）を用いて溶
出する。Ｌ細胞障害活性を示す画分を、限外濾過
により濃縮する。次いで5mMリン酸緩衝液で平
衡化したセフアクリルＳ−200（フアルマシア社、
スウエーデン）のカラムに該濃縮液を添加し、同
緩衝液にてゲル濾過を行なう。活性画分は限外濾
過により濃縮し3.5×106単位を回収する。比活性
は18×106単位／mgである。 工程３ （抗TNF抗体） 血清より得たTNFを工程２の如く部分精製し
フロイントの完全アジユバントを１：１で混合し
12週令の雄BALB／ｃマウスの背部皮下に注射
する。２週後、及び４週後にこの操作を繰返し、
更に１週後に全採血し、その血清を取得する。 この血清をＬ細胞障害活性を測定する培地中に
終濃度500倍希釈となるように添加し、ウサギ血
清から得たTNFのＬ細胞障害活性を参考例１に
示す方法で測定すると、Ｌ細胞障害活性は認めら
れない。ここに得られるマウス血清は、ウサギ血
清TNFに対する抗体（抗TNF抗体と称する）を
含むものと結論できる。 参考例 ２ 工程１ （TNF産生細胞取得） 雌ウサギにホルマリンにて死菌処理したプロピ
オニバクテリウム・アクネス
（Propionibacterium acnes）〔コリネバクテリ
ウム・パーバム（Corynebacterium parvum）、
ウエルカム社、英国〕を静脈内投与し、７日後に
気管切開し、肺を生理食塩水で洗浄することによ
り浮遊性細胞を得る。この細胞を生理食塩水で洗
浄後、10％ウシ胎児血清（フロー・ラボラトリー
社、米国）を含むRPMI1640（フロー・ラボラト
リー社、米国）を培地とし、炭酸ガス５％含有空
気を雰囲気とする炭酸ガスインキユベーターに
て、37℃で培養する。培養器を２コに分け、一方
には大腸菌由来のエンドトキシン〔大腸菌026：
B6由来のリポポリサツカライド、デイフコ社、
米国〕を10μｇ／mlとなるように添加し、一方に
は同量の滅菌水を添加する。エンドトキシンを添
加した培養上清にＬ細胞障害活性が出現し７時間
で最高値に達する。この活性は抗TNF抗体で消
去されるが、正常マウス血清では消去されない。 一方、エンドトキシンを添加しない細胞培養上
清にはＬ細胞障害活性は認められない。 工程２ （TNFの分子量） 工程１における細胞培養においてエンドトキシ
ンと共に放射性Ｌ−（35S〕メチオニン（1300Ci／
mmole、アマーシヤム社、英国）を1mCi／mlと
なるように添加して培養を行う。培養上清をレム
リ（Laemmli）の方法〔レムリ（Laemmli），英
国（1970年）ネーチヤー（Nature）（ロンドン）
227巻680〜685頁〕に従つてSDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により解析する。ゲル濃度は
12.5％となるように調製する。泳動後エンハンス
（ENHANCE ）（ニユー・イングランド・ヌク
レアー社、米国）により処理し、乾燥後、Ｘ線フ
イルム（フジRX、富士写真フイルム）に密着露
光せしめる。エンドトキシン存在下に培養した培
養上清に、分子量約17500の物質の生成が認めら
れる。 また工程１における細胞培養の上清を上記と同
様にSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し
た後、2.5％NP40 （カルビオケム社、米国）で
１時間、水中で２時間振とう後、各泳動レーンを
切断分離し、泳動方向に直角に２mm巾にスライス
する。各スライス断片をＬ細胞と共に培養するこ
とにより、Ｌ細胞障害活性を調べる。エンドトキ
シン存在下に培養上清を展開したレーンの分子量
約17500の位置にＬ細胞障害活性が認められ、そ
の他の位置には細胞障害活性は認められない。 工程３ （mRNAの取得） 工程１と同様な細胞培養においてエンドトキシ
ンを添加後２時間培養したのち、遠心分離して細
胞（ウサギ肺洗浄細胞）を集める。細胞質RNA
およびその中からのmRNAの抽出は下記の如く
チヤーグウイン（Chirgwin）らの条件〔チヤー
グウイン、ジエイ．エム（Chirgwin，J.M.）ら、
バイオケミストリー（Biochemistry）18巻5294
頁（1979年）〕に従つて行なう。細胞３×108個に
対して４mlの4Mグアニジンチオシアネート溶液
を加え、ホモジナイザー（AM−７、日本精機製
作所）にて破砕する。残査を遠心除去後、2.4ｇ
の塩化セシウムを溶解し、あらかじめ2.5mlの
5.7M塩化セシウム、0.1M EDTA溶液（PH7.5）
を入れてあるポリアロマーチユーブへ静かに重層
する。 ベツクマンSW41ローター（ベツクマン社、米
国）を用いて20℃で30000rpmにて12時間、超遠
心分離を行つた後、上清を除き、ペレツトを
10mMトリス−塩酸緩衝液（5mM EDTA，
1w／ｖ％SDSを含有する）１mlにて溶解する。
この溶液を１mlのクロロホルムと１−ブタノール
の混液（容積比４：１）で抽出し、水層に0.05容
積の2M酢酸ナトリウムと、2.5容積のエタノール
を加え、−20℃で２時間以上放置してRNAを沈澱
させる。遠心にて沈澱を集め、乾燥させたのち滅
菌水500μに溶解して、細胞質RNA溶液を得
る。 上記細胞質RNA溶液を68℃、２分間加熱後急
冷し、500μの２倍濃度の10mMトリスEDTA
緩衝液PH7.4（1mM EDTA，0.1w／ｖ％SDS及び
0.5M塩化リチウムを含む）を加え、200mgのオリ
ゴ（dT）−セルロース（ビーアールエル（BRL）
社、米国）カラムに展開、１倍濃度の上記バツフ
アー10mlで洗浄、溶出緩衝液（10mMトリス−塩
酸PH7.4、1mM EDTA、0.1w／ｖ％SDSを含む）
２mlで溶出する。溶出液に0.05容積の酢酸ナトリ
ウム溶液、2.5容積のエタノールを加えて、−20℃
に冷却して沈澱せしめる。沈澱を遠心にて集め、
再度同様にオリゴ（dT）セルロースカラムに吸
着する画分を集める。紫外吸収スペクトル分析に
より、85μｇのmRNAを回収する。 工程４ （mRNAのサイズ分画） 工程３と同様にして得られるmRNA880μｇを
250μの水に溶解し、５−25％直線シヨ糖密度
勾配10mlに重層する。シヨ糖密度勾配は、５およ
び25％のシヨ糖を各々含むトリス緩衝液（25mM
トリス塩酸PH7.2、2mM EDTA、1w／ｖ％SDS
を含有する）を用い、ISCO570グラジエンター
（イスコ社、米国）により作製する。 ベツクマンSW41ローターを用い、４℃
40000rpm、12時間の超遠心を行つたのち、分画
回収装置（ベツクマン社、米国）により各400μ
の分画を回収する。各分画はエタノール沈澱
し、遠心後滅菌水に溶解する。 工程５ （mRNAの翻訳実験） アフリカツメガエル卵母細胞によるmRNAの
翻訳は、実験書（例えば寺岡宏、五木幹男、田中
兼太郎、蛋白質、核酸、酵素、臨時増刊、遺伝子
操作、602頁1981年）に依る。アフリカツメガエ
ルは、浜松生物教材より得る。工程４で得た分画
mRNAを1μｇ／μになるように滅菌水に溶解
し、卵母細胞１個あたり、50nずつを微量注入
し、１mg／mlのウシ血清アルブミンを含有するバ
ース（Barth）溶液（7.5mMトリス−塩酸PH7.6、
88mM塩化ナトリウム、1mM塩化カリ、0.33mM
硝酸カルシウム、0.41mM塩化カルシウム、
0.82mM硫酸マグネシウム、2.4mM重炭酸ナトリ
ウム、18U／mlペニシリンＧ、18μｇ／mlストレ
プトマイシンを含有する）中で24時間培養する。
培養液のまま卵母細胞をガラス棒でつぶし、遠心
後、上清のＬ細胞障害活性を測定する。沈降定数
16S付近において、Ｌ細胞障害活性が最高値を与
える。またこの活性は参考例２工程３で得た抗
TNF抗体により消去されるが正常マウス血清で
は消去されない。 工程６ （形質転換体の取得） 工程４で得た分画mRNA 5μｇを用い、実験書
(1)96頁以降に従つて二重鎖DNAを調製する。逆
転写酵素はライフサイエンス社（米国）のものを
使用する。二重鎖DNAを3.5％ゲル濃度のポリア
クリルアミドゲル電気泳動にて分画し、長さ約
1000〜2000bpの画分330nｇを得る。この画分7n
ｇを用い同上の実験書に従い、ターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ビーアー
ル（BRL）社、米国）を用いてデオキシＣ鎖を
つなぎ、同様にPst部位にデオキシＧ鎖をつな
いだプラスミドpBR322 56nｇとアニールせしめ
る。アニール後の混合物を用いて大腸菌Ｋ−12株
（HB101、ATCC 33694）を形質転換し、2000株
の形質転換体を得る。 工程７ （ウサギTNFの部分アミノ酸配列） 参考例２で部分精製するTNFを、工程２にお
けると同様にSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動により精製する。一部をクマシー・ブリリアン
ト・ブルー染色し、分子量約17000の位置に対応
するバンドをゲルから切出し、１％重炭酸アンモ
ニウムにより抽出する。５×107単位のTNFを使
用し、蛋白として約180μｇ回収する。 このうち150μｇを１％重炭酸アンモニウム75μ
に溶解、TPCKトリプシン（ワーシントン・バ
イオケミカル社、米国）3μｇを添加し、37℃、
４時間インキユベートする。反応液をコスモシル
5C8（半井化学）を担体とする高速液体クロマト
グラフイーにより分画し、トリプシン消化断片を
得る。 上記の如く高純度に精製したTNFおよびその
トリプシン消化断片は、次に、セフアデツクス
G25のカラムで脱塩し、凍結乾燥する。アール．
エム．ヒユーイツク（R.M.Hewick）らの方法
〔ジエイ．バイオロ．ケム（J.Biol.Chem.）256巻
7990−7997頁、1981年〕に準じて、Ｎ末端よりエ
ドマン分解を行なう。各ステツプにおいて遊離し
てくるフエニルチオヒダントインアミノ酸は、高
速液体クロマトグラフイー、モデルSP8100（スペ
クトラフイジツクス社、米国）を用い、ゾルパツ
クスODS）デユポン社、米国）をカラムとして、
常法により分析する。この結果、TNFのＮ末端
側からのアミノ酸配列は下記の通りである。 Ser−Ala−Ser−Arg−Ala−Leu−Ser−Asp
−Lys− Pro−Leu−Ala−His−Val−Val−Ala−Asn
−Pro− Gln−Val−Glu−Gly−Gln−Leu−Gln− トリプシン消化断片のうちの１つは、そのＮ末
端より下記のアミノ酸配列をもつ。 Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met
Ala 工程８ （オリゴDNAプローブの合成） 参考例３工程７で得たTNFのアミノ酸配列か
ら推定される。mRNAの塩基配列に対し、相補
的な、オリゴDNAを合成する。合成方法は、伊
東らが既に発表している改良リン酸トリエステル
法（エイチ．イトウ（H.Ito）ら、ニユークレイ
ツク アシツズ レス．（Nucleic Acids Res.）
10巻1755〜1769頁、1982年）により行う。 アミノ酸配列から推定される128種類のオリゴ
DNAを５グループに分け、各々16，16，32，32，
32種類の混合物として合成する。各々を常法に従
つて脱保護し、セフアデツクスＧ−50（フアルマ
シア社、スウエーデン）を用いるカラムクロマト
グラフイー、7M尿素を含む20％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動及び、DE52（ワツトマン社、米
国）カラムクロマトグラフイーにより精製し、
0.1mMトリス−EDTA緩衝液に対し透析する。 各々の精製オリゴDNAを常法によりT4ポリヌ
クレオチドキナーゼ（ベセスダリサーチラボラト
リーズ社、米国）およびγ−32P−アデノシント
リリン酸を用いて放射性ラベルし、DE52カラム
（ワツトマン社、米国）により精製する。各々、
約３×108cpm／μｇの放射能が導入される。各
グループの混合物の形で得られたオリゴDNAプ
ローブを第１表に示すように命名する。 第１表にウサギTNFのアミノ酸配列の一部と
ウサギTNFのアミノ酸配列から推定される
mRNA塩基配列、およびこれに基づく各グルー
プの合成オリゴDNAのプローブの塩基配列を示
す。 【表】 参考例３工程３に従つて得たTNF産生細胞の
mRNAを1Mグリオキザール、50容量％ジメチル
スルホキシド及び10mM NaH2PO4の存在下に50
℃60分間処理したのち、1.1重量％アガロースゲ
ル電気泳動により分画する。分画後のmRNAを、
電気泳動式トランスフアーブロテイング装置（バ
イオラツド社、米国）を用いて、メーカーのマニ
ユアルに従い、移動せしめる。次いで、この膜上
のmRNAと、５×SSC及び150μｇ／mlの変性サ
ケ精子DNAを含む５×デンハルト溶液で65℃、
２時間処理したのち、放射性標識したオリゴ
DNAを１×107cpm／ml、５×SSC溶液を含む５
×デンハルト溶液で50℃、２時間処理する。次い
でこの膜を６×SSCで室温、40℃、50℃、60℃で
順次洗浄し、Ｘ線フイルムXAR−５（イーストマ
ン・コダツク社、米国）に対し露光せしめる。こ
の結果、mRNAと最も強くハイブリダイズする
オリゴDNAはMJであつて、MJ混合物中で
mRNAと完全に相補的な配列を有するオリゴ
DNAが含まれていることが判明する。 工程９ （ウサギTNF遺伝子のクローニング） 参考例３工程６で得られる形質転換体を実験書
(2)162頁の方法に従つてセルロースフイルター上
に移し、そのDNAと、参考例３工程８で選択さ
れる放射性標識オリゴDNA（MJ）とを参考例３
工程８と同様の条件でハイブリダイズせしめる
（コロニー・ハイブリダイゼーシヨン）。強くハイ
ブリダイズする株49個を選び更にフイルター上に
固定して再度コロニーハイブリダイゼーシヨンを
実施し、標識オリゴDNA（プローブMJ）により
強くハイブリダイズする９個を選ぶ。 この９個の株から、実験書(1)の６頁の迅速プラ
スミド分離法に従つて各々約5μｇのプラスミド
を取得する。このプラスミドを制限酵素Pst、
Taq、Rsa、Pvu（いずれもBRL社、米
国）を用い、メーカーのマニユアルに従つて切断
し、１重量％アガロースゲル電気泳動で、各々の
酵素による切断片の長さを比較する。 この結果、９株すべてが、約50bpのPvuと
Rsaによる断片を有し、９株のほとんどがRsa
による約200bpの断片を有し、部分的に共通の
配列を有することが示唆される。第１図に制限酵
素による解析結果を図示する。 また、このうち７株を10μｇ／mlのテトラサイ
クリンを含む２mlのLB培地中で吸光度が第２表
に示す値になるまで培養し、遠心にて集めた菌体
を２mlの生理食塩水中で超音波により破砕し、遠
心上清のＬ細胞障害活性を測定すると、第２表に
示す如く、Ｌ細胞障害活性を示す。対照実験とし
てプラスミドpBR322を含有する株を用いて同様
の操作を繰返して行なう。結果を第２表に示す。 【表】 またこの活性は抗TNF抗体により消去され、
正常マウス血清では消去されない。従つてこの９
株すべてがTNF遺伝子を含むプラスミドを有し
ていることが示される。 工程10 （ウサギTNF遺伝子の塩基配列の決定） プラスミドpB2−７、およびpR18を含有する
大腸菌株を、10μｇ／mlのテトラサイクリンを含
有するM9培地〔実験書(3)440頁〕１中で培養し
た後、実験書(3)90頁の方法に従つてプラスミドを
単離し、各々約150μｇを得る。 各々の塩基配列をマキサム−ギルバート
（Maxam−Gilbert）法〔マキサム（Maxam）
ら、メソツド イン エンザイモロジー
（Method in Enzymology）、55巻、490頁、1980
年、アカデミツク プレス（Academic Press）〕
に従つて決定する。また、この塩基配列と参考例
３工程７で決定された部分アミノ酸配列の一致に
より、ウサギTNF蛋白の全構造が解明される。 工程 11 プラスミドpR12の組換体を用いて大腸菌内で
lacをプロモーターとしてTNFを発現させること
を目的にプラスミドの構築を行なう。第２図に示
す様に10μｇのプラスミドpR12を10ユニツトの
Apa（ビーアールエル（BRL）社）で37℃で
２時間消化し、４％のポリアクリルアミドゲル電
気泳動で約630bp断片を単離する。約1μｇの断片
がゲルから電気泳動溶出する。参考例３工程８と
同様の方法によつて第２図に示す２個デオキシオ
リゴヌクレオチド即ち、5′−
GATCCATGTCAGCTTCTCGGGCC−3′と5′−
CGAGAAGCTGACATG−3′とを合成し、実験
書(3)122頁に従つて約100pmoleの各デオキシオリ
ゴヌクレオチドの5′末端をT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いてリン酸化する。反応終了後、反応
混合物をフエノールを用いて抽出し、さらにクロ
ロフオルムを用いて抽出した後、オリゴマーを
0.5μｇの約610塩基対のApa断片と合せてエタ
ノール沈澱させる。実験書(1)37頁に従つて10ユニ
ツトのT4DNAリガーゼで前記の断片を４℃で１
夜反応させ結合する。反応終了液をエタノール沈
澱後、20ユニツトのBamHIで37℃３時間消化し、
４％のポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、
約670bpの断片を電気泳動溶出により回収する。
市販のプラスミドpUC−８（Ｐ−Ｌバイオケミカ
ル社、カタログ番号4916、米国）1μｇをBamHI
で消化してフエノール抽出、クロロフオルム抽
出、エタノール沈澱をして調製したベクター0.5μ
ｇに約670bpのTNFの構造遺伝子を含む両端に
BamHIサイトを持つた断片をT4DNAリガーゼ
を用いて結合する。実験書(4)、20頁に従つて、大
腸菌を形質転換して1mMIPTG及び0.004％
（ｗ／ｖ）ｘ−galを含む寒天培地で培養して約
200個の白色コロニーを得る。これらの形質転換
体100個からプラスミドDNAを調製し、BamHI
で消化したところ、15個が目的の約670bpのBam
HI断片を含んでいる。さらに、挿入の方向を調
べるために、上記15個のプラスミドをpUC−８
上に１ケ所しか認識部位がないEcoRIとPvu
（約670bpの断片上に認識部位がある）を用いて
消化し、６重量％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を用いて調べることにより、７個のプラスミド
から目的の約140bpの断片が確認され、pUC−８
上のlacプロモーターから順方向であることが判
明する。 塩基配列の解析により、この７個のプラスミド
は同一で、lacプロモーター、合成DNA及び
cDNA間の結合部に所望のヌクレオチド配列を有
することが確認される。 プラスミドpR17を用いて、大腸菌内でlacUV5
をプロモーターとしてTNFを直接発現させるこ
とを目的にプラスミドの構築を行なう。第３図に
示す様に10μｇのプラスミドpR17を10ユニツトの
Apa（ビーアールエル（BRL）社）で37℃２
時間消化し、４％のポリアクリルアミドゲル電気
泳動で約630bpの断片を単離する。約1μｇの断片
がゲルから電気泳動溶出する。工程８と同様の方
法によつて第３図の２個のデオキシオリゴヌクレ
オチド即ち、5′−
AATTCATGTCAGCTTCTCGGGCC−3′と
5′−CGAGAAGCTGACATG−3′とを合成し、
実験書(3)122頁に従つて約100pmoleの上記２種の
デオキシオリゴヌクレオチドの5′末端をT4ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてリン酸化する。反応
終了液をフエノールを用いて抽出し、さらにクロ
ロフオルム抽出した後、先に得たpR17のApa
消化断片（約630bp）0.5μｇと合わせてエタノー
ル沈澱する。実験書(1)37頁に従つて10ユニツトの
T4リガーゼで４℃一夜反応させ、結合せしめる。
反応後、反応液をエタノール沈殿し、20ユニツト
のEcoRIで37℃３時間消化し、４％のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により約670bpの断片を回
収する。 プラスミドpOP95−15は、フラーの方法（エ
フ．フラー（F.Fuller），ジーン（Gene），19巻
42頁〜54頁、1982年〕に従つて調製する。 pOP95−15の1μｇをEcoRIで消化してフエノー
ル抽出、クロロフオルム抽出、エタノール沈澱を
してベクターを調製する。ベクター0.5μｇは、上
記の如く合成デオキシオリゴヌクレオチドと、
TNFをコードするDNAを結合して得られる約
670bpの断片に、T4DNAリガーゼを用いて結合
される。実験書(4)、20頁に従つて、大腸菌を形質
転換して1mM IPTG及び0.004％（ｗ／ｖ）ｘ−
galを含む寒天培地上に約150個の白色コロニーを
得る。 これらのコロニー100個からプラスミドDNAを
調製し、EcoRIで消化したところ12個が、目的の
約670bpのEcoRI断片を有している。さらに挿入
の方向を調べるために上記12個のプラスミドを
PvuとPstを用いて消化し、1.5重量％アガロ
ースゲル電気泳動を用いて調べると４個のプラス
ミドから目的の約1280bp及び2600bpの断片が確
認され、lacUV5プロモーターから順方向にTNF
遺伝子が接続されていることが判明する。 塩基配列の解析により、この４個のプラスミド
は同一で、lacUV5プロモーター、合成デオキシ
オリゴヌクレオチド、及びcDNAが正しく結合さ
れていることが確認される。得られるプラスミド
をpTNF−lacUV5−１と命名する。 工程12 （大腸菌が産生するTNFの精製） 工程11で得られたプラスミドを含有する大腸菌
株をアンピシリンを含有するLB培地に50ml中37
℃で１夜培養し、５の同上の培地に移して更に
３時間培養する。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド（シグマ社米国）を終濃度1mM
になる様に添加し更に、６時間培養を続けたのち
冷却し、遠心分離により菌株を集める。工程11に
おけると同様に菌体を0.04Mトリス−塩酸緩衝液
（PH7.5）５中で超音波破砕し、菌体蛋白溶液を
得る。 この溶液は５×107単位／のＬ細胞障害活性
を示す。 この溶液を参考例２工程２と同様に精製し1.2
×106単位のTNFを得る。このものの比活性は
6.8×107単位／mgである。 工程13 〔メスＡザルコーマ（Meth Ａ
sarcoma）担癌マウスを用いる活性評価〕 BALB／ｃマウスの腹部皮内に２×105個のメ
スＡザルコーマ（Meth Ａ sarcoma）細胞を移
植する。７日後、移植した腫瘍の大きさが直径７
〜８mmとなり、出血性壊死などがなく良好な血行
状態にあるマウスを選び、尾静脈より生理食塩水
で希釈した0.5mlの参考例３工程12で得られる
TNF試料を注射し、24時間後に次の判定基準に
より判定を行なう。 （−）：変化なし （＋）：かすかな出血性壊死 （）：中程度の出血性壊死（移植癌表面の真
中から50％以上にわたつて壊死） （）：顕著な出血性壊死（移植癌の中央部が
重度に壊死し、周囲の癌組織がわずかに残つ
た状態） また、試料投与後20日目に癌が完全に退縮した
かどうかを観察し完治率を求める。 以上の方法により測定し、大腸菌の生産する
TNFの活性を第３表に示す。 完治率＝完全に癌が退縮したマウス数／実験マウス数 【表】 実施例 １ 工程１ （プラスミドpR18、pB2−７、pB2−２
の大腸菌K12、MC1061株（Casadaban et
al.，Journal of Bacteriology，vol.143，No.
２，p.971−980（1980）に所載）への形質転換） 参考例３で得られる上記３種のプラスミドを常
法に従つて大腸菌K12MC1061株へ形質転換する。
詳しくは大腸菌K12MC1061株のコロニーをLB培
地を用いて、550nmの吸光度が0.3になるまで培
養する。該培養物50mlを集め、25mlの10mM
RbClを含む10mM MOPS（PH7.0）溶液で洗浄
し、次いで50mM CaCl2、10mM RbClを含む
0.1M MOPS（PH6.5）に再び懸濁する。 該懸濁液を30分間氷冷し、遠心後、上清を除去
し、30μのDMSOおよび50mM CaCl2と10mM
RbClを含む0.1M MOPS（PH6.5）の混合液中に懸
濁させる。該懸濁液を200μずつ分注し、前述
のプラスミドDNA溶液10μをそれぞれに加え
る。 該混合液をそれぞれ30分間氷冷した後、44℃で
60秒ヒートシヨツクを与え、ただちに、あらかじ
め37℃に温めておいた５mlのLB培地を加える。
この溶液を37℃で１時間培養した後、それぞれの
溶液を遠心し、上清を除去し、細胞ペレツトを得
る。該細胞ペレツトにLB培地を加え、撹拌した
後、懸濁液とする。該懸濁液を30μｇ／mlのテト
ラサイクリンを含むLB寒天プレートにまき、37
℃で１夜培養を行なう。その結果、プラスミド
pR18、pB2−７とpB2−２からそれぞれテトラサ
イクリン耐性形質転換菌のコロニーが得られる。 工程２ （pB2−７とpR18プラスミドDNAの調
製） 工程１で得られるプラスミドpB2−７とpR18
の形質転換体を下記の報文の方法に従つて培養
し、プラスミドを増幅させる。次いで得られる形
質転換体を集菌し、破砕したのち、プラスミド
DNAを精製する。〔実験書(3)、88−96頁〕 すなわち、30μｇ／mlテトラサイクリンを含有
するLB培地に、それぞれの形質転換体を植菌し、
激しく振とうしながら37℃で培養する。 次いで、この工程をくりかえして形質転換体を
増殖させ、更にプラスミドを増幅させる。次に、
得られる形質転換体の培養液を４℃に冷却しなが
ら、4000ｇで10分間遠心を行ない、上清を除去す
る。 氷冷STE〔0.1M塩化ナトリウム、10mMトリス
−塩酸緩衝液（PH7.8）と1mM EDTA〕の100ml
を用いて洗浄し、続いて10mMトリス−塩酸緩衝
液（PH8.0）の中に20mg／mlのリゾチームを含む
水溶液を用いて細胞を煮沸溶菌する。得られる粘
性液体を超遠心チユーブに移し入れ25000rpm30
分間４℃で遠心を行なつてDNA溶液を得る。 該DNA溶液の容量を測つた後、該溶液１ml当
りに、固体の塩化セシウム１ｇを加え、塩化セシ
ウムが完全に溶けるまで、ゆつくりと注意深く撹
拌する。該塩化セシウム水溶液の10ml毎に、10
mg／mlのエチジウムブロマイド水溶液0.8mlを加
える。この結果、該溶液の最終比重は1.55ｇ／
ml、エチジウムブロマイドの最終濃度は約600μ
ｇ／mlとなる。 該塩化セシウム水溶液を適当な遠心チユーブに
移し、空隙に軽パラフインオイルを加え、20℃で
36時間、45000rpmの遠心を続けると上層に鎖状
の微生物由来DNAとニツクの入つた環状プラス
ミドDNAと、下層に閉環状プラスミドDNAがく
る。下部のDNAのバンドをチユーブの横に注射
針をさしこんで採取しガラスチユーブに移す。エ
チジウムブロマイドを除去し、水層をTAF緩衝
液に透析する。プラスミドDNA溶液をRNアー
ゼ（RNase）処理し、等量の飽和フエノール溶
液で抽出する。水層をあらかじめ0.1％SDSを含
むTAF緩衝液（PH8.0）で平衡化したバイオゲル
（Biogel）Ａ−150に付す。DNAを洗い込み、活
性画分を取得する為に0.1％SDSを含むTAE緩衝
液で溶出する。分画液をエタノールで沈殿させ、
精製したプラスミドDNAを得る。 上記の方法により、精製pB2−７プラスミド
DNAが250μｇ、pB18プラスミドDNAが134μｇ
得られる。 工程３ （精製pB2−７とpR18プラスミドDNA
のニツクトランスレーシヨン） 工程２で得られる精製プラスミドDNA40μｇ
を制限酵素PstＩで消化分解し、次いで４％アク
リルアミドゲル電気泳動にかける。 電気泳動後、染色を行ない目的とするバンドを
切出してPstＩインサートを単離する。500ngの
該PstＩインサートを用いてテイー．マニアテイ
ス（T.Maniatis）らの方法〔プロク．ナトル．
アカド．サイ．（Proc.Natl.Acad.Sci.）、アメリ
カ合衆国、72巻、1184頁（1974年）〕に従つてニ
ツクトランスレーシヨンを行なつた。ニツクトラ
ンスレーシヨンは市販キツト（ビーアールエル
（BRL）社）を用いる。 25μの反応系中で放射化したdCTPを
80pmole用いる（400Ci／ｍ moleの場合）。 まず下記混合溶液を調製する。 2.5μ 溶液Ａ（dNTP溶液） 2.5μ 溶液Ｂ（500ngのDNA、すなわちPstＩ
インサート） 5μ 放射性dCTP（3200Ci／ｍ mole） 1.3μ dCTP（65pmole、50pmole／μ
dCTP） 11.2μ 溶液Ｅ（H2O） 計22.5μ この22.5μの溶液に、2.5μの溶液Ｃ（DNア
ーゼ（DNase）、DNAポリメラーゼ）を加
え、15℃60分反応させる。 次いで、溶液Ｄ（停止緩衝液）を加え、停止さ
せる。更に、キヤリアーtRNAを加えエタノール
沈澱を２回行ない、次いで500μの水に溶解す
る。 比活性は、9.3×107cpm／μｇDNAである。 工程２で得られる精製pR18を用いて、同様に
上記の方法に従つてニツクトランスレーシヨンを
行なう。比活性は７×107cpm／μｇDNAであ
る。 工程４ （pR18プラスミドDNAのRsa断片取
得） 80μｇのpR18プラスミドDNAを制限酵素Rsa
で消化し、４％アクリルアミドゲル電気泳動に
付す。下記の目的とするインサートのバンドを切
出しBNDカラムを用いて精製する。 約640bp 3.77μｇ （回収率52％） 約175bp 1.77μｇ （回収率50％） この約640bpのインサートをpR18の3′断片
（pR18の3′側の翻訳されない部分を意味する）、
約175bpのインサートをpR18−cfr（pR18のコー
ド部分）と命名する。 更に上記に於いてRsaの代わりにPstと
Mstを用いて消化して、約450bpの断片3.65μｇ
（回収率60％）を得る。このインサートはpR18の
5′断片と命名する。 工程５ （ヒト染色体TNF遺伝子の単離） 実施例１工程３で得られる32Pラベル化プラス
ミドpB2−７インサートをハイブリダイズ用プロ
ーブとして用い、シヤロン 4AのEcoＲ切断
サイト〔ブラツトナー（Blattner）らの方法、サ
イエンス（Science）、196巻、161頁（1977年）〕
にヒトDNAを部分消化しサイズ分画した断片
〔マニアテイス（Maniatis）ら、セル（Cell）、15
巻、687頁（1978年）〕を組込んで作成したバクテ
リオフアージ シヤロン 4A／ヒト染色体遺伝
子ライブラリーの106コのプラークをスクリーニ
ングする。その方法として〔ベントン（Benton）
及びデイビス（Davis）、サイエンス（Science）、
196巻、180頁（1977年）〕を用いる。 出発培養液中のバクテリオフアージの総てが、
該生理活性物質を作成する為に必要な遺伝子材料
を含んでいるとは限らないので、ウサギTNFの
遺伝子に相補的な配列を持つプローブを用いる。 目的とする遺伝子を含むフアージプラークは、
放射活性を有するプローブとハイブリダイズし、
その放射能活性により見つけることができる。こ
のようにして９つのハイブリダイズプラークが、
該ライブラリーから得られる。 方法と条件は次の通りである。 １ プラーク数：１×106プラーク（〜４×104プ
ラーク／φ150mmプレート×25） ２ ニトロセルロースフイルターへの転写：〔ベ
ントン（Benton）及びデイビス（Davis）、サ
イエンス（Science）、196巻、180頁（1977年）
参照〕 ３ ハイブリダイズ：1.25×10cpm／mlの実施例
１工程３で得たpB2−７インサートプローブの
添加、42℃、19.5時間 ４ 洗い：２×SSC−0.1％SDSを用いて室温で
10分間洗いを４回、続いて１×SSC−0.1％
SDSを用いて50℃で30分間洗いを２回 ５ 露光：VAR−５、−80℃、２枚の増感紙、39
時間 上記スクリーニングで12の候補株が得られる。
上述と同様の方法で二次スクリーニングを行ない
所望の断片を有する９個の株を得る。これらの株
を用いて上述と同様の方法で三次スクリーニング
を行ない所望の断片を有する９個の株を得る。こ
の９個の株について上述と同様の方法で４次スク
リーニングを行ない、９個の株が所望の断片を含
むことを確認する。所望の断片を含む９個のバク
テリオフアージを、それぞれHG1〜HG9と命名
する。 工程６ （ウサギ染色体TNF遺伝子の単離） 消化ヒトDNAの代りに消化ウサギDNA〔マニ
アテイス（Maniatis）ら、セル（Cell）、15巻、
687頁（1978年）〕を用いて調製した106個のバク
テリオフアージ シヤロン4A／ウサギ染色体遺
伝子ライブラリーのプラークを用いる以外は実施
例１工程５と実質的に同様の操作を行なう。6.7
×105個のバクテリオフアージ シヤロン4A／ウ
サギ染色体遺伝子ライブラリーのプラークを106
個のバクテリオフアージ シヤロン4A／ヒト染
色体遺伝子ライブラリーのプラークの代わりに用
いる。 ウサギ染色体遺伝子を含む２つのバクテリオフ
アージ（RG−１、RG−２）が得られる。 工程７ （ヒト遺伝子クローンのサザンブロツト
解析） 実施例１工程５で得られたHG−３、HG−６、
HG−７のバクテリオフアージを用いて、それぞ
れDNAを次の方法に従つて得る。 ６×1010個の大腸菌LE392（宿主）を18mlのSM
中に懸濁し、そこにバクテリオフアージHG−３
の３×109PFUを加え、37℃で20分間感染させ
る。次いで得られる混合液を３のNZブロスに
加え、37℃、23時間撹拌培養する。次いで60mlの
クロロホルムを該混合液に加えて30分間撹拌す
る。最終濃度1Mとなるように混合液中に塩化ナ
トリウムを加えた後15分間放置する。次いで遠心
操作を行なつて上清を得る。次いで得られる上清
に分子量約6000のポリエチレングリコールをポリ
エチレングリコールの濃度が10％（ｗ／ｖ）にな
るように加えて、４℃、22時間放置する。次いで
バクテリオフアージを遠心操作を行なつて採取す
る。得られるバクテリオフアージをSMの28mlに
懸濁し、次いでクロロホルムを等量加える。ボル
テツクスミキサーで30秒間混合した後、遠心して
水層を集め、その全量をSMで30mlにする。これ
に26.4ｇの塩化セシウムを加え、静かに溶解した
後、超遠心（45000rpm、20時間）でフアージの
バンドを採取する。10mM塩化ナトリウムと
10mM塩化マグネシウムを含む50mMトリス緩衝
液（PH8.0）に透析した後、それぞれの最終濃度
が20mM、50μｇ／ml、0.5％となるように
EDTA、プロテイナーゼＫ、SDS、を加えて65
℃で１時間処理する。次にフエノール、フエノー
ル：クロロホルム＝１：１（容積比）、クロロホル
ムで各１回ずつ抽出し、得られる水層を
1mMEDTAを含む10mMトリス緩衝液（PH8.0）
で透析する。この溶液の紫外線吸光度を測定する
と、バクテリオフアージHG−３の純粋なDNA
が得られることが確認される。 バクテリオフアージHG−３のDNAを調製す
るために用いられる方法と実質的に同じ方法を応
用することにより、バクテリオフアージHG−６
とHG−７のDNAを得る。 このようにしてHG−３、HG−６、HG−７の
DNAを各々2920μｇ、1100μｇ、819μｇを得る。
次いでサザーン（Southern）法〔イー．エム．
サザーン（E.M.Southern）、ジエイ．モル．バイ
オル．（J.Mol.Biol.）、98巻503頁（1975年）〕に
従つて、以下の実験条件でこれらのDNAのサザ
ンブロツテイングを行なう。 １ DNA： HG−３ 825ng HG−６ 935ng HG−７ 685ng ２ 各種制限酵素による分解： BamＨ 10単位、EcoＲ 10単位、 BamＨ 10単位＋EcoRI 10単位、 Hinｄ 10単位、 Hinｄ 10単位＋EcoRI 10単位、 Pvu 10単位 37℃ ３時間 ３ 電気泳動： 0.8％アガロースゲル TAE 20V、15.5時間 ４ ニトロセルロースフイルターへの転写： 〔イー．エム．サザーン（E.M.Southern）、ジ
エイ．モル．バイオル．（J.Mol.Biol.）、98巻
503頁（1975年）参照〕 ５ プロハイブリダイズ： 30ml FDSS 42℃ ６時間 ６ ハイブリダイズ： pR18の5′−断片（１×105cpm／ml、実施例１
工程４にて調製したもの）を含む42℃、14時間 ７ 洗い： ２×SSC−0.1％SDSを用いて室温で10分間洗
いを４回、続いて１×SSC−0.1％SDSを用い
て50℃で30分間洗いを２回 ８ 露光： XAR−５（イーストマン・コダツク社、米国）、
−80℃、２枚の増感紙 14時間ハイブリダイズの結果は、第４表に示
す。 【表】 ←は左と同じ断片がハイブリダイズし
たことを示す。
工程８ （ウサギ遺伝子クローンのサザンブロツ
ト解析） 実施例１工程７において、HG−３、HG−６、
HG−７のかわりにRG−１、RG−２のバクテリ
オフアージのそれぞれを用いる以外は、実質的に
同様の操作によつてサザンブロツト解析を行な
う。その結果、pR18の5′断片はRG−１および
RG−２をBamＨ、EcoＲ、Bgl、Hinｄ
およびBamＨ＋EcoＲのそれぞれで分解して
得られる断片の、単一バンドにハイブリダイズす
ることがわかる。 工程９ （ヒト染色体のTNF遺伝子を含むバク
テリアクローンの構築） 工程５において得られたHG−３のDNAを、
ランデイ（Landy）らの方法〔バイオケミストリ
ー（Biochemistry）、13巻2134頁（1974年）〕に
よつて得る。このHG−３のDNA33μｇをEcoＲ
の80単位によつて37℃で３時間分解する。分解
物は１％低融点アガロースゲル（条件：１×
TAE、20V、14.5時間）にて電気泳動する。２・
9kbのバンドをアガロースゲルより、テイー．マ
ニアテイス（T.Maniatis）〔モレキユラー クロ
ーニング（Molecular Cloning）、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー（Cold
Spring Harbor Laboratory）、377頁（1982年）〕
の方法で単離する。詳しくは、2.9kbのバンド部
位を切り出したゲルを65℃で15分間加熱する。さ
らに、この2.9kbの長さを持つEcoＲ分解HG−
３断片（以降、これを「HG−３／EcoＲ
2.9kb断片」と略することが多い）を、溶けたゲ
ルよりフエノールで３回、他の抽出溶媒で３回抽
出、酢酸アンモニウムを含むエタノールで沈澱し
て回収する。このようにして、637μｇ（収率約
30％）のHG−３／EcoＲ 2.9kb断片を得る。 上記断片255ngとEcoＲ分解pUC13〔ジエイ．
メツシング（J.Messing）、メソツズ イン エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology）、
101巻20頁（1983年）〕を、2.5単位のT4リガーゼ
を用いて結合する。 大腸菌K12JM83株を上で得られる結合生成物
を用いて形質転換する。詳しくは、大腸菌
K12JM83株をLB培地中で、培養ブロスの550nm
における吸光度が0.3になるまで培養する。50ml
の増殖した大腸菌K12、JM83株を集め、25mlの
10mM MOPS（PH7.0）−10mM RbClで洗い、25
mlの0.1M MOPS（PH6.5）−50mM CaCl2−10mM
RbCl中に懸濁する。この懸濁液203μに、10ng
の上記結合生成物を含む10μの水溶液を加え
る。この混合物を氷中にて30分間冷却し、40℃で
60秒間加熱する。その後すぐに、あらかじめ37℃
にしておいたLBブロス５mlに、加熱した混合物
を加え、37℃で１時間培養する。得られる培養ブ
ロスを遠心し上清を除去する。遠沈した細胞に
LB培地を加えて、30μｇ／mlのアンピシリンと
40μｇ／mlのｘ−galを含むLBプレートに植菌す
る。インサートを含むプラスミドが導入された大
腸菌K12 JM83株のコロニーは白色であるが、プ
ラスミドのみが導入された株のコロニーは青色で
ある。得られる白色コロニーは再び、30μｇ／ml
のアンピシリンと40μｇ／mlのｘ−galを含むLB
プレートに確認のため植菌する。 上で得られる白色コロニーより、10個のコロニ
ー（バイテリアルクローン）を選び、迅速法を用
いてスクリーニングする。 詳しくは、それぞれのコロニーを30μｇ／mlの
アンピシリンを含むLB培地で一晩培養する。増
殖した細胞を集め、２mg／mlリゾチーム−50mM
グルコース−10mM EDTA−25mM Tris HCl
（PH8.0）を含有する溶液中に懸濁する。この懸濁
液を室温で５分間おき、これに200μの0.2N
NaOH−１％SDSを加える。ゆつくり撹拌した
のち、この懸濁液を２分間室温におく。続いて、
150μの3M酢酸ナトリウム（PH5.2）を加え、10
分間−20℃におき、15分間遠心してその上清を得
る。この上清に900μの冷エタノールを加え、
５分間遠心してその沈澱を得る。得られる沈澱を
70％エタノールで洗い乾燥してプラスミドDNA
を得る。この方法を用いて10個のプラスミドを得
る。 それぞれのプラスミドDNAを、10mM Tris−
0.1mM EDTA（PH8.0）に溶かし、EcoＲで消
化し、制限酵素消化のために電気泳動に供する。
消化と電気泳動の条件は以下の通りである。 消化：プラスミドDNA溶液＝上で得られたもの
の５分の１量、３単位のEcoＲ、37℃、1.5時間 電気泳動：１％アガロースゲル、１×TAE、
120V、２時間 上記の制限酵素解析によつて、10個のクローン
のうち８種が目的のものであることが示される。
すなわち、この８種のクローンは2.9kbの断片を
持つている。８種の目的のクローンのうち、１つ
を選び大腸菌K12JM83（pHGE）株と命名する。
なお、この大腸菌K12JM83（pHGE）株は、ブタ
ペスト条約に基いてATCC39656の寄託番号で
ATCCに寄託されている。 続いて、pB2−７とpR18を有する大腸菌のか
わりに大腸菌K12のJM83（pHGE）株を用いる以
外は工程２と同じ操作によつて、１・89mgの
pHGE DNAを得る。 工程10 （EcoＲ分解RG−１のサブクローニ
ング） 工程６において得られる30μｇのRG−１をEco
Ｒにより消化する。得られる各種断片の混合物
より、上記各種断片の混合物と0.8％の低融点ア
ガロースゲルを用いる以外は工程９と実質的に同
じ操作によつて、約3.5kbの長さを持つ断片を回
収し、1.0μｇのEcoＲ分解RG−１断片
（3.5kb）を得る。この断片とEcoＲで消化した
pUC13を、EcoＲ分解HG−３断片（2.9kb）の
かわりに上記EcoＲ分解断片（3.5kb）を用い
る以外は工程９と実質的に同じ操作によつて、連
結する。 大腸菌K12JM83株への形質転換、バクテリア
クローンのスクリーニング クローンDNAの分
解と電気泳動は、上記結合DNA断片を用いる以
外は上記工程９と実質的に同じ操作によつて行な
う。得られるクローンは大腸菌K12JM83
（pRGE）株と命名する。なお、この大腸菌
K12JM83（pRGE）株は、ブタペスト条約に基い
てATCC39655の寄託番号でATCCに寄託されて
いる。 続いて、大腸菌K12JM83（pRGE）株をpB2−
７とpR−18のかわりに用いる以外は工程２と実
質的に同じ操作によつて、pRGE DNAを1.70mg
調製する。 工程11 （pHGEプラスミドDNAの制限酵素解
析） 工程９で得られるpHGE DNAの制限酵素解析
を、マニアテイス（Maniatis）の方法〔モレキ
ユラー クローニング（Molecular Cloning）、
コールド スプリング ハーバー ラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory）、98頁
（1982）〕によつて行なう。 その方法と条件は以下の通りである。 １ EcoＲによるpHGE DNAの分解：18.6μｇ
のpHGE、64単位のEcoＲ、37℃ ２時間 ２ エタノール沈殿：沈殿物 ３ 溶解：EcoＲ分解pHGEが1μｇ／mlの溶液
になるように蒸留水を加える。 ４ 各種制限酵素による消化：1μｇの上記EcoＲ
分解pHGE、制限酵素：５単位のPvu、５
単位のPvu＋10単位のRsa、10単位のRsa
、４単位のMst、３単位Ava、９単位の
Pst、37℃、２時間 ５ 電気泳動：２％アガロースゲル、１×
TAE28V、14.5時間 ６ ニトロセルロースフイルターへの転写：〔イ
ー．エム．サザーン（E.M.Southern）、ジエ
イ・モル・バイオル（J.Mol.Biol.）、98巻503
頁（1975年）参照〕 ７ 第一回プレハイブリダイズ：30mlFDSS、42
℃、６時間 ８ 第一回ハイブリダイズ：pR18の5′断片（工
程４で得られるもの、５×104cpm／ml）42℃、
14時間 ９ 洗い：２×SSC−0.1％SDSを用いて室温で
10分間洗いを４回、続いて１×SSC−0.1％
SDSを用いて50℃で30分間洗いを２回 10 露光：XAR−５（イーストマン・コダツク
社、米国）、−80℃、２枚の増感紙、17.5時間 11 洗い：0.5M NaOH−1.5M NaClで１分間、
0.5Mトリス（Tris）−1.5M NaClで１分間、３
×SSCで１分間 12 露光：露光時間を19時間とする以外は、上記
10と同じ操作 13 第２回プレハイブリダイズ：７と同じ操作 14 第２回ハイブリダイズ：pB2−７インサート
（工程３で得られるもの）、42℃、16.5時間 15 洗い：９と同じ操作 16 露光：露光時間を19.5時間とした以外は、上
記10と同じ操作 17 洗い：11と同じ操作 18 露光：露光時間を20時間とした以外は、上記
10と同じ操作 19 第３回プレハイブリダイズ：７と同じ操作 20 第３回ハイブリダイズ：pR18の3′断片（工
程４で得られるもの、4.5×105cpm／ml）、42
℃、15時間 21 洗い：９と同じ操作 22 露光：10と同じ操作 制限酵素地図解析の結果を第４図に示す。 工程12 （pRGEプラスミドDNAの制限酵素解
析） pHGEプラスミドDNAのかわりにpRGEプラ
スミドDNAを用いる以外は工程11と実質的に同
じ方法により工程10で得られるpRGEプラスミド
DNAの制限酵素解析を行なう。得られるpRGE
DNAインサートの制限酵素地図を第５図に示す。 工程13 （ウサギTNF遺伝子とヒトTNF遺伝子
の塩基配列の決定） 工程９で得られる大腸菌K12JM83（pHGE）株
と工程10で得られる大腸菌K12JM83（pRGE）株
をpB2−７を有する大腸菌K12MC1061株とpR18
を有する大腸菌K12MC1061株の代わりに用いる
以外は前記工程２と実質的に同じ操作を行なう。
そして、それぞれ150μｇのpRGEプラスミド
DNAとpHGEプラスミドDNAを得る。 pRGEとpHGEの塩基配列はマクサム−ギルバ
ート（Maxam−Gilbert）法〔マクサム
（Maxam）ら、メソツズ イン エンザイモロ
ジー（Methods in Enzymology）55巻490頁
（1980年）アカデミツク プレス（Academic
Press）〕によつて決定する。 参考例３で決定したpR−18の塩基配列と、上
で決定したpRGEの塩基配列を比較して、ウサギ
TNF遺伝子の構造（エクソンとイントロンを含
む）を解明する。pRGE DNAインサートの構造
は第５図に示す。続いて、pRGEとpHGEの塩基
配列を比較して、類似性とイントロン・エクソン
境界付近の相同配列を調べる。このようにしてヒ
トTNF遺伝子の構造（エクソンとイントロンを
含む）を解明する。ヒトTNF遺伝子の構造を第
４図に示す。 このようにして得られるウサギTNFとヒト
TNFをコードする塩基配列を下に示す。この塩
基配列において、上の行はウサギTNFをコード
する塩基配列（Ｒ）を、下の行はヒトTNFをコ
ードする塩基配列（Ｈ）を示す。 【表】 工程14 （オリゴデオキシヌクレオチドの合成） コハク酸残基を介して2.0μMのデオキシヌクレ
オシドが結合しているポリスチレン樹脂20mgを、
上下にステンレススチール製のフイルターのつい
た500μ容量の反応容器に装填する。樹脂は1M
臭化亜鉛ジクロルメタン−イソプロパノール溶液
（85：15）で処理してジメトキシトリチル
（DMT）保護基を除き、ジクロルメタン−イソ
プロパノール（85：15）、次いでジメチルフオル
ムアミド、ピリジン、更にアセトニトリルで洗浄
し、窒素気流で乾燥する。次いでDMT−ヌクレ
オチド（20μM）および、メシチレンスルフオニ
ルニトロトリアゾール（60μM）の乾燥ピリジン
溶液200μを加える。45℃で20分間反応せしめ
た後、反応液を除去し、乾燥ピリジンで樹脂を洗
浄後、ピリジン中の無水酢酸で未反応の残基を保
護する。この、脱保護及び縮合のサイクルを繰り
返して、所望のオリゴデオキシヌクレオチドが樹
脂上に合成される。次に樹脂をとり出し、オリゴ
ヌクレオチドを樹脂から分離して、精製を行う。
上記のオリゴデオキシヌクレオチドの合成および
精製は伊東ら〔Nuc.Ac.Res.10巻、1755頁
（1982）〕の方法に従つて実施する。このようにし
て下記の如きオリゴデオキシヌクレオチドが得ら
れる。 １ 5′−
AATTCATGTCATCTTCTCGAACCCCGA
ＧＴＧＡＣＡＡ−3′ ２ 3′−
GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCTCACT
ＧＴＴＣＧＧ−5′ ３ 5′−
GCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCC
ＴＣＡＡＧＣ−3′ ４ 3′−
ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGT
ＴＣＧＡＣＴ−5′ 工程15 （ヒトTNFのミニ遺伝子を含む
M13mp9−HGEの調製） プラスミドpHGE（10μｇ）をEcoＲ（20単
位）で消化し、１％の低融点アガロースゲル電気
泳動の後、2.9kbのフラグメントを切出し溶出す
る。このフラグメントはM13mp9フアージの複製
型のEcoＲフラグメント中へ挿入する。EcoＲ
フラグメントを挿入されたDNAはBRL社の手
引書（〔ユーザー マニユアル（User
Manual）／M13mp7クローニング
（Cloning）／’デイデオキシ（Dideoxy）’シー
ケンシング（Sequencing）、1980年〕）に従い、
大腸菌JM103（E.coli K12 JM103，New
England BioLabs製−NEW ENGLAND
BioLabs CATALOG 1981−1982所載）を形質
転換する生成物をM13mp9−HGEと命名する。 工程16 （M13mp9−HGE一重鎖DNAとデリー
ターE3−４を用いるイントロン３の除去） M13mp9−HGE一重鎖DNAはBRL社の手引書
（ユーザー マニユアル（User Manual）／
M13mpクローニング（Cloning）／’デイデオキ
シ（Dideoxy）’シーケンシング
（Sequencing）、1980年〕に従つて調製される。 工程14で調製されたオリゴデオキシヌクレオチ
ド４）3′−
ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTT
ＣＧＡＣＴ−5′がイントロン３のデリーターとして
用いられる。イントロン３のデリーターは“E3
−４”と命名する。 デリーターE3−４は、除去されるべきイント
ロン３の前方（即ちエクソン３）、及び後方（即
ちエクソン４）に対し相補的な配列を有してい
る。イントロン３の除去はウオーレス
（Wallace）らの方法〔サイエンス（Science）
209巻1396頁（1980年）〕に従い、次の如く行う。 E3−４（164ng、15pmole）は、T4キナーゼお
よびATP（3mM）を用いてリン酸化され、鋳型
M13mp9−HGE（1.65μｇ、0.5pmole）に加えら
れる。反応混合物は65℃に加熱し、５分間室温に
冷却し、更に氷水中で冷却する。各0.4mMの
dATP、dCTP、dGTP、dTTPおよびATP溶液
に対し、クレノーフラグメント
（Klenowfragment）５単位、T4リガーゼ10単位
を含むヒン（Hin）緩衝液〔ウオーレス
（Wallace）ら、ヌク．アク．レス．（Nuc.Ac.
Res.）、９巻、3647頁（1981年）〕、即ち10mMト
リス−塩酸（PH7.2）、2mM塩化マグネシウム及
び1mMβ−メルカプトエタノールを含む液、を加
える。反応混合物（最終容量50μ）は４℃で30
分間及び室温で30分間、インキユベートする。オ
リゴヌクレオチドをプライマーとして二重鎖合成
されたDNAはBRL社の手引書（〔ユーザー マ
ニユアル（User Manual）／M13mpクローニン
グ（Cloning）／’デイデオキシ（Dideoxy）’
シーケンシング（Sequencing）、1980年〕）に従
つて、大腸菌JM103株に感染せしめる。このよう
にして得られるプラークは、YTプレート〔ジエ
イ．エイチ．ミラー（J.H.Miller）、エクスペリ
メンツ イン モレキユラー ジエネテイツクス
（Experiments in Molecular Genetics）、コール
ド スプリング ハーバー ラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory）（1972年）
433頁〕に移す。得られるコロニーは、32Pで標識
されたE3−４と55℃２時間の条件でハイブリダ
イズされる。イントロン除去工程の結果得られる
各種生成物の内から、所望の配列を有するDNA
を得るためのプローブとして、ここでは、デリー
ターE3−４それ自身を利用する。かくしてデリ
ーターE3−４とハイブリダイズするコロニーを
得、更にフアージを取得する。 得られるフアージをプレートにまき、得られる
プラークをYTプレートに移す。ここで再び32P
で放射ラベルしたE3−４と55℃２時間の条件で
ハイブリダイズせしめる。強くハイブリダイズす
るクローンから、フアージDNAを取得し、塩基
配列を解析し、イントロン３が完全に除去されて
いるフアージを選別する。このようなフアージの
１つをmp9−HGE△３−１と命名する。 工程17 （pHTNF−lacUV5−２の構築） mp9−HGE△３−１の複製型をEcoＲで消化
し、電気泳動により単離する。この断片をEcoＲ
で切断したpBR327に挿入し、プラスミド
pHGE△３−１を得る。 次にプラスミドpHGE△３−１を用い、lac
UV5をプロモーターとしてTNFを大腸菌中で、
直接発現させることのできるプラスミドを構築す
る。この構築方法は第７図に示される。 まず10μｇのプラスミドpHGE△３−１を10単
位のAvaとEcoＲ（BRL社、米国）で37℃２
時間消化し、４重量％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により目的フラグメントを単離する。約
1μｇの断片が電気泳動溶出によりゲルから回収
される。工程14と同じように第７図に示される２
種のオリゴデオキシヌクレオチド即ち5′−
AATTCATGTCATCTTCTCGAACC−3′及び
5′−TCGGGGTTCGAGAAGATGACATG−
3′を合成する。次いで文献(3)122頁の方法に従い
この２本のオリゴヌクレオチド（約100pmole）
の5′端をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリ
ン酸化する。反応後、フエノールで次いでクロロ
ホルムで抽出する。かくして得られる合成オリゴ
マーと、上記で得られるpHGE△３−１のAva
−EcoＲ断片0.5μｇとを混合し、エタノール沈
澱した後、文献(1)37頁の方法に従つて10単位の
T4リガーゼを用い４℃一夜で結合せしめる。反
応終了後、混合物はエタノール沈澱し、４重量％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により目的断片
を単離する。 プラスミドpOP95−15はエフ．フラー（F.
Fuller）の方法〔ジーン（Gene）19巻、42−54
頁（1982年）〕により調製する。 pOP95−15の1μｇをEcoＲで消化してフエノ
ール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈澱を
して調製したベクター0.5μｇと、上記の如く得た
断片を、T4DNAリガーゼを用いて結合する。実
験書(4)、20頁に従つて、得られるベクターで大腸
菌JM101株（ATCC33876）を形質転換して1mM
IPTG及び0.004％（ｗ／ｖ）ｘ−galを含む寒天
培地上に約100個の白色コロニーを得る。 これらの形質転換体からプラスミドDNAを調
製し、EcoＲで消化し、目的のEcoＲ断片を
有するプラスミドを同定する。更にDNAの挿入
の方向を調べるためにこれらのプラスミドをPvu
とPst消化して1.5重量％アガロースゲル電気
泳動を行つた結果約1080bp及び約2600bpの断片
を有し、lacUV5プロモーターの下流に正しく
TNFをコードするDNAが接続されているプラス
ミドを選別する。 塩基配列を決定すると、２コのプラスミドは同
じ塩基配列を有し、合成オリゴヌクレオチド及び
染色体由来のDNAが正しく接続されていること
が示される。得られるプラスミドをpHTNF−
lacUV5−２と命名する。 pHTNF−lacUV5−２を含有する上記大腸菌
を、前述のLB培地等の栄養培地で培養する。生
成物のTNF活性を測定すると、lacプロモーター
によつて制御されるウサギTNF遺伝子を有する
pTNF−lacUV5−１を含有する大腸菌の生産物
とほとんど同様の活性を示す。 実施例 ２ 実施例１における工程１から14に従つて調製さ
れるプラスミドpHGEとオリゴヌクレオチド１
−４を用いて、pHTNF−lacUV5−１を調製す
る。その調製方法を第６図に示す。 本発明の一部を構成する新規な微生物および培
養細胞はヒトTNFを産生する能力があるために
重要であり新規であることが理解されよう。従つ
て、以上の記載に従つて調製される形質転換微生
物および培養細胞に加えて、本発明は更に、
TNF産生において強い活性を示すようなそれら
の変異株や突然変異体をも包含するものである。 微生物及び新規プラスミドは、該プラスミドを
含有する微生物の試料を寄託することにより、ア
メリカ合衆国、メリーランド、ロツクビル
（Rock−ville、Maryland、U.S.A）のアメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（American Type Culture Collection）に1984
年４月６日付で寄託されている。微生物大腸菌Ｋ
−12JM83（pRGE）株にはATCC寄託番号第
39655号が、大腸菌Ｋ−12JM83（pHGE）株には
ATCC寄託番号第39656号が与えられている。 以上本発明について述べたように、本発明は
様々な方法で達成することができる。そのような
変化は本発明の精神と範囲からはずれるものと見
なすべきではなく、当業者にとつて明らかである
そのような全ての変化は本願の特許請求の範囲に
含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は従来のウサギ生理活性ポリペプチドを
コードするDNAを各々含有するプラスミドイン
サートの制限酵素地図である。第２図は従来のウ
サギ生理活性ポリペプチドをコードする組換
DNA（pTNF−lac−１）の調製方法を示すフロ
ーシートである。第３図は従来のウサギ生理活性
ポリペプチドをコードするもう一つの組換DNA
（pTNF−lacUV5−１）の調製方法を示すフロー
シートである。第４図は本発明のヒト生理活性ポ
リペプチドの遺伝子を含有するプラスミドの一部
分の制限酵素地図である。第５図は従来のウサギ
生理活性ポリペプチドの遺伝子を含有するプラス
ミドの一部分の制限酵素地図である。第６図は本
発明のヒト生理活性ポリペプチドをコードする組
換DNA（pHTNF−lacUV5−１）の調製方法を
示すフローシートである。第７図は本発明のヒト
生理活性ポリペプチドをコードするもう一つの組
換DNA（pHTNF−lacUV5−２）の調製方法を
示すフローシートである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 次式（） Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys
    Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln
    Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
    Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val
    Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro
    Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
    Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser
    Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
    Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val
    Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys
    Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
    Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly
    Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg
    Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr
    Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr
    Phe Gly Ile Ile Ala Leu （式中、Glnはグルタミン残基、Aspはアスパ
    ラギン酸残基、Proはプロリン残基、Tyrはチロ
    シン残基、Valはバリン残基、Lysはリジン残基、
    Gluはグルタミン酸残基、Alaはアラニン残基、
    Asnはアスパラギン残基、Leuはロイシン残基、
    Pheはフエニルアラニン残基、Glyはグルシン残
    基、Hisはヒスチジン残基、Serはセリン残基、
    Thrはスレオニン残基、Ileはイソロイシン残基、
    Trpはトリプトフアン残基、Argはアルギニン残
    基、Metはメチオニン残基及びCysはシステイン
    残基を表わす） で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト生理活
    性ポリペプチド。 ２ 次式（） Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys
    Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln
    Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
    Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val
    Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro
    Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
    Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser
    Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
    Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val
    Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys
    Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
    Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly
    Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg
    Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr
    Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr
    Phe Gly Ile Ile Ala Leu （式中、Glnはグルタミン残基、Aspはアスパ
    ラギン酸残基、Proはプロリン残基、Tyrはチロ
    シン残基、Valはバリン残基、Lysはリジン残基、
    Gluはグルタミン酸残基、Alaはアラニン残基、
    Asnはアスパラギン残基、Leuはロイシン残基、
    Pheはフエニルアラニン残基、Glyはグルシン残
    基、Hisはヒスチジン残基、Serはセリン残基、
    Thrはスレオニン残基、Ileはイソロイシン残基、
    Trpはトリプトフアン残基、Argはアルギニン残
    基、Metはメチオニン残基及びCysはシステイン
    残基を表わす） で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト生理活
    性ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を
    複製可能な発現ベクターに連結して該デオキシリ
    ボ核酸と該複製可能な発現ベクターとを含有する
    複製可能な組換DNAを得、 (b) 該複製可能な組換DNAで微生物を形質転換
    させて、形質転換体を形成せしめ、 (c) 該形質転換体を該微生物の親細胞から選別
    し、 (d) 該形質転換体を培養して、該形質転換体に該
    デオキシリボ核酸を発現させてヒト生理活性ポ
    リペプチドを産生せしめ、そして (e) 該ヒト生理活性ポリペプチドを培養した形質
    転換体から単離する ことを含む上記式（）で表わされるアミノ酸配
    列を含有するヒト生理活性ポリペプチドの製造方
    法。
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