FI86992C - Foerfarande foer framstaellning human tumoernekrosfaktor och plasmid anvaend vid foerfarandet - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning human tumoernekrosfaktor och plasmid anvaend vid foerfarandet Download PDFInfo
- Publication number
- FI86992C FI86992C FI851336A FI851336A FI86992C FI 86992 C FI86992 C FI 86992C FI 851336 A FI851336 A FI 851336A FI 851336 A FI851336 A FI 851336A FI 86992 C FI86992 C FI 86992C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- residue
- leu
- ser
- ala
- vai
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 91
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 70
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 title claims description 54
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 title claims description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 136
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 94
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 82
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 36
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 20
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 11
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 9
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 6
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 6
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 claims description 6
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 6
- XCVRVWZTXPCYJT-BIIVOSGPSA-N Ala-Asn-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N XCVRVWZTXPCYJT-BIIVOSGPSA-N 0.000 claims description 5
- PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N Ala-Glu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 5
- OVQJAKFLFTZDNC-GUBZILKMSA-N Arg-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OVQJAKFLFTZDNC-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 5
- ZJBUILVYSXQNSW-YTWAJWBKSA-N Arg-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O ZJBUILVYSXQNSW-YTWAJWBKSA-N 0.000 claims description 5
- UEGIPZAXNBYCCP-NKWVEPMBSA-N Gly-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CN)C(=O)O UEGIPZAXNBYCCP-NKWVEPMBSA-N 0.000 claims description 5
- IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N Leu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N 0.000 claims description 5
- PJWOOBTYQNNRBF-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N PJWOOBTYQNNRBF-BZSNNMDCSA-N 0.000 claims description 5
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 5
- CJNCVBHTDXKTMJ-CYDGBPFRSA-N Ser-Asp-Lys-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CJNCVBHTDXKTMJ-CYDGBPFRSA-N 0.000 claims description 5
- QNBVFKZSSRYNFX-CUJWVEQBSA-N Ser-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O QNBVFKZSSRYNFX-CUJWVEQBSA-N 0.000 claims description 5
- XGFGVFMXDXALEV-XIRDDKMYSA-N Trp-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N XGFGVFMXDXALEV-XIRDDKMYSA-N 0.000 claims description 5
- BSCBBPKDVOZICB-KKUMJFAQSA-N Tyr-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BSCBBPKDVOZICB-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims description 5
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 claims description 5
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 claims description 5
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 5
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 5
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 5
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 claims description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 5
- 108010007375 seryl-seryl-seryl-arginine Proteins 0.000 claims description 5
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 5
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 claims description 5
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 5
- XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N 0.000 claims description 4
- RZZMZYZXNJRPOJ-BJDJZHNGSA-N Ala-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N RZZMZYZXNJRPOJ-BJDJZHNGSA-N 0.000 claims description 4
- NXDXECQFKHXHAM-HJGDQZAQSA-N Arg-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NXDXECQFKHXHAM-HJGDQZAQSA-N 0.000 claims description 4
- IWAXHBCACVWNHT-BQBZGAKWSA-N Gly-Asp-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IWAXHBCACVWNHT-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 4
- XVZJRZQIHJMUBG-TUBUOCAGSA-N His-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N XVZJRZQIHJMUBG-TUBUOCAGSA-N 0.000 claims description 4
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N 0.000 claims description 4
- CYZBFPYMSJGBRL-DRZSPHRISA-N Phe-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CYZBFPYMSJGBRL-DRZSPHRISA-N 0.000 claims description 4
- KYKKKSWGEPFUMR-NAKRPEOUSA-N Ser-Arg-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KYKKKSWGEPFUMR-NAKRPEOUSA-N 0.000 claims description 4
- XQAPEISNMXNKGE-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Cys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O XQAPEISNMXNKGE-FXQIFTODSA-N 0.000 claims description 4
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfisoxazole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N Thr-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N 0.000 claims description 4
- LHTGRUZSZOIAKM-SOUVJXGZSA-N Tyr-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O LHTGRUZSZOIAKM-SOUVJXGZSA-N 0.000 claims description 4
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 claims description 4
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 4
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 4
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 claims description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 125000002480 thymidyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims 3
- LWXJVHTUEDHDLG-XUXIUFHCSA-N Asn-Leu-Leu-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LWXJVHTUEDHDLG-XUXIUFHCSA-N 0.000 claims 3
- CXRWMMRLEMVSEH-PEFMBERDSA-N Glu-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CXRWMMRLEMVSEH-PEFMBERDSA-N 0.000 claims 3
- VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N Glu-Leu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 3
- AFWYPMDMDYCKMD-KBPBESRZSA-N Gly-Leu-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AFWYPMDMDYCKMD-KBPBESRZSA-N 0.000 claims 3
- WIZPFZKOFZXDQG-HTFCKZLJSA-N Ile-Ile-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WIZPFZKOFZXDQG-HTFCKZLJSA-N 0.000 claims 3
- GVEODXUBBFDBPW-MGHWNKPDSA-N Ile-Tyr-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 GVEODXUBBFDBPW-MGHWNKPDSA-N 0.000 claims 3
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- CZCSUZMIRKFFFA-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CZCSUZMIRKFFFA-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 3
- NRFGTHFONZYFNY-MGHWNKPDSA-N Leu-Ile-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NRFGTHFONZYFNY-MGHWNKPDSA-N 0.000 claims 3
- XFANQCRHTMOEAP-WDSOQIARSA-N Lys-Pro-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O XFANQCRHTMOEAP-WDSOQIARSA-N 0.000 claims 3
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 claims 3
- NMELOOXSGDRBRU-YUMQZZPRSA-N Pro-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 NMELOOXSGDRBRU-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims 3
- FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N Pro-Ser-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 3
- OKDNSNWJEXAMSU-IRXDYDNUSA-N Tyr-Phe-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OKDNSNWJEXAMSU-IRXDYDNUSA-N 0.000 claims 3
- 108010081404 acein-2 Proteins 0.000 claims 3
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 108010050475 glycyl-leucyl-tyrosine Proteins 0.000 claims 3
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 claims 3
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 claims 3
- DFCIPNHFKOQAME-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DFCIPNHFKOQAME-FXQIFTODSA-N 0.000 claims 2
- YAXNATKKPOWVCP-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asn-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YAXNATKKPOWVCP-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 85
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 76
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 57
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 55
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 53
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 51
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 50
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 36
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 35
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 27
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 23
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 22
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 21
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 19
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 18
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 17
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 14
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 14
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 description 11
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 9
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 9
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 9
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 7
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 7
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 7
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 6
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 6
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 5
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 5
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 4
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- -1 methionine amino acid Chemical class 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- CHFFHQUVXHEGBY-GARJFASQSA-N Ala-Lys-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N CHFFHQUVXHEGBY-GARJFASQSA-N 0.000 description 2
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MFVQGXGQRIXBPK-WDSKDSINSA-N Gly-Ala-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFVQGXGQRIXBPK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGBMPFKFKXYROZ-UFYCRDLUSA-N Val-Tyr-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O)N PGBMPFKFKXYROZ-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 2
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate Chemical compound [Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011874 heated mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 2
- 210000002864 mononuclear phagocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 229940055019 propionibacterium acne Drugs 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- VNDYJBBGRKZCSX-UHFFFAOYSA-L zinc bromide Chemical compound Br[Zn]Br VNDYJBBGRKZCSX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N (2s)-2-azanyl-5-[bis(azanyl)methylideneamino]pentanoic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N 0.000 description 1
- YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 2-azanyl-3-sulfanyl-propanoic acid Chemical group SCC(N)C(O)=O.SCC(N)C(O)=O YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IFDSZZKEBWQHJE-UHFFFAOYSA-N 4-nitro-5-(2,4,6-trimethylphenyl)sulfonyl-2h-triazole Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)N=NN1 IFDSZZKEBWQHJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- REWSWYIDQIELBE-FXQIFTODSA-N Ala-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O REWSWYIDQIELBE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000186427 Cutibacterium acnes Species 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N Glu-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- WRPDZHJNLYNFFT-GEVIPFJHSA-N His-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O WRPDZHJNLYNFFT-GEVIPFJHSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N Leu-Gly-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 206010024305 Leukaemia monocytic Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- HXNYBZQLBWIADP-WDSKDSINSA-N Pro-Cys Chemical compound OC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HXNYBZQLBWIADP-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- RYJRPPUATSKNAY-STECZYCISA-N Pro-Ile-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 RYJRPPUATSKNAY-STECZYCISA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YRBGKVIWMNEVCZ-WDSKDSINSA-N Ser-Glu-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O YRBGKVIWMNEVCZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N Thr-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(O)=O DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N Thr-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- CRCHQCUINSOGFD-JBACZVJFSA-N Trp-Tyr-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N CRCHQCUINSOGFD-JBACZVJFSA-N 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010075344 Tryptophan synthase Proteins 0.000 description 1
- DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N Tyr-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- REJBPZVUHYNMEN-LSJOCFKGSA-N Val-Ala-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N REJBPZVUHYNMEN-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- GJNDXQBALKCYSZ-RYUDHWBXSA-N Val-Phe Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 GJNDXQBALKCYSZ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- JSOXWWFKRJKTMT-WOPDTQHZSA-N Val-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N JSOXWWFKRJKTMT-WOPDTQHZSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical group C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- BLEBFDYUDVZRFG-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;propan-2-ol Chemical compound ClCCl.CC(C)O BLEBFDYUDVZRFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethanethiol Chemical compound CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical group CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000002655 kraft paper Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 201000006894 monocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 208000018655 severe necrosis Diseases 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 239000000003 vaginal tablet Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229940102001 zinc bromide Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/828—Cancer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
- Image Analysis (AREA)
Description
86992
Menetelmä ihmisen kasvainnekroositekijän valmistamiseksi ja menetelmässä käytettävä plasmidi
Keksintö koskee deoksiribonukleiinihappoa (käytetään tästä lähtien lyhennettä "DNA"), joka koodittaa uutta ihmisen fysiologisesti aktiivista polypeptidiä. Keksintö koskee myös replikoituvaa, kyseisen DNA-jakson sisältävää DNA:ta, replikoituvalla DNA:11a transformoitunutta mikro-organismia, uutta ihmisen fysiolo gisesti aktiivista polypeptidiä, joka on DNA:n ilmenty-mistuote, oleellisesti ottaen puhdasta ihmisen fysiologisesti aktiivista polypeptidiä, jolla on tässä selostuksessa mainittu aminohappojärjestys, sekä menetelmää ihmisen fysiologisesti aktiivisen polypeptidin valmistamiseksi. Tarkemmin sanottuna keksintö koskee ihmisen kasvainnekroositeki jää (TNF, Tumor Necrosis Factor) koodittavaa DNA:ta, jonka kasvainnekroositekijän aminohappojärjestys on johdettu DNA:n emäsjärjestyksestä, menetelmää ihmisen kasvainnekroositekijän valmistamiseksi DNA: sta käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa ja menetelmällä saadun tuotteen käyttöä.
Tässä selostuksessa käytetään aminohapoista ja peptideistä jäljempänä mainittuja IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclaturen (CBN) hyväksymiä lyhenteitä. Mitä tulee aminohappoihin ja vastaaviin yhdisteisiin, joilla on isomeerejä, tarkoitetaan seuraavilla lyhenteillä L-konfiguraatiota, ellei toisin mainita.
Gin: glutamiinitähde Asp: asparagiinihappotähde Pro: proliinitähde Tyr: tyrosiinitähde Vai: valiinitähde Lys: lysiinitähde 2 86992
Glu: glutamiinihappotähde Ala: alaniinitähde Asn: asparagiinitähde Leu: leusiinitähde Phe: fenyylialaniinitähde Gly: glysiinitähde His: histidiinitähde Ser: seriinitähde Thr: treoniinitähde Ile: isoleusiinitähde Trp: tryptofaanitähde Arg: arginiinitähde Met: metioniinitähde Cys: kysteiinitähde
Polydeoksiribonukleotidit ja oligodeoksiribonuk-leotidit esitetään deoksinukleotiditähdesekvensseinä, joissa käytetään seuraavia lyhenteitä: A: 2'-deoksiadenyylihappotähde C: 2'-deoksisytidyylihappotähde G: 21-deoksiguanyylihappotähde T: tymidyylihappotähde
Ellei toisin ole ilmoitettu, on deoksinukleotidi-sekvenssin vasen pää 5'-pää.
Ennestään tunnetaan erilaisia aineita, jotka kykenevät stimuloimaan retikuloendoteelijärjestelmää. Tällaisia ovat esimerkiksi grampositiivisten bakteerien ja endotoksiinien indusoimat fysiologisesti aktiiviset aineet, joilla on kasvaintenvastainen vaikutus. Erityisesti Carswell et ai havaitsivat, että sveitsiläisten CD-1-hiirten seerumilla, kun hiiret on ensin in-fektoitu Calmette-Guörin-bakteerilia (BCG) ja tästä kahden viikon kuluttua injektoitu endotoksiinia intra-venoosisesti, on sytotoksinen vaikutus viljeltyihin L-soluihin, ja että se indusoi verenvuotonekroosin Meth A-sarkoomasiirrännäiseen (BALB/c x C57BL/6)-hiirillä. Nämä tutkijat antoivat seerumin sisältämälle vaikut- 3 86992 tavalle aineelle nimeksi kasvainnekroositekijä (TNF,
Tumor Necrosis Factor) (Proc.Nat.Acad.Sei.USA, Voi.
72 (No. 9), ss. 3666-3670 (1975)). Tämän jälkeen Ruff et ai. raportoivat, että edellämainitulla Carswell et ai: n menetelmällä valmistettu kanin kasvainnekroositekijä oli saatu puhdistetuksi n. 2000-kertaiseksi seerumin pitoisuuteen verrattuna (J. Immunol., Voi. 125 (No. 4 ), ss. 1671-1677 (1980)). Lisäksi Matthews et ai. ovat raportoineet puhdistaneensa kanin kasvainnekroositekijän n.
1000-kertaiseksi seerumin pitoisuuteen verrattuna (Br.
J. Cancer., Voi. 42, ss. 416 - 422 (1980)). Kuitenkaan Ruff et ai.ja Matthews et ai. eivät ole varmistaneet puhdistetun kasvainnekroositekijän kasvainnekroosivaiku--tusta eläinkokeilla.
Japanilaisessa julkisessa patenttihakemuksessa no. 57-140725(1982) selostetaan menetelmää kasvaintenvas-taisen aktiivisuuden omaavan fysiologisesti aktiivisen proteiiniaineen eristämiseksi ja puhdistamiseksi, joka aine indusoidaan nisäkkäässä, kuten hiiressä, kanissa tai marsussa, antamalla vähintään yhtä ainetta, joka kykenee stimuloimaan retikuloendoteelijärjestelmää, ja injektoimalla nisäkkääseen sen jälkeen gramnegatiivi-sen bakteerin endotoksiinia tai lisäämällä gramnegatii-visen bakteerin endotoksiinia kudosviljelmään, joka sisältää nisäkkään aktivoituneita makrofaageja. Tässä japanilaisessa julkisessa patenttihakemuksessa mainitaan myös puhdistetun fysiologisesti aktiivisen proteiini-aineen molekyylipaino ja isoelektrinen piste (molekyy-lipaino: 39 000 + 5 000 geelisuodatuksella ja SDS-poly-elektroforeesilla mitattuna; isoelektrinen piste: pH
3,9 + 0,3 isoelektrisellä fokusoinnilla mitattuna), mutta aineen yksityiskohtainen rakenne ei ilmene ko. hakemuksesta .
Toisaalta Matthews mainitsee, että voidaan saada aikaan aine, jolla on sytotoksinen vaikutus L-soluihin, injektoimalla BCG:tä kaniin ja ottamalla talteen mono-nukleaariset fagosyytit kanin eri kudoksista kahden vii- 4 86992 kon kuluttua injektoinnista, jonka jälkeen mononukle-aaristen fagosyyttien soluviljelmään lisätään endotok-siinia (Br. J. Cancer, Voi. 44 (3), ss. 418 - 424 (1981)). Kuitenkaan tässä raportissa ei ole saadun aineen yksityiskohtaista rakennetta eikä mitään todisteita siitä, että saatu aine olisi identtinen seerumissa olevan kasvainnekroositekijän kanssa.
Lisäksi on olemassa lukuisia painettuja julkaisuja, joissa mainitaan tekijöistä, joilla on kasvainnekroosi-tekijän kaltainen bioaktiivisuus tai sitä muistuttava bio-aktiivisuus. Esimerkiksi Reed et ai.löysivät tällaisen tekijän ihmisen perifeerisen veren makrofaageista ja vastaavista (J. Immunology, Voi. 115, s. 395 (1975)), Matthews et ai. ihmisen perifeerisen veren monosyyteis-tä tai myelogeenista monosyyttistä leukemiaa sairastavalta johdetuista leukemiasoluista (Immunology, Voi. 44 , s. 135 /1981)), D. Barbara Epstein-barr-viruksella transformoituneista ihmisen B-soluista (Proc. Nat.Acad.Sei.
USA, Voi. 80, s. 5397 (1983)) ja B. Bharat lymfoblastoi-disolulinjasta 1788. Edellämainitut tekijät on mainittu myös japanilaisissa julkisissa patenttihakemuksissa no. 58-15921 (1983), 58-21621 (1983), 58-107197 (1983) ja 58-225024 (1983) ja brittiläisissä julkisissa patenttihakemuksissa no. 2 106 117 ja 2 117 385. Kuitenkaan tähän mennessä ei ole vielä onnistuttu löytämään soluja tai solulinjoja, jotka kykenevät tuottamaan tällaisia tekijöitä tehokkaasti. Lisäksi näistä tekijöistä on selvittämättä monia seikkoja, kuten rakenteet ja ominaisuudet .
Ito (japanilainen patenttihakemus no. 58-251817 (1983)) on tutkinut kanin kasvainnekroositekijän ja kanin kasvainnekroositekijää tuottavien solujen ominaisuuksia ja rakennetta. Tämän tuloksena hän sai aikaan soluja, jotka kykenevät tuottamaan ainetta, jolla on sytotoksinen vaikutus L-soluihin, antamalla rcfcikulo-endoteelijärjestelmää stimuloivaa ainetta kanille ja injektoimalla sen jälkeen kaniin bakteerista johdet- 5 86992 tua endotoksiinia, ja näitä soluja käyttänällä hän sai sitten tällaista ainetta. Hän todisti myös, että edellä saatuja soluja käyttämällä valmistetun aineen, jolla on sytotoksinen vaikutus L-soluihin, molekyylipaino ja immunologiset ominaisuudet ovat samat kuin kanin seerumista saadulla kasvainnekroositekijällä. Geenitekniikan kehityksen myötä tuli mahdolliseksi määrittää proteiinin rakenne, jos vaan proteiinia koodittava DNA onnistutaan eristämään. Tämä johtuu siitä, että eristetyn DNA:n rakenne voidaan määrittää ja sen jälkeen DNA:n rakenteen perusteella voidaan päätellä proteiinin rakenne. Lisäksi tuli mahdolliseksi tuottaa proteiinia tätä proteiinia koodittavan DNA:n avulla käyttämällä mikro-organismi- tai soluviljelmiä. Ito sovelsi edellämainittuja geenitekniikan menetelmiä soluihin, jotka kykenivät tuottamaan ainetta, jolla on sytotoksinen vaikutus L-soluihin. Tämän seurauksena hän kykeni eristämään kanin kasvainnekroositekijää koodittavan DNA:n, määrittämään tämän DNA:n ja kanin kasvainnekroosite-kijän rakenteen ja tuottamaan kanin kasvainnekroosite-kijää tätä DNA:ta käyttämällä.
Edelläselostetun perusteella voidaan hyvin ymmärtää, että Ito saavutti suuren menestyksen tuottaessaan kanin kasvainnekroositekijää. Kuitenkin on syytä ottaa huomioon, että annettaessa kasvainnekroositekijää eläimelle, josta kasvainnekroositekijä ei ole lähtöisin, saatetaan aiheuttaa anafylaktinen shokki. Tämä johtuu siitä, että kasvainnekroositekijä on polypeptidi, joka toimii antigeeninä vasta-ainetta tuottaen muulle eläimelle annettuna. Jos siis kasvainnekroositekijää halutaan antaa ihmiselle, on mieluiten käytettävä ihmisperäistä kasvainnekroositeki jää. Mutta ei edes ihmi sen kasvainnekroositekijän rakennetta ole onnistuttu tähän mennessä selvittämään. Näin ollen on ollut olemassa suuri tarve saada määritetyksi ihmisen kasvainnekroositeki jää koodittavan DNA:n rakenne.
Esillä olevan keksinnön tekijät ovat tutkineet laajasti ja syvällisesti ihmisen kasvainnekroositeki- 6 86992 jää koodittavan DNA:n rakennetta. Tämän tuloksena keksijät ovat yllättäen havainneet, että ihmisen polypep-tidin geeni ja kanin kasvainnekroositekijän geeni voidaan kloonata käyttämällä koettimena kanin cDNArta, että ihmisen polypeptidiä koodittava DNA voidaan eristää taidokkaasti ja sen rakenne määrittää vertaamalla kanin kasvainnekroositekijän geeniä, ihmisen polypeptidin geeniä ja kanin cDNA:ta toisiinsa niiden emässekvenssien homologiaa hyväksikäyttäen, että ihmisen polypeptidiä koodittavan puhtaan DNA:n rakenne voidaan taidokkaasti määrittää ja saada aikaan puhdas DNA, ja että ihmisen polypeptidiä koodittavaa DNA:ta käyttämällä valmistetulla ihmisen polypeptidillä on sytotoksinen vaikutus L-soluihin.
Esillä oleva keksintö perustuu näihin uusiin havaintoihin .
Näin ollen keksinnön tarkoituksena on tarjota ihmisen fysiologisesti aktiivinen polypeptidi.
Edelleen keksintö tarjoaa ihmisen kasvainnek-roositekijää koodittavan DNA:n.
Edelleen keksintö tarjoaa replikoituvan yhdis-telmä-DNA:n, joka sisältää ihmisen kasvainnekroosi-tekijää koodittavan DNA:n ja replikoituvan ilmentymis-välineen.
Vielä keksintö tarjoaa mikro-organismin tai solun, joka on transformoitunut edellämainitun kaltaisella yhdistelmä-DNA:11a.
Vielä keksintö tarjoaa menetelmän edellämainitun kaltaisen ihmisen fysiologisesti aktiivisen polypeptidin tuottamiseksi.
Edellämainitut ja muut tämän keksinnön kohteet, ominaisuudet ja edut ilmenevät seuraavasta yksityiskohtaisesta selostuksesta sekä liitteenä olevista piirroksista joista:
Kuva 1 esittää sellaisten plasmidi-inserttien restriktio-karttoja, jotka kukin sisältävät tavallista kanin fysiologisesti aktiivista polypeptidiä koodittavan DNA:n.
7 86992
Kuva 2 on kaavio menetelmästä, jolla valmistetaan tavallista kanin fysiologisesti aktiivista poly-peptidiä koodittava yhdistelmä-DNA (pTNF-lac-1).
Kuva 3 on kaavio menetelmästä, jolla valmistetaan toinen kanin fysiologisesti aktiivista poly-peptidiä koodittava yhdistelmä-DNA (pTNF-lacUV-5-1) .
Kuva 4 on restriktiokartta osasta plasmidia, joka sisältää tämän keksinnön mukaisen ihmisen fysiologisesti aktiivisen polypeptidin geenin.
Kuva 5 on restriktiokartta osasta plasmidia, joka sisältää tavallisen kanin fysiologisesti aktiivisen polypeptidin geenin.
Kuva 6 on kaavio menetelmästä, jolla valmistetaan tämän keksinnön mukainen ihmisen fysiologisesti aktiivista polypeptidiä koodittava yhdistelmä-DNA (pHTNF-lacUV5-1).
Kuva 7 on kaavio menetelmästä, jolla valmistetaan toinen tämän keksinnön mukaista ihmisen fysiologisesti aktiivista polypeptidiä koodittava yhdistelmä-DNA (pHTNF-lacUV5-2).
Oleellisesti ottaen tämä keksintö tarjoaa ihmisen fysiologisesti aktiivisen polypeptidin, jolla on seu-raavan kaavan (I) mukainen aminohappojärjestys:
Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Vai Ala His Vai Vai
Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Vai Glu Leu Arg Asp Asn Gin
Leu Vai Vai Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Vai
Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Vai Leu Leu Thr
His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Vai Ser Tyr Gin Thr Lys Vai A.sn
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu
Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly 8 B 6 992
Vai Phe Gin Leu Glu Lvs Gly Asp A.rg Leu Ser Ala Glu lie A.sn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe A.la Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly lie lie Ala Leu jossa Gin on glutamiinitähde, Asp asparagiinihappo-tähde, Pro proliinitähde, Tyr tyrosiinitähde, Val valiinitähde, Lys lysiinitähde, Glu glutamiinihappo-tähde, Ala alaniinitähde, Asn aspagiinitähde, Leu leusiinitähde, Phe fenyylialaniinitähde, Gly glysii-nitähde, His histidiinitähde, Ser seriinitähde, Thr treoniinitähde, Ile isoleusiinitähde, Trp tryptofaani-tähde, Arg arginiinitähde, Met metioniinitähde ja Cys kysteiinitähde.
Tämän keksinnön mukainen ihmisen fysiologisesti aktiivinen polypeptidi kattaa myös polypeptidin, jossa on metioniiniaminohappo liittyneenä edellämainitun aminohapposekvenssin N-päähän, sekä välituotteen, jossa on ihmisen kasvainnekroositekijän signaali osana tai kokonaisena liittyneenä edellämainitun aminohapposekvenssin N-päähän. On mahdollista muuntaa polypeptidiä koodittavan DNA:n rakenteen osaa luonnollisella tai keinotekoisella mutatoinnilla vaikuttamatta oleellisesti polypeptidin aktiivisuuteen. Tämän keksinnön mukainen ihmisen fysiologisesti aktiivinen polypeptidi kattaa polypeptidin, jonka rakenne vastaa edellämainitun aminohapposekvenssin omaavan polypeptidin homologista varianttia tai homologisia variantteja. Kaikista tällaisista fysiologisesti aktiivisista polypep-tideistä käytetään tästä lähtien nimitystä "ihmisen kasvainnekroositekijä".
Edelleen keksintö tarjoaa deoksiribonukleiini-hapon, jonka emässekvenssi koodittaa ihmisen fysiologisesti aktiivista polypeptidiä, jonka aminohappojärjestys on seuraavan kaavan (I) mukainen: 9 8699?
Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Vai Vai
Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin
Leu Val Val Pro Ser Glu Gly. Leu Tyr Leu He Tyr Ser Gin Val
Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr
His Thr He Ser Arg He Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn
Leu Leu Ser Ala lit- Lys 5er Pro Cys Gin Ars G;u Thr Pro Glu
Gly Ala Glu Ala Lys Pro Tr? Tyr Glu Pro He Tyr Leu Gly Gly
Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu He Asn
Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe
Gly He He Ala Leu jossa Gin on glutamiinitähde, Asp on asparagiinihappo-tähde, Pro on proliinitähde, Tyr on tyrosiinitähde,
Vai on valiinitähde, Lys on lysiinitähde, Glu on glut-amiinihappotähde, Ala on alaniinitähde, Asn on aspara-giinitähde, Leu on leusiinitähde, Phe on fenyyliala-niinitähde, Gly on glysiinitähde, His on hsitidiini-tähde, Ser on seriinitähde, Thr on treoniinitähde,
He on isoleusiinitähde, Trp on tryptofaanitähde,
Arg on arginiinitähde, Met on metioniinitähde ja Cys on kysteiinitähde.
Edelleen keksintö tarjoaa deoksiribonukleiini-hapon, joka sisältää seuraavan kaavan (II) mukaisen emässekvenssin ja/tai mainitun emässekvenssin komplementaarisen emässekvenssin:
TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA
GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG
GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
10 86992
CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC
CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC
CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC
CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG
GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG
GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT
CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT
GGG ATC ATT GCC CTG
jossa A on deoksiadenyylihappotähde, G on deoksiguanyy-lihappotähde, C on deoksisytidyylihappotähde ja T on tymidyylihappotähde ja kaavan (II) vasemmassa päässä on 5'-hydroksyyliryhmä ja oikeassa päässä 3'-hydr-oksyyliryhmä.
Tämän keksinnön mukainen DNA kattaa DNA:n, jossa on ATG-kodoni (A, T ja G ovat edellämääriteltyjä) liittyneenä edellämainitun emässekvenssin 5'-päähän, jotta saadaan tuotetuksi kypsää ihmisen kasvainnekroositeki-jää viljelemällä mikro-organismia. Tämän keksinnön mukainen DNA kattaa myös sellaisen DNA:n, joka sisältää 5'-oheis-DNA-sekvenssin, joka koodittaa ihmisen kasvainnekroositekijän signaalipeptidiä osaksi tai kokonaan.
DNA:n rakennetta ja kaavasta johdetun polypepti-din rakennetta voidaan osittain muuntaa luonnollisella tai keinotekoisella mutatoinnilla vaikuttamatta poly-peptidin pääaktiivisuuteen. Näin ollen tämän keksinnön mukainen DNA voi vaihtoehtoisesti sisältää emässekvenssin, joka koodittaa polypeptidiä, joka on rakenteeltaan minkä tahansa edellämainitun polypeptidin homologinen variantti.
Geneettisen koodin degeneroitumisen tuloksena on mahdollista korvata ainakin yksi geenin emässekvenssin angs toisenlaisella emäksellä silti aiheuttamatta geenin tuottaman polypeptidin aminohappojärjestyksen muut- 11 86992 tumista. Näin ollen tämän keksinnön mukaisella DNA:11a voi olla mikä tahansa emässekvenssi, joka on muuttunut geneettisen koodin degeneroitumisen mukaisella substituutiolla. Tällöin mainitun substituution kautta syntyneestä emässekvenssistä johdettu aminohappo-järjestys on on identtinen edellämainitun kaavan (I) mukaisen aminohappojärjestyksen kanssa.
Edelleen keksintö tarjoaa replikoituvan yhdistel-mä-DNA:n, joka sisältää keksinnönmukaisen, edellämainitun deoksiribonukleiinihapon ja replikoituvan ilmen-tämisvälineen. Yhdistelmä-DNA kykenee transformoituneessa mikro-organismiviljelmässä ilmentämään polypeptidin, joka sisältää ihmisen kasvainnek-roositekijän aminohappojärjestyksen. Sopivista il-mentämisvälineistä voidaan mainita esim. pHTNF-lacUV5-1 ja pHTNF-lacUV5-2.
Edelleen tämä keksintö koskee mikro-organismiviljelmää, joka on transformoitunut yhdistelmä-DNArlla, joka kykenee ilmentämään polypeptidin, jossa on ihmisen kasvainnekroositekijän aminohapposekvenssi. Esimerkkejä tällaisista mikro-organismiviljelmistä ovat mm. Escherichia coli ja Bacillus subtilis.
Lisäksi keksintö tarjoaa menetelmän tämän keksinnön mukaisen ihmisen kasvainnekroositekijän tuottamiseksi siten, että (a) liitetään edelläolevan kaavan (II) mukainen deoksiribonukleiinihappo replikoituvaan ilmentämisväli-neeseen niin, että saadaan replikoituva yhdistelmä-DNA, joka sisältää mainitun deoksiribonukleiinihapon ja mainitun ilmentämisvälineen; (b) transformoidaan mikro-organismiviljelmän solut mainitulla replikoituvalla yhdistelmä-DNA: 11a niin, että saadaan transformantteja; (c) valitaan mainitut transformantit mikro-organismiviljelmän kantasolujen joukosta; (d) inkuboidaan mainittuja transformantteja niin, 12 86 992 että saadaan ne ilmentämään mainittu deoksiribonukle-iinihappo ja tuottamaan ihmisen kasvainnekroositekijää; ja (o) eristetään ihmisen kasvainnekroosiieki jö inkuboiduista transformanteista.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä liitetään edellämainittu tämän keksinnön mukainen polydeoksi-ribonukleiinihappo replikoituvaan ilmentämisvälinee-seen vektoriksi niin, että saadaan replikoituva yh-distelmä-DNA, joka sisältää edellämainitun polydeoksi-ribonukleiinihapon. Mikro-organismiviljelmä transformoidaan näin saadulla replikoitavalla yhdiste lmä-DNA: 11a , jotta saadaan yhdistelmä-DNA:n sisältävä transformoitunut mikro-organismiviljelmä.
Näin saadut transformantit erotetaan kantamikro-orga-nismiviljelmästä DNA:n antaman fenotyyp-pisen ominaisuuden perusteella. Näin saatua transformoitunutta mikro-organismiviljelmää kasvatetaan niin, että saadaan aikaan edellämainitun deoksiribonukleiinihapon koodittaman geneettisen informaation ilmentyminen, jolloin syntyy tämän keksinnön mukaista kasvainnekroositekijää.
Edelleen keksintö koskee kypsässä muodossa olevaa ihmisen kasvainnekroositekijää, joka erittyy isän-täsoluista suorana ilmentymistuotteena. Ihmisen kypsän kasvainnekroositekijän valmistuksesta mainittakoon esimerkiksi menetelmä, jossa rakennetaan DNA-sekven-si, joka koodittaa 15-40 aminohapon muodostamaa signaalipeptidinä tunnettua aminohapposekvenssiä, joka on johdettu mikro-organismista tai korkeammasta . . eläimestä ja on liittyneenä kasvainnekroositekijään ennen kypsymistä.
Ihmisen kasvainnekroositekijä voidaan saada aikaan seuraavalla tavalla: 1. Käytetään bakteriofaagiX/kanin geenikirjastoa ja bakteriofaagi λ/ihmisen geenikirjastoa, jotka professori T. Maniatis oli valmistanut (Department of 13 86992
Biochemistry and Molecular Biology, Harvard University, 7 Divinity Avenue, Cambridge, Massachusetts 02138 USA). Nämä raaka-aineet voidaan valmistaa seuraa-valla tavalla (ks. Cell, J_5, s. 687 (1978)): (1) Kanin tai ihmisen kudos, esim kanin tai ihmisen haimakudos, hienonnetaan jäädytetyksi jauheeksi ja käsitellään RNA:n ja proteiinimateriaalin hajotta-mistarkoituksessa, jonka jälkeen saadaan saostuksen avulla suurimolekyylinen kanin tai ihmisen DNA-materi-aali.
(2) Suurimolekyylinen DNA pilkotaan osittaisesti satunnaisesti kohdennetulla leikkauksella geenilokuksen suhteen.
(3) Näin saadut DNA-jaksot fraktioidaan koon perusteella niin, että saadaan 15-20 kiloemäksen (ke) pituisia jaksoja.
(4) Vaiheessa 3 saadut jaksot kloonataan käyttämällä λ Charon 4A-faagivektoria.
(5) Näin saadut vektorit pakataan in vitro rDNA:ta sisältäviin infektoiviin faagipartikkeleihin niin, että saadaan edellämainittu kanin tai ihmisen geenikirjas-to.
2. Vertailuesimerkissä 3 saatu kanin kasvainnekroosi- 32 tekijän cDNA leimataan P:llä käyttämällä P.W.J.
Rigby et al:n nick-luentamenetelmää (ks. J.Mol.Biol.
113, s. 237 (1977)).
3. Bakteriofaagi λ/kanin geenikirjastoa ja bakteriofaa- gi λ/ihmisen geenikirjastoa kasvatetaan kutakin levyllä: bakteerikerroksen päällä oleellisesti ottaen yhtymiseen (confluence) asti ja suoritetaan seulonta hybridisoi-32 maila P:llä leimatulla kanin kasvainnekroositekijän cDNA:11a.
: r 4. Lupaavista klooneista eristetään vastaava DNA ja se . .·. restriktiokartoitetaan ja analysoidaan Southernin hybri- . · . disointimenetelmällä (ks. Southern, J. Mol. Biol., 98, s.
503 (1975)). Kanin tai ihmisen kasvainnekroositekijän geenejä sisältävät restriktiojaksot alakloonataan plas- 14 86992 midivektoreihin ja sen jälkeen'sekvensoidaan.
5. Kanin kasvainnekroositekijän cDNA:n emässekvenssiä verrataan kanin kasvainnekroosigeenin vastaavaan, jotta saadaan määritetyksi eksonit (tietyt emässekvennsit, jotka koodittavat kanin kasvainnekroositekijän aminohappo-järjestystä) ja intronit (tietyt emässekvenssit, jotka eivät koodita kanin kasvainnekroositekijän aminohappo-sekvenssiä) kanin kasvainnekroositekijän geenistä.
6. Tämän jälkeen ihmisen kasvainnekroositekijän geenin emässekvenssiä verrataan kanin kasvainnekroositeki-jän vastaavaan, jotta saadaan määritetyksi ihmisen kasvainnekroositekijän geenin eksonit ja intronit.
7. Varmistetaan, että kanin kasvainnekroositekijän aminohapposekvenssi, joka on päätelty emässekvenssis-tä, joka on saatu poistamalla intronit kanin kasvainnekroositeki jästä ja yhdistämällä eksonit toisiinsa, vastaa sitä aminohapposekvenssiä, joka on päätelty kanin kasvainnekroositekijän cDNA:n emässekvenssistä.
8. Seuraavaksi ihmisen kasvainnekroositekijän aminohappojärjestys päätellään ihmisen kasvainnekroositeki-jää koodittavan DNA:n emässekvenssistä, joka on saatu poistamalla intronit ihmisen kasvainnekroositekijän geenistä ja yhdistämällä eksonit. Ihmisen kasvainnekroositeki jän aminohappojärjestyksen todetaan olevan osittain sama kuin kanin kasvainnekroositekijässä.
9. Sitten ihmisen kasvainnekroositekijää koodattava DNA valmistetaan räätälintyönä in vitro liitettäväksi sopivaan ilmentämisvälineeseen, jotta saadaan DNA:ta koodattava yhdistelmä-DNA. Yhdistelmä-DNA:11a transformoidaan sopiva isäntäsolu, jonka puolestaan annetaan kasvaa viljelmässä ja ilmentää haluttua ihmisen kasvainnekroositekijää.
10. Näin saadussa, kypsässä muodossa olevassa ihmisen kasvainnekroositekijässä on 155 aminohappotähdettä alkaen seriinistä. Kun tekijän presekvenssissä on sig-naalipeptidi, on viimeksimainittu luonteeltaan hyvin hydrofobinen.
15 86992
Edellä on selostettu toimenpiteitä, joilla saadaan aikaan ihmisen kasvainnekroositekijän geeni, ihmisen kasvainnekroositekijää koodittavan DNA:n emäs-sekvenssi, sekä menetelmää ihmisen kasvainnekroositeki jän tuottamiseksi tätä DNA:ta käyttämällä- Kuitenkin on syytä huomata, ettei edelläolevalla selostuksella ole tarkoitus rajoittaa keksintöä, ja että alan ammatti-ihmiset voivat soveltaa itsestään selviä muunnoksia silti poikkeamatta keksinnön oleellisista tunnusmerkeistä ja perusperiaatteesta.
Johtuen kutakin aminohappoa vastaavan kodonin (geneettinen koodi) vaihtelevasta käyttötaajuudesta sekä muista syistä, voidaan ihmisen kasvainnekroositeki jää koodittava DNA:n emässekvenssi osaksi tai kokonaan korvata orgaanisella, kemiallisesti syntetisoidulla DNA:11a silti aiheuttamatta tästä saadun polypeptidin aminohappojärjestyksen muuttumista.
Oletettavasti voidaan ihmisen kasvainnekroositeki jää tuottaa solunsisäisesti epäkypsässä muodossa, kuten prepeptidinä tai prepropeptidinä, joka voi välituotteen kautta prosessoitumalla muuttua kypsäksi kasvainnekroositekijäksi. Ihmisen kasvainnekroosi-tekijän epäkypsä muoto voidaan päätellä ihmisen kasvainnekroositeki jän geenin emäsjärjestyksestä. Sellaiseen kasvainnekroositekijän DNA:han, joka sisältää epäkypsän tai välituotemuodossa olevan kasvainnekroosi-tekijän DNA:n, voidaan myös liittää luontainen tai keinotekoisesti syntetisoitu DNA-jakso.
Eräässä tämän menetelmän sovellutuksessa voidaan kypsän, välituotteen muodossa olevan tai epäkypsän kasvainnekroosi-DNA:n 5'-päähän sijoittaa metioniini-kodoni (ATG) ja vähintään yksi lopetuskodoni (TAA, TAG tai TGA) vastaavasti 3'-päähän. Metioniinikodo-nin läsnäolosta johtuen, voidaan kypsää, välituotteen muodossa olevaa tai epäkypsää kasvainnekroositekijää tuottaa mRNArlla, joka syntetisoituu sopivan promoottorin avulla. Kuitenkin kasvainnekroositekijän N-: päähän liittynyt metioniinitähde lohkeaa tai jää loh- 16 86992 keamatta riippuen käytetystä isäntäsolusta. Lopetus-kodonin tarkoitus on pysäyttää kasvainnekroositekijän DNA: s ta transkriboidun mRNA:n luenta oikeassa koh dassa (kaavan I mukaisen polypeptidin C-pää).
Toisessa tämän menetelmän sovellutuksessa voidaan DNA:han liittää erittäin hydrofobista "signaali-sekvenssiä" koodittava emässekvenssi. Tämän lisäyksen ansiosta saattaa olla mahdollista erittää kas-vainnekiroositekijä isäntäsolun ulkopuolelle tai gramnegatiivisten bakteerien ollessa kyseessä ns. "peri-plasmiseen tilaan".
Kun käytetään vektoria, joka sisältää aloitus-kodonin, voidaan saada aikaan fuusiopeptidi, jossa on ihmisen kasvainnekroositekijä ja vektorista peräisin oleva peptidi. Tässä tapauksessa voidaan fuusiopeptidi katkaista kemiallisesti tai entsymaattisesti. Jos ihmisen kasvainnekroositekijän pääasialliseen aktiivisuuteen ei ole vaikutettu, voidaan fuusiopep-tidiä käyttää myös sellaisenaan.
Ihmisen kasvainnekroositekijän DNA:n 5'-pään yläpuolelle voidaan liittää promoottori, jolloin saadaan kasvainnekroositekijän DNA-promoottorisekvenssi, joka ei estä replikoitumista eikä vaikuta haitallisesti . näin syntyvän RNA:n luentaan. Näin saatu kasvainnek roositeki jän DNA”promoottorisekvenssi voidaan liittää bakteerissa replikoi- tuvaan vektoriin niin, että saadaan aikaan yhdistelmä-geeni. Näin saadulla yhdistelmägeenilla voidaan transformoida isäntänä toimiva bakteeri.
Näin saatua transformanttia voidaan viljellä niin, että kasvainnekroositekijän geeni ilmentyy ja tuottaa ihmisen kasvainnekroositekijää.
Kun edellämainittuna isäntänä käytetään Escherichia colia, tulevat kysymykseen mm. E. coli K-12:n eri mutanttikannat, kuten HB101(ATCC 33694), C600K(ATCC 33955), D1210, RRI(ATCC 31343), MC1061, LE392(ATCC 33572), JM101 (ATCC 33876), JM83ja χ1776 (ATCC 31244). Kun isäntänä käytetään E. colia, ovat sopivia vektoreita '7 86992 esimerkiksi plasmidit pBR322 , pBR325, pBR327, pUC8, pöeg, pMB9(ATCC 37019), pJB8 (ATCC 37074) ja pKC7(ATCC 37084), λ-faagit, kuten Agt, AB ja Charon 4A ja M13-faagi.
Jotta E. coli tuottaisi kasvainnekroositekijää, voidaan promoottori valita E. colin geenien ja faagigeenien promoottorien joukosta. Sopivia promoottoreja ovat esimerkiksi laktoosinhajotusentsyymin promoottori (LAC), sen UV5-mutantti, penisillinaasin promoottori (BLA), tryptofaanin syntetaasin promoottori (TRP), λ-faagin P^-promoottori ja tac-promoottori, joka on tryptofaanisyntetaasin ja laktoosinhajotusentsyymin fuusioitunut promoottori.
Kun isäntänä käytetään Bacillus subtilista, tulevat kysymykseen esim. BDl70-kanta (ATCC 33608), BR151-kanta (ATCC 33677) ja MI112-kanta (ATCC 33712). Kun käytetään Bacillus subtilis-isäntää, ovat sopivia vektoreita mm. plasmidit pd94 (ATCC 37034), pUBl10 (ATCC 37015), pSA2100 (ATCC 37014) japEl94. Lisäksi, kun käytetään Bacillus subtilis-isäntää, ovat sopivia promoottoreja mm. kloramfenikolin asetyloitu-misentsyymin promoottori (CAT), penisillinaasin promoottori ja antierytromysiinin promoottori.
18 86992 Tämän keksinnön mukainen kasvainnekroositeki-jä on uusi ihmisen fysiologisesti aktiivinen polypeptidi, joka saa aikaan kasvainten nekroosin ilman elimistön normaaleihin kudok siin kohdistuvaa myrkkyvaikutusta. Keksinnön mukainen aktiivinen polypeptidi voidaan formuloida ennestään tunnetuilla menetelmillä farmaseuttisiksi seoksiksi, joita voidaan käyttää solujen lisääntymisen, esim. pahanlaatuisten kasvainsolujen lisääntymisen estämiseen. Vaikuttava polypeptidi voidaan sekoittaa farmaseuttisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen. Tehokas määrä keksinnönmukaista aktiivista polypeptidiä voidaan sekoittaa sopivaan määrään kantaja-ainetta niin, että saadaan valmistetuksi potilaalle tehokkaasti annettavissa oleva farmaseuttisesti hyväksyttävä seos.
Tämän keksinnön mukainen fysiologisesti aktiivinen polypeptidi voidaan antaa kasvaimiin tai viruksiin kohdistuvaa lääkitystä varten potilaalle ruiskeina, silmätippoina, nenätippoina, hengitettävinä lääkkeinä, ulkoisesti käytettävinä valmisteina, suun kautta annettavina valmisteina, rektaalisina valmisteina tai emätintabletteina. Keksinnön mukaisen polypeptidin aikuiselle annettava vuorokausiannos on yleensä 50 -100 000 000 yksikköä. Se on mielellään 50 - 500 000 yksikköä paikallisesti annettaessa, 1 000 - 1 000 000 yksikköä yleisinjektiona, kuten intravenoosisena tai intramuskulaarisena injektiona annettaessa ja 10 000 -100 000 000 yksikköä suun kautta annettaessa. Vuorokausiannosta voidaan suurentaa tai pienentää riippuen käyttökohteesta ja oireista.
Edelläkäytetyllä termillä "1 yksikkö" tarkoitetaan sellaista määrää tämän keksinnön mukaista fysiologisesti aktiivista polypeptidiä, joka tappaa 50 % L-M-solumäärästä (American Type Culture Collection CCL 1.2), joka on 1 x 105 solua/ml. Mainittu määrä mitataan seuraavalla tavalla. Viljelyssä käytetään 96 ko- 19 86952
Ion mikrotitrauslevyjä (Flow Laboratories, Inc. USA) ja L-M-soluja viljellään Eaglen välttämättömät vähimmäis-ravinteet sisältävässä alustassa, jossa on 1 tilavuus-% naudan sikiön seerumia (tämän alustan koostumus on selostettu esim. teoksessa Tissue Culture, toim. Junnosuke Nakai et ai., Asakura Shoten, Japani (1967)). Ravin-nealustalla sarjalaimennettu näyte (0,1 ml) ja L-M-solususpensio (0,1 ml, 1 x 10^ solua/ml) sekoitetaan keskenään levyn kussakin kolossa ja levyjä inkuboi-daan 48 tuntia 37°C:ssa ilmassa, jossa on 5 % hiilidioksidia. Viljelyn lopuksi lisätään 20 ui glutaarialde-hydiä solujen kiinnittämiseksi. Kiinnittämisen jälkeen levyt pestään tislatulla vedellä ja annetaan kuivua, lisätään 0,05 % metyleenisinistä (0,1 ml) elävien solujen värjäämiseksi. Levyt pestään perusteellisesti tislatulla vedellä ylimääräisen väriaineen poistamiseksi ja annetaan kuivua. Jokaiseen koloon lisätään 0,36 N suolahappoa, jotta väriaine saadaan uutetuksi värjäytyneistä soluista. Jokaisen kolon absorbanssi mitataan 665 nm: ssä Titertek Multiskan-laitteella (Flow Laboratories, Inc.). Absorbanssi on verrannollinen elävien solujen lukumäärään. Edellämainittu määrä tämän keksinnön mukaista fysiologisesti aktiivista polypeptidiä, joka 5 tappaa 50 % L-M-solumäärästä 1 x 10 solua/ml, saadaan piirtämällä laimennus-absorbanssikäyrä.
Tämän keksinnön mukainen fysiologisesti aktiivinen polypeptidi voidaan antaa parenteraalises-ti. Parenteraalista antoa varten voidaan formulaatioon sisällyttää lisäaineeksi sakeutusaine, kuten sakkaroosi, glyseriini, metyyliselluloosa, karboksimetyyli-selluloosa tms. ja/tai pH:nsäätöaine, kuten joku epäorgaaninen suola. Polypeptidi voidaan myös antaa tablettien muodossa. Tabletteihin voidaan sisällyttää lisäaineeksi kantaja-aine, kuten tärkkelys, laktoosi tms.
Eläinkokeissa on havaittu, että hiiren kasvain useimmissa tapauksissa paranee täysin yhdellä tai kah- 20 86992 della ruiskeella. Tarkemmin sanottuna erä keinotekoisia kasvainsoluja (Meth-A-soluja) siirrostettiin kunkin hiiren ihoon. Kun kasvainten halkaisija oli saavuttanut 6-7 mm, injektoitiin vain 0,6 yg tämän keksinnön mukaista polypeptidiä. Viikkoa myöhemmin ilmestyi rupi. Kahden viikon kuluttua alkoi kasvaa karvaa, mikä merkitsee kasvaimen täydellistä paranemista. Myöhemmin samoilla hiirillä oli raskaus ja onnistunut synnytys.
Tämä keksintöä selostetaan tarkemmin seuraavien vertailu- ja menetelmäesimerkkien avulla, joita ei ole tarkoitettu keksintöä rajoittaviksi.
Tämän keksinnön käytännön toteutuksessa yhdistel-mä-DNA:n rakentaminen ja sijoittaminen mikro-organismiin suoritetaan seuraavissa julkaisuissa kuvatuilla menetelmillä (kirjallisuusviitteet (1) - (4)), ellei toisin ole ilmoitettu.
(1) Yasutaka Takagi, Manual For Genetic Engineering, Kodan-sha, Tokio.
(2) Yasutaka Takagi, Experimental Method In Genetic Engineering, Kodan-sha, Tokio.
(3) T. Maniatis, E.F. Fritsch, J.Sam Brook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
(4) Ray Wu et al., Method in Enzymology, Vol. 101, Academic Press, New York.
Vertailuesimerkeissä ja esimerkeissä käytetyt lyhenteet: MOPS: morfolinopropaanisulfonihappo LB-alusta: Luria-Bertani-alusta DMSO: dimetyylisulfoksidi PFU: täplänmuodostajayksikkö EDTA: etyleenidiamiinitetraetikkahappo SDS: natriumdodekyylisulfaatti BRL: Bethesta Research Laboratories Inc.
DMT: dimetoksitrityyli lac: laktoosi 21 86992
Tris: tris(hydroksimetyyli)aminometaani
XAR-5: Röntgenfilmi, Eastman Kodak Company, USA
1 x SSC: 0,15 M NaCl + 0,015 M natriumsitraatti, pH 7 2 x SSC: 0,30 M NaCl + 0,030 M natriumsitraatti, pH 7 3 x SSC: 0,45 M NaCl + 0,045 N natriumsitraatti, pH 7 5 x SSC: 0,75 M NaCl + 0,075 M natriumsitraatti, pH 7 6 x SSC: 0,9 M NaCl + 0,09 M natriumsitraatti, pH 7 FDSS: 50 % deionoitua formamidia + 5 x Denhardt-liuos + 5 x SSPE + 0,1 % SDS + 100 yg/ml denaturoitua vasikan kateenkorvan DNA:ta.
SSPE: 0,18 M NaCl + 10 mM NaH2P04 + 1 mM EDTA, pH 7,4 SM: Faaginvarastointiliuos, joka sisältää 5,8 g NaCl, 2 g MgS04.7H20, 50 ml 1 M Tris.Cl (pH 7,5) ja 5 ml 2 % liivatetta litraa kohti.
NZ-liemi: Alusta, joka sisältää 10 g NZ-amiinia, 5 g
NaCl ja 2 g MgS04.7H20 (NZ-amiini on kaseiinin tyyppiä A oleva hydrolysaatti, jota valmistaa ja myy Humko Sheffield Chemical Division, Kraft, Inc., USA) IPTG: isopropyylitiogalaktosidi x-gal: 5-bromi-4-kloori-3-indolyyligalatosidi TAE: 0,04 M Tris-asetaatti (pH 8,0) -0,002 M EDTA 5 x Denhardt-liuos: Vesiliuos, joka sisältää 1000 mg
Ficollia, 1000 mg polyvinyylipyrrolidonia ja 1000 BSA: - . ta litraa kohti e: emäspari
Vertailuesimerkki 1 L-soluihin kohdistuvan sytotoksisen vaikutuksen arviointi
Seuraavissa vertailuesimerkeissä ja esimerkeissä valmistetun fysiologisesti aktiivisen aineen sytotok-sinen aktiivisuus L-solujen suhteen mitataan L929-soluihin (American Type Culture Collection CCL1) kohdistuvana sytotoksisena vaikutuksena menetelmällä Ruff et ai (ks. Lymphokines, Voi. 2, toim. E. Pick, Academic Press, N.Y., s. 1279 (1980)) tai menetelmällä 22 86992 jota on selostettu julkaisussa J. Immunol 126, s. 235 (1981)) .
Esimerkeissä valmistetun fysiologisesti aktiivisen aineen sytotoksisen aktiivisuuden määritysmenetelmä selostetaan seuraavassa.
Viljelyssä käytetään 96 koloa sisältäviä mikro-titrauslevyjä (Flow Laboratories, Inc. (USA)) ja L929-soluja, joita kasvatetaan Eaglen minimaalisella välttämättömät ravinteet sisältävällä alustalla, jossa on 1 tilavuus-% naudan sikiön seerumia ja 5 yg/ml (lopullinen väkevyys) aktinomysiini D:tä (tämän alustan koostumus on selostettu esim. teoksessa Tissue Culture, toim. Junnosuke Nakai et ai., Asakura Shoten, Japani (1967)). Ravinnealustalla sarjalaimennettu 5 näyte (0,1 ml) ja L929-solususpensio (0,1 ml, 1 x 10 solua) sekoitetaan keskenään kussakin levyn kolossa ja levyjä inkuboidaan 21 tuntia 37°C:ssa ilmassa, jossa oli 5 % hiilidioksidia. Viljelyn loputtua lisätään 20 yl glutaarialdehydin 20 % vesiliuosta solujen kiinnittämiseksi. Kiinnittämisen jälkeen levyt pestään tislatulla vedellä ja annetaan kuivua ja lisätään 0,05 % metyleenisinistä (0,1 ml) elävien solujen värjäämiseksi. Levyt pestään tislatulla vedellä perusteellisesti, jotta ylimääräinen väri poistuu, ja annetaan kuivua. Jokaiseen koloon lisätään 0,36 N suolahappoa värin uuttamiseksi värjäytyneistä soluista. Kunkin kolon absorbanssi mitataan 665 nmrssä Titertek Multiskan-laitteella (Flow Laboratories, Inc. USA). Absorbanssi on verrannollinen elävien solujen lukumäärään. Fysiologisesti aktiivisen aineen sytotoksinen aktiivisuus, yksikköä/ml, on käänteislukuna se laimennus fysiologisesti aktiivista ainetta, joka saa aikaan 50 % sy-totoksisuuden ja voidaan saada selville piirtämällä laimennus-absorbanssikäyrä. Vertailuesimerkeissä käytetty "1 yksikkö" tarkoittaa sellaista määrää kanin kasvainnekroositekijää, joka tappaa 50 % L929 soluis- 5 ta, joita on alunperin 10 solua/ml.
2J 86992
Toisaalta proteiinimäärä määritetään menetelmällä, jossa Coomassie Brilliant Blue G250 sidotaan proteiiniin (ks. Bradford et ai., Anal. Biochem. Voi.
72, ss. 248-254 (1976)).
Vertailuesimerkki 2 Vaihe 1 (Kasvainnekroositekijän valmistus kanin seerumista)
Naaraskaneihin, joiden paino on 2,5 - 3 kg, injektoidaan korvalaskimon kautta 50 mg formaliinilla tapettua Propionibacterium acnesta (Corynebacterium parvum; Wellcome Research Laboratories, Englanti). Kahdeksan vuorokautta myöhemmin injektoidaan korvalaskimon kautta 100 yg endotoksiinia (Escherichia Coli 026:B6:n tuottama lipopolysakkaridi, valmistaja Difco Laboratories, USA) ja 2 tuntia myöhemmin sydämen kautta otetaan koko veri. Kerättyyn vereen lisätään hepariininatriumia 100 yksikköä per 100 ml. Sitten veri scntrifugoidaan jäähdytyksen alaisena 30 minuuttia nopeudella 5000 1/min, jotta verisolut ja liukenemattomat kiinteät aineet saadaan poistetuiksi. Näin saadaan 40 kanista plasma (2,4 litraa), jonka seerumin kasvainnekroositekijän sytotoksinen aktiivi- 4 suus on 3 x 10 yksikköä/ml.
Vaihe 2 (Kasvainnekroositekijän osittainen puhdistaminen kanin seerumista)
Vaiheessa 1 saatuun plasmaan (2,4 litraa) lisätään 24 g celliteä. Saatua seosta sekoitetaan 1 tunti ja sen jälkeen suodatetaan. Suodokseen sekoitetaan 1,2 litraa 0,04 M Tris.HCl-puskuria (pH 7,8) ja sen j«'i 1 keon seos si joi Loi aan DEAE-Sepharose CL-6B-pylvääseen (Pharmacia Eine Chemicals, Inc.,Ruotsi), joka on sitä ennen riittävästi tasapainotettu 0,04 M Tris.HCl-puskurilla (pH 7,8), jossa on 0,1 M NaCl.
24 86992
Pylväs pestään 0,04 M Tris.HCl-puskurilla ja adsorboitunut kasvainnekroositekijä eluoidaan 0,04 M Tris.HCl-puskurilla (pH 7,2), jossa oli 0,18 M NaCl. Jakeet, jotka osoittavat sytotoksista aktiivisuutta L-soluja kohtaan, väkevöidään ultrasuodatuksella. Näin saatu konsentraatti sijoitetaan Sephacryl S-200 - pylvääseen (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Ruotsi), joka on riittävästi tasapainotettu 5 roM fosfaattipuskurilla ja suoritetaan geelisuodatus tätä samaa puskuria käyttäen. Aktiiviset jakeet väkevöidään ultra-suodatuksella, jolloin saadaan puhdistettua kasvainnekroositeki jää, jonka aktiivisuus on 3,5 x 10^ yksikköä ja ominaisaktiivisuus 18 x 10^ yksikköä/mg.
Vaihe 3 (Antikasvainnekroositekijävasta-aine)
Vaiheessa 2 osittain puhdistettuun kanin seerumin kasvainnekroositekijään sekoitetaan täydellistä Freundin adjuvanttia (1:1) ja saatua seosta injektoidaan subkutaanisti 12 viikon ikäisten koiraspuolisten BALB/c-hiirten selkään. Mainittu toimenpide toistetaan 2 ja 4 viikon kuluttua alkuperäisestä injektoin-nista. Viikon kuluttua viimeisestä injektoista koko veri kerätään. Kerätystä verestä otetaan talteen seerumi .
Näin saatu seerumi lisätään lopullisesti 500-kertaisesti laimennettuna kasvualustaan, jotta saadaan selville kasvainnekroositekijän sytotoksinen vaikutus L-soluihin. Kanin seerumin kasvainnekroositekijän sytotoksinen aktiivisuus L-soluja vastaan arvioidaan samoin kuin vertailuesimerkissä 1 on kuvattu. Havaitaan, että kanin seerumi ei ole lainkaan sytotoksinen L-soluille. Saadusta tuloksesta voidaan päätellä, että tässä vaiheessa saatu hiiren seerumi sisältää vasta-aineen kanin seerumin kasvainnekroositekijälle (käytetään jäljempänä nimitystä "antikasvainnekroositekijä-vasta-aine").
86992
Vertailuesimerkki 3 Vaihe 1 (Kasvainnekroositekijää tuottavien solujen valmistus)
Naaraspuoliseen kaniin injektoidaan intravenoo-sisesti formaliinilla tapettuja Propionibacterium ac-nes-soluja (Corynebacterium parvum; Wellcome Research Laboratories, Englanti). Tästä seitsemän vuorokauden kuluttua kanille suoritetaan trakeotomia ja keuhkot pestään fysiologisella suolaliuoksella, jolloin saadaan kelluvia soluja. Näin saadut solut pestään fysiologisella suolaliuoksella. Soluja inkuboidaan RPMI 1640-alustassa (Flow Laboratories, Inc., USA), jossa on 10 tilavuus-% vasikan sikiön seerumia, 37°C:ssa ilmeissä, jossa on 5 % hiilidioksidia. Soluviljelmä jaetaan kahteen ryhmään, joista toiseen lisätään E. colin endotoksiinia 10 yq/ml (E. ooli 026:B6:n lipopolysakkaridi, Difco Laboratories, USA). Toiseen lisätään sama määrä steriiliä vettä. Se soluviljelmä, johon on lisätty endotoksiinia, osoittaa sytotoksisuutta L-solujen suhteen ja aktiivisuus saavuttaa maksimaalisen arvonsa 7 tunnin kuluessa. Anti-kasvainnekroositekijävasta-aine hävittää tämän aktiivisuuden, kun taas normaali hiiren seerumi ei hävitä.
Toisaalta sen soluviljelmän emäliuos, johon ei ole lisätty endotoksiinia, ei ole millään tavalla sytotoksinen L-soluille.
Vaihe 2 (Kasvainnekroositekijän molekyylipaino)
Siihen vaiheessa 1 saatuun soluviljelmään, johon on lisätty endotoksiinia, lisätään vielä radio-35 aktiivista L-( S)-metioniinia (1300 Ci/mmol,
Amersham Industries plc, Englanti) (1 mCi/ml). Emä-liuos analysoidaan Laemmlin menetelmällä (ks. Laemmli, U.K. (1979), Nature (London), Voi. 227, ss. 680-685) käyttämällä SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesia. Geelin pitoisuudeksi säädetään 12,5 paino-%. Elektro- 26 86992 t> foreesin jälkeen geeli käsitellään Enhancella (New England Nuclear, Inc:n tuotteen tavaramerkki (USA)), kuivataan ja kuvataan röntgenfilmillä (Fuji RX,
Fuji Photo Film Co., Ltd., Japani). Endotoksiinia saaneen soluviljelmän emäliuokseen oli muodostunut ainetta, jonka molekyylipaino oli noin 17500.
Lisäksi kullekin vaiheessa 1 saadulle soluviljelmälle suoritetaan SDS-polyakryyliamidigeelielektro-foreesi edelläkuvatulla tavalla. Sen jälkeen geeliä ravistellaan 2,5 % NP 40 :ssä (pinta-aktiivinen aine, Calbiochem, USA) 1 tunti ja sitten veden kanssa 2 tuntia. Ravistelun jälkeen kukin kulkeutumiskaista leikataan irti erikseen ja sen jälkeen leikataan 2 mm levyisiksi vyöhykkeiksi kohtisuorassa kulkeutumis-suuntaa vasten. Kutakin kaistaa viljellään L-so-lujen kanssa, jonka perusteella arvioidaan sytotok-sinen aktiivisuus L-solujen suhteen. Siinä kaistassa, joka on kehitetty endotoksiinia sisältävästä soluviljelmästä, löytyy vyöhyke, joka on sytotoksi-nen L-soluille, ja jonka asema vastaa molekyylipai-noa 17500. Muista kohdista ei löydy sytotoksisuutta.
Vaihe 3 (mRNArn uuttaminen)
Vaiheessa 1 valmistettua soluviljelmää inkuboi-daan 2 tuntia endotoksiinin lisäyksen jälkeen ja sen jälkeen solut sentrifugoidaan talteen. Sytoplasman RNA:n uutto kerätyistä soluista ja mRNA:n uutto sytoplasman RNA:sta suoritetaan menetelmällä Chirgwin, J.M. et ai., Biochemistry, Voi. 18, s. 5294 (1979). 4 ml 4 M guani- g diinitiosyanaattiliuosta lisätään 3x10 solun määrään ja saatu seos jauhetaan homogenisaattorilla (Malli AM-7, Nihon Seiki Seisakusho, Japani). Kiinteät jäännökset sentrifugoidaan pois ja liuokseen liuotetaan 2.4 g keesiumkloridia. Seos kaadetaan huolellisesti polyallomeeriputkeen, johon on sitä ennen sijoitettu
2.5 ml liuosta, jossa on 5,7 M keesiumkloridia ja 0,1 M
27 86992 EDTA (pH 7,5), ja sen jälkeen ultrasentrifugoidaan 12 tuntia 20°C:ssa nopeudella 30 000 1/min käyttämällä Beckman SW41-roottoria (Beckman Instrument, USA)-Emäliuoksen poiston jälkeen pelletti liuotetaan 1 ml:aan 10 mM Tris-HCl-puskuria (sisältää 5 mM EDTA ja 1 % (paino/tilavuus) SDS). Saatu liuos uutetaan kloroformin ja 1-butanolin seoksella (4:1, tilavuus-osina). Vesifaasiin lisätään 0,05 tilavuutta 2 M natriumasetaattia ja 2,5 tilavuutta etanolia ja annetaan seisoa -20°C:ssa 2 tuntia tai pitempään, jotta RNA saostuu. Sakka sentrifugoidaan talteen, kuivataan ja liuotetaan sen jälkeen 500 yl:aan steriiliä vettä. Näin saadaan sytoplasmian sisältämän RNA:n liuos.
Saatua RNA-liuosta kuumennetaan 2 minuuttia 68 °C:ssa ja sen jälkeen jäähdytetään nopeasti. Liuokseen lisätään 500 yl väkevyydeltään 2-kertaista 10 mM Tris-EDTA-puskuria (pH 7,4) (sisältää 1 mM EDTA, 0,1 % (paino/tilavuus) SDS ja 0,5 M litiumkloridia) ja saatu seos sijoitetaan 200 mg:n oligo-dT-selluloosapylvää-seen (Bethesda Research Laboratories, Inc. USA) ja pestään 10 ml:11a samaa puskuria (perusväkevyys). Pylvään pidättämä materiaali eluoidaan 2 ml:11a eluointipuskuria, joka sisältää 10 mM Tris-HCl-puskuria pH 7,4, 1 mM EDTA ja 0,1 % (paino/tilavuus) SDS. Eluaattiin lisätään 0.05 tilavuutta natriumasetaat-tiliuosta ja 2,5 tilavuutta etanolia ja saatu seos jäähdytetään -20°C:een saostumista varten. Sakka suodatetaan talteen ja sijoitetaan oligo-dT-selluloosapylvää-seen ja oligo-dT-selluloosaan adsorboituneet jakeet otetaan talteen. Talteen saadaan 85 yg mRNA:ta UV-spektrianalyysillä määritettynä.
Vaihe 4 (mRNA:n fraktiointi koon perusteella) 880 yg vaiheessa 3 kuvatulla tavalla valmistettua mRNA:ta liuotetaan 250 yl:aan vettä ja saatu liuos 28 86992 kerrostetaan 10 ml:11a 5 - 25 % lineaarista sakkaroosi-tiheysgradienttia. Sakkaroositiheysgradientti valmistetaan ISCO 570-gradienttien avulla (ISCO Inc., USA) käyttämällä Tris-puskuriliuoksia (25 mM Tris.HCl,<PH 7,2), 2 mM EDTA ja 1 % (paino/tilavuus) SDS) ja vastaavasti 5 % ja 25 % sakkaroosipitoisuutta.
Ultrasentrifugointi suoritetaan Beckman SW41-roottorilla (40 000 1/min, 12 tuntia, 4°C) ja jakei-dentalteenottolaitteella otetaan talteen 400 μ1:η jakeet (Beckman Instrument, USA) ja sen jälkeen saostetaan etanolilla. Saostetut jakeet sentrifugoi-daan ja liuotetaan steriiliin veteen.
Vaihe 5 (mRNA:n luentakoe) mRNA:n luenta käyttämällä Xenopus laevis (Hamamatsu biological teaching materials)varhaismunasoluia suoritetaan esim. seuraavassa julkaisussa kuvatulla menetelmällä: Hiroshi Teraoka, Mikio Itsuki and Kentaro Tanaka, "Protein, Nucleic acid, Enzyme", Genetic Engineering, extra edition, 1981, s. 602. Hamamatsu biological teaching materials tuottaa Xenopus laevista. Vaiheessa 4 saatu fraktioitu mRNA liuotetaan steriiliin veteen pitoisuuteen 1 yg/yl ja liuos injektoidaan var-haismunasoluihin määränä 50 nl per solu. Sitten soluja viljellään 24 tuntia Barthin liuoksessa (7,5 mM Tris.HCl (pH 7,6), 88 mM NaCl, 1 mM kaliumkloridia, 0,33 mM kalsiumnitraattia, 0,41 mM kalsiumkloridia, 0,82 mM magnesiumsulfaattia, 2,4 mM natriumbikarbonaattia, 18 yksikköä/ml penisilliini G:tä ja 18 yg/ml streptomysiiniä), joka sisältää 1 mg/ml naudan seeru-mialbumiinia. Varhaismunasolut rikotaan viljelyliuok-sessa lasitankoa käyttäen. Sitten viljelyliuos sentri-fugoidaan ja emäliuoksesta mitataan sytotoksinen aktiivisuus L-solujen suhteen. mRNA, joka luettuna antaa maksimaalisen aktiivisuuden omaavan polypep-tidin, laskeutuu 16 S-kokoluokassa. Vertailuesi- 29 86992 merkin 2 vaiheessa 3 saatu antikasvainnekroositekijä-vasta-aine eliminoi tämän aktiivisuuden, mutta hiiren normaali seerumi ei sitä tee.
Vaihe 6 (Transformanttien valmistus) Käyttämällä 5 yg vaiheessa 4 saatua fraktioitua mRNArta valmistetaan kaksisäikeinen DNA kirjallisuusviitteen (1) sivulla 96 kuvatulla tavalla. Kään-teiskopioijaentsyyminä käytetään Life Science, Inc., USA-firman tuotetta. Kaksisäikeinen DNA fraktioidaan koon perusteella 3,5 % polyakryyliamidigeelissä, jolloin saadaan 330 ng noin 1000 - 2000 e:n jaetta. Noudattamalla kirjallisuusviitteessä (1) kuvattua menetelmää, 7 ng:aan tätä jaksojaetta liitetään deoksiC-hännät käyttämällä terminaalista deoksinukleotidyyli-transferaasia (Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) ja pariutetaan 56 ng:n kanssa plasmidia pBR322, joka on katkaistu Pstirllä ja hännitetty deoksiG-tähteillä. Näin pariutettu seos sijoitetaan E. coli K-12-kantaan (HB101, ATCC 33694) suorittamalla trans-formointi. Tuloksena on 12000 transformanttia.
Vaihe 7 (Kanin kasvainnekroositekijän osittainen aminohappo-sekvenssi)
Vertailuesimerkissä 2 osittain puhdistetulle kanin kasvainnekroositekijälle (aktiivisuus 5 x 10 yksikköä) suoritetaan SDS-polyakryyliamidigeelielektro-foreesipuhdistus samoin kuin vaiheessa 2. Osa geelistä värjätään Coomassie Brilliant Bluella. Vyöhyke, joka vastaa paikkansa perusteella molekyylipainoa 17000, leikataan irti geelistä ja uutetaan 1 % am-moniumbikarbonaati11a. Näin saadaan talteen noin 180 ug kasvainnekroositekijää proteiinina.
150 yg saatua kasvainnekroositekijää liuotetaan 75 yIraan 1 % ammoniumbikarbonaattia ja sen jälkeen li- 30 8 6 9 9 2 sätään 3 yg TPCK-trypsiiniä (Worthington Biochemical, USA). Saatua seosta inkuboidaan 4 tuntia 37°C:ssa.
Sitten seos fraktioidaan suuren erotuskyvyn nestekro-matografiapylväällä, joka om.pakattu Cosmosil 5C8:lla (Nakarai Chemical, Ltd., Japani), jolloin saadaan trypsiinillä pilkotut jakeet.
Sitten erittäin puhtaalle kasvainnekroositekijäl-le ja sen trypsiinillä pilkotuille jakeille suoritetaan suolanpoisto Sephadex G-25-pylväässä ja kylmäkui-vataan.Puhdistetulle kasvainnekroositekijälle ja trypsiinillä pilkotuille jakeille suoritetaan N-päästä Edmanin hajotus menetelmällä R.M. Hewick et ai., J. Biol.Chem. , Voi. 256, ss. 7990-7997, 1981 . Kussakin vaiheessa vapautunut PTH-aminohappo analysoidaan tavanomaisella menetelmällä käyttämällä suuren erotuskyvyn kromatografia SP8100 (Spectra physics, USA), jossa on Solpacks ODS-pylväs (E.I. DuPont, USA). Tulokseksi saadaan, että kasvainnekroositekijän N-pään aminohappo-järjestys on seuraava: Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-
Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln-
Yhdellä trypsiinillä hajotetuista jaksoista on seuraava N-pään aminohappojärjestys: Glu-Thr-Pro-Glu-Glu-Ala-Glu-Pro-Met-Ala
Vaihe 8 (Oligodeoksinukleotidikoettimen synteesi)
Vertailuesimerkin 3 vaiheessa 7 saadun kanin kasvainnekroositekijän aminohappojärjestyksestä johdetun mRNA:n emässekvenssille komplementaariset oligodeoksi-nukleotidit syntetisoidaan parannetulla fosfotriesteri-menetelmällä, jota esillä olevan keksinnön tekijä on selostanut julkaisussa H. Ito et ai., "Nucleic Acid Res.", H), 1755-1769 (1982). Oligodeoksinukleotideja valmistettaessa lajitellaan kanin kasvainnekroositeki jän aminohappojärjestyksestä päätollyl 128 oligo-deoksinukleotidia viiteen ryhmään, nimittäin 16, 16, 31 86992 32, 32 ja 32 sisältäviin ryhmiin ja syntetisoidaan vastaavien ryhmien oligodeoksinukleotidien seoksina. Saaduista Vastaavien ryhmien oligodeoksinukleotideista poistetaan suojaus tavalliseen tapaan ja puhdistetaan Sephadex G-50-kromatografiapylväässä (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Ruotsi), elektroforeesilla 20-painoprosentti-sessa polyakryyliaraidigeelissä, jossa on 7 M ureaa, ja kromatografisesti DE52-pylväässä (Whatman Ltd, USA). Näin saadut vastaaviin ryhmiin kuuluvat oligo-deoksinukleotidit dialysoidaan 0,1 mM Tris-EDTA-pusku-riliuosta vasten.
Kunkin vastaavan ryhmän puhdistetut oligodeoksi- nukleotidit leimataan käyttämällä T^-polynukleotidi- kinaasia (Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) 32 3a γ- P-adenosiinitrifosfaattia ja sen jälkeen puhdistetaan kromatografisesti käyttämällä DE52-pylvästä (Whatman Etd., USA). Kuhunkin vastaavan ryhmän oligo-deoksinukleotidiin sisällytetään radioaktiivista ma- g teriaalia noin 3 x 10 cpm/yg. Oligodeoksinukleotidi-koettimet, jotka kukin on saatu vastaavan ryhmän seoksen muodossa, on merkitty taulukkoon 1 .
Taulukossa 1 on esitetty osa kanin kasvainnek-roositekijän aminohappojärjestyksestä, kanin kas-vainnekroositekijän aminohappojärjestyksestä pää-• " telty mRNA:n emässekvenssi ja vastaavien ryhmien synteettisten oligodeoksinukleotidikoettimien emäs-sekvenssit.
32 86992
Taulukko 1 [Aminohappo- Karboksi- , , Amino- i järjestys pää pgä m RNA 3' ·:---- XCG GTA XCC YAG XCG YAG YAG ..... 5’
Koetin MH 5' GC CAT MGG MTC GGC MTC MTC 3'
Koetin MI 5' GC CAT NGG MTC GGC MTC MTC 3'
Koetin MJ 51 GC CAT ZGG MTC AGC MTC MTC 3
Koetin MK 5 ’ GC CAT ZGG MTC CGC MTC MTC 3'
Koetin ML 5' GC CAT ZGG MTC TGC MTC MTC 3 *
Huom: X on ribonukleiinihappotähde A, C, G tai U.
Y on ribonukleiinihappotähde A tai G.
M on deoksiribonukleiinihappotähde T tai C.
N on deoksiribonukleiinihappotähde A tai G.
Z on deoksiribonukleiinihappotähde A, C, G tai T.
Vertailuesimerkin 3 vaiheen 3 mukaisesti mukaisesti saatua kasvainnekroositekijää tuottavien solujen mRNA:ta käsitellään 60 minuuttia 50°C:ssa liuoksella, jossa on 1 M glyoksaalia, 10 mM Na^PO^ ja 50 tilavuus-% dimetyylisulfoksidia, ja sen jälkeen suoritetaan fraktiointi elektroforeettisesti käyttämällä 1,1 painoprosenttista agaroosigeeliä. Fraktioitu mRNA siirretään elektroforeesityyppisen siirto-täplityslaitteen suotimeen (Bio Rad, USA) valmistajan käsikirjan ohjeen mukaisesti. Sitten laitteen suoti- messa olevaa mRNA:ta käsitellään 2 tuntia 65°C:ssa liuoksella (5 x Denhardt), jossa on 5 x SCC ja 150 yg/ml lohen siittiöiden denaturoitua DNA:ta, ja sen jälkeen käsitellään 2 tuntia 50°C:ssa liuoksella (5 x Denhardt), jossa on 1 x 10 cpm/ml leimattuja oligo- 33 86992 deoksinukleotideja ja 5 x SCC. Saatu suodin pestään 6 x SSC-liuoksella 4 kertaa; huoneenlämpötilassa, 40, 50 ja 60°C:ssa. Sitten XAR-5-röntgenfilmi (Eastman Kodak Company, USA) valotetaan suotimen säteilyllä. Näin saadaan selville, että koettimen MJ oligodeoksinukleotidit hybridisoituvat voimakkaimmin mRNA:n kanssa, mikä osoittaa että koettimen MJ oligodeoksinukleotidit sisältävät sellaisen oligodeoksinukleotidin, jonka emässekvenssi on täysin komplementaarinen mRNArn kanssa.
Vaihe 9 (Kanin kasvainnekroositekijän geenin kloonaus)
Kirjallisuusviitteen (2) sivulla 162 kuvatun menetelmän mukaisesti siirretään vertailuesimerkin 3 vaiheessa 6 saadut transformantit selluloosasuotimel-le ja transformanttien DNA hybridisoidaan vertailuesimerkin 3 vaiheessa 8 valitulla leimatulla oligodeoksinuk-leotidilla (koetin MJ) samoissa olosuhteissa kuin vertailuesimerkin 3 vaiheessa 8 (pesäkehybridisointi). Tällöin 49 pesäkkettä hybridisoituu voimakkaasti näiden leimattujen oligodeoksinukleotidien (koetin MJ) kanssa, jotka pesäkkeet valitaan ja kiinnitetään toiseen nitro-selluloosasuotimeen. Sitten näitä 49 peäskkettä käyttämällä suoritetaan jatkohybridisointi ja valitaan 9 pesäkettä, jotka hybridisoituvat leimattujen oligodeoksinukleotidien (koetin MJ) kanssa voimakkaimmin.
Kustakin yhdeksästä pesäkkeestä saadaan noin 5 yg plasmidia käyttämällä kirjallisuusviitteessä (1) sivulla 6 kuvattua nopeata plasmidinerotusmenetelmää.
_·' Kukin saaduista plasmideista leikataan restriktioent- syymeillä PstI, Taql, RsaI ja PvuII (Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) valmistajan käsikirjan ohjeita noudattaen, jonka jälkeen suoritetaan elektroforeesi 1-painoprosenttisella agaroosigeelillä. Sitten vas- 34 86992 taavilla restriktioentyymeillä pilkkomalla saatuja jaksoja verrataan toisiinsa pituuden suhteen.
Tulokset viittaavaat siihen, että kaikissa yhdeksää pesäkettä vastaavissa yhdeksässä kannassa on noin 50 emäsparin fragmentti, jolla on PvvJIrlla ja Rsalrllä pilkkomalla saatu emässekvenssi, ja että useimmissa näistä yhdeksästä kannasta on noin 200 emäsparin fragmentti, jolla on Rsalrllä pilkkomalla saatu emässekvenssi. Toisin sanoen tulokset siis viittaavat siihen, että kyseisillä yhdeksällä kannalla on osittain sama emässekvenssi. Restriktioentsyymi-analyysin tulokset on esitetty kuvassa 1.
Seitsemää seuraavassa taulukossa 2 mainitun plasmidin sisältävää kantaa viljellään 2 mlrssa LB-alustaa, jossa on 10 yg/ml tetrasykliiniä, kunnes liuoksella on taulukossa 2 mainittu optinen tiheys, ja sen jälkeen otetaan vastaavat kannat talteen sentri-fugoimalla. Kukin saaduista kannoista lisätään erikseen 2 ml:aan fysiologista suolaliuosta ja rikotaan sonikaatiolla. Saadut liuokset sentrifugoidaan ja määritetään saatujen emäliuosten-sytotoksiset aktiivisuudet L-solujen suhteen. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 2. Sokkokokeessa suoritetaan samat toimenpiteet plasmidin pBR322 sisältävälle kannalle. Saadut tulokset on myös esitetty taulukossa 2.
35 86992
Taulukko 2 >v Pariutunei- Sytotoksinen N. den emäspä- 600 vaikutus L-so- *s. rien luku- luihin
Plasmidi N. määrä (Yksikkö/ml) pB 2-2 1400 1.369 35 pB 2-3 800 1.605 < 10 PB 2-7 1060 1.364 < 10 PR 9 1550 1.618 < 10 pR 12 1400 1.458' 15 PR 18 1850 1.438 < 10 pR 25 1350 1.514 < 10 pBF.322 0 1.677 < 10
Sytotoksinen vaikutus L-soluihin eliminoituu antikasvainnekroositekijävasta-aineella mutta ei normaalilla hiiren seerumilla. Tämä osoittaa, että kaikissa edellämainituissa yhdeksässä pesäkkeessä on plasmideja,joissa on kasvainnekroositekijää koo-dittavia oligodeoksinukleotideja.
Vaihe 10 ( Kanin kasvainnekroositekijää koodittavan DNA:n emässekvenssin määrittäminen) E. coli-kantoja, joissa on plasmidi pB2-7 tai pRl8, viljellään 1 litrassa M9-alustaa, jossa on 10 yg/ml tetrasykliiniä, kirjallisuusviitteen (3) sivulla 440 kuvatulla tavalla, jolloin kutakin plas-midia saadaan noin 150 yg.
Kunkin plasmidin sisältämän liitännäisen emäs-sekvenssi määritetään Maxamin ja Gilbertin menetelmällä, 36 86992 joka on selostettu julkaisussa Maxam et ai., "Methods in Enzymology", 55, P 490 (1980), Academic Press. Näin määritetty emässekvenssi vastaa vertailuesimerkin 3 vaiheessa 7 määritettyjä osittaisia aminohappo-järjestyksiä. Näin kanin kasvainnekroositekijän koko sekvenssi katsotaan selvitetyksi.
Vaihe 11 Tässä vaiheessa rakennetaan plasmidi käyttämällä plasmidia pRl2 ja lac-promoottoria, jotta kasvainnekroositekijä saadaan suoraan ilmentymään E. colissa. Menetelmä on selostettu kuvassa 2.
Ensin pilkotaan 10 yg plasmidia pR12 10 yksiköllä Apal:tä (Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) 37°C:ssa 2 tuntia ja sen jälkeen erotetaan 630 emäs-parin fragmentti elektroforeettisesti 4-painoprosent-tisella polyakryyliamidigeelillä. Geelielektroeluu-tiolla saadaan noin 1 yg eristettyä fragmenttia. Vertailuesimerkin 3 vaiheen 8 mukaisesti syntetisoidaan kuvaan 2 merkityt kaksi oligodeoksinukleotidia eli 5'-GATCCATGTCAGCTTCTCGGGCC-3'ja 5'-CGAGAAGCTGACATG-3'. Sitten kunkin oligodeoksinukleotidin (noin 100 pmol) 5'-pää fosforyloidaan käyttämällä T^-polynukleotidi-kinaasia kirjallisuusviitteessä (3) sivulla 122 kuvatulla menetelmällä. Reaktion tapahduttua reaktio-seos uutetaan ensin fenolilla ja sitten kloroformilla. Sitten saadut synteettiset oligomeerit sekoitetaan 0,5 yg:aan 630 e:n Apal-fragmenttia ja saostetaan etanolilla. Fragmentti liitetään yhteen synteettisten oligomeerien kanssa 4°C:ssa yön aikana käyttämällä 10 yksikköä DNA-ligaasia kirjallisuusviitteessä (1) sivulla 37 kuvatulla tavalla. Kun reaktio on tapahtunut, seos saostetaan etanolilla ja pilkotaan 3 tuntia 37°C:ssa 20 yksiköllä BamHIrtä, sitten suoritetaan elektroforeesi 4-painoprosenttisessa polyak-ryyliamidigeelissä ja 670 e:n fragmentti otetaan talteen elektroeluutiolla. 1 yg kauppatavarana 37 86992 saatavissa olevaa plasmidia pUC-8 (luettelon no. 4916, P-L Biochemicals, Inc., USA) pilkotaan BamHI:llä ja uutetaan ensin fenolilla ja sen jälkeen kloroformilla ja sen jälkeen saostetaan etanolilla, jolloin saadaan vektori. 0,5 pg saatua vektoria liitetään yhteen edellämainitun fragmentin kanssa, jossa on BamHI-kohta kummassakin päässä, ja joka sisältää noin 670 kasvainnekroositekijää koodittavaa emäsparia, käyttämällä DNA-ligaasia. Kirjallisuusviitteen (4) sivulla 20 kuvatulla menetelmällä transformoidaan E. coli käyttämällä edelläsaatua vektoria ja, kun viljellään agaralustassa, jossa on 1 mM IPTG:tä ja 0,004 % (paino/tilavuus) X-gal:ia, saadaan noin 200 valkoista pesäkettä. 100 tällaisesta transforman-tista valmistetaan piasmiai-DNA ja pilkotaan BamHItllä. Tämän tuloksena havaitaan, että 15 plasmidia sisältää tarkoitetun BamHI-fragmentin (noin 670 e). Liitännäisen suunnan tutkimiseksi edellämainitut 15 plasmidia pilkotaan EcoRI:llä, sillä pUC-8:ssa on sille vain yksi tunnistuskohta, ja PvuII:lla, sillä 670 e:n fragmentissa on sille vain yksi tunnistuskohta, ja suoritetaan elektroforeesi 6-painoprosenttisella polyakryyli-amidigeelillä. Tulokseksi saadaan, että 7 plasmidissa on tarkoitettu noin 140 e:n fragmentti, ja että lac-promoottorin transkriptiosuunta pUC-8:ssa vastaa kasvainnekroositekijää koodittavien oligodeoksinukleo-tidien transkriptiosuuntaa.
DNA:n sekvensointi osoittaa, että näissä seitsemässä plasmidissa on sama sekvenssi ja haluttu nuk-leotidisekvenssi lac-promoottorin, synteettisen DNA:n ja cDNA:n liitoskohdissa.
Seuraavaksi rakennetaan plasmidi käyttämällä plasmidia pR17 ja lac UV5-promoottoria, jotta saadaan kasvainnekroositekijä ilmentymään suoraan E. colissa. Menetelmä on esitetty kuvassa 3. Ensin pilkotaan 10 yg plasmidia pR17 10 yksiköllä Apal:tä (Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) 2 tuntia 37°C:ssa, suorite- 38 86992 taan elektroforeesi 4-painoprosenttisessa polyakryy-liamidigeelissä, jotta saadaan eristetyksi noin 630 e:n fragmentti. Noin 1 pg fragmenttia eristetään geelistä elektroeluutiolla. Samoin kuin vaiheessa 8 syntetisoidaan kaksi kuvassa 3 esitettyä oligodeoksinukleo-tidia eli 5 *-AATTCATGTTCAGCTTCTTGGGCC-3' ja 51-CGAGAAGCTGACATG-31. Sitten kahden oligodeoksinukleo-tidin (noin 100 pmol) 5'-päät fosforyloidaan käyt tämällä T4-polynukleotidikinaasia kirjallisuusviitteessä (3) sivulla 122 kuvatulla menetelmällä. Reaktion tapahduttua reaktioseos uutetaan fenolilla ja sen jälkeen kloroformilla. Sitten synteettiset oligomeerit sekoitetaan 0,5 yg:aan edellä saatua Apal-fragmenttia (noin 630 e), joka on valmistettu plasmidista pRl7 ja saostettu etanolilla. Fragmenttia ja synteettisiä oligomeereja liitetään yhteen yön yli 4°C:ssa käyttämällä 10 yksikköä T^-ligaasia kirjallisuusviitteessä (1) sivulla 37 kuvatulla tavalla. Reaktion tapahtut-tua seos saostetaan etanolilla ja pilkotaan 3 tuntia 37°C:ssa 20 yksiköllä EcoRI:tä, jonka jälkeen suoritetaan elektroforeesi 4-painoprosenttisella polyakryyli-amidigeelillä ja fragmentti (noin 670 e) otetaan talteen elektroeluutiolla.
Plasmidi pOP95-15 valmistetaan menetelmällä F. Fuller, "Gene", 1_9, ss. 42-54 (1982).
1 yg plasmidia pOP95-15 pilkotaan EcoRI:llä ja uutetaan ensin fenolilla ja sen jälkeen kloroformilla ja saostetaan etanolilla, jolloin saadaan vektori.
DNA-ligaasia käyttämälllä liitetään 0,5 yg saatua vektoria fragmenttiin (noin 670 e), joka on saatu liittämällä yhteen synteettinen oligonukleotidi ja kasvainnekroositekijää koodittava oligonukleotidi.
E. coli JM101 (ATCC 33876) transformoidaan kirjallisuusviitteessä (4) sivulla 20 kuvatulla tavalla näin saadulla vektorilla ja viljellään alustassa, jossa on 1 mM IPTG:tä ja 0,004 % (paino/tilavuus) X-gal:ia, jolloin saadaan noin 150 valkoista pesäkettä.
39 8 6 9 9 2 100 pesäkkeestä valmistetaan plasmidi-DNA ja pilkotaan EcoRI:llä. Näin selviää, että 12 plasmidia sisältää tarkoitetun EcoRI-jakson (noin 670 emäsparia).
Jotta saataisiin selville liitännäisen suunta, edellämainitut 12 plasmidia pilkotaan PvuIItlla ja Pstlrllä ja suoritetaan elektroforeesi 1,5 painoprosentti-sella agaroosigeelillä. Tämän tuloksena selviää, että neljässä plasmidissa on halutut fragmentit (noin 1280 ja 2600 emäsparia), ja että lac UV5-promoottorin transkription suunta vastaa kasvainnekroositekijää koodit-tavien oligodeoksinukleotidien transkription suuntaa.
Emässekvenssin analyysi osoittaa, että näillä neljällä plasmidilla on sama sekvenssi, ja että lac UV5-promoottori, synteettinen oligodeoksinukleotidi ja cDNA ovat oikella tavalla liittyneet yhteen. Saaduista plasmideista käytetään nimitystä pTNF-lacUV5-1.
Vaihe 12 (E. colin tuottaman kasvainnekroositekijän puhdistus) Vaiheessa 11 saatuja plasmidin sisältäviä E. coli-kantoja viljellään yön yli 37°C:ssa 50 ml:ssa LB-alustaa, joka sisältää ampisilliinia. Sitten kannat siirretään 5 litraan LB-alustaa, jossa on 100 Ug/ml ampisilliinia, ja viljellään vielä 3 tuntia 37 °C:ssa. Lisätään isopropyyli-8-D-tiogalaktopyranosidia (Sugman Chemical Company, Inc., USA) lopulliseen väkevyyteen 1 mM. Kasvatusta jatketaan vielä 6 tuntia ja sen jälkeen jäähdytetään. Bakteeri sentrifugoidaan talteen. Sitten kasvusto lisätään vaiheessa 11 kuvatulla tavalla 5 litraan 0,04 M Tris-HCl-puskuriliuosta (pH 7,8) ja solut rikotaan sonikaatiolla, jolloin saadaan proteiiniliuos. Saadun liuoksen sytotoksisuus L-solujen suhteen on 5 x 10 yksikköä/1.
Kun saatu liuos puhdistetaan vertailuesimer-kin 2 vaiheessa 2 kuvatulla tavalla, saadaan 1,2 x g 10 yksikköä kasvainnekroositekijää. Kasvainnekroosi- 7 tekijän ominaisaktiivisuus on 6,8 x 10 yksikköä/mg.
40 8 6 9 9 2
Vaihe 13 (Arviointi käyttämällä hiireen siirrostettua Meth A-sarkoomaa) 2 x 105 Meth A-sarkoomasolua siirrostetaan ihonsisäisesti BALB/c-hiirten vatsa-alueelle ja 7 vuorokauden kuluttua valitaan arviointiin sellaiset hiiret, joilla on halkaisijaltaan 7 - 8 mm kasvaimet ilman spontaania keskustan nekroosia. Vertailuesimerkin 3 vaiheessa 12 saatu kasvainnekroositekijänäyte (0,2 ml) laimennetaan fysiologisella suolaliuoksella ja injektoidaan häntälaskimoon. Näytteen aktiivisuus määritetään 24 tunnin kuluttua seuraavien kriteerien mukaan.
(-): ei muutosta (-): vähäinen verenvuotonekroosi (++): kohtalainen verenvuotonekroosi (keskustanek- roosi, joka ulottuu noin 50 %:lle pinta-alueesta) (+++): voimakas verenvuotonekroosi (vahva nekroosi, joka jättää pienen elävän aluereunan kasvaimen ulkoreunaan) 20 vuorokauden kuluttua näytteen injektoinnista lukien tehdään havainnot kasvainten kehityksestä ja paranemisuhde määritetään seuraavan yhtälön avulla:
Kasvaimesta täysin parantuneiden hiirten lukumäärä
Paranemissuh.de ---
Kokeessa käytettyjen hiirten lukumäärä
Saadut tulokset on esitetty taulukossa 3.
41 86992
Taulukko 3
Ruiskeella annettu Kokeessa käy- Näytteen aktiivisuuden Paranemis- E. colin tuottama tetty hiili- arviointi (1 vrk:n suhde kanin kasvainnekroo- ^ ^ kuluttua) (20 vrk:n ku- sitekijämäärä luttua) + ++ +++ 2 x 105 5 0014 5/5
Verrokki 5 5 0 0 0 0/5 (fysiologinen ‘ .
suolaliuos)
Esimerkki 1
Vaihe 1 (E. coli Kl2-kannan MC1061 transformointi plasmideilla pR18, pB2-7 ja pB2-2) E. coli Kl2-kannan MC1061 pesäkkeet transformoidaan tavalliseen tapaan plasmideilla pR18, pB2-7 ja pB2-2 erillisesti. Tarkemmin sanottuna E. coli K12-kantaa MC1061 kasvatetaan LB-alustassa optiseen tiheyteen 0,3 (550 nm). 50 ml saatua E. coli-viljelmää otetaan talteen, pestään 25 ml:11a liuosta, jossa on 10 mM MOPS (pH 7,0) ja 10 mM RbCl, ja suspendoidaan uudestaan 25 ml:aan liuosta, jossa on 0,1 M MOPS (pH 6,5), 50 mM CaC^ ja 10 mM RbCl. Saatua suspensiota jäähdytetään jäällä 30 minuuttia, sentrifu-goidaan ja suspendoidaan 2 ml:aan edellämainittua liuosta, jossa on 0,1 M MOPS (pH6,5), 50 mM CaC^r 10 mM RbCl ja 30 yl DMSO. Kyseinen plasmidi-DNA-liuos (10 yl) lisätään 200 yl:aan saatua suspensiota. Saatua seosta jäähdytetään jäällä 30 minuuttia ja sen jälkeen annetaan 60 sekunnin lämpöshokki 44°C:ssa. Välittömiisi i tämän jälkeen lisätään 37°C:een esi lämmitettyä LB-alustaa kuumennettuun seokseen ja inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. Saaduista viljelmistä otetaan talteen 42 86992 solupelletit. Emäliuokset heitetään pois ja kukin solupelletti suspendoidaan LB-alustaan. Kukin suspensio siirrostetaan LB-agarlevylle, jossa on 30 Ug/ral tetrasykliiniä, jonka jälkeen inkuboidaan yön yli 37°C:ssa. Näin saadaan tetrasykliinille vastustuskykyisiä transformantteja, joissa transformoitumisen aiheuttaja on pRl8, pB2-7 tai pB2-2 vastaavasti.
Vaihe 2 ( pB2-7- ja pR18-plasmidi-DNA:n valmistaminen)
Vaiheessa 1 saatuja transformantteja, jotka ovat transformoituneet plasmidilla pB2-7 ja plasmidilla pR18 vastaavasti, (1) viljellään niin, että plasmidi moninkertaistuu; (2) otetaan transformantti talteen ja aiheutetaan lyysi; ja (3) puhdistetaan plasmidi-DNA (T. Maniatis, E.F. Fritschanc^ J. Sambrook, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, USA, ss.
88-96). Tarkemmin sanottuna kukin transformantti siirrostetaan LB-alustaan, joka sisältää 30 yg/ml tetrasykliiniä, ja inkuboidaan 37°C;ssa voimakkaasti ravistellen. Tämä vaihe toistetaan, jotta transformantti saadaan kasvamaan ja plasmidi monistumaan. Transformanttiviljelmä otetaan talteen sentri-fugoimalla 10 minuuttia 4°C:ssa 4000 g:ssä. Emäliuos heitetään pois. Saatu pelletti pestään 100 ml :11a jääkylmää STE-liuosta (0,1 M NaCl, 10 mM Tris.Cl (pH 7,8) ja 1 mM EDTA) ja suoritetaan lyysi keittäen 20 mg/ml lysotsyymiliuoksessa, jossa on 10 mM Tris.Cl, pH 8,0. Viskoosinen tuote siirretään ultrasentifuugiin ja sentrifugoidaan 30 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 25 000 1/min, jolloin saadaan DNA-liuos. DNA-liuoksen tilavuus mitataan. Millilitraa kohti lisätään tarkalleen 1 g kiinteätä keesiumkloridia ja sekoitetaan hitaasti, kunnes kaikki suola on liuennut. Lisätään 0,8 ml etidiumbromi-diliuosta (10 mg/ml H20) per 10 ml keesiumkloridi-liuosta. Liuoksen lopullinen tiheys on 1,55 g/ml ja etidiumbromidipitoisuus on noin 600 μg/ml. Keesium-kloridiliuos siirretään sopivaan sentrifuugiputkeen « 86992 ja loput putkesta täytetään kevyellä prafiiniöljyllä. Sentrifugoidaan 36 tuntia 20°C:ssa nopeudella 45 000 1/min, jolloin saadaan kaksi DNA-vyöhykettä, joista ylempi sisältää lineaarisen bakteeri-DNA:n ja radioaktiiviseksi vaihdetun (nicked) rengasmaisen plasmidi-DNA:n ja alempi vyöhyke sisältää suljetun rengasmaisen plasmidi-DNA:n. Alemman vyöhykkeen DNA otetaan lasiputkeen neulalla, joka on työnnetty sisään putken sivusta. Etidiumbromidi poistetaan ja vesifaasi dialysoidaan TAE-liuosta vasten. Plasmidi-DNA-liuos käsitellään RNaasil-la ja uutetaan tilavuudellaan tasapainotettua fenolia. Vesifaasi kerrostetaan Bio-Gel A-150-pylväässä, joka on tasapainotettu TAE :Ha (pH 8,0) ja 0,1 % SDS:llä. Pylvään DNA pestään ja jakeet kerätään TE:llä, jossa on 0,1 % SDS:ää. Jakeet saostetaan etanolilla, jolloin saadaan puhdas plasmidi-DNA.
Edelläkuvatulla menetelmällä saadaan 250 yg puhdasta pBR2-7-plasmidi-DNA:ta ja 134 yg puhdasta pR18-plasmidi-DNA:ta.
Vaihe 3 (Puhtaan pB2-7-plasmidi-DNA:n ja puhtaan pRl8-plasmidi-DNA:n "nick"-luenta)
Vaiheessa 2 saatua puhdasta pB2-7-plasmidi-DNA:ta otetaan 40 yg, pilkotaan se Pstl-restriktioentsyymillä ja suoritetaan elektroforeesi 4 % akryyliamidigeelillä. Elektroforeesin jälkeen DNA värjätään ja haluttu vyöhyke leikataan irti Pstl-liitännäisen eristämiseksi.
500 ng:lle eristettyä Pstl-liitännäistä suoritetaan "nick"-luenta menetelmällä Maniatis et ai., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 72, 1184 (1975). "Nick"-luennas-sa käytetään Nick Translation Kit-pakkausta (Bethesda Research Laboratories Inc., USA) ja 80 pmol radioaktiivista dCTP:tä 25yl:ssa reaktioliuosta (400 Ci/mmol). Seokseen, jossa on 2,5 μ 1 liuosta A (dNTP-liuos), 2,5 11 ) liuosta B (500 nq tutkittavaa DNA:ta, Pstl- liitännäinen),5 μ 1 kuumaa dCTP:tä (3200 Ci/mmol), 1,3 y1 kylmää dCTP:tä (65 pmol, 50 pmol/ μ g dCTP), 44 86992 11,2 μΐ liuosta E U^O) (kaikkiaan 22,5 μΐ), lisätään 2,5 μΐ liuosta C (DNaasi I, DNA-polymeraasi I) ja annetaan reagoida 60 minuuttia 15°C:ssa. Sitten reaktio pysäytetään lisäämällä liuosta D (pysäytyspuskuria). Edelleen lisätään kantaja-tRNA:ta, suoritetaan etanoli-saostus kahdesti ja liuotetaan 500 ul:aan vettä. Omi-nai saktiivisuus per pg DNA: ta on 9,3 x 10^ cpm.
Vaiheessa 2 saadulle puhtaalle pR18-plasmidi-DNArlle suoritetaan myös edelläkuvattu "nick"- luenta. Ominaisaktiivisuus per μg DNArta oli 7 x 7 10 cpm.
Vaihe 4 (pR18-plasmidi-DNA:n Rsal-fragmentin valmistaminen) 80 μg pRl8-plasmidi-DNA:ta pilkotaan Rsal-restrik-tioentsyymillä ja suoritetaan elektroforeesi 4 % poly-akryyliamidigeelillä. Seuraavat vyöhykkeet leikataan irti ja puhdistetaan BND-pylväässä: n. 640 e 3,77 \xq (saanto 52 %) n. 175 e 1,77 Mg (saanto 50 %)
Edellämainitusta noin 640 e:n liitännäisestä käytetään nimitystä pR18:n 3'-fragmentti (tarkoittaa pR18:n luetuksi tulematonta 3'-aluetta) ja noin 175 e:n liitännäisestä käytetään nimitystä pRl8-cfr (tarkoittaa pRl8:n koodittavaa aluetta).
Lisäksi edelläkuvatut toimenpiteet toistetaan käyttämällä Rsalrn tilalla restriktioentsyymejä PstI ja Mstll, jolloin saadaan seuraava vyöhyke: n. 450 e 3,65 μg(saanto 60 %) Tälle liitännäiselle annetaan nimi pR18:n 5'-fragmentti.
Vaihe 5 (Ihmisen perimän kasvainnekroositekijägeenin eristäminen) 32
Esimerkin 1 vaiheessa 3 saatua P:llä merkittyä plasmidin pB2-7 sisältämää liitännäistä käyte- g tään hybridisaatiokoettimena seulottaessa 10 täplää, 45 86992 jotka ovat muodostuneet bakteriofaagi Charon 4A/ihmisen geenikirjastosta, joka on valmistettu liittämällä Charon 4A:n EcoRI-liittämiskohtaan (Blattner et ai., Science, 196, 161 (1977)) ihmisen osittain pilkotun DNA:n kooltaan tunnetut fragmentit (Maniatis et ai.,
Cell, Jj>, 687 (1978)). Täplähybridisointi suoritetaan menetelmällä Benton and Davis, Science, 196, 180 (1977). Koska lähtöviljelmän kaikki bakteriofaagimateriaali ei sisällä tarvittavaa geneettistä materiaalia ihmisen kasvainnekroositekijän valmistamiseksi, käytetään koe-tinta, jolla on kanin kasvainnekroositekijän geenille komplementaarinen emässekvenssi. DNA-faagitäplät, joissa on kiinnittyneenä radioaktiivinen koetin, tunnistetaan radioaktiivisuuden perusteella. Kirjastosta eristetään 9 hybridisoitunutta täplää.
Toimenpiteet ja olosuhteet ovat seuraavat: 1) Täplämäärä: 6 4 n. 1 x 10 täplää (n. 4 x 10 täplää/ ^ 150 mm levy x 25) 2) Siirto nitroselluloosasuotimille: (ks. Benton and Davis, Science, 196, 186 (1977)) 3) Hybridisointi: 5
Lisätään 1,25 x 10 cpm/ml esimerkin 1 vaiheessa 3 valmistettua pB2-7-liitännäiskoetinta, 42°C, 19,5 h 4) Pesu: 2 x SSC - 0,1 % SDS huoneenlämpötilassa, upotus 10 min x 4; sen jälkeen 1 x SSC - 0,1 % SDS, 50°C:ssa, upotus 30 minuuttia x 2 5) Valotus: XAR-5 (Eastman Kodak Company, USA), -80°C, 2 vahvistus-varjostinta, 39 tuntia.
Edelläkuvatussa seulonnassa saadaan 12 lupaavaa kantaa. Kun suoritetaan toinen seulonta edelläkuvatulla tavalla, saadaan 9 kantaa, jotka sisältävät halutun fragmentin. Näille kannoille suoritetaan kolmas seulonta samalla tavalla, jolloin saadaan 9 kantaa, jotka sisältävät halutun fragmentin. Näille kannoille suoritetaan neljäs seulonta, jotta saadaan varmistetuksi, että ne sisältävät halutun fragmentin.
86992 46
Saaduille yhdeksälle bakteriofaagille, jotka sisältävät halutun fragmentin, annetaan vastaavasti nimet HG-1 - HG-9.
Vaihe 6 (Kanin perimän kasvainnekroositekijän eristäminen)
Toimitaan oleellisesti ottaen samalla tavalla kuin esimerkin 1 vaiheessa 5, mutta käytetään bakterio-faagi Charon 4A/kanin geenikirjastoa, joka on valmistettu pilkotusta kanin DNA:sta (Maniatis et ai., Cell, 1 5, 687 (1978) eikä pilkotusta ihmisen DNA:sta. Käy- 5 tetään 6,7 x 10 bakteriofaagi Charon 4A/kanin geenikir jastotäplää (bakteriofaagi Charon 4A/ihmisen geenikir jastotäpliä käytettiin 10^). Näin saadaan kaksi bakteriofaagikantaa (RG-1 ja RG-2), jotka sisältävät kanin perimän kasvainnekroositekijägeenin .
Vaihe 7 (Ihmisen kloonien Southernin täplitysanalyysi)
Esimerkin 1 vaiheessa 5 saaduista bakteriofaa- geista HG-3, HG-6 ja HG-7 otetaan talteen kunkin bakteriofaagin DNA seuraavalla tavalla.
1 0 6 x 10 E. coli LE392-solua (isäntäsolu) sus- 9 pendoidaan 18 ml:aan SM:ää ja lisätään 3 x 10 täp-länmuodostajayksikköä (PFU) bakteriofaagi HG-3:a ja annetaan E. colin infektoitua 20 minuuttia 37°C:ssa.
Näin saatu seos lisätään 3 litraan NZ-alustaa ja kasvatetaan ravisteluviljelmässä 23 tuntia 37°C:ssa.
Seokseen lisätään 60 ml CHCl^ ja viljellään ravistelussa 30 minuuttia. Seokseen lisätään natriumkloridia niin, että lopulliseksi väkevyydeksi tulee 1 M, saadun seoksen annetaan seisoa 15 minuuttia ja emäliuos sentrifu-goidaan talteen. Sitten seokseen lisätään polyetylee-niglykolia (molekyylipaino noin 6000) niin, että sen väkevyydeksi tulee 10 % (paino/tilavuus), ja annetaan seisoa 22 tuntia 40°C:ssa. Bakteriofaagit otetaan talteen sentrifugoimalla. Saadut faagit suspendoidaan 47 86992 28 ml:aan SM:ää ja lisätään yhtä suuri tilavuus kloroformia. Sekoitetaan Vortexilla 30 sekuntia ja vesi-faasi sentrifugoidaan talteen. Sitten vesifaasiin lisätään SM-liuosta niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 30 ml. Saatuun seokseen lisätään 26,4 g CsC1, liuotetaan se varovaisesti ja ultrasentrifu-goidaan (45000 1/min, 20 tuntia), jolloin bakterio-faagit saadaan vyöhykkeenä. Saatu bakteriofaagiseos dialysoidaan liuosta vasten, jossa on 10 mM NaCl, 50 mM Tris (pH8) ja 10 mM MgC^· Sitten seokseen lisätään EDTA, proteinaasi K:ta ja SDS:ää niin, että pitoisuuk-jr siksi tulee vastaavasti 20 mM, 50 ug/ml ja 0,5 % (paino/tilavuus). Sitten seosta käsitellään 1 tunti 65°C:ssa, uutetaan fenolilla ja fenolin ja kloroformin seoksella (1:1 tilavuusosina) ja lopuksi kloroformilla. Saatu vesifaasi dialysoidaan liuosta vasten, jossa on 10 mM Tris (pH 8) ja 1 mM EDTA. Vesifaasille tehty UV-absorptiomittaus osoittaa, että kyseessä on puhdas bakteriofaagi HG-3:n DNA.
Kun nämä toimenpiteet toistetaan oleellisesti ottaen samoina, saadaan bakteriofaagien HG-1 ja HG-7 DNA:t.
Näin saadaan 2920 yg Hg-3:a, 1100 yg HG-6:tta ja 819 yg HG-7:ää.
Saaduille DNA-laaduille suoritetaan Southernin täplitysanalyysi, joka on selostettu julkaisussa E.M. Southern, J. Mol. Biol. , 9J3, 503 (1975). Toimenpiteet ja olosuhteet ovat seuraavat: 1) DNA: HG-3 825 ng kussakin HG-6 935 ng kussakin HG-7 685 ng kussakin 2) Pilkkominen eri restriktioentsyymeillä: 10 yksikköä BamHI, 10 yksikköä EcoRI, 10 yksikköä BamHI + 10 yksikköä EcoRI 10 yksikköä Hindlll,
10 yksikköä Hindlll + 10 yksikköä EcoRI 10 yksikköä PvuII
48 8 6 9 9 2 37°C, 3 tuntia.
3) Elektroforeesi:
0,8 % agaroosigeeli TAE
28 V, 15,5 tuntia 4) Siirto nitroselluloosasuotimille: (ks. E.M. Southern, J. Mol.Biol., 98, 503 (1975)) 5) Esihybridisointi:
30 ml FDSS
42°C, 6 tuntia 6) Hybridisointi 5 pR18:n 5’-fragmentti (1 x 10 cpm/ml) (valmistettu esimerkin 1 vaiheessa 4) 42°C, 14 tuntia 7) Pesu 2 x SCC - 0,1 % SDS, huoneenlämpötilassa.
Upotus 10 min x 4; sen jälkeen 1 x SSC - 0,1 SDS% 50°C:ssa Upotus 30 min x 2 8) Valotus: XAR-5 (Eastman Kodak Company, USA), -80°C, 2 vahvistus-varjostinta, 14 tuntia
Hybridisointitulokset on esitetty taulukossa 4.
49 86992
Taulukko 4
Klooni- Koettimella (pRl8) hybridisoituvan fragmentin
Entsyymi (bakterio-U^Q-.—— __ faagi) | 5'-pää | 3'-pää HG-3 6‘7 ke <
BamHI -6 11.2 ke «- -7 9.2 ke <
BamHI HG-3 2.9 ke ^— + -6 " <r-
EcoRI -7 " c- HG-3 ” <:-
EcoRI -6 ____^
HincIII HG-3 " ^- + -6 -
EcoRI -7 " i -i— __ j i ; HG-3 9.7 ke v-
HincIII -6 4.1 ke τ- -7 9.7 ke <- KG-3 2.2 ke 0.9 ke
PvuII -6 1.9 ke 0.9 ke -7 2.2 ke 0.9 ke | HUOM.: Symboli _" tarkoittaa, että sama fragmentti hybridisoituu.
50 86992
Vaihe 8 (Kanin kloonien Southernin täplitysanalyysi)
Toimitaan oleellisesti ottaen samoin kuin esimerkin 1 vaiheessa 7, mutta käytetään bakteriofaageja RG-1 ja RG-2 eikä bakteriofaageja HG-3, HG-6 ja HG-7. Southernin täplitysanalyysin tuloksena havaitaan, että pR18:n 5'-fragmentti hybridisoituu sellaisten fragmenttien muodostaman yhden vyöhykkeen kanssa, jotka on saatu pilkkomalla RG-1 ja RG-2 kullakin seuraavista restriktioentsyymeistä ja entsyymiyhdistelmistä: BamHI, EcoRI, Bglll, Hindlll ja BamHI + EcoRI.
Vaihe 9 ( Ihmisen perimän kasvainnekroositekijän geenin sisältävien bakteerikloonien rakentaminen) HG-3-DNA valmistettiin Landy et ai:n menetelmällä (Biochemistry, Voi. 13, 2134 (1974)) (sama kuin edellä vaiheessa 5). 33 yg saatua HG-3-DNA:ta pilkotaan 80 yksiköllä EcoRI:tä 3 tuntia 37°C:ssa. Hajotustuotteel-le suoritetaan elektroforeesi 1 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä (olosuhteet: 1 x TAE, 20 V, 14,5 tuntia). 2,9 ke:n vyöhyke eristetään agaroosigeelistä T. Maniatiksen kuvaamalla tavalla (Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory, s. 377 (1982)). Tarkemmin sanottuna geelistä irti leikattua, 2,9 ke:n fragmentit sisältävää osaa kuumennetaan 15 minuuttia 65°C: ssa. 2,9 ke:n pituinen, EcoRI:llä leikattu HG-3-frag-mentti (käytetään tästä lähtien nimitystä "HG-3/EcoRI
2,9 ke-fragmentti") otetaan talteen sulatetusta geelistä uuttamalla 3 kertaa fenolilla ja 3 kertaa jollain muulla uutto-liuottimella, jonka jälkeen saostetaan airmoniumasetaattipitoisella etanolilla. Näin saadaan 637 ng (saanto noin 30 %) HG-3/EcoRI 2,9 ke-fragmenttia.
255 ng edelläsaatua fragmenttia liitetään 56,5 ng:aan EcoRI:11ä pilkottua pUC13:ta (J. Messing, Methods 51 86992 in Enzymology, Voi. 101, 20 (1983)) käyttämällä 2,5 yksikköä T^-ligaasia 4°C:ssa 20 tuntia.
E. coli K12-kanta JM83 transformoidaan käyttämällä edelläsaatua liitostuotetta. Tarkemmin sanottuna E. coli K12-kantaa JM83 viljellään LB-alustassa, kunnes viljelmän optinen tiheys on 0,3 550 nm:ssä. 50 ml:sta näin saatua E. coli Kl2-kannan JM83-viljelmää otetaan solut talteen, pestään 25 ml:11a liuosta, jossa on 10 mM MOPS (pH 7,0) ja 10 mM RbCl, ja suspendoidaan uudestaan 25 ml:aan liuosta, jossa on 0,1 M MOPS (pH 6,5), 50 mM CaCl2 ja 10 mM RbCl. Saatua suspensiota jäähdytetään jäällä 30 minuuttia, sentrifugoidaan ja suspendoidaan seokseen, jossa on 2 ml liuosta, joka sisältää 0,1 M MOPS (pH 6,5), 50 mM CaCl2 ja 10 mM RbCl, ja 30 μΐ DMSO. 203 yl:aan suspensiota lisätään 10 yl liitostuotteen vesiliuosta, joka sisältää 10 ng liitos-tuotetta. Seosta jäähdytetään jäällä 30 minuuttia ja sen jälkeen kuumennetaan 60 sekuntia 40°C:ssa. Kuumennettuun seokseen lisätään välittömästi 5 ml 37°C:een esi-lämmitettyä LB-alustaa ja sitten inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. Saatu kasvusto sentrifugoidaan ja emäliuos poistetaan. Saatuun solupellettiin lisätään LB-alustaa ja sillä siirrostetaan LB-levy, jossa on 30 ug/ml ampisilliinia ja 40 ug/ml X-gal:ia. Pesäkkeet, joissa on liitännäisen sisältävillä plasmideilla transformoituneita E. coli Kl2-kannan JM83-soluja, ovat valkoisia, kun taas pelkällä plasmidilla transformoituneita E. coli Kl2-kannan JM83 soluja sisältävät pesäkkeet ovat sinisiä. Saadut valkoiset pesäkkeet siirrostetaan uudestaan LB-alustaan, jossa on 30 ug/ml ampi-silliiniä ja 40 ug/ml X-gal:ia, varmistamistarkoituk-sessa.
Edelläsaaduista valkoisista pesäkkeistä valitaan ja seulotaan 10 pesäkettä (bakteerikloonit) käyttämällä mini-prep-tekniikkaa : | Tarkemmin sanottuna kutakin pesäkettä kasvate- 86992 taan yön yli LB-alustassa jossa on 30 yg/ml ampisil-liiniä.Kasvaneet solut otetaan talteen ja suspendoidaan liuokseen, jossa on 2 mg/ml lysotsyymiä, 50 mM glukoosia,10 mM EDTA ja 25 mM Tris.HCl (pH 8,0). Suspension annetaan seisoa huoneenlämpötilassa 5 minuuttia ja sen jälkeen lisätään 200 yl liuosta, jossa on 0,2 N NaOH ja 1 % SDS. Sekoitetaan hitaasti ja sen jälkeen annetaan seisoa huoneenlämpötilassa 2 minuuttia. Sitten lisätään 150 yl 3 M natriumasetaattia (pH 5,2), annetaan seisoa 10 minuuttia -20°C:ssa ja otetaan emäliuos talteen sentrifugoimalla 15 minuuttia. Emäliuokseen lisätään 900yl kylmää etanolia, ja sentrifugoidaan 5 minuuttia, jotta saadaan sakka talteen. Saatu sakka pestään 70-prosenttisella etanolilla ja kuivataan niin, että saadaan plasmidi-DNA. Edelläkuvatulla menetelmällä saatiin kymmenen plasmidi-DNA:ta.
Kukin plasmidi-DNA liuotetaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris ja 0,1 M EDTA (pH 8,0), pilkotaan EcoRIzllä ja suoritetaan restriktioanalyysi elektroforeesilla. Pilkkomis- ja elektroforeesiolosuhteet ovat seuraavat:
Pilkkominen: Plasmidi-DNA-liuos, 1/5 edellävalmiste- tusta; EcoRI, 3 yksikköä; 37°C; 1,5 tuntia. Elektroforeesi: 1% agaroosigeeli; 1 x TAE; 120 V, 2 tuntia.
Tämä restriktioanalyysi osoittaa, että kahdeksan näistä kymmenestä kloonista on positiivisia. Tämä tarkoittaa sitä, että kahdeksassa kloonissa on 2,9 ke:n fragmentti. Kahdeksasta positiivisesta kloonista valitaan yksi ja sille annetaan nimi E. coli K12-kanta JM83 (pHGE) (ATCC 39656).
Oleellisesti ottaen samoin kuin edellä vaiheessa 2 valmistetaan 1,89 mg pHGE-DNA:ta käyttämällä E. coli K12-kantaa JM83 (pHGE) eikä E. coli-kantoja, joissa on pB2-7 tai pRl8.
53 86992
Vaihe 10 (EcoRI:llä pilkotun RG-1:n alakloonaus) 30 yg edellä kohdassa 6 valmistettua RG-1:tä pilkotaan EcoRI:llä. Saadusta fragmenttiseoksesta otetaan talteen noin 3,5 ke:n pituinen fragmentti oleellisesti ottaen samoin kuin edellä kohdassa 9, mutta käytetään 0,8 %':sta matalalla sulavaa agaroosi-geeliä. Näin saadaan 1,0 yg EcoRI:llä leikattua RG-1-fragmenttia (noin 3,5 ke). Näin saatu EcoRI-katkaisulla saatu RG-1-fragmentti (3,5 ke) liitetään EcoRI:llä katkaistuun pUC13 oleellisesti ottaen samoin kuin edellä vaiheessa 9.
E. coli Kl2-kannan JM83 transformointi, baktee-rikloonien seulonta, kloonien pilkkominen ja elektroforeesi suoritetaan oleellisesti ottaen samoin kuin edellä kohdassa 9. Saadulle kloonille annetaan nimeksi E. coli K12-kanta JM83 (pRGE) (ATCC 39655)
Oleellisesti ottaen samoin kuin edellä kohdassa 2 valmistetaan 1,70 mg pRG-DNA:ta, mutta nyt käytetään E. coli Kl2-kantaa JM83 (pRGE).
Vaihe 11 (pHGE-plasmidi-DNA:n restriktioentsyymianalyy-si)
Vaiheessa 9 saadun pHGE-DNAn restriktioentyymi-analyysi suoritetaan menetelmällä Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 98 (1982) .
Toimenpiteet ja olosuhteet ovat seuraavat: 1) pHGE-DNA:n pilkkominen EcoRIrllä 18,6 yg pHGE-DNA:ta, 64 yksikköä EcoRI:tä, 37°C, 2 tuntia 2) Etanolisaostus: sakka 3) Sakkaan lisätään tislattua vettä: ; EcoRI:llä pilkotun pHGE:n pitoisuus 1 yg/yl 4) Pilkkominen eri restriktioenstyymeillä: 1 yg pHGE/EcoRI:tä
Restriktioentsyymit: 5 yksikköä PvuII, 5 yksikköä PvuII + 10 yksikköä RsaI, 10 yksikköä RsaI, 4 yksikköä Mstll, 3 yksikköä Aval, 9 yksikköä PstI, 37°C, 2 tuntia 5) Elektroforeesi: 86992 2 % agaroosigeeli, 1 x TAE, 28 V, 14,5 tuntia 6) Siirto nitroselluloosasuotimelle: (ks. E.M. Southern, J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)) 7) Ensimmäinen prehybridisointi: 30 ml FDSS, 42°C, 6 tuntia 8) Ensimmäinen hybridisointi: 4 pRl8 5'-fragmentti (5 x 10 cpm/ml) (valmistettu edellä kohdassa 4), 42°C, 14 tuntia 9) Pesu: 2 x SSC - 0,1 % SDS, huoneenlämpötila Upotus 10 minuuttia x 4; sitten 1 x SSC - 0,1 % SDC, 50°C Upotus 30 minuuttia x 2 10) Valotus: XAR-5 (Eastman Kodak Company, USA), -80°C, 2 vah-vistusvarjostinta, 17,5 tuntia 11) Pesu: 0,5 M NaOH - 1,5 M NaCl (Upotus: 1 minuutti) 0,5 M Tris - 1,5 M NaCl (Upotus: 1 minuutti)
Sitten 3 x SSC (Upotus: 1 minuutti) 12) Valotus:
Suoritetaan samoin kuin kohdassa 10), mutta valotusaika on 19 tuntia.
13) Toinen esihybridisointi:
Samoin kuin kohdassa 7) 14) Toinen hybridisointi: pB2-7-liitännäinen (valmistettu edellä kohdassa 3), 42°C, 16,5 tuntia.
15) Pesu:
Samoin kuin kohdassa 9).
16) Valotus:
Samoin kuin kohdassa 10), mutta valotusaika on 19,5 tuntia.
17) Pesu:
Samoin kuin kohdassa 11).
18) Valotus:
Samoin kuin kohdassa 10), mutta valostuaika on 20 tuntia.
55 86992 19) Kolmas esihybridisointi:
Samoin kuin kohdassa 7).
20) Kolmas hybridisointi: pR18 31-fragmentti (4,5 x 10^ cpm/ml) (valmistettu edellä kohdassa 4), 42°C, 15 tuntia 21) Pesu:
Samoin kuin kohdassa 9).
22) Valotus:
Sama kuin kohdassa 10.
Restriktioentsyymianalyysin tulokset on esitetty kuvassa 4
Vaihe 12 (pRGE-plasmidi-DNA:n restriktioentsyymianalyysi)
Vaiheessa 10 valmistetulle pRGE-plasmidi-DNA:lie suoritetaan restriktioentsyymianalyysi oleellisesti ottaen samalla tavalla kuin edellä kohdassa 11. Saatu pRGE-DNA-liitännäisen restriktiokartta on esitetty kuvassa 5.
Vaihe 13 (Kanin kasvainnekroositekijägeenin ja ihmisen kasvainnekroositekijägeenin emässekvenssin määrittäminen)
Noudatetaan oleellisesti ottaen vaiheen 2 toimen-• · piteitä, mutta käytetään edellä vaiheessa 9 saatua E. coli K12-kantaa JM83 (pHGE) ja edellä kohdassa 10 saatua E. coli K12-kantaa JM83 (pRGE) vaiheessa 2 käytettyjen kantojen tilalla (E. coli K!2-kanta MC1061 (pB2-7) ja E. coli Kl2-kanta MC1061(pR18)). Näin saadaan 150 yg kumpaakin plasmidi-DNA:ta pRGE ja pHGE.
pRGE:n ja pHGE:n emässekvenssi määritetään Maxam-Gilbertin menetelmällä (Maxam et ai., Methods in Enzymology, Voi. 55, 490 (1980), Academic Press).
Vertailuesimerkissä 3 määritettyä pR-18:n emäs-sekvenssiä verrataan määritettyyn pRGE:n emässekvens-siin, jotta saadaan selville kanin kasvainnekroositeki jän geenin rakenne eksoneineen ja introneineen. pRGE-DNA-liitännäisen rakenne on esitetty kuvassa 5.
56 86992
Sen jälkeen pRGErn emässekvenssiä verrataan pHGE:n emässekvenssiin, jotta saadaan selville homologia ja intronin ja eksonien välisen rajan yhtäpitävyys.
Näin saadaan selville ihmisen kasvainnekroositekijän geenin rakenne, eksonit ja intronit mukaanlukien.
Ihmisen kasvainnekroositekijän geenin rakenne on esitetty kuvassa 4.
Seuraavassa on esitetty edellä saadut emässek-venssit, jotka koodittavat kanin kasvainnekroositeki-jää ja ihmisen kasvainnekroositekijää vastaavasti. Kaavassa ylempi rivi esittää kanin kasvainnekroositeki-jää (R) ja alempi ihmisen kasvainnekroositekijää (H).
R TCA GCT TCT CGG GCC CTG AGT GAC AAG CCT CTA G CC CAC GTA GTA
H TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA
R GCA AAC CCG CAA GTG GAG GGC CAG CTC CAG TGG CTG AGC CAG CGT
H GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG
R GCG AAC GCC CTG CTG CGC AAC GGC ATG AAG CTC AC G GAC AAC CAG
H GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
R CTG GTG GTG CCG GCC GAC GGG CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTT
H CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC
R CTC TTC AGC GGT CAA GGC TGC CGC TCC · · · TAC GTG CTC CTC ACT
H CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC
R CAC ACT GTC AGC CGC TTC GCC GTC TCC TAC CCG AAC AAG GTC AAC
H CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC
R CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAC CGG GAG ACC CCC GAG
H CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG
R GAG GCT GAG CCC ATG GCC TGG TAC GAG CCC ATC TAC CTG GGC GGC
H GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG
R GTC TTC CAG TTG GAG AAG GGT GAC CGG CTC AGC ACC GAG GTC AAC
H GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG A.TC AAT
R CAG CCT GAG TAC CTG GAC CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC TTT
H CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT
R GGG ATC ATT GCC CTG
H GGG ATC ATT GCC CTG
57 86992
Huom: Symboli tarkoittaa, että tämä kohta puut tuu kanin kasvainnekroositekijää koodittavasta DNA-sekvenssistä, josta syystä symbolin kummallakin puolella olevat kodonit ovat suoraan liittyneet toisiinsa.
Vaihe 14 (Oligodeoksinukleotidien synteesi)
Ruostumattomasta teräksestä valmistettuun 500 μ1:η reaktioastiaan, jossa on kummassakin päässä ruostumaton-terässuodin, lisätään 20 mg polystyreenihartsia, johon on liitetty nukleosidi (2,0 μΜ) sukkinaattisidoksella. Tämä hartsi käsitellään sinkkibromidin 1 M dikloori-metaani-isopropanoliliuoksella (85:15), jotta dimetoksi-trityylisuojaryhmä (DMT) saadaan poistetuksi, pestään dimetyyliformamidilla, pyridiinillä ja asetonitriilillä ja kuivataan typpivirrassa. Kuivattuun hartsiin lisätään liuos, jossa on DMT-nukleotidia (20 μΜ) ja mesityleeni-sulfonyylinitrotriatsolia (60 μΜ) 200 μ1:333 pyridiiniä. Kytkemisreaktion annetaan edetä 20 minuuttia 45°C:ssa. Tämä suojauksen poisto ja kytkeminen suoritetaan peräkkäisiä nukleotideja varten, kunnes haluttu oligodeoksi-nukleotidi on saatu kootuksi hartsille. Sitten hartsista irroitetaan oligodeoksinukleotidi ja suoritetaan puhdistus menetelmällä Ito , Ike, Ikuta ja Itakura, Nuc.Ac.Res. H>:1755 (1982).
Näin saadaan seuraavat oligodeoksinukleotidit: 1) 5'-AATTCATGTCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAA-3' 2) 3'-GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCTCACTGTTCGG-5' 3) 5'-GCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGC-3' 4) 3'-ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5'
Vaihe 15 (Ihmisen kasvainnekroositekijän minigeenin sisältävän Ml3mp9-HGE:n rakentaminen)
Plasmidi pHGE (10 μg) pilkotaan EcoRI:llä (20 se 86992 yksikköä). Suoritetaan elektroforeesi 1 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä ja 2,9 ke:n fragmentti eluoidaan. Tämä fragmentti sijoitetaan M13mp9-faagin lisääntyvän muodon EcoRI-jaksoon. M13mp9-faagi valitaan, koska se sopii erittäin hyvin DNA-fragment-tien vastaanottajaksi. Tuote transfektoi E. coli JM103-kannan (BRL, Bethesda Research Laboratories, Inc., USA; User Manual/Ml3mp7 Cloning/'Dideoxy' sequencing, 1980). Tuotteelle annetaan nimeksi M13mp9-HGE.
Vaihe 16 (Intronin 3 poisto käyttämällä M13mp9-HGE:n yksisäikeistä DNA:ta ja deleettoria E3-4)
Yksisäikeinen M13mp9-HGE-DNA valmistetaan käyttämällä menetelmää, joka on kuvattu käsikirjassa BRL User Manual/M13mp7 cloning/'Dideoxy' sequencing, 1980.
Oligodeoksinukleotidia 4) 3'-ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5' joka on valmistettu vaiheessa 14, käytetään intronin 3 deleettorina. Intronin 3 deleettorista käytetään nimitystä "E3-4".
Deleettorin E3-4 emässekvenssi on komplementaarinen poistettavaa intronia 3 edeltävän emässekvenssin (eksoni 3) ja mainitun intronin jäljessä olevan emäs-sekvenssin (eksoni 4) kanssa. Introni 3 poistetaan menetelmällä Wallace et ai., Science 209:1396 (1980) seuraavalla tavalla.
E3-4 (164 ng, 15 pmol) fosforyloidaan käyttämällä T4-kinaasia ja ATP:tä (3 mM) ja lisätään templaattiin M13mp9-HGE (1,65 yg, 0,5 pmol).
Reaktioseosta kuumennetaan 65°C:ssa, jäähdytetään huoneenlämpötilaan 5 minuutiksi ja lopuksi jäähdytetään jäävedessä. Seokseen, jossa on dATP, dCTP, dGTP, dTTP ja ATP (0,4 mM) lisätään Klenow-fragmentti (5 yksikköä) ja T4-ligaasi (10 yksikköä) Hin-puskuris-sa (Wallace et ai., Nuc.Ac.Res. 3_; 3647 ( 1 981 )), 1 0 mM Tris.HCl (pH 7,2), 2 mM MgCl2 ja 1 mM β-merkaptoeta- i 59 8 6 9 9 2 nolia. Reaktioseosta (lopullinen tilavuus 50 μΐ) inku-boidaan 30 minuuttia 4°C:ssa ja sen jälkeen 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. DNA:11a, joka on saatu käyttämällä reaktiossa oligonukleotidialuketta, trans-fektoidaan E. coli JM103 menetelmällä, jota on kuvattu käsikirjassa BRL User Manual/Ml3mp7 cloning/'Dideoxy' sequencing, 1980. Tällä tavalla saadut täplät poimitaan YT-levyille (J.H. Miller, s. 433, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)). Saatuja pesäkkeitä hybridisoidaan 2 tuntia o 32 55°C:ssa ^Pillä leimatun E3-4:n kanssa. Tässä vaiheessa käytetään koettimena deleettoria, jotta saadaan tunnistetuksi DNA-sekvenssit, joilla on komplementaarinen sekvenssi intronin poiston jälkeen. Faagi eristetään niistä pesäkkeistä, jotka hybridisoituvat deleettorin kanssa.
Saatua faagia viljellään levyillä ja täplät poimitaan YT-levyille. Kloonien annetaan hybridisoitua 2 tuntia 55°C:ssa ^P:llä merkityn E3-4:n kanssa. Otetaan talteen positiiviset kloonit ja faagi-DNA sek-ventoidaan, jotta saadaan selville ne faagit, joista introni 3 on poistunut kokonaan. Yhdelle tällaiselle faagille annetaan nimi mp9-HGEA 3-1.
Vaihe 17 (pHTNF-lacUV5-2:n rakentaminen) mp9-HGEA3-1:n replikoituva muoto pilkotaan EcoRI:llä. EcoRI-fragmentti eristetään ja kloonataan EcoRIrllä katkaistuun pBR327:ään, jolloin saadaan plas-midi pHGEA3-1.
Plasmidin rakentamista jatketaan plasmidista pHGEÄ 3-1 lähtien, jotta saadaan aikaan plasmidiA 3-1, : joka ilmentää kasvainnekroositekijää suoraan E. co- lissa käyttämällä lacUV5:ttä promoottorina. Toimenpiteet on esitetty kuvassa 7. Ensin 10 yg plasmidi-pHGEA3-1-DNA:ta pilkotaan 10 yksiköllä Aval:tä ja EcoRI:tä (Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) 60 86992 37°C:ssa 2 tuntia ja sen jälkeen suoritetaan elektroforeesi 4-painoprosenttisessa polyakryyliamidigeelis-sä fragmenttien eristämiseksi. Geelistä saadaan eristetyksi elektroeluutiolla noin 1 yg fragmenttia. Kuvassa 7 mainitut kaksi oligodeoksinukleotidia eli 5'-AATTCA TGTCATCTTCTCGAACC-3' ja 5'-TCGGGGTTCGAGAAGATGACATG-3' syntetisoidaan vaiheessa 14 esitetyllä menetelmällä. Sitten kummankin oligodeoksinukleotidin (noin 100 pitol 5'-pää fosforyloidaan käyttämällä T4-polynukleotidiki-naasia kirjallisuusviitteessä (3) sivulla 122 esitetyllä menetelmällä. Kun reaktio on tapahtunut täydellisesti, reaktioseos uutetaan fenolilla ja sen jälkeen kloroformilla. Näin saadut synteettiset oligo-meerit sekoitetaan 0,5 yg:aan plasmidista pHGEÄ3-1 edellä saatua Aval-EcoRl-fragmenttia ja saostetaan etanolilla. Näitä fragmentteja liitetään liitetään yhteen yön yli 4°C:ssa 10 yksikön kanssa T4-ligaasia noudattamalla kirjallisuusviitteen (1) sivulla 37 kuvattua menetelmää. Reaktion loputtua seos saostetaan etanolilla, suoritetaan elektroforeesi 4-painopro-senttisella polyakryyliamidigeelillä, jotta fragmentti saadaan talteen elektroeluutiolla.
Plasmidi pOP95-15 valmistetaan menetelmällä F. Fuller, Gene, J_9, ss. 42-54 (1982).
1 yg pOP95-15 pilkotaan EcoRIrllä ja uutetaan fenolilla ja sen jälkeen kloroformilla ja saostetaan etanolilla, jotta saadaan vektori. T4 DNA-ligaasia käyttämällä 0,5 yg saatua vektoria liitetään edelläsaatuun fargmenttiin. Kirjallisuusviitten (4) sivulla 20 kuvatulla menetelmällä E. coli JM101 (ATCC 33876) transformoidaan edelläsaadulla vektorilla ja viljellään agaralustalla, jossa on 1 mM IPTG:tä ja 0,004 % (paino/tilavuus) X-gal:ia, jolloin saadaan noin 100 valkoista pesäkettä.
: Näistä transformanteista valmistetaan plasmidi- DNA ja suoritetaan pilkkominen EcoRI:llä, jotta saadaan tunnistetuksi ne plasmidit, joissa on haluttu 61 86992
EcoRI-fragmentti. Jotta saataisiin selville liitännäisen suunta, plasmidit pilkotaan PvuII:lla ja Pstl:llä ja suoritetaan elektroforeesi 1,5-painopro-senttisella agaroosigeelillä, jotta saadaan valituksi plasmidit, jotka antavat noin 1280 emäsparin ja 2600 emäsparin fragmentteja, mikä osoittaa, että lacUV5-promoottorin transkriptiosuunta on sopusoinnussa kas-vainnekroositekijää koodittavan oligodeoksinukleoti-din transkriptiosuunnan kanssa.
Emässekvenssin analyysi osoittaa, että näillä 2 plasmidilla on sama sekvenssi, ja että lacUV5-promoot-tori, syntetisoitu oligodeoksinukleotidi ja DNA ovat oikealla tavalla liittyneet toisiinsa. Saadulle plas-midille annetaan nimi pHTNF-lacUV5-2.
E. colia, joka sisältää pHTNF-lacUV5-2:n, viljellään tavallisessa ravinnealustassa. Kun määritetään tuotteen kasvainnekroositejikäaktiivisuus biologisesti, havaitaan sen olevan suunnilleen sama kuin plasmidir inf -lacUV-1:n tuotteella, joka plasmidi sisältää kanin kasvainnekroositekijän geenin lac-pro-moottorin ohjauksessa.
Esimerkki 2
Kun käytetään plasmidia pHGE ja oligodeoksinuk-leotideja 1 - 4), jotka on saatu aikaan esimerkin 1 vaiheissa 1-14 kuvatuilla menetelmillä, valmistetaan pHTNF-lacUV5-1 toimimalla kuvassa 6 esitetyllä tavalla.
Mikro-organismit ja uudet plasmidit (mikro-orga-nisminäytteet sisältävät plasmidit) on taltioitu American Type Culture Collection-kokoelmaan, Rockville, Maryland, USA, 6. huhtikuuta 1984. Mikro-organismille E. coli k-12-kanta JM83 (pRGE) annettiin numero ATCC 39655. Mikroorganismille E. coli k-12-kanta JM83 (pHGE) annettiin numero ATCC 39656.
62 86992
On selvää, että tässä selostuksessa kuvattua keksintöä voidaan muunnella monilla tavoin. Tällaisia muunnoksia ei pidä katsoa keksinnön kattamasta alasta ja hengestä poikkeaviksi ja kaikkien sellaisten muunnosten, joiden voidaan katsoa olevan itsestään selviä alan ammatti-ihmiselle, katsotaan kuuluvan seuraavien patenttivaatimusten kattamaan alaan.
Claims (6)
1. Replikoituva yhdistelmä-DNA, tunnettu siitä, että se sisältää DNA:n, joka sisältää ihmisen kas-vainnekroositekijää koodittavan emässekvenssin, jonka ihmisen kasvainnekroositekijän aminohappojärjestys on kaavan (I) mukainen: Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Vai Ala His Vai Vai Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Vai Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Vai Vai Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Vai Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Vai Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Vai Ser Tyr Gin Thr Lys Vai Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Vai Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Vai Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu jossa kaavassa Gin on glutamiinitähde, Asp on aspara-giinihappotähde, Pro on proliinitähde, Tyr on tyrosiini-tähde, Vai on valiinitähde, Lys on lysiinitähde, Glu on glutamiinihappotähde, Ala on alaniinitähde, Asn on aspa-ragiinitähde, Leu on leusiinitähde, Phe on fenyylialanii-nitähde, Gly on glysiinitähde, His on histidiinitähde, Ser on seriinitähde, Thr on treoniinitähde, Ile on iso-leusiinitähde, Trp on tryptofaanitähde, Arg on arginiini-tähde, Met on metioniinitähde ja Cys on kysteiinitähde, ja replikoituvan ilmentämisvälineen.
2. Plasmidi- tai bakteriofaagisiirtovektori, tunnettu siitä, että se sisältää emässekvenssin, joka koodittaa ihmisen kasvainnekroositekijää, jolla on kaavan 64 86992 (I) mukainen aminohappojärjestys: Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Vai Ala His Vai Vai Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Vai Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Vai Vai Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Vai Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Vai Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Vai Ser Tyr Gin Thr Lys Vai Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Vai Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Vai Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu jossa kaavassa Gin on glutamiinitähde, Asp on aspara-giinihappotähde, Pro on proliinitähde, Tyr on tyrosiini-tähde, Vai on valiinitähde, Lys on lysiinitähde, Glu on glutamiinihappotähde, Ala on alaniinitähde, Asn on aspa-:: ragiinitähde, Leu on leusiinitähde, Phe on fenyylialanii- *' nitähde, Gly on glysiinitähde, His on histidiinitähde, Ser on seriinitähde, Thr on treoniinitähde, Ile on iso-leusiinitähde, Trp on tryptofaanitähde, Arg on arginiini-tähde, Met on metioniinitähde ja Cys on kysteiinitähde.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on pHGE, joka on talletettu American Type Culture Collection-talletuslaitokseen talletusnumerolla ATCC 39656.
4. Menetelmä ihmisen kasvainnekroositekijän valmistamiseksi, jonka aminohappojärjestys on kaavan (I) mukainen: Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Vai Ala His Vai Vai Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg 65 86992 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Vai Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Vai Vai Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Vai Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Vai Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Vai Ser Tyr Gin Thr Lys Vai Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Vai Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Vai Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu jossa kaavassa Gin on glutamiinitähde, Asp on aspara-giinihappotähde, Pro on proliinitähde, Tyr on tyrosiini-tähde, Vai on valiinitähde, Lys on lysiinitähde, Glu on glutamiinihappotähde, Ala on alaniinitähde, Asn on aspa-ragiinitähde, Leu on leusiinitähde, Phe on fenyylialanii-nitähde, Gly on glysiinitähde, His on histidiinitähde, Ser on seriinitähde, Thr on treoniinitähde, Ile on iso-leusiinitähde, Trp on tryptofaanitähde, Arg on arginiini-tähde, Met on metioniinitähde ja Cys on kysteiinitähde, tunnettu siitä, että a) DNA, joka koodittaa ihmisen kasvainnekroositeki-jää, liitetään replikoituvaan ilmentämisvektoriin, joka kykenee ilmentämään mainittua DNA:ta, jolloin saadaan replikoituva yhdistelmä-DNA, joka sisältää mainitut DNA:n ja replikoituvan ilmentämisvälineen; b) transformoidaan EL. coli- tai Bacillus subtilis-viljelmän solut mainitulla replikoituvalla yhdistelmä-DNA: 11a niin, että saadaan transformantteja; c) valitaan transformantit EL. coli- tai Bacillus subtilis-vilielmän kantasolujen joukosta; d) inkuboidaan näitä transformantteja niin, että saadaan ne ilmentämään mainittu DNA ja tuottamaan ihmisen ... kasvainnekroositekijää; ja 66 86992 e) eristetään ihmisen kasvainnekroositekijä inku-boiduista transformanteista.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu DNA sisältää seuraavan kaavan (II) mukaisen emässekvenssin ja/tai mainitulle emässekvenssille komplementaarisen emässekvenssin TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT G TT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG jossa A on deoksiadenyylihappotähde, G on deoksiguanyy-lihappotähde, C on deoksisytidyylihappotähde ja T on ty-midyylihappotähde ja kaavan (II) vasemmassa päässä on 5'-hydroksyyliryhmä ja oikeassa päässä 31-hydroksyyliryh-mä.
6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu DNA on saatu korvaamalla vähintään yksi emäs tämän DNA:n patenttivaatimuksessa 5 määritellyissä emässekvensseissä geneettisen koodin degeneroitumisen mukaisesti. 86992
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US59737284 | 1984-04-06 | ||
| US06/597,372 US4879226A (en) | 1984-04-06 | 1984-04-06 | Novel human physiologically active polypeptide |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI851336A0 FI851336A0 (fi) | 1985-04-03 |
| FI851336L FI851336L (fi) | 1985-10-07 |
| FI86992B FI86992B (fi) | 1992-07-31 |
| FI86992C true FI86992C (fi) | 1992-11-10 |
Family
ID=24391235
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI851336A FI86992C (fi) | 1984-04-06 | 1985-04-03 | Foerfarande foer framstaellning human tumoernekrosfaktor och plasmid anvaend vid foerfarandet |
Country Status (39)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4879226A (fi) |
| EP (2) | EP0158286A3 (fi) |
| JP (1) | JPS60252496A (fi) |
| KR (1) | KR920007399B1 (fi) |
| AR (1) | AR240475A1 (fi) |
| AU (2) | AU595480B2 (fi) |
| BE (1) | BE902119A (fi) |
| BG (1) | BG43355A3 (fi) |
| BR (1) | BR8501624A (fi) |
| CA (1) | CA1341348C (fi) |
| CH (2) | CH672790A5 (fi) |
| DD (1) | DD251785A5 (fi) |
| DK (1) | DK151985A (fi) |
| EG (1) | EG17965A (fi) |
| ES (1) | ES8704976A1 (fi) |
| FI (1) | FI86992C (fi) |
| FR (1) | FR2564097B1 (fi) |
| GB (1) | GB2158829B (fi) |
| GR (1) | GR850836B (fi) |
| HK (1) | HK102192A (fi) |
| HU (1) | HUT37813A (fi) |
| IE (1) | IE58833B1 (fi) |
| IL (1) | IL74804A (fi) |
| IN (1) | IN163653B (fi) |
| IT (1) | IT1218469B (fi) |
| JO (1) | JO1365B1 (fi) |
| LU (1) | LU85835A1 (fi) |
| MA (1) | MA20402A1 (fi) |
| MT (1) | MTP963B (fi) |
| MY (1) | MY101887A (fi) |
| NO (1) | NO174473C (fi) |
| NZ (2) | NZ211666A (fi) |
| OA (1) | OA07983A (fi) |
| PL (1) | PL156392B1 (fi) |
| PT (1) | PT80239B (fi) |
| RO (1) | RO93650B (fi) |
| SG (1) | SG77892G (fi) |
| YU (1) | YU57885A (fi) |
| ZA (1) | ZA852563B (fi) |
Families Citing this family (74)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0695939B2 (ja) * | 1983-12-02 | 1994-11-30 | 大日本製薬株式会社 | ウサギ癌壊死因子をコ−ドするクロ−ン化ｄνａ |
| US5288852A (en) * | 1984-03-06 | 1994-02-22 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Human tumor necrosis factor polypeptides |
| JP2584206B2 (ja) * | 1984-08-17 | 1997-02-26 | 大日本製薬株式会社 | ヒト癌壊死因子 |
| DE3582183D1 (de) * | 1984-03-06 | 1991-04-25 | Dainippon Pharmaceutical Co | Dns den menschlichen tumornekrosisfaktor kodierend und das menschliche tumornekronisfaktor-polypeptid. |
| US4965199A (en) * | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
| JPS60228297A (ja) * | 1984-04-24 | 1985-11-13 | 株式会社 東京タツノ | 給油装置 |
| GR851626B (fi) * | 1984-07-05 | 1985-11-26 | Genentech Inc | |
| US6686455B1 (en) * | 1984-07-05 | 2004-02-03 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor |
| US5672347A (en) * | 1984-07-05 | 1997-09-30 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor antagonists and their use |
| JP2675294B2 (ja) * | 1984-10-15 | 1997-11-12 | カイロン コーポレイション | ヒト腫瘍壊死因子 |
| EP0200748B1 (en) * | 1984-10-15 | 1991-02-06 | Cetus Corporation | Human tumor necrosis factor |
| US4959314A (en) | 1984-11-09 | 1990-09-25 | Cetus Corporation | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
| JPS61124392A (ja) * | 1984-11-22 | 1986-06-12 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の精製法 |
| IL73883A (en) * | 1984-12-20 | 1990-12-23 | Yeda Res & Dev | Monoclonal antibodies against tnf-alpha,hybridomas producing them and method for the purification of tnf-alpha |
| ATE73856T1 (de) * | 1984-12-21 | 1992-04-15 | Biogen Inc | Reinigung, herstellung und verwendung von tumor- nekrosisfaktoren. |
| JPS6248634A (ja) * | 1985-07-23 | 1987-03-03 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 新規アミノ酸組成物、その製造方法及び該アミノ酸組成物を含有する医療組成物 |
| US5059530A (en) * | 1985-09-30 | 1991-10-22 | Suntory Ltd. | Expression vector for human TNF |
| JPH0698004B2 (ja) * | 1985-09-30 | 1994-12-07 | サントリー株式会社 | Ｔｎｆ発現用新規プラスミド |
| US4894439A (en) * | 1986-05-22 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | N-terminal derivatives of tumor necrosis factor purified by microporous PTFE membranes |
| US4677197A (en) * | 1985-10-30 | 1987-06-30 | Cetus Corporation | Purification method for tumor necrosis factor |
| US4828830A (en) * | 1986-01-24 | 1989-05-09 | Genentech, Inc. | Method and composition for prophylaxis and treatment of viral infections |
| US5425940A (en) * | 1986-04-09 | 1995-06-20 | Cetus Oncology Corporation | Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor |
| CA1310924C (en) * | 1986-04-24 | 1992-12-01 | Francis P. Mccormick | Infective drug delivery system |
| PT84869B (pt) * | 1986-07-31 | 1990-11-07 | Genentech Inc | Metodo para a profilaxia e tratamento de infeccoes por retrovirus e processo para a preparacao de composicoes para esse fim, contendo factor de necrose tumoral |
| DE3716513A1 (de) * | 1987-05-16 | 1988-11-24 | Basf Ag | Proteine mit tnf-wirkung |
| GB2217325B (en) * | 1988-04-08 | 1991-11-20 | British Bio Technology | Synthetic gene for tumour necrosis factor alpha. |
| US5071834A (en) * | 1988-09-16 | 1991-12-10 | Genentech, Inc. | Purified activin B composition |
| CA2003981C (en) * | 1988-12-27 | 2000-06-13 | Hiroshi Ishimaru | Pharmaceutical compositions and use thereof in the treatment of psoriasis |
| US5342613A (en) * | 1988-12-27 | 1994-08-30 | Health Research Inc. | Pharmaceutical compositions and use thereof in the treatment of psoriasis |
| DE69029799T2 (de) * | 1989-02-21 | 1997-05-28 | Washington University, St. Louis, Mo. | Modifizierte formen von fortpflanzungshormonen |
| US6586222B1 (en) | 1989-08-16 | 2003-07-01 | Chiron Corporation | Recombinant PR-3 and compositions thereof |
| US5843693A (en) * | 1989-08-16 | 1998-12-01 | Chiron Corporation | Assay method for screening for inhibitors of proTNF conversion |
| ATE148992T1 (de) | 1989-08-16 | 1997-03-15 | Chiron Corp | Zusammensetzungen zur hemmung der bildung von proteinhormon und deren verwendungen |
| US5998378A (en) * | 1989-08-16 | 1999-12-07 | Chiron Corporation | Compositions for the inhibition of TNF hormone formation and uses thereof |
| ATE212672T1 (de) * | 1989-10-24 | 2002-02-15 | Chiron Corp | System zur freisetzung von infektiösen proteinen |
| US5653974A (en) * | 1990-10-18 | 1997-08-05 | Board Of Regents,The University Of Texas System | Preparation and characterization of liposomal formulations of tumor necrosis factor |
| US5420019A (en) * | 1993-02-02 | 1995-05-30 | Xoma Corporation | Stable bactericidal/permeability-increasing protein muteins |
| KR970005042B1 (ko) * | 1993-02-09 | 1997-04-11 | 한일합성섬유공업 주식회사 | 종양괴사인자-알파 뮤테인 |
| CA2163032C (en) | 1993-06-03 | 2001-02-06 | John Landon | Antibody fragments in therapy |
| US6551623B1 (en) | 1993-09-09 | 2003-04-22 | Lorus Therapeutics Inc. | Immunomodulating compositions from bile |
| WO1995024501A1 (en) | 1994-03-07 | 1995-09-14 | Cetus Oncology Corporation | Compositions for the inhibition of tnf formation and uses thereof |
| BR9607967A (pt) | 1995-03-16 | 1998-01-13 | Imutec Pharma Inc | Uso de composições imunomodulares extraídas da bile para o tratamento das desordens do sistema imunológico fabricação do medicamento e emprego do mesmo |
| US6001812A (en) * | 1995-04-28 | 1999-12-14 | Societe L'oreal S.A. | Modulating body/cranial hair growth with derivatives of the α-type melanocyte-stimulating hormone |
| FR2733421B1 (fr) * | 1995-04-28 | 1997-06-06 | Oreal | Utilisation de derives de l'hormone stimulatrice des melanocytes de type alpha pour stimuler ou induire la pousse des cheveux et/ou stopper leur chute |
| US6617171B2 (en) * | 1998-02-27 | 2003-09-09 | The General Hospital Corporation | Methods for diagnosing and treating autoimmune disease |
| US6599710B1 (en) | 1999-03-10 | 2003-07-29 | The General Hospital Corporation | Treatment of autoimmune disease |
| US7056695B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-06-06 | Xencor | TNF-α variants |
| US20070172449A1 (en) * | 2000-03-02 | 2007-07-26 | Xencor, Inc. | TNF-alpha VARIANT FORMULATIONS FOR THE TREATMENT OF TNF-alpha RELATED DISORDERS |
| US7446174B2 (en) | 2001-03-02 | 2008-11-04 | Xencor, Inc. | Protein based TNF-α variants for the treatment of TNF-α related disorders |
| US7101974B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-09-05 | Xencor | TNF-αvariants |
| US7687461B2 (en) * | 2000-03-02 | 2010-03-30 | Xencor, Inc. | Treatment of TNF-α related disorders with TNF-α variant proteins |
| US7662367B2 (en) * | 2000-03-02 | 2010-02-16 | Xencor, Inc. | Pharmaceutical compositions for the treatment of TNF-α related disorders |
| US7244823B2 (en) * | 2000-03-02 | 2007-07-17 | Xencor | TNF-alpha variants proteins for the treatment of TNF-alpha related disorders |
| US6579522B1 (en) * | 2000-06-27 | 2003-06-17 | Genvec, Inc. | Replication deficient adenoviral TNF vector |
| EP1399140A1 (en) * | 2001-06-20 | 2004-03-24 | Lorus Therapeutics Inc. | Biological response modifier composition and uses thereof |
| US20030086903A1 (en) * | 2001-11-02 | 2003-05-08 | Genvec, Inc. | Therapeutic regimen for treating cancer |
| US7582313B2 (en) * | 2002-06-27 | 2009-09-01 | The General Hospital Corporation | Methods of organ regeneration using Hox 11-expressing pluripotent cells |
| US7628988B2 (en) | 2002-06-27 | 2009-12-08 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for treating type 1 diabetes |
| AU2003290948A1 (en) * | 2002-11-15 | 2004-06-15 | The General Hospital Corporation | Screening methods to identify treatments for autoimmune disease |
| MXPA05005921A (es) | 2002-12-02 | 2005-10-19 | Abgenix Inc | Anticuerpos dirigidos a factor de necrosis tumoral y sus usos. |
| US7101978B2 (en) * | 2003-01-08 | 2006-09-05 | Applied Molecular Evolution | TNF-α binding molecules |
| CA2545815A1 (en) * | 2003-11-14 | 2005-06-09 | Genvec, Inc. | Adenoviral vectored tnf-a and chemoradiation to treat cancer |
| US7435799B2 (en) * | 2004-01-08 | 2008-10-14 | Applied Molecular Evolution | TNF-α binding molecules |
| US20080102054A1 (en) * | 2005-01-18 | 2008-05-01 | Faustman Denise L | Compositions Containing Agm Cells And Methods Of Use Thereof |
| US9605844B2 (en) * | 2009-09-01 | 2017-03-28 | Cree, Inc. | Lighting device with heat dissipation elements |
| JP6185468B2 (ja) * | 2011-08-12 | 2017-08-23 | メロ バイオテクノロジー インコーポレイテッドＭｅｌｌｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ． | 原核細胞内においてヘアピン様ｒｎａを発現させる方法及び組成物 |
| US10196662B2 (en) | 2012-08-10 | 2019-02-05 | Mello Biotechnology, Inc. | Composition for producing microRNA precursors as drugs for enhancing wound healing and production method of the microRNA precursors |
| ES2885423T3 (es) | 2013-02-07 | 2021-12-13 | Massachusetts Gen Hospital | Procedimientos para la expansión o el empobrecimiento de células T reguladoras |
| JP6560200B2 (ja) | 2013-10-17 | 2019-08-14 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 自己免疫疾患の治療に応答性の対象を同定する方法およびそれを治療するための組成物 |
| WO2016187068A1 (en) | 2015-05-15 | 2016-11-24 | The General Hospital Corporation | Antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor superfamily antibodies |
| EP3340999A4 (en) | 2015-08-28 | 2019-06-12 | The General Hospital Corporation | AGONISTIC ANTI-TUMOR NECROSIS RECEPTOR 2 ANTIBODIES |
| US11266730B2 (en) | 2015-09-29 | 2022-03-08 | The General Hospital Corporation | Methods of treating and diagnosing disease using biomarkers for BCG therapy |
| CN116715767A (zh) | 2016-05-13 | 2023-09-08 | 综合医院公司 | 拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体 |
| WO2018087172A1 (en) | 2016-11-09 | 2018-05-17 | Philogen S.P.A | Il2 and tnf mutant immunoconjugates |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4309418A (en) * | 1980-03-25 | 1982-01-05 | Sloan-Kettering Research Institute For Cancer | Anti-tumor agent from human serum and process |
| US4359415A (en) * | 1981-06-03 | 1982-11-16 | University Of Tennessee Research Corporation | Isolation of an antineoplastic protein fraction and an antineoplastic peptide fraction from human urine |
| JPS5821621A (ja) * | 1981-07-31 | 1983-02-08 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ヒトツモア・ネクロシス・ファクタ−を含有する悪性腫瘍治療剤 |
| JPS6011890B2 (ja) * | 1981-12-21 | 1985-03-28 | 株式会社林原生物化学研究所 | ツモアネクロシスフアクタ−の製造方法 |
| SE8204382L (sv) * | 1981-07-21 | 1983-01-22 | Hayashibara Biochem Lab | Sett att framstella malcellysfaktor och anvendning derav |
| JPS57140725A (en) * | 1981-12-28 | 1982-08-31 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | Physiologically active substance having carcinostatic action |
| JPS58141785A (ja) * | 1982-02-16 | 1983-08-23 | Nippon Shinyaku Co Ltd | 抗腫瘍物質の製法 |
| US4481137A (en) * | 1982-02-26 | 1984-11-06 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Glycoproteins and processes for their production |
| HU189251B (en) * | 1982-04-07 | 1986-06-30 | Asahi Kasei Kogyo Kk,Jp | Process for stabilizing tumor necrosis factor |
| JPS591288A (ja) * | 1982-06-29 | 1984-01-06 | Sato :Kk | 連続値札印字装置 |
| AU8956582A (en) * | 1982-10-06 | 1984-04-24 | Makitsubo, T. | Process for extracting tumor necrosis factor from macrophage |
| JPS59169492A (ja) * | 1983-03-15 | 1984-09-25 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ヒト融合細胞からの生理活性物質の産生方法 |
| CA1265444A (en) * | 1983-06-27 | 1990-02-06 | Lloyd J. Old | Effect of human tumor necrosis factor and human interferon on human cancer cells and methods |
| JPS6019719A (ja) * | 1983-07-15 | 1985-01-31 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 抗腫瘍活性を有する蛋白質 |
| JPS5943617Y2 (ja) * | 1983-08-26 | 1984-12-25 | 株式会社潤工社 | 広い周波数帯域において均一な特性を有する伝送線路用導体 |
| JPS60112718A (ja) * | 1983-11-21 | 1985-06-19 | Kyorin Pharmaceut Co Ltd | 抗腫瘍作用を示す蛋白性物質及びその製造方法 |
| JPH0695939B2 (ja) * | 1983-12-02 | 1994-11-30 | 大日本製薬株式会社 | ウサギ癌壊死因子をコ−ドするクロ−ン化ｄνａ |
| DE3582183D1 (de) * | 1984-03-06 | 1991-04-25 | Dainippon Pharmaceutical Co | Dns den menschlichen tumornekrosisfaktor kodierend und das menschliche tumornekronisfaktor-polypeptid. |
| JPS60185799A (ja) * | 1984-03-06 | 1985-09-21 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
| JPS60260522A (ja) * | 1984-06-07 | 1985-12-23 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 遺伝子組換体が生産する生理活性物質の安定化法 |
| DE3423234A1 (de) * | 1984-06-23 | 1986-02-06 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Synergistische mischungen von interferonen und tumor-nekrose-faktor |
| JPS61124392A (ja) * | 1984-11-22 | 1986-06-12 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の精製法 |
-
1984
- 1984-04-06 US US06/597,372 patent/US4879226A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-02-21 IN IN125/CAL/85A patent/IN163653B/en unknown
- 1985-04-02 NZ NZ211666A patent/NZ211666A/en unknown
- 1985-04-02 RO RO118239A patent/RO93650B/ro unknown
- 1985-04-02 EG EG209/85A patent/EG17965A/xx active
- 1985-04-02 NZ NZ231317A patent/NZ231317A/xx unknown
- 1985-04-02 AR AR299944A patent/AR240475A1/es active
- 1985-04-03 CA CA000478300A patent/CA1341348C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-03 LU LU85835A patent/LU85835A1/fr unknown
- 1985-04-03 JO JO19851365A patent/JO1365B1/en active
- 1985-04-03 GR GR850836A patent/GR850836B/el unknown
- 1985-04-03 FI FI851336A patent/FI86992C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-04-03 ES ES541920A patent/ES8704976A1/es not_active Expired
- 1985-04-03 NO NO851400A patent/NO174473C/no unknown
- 1985-04-03 IL IL74804A patent/IL74804A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-04-03 HU HU851278A patent/HUT37813A/hu unknown
- 1985-04-03 DK DK151985A patent/DK151985A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-04-04 MT MT963A patent/MTP963B/xx unknown
- 1985-04-04 BE BE0/214792A patent/BE902119A/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-04-04 AU AU40882/85A patent/AU595480B2/en not_active Expired
- 1985-04-04 ZA ZA852563A patent/ZA852563B/xx unknown
- 1985-04-04 DD DD27489385A patent/DD251785A5/de not_active IP Right Cessation
- 1985-04-04 EP EP85104109A patent/EP0158286A3/en not_active Withdrawn
- 1985-04-04 PT PT80239A patent/PT80239B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-04-04 GB GB8508864A patent/GB2158829B/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-04 IE IE86385A patent/IE58833B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-04-04 CH CH1497/85A patent/CH672790A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-04-04 OA OA58559A patent/OA07983A/xx unknown
- 1985-04-04 EP EP89116531A patent/EP0354592A1/en not_active Withdrawn
- 1985-04-05 MA MA20624A patent/MA20402A1/fr unknown
- 1985-04-05 FR FR8505283A patent/FR2564097B1/fr not_active Expired
- 1985-04-05 IT IT20242/85A patent/IT1218469B/it active
- 1985-04-05 PL PL1985252807A patent/PL156392B1/pl unknown
- 1985-04-05 BG BG069607A patent/BG43355A3/xx unknown
- 1985-04-05 JP JP60071283A patent/JPS60252496A/ja active Granted
- 1985-04-06 KR KR1019850002321A patent/KR920007399B1/ko not_active Expired
- 1985-04-08 BR BR8501624A patent/BR8501624A/pt unknown
- 1985-04-18 YU YU00578/85A patent/YU57885A/xx unknown
-
1987
- 1987-04-16 MY MYPI87000492A patent/MY101887A/en unknown
-
1989
- 1989-04-04 CH CH2391/89A patent/CH675423A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1989-08-23 AU AU40162/89A patent/AU637054B2/en not_active Expired
-
1992
- 1992-07-30 SG SG778/92A patent/SG77892G/en unknown
- 1992-12-17 HK HK1021/92A patent/HK102192A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI86992C (fi) | Foerfarande foer framstaellning human tumoernekrosfaktor och plasmid anvaend vid foerfarandet | |
| KR940010865B1 (ko) | 종양 괴사 인자의 생산 방법 및 종양 괴사 인자의 수율을 증가시키는 방법 | |
| JP2612149B2 (ja) | α−インターフェロン及びその製造方法 | |
| HU210118B (en) | Method for producing new human tnf polypeptide mutanst | |
| US4880915A (en) | Method for purifying a physiologically active substance produced by recombinant DNA technique | |
| AU589919B2 (en) | Human tumor necrosis factor | |
| AU627477B2 (en) | Interleukin ii analogs | |
| US5187075A (en) | Cloning and expression of a variant gene of platelet factor 4 and compositions thereof to modulate immune responses | |
| KR930000187B1 (ko) | Dna 재조합 기술에 의해 제조된 생리적 활성물질의 안정화 방법 및 상기 물질을 함유하는 안정화 수용액 또는 분말의 제조방법 | |
| JP2675294B2 (ja) | ヒト腫瘍壊死因子 | |
| JPH066066B2 (ja) | 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の熱処理法 | |
| KR870000511B1 (ko) | 발현 비히클의 제조방법 | |
| JPH0242986A (ja) | 新規なヒト生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａ | |
| JPS62135493A (ja) | ガン壊死因子 | |
| JPS61293994A (ja) | ラベル化された生理活性タンパク及びその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: ASAHI KASEI KABUSHIKI KAISHA |