JPS62135493A - ガン壊死因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明はガン壊死因子に関する。

〔従来技術〕

Ｃａｒｓｗｅｌｌらは、あらかじめｂａｃｉｌｌｕｓ　
Ｃａ１ｍｅｔｔｅＧｕ≦ｒｉｎ（ＢＣＧ）に怒染させ、
ついでエンドトキシンで処理したマウスの血清中には、
移植したＭｅｔｈＡ肉腫によるガンを壊死させる物質が
含まれていることを見出し、この物質をガン壊死因子と
名付けた〔プロシーディンゲス　イン　ナショナル　ア
カデミ−イン　サイエンス　Ｕ、　　Ｓ。

Ａ、７２．３６６６（１９７５））。

ガン壊死因子はマクロファージから放出される生理活性
物質と考えられており、その特徴としては（ｉ）担癌動
物に投与すると、ある種のガンを壊死させ治癒せしめる
こと、（ｉｉ　）　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　　である種のガ
ン細胞（例えばマウスのガン細胞であるし細胞、ヒトガ
ン由来のＡ−５４９細胞）を傷害するが、正常細胞には
ほとんど有害な作用をおよぼさないこと、（ｉｉｉ　）
その作用が種特異的でないことが知られている。

このような特徴のためガン壊死因子は、新しいタイプの
制癌剤としてその￥Ｉｎ床的床用応用待されている。

〔本発明の構成および効果〕

本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、マウスマクロファ
ージセルラインＪ７７４．１から遺伝子組み換え手法に
よりガン細胞傷害活性を有する新規なガン壊死因子を得
ることに成功し、本発明を完成したものである。

すなわち、本発明はアミノ酸配列 Ｒ−Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ
　　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　旧ｓ　　Ｖａｌ　　ＶａｌＡ
ｌａ　Ａｓｎ　ｌ１ｉｓ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇ
ｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＴｒｐＬｅｕ　Ｓｅｒ
　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　
Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＡｓｎＧｌｙ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｌｅ
ｕ　Ｌｙｓ　Ａ’ｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｖａ
ｌ　ＶａｌＰｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　
Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＧｌｎＶａ
ｌ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ
　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　ＴｙｒＶａｌ　　Ｌｅｕ　
　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　
　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ　　Ａｌａｌｌｅ　Ｓｅ
ｒ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ
　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　５ｅｒＡｌａ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｓ
ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈ
ｒ　Ｐｒ。

Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐ
ｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒ。

１１ｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐ
ｈｅ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＧｌｙ　　Ａｓ
ｐ　　Ｇｉｎ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｇｌ
ｕ　　Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇ
ｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　ＶａｔＴｙｒ　Ｐｈｅ
　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ（但し、Ｒ
は１６以下のアミノ酸からなるペプチドを表す。） で示されるガン壊死因子である。

上記アミノ酸配列においてＲで示されるペプチドとして
は例えば５ｅｒ−５ｅｒ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎｓ　
Ｍｅｔ−３ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｇｉｎ−Ａｓｎまた
はＭｅｔ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ　
−５ｅｒ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｖａ　Ｉ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉ
ｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌｕなどのアミノ
酸配列で示されるペプチドがあげられる。

本発明のガン壊死因子はつぎのようにして製することが
できる。

（１）ガン壊　因子ｍＲＮＡの調製 ガン細胞傷害活性物質ｍＲＮＡを得るには、まずマウス
由来マクロファージ細胞株ＪＴ１４．１〔ジャーナル　
イン　イムノロジー、月４．８９８（１９７５”）　）
を通常の細胞培養に際し用いられる方法により培地中で
培養して増殖させる。

培養は例えば培地中、細胞密度が０．５〜５×１０　’
　ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように接種し、約３０〜４０
℃でスピナーカルチャーを行うことにより実施できる。

培地としてはたとえばＲＰＭＩ−１６４０培地〔ジャー
ナル　イン　アメリカン　メディカル　アソシエーショ
ン、■、５１９　　（１９６７）　）、タルベソコ改変
イーグル培地〔ピロロシイ、１２．１８５　　（１９６
０）　）　、ハム培地〔エクスペリメンタル　セル　リ
サーチ、益、５１５　（１９６３））などをもちいるこ
とができる。また培地には動物血清（例えば牛胎児血清
など）や抗生物質（例えばカナマイシン、ペニシリン、
ストレプトマイシンなど）を適宜添加することにより好
結果をえることが出来、その添加量は動物血清であれば
通常約２〜２０％、抗生物質であれば通常約０．０５〜
１　ｍｇ／ｍ＋が適当である。

ついで増殖したマウス由来マクロファージ細胞を集め新
鮮培地にけん濁した液中に、または該細胞培養液にエン
ドトキシンもしくは網内系賦活物質を加えて培養する。

エンドトキシンとしてはたとえば大腸菌、ネズミ腸チフ
ス菌、霊菌由来のりポボリサソカライドがあげられ、網
内系賦活物質としては酵母由来の水溶性ペプチドグルコ
マンナンＳＰＣＭ−１（特公昭５４−７８７８号）があ
げられ、これらの濃度は最終濃度として約０．１〜１０
０μｇ／ｍｌとなるように加えるのが好ましい。培養は
約３０〜４０°Ｃで約４〜１２時間行うのが適当である
。

培養終了後、培養液を遠心し細胞を集め、該細胞中から
全ＲＮＡを抽出する。

ＲＮＡの抽出は常法、例えばＣｈｉｒｇｗｉｎらの方法
〔バイオケミオリ−１■、５２９４　（１９７９）　）
にしたがってグアニジンイソシアネート溶液中で細胞を
破砕し、この細胞破砕液を遠心チューブ中の５．７Ｍ塩
化セシウム溶液上に重層した後、遠心分離してＲＮＡを
沈澱させることにより実施できる。

得られた全ＲＮＡからのガン壊死因子のｍ　ＲＮＡの採
取は常法に従って全ＲＮＡを精製することにより行うこ
とが出来る。

例えば全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースまたはポリ
　（Ｕ）セファロースなどを用いる吸着カラムクロマト
グラフィー処理またはバッチ処理によりポリ　（Ａ）Ｒ
ＮＡ画分を分離し、このポリ　（Ａ）ＲＮＡ画分をショ
糖密度勾配遠心分離法または酸性尿素アガロースゲル電
気泳動で処理することによりガン壊死因子ｍＲＮＡを濃
縮精製することができる。

オリゴ（ｄＴ）セルロースまたはポリ　（Ｕ）セファロ
ースなどを用いる吸着カラムクロマトグラフィー処理、
バッチ処理あるいはショ糖密度勾配遠心分離法、酸性尿
素アガロースゲル電気泳動処理はいずれも常法により実
施することが出来る。

（２）ガン壊死因子ｃＤＮＡのクローニング上記（１）
の工程で得たｍＲＮＡを鋳型とし、オカヤマとバーブの
方法〔モレキュラー　アンドセルラー　バイオロジー、
１．１６１　（１９８２））　、またはグブラーとホフ
マンの方法〔ジーン、剣、２６３　（１９８３）３等に
よりｃＤＮＡライブラリーを作成することができる。例
えば、ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴ（ｄＴ）をブライマ
ーとして、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰＳｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの
存在下で逆転写酵素（例えば、トリ骨髄性白血病ウィル
ス由来の逆転写酵素など）によりｍＲＮＡと相補的な第
１鎖ｃＤＮＡを合成する。

ついで、この第１鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、大腸菌由来Ｒ
ＮａｓｅＨでｍＲＮＡを分解除去しつつ大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼ■と大腸菌ＤＮＡリガーゼを用いて第２鎖ｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａを合成し、二本ＳＡＤ　ＮＡを得る。この
二本鎖ｃＤＮＡにｄＧＴＰ存在下でターミナルトランス
フェラーゼを作用させ、ポリ　（ｄ　Ｇ）ホモポリマー
テールを付加する。これとは別にプラスミドｐＢＲ３２
２を制限酵素Ｅｃ。

ＲＶで開裂させ、ｄＣＴＰ存在下でターミナルトランス
フェラーゼによりポリ　（ｄ　Ｃ）ホモポリマーテール
を付加する。このように操作したｃ　Ｄ　ＮＡとプラス
ミドｐＢＲ３２２のＤＮＡを混合しアニールさせた後、
例えば、モリソンの方法〔メソッド　イン　エンザイモ
ロジー、並、３２６　（１９７９）〕に準じて宿主細胞
〔例えばＥ、　ｃｏｌｉχ１７７６（ＡＴＣＣ３１２４
４）など〕に導入して形質転換させ、選択（Ｅ、　ｃｏ
ｌｉχ１７７６株であれば、アンピシリン耐性の株を選
択）することによりｃＤＮＡライブラリーを作製できる
。

このｃＤＮＡライブラリーについてプラス・マイナス法
によるコロニーハイブリダイゼーション試験〔ジーン、
迎、６３（１９８０））を行い、目的のクローンをスク
リーニングする。すなわち、ｍ　ＲＮＡを鋳型として３
２ｐ標識ｃＤＮＡを合成し、誘導プラスプローブとする
。このとき、誘導プラスプローブとして網内系賦活物質
と千オウリジンの存在下に培養したマウス由来マクロフ
ァージ細胞株の細胞からｍＲＮＡを抽出・濃縮して、吸
着クロマドグラフィーによりチオウリジン含有ｍＲＮＡ
を精製し、このｍＲＮＡを鋳型としてｆｆ２ｐ標識ＣＤ
　Ｎ　Ａを合成したものをもちいてもよい。

これとは別に、網内系■１（活物質の非存在下に培養し
たマウス由来マクロファージ細胞株Ｊ７７４．１の細胞
から抽出・濃縮したｍＲＮＡを鋳型として３２ｐ標識ｃ
ＤＮＡを合成し、誘導マイナスプローブとする。コロニ
ーハイブリダイゼーション法により前記のｃＤＮＡライ
ブラリーから、誘導プラスプローブと強く結合し誘導マ
イナスプローブとは殆ど結合しないクローンを選択する
。

かくして得たクローンからプラスミドＤＮＡを分離し、
加熱またはアルカリ変性により一本ｕｉｃＤＮＡとし、
ニトロセルロースフィルターに固定する。これにガン壊
死因子ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ画分を加えハイブリダイ
ズさせる。ついで、結合したｍＲＮＡを溶出回収してア
フリカッメガエルの卵母細胞に注入しガン壊死因子を生
産するかどうかを試験する（ハイブリダイゼーション・
トランスレーション試験）。

以上の方法によりガン壊死因子のｍＲＮＡと相補性のあ
る塩基配列を含むＤＮＡ断片を組み込んだクローン化Ｄ
ＮＡプラスミドを含む形質転換株を得ることができる。

更に、この形質転換株のクローン化ＤＮＡ断片を適当な
制限酵素で切り出し、３Ｚｐで標識したものをプローブ
として用い、前記のｃＤＮＡライブラリーを再スクリー
ニングすることにより、より大きなサイズのｃＤＮＡを
選択することも出来る。

か（して得られたクローン化ＣＤＮＡ断片について、メ
ッシングらの方法〔ヌクレイツクアシッド　リサーチ、
主、３０９　（１９８１））またはマキサムらの方法〔
メソッド　イン　エンザイモロジー、並、４９９　（１
９８０））によって塩基配列を解析し、ガン壊死因子の
Ｎ末端部分のアミノ酸配列をコードする塩基配列を求め
、最終的にガン壊死因子の全翻訳領域に対応する塩基配
列を含むｃＤＮＡを選択することにより、ガン壊死因子
のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するクローン
化ｃＤＮＡを得ることができる。

（３）ガン壊死因子ｃＤＮＡの形質発現上記（２）で得
たガン壊死因子のクローン化ＣＤＮＡを用いてガン壊死
因子を生産するには、先ず、クローン化ｃＤＮＡ実質的
な配列を適当な形質発現ベクターに組み込みガン壊死因
子生産用の組み換えＤＮＡ分子を作製する。ついでこの
組み換えＤＮＡ分子を適当な宿主細胞に４人して形質転
換し形質転換株を得る。この形質転換株を培地中で培養
することによりガン壊死因子を含有する培養組成物を得
ることができる。

本発明によればクローン化したガン壊死因子ＣＤＮＡの
実質的な塩基配列を形質発現させるについては広範囲の
原核生物、真核生物もしくは多細胞生物由来の培養細胞
の宿主細胞と形質発現ベクターの組み合わせを採用する
ことができる。

宿主細胞として原核生物を用いる場合には、例えばＥ、
　ｃｏｌｉＫ　１２株に属するＥ、ｃｏｌｉＺ　１７７
６株（ＡＴＣＣ３１２４４）　、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　Ｍ
Ｍ　２９４株（ＡＴＣＣ３３６２５）　、Ｅ、　ｃｏｌ
ｉ　Ｊ　Ｍ　１０３株〔ヌクレイツク　アシッド　リサ
ーチ、９．３０９　（１９８１））　、Ｅ、　ｃｏｌｉ
ＪＭ　１０５株〔蛋白質・核酸・酵素、社、２９４（１
９８１）　）が好ましい。またこの他、Ｅ、　ｃｏｌｉ
Ｗ　３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）　、Ｅ、　ｃｏ
ｌｉＢ株、サルモネラ　チフィムリラム、セラチアマル
セフセンスなどの腸内細菌または枯草菌をも用いること
ができる。また真核生物を用いる場合には例えばサツカ
ロマイセス　セレビジエアがあげられる。さらに多細胞
生物由来の培養細胞を用いる場合にはＶＥＲＯ細胞、Ｈ
ｅ１ａ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞系、Ｗ
１３８、ＢＨＫ、ＣＯ３−７およびＭＤＣＫなどの各細
胞系があげられる。

また形質発現用ベクターとしては、上記宿主細胞に適合
し得るレプリコンと調節機能を含むベクターおよび該宿
主細胞がそれ自身の蛋白質を発現するのに必要なプロモ
ーターを含有するかもしくは含有するように改良された
ものが好ましい。

これらの各組み合わせの具体例を示すと以下の通りであ
る。

プラスミドとしてｐＢＲ３２２（ジーン、主、９５、（
１９７７））　、プロモーターとしてβ−ラクタマーゼ
プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター〔ネ
ーチャー、％迂、５４４（１９７９）　）　、ｌ−リプ
トファン（ｔｒｐ）プロモーター〔ヌクレイツク　アシ
ッド　リサーチ、■、４０５７　（１９８０）　）およ
びタンク（ｔａｃ）プロモーター〔プロシーディング　
オプナショナル　アカデミ−イン　サイエンスＵ、Ｓ、
Ａ、　、川、２１　（１９８３）　）などを有するもの
があげられる。かかる形質発現用ベクターとしては、例
えばｐＵｃ１８などのｐＵＣベクター〔メソッド　イン
　エンザイモロジー、１０１．２０（１９８３）〕ある
いはｐＫＫ２２３−３　　（スウェーデン、ファルマシ
ア社〕などがあげられる。

宿主細胞がサツカロマイセスセレビシェの場合ニブラス
ミドとしてＹＲｐ７（ネーチャー、２８２．３９（１９
７９））が、またプロモーターとして３−ホスホグリセ
レートキナーゼプロモーター〔ジャーナル　イン　バイ
オロジカル　ケミストリー、２５互、２０７３（１９８
０））　、エノラーゼプロモーター〔ジャーナル　イン
　バイオロジカルケミストリー、ｍ、１３８５（１９８
１））　、グリセルアルデヒド−３−ホスホフェートデ
ヒドロゲナーゼプロモーター〔ジャーナル　イン　バイ
オロジカルケミストリー、１区、９８３９　（１９７９
）　３などがあげられる。ががる形質発現用ベクターと
しては、例えばＹＥｐＩＰＴ〔サイエンス、担、６２０
　（１９８３）　）などがあげられる。

宿主細胞が　細胞生物由来培養細胞の場合ニブラスミド
としてＳＶ４０ウィルス、ウシパピローマウィルスの６
９％ゲノム〔プロシーディング　イン　ナショナル　ア
カデミ−イン　サイエンス　Ｕ、Ｓ、Ａ、　、互、２７
２７　（１９８１）　）などを、またプロモーターとし
てＳＶ４０ウィルスの後期および前記プロモーター〔ネ
イチャー、２７３．１１３　（１９７８）　）やクロー
ン化ｃＤＮＡそれ自身の染色体遺伝子に結合しているプ
ロモーターなどを有する形質発現用ベクターがあげられ
る。

−上記の如き宿主細胞と形質発現ベクターを用いるガン
壊死因子生産用の組み換えＤＮＡ分子の作製は、分離し
たベクターＤＮＡおよびクローン化ｃＤＮＡを開裂し、
修復し、また必要に応じオリゴヌクレオチドを用い、ガ
ン壊死因子をコードする塩基配列を有効に形質発現ベク
ター内のプロモーター配列に連結することにより実施す
ることができる。ＤＮＡの開裂は、緩衝液中、３７°Ｃ
で約１〜３時間、制限酵素でＤＮＡを処理すればよく、
開裂ＤＮＡはフェノールおよびクロロホルム抽出により
除蛋白し、水性画分からエタノールで沈澱させることに
より得ることができる。ついで開裂ＤＮＡをｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの存在下もしくは非存在
下に、Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼｌ　（フレノウ断片）で
処理した後、フェノールおよびクロロホルム抽出により
除蛋白し、水層からエタノールで沈澱させることにより
修復ＤＮＡを得ることができる。ＤＮＡポリメラーゼＩ
処理は約１５℃で１５分間程度行うのが適当である。

また本発明においては翻訳をより容易にするためプロモ
ーターのあとにオリゴヌクレオチドを付加することもで
きる。

かくして得られたＤＮＡの連結は、上記の各ＤＮＡ、即
ちベクターＤＮＡおよびクローン化ｃＤＮＡの末端と連
結後の塩基配列が正しく符号するように処理し、また所
望によりオリゴヌクレオチドを用いるときはオリゴヌク
レオチドを、各等モル量混合しりガーゼで処理すること
により実施することができる。

かくして得られた組み換えＤＮＡ分子は常法により宿主
細胞中に導入することができる。

例えば、宿主細胞が多細胞生物の培養細胞である場合に
はグラハムらの方法〔ピロロシイ、奴、５４６（１９７
８）　）によるリン酸カルシウム法の他、核注入法また
はプロトプラスト融合法などを用いることもできる。宿
主細胞が酵母などの真核細胞の場合は、ポリエチレング
リコール存在下にプロトプラストにＤＮＡを取り込ませ
る方法〔プロシーディンゲス　イン　ナショナル　アカ
デミ−オプ　サイエンス　Ｕ、Ｓ、Ａ、互、１９２９　
（１９７８）　）を用いることができ、宿主細胞が原核
細胞の場合には塩化カルシウム処理による方法〔プロシ
ーディンゲス　イン　ナショナル　アカデミ−インサイ
エンス　Ｕ、Ｓ、Ａ、聾、２１１０　（１９７２）　）
を用いることができる。

本発明においてはこれらいずれの方法を用いてもよいが
、通常は原核細胞を宿主細胞とする方法により実施する
のが好ましい。

かくして得られるガン壊死因子生産用の組み換えＤＮＡ
分子を含有する宿主細胞（以下、組み換え体と云う）の
培養は液体培地中、好気的に行うことができる。培地と
しては、例えばポリペプトン、酵母抽出物、食塩、グル
コースなどを含有する通常の栄養培地の他、デービスの
最少培地〔ジャーナル　イン　バクテリオロジー、６０
．１７（１９５０）〕などを用いることができる。培養
は約３０〜４０℃で実施するのが好ましい。

また培養に際し、用いたプロモーターに応じて適当な誘
導剤、例えばＩａｃプロモーターの場合であればイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを培地中に添加する
ことにより組み換え体の培養をより効率的に行うことが
できるので好ましい。

かくして得られる組み換え体からの目的のガン壊死因子
の分離は培養組成物、細胞抽出物を硫安分画、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフ
ィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティ
ークロマトグラフィーなどの分離精製における常法を適
宜組み合わせることにより実施でき、極めて純度の高い
ものとすることができる。

尚、本発明においては以下の略号を使用する。

Ａ：アデニン Ｃ：シトシン Ｇニゲアニン Ｔ：チミン Ａｌａ　：アラニン Ａｒｇ：アルギニン ＡＳｎ：アスパラギン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｃｙｓニジスティン Ｑｌｎ：グルタミン Ｇｌｕ：グルタミン酸 ｃｔｙニゲリシン Ｈｉｓ：ヒスチジン １１ｅ：イソロイシン ’Ｉ−ｅｕ：ロイシン Ｌｙｓ：リジン Ｍｅｔ：メチオニン Ｐｈｅ：フヱニルアラニン Ｐｒｏニブロリン Ｓｅｔ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｔｒｐ：）リブトファン Ｔｙｒ：チロシン Ｖａｌ：バリン ＤＮＡ　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補ＤＮＡ ＲＮＡ：リボ核酸 ｍＲＮＡ　：伝令ＲＮＡ ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｅｔｃ’ｒｐ：
デオキシシチジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシ
ン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸 オリゴ（ｄＣ）：オリゴデオキシシチジル酸オリゴ（ｄ
Ｇ）：オリゴデオキシグアニル酸オリゴ（ｄＴ）：オリ
ゴデオキシチミジル酸ポリ　（Ａ）：ポリアデニル酸 ポリ　（Ｕ）　：ポリウリジル酸 ポリ　（ｄＡ）：ポリデオキシアデニル酸ポリ　（ｄＣ
）：ポリデオキシシチジル酸ポリ　（ｄＧ）：ポリデオ
キシグアニル酸ポリ　（ｄＴ）：ポリデオキシチミジル
酸ＮＡＤ：ニコチンアデニンジヌクレオチドＡＴＰ：ア
デノシン三リン酸 ＥＤＴＡ　：エチレンジアミン四酢酸 ｋｂ：キロ塩基 ｋｂｐ　：キロ塩基対 以下、本発明を実施例、実験例により更に詳細に説明す
る。

実施例１ （１）マウス由来マクロファージ細胞株からのｍＲＮＡ
の単離精製 ■　マウス由来マクロファージ細胞株Ｊ　７７４゜１を
、牛胎児血清１０％、ペニシリン１００４Ｄ位／ｍｌお
よびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含有するハ
ムのＦ１２に培地３０ｍ１中にけん濁（細胞数２．５Ｘ
１０’個）する。該けん濁液を市販の組織培養用ポリス
チレンフラスコで、５％００２　　９５％空気中３７℃
で４日間培養する。

培養後フラスコ底面に付着した増殖細胞をかきとって浮
遊させる。同様の浮遊細胞を合計１０本分のフラスコか
ら集め遠沈管に移し遠心分離（１０００ｒｐｍ５分間）
により細胞を集める。該細胞を血清を含まないハムのＦ
１２に培地１０１００ＯにｌＸｌ０’個となるようにＱ
％する。これに大腸菌由来のりポポリサソカライド（米
国、ディフコ社製０１２８：Ｂ２）を１０　μｇ／ｍｌ
となるように添加しマイクロキャリアースピナーフラス
コ（米国、ベルコ社製）に移す。攪拌（６０ｒｐｍ）下
、３７°Ｃで８時間培養する。

かくして得た培養液を遠心分離（１０００ｒｐｍ５分間
）して得られる細胞の１×１０９個を６Ｍグアニジンイ
ソシアーｓ−ト、５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）　、０．１Ｍ２−メルカプトエタノールおよ
び０．５％ザルコシン酸ナトリウムとからなる溶液１０
ｍ１に加え、２２ゲージの注射針を装着した注射器で約
１０回吸引排出をくりかえし、細胞を破壊する。かくし
て得られるホモジネートに２．５ｍｌ当たり１ｇの割合
で塩化セシウムを加えて溶解する。該溶液を遠心チュー
ブ（米国、ベックマン社製、５Ｗ４０Ｔｉローター用）
中の５．７Ｍ塩化セシウム−〇、ＩＭＥＤＴＡ　（ｐＨ
７，５）溶液２．５ｍｌ上に重層し、３３０００ｒｐｍ
で１６時間遠心してＲＮＡを沈、；２させる。上清を吸
引除去したのちチューブ下方２ｃｍを残して上部を切り
取る。チューブ壁面を乾燥させた後ＲＮＡの沈澱を５ｍ
ＭＥＤＴＡと１％ＳＤＳを含む５０ｍＭ）リス塩酸緩衝
液（ｐ）１７゜４）１ｍｌに溶解する。これに同緩衝液
で飽和したフェノール、クロロホルムおよびイソアミル
アルコール混液（２５：　２４　：　１）を加えよく振
とうした後１１００００ｒｐで１０分間遠心して水層を
・） 回収する。この操作を繰り返したのち水層にクロロホル
ム：イソアミルアルコール（２４：１）混液を等量刑え
て攪拌し遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）して
水層を採取する。ついで該水層に０．１容の３Ｍ酢酸ア
ンモニウム（ｐＨ５，２）と２．２容のエタノールを加
え、−２０’Ｃで５時間静置してＲＮＡを沈澱させた後
、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）してＲＮＡ
を得る。

かくして得たＲＮＡを塩化ナトリウム０．５Ｍ、ＥＤＴ
ＡｌｍＭおよび５Ｄ３０．１％を含む２０ｍＭ１−リス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）の５ｍｌに溶解する。該溶液
を６５℃で５分間処理し冷却した後、上記と同じ緩衝液
で平衡化させた４ｍｌのオリゴ（ｄＴ）セルロース（ス
ウェーデン、ファルマシア社製、タイプ７）カラムに通
導した。流出液を６５℃で５分間再度処理し冷却後、上
記カラムに通導しＲＮＡを吸着させる。ついでカラムを
上記と同一組成の緩衝液で紫外線（波長：２６０ｎｍ　
）の吸収がなくなるまで洗浄する。ＥＤＴＡＩｍＭと５
ＤＳ０．０５％を含む２０ｍＭ１−リス塩酸緩衝液をカ
ラムに通導し紫外線（波長＝２６０ｎｎ＋　）の吸収を
有する流出液を集めることによりＲＮＡを含む溶出液を
得る。該溶出液に０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５，２）と２．２容量のエタノールを加え一２０°Ｃ
で放置しＲＮＡを沈澱させ、遠心分離（１００００ｒｐ
ｍ、１０分間）してＲＮＡを得る。このＲＮＡをＥＤＴ
ＡｌｍＭと５ＤＳ０．２％を含む１０ｍＭトリス塩酸緩
衝液に溶解し、等量のホルムアミドを加えて３７°Ｃで
５分間加温する。この溶液を５〜２０％ショ糖の密度勾
配溶液〔ショ糖をＥＤＴＡｌｍＭ、５ＤＳ０．２％およ
びホルムアミド５０％を含む１００ｍＭ）リス塩酸緩衝
液に溶解したもの〕上に重層し５Ｗ４０Ｔｉローター（
米国、ベックマン社製）を用いて遠心分離（３２０００
ｒｐｍ　、２０時間、２０℃）する。Ｓ値測定用標準Ｒ
ＮＡとして真核生物由来の２ＢＳ、１８Ｓおよび４Ｓの
ＲＮ、Ａを用い別の遠心チューブで同様に遠心分離する
。　ついでショ糖密度勾配にそって分離されたＲＮＡの
うち１６Ｓ〜１８Ｓの画分を採取し０゜１容の３Ｍ酢酸
ナトリウムと２．２容のエタノールを加え一２０°Ｃで
保存し沈澱するｍＲＮＡを遠心分離により集める。かく
して目的のガン壊死因子をコードするｍＲＮＡ４５μｇ
を得る。

（２）ＣＤＮＡの合成 ■一本鎖ＣＤＮＡの合成 上記（１）で得たｍＲＮＡ３０μｇ　、５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，３）　、１００ｍＭ塩化カリウム
、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイト
ール、１．２５ｍＭｄＡＴＰ。

１．２５ｍＭｄＧＴＰ、１．２５ｍＭｄＣＴＰ。

１．２５ｍＭｄＴＴＰ、２００ｊｔｉ位ＲＮａｓ％哀（
商品名、プロメガ　バイオチック社製、米国）、２０μ
ｇオリゴ（ｄＴ）＋ｚ−＋ｅおよび１００単位トリ骨髄
性白血病ウィルス由来逆転写酵素を４２℃で９０分間反
応させた後、０．５ＭＥＤＴＡ水溶液を最終濃度２０ｍ
Ｍになるように加え反応を停止させる。フェノール：ク
ロロホルム：イソアミルアルコール混液（２５：２４：
１）を加えて混合し、遠心分＋１（１５０００ｒｐｍ、
５分間）する。水層を回収し等容の４Ｍ酢酸アンモニウ
ムを加え混合する。これに２倍容のエタノールを加え一
７０℃に１５分間静置した後、遠心分離（１５０００ｒ
ｐｍ、１０分間）する。沈澱を５０μｌの４Ｍ酢酸アン
モニウムと２００μｌのエタノールを加え一７０℃に１
５分間静置した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０
分間）する。沈澱を７０％エタノールで洗浄し、減圧乾
燥することによりｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体５μｇを得
る。

■二本鎖ｃＤＮＡの合成 ■で得たｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体５μｇ、２０ｍＭ、
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　、４ｍＭ塩化マグネ
シウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、１００ｍＭ塩化カ
リウム、５μｇ牛血清アルブミン、０．１４ｍＭβ−Ｎ
ＡＤ、４０μＭｄＡＴＰ１４０μＭｄＧＴＰ、４０μＭ
ｄＣＴｐ、４０μＭｄＴＴＰ、１単位ＲＮａｓｅ　Ｈ，
１単位大腸菌由来ＤＮＡリガーゼ及び２３単位ＤＮＡポ
リメラーゼ■を１２℃で６０分間、ついで２５℃で６０
分間反応させた後、０　、　５　Ｍ’Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを
最終濃度２０ｍＭになるように加えて反応を停止させる
。

得られた反応液を、上記と同様にフェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコールｍ液（２５：２４：１）で
抽出し、水層に４Ｍ酢酸アンモニウムとエタノールを加
えて二本鎖ｃＤＮＡを沈澱させる。この沈澱を集め、水
１２０μｌに溶解しエタノールを加えて二本鎖ｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａを沈澱させる。

この沈澱を集め、７０％エタノールで洗浄し二本鎖ｃＤ
ＮＡ３μｇを得る ■二本鎖ｃＤＮＡの分画 ■で得た二本鎖ｃＤＮＡを水５０μｌに溶解し、全量を
１％低融点アガロース（アガロースＥＰ、宝酒造製）平
板ゲルで電気泳動（７０■、６時間）する。ＤＮＡをエ
チジウムプロミドで染め、約１〜２ｋｂｐに相当するｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａを含むゲルを切り取る。得られたゲルを５
ｍｌの低塩濃度緩衝液（２０ｍＭ）リス塩酸緩衝液ｐｔ
−ｒ７．４．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２Ｍ塩化ナトリウム
）中、６５℃で約１０分間加温しゲルを溶解する。３７
°Ｃまで冷却し、予め３７℃の低塩濃度緩衝液で平衡化
しておいたＲＤＰミニカラム（米国、バイオ−ラッド社
製）に約０．５ｍｌ／分の流速で導通ずる。３７℃の低
塩濃度緩衝成約３ｍｌでカラムを洗浄した後、約０．５
ｍｌの低塩濃度緩衝液（２０ｍＭトリス塩ａｌｌ街液ｐ
Ｈ７，４，１ｍＭＥＤＴＡ、１Ｍ塩化ナトリウム）でｃ
ＤＮＡを）容出する。ｃＤＮＡを含む溶出液に等容のフ
ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混液を
加えて混合し、ｃＤＮＡを抽出する。遠心分離して水層
を回収し４Ｍ酢酸アンモニウムとエタノールを加え一７
０℃に１５分間静置した後、遠心分離する。沈澱を７０
％エタノールで洗浄し、減圧乾燥することにより約１〜
２ｋｂｐの二本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを得る。

■オリゴ（ｄＧ）テール付加ｃＤＮＡの調製上記■で得
た二本鎖ｃＤＮＡに反応緩衝液〔１４０ｍＭカコジル酸
ナトリウム、３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ５，８）
　、１ｍＭ塩化コバルト、Ｑ、１ｍＭジチオスレイトー
ル、４０．ｌＪＭｄＧＴＰ、３．２μＣｉα−”Ｐ−ｄ
ＧＴＰ　（比活性８００Ｃ４／ｍｍｏ　１）　、２２単
位ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラー
ゼ〕３０μｌを加えて溶解し、３７℃で５分間反応させ
る。これに０．５ＭＥＤＴＡを２０ｍＭとなるように加
えて反応を停止させ、反応液をフェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール混液で抽出し、水層にエタノ
ールを加えて沈澱させる。この操作を二度繰り返し、沈
澱を集め、７０％エタノールで洗浄した後、減圧乾燥し
てオリゴ（ｄ　Ｇ）テール付加ｃＤＮＡを得る。

プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ２００μｇ、６ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，９）　、６ｍＭ塩化マグネシウ
ム、６ｍＭ２−メルカプトエタノール、１５０ｍＭ塩化
ナトリウムおよび１００単位制限酵素ＥｃｏＲＶを３７
℃で５時間反応させ、フヱノールニクロロホルム：イソ
アミルアルコール混液で抽出する。水層を５〜２５％の
ショ糖密度勾配遠心分離（（３８００Ｏｒｐｍ、１３時
間）、ジャーナル　イソ　バイオロジカル　ケミストリ
ー、顕Ｌ、７６６５　（１９８０）　）　Ｌ、分画して
形質転換顧度の低い直鎖状ｐＢＲ３２２ＤＮＡ画分を採
取する。ＤＮＡをエタノール沈澱により集め、ｌＯｍＭ
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）および１ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡを含む水溶液に１ｍｌあたりｐＢＲ３２２ＤＮＡが
２■となるように溶解する。

このｐＢＲ３２２ＤＮＡを含む゛９容ン夜４．２μｌと
反応緩衝液（１４０ｍＭカコジル酸すｌ・リラム、３０
ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ６，８）　、１ｍ　Ｍ　塩
化コバルト、０．１ｍＭジチオスレイトール、４０μＭ
ｄＣＴＰ、３．２μＣｉα−：ｌｐ　　ａＣＴＰ　（比
活性８００Ｃｉ／ｍｍｏ　り　、２２ｊｔＬ位ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）１５．
８μｌを３７℃で５分間反応させる。これに０．５Ｍ　
　ＥＤＴＡを２０ｍＭとなるように加えて反応を停止さ
せ、反応液をフェノール−クロロホルムーイソアミルア
ルコールン昆液で抽出し、水層にエタノールを加えて沈
澱させる。

この操作を二度繰り返し、沈澱を集め、７０％エタノー
ルで洗浄した後、減圧乾燥する。かくしてオリゴ（ｄ　
Ｃ）テール付加プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ２μｇを
得る。

（４）ｍみ換えＤＮＡのｉ、製 ■組み換えＤＮＡを含む溶液の調製 上記（２）−■で得たオリゴ（ｄ　Ｇ）テール付加ｃＤ
ＮＡを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）　、
１ｍＭＥＤＴＡおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む
水溶液に１ｍｌあたり０．５μｇとなるように溶解する
。

また上記（３）で得たオリゴ（ｄＣ）テール付加プラス
ミドｐＢＲ３２２ＤＮＡを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）および１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む水溶液に
１ｍｌあたり２μｇとなるように溶解する。

、これらの溶液各１００μｌを混合し、５８°Ｃで９０
分間加温してアニーリングを行い、組み換えＤ　Ｎ　Ａ
を含む溶液を調製する。

■ｃＤＮＡのライブラリーの作成 Ｅ、　ｃｏｌｉ２１７７６株（ＡＴＣＣ３１２４４）を
χ１７７６培地〔２，５％バタトトリプトン、０．７５
％バクト酵母抽出物、２０ｍＭｔ−リス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）　、５ｍＭ塩化マグネシウム、１００μｇ／
ｍｌジアミノピメリン酸、４０μｇ／ｍｌチミジン、０
．５％グルコース）１００ｍｌ中、３７℃で吸光度（５
５０ｎｍ）が０．２になるまで振とう培養する。菌体を
遠心分離（４０００Ｘｇ、５分間、４℃）により集め、
形質転換用緩衝液（１０ｍＭ塩化カルシウム、１００ｍ
Ｍ塩化ルビジウム、４５ｍＭ塩化マンガン、５ｍＭ塩化
マグネシウム、０．５ｍＭ塩化リチウム、３５ｍ　Ｍ　
ｒｉｐ　ｔｍカリウム緩衝液（ｐＨ６，２）　、１５％
ショ糖）２０ｍｌに懸濁する。この閏懸濁液を再度遠心
分ｉＴ！（４０００ｘｇ、５分間、４°ｃ）Ｌ菌体を沈
澱させる。上清を捨て、菌体を水冷した４ｍｌの形質転
換用緩衝液に懸濁した後、０．２ｍｌづつに分けて０℃
で５分間冷却した。これに５０％グリセロールを５０μ
ｌ加えた後、−７０℃で凍結保存する。凍結保存した菌
体Ｑ、　？５　？（ｌを０℃に３０分間保ち融解した後
、上記■で調製した組み換えＤＮＡ溶液を１０μＩずつ
添加混合し０℃で３０分間静置する。更に一７０℃で１
分間冷却した後、４２℃で１分間加温し、前記のχ１７
７６１７７６培地加えて３７°Ｃで１時間静置する。こ
の培養液の一部を採り、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ
を含むχ１７７６寒天平板培地（χ１７７６培地に１．
５％寒天を加える）に塗布し、３７℃で約１６時間培養
し、アンピシリン耐性菌のクローンを得て形質転換株か
らなるｃＤＮＡライブラリーを作成する。

■ガン壊死因子ＣＤＮＡクローンの選択上記■のｃＤＮ
Ａライブラリーについて、ガン壊死因子をコードするｃ
ＤＮＡを含む形質転換株を選択するため、３ｔｐ標識ｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａプローブをもちいるコロニーハイブリダイ
ゼーションテストをＨａｎａｈａｎ　らの方法〔ジーン
、川、６３　（１９８０）　）に従って行った。

すなわち、５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，３）　
、１００ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム
、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭｄＡＴＰ、１ｍ
ＭｄＧＴＰ、１ｍＭｄＴＴＰ、５０　μＭｄ　ＣＴＰ、
　３３　μｃｉｏニー”Ｐ　−ｄ　Ｃ’ｒＰ、０．１６
μｇオリゴ（ｄＴ）　ｒｚ−＋＊　、１．６μｇｍＲＮ
Ａおよび２単位トリ骨髄性白血病ウィルス由来逆転写酵
素を４２℃で６０分間反応させた後、０．５ＭＥＤＴＡ
水溶液を最終濃度２０ｍＭになるように加え反応を停止
させる。これに水酸化ナトリウムを０．３Ｍ？ｆｆｉ度
となるように、またサケ由来ＤＮＡを７５０℃ｇ／ｍｌ
となるように、それぞれ加え３７℃で１時間保温して、
ｍＲＮＡを分解除去した。反応液を酢酸で中和した後、
５１１１１容のセファデックスＧ−１００（スウェーデ
ン、ファルマシア社製）カラムに通導し１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）と１ｍＭＥＤＴＡを含む溶液
でＤＮＡを溶出することにより３２ｐ標識ｃＤＮＡを含
む両分を採取する。

得られたｆｆ！ｐ標識ｃＤＮＡプローブを用い、上記■
で調製したｃＤＮＡライブラリーをコロニーハイブリダ
イゼーションテスト〔ジーン、廷、６３（１９８０”）
　）でスクリーニングし、誘導プラスプローブと強く結
合し、誘導マイナスプローブとは結合しないか、弱くし
か結合しない塩基配列を含む組み換えＤＮＡ分子を有す
る形質転換株を選別することにより、約４万個のコロニ
ーから４０個のコロニーを得た。

この４０個のコロニーについてハイブリッドセレクトト
ランスレーションテストをパーンズらの方法〔モレキュ
ラー　クローニング、Ｐ３３１　（コールド　スプリン
グ　ハーバ−ラボラトリ−発行）（１９８２））に従っ
て実施した。

即ち、それぞれの形質転換株からプラスミドＤＮＡを抽
出、精製した後、該プラスミドＤＮＡを５００℃ｇ／ｍ
ｌとなるように水に溶解し、１００℃で１０分間加熱し
たのち急冷する。これに等容のＩＮ水酸化ナトリウムを
加え室温で２０分間静置する。ついで、１Ｍ水酸化ナト
リウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、０．５Ｍトリス
塩Ｍｔｔ街１ｆｆｌ（ｐＨ８，０）およびＩＮ塩酸から
なる溶液を加えテ中和し、１ｃｍ”ニトロセルロースフ
ィルター（米国、ミリポア社製、ＨＡＷＰタイプ）に軽
く吸引しながらしみこませる。フィルターを室温で１時
間乾燥し６ｘＳＳＣ（０，９Ｍ塩化ナトリウム、０．０
９Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０））５０ｍ
ｌで２回洗浄した後、室温で１時間、ついで８０℃で２
時間乾燥することによりＤＮＡ結合フィルターを調製し
た。このフィルターを１．５ｍｌの微量遠心チューブに
入れ１ｍｌの水を加え、１００℃で１分間加熱した後急
冷する。

さらに１ｍｌの水で洗浄し、Ｊ７７４．１細胞から前記
（１）と同様にして調製したｍＲＮＡをふくむ反応液（
３０μｇ　ｍＲＮＡ、６５％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、
２０　ｍ　Ｍ　Ｐ　Ｉ　Ｆ　Ｅ　３１１衝液（ｐＨ６，
４）、０．２％ＳＤＳ、０．４Ｍ塩化ナトリウム、１０
μｇ牛腎臓由来ｔＲＮＡ）１００μｌと混合後、３７℃
で１８時間反応させる。反応終了後、フィルターを予め
６５℃に加温した緩衝液（１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）　、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、０゜５％５ＤＳ）で１０回洗浄し、更にＳＤＳ
を含まない上記緩衝液で２回洗浄する。

ついでフィルターに牛腎臓由来ｔＲＮＡ水溶液（１００
μｇ／ｍｌ）を３００　ｕ　１！　／　０　、５　ｃｒ
Ａとなるように加え、１００℃で１分間加熱したのち、
液体窒素中で急冷する。得られるｍＲＮＡ抽出液を常法
通りフェノール抽出し、水溶液に酢酸ナトリウムを０．
３Ｍとなるように加え、更に２．５容のエタノールと混
合し一２０℃で２０時間静置する。該溶液を遠心分ｉｔ
Ｉ！（１５０００ｒｐｍ、１０分間）してｍＲＮＡを採
取し、７０％エタノールで洗浄後、ＲＮａ５ｉｎ水溶液
（２単位／　ｍ　ｌ　＞に溶解する。

かくして得られたｍＲＮＡをアフリカッメガエル卵母細
胞にマイクロインジェクションし、その２０個を０．２
ｍｌの改変パースの培養液〔モレキュラー　クローニン
グＰ３５１　（１９８２）　　コールドスプリング　ハ
ーバ−ラボラトリ−発行〕中、２２℃で２４時間培養し
、ホモジナイズした後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、
１０分間）してその上清液を検体としてＬ−９２９細胞
傷害活性を文献〔ジャーナル　オプ　イムノロジー、１
２６．１２７９、（１９８１）　）記載の通り測定し、
ガン壊死因子活性を確認した。

これにより、ガン壊死因子ｍＲＮＡと強くハイブリダイ
ズするｃＤＮＡを含む組み換えＤＮＡ分子を有する形質
転換株を４株見出し、このうち最も長いｃＤＮＡ（約１
．５Ｋｂｐ）を含む組み換えＤＮＡ分子を分離精製〔モ
レキュラー　クローニング、Ｐ２Ｏ（１９８０）　　コ
ールド　スプリングハーバ−ラボラトリ−発行〕するこ
とによりＣＤＮＡ分子ｐＭｕＴＮＦ４８１を得た。

（５）クローンヒＣＤＮＡの塩　配列ン上記で得たｃＤ
ＮＡ分子ｐＭｕＴＮＦ４８１のＤＮＡを制限酵素Ｂａｍ
ＨＩで開裂させ、ｃ　ＤＮＡ断片（約１．５５Ｋｂｐ）
を前記（２）−〇の二本鎖ｃＤＮＡの分画におけると同
様にして低融点アガロースとＲＤＰミニカラムを用いて
単Ｍｉｆ製した。このクローン化ｃＤＮＡ断片について
、ベクターＭｌ　３ｍｐ　１０およびＭｌ　３ｍｐ　１
１と宿主Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　１０３を用いるメッ
シングのクローニング系〔メソッド　イン　エンザイモ
ロジー、利し、２０．　（１９８３）　　）とジデオキ
シ法による塩基配列決定法〔プロシーディンゲス　オプ
　ナショナル　アカデミ−イン　サイエンス　ＵＳＡ■
、５４６３　　（１９７７））とによりその塩基配列を
決定゛−７た。塩基配列は第１表に示す通りである。同
表において４〜１５番はｃＤＮＡをベクターに組み込む
ために付加したポリ（ｄＧ）テイルに由来し、第１８４
〜８８５番はガン壊死因子の前駆体を構成するに必要な
ポリペプチドをコードすると推定される塩基配列である
。第４２４〜４３８番は後記実験例に示した如く、ガン
壊死因子のＮ末端に相当するアミノ酸配列をコードして
おり、またＣ末端アミノ酸であるロイシンのコドンに続
いて終始コドン（ＴＧＡ）が存在する。

第１表 ＧＡＴ　　ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＧ　　ＣＡＧ
　　ＡＡＧ　　ＣＴＣＣＣＴ　　ＣＡＧＣＧＡ　ＧＧＡ
　ＣＡＧ　ＣＡＡ　ＧＧＧ　ＡＣＴ　ＡＧＣＣＡＧ　Ｇ
ＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＡＣＡＧ　ＡＡＡ　ＣＴＣＣＡＧ　
ＡＡＣＡＴＣＣＴＧ　ＧＡＡ　ＡＴＡ　ＧＣＴ　ＣＣＣ
ＡＧＡ　　ＡＡＡ　　ＧＣＡ　　ＡＧＣＡＧＣＣＡＡ　
　ＣＣＡ　　ＧＧＣＡＧＧ　　ＴＴＣＴＧＴＣＣＣＴＴ
Ｔ　　ＣＡＣＴＣＡ　　ＣＴＧ　　ＧＣＣＣＡＡ　　Ｇ
ＧＣＧＣＣＡＣＡ　　ＴＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＡ　ＡＡ
Ａ　ＧＡＣＡＣＣＡＴＧ　ＡＧＣＡＣＡ　ＧＡＡ　ＡＧ
ＣＡＴＧ　　ＡＴＣＣＧＣＧＡＣＧＴＧ　　ＧＡＡ　　
ＣＴＧ　　ＧＣＡ　　ＧＡＡ　　ＧＡＧ　　ＧＣＡＣＴ
ＣＣＣＣＣＡＡ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＧＧＧ　ＧＧＣＴＴ
ＣＣＡＧ　ＡＡＣＴＣＣＡＧＧ　ＣＧＧ　ＴＧＣＣＴＡ
　ＴＧＴ　ＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡ　ＴＴＣＣ
ＴＧ　ＣＴＴ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＧＧＧ　ＧＣＣＡＣＣ
ＡＣＧ　ＣＴＣＴＴＣＴＧＴＣＴＡ　　ＣＴＧ　　ＡＡ
ＣＴＴＣＧＧＧ　　ＧＴＧ　　ＡＴＣＧＧＴ　　ＣＣＣ
ＣＡＡ　　ＡＧＧＧＡＴ　ＧＡＧ　ＴＴＣＣＣＡ　ＡＡ
Ｔ　ＧＧＣＣＴＣＣＣＴ　ＣＴＣＡＴＣＡＧＴＴＣＴ　
　ＡＴＧ　　ＧＣＣＣＡＧ　　ＡＣＣＣＴＣＡＣＡ　　
ＣＴＣＡＧＡ　　ＴＣＡ　　ＴＣＴＧＴＣＧＴＡ　　Ｇ
ＣＡ　　ＡＡＣＣＡＣＣＡＡ　　ＧＴＧ　　ＧＡＧ　　
ＧＡＧ　　ＣＡＧ　　ＣＴＧＧＡＡ　　ＴＧＧ　　ＧＴ
Ｇ　　ＴＴＣＡＴＣＣＡＴ　　ＴＣＴ　　ＣＴＡ　　Ｃ
ＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＣＴＣＴ　　ＧＡＣＣＣＣＴＴＴ
　　ＡＣＴ　　ＣＴＧ　　ＡＣＣＣＣＴ　　ＴＴＡ　　
ＴＴＧＴＣＴ　　ＡＣＴ　　ＣＣＴ　ＣＡＧ　　ＡＧＣ
ＣＣＣＣＡＧ　　ＴＣＴ　ＧＴＧ　　ＴＣＣＴＴＣＴＡ
Ａ　　ＣＴＴ　　ＡＧＡ　　ＡＡＧ　　ＧＧＧ　　ＡＴ
Ｔ　　ＡＴＧ　　ＧＣＴ　　ＣＡＧ　　ＡＧＴ　　ＧＴ
ＴＧＧＧ　　ＡＧＣＣＧＣＧＣＣＣＡＣＡＴＴ　　ＣＧ
ＣＣＧＴ　　ＴＡＣＡＡＧ　　ＡＴＧＧＣＧ　　ＣＴＧ
　　ＡＣＡ　　ＧＣＴ　　ＧＴＧ　　ＴＴＣＴＡＡ　　
ＧＴＧ　　ＧＴＡ　　ＡＡＣＡＡＡＴＡＡ　　ＴＣＴ　
　ＧＣＧ　　ＣＡＴ　　ＧＴＧ　　ＣＣＡ　　ＡＧＧ　
　ＧＴＡ　　ＴＣＴ　　ＴＡＴ　　ＧＡＣＴＡＣＴＴＧ
　　ＴＧＣＴＣＴ　　ＧＣＣＴＴＣＣＣＣＧＴＧ　　Ａ
ＣＧ　　ＴＣＡ　　ＡＣＴＣＧＧ　　ＣＣＧ　　ＡＴＧ
　　ＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡ　　ＴＣＡ　　ＧＧＧ　
　ＡＧＴ　　ＧＡＣＡＣＧ　　ＴＣＣＧＡＧ　　ＧＣＧ
　　ＡＡＧ　　ＧＡＧ　　ＡＡＴ　　ＧＣＴ　　ＣＣＴ
　　ＴＡＡ　　ＧＡＧＧＧＡ　　ＣＧＧ　　ＧＧＴ　　
ＴＴＣＧＴＴ　　ＴＴＣＴＣＴ　　ＣＧＣＴＣＴ　　Ｔ
ＧＣＴＴＣＴＴＧ　　ＣＴＣＴＣＴ　　ＴＧＣＴＴＣＴ
ＴＡ　　ＣＡＣＧＣＴ　　ＴＧＣＴＣＣＴＧＡＡＡＡ　
　ＴＧＴ　　ＡＡＧ　　ＡＡＡ　　ＴＡＡ　　ＡＧＣＴ
ＴＴ　　ＧＣＣＧＣＡ　　ＧＡＡ　　ＡＡＡＡＡＡ　　
ＡＡＡ　　ＡＡＡ　　ＡＡ また、ガン壊死因子のポリペプチドをコードする領域の
塩基配列（上記第１表の第４２４〜８８５番、下線部分
）から翻訳されるアミノ酸残基数は１５４個であり、そ
の組成および計算分子量は第２表に示す通りである。

第２表 Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ＶａｌＡｌａ　Ｈｉｓ
　Ｖａｔ　Ｖａｔ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　
Ｖａｔ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＧｉｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　
　Ｔｒｐ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ　　Ａｒｇ　
　Ａｌａ　　Ａｓｎ　　ＡｌａＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ
　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　
Ａｓｐ　ＡｓｎＧｌｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｖａｌ　Ｐｒ
ｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ
Ｖａｌ、Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐ
ｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　ＧｌｙＣｙｓ　Ｐｒｏ
　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　
Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　ＶａｌＳｅｒ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ　
　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｎ　
　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　ＶａｌＡｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｌ
ｅｕ　Ｓｅｒ　＾Ｉａ　Ｖａｌ　　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐ
ｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａ
ｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　　ＰｈｅＧｉｎ　　
Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ
　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　Ａｌａ　ＧｌｕＶａｌ　　Ａｓ
ｎ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅ
ｕ　　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　ＧｌｕＳｅｒ　
Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　Ｐｈｅ　Ｇｌ
ｙ　　Ｖａｌ　　ｌｉｅ　Ａｌａ　　Ｌｅｕ（６）ガン
壊死因子の発現 ■　形質発現ベクターとしてｐＵｃ１８（ジーン、別、
１０３　（１９８５））　　１　ｐｇ　、１０　ｍＭ　
トリス塩酸？２を街）夜（ｐＨ７，４）　、１ｍＭジチ
オスレイトール、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭ
塩化ナトリウム、１単位の制限酵素ＡｃｃｌおよびＨｉ
ｎｄ■の混合物を３７℃で３時間反応させ、ついで６５
℃で１０分間処理した後、フェノール抽出で除蛋白した
反応液からＤＮＡをエタノール沈澱させる。得られた沈
澱を７０％エタノールで洗浄し、減圧乾燥する。

■　別に前記（５）で単離精製したＣＤＮＡ断片（約１
．５５Ｋｂ）０．５．Ｉｊｇ、１０ｍＭ）リス塩酸緩衝
液（ｐＨ７，４）　、１ｍＭジチオスレイトール、１０
ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１単
位の制限酵素ＴａｑｌおよびＨｉｎｄｌＩ［の混合物を
３７℃で３時間反応させ、ついで６５℃で１０分間処理
した後、フェノール抽出で除蛋白した反応液からＤＮＡ
をエタノール沈澱させる。得られた沈澱を７０％エタノ
ールで洗浄し、減圧乾燥する。

■　■で得た開裂ＤＮＡ０．５μｇ、■で得た開裂ＤＮ
Ａ０．４μｇ　、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，
５）　、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭジチオス
レイトール、１　ｍ　Ｍ　Ａ　Ｔ　Ｐおよび１単位Ｔ４
ＤＮＡリガーゼの混合物を１６℃で１５時間反応させた
反応液を用いて以下のようにしてＥ、　ｃｏｌｉＪＭ　
１０５株を形質転換した。

すなわち、Ｅ、　ｃｏｌｉＪＭ　１０５株をＬブロス培
地（１，０％バクトドリプトン、０．５％Ｍ母エ生エキ
ス、５％塩化ナトリウム）２０ｍｌ中、３７℃で吸光度
（６６０ｒ＋ｍ）が０６２になるまで振カ培養し、遠心
分離して菌体を集める。該菌体を１０ｍ１の氷冷した５
０ｍＭ塩化カルシウム水溶液に！ｕとする。０°Ｃで２
０分間静置した後、遠心分離して菌体を集め、２ｍｌの
水冷した５０ｍＭ塩化カルシウム水溶液に：、！！、濁
する。この菌体ＱＱＱ液０゜２ｍｌに上記の反応液１０
μｌを加え、０℃で６０分間静置した後４２°Ｃで２分
間処理した。これに上記しブロス培地２ｍｌを加え、３
７℃で９０分間振盪培養した後、培養液の一部をＱ、１
ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（以下、
■ＰＴＧ）と０．００４％の５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−ガラクトシド（以下、Ｘｇａｌ）
および１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴ平板培地
〔１％バタトトリプトン、０．　５％塩化ナトリウム、
１．５％寒天〕に塗布した。

これを３７℃で１６時間培養して白色のアンピシリン耐
性菌のコロニーを選別することにより目的の組み換えＤ
ＮＡ分子（ｐＧＴｌｌ）を含有する形質転換株（ＧＴ５
０１１）を得た。

この菌株をＬブロス（１％バタトトリプトン、０．５％
酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、０．１％グルコ
ース〕中で培養し、バーンボイムらの方法〔ヌクレイツ
ク　アシッド　リサーチ、７　１５１３　（１９７９）
　）で組み換えプラスミドＤＮＡを抽出し、上記方法に
従って制限酵素ＴａｑＩおよびＨｉｎｄｎ［でＤＮＡを
切断した後、１．３％アガロースゲル電気泳動によりＤ
ＮＡを解析したところ、制限酵素ＡｃｃｌとＨｉｎｄｌ
ｌで開裂されたｐｕＣ１８ＤＮＡ断片（２，７Ｋｂｐ）
と制限酵素ＴａｑｌとＨｉｎｄＩ［［で開裂されたクロ
ーン化ｃ　ＤＮＡ断片（０，８５Ｋｂｐ）から成ってい
ることを確認した。

かくして得た目的の組み換えＤＮＡ分子（ｐＧＴｌｌ）
はＩａｃプロモーターの制御下で第３表に示すガン壊死
因子融合蛍白質を生産する。

第３表 Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓ
ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒ。

ＧｌｙＡｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅ
ｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ＶａｌＡｌａ　Ｈｉｓ　
Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｇｌｎ　Ｖ
ａｌ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＧｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ
　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｎ　
ＡｌａＬｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ａｓｎ　　Ｇｌ
ｙ　　Ｍｅｔ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｓ
ｐ　　ＡｓｎＧｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　
　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　
ＬｅｕＶａｌ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌｅ
ｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　ＧｌｙＣｙｓ　
Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔ
ｈｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　ＶａｌＳｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ
　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ
　Ｌｙｓ　ＶａｌＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａ
ｌａ　Ｖａｌ　　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐ
ｒ。

Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａ
ｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　　ＰｈｅＧｉｎ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ｇ
ｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　ＧｌｕＶａｌ
　　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ
　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　ＧｌｕＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇ
ｉｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　　Ｉ
ｌｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ（７）ガン壊死因子の生産 形質転換株ＧＴ５０１１およびプラスミドｐｕ−０１８
を含有するＥ、　ｃｏｌｉＪＭｌ　０５株（ＪＭＩ０５
　　（ｐＵｃ１８）と略称する。〕をそれぞれＴ培地（
１％バタトトリブトン、０．５％塩化ナトリウム、１０
０μｇ／ｍｌアンピシリン）２００ｍｌ中、３７℃で振
盪培養し、吸光度（６６０ｎｍ）が０．３となればＩ　
ＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように加え、更に１
７時間振盪培養する。

ついで培養液を遠心分離（６０００ｒｐｍ、１５分間）
して菌体を集め、５０ｍ１のリン酸緩衝生理食塩水（以
下、ＰＢＳと略称する）に懸濁する。

再度遠心分離して菌体を集め、０．１ｍＭフェニルメチ
ルスルホニルフルオライドを含むＰＢＳ３ｍｌに懸濁す
る。この懸濁液を超音波処理（９０００Ｈｚ、５分間、
０℃）した後、遠心分離（１０００００ｘｇ、１時間、
４°Ｃ）してその上清を採取し、菌体抽出液を得る。こ
の菌体抽出液を用いてガン壊死因子活性の指標となるｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏガン細胞傷害活性をマウス由来繊維芽細
胞Ｌ−９２９株を用いて文献〔ジャーナル　オプ　イム
ノロジー、１２６．１２７９　（１９８１）　）記載方
法に準じて検討した。

即ち、９６穴プレートにＬ−９２９細胞（２゜５Ｘ１０
’個）の培養液を移植し２４時間培養した後、上記で得
たガン細胞傷害活性物質を含有する上清液０，１ｍｌま
たはその希釈液０．１ｍｌとアクチノマイシンＤ（１μ
ｇ／ｍｌ）を添加し、３７°Ｃで２４時間培養する。こ
の培養液へ０．００３％のニュートラルレッド溶液を添
加し、さらに培養を１時間続けた後、培養液を除き細胞
を新しい培地で洗浄する。ついで５０％エタノール−０
゜１Ｍ第ユニリン酸水素ナトリウム加えると生細胞が取
り込んだニュートラルレッドが溶出されるので、これを
比色室ｆｆｉ（５４０ｎｍ）する。

ガン細胞傷害活性は下記式により算出される傷害活性が
５０％を示すのに必要なガン細胞傷害活性物質の量を１
単位とした。

傷害活性（％）−（１−活性物質添加の場合の吸光度／
無添加の場合の吸光度）Ｘ１００■結果 結果は第４表に示す通りであり、形質転換株ＧＴ５０１
１がガン壊死因子を生産しているのに対し、ＪＭＩ　Ｏ
５（ｐＵｃｌ　８）は全くガン壊死因子を生産していな
いことが明らかである。

第４表 更に、上記の菌体抽出液の少量をレムリの方法〔ネイチ
ャー、２７７．６８０　（１９７０））に従って５ＤＳ
−ポリアクリルアミド平板ゲル電気泳動法で解析した。

その結果、組み換えＤＮＡ分子ｐＧＴ１１によって発現
された蛋白質の分子量は約１８５００であり、この値は
前記第３表のアミノ酸配列を有するポリペプチドの計算
値と一致した。

また、その生産量は菌体抽出液中の蛋白質の約４％に達
した。

実施例２ 細菌内でのガン壊死因子の発現 形質発現ベクターｐＫＫ２２３−３　（スエーデン、フ
ァルマシア社）と化学合成オリゴヌクレオチドを用いて
ガン壊死因子を生産する。

■化学合成オリゴヌクレオチドの調製 ５　’　−ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＧ
ＡＡＣＴ−３’および３　’　−ＧＴＡＣＡＧＡＡＧＡ
ＡＧＡＧＴＣＴＴＧＡＧＣ−５’からなるオリゴヌクレ
オチド２種をそれぞれ合成する。すなわち、自動ＤＮＡ
合成装置（米国、アプライドバイオシステムズ社、３８
０Ａ型）で合成したのち、ジメチルトリチル基以外の保
護基を除去し、逆相ＨＰＬＣ（条件：　Ｓｈｉｍｐａｃ
ｋ　　ＣＬ　Ｃ−ＯＤ　Ｓカラムを用い、移動相として
１００ｍＭトリエチルアミンアセテート緩衝液（ｐ）Ｉ
７．５）中、アセトニトリルからなる密度勾配液を用い
る〕で精製する。ついで８０％酢酸−２０％アセトニト
リルの混液を用いてジメチルトリチル基を除去した後、
再度逆相ＨＰＬＣでＤＮＡを精製する。

かくして得られた合成オリゴヌクレオチド各２５μｇ、
１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　、ＬｍＭＥ
ＤＴＡ、１５０ｍＭ塩化ナトリウムの混合物を１００°
Ｃで５分間加熱した後急冷し、５０℃で１時間加温する
ことによりアニーリングせしめて、塩基配列 ５　　’　　−ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣ
ＡＧＡＡＣＴ−３３’　　−ＧＴＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧ
ＡＧＴＣＴＴＧＡＧＣ−５で示されるオリゴヌクレオチ
ドリンカーを得る。

■形質発現ベクターｐＫＫ２２３−３の処理５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）　、ＩＱ　ｍ　Ｍ　６ｆ
Ｌ酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、１００
ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｇｇｐＫＫ２２３−３．１０
単位制限酵素ＥｃｏＲＩおよび１（ｉｎｄＩＩ［の混合
物を３７℃で５時間反応させた後、前記実施例１−（２
）−■の二本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの分画におけると同様に
して低融点アガロースとＲＤＰミニカラムを用いて単離
精製し、約４．５ＫｂｐのベクターＤＮＡを調製する。

■ガン壊死因子ｃＤＮＡの処理 前記実施例１−（５）で単離精製したｃＤＮＡＩ　０８
ｇ　、１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７゜４）　、１
０ｍＭ６ｉＪマグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール
、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０単位制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＨｉｎｄｎｌの混合物を３７°Ｃで５時間反応
させた後、前記実施例１−（２′　　）−■の二本鎖ｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａ　（７）分画におけると同様にして低融点
アガロースとＲＤＰミニカラムを用いて華離精製し、約
８５０ｂｐのＣＤ　Ｎ　Ａ断片を調製する。

■組み換えＤＮＡおよび形質転換体の調製５０ｍＭ）リ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ塩化マグネシ
ウム、２０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、０
．１　ｐｇオリゴヌクレオチドリンカーＤＮＡ、１μｇ
ベクターＤＮＡ。

１μｇｃＤＮＡ断片および２単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼの
混合物を１６℃で１５時間反応させた後、ＪＭ１０３株
を用いて前記実施例１−（２）−〇と同様に実施するこ
とにより、組み換えＤＮＡ　（ｐＧＴ１４）を含有する
形質転換体ＧＴ５０１４を得る。

かくして得られた形質転換体ＧＴ５０１４は下記第５表
で示される塩基配列でコードされるガン壊死因子を生産
する。

第５表 ＡＴＧ　　ＴＣＴ　　ＴＣＴ　　ＴＣＴ　　ＣＡＧ　　
ＡＡＣＴＣＧ　　ＡＧＴ　　ＧＡＣＡＡＧ　　ＣＣＴＧ
ＴＡ　　ＧＣＣＣＡＣＧＴＣＧＴＡ　　ＧＣＡ　　ＡＡ
ＣＣＡＣＣＡＡ　　ＧＴＧ　　ＧＡＧＧＡＧ　ＣＡＧ　
ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　ＡＧＣＣＡＧ　ＣＧ
ＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＴＧ　ＧＣＣＡＡＣＧＧ
ＣＡＴＧ　ＧＡＴ　ＣＴＣＡＡＡ　ＧＡＣ＾ＡＣＣＡＡ
　ＣＴＡ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＧＣＣＧＡＴ　Ｇ
ＧＧ　ＴＴＧ　ＴＡＣＣＴＴ　ＧＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡ
Ｇ　ＧＴＴ　ＣＴＣＴＴＣＡＡＧ　ＧＧＡ　ＣＡＡＧＧ
ＣＴＧＣＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＴＧ　　ＣＴＣＣＴＣＡ
ＣＣＣＡＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＣＧＡ　ＴＴＴ　ＧＣＴ
　ＡＴＣＴＣＡ　ＴＡＣＣＡＧ　ＧＡＧ　ＡＡＡＧＴＣ
ＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ　　ＧＣＣＧＴＣＡＡＧ　　
ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡ、ＡＧ　ＧＡＣＡＣＣＣＣ
Ｔ　ＧＡＧ　Ｇｆ；Ｇ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣＡＡＡ
ＣＣＣＴＧＧ　ＴＡＴ　ＧＡＧ　ＣＣＣＡＴＡ　ＴＡＣ
ＣＴＧ　ＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＴＣＴＴＣＣＡＧ　　ＣＴ
Ｇ　　ＧＡＧ　　ＡＡＧ　　ＧＧＧ　　ＧＡＣＣＡＡ　
　ＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＧ　　ＧＴＣＡＡＴ　　ＣＴ
Ｇ　　ＣＣＣＡＡＧ　　ＴＡＣＴＴＡ　　ＧＡＣＴＴＴ
　　ＧＣＧＧＡＧ　ＴＣＣＧＧＧ　ＣＡＧ　ＧＴＣＴＡ
ＣＴＴＴ　ＧＧＡ　ＧＴＣＡＴＴ　ＧＣＴＴＧ ■形質転換体によるガン壊死因子の生産ＧＴ５０１４お
よびプラスミドｐＫＫ２２３−３を含むＥ、　ｃｏｌｉ
ＪＭｌ　０３　（ＪＭＩ　０３　（ｐＫＫ２２３−３）
と略称〕をそれぞれ前記実施例１−（７）と同様にして
Ｔ培地で培養し、菌体抽出液を調製する。この菌体抽出
液のｉｎ　ｖｉｔｒｏガン細胞傷害活性を前記実施例１
−（７）と同様にして測定する。

■結果 結果は第６表に示す通りであり、形質転換株ＧＴ５０１
４がガン壊死因子を生産しているのに対し、ＪＭ１０３
　　（ｐＫＫ２２３−３）は全くガン壊死因子を生産し
ていないことが明らかである更に、上記の菌体抽出液の
少量をレムリの方法に従って５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ド平板ゲル電気泳動法で解析した。その結果、組み換え
ＤＮＡ分子ｐＧＴ１１によって発現された蛋白質の分子
量は約１７０００であり、この値は前記第２表のアミノ
酸配列を有するポリペプチドの計算値と一致した。

また、その生産量は菌体抽出液中の蛋白質の約４％に達
した。

実施例３ ■ガン壊死因子融合蛋白質の精製と活性評価実施例１で
得た菌株ＧＴ５０１１をＴ培地（１％バタトトリプトン
、０．５％塩化ナトリウム、１００μｇ／ｎｌアンピシ
リン）中、３７℃で振盪培養し、６６０ｎｍでの吸光度
が０．３になればＩ　ＰＴＯを最終濃度０，１ｍＭにな
るように加える。ついで振盪培養を１７時間続け、得ら
れた培養液から遠心分離により菌体を集める。該菌体を
抽出用緩衝液（２０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，
４）　、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．１ｍＭフェニ
ルメチルスルホニルフルオライド、５％グリセリリンで
菌体を洗浄し、同緩衝液に懸濁する。この菌体懸Ｓ液を
超音波処理（９０００Ｈｚ、１０分間）した後、遠心分
離し主情を採取した。かくして得られた菌体抽出液は１
×ＩＯ９単位のガン細胞傷害活性物質を含んでおり、こ
の菌体抽出液に硫酸アンモニウムを４０％濃度になるよ
うに加えて０℃で３０分間攪拌し、遠心分離して上清を
得る。この上清に更に硫酸アンモニウムを６０％濃度に
なるように加え０℃で３０分間攪拌し、遠心分離する。

沈澱を５ｍｌのＴＭＡ緩衝液〔２０ｍＭ）リス塩酸緩衝
液（ｐＨ７，４）　、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．
１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド〕に溶解
し、同緩衝液１１に対し１８時間透析した後、遠心分離
し、上清を得る。この上清をＴＭＡ緩衝液で平衡化した
ＤＥＡＥ−セファセル（スウェーデン、ファルマシア社
）のカラムに通導する。該カラムをＴＭＡ緩衝液で洗浄
後、同緩衝液に塩化ナトリウムの濃度を０．５Ｍまで直
線的に変化させた濃度勾配液で溶出させる。溶出液のう
ちガン細胞傷害活性を有する両分を集め限外濾過して濃
縮した後、リン酸緩衝生理食塩水で緩衝液置換を行う。

ついで、リン酸緩衝生理食塩水で平衡化したセファクリ
ルＳ−２００（スウェーデン、ファルマシア社）のカラ
ムに通導し、該カラムを同緩衝液でゲル濾過を行う。活
性画分を集めることによりガン壊死因子融合蛋白質の部
分精製標品（５Ｘ１０”単位）を得た。このものの比活
性は２Ｘ１０’単位／ｍｇ蛋白質であった。

■Ｍｅｔｈ　Ａザルコーマ担癌マウスに対する活性評価 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの腹部皮内にＩ　Ｘ　１
０６個　　　　゛のＭｅｔｈ　Ａザルコーマ細胞を移植
し、７日後移植した腫瘍の大きさが直径７〜８ｍｍとな
り、出血性壊死がな（良好な血行状態にある腫瘍を有す
るマウスを選ぶ。このマウスに上記で得られたガン壊死
因子融合蛋白質の部分精製標品を生理食塩水で希釈した
液０．２ｍｌを、−匹あたりｌＸｌ０６単位となるよう
尾静脈より注射し、２４時間後に壊死反応の判定を行っ
た。

〔結果〕

結果は下記第７表に示す通りであった。

第７表 〔注〕　：判定基準は次の通りである（以下、同）。

（＝）：変化なし く＋）：かすかな出血性壊死 （４）：中程度の出血性壊死 （移植表面の真中から５０％以上にわたって壊死） （−＋））−）　　：顕著な出血性壊死（移植癌の中央
部が重度の壊死し、周囲の癌組織がわずかに残った状態
） 実施例４ 成熟ガン壊死因子の精製および活性評価実施例２で得た
菌株ＧＴ５０１４を実施例３と同様に培養し、処理する
ことにより菌体抽出液を得る。この菌体抽出液は５Ｘ１
０”単位のガン細胞傷害活性物質を含んでおり、これを
精製することにより２Ｘ１０’単位の成熟ガン壊死因子
の部分精製品を得る。このものの比活性は１×１０８車
位／■蛍白質であった。この成熟ガン壊死因子の部分精
製品のＭｅｔｈ　Ａザルコーマ担癌マウスに対する活性
評価を実施例２と同様にして行った。

〔結果〕

結果は下記第８表に示す通りである。

第８表 実験例１ マウスガン壊死因子の精製 マウス由来マクロファージ細胞株Ｊ７７４．１を１０％
牛脂児血清を含むハムのＦ−１２培地（米国、フロラ　
ラボラトリ−社製）を用い、３７℃にてスピナーフラス
コで培養した。細胞濃度が１〜２Ｘ１０’個／ｍｌとな
れば遠心分離して細胞を集め、２度洗浄した。ついで細
胞を牛胎児血清を含まないハムのＦ−１２培地に１’Ｘ
１０ｂ個／ｍ１の濃度となるように懸濁し、リポポリサ
ッカライド（米国、ディフコ社）を１０μｇ／ｍｌとな
るように加えて１６時間培養した。

かくして得られるガン壊死因子を含む上清１０１を限外
濾過（米国、アミコン社製、ＨＩＰ−１０、ＰＭ−１０
）により濃縮し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）
で平衡化したＤＥＡＥ−セファセル（スウェーデン、フ
ァルマシア社製）、のカラムを用いてクロマト処理を行
った。このとき溶出液として用いる塩化ナトリウム溶液
の濃度をリニアグラジェントに増加させ、０．４〜０．
５Ｍ濃度で溶出する百分を濃縮した。濃縮液はセファク
リルＳ−２００（スウェーデン、ファルマシア社製）の
カラムを用いて２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で
ゲル濾過し、分子量４〜６×１０４付近で溶出する百分
を濃縮した。更にモノＱカラム（スウェーデン、ファル
マシア社製）を用いてＦＦ）ＬＣで精製した。すなわち
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）中で塩化ナトリウ
ムの濃度を増加させ、０．２〜ｏ、ｚｓＭ＞ａ度で溶出
する活性画分を採取した。活性画分は更にシンクロバッ
クＲＰ−４（米国、ジンクローム社製）のカラムを用い
てＨＰＬ’Ｃで精製した。すなわち０゜１％トリフルオ
ロ酢酸中で１−プロパツールの濃度をあげて溶出し、１
−プロパツール濃度２５％付近で溶出した両分を凍結乾
燥することにより高純度精製ガン壊死因子を得た。

この高純度精製ガン壊死因子を気相アミノ酸シーケンサ
−（米国、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて
、そのアミノ酸配列を調べたところ、ガン壊死因子のＮ
末端側からのアミノ酸配列は５ｅｔ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−
Ｇｉｎ−Ａｓｐ−であった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 （但し、Ｒは１６以下のアミノ酸からなるペプチドを表
   す。） で示されるガン壊死因子
2. 　（２）ＲがＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ
   で示されるペプチドであるか、Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ
   −Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎで示されるペプチドであるか
   、またはＭｅｔ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａ
   ｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
   ｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕで示されるペプチ
   ドである特許請求の範囲第１項記載のガン壊死因子