KR970005042B1 - 종양괴사인자-알파 뮤테인 - Google Patents

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Abstract

내용없음.

Description

종양괴사인자-알파 뮤테인
제1도는 플라스미드 pGHH-TNF의 조립에 관한 개요를 나타낸 것이다.
제2도는 플라스미드 pT7-TNF의 조립에 관한 개요를 나타낸 것이다.
본 발명은 종양괴사인자 뮤테인들의 DNA 염기 서열과 아미노산 서열, 그리고 이들 뮤테인들의 제조 및 정제법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 암세포에 대한 세포독성이 기존 종양 괴사인자보다 증가된 뮤테인들의 제조에 관한 것이다.
종양괴사인자(또는 종양괴사인자-알파)는 그람음성균의 세포벽 주성분인 리포다당류 등의 자극에 의해 단핵세포와 대식세포 등에서 분비되는 사이토카인의 일종으로서 여러종류의 암세포들에 대해 생체내및 생체외에서 세포증식 억제성 및 세포독성 효과를 갖는다(Aggarwal, B. B., Drugs of the Future 891-898(1987)). 종양괴사인자는 또한 항바이러스작용(Mestan, J. et al., Nature(London), 816-819(1986) ; Wong, G.H.W. Goeddel, D.V., Nature(London)819-822(1986))과 말라리아 감염에 대해 예방효과를 지닌 것으로 알려져 있다(Playfair, J.H. Taverne, J. in Tumor Necrosis Factor and Related Cytotoxins (Ciba Foundation Symposium 131) 192-205(Wiley, Chichester)(1987)).
사람종양괴사인자의 유전자는 1984년에에 클로닝되어 발현되었으며(Pennica, D. et al., Nature (London), 724-729(1984) ; Shirai, T.et al., Natur e(London)803-806(1985)), 엑스선 결정법을 이용한 사람종양괴사인자의 3차 구조가 두 연구팀에 의해 각각 밝혀졌다(Jones, E.Y. et al., Nature(London)225-228(1989) ; Eck. M.J Sprang, S.R., J. Biol. Chem.17595-17605(1989)). 이들 연구에 따르면 종양괴사인자는 젤리-롤 토폴로지(jelly-roll topology)를 갖는 기다란 반-평행 베타 사이트 샌드위치구조를 갖고 있으며 3중 대칭(3-fold symmetry)을 갖는 삼합체로 존재한다. 성숙한 사람종양괴사인자는 프로호르몬의 아미노말단에서 76개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 절단한 후 비로소 분비된다. 성숙 단백질은 분자내 다이설파이드 결합을 1개 갖고 있다(Aggarwal, B.B. et al., J. Biol. Chem.2345-2354 (1985). 분석 초원심분리(Wingfield, P. et al., FEBS Lett.179-184(1987)), 크로스-링킹(Smith, R.A Bablioni, C.J., J. Biol. Chem.6951-6954(1987)), 소각(small angle ) 엑스선 산란법(Lewit-Bentley, A. et al., J. Mol. Biol.389-392 (1988)), 그 리고 겔-전기 영동 연구(Eck. M.J. et al., J.Biol. Chem.12816-12819(1988))는 종양괴사인자가 용액내에서 삼합체로 존재함을 보여준다.
암환자를 대상으로 한 임상실험에서는 만족할만한 항암효과를 거두지 못했는데, 이는 주로 종양괴사인자의 부작용 때문에 항암효과를 나타낼 수 있는 적정양을 투여할 수 없기 때문으로 여겨지고 있다. 따라서 단백질 변이를 통해 천연형(wild type) 종양괴사인자보다 증가된 항암효과와 감소된 부작용을 지닌 종양괴사인자 뮤테인들을 만들려는 시도가 있어 왔다. 이러한 시도는 주로 종양괴사인자의 아미노말단에서 몇 개의 아미노산을 제거하거나 또는 무작위 변이유발을 통해 새로운 종양괴사인자 뮤테인들을 만드는 작업이었다. 이제까지 제조된 가장 우수한 뮤테인들은 천연형(wild type) 종양괴사인자에 비해 7배의 세포독성 효과를 나타낸다고 보고되었다(Nakamura, S. et al., Int. J. Cancer744-748(1991)).
상기와 유사한 종양괴사인자와 뮤테인들에 대한 연구결과가 여러 문헌들과 특허들에 발표되었다(Green et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.381(1976) ; Mat tews et al., Br. J. Cancer416(1980) ; Ruff et al., J. Immunol.1671(1980 ) ; Mannel et al., Infect. Immunity204(1980) ; Haranaka et al. Japan. J. Exp. Med.191(1981) ; European Patent Publication No. 90892 ; European Patent Publication No. 86475 ; Japanese Patent Publication No. 21621/1983 ; Europea n Patent Application(1985) No. 155 549 ; 및 European Patent Application(198 5) No. 168 214).
최근의 엑스선 결정법에 의한 사람종양괴사인자의 3차 구조 결정(Eck. M.J. Sprang, S.R., J. Biol. Chem.17595-17605(1989))과 변이연구(Ostade, X.V. et al., EMBO J.827-836(1991))는, 종양괴사인자의 수용체와의 결합부위가 종양괴사인자 삼합체의 바닥에 위치하고 있을 가능성을 강력히 시사하고 있다. 따라서 본 발명에서는, 종양괴사인자의 3차 구조와 컴퓨터를 이용한 단백질 분자 모델링을 통해; 종양괴사인자의 수용체와의 가능한 모든 결합부위를 선정, 체계적인 변이실험을 통해 뮤테인들을 제조하였다. 좀더 상세히 설명하면 종양괴사인자 삼합체의 바닥을 구성하는 6개의 영역(region)들, 영역-1(아미노산 서열 1번부터 10번까지), 영역-2(아미노산 서열 37번부터 41번까지), 영역-3(아미노산 서열 52번부터 56번까지), 영역-4(아미노산 서열 84번부터 88번까지), 영역-5(이마노산 서열 126번부터 130번까지), 영역-6(아미노산 서열 156번과 157번)등을 소수성 아미노산(hydrophobic amino acid), 양전하를 띤 아미노산, 또는 음전하를 띤 아미노산들로 치환하여 수용체와의 결합력에 변화를 주도록 유도하였다.
이러한 접근법에 따라 만들어진 종양괴사인자 뮤테인들은, 상당수가 천연형 종양괴사인자와 기존의 뮤테인들에 비해 높은 세포독성 효과를 보였다.
본 발명은 천연형 종양괴사인자-알파 혹은 기존의 뮤테인들에 비해 세포독성이 보다 증가된 종양괴사인자 뮤테인에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 아래 서열표[1]의 아미노산 서열에서 다음 1) 내지 26)의 치환을 하나 이상 포함하고, 아미노 말단으루부터 1 내지 7개, 바람직하게는 3 내지 7개의 아미노산 절단된 폴리펩타이드의 제조 및 정제에 관한 것이다.
1) 위치 4의 세린의 아르지닌으로의 치환 ;
2) 위치 5의 세린의 아르지닌으로의 치환 ;
3) 위치 6의 아르지닌의 알라닌으로의 치환 ;
4) 위치 7의 트레오닌의 히스티딘 또는 라이신으로의 치환;
5) 위치 8의 프롤린의 아르지닌으로의 치환 ;
6) 위치 10의 아스파라진산의 아르지닌으로의 치환 ;
7) 위치 38의 알라닌의 아스파라진으로의 치환 ;
8) 위치 39의 아스파라진의 아스파라진산, 라이신, 또는 발린으로의 치환 ;
9) 위치 40의 글라이신의 아스파라진산, 라이신, 또는 발린으로의 치환 ;
10) 위치 41의 발린의 세린으로의 치환 ;
11) 위치 52의 세린의 아이소류신으로의 치환 ;
12) 위치 53의 클루타민산의 라이신, 또는 로이신으로의 치환 ;
13) 위치 54의 클라이신의 아스파라진산으로의 치환 ;
14) 위치 56의 타이로신의 글루타민산으로의 치환 ;
15) 위치 85의 발린의 글루타민산, 또는 아르지닌으로의 치환 ;
16) 위치 86의 세린의 로이신, 라이신, 글루타민산, 또는 아스파라진산으로의 치환 ;
17) 위치 87의 타이로신의 글루타민산, 또는 아르지닌으로의 치환 ;
18) 위치 88의 글루타민의 글루타민산으로의 치환 ;
19) 위치 127의 글루타민산의 알라닌, 발린, 또는 라이신으로의 치환 ;
20) 위치 128의 라이신의 알라닌, 발린, 또는 글루타민산으로의 치환 ;
21) 위치 129의 글라이신의 글루타민산, 라이신, 또는 발린으로의 치환 ;
22) 위치 156의 알라닌의 아스파라진산으로의 치환 ;
23) 위치 157의 로이신의 페닐알라닌으로의 치환 ;
24) 위치 8의 프롤린의 아르지닌으로, 위치 9의 세린의 라이신으로, 위치 10의 아스파라진의 아르지닌으로 및 위치 157의 로이신의 페닐알라닌으로의 치환 ;
25) 위치 52의 세린의 아이소류신으로 및 위치 56의 타이로신의 페닐알라닌으로의 치환 ; 및
26) 위치 52의 세린의 아이소류신으로, 위치 56의 타이로신의 페닐알라닌으로, 위치 156의 알라닌의 아스파라진산으로 및 위치 157의 로이신의 페닐알라닌으로의 치환.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드 뮤테인들을 코우딩하는 DNA 염기 서열에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 염기 서열은 다음과 같다.
특히 본 발명은 아래의 치환중 하나 이상의 치환이 이루어진 염기 서열에 관한 것이다.
4번째 세린의 코돈인 TCT가 아르지닌의 코돈인 CGT로 치환
5번째 세린의 코돈인 TCT가 아르지닌의 코돈인 CGT로 치환
6번째 아르지닌의 코돈인 CGA가 알라닌의 코돈인 GCT로 치환
7번째 트레오닌의 코돈인 ACC가 히스티딘의 코돈인 CAT 또는 CAC로 치환
8번째 프롤린의 코돈인 CCG가 아르지닌의 코돈인 CGG로 치환
9번째 세린의 코돈인 AGT가 라이신의 코돈인 AAA로 치환
10번째 아스파라진산의 코돈인 GAC가 아르지닌의 코돈인 CGC로 치환
38번째 알라닌의 코돈인 GCC가 아스파라진산의 코돈인 GAC로 치환
39번째 아스파라진의 코돈인 AAT가 아스파라진산의 코돈인 GAT, 라이신의 코돈인 AAG, 또는 발린의 코돈인 GGT로 치환
40번째 글라이신의 코돈인 GGC가 아스파라진산의 코돈인 GAT, 라이신의 코돈인 AAA, 또는 발린의 코돈인 GTA로 치환
41번째 발린의 코돈인 GTG가 세린의 코돈인 TCC로 치환
52번째 세린의 코돈인 TCA가 이소로이신의 코돈인 ATA, 글루타민산의 코돈인 GAA, 또는 라이신의 코돈인 AAA로 치환
53번째 글루타민산의 코돈인 GAG가 라이신의 코돈인 AAG 또는 로이신의 코돈인 CTG로 치환
54번째 글라이신의 코돈인 GGC가 아스파라진산의 코돈인 GAC 또는 발린의 코돈인 GTC로 치환
56번째 타이로신의 코돈인 TAC가 페닐알라닌의 코돈인 TTC 또는 글루타민산의 코돈인 GAA로 치환
85번째 발린의 코돈인 GTG가 글루타민산의 코돈인 GAG 또는 아르지닌의 코돈인 CGT로 치환
86번째 세린의 코돈인 TCC가 로이신의 코돈인 TTG, 글루타민산의 코돈인 GAG, 라이신의 코돈인 AAA 또는 아스파라진산의 코돈인 GAC로 치환
87번째 타이로신의 코돈인 TAC가 글루타미산의 코돈인 GAA, 또는 아르지닌의 코돈인 CGT로 치환
88번째 글루타민의 코돈인 CAG가 글루타민산의 코돈인 GAG로 치환
127번째 글루타민산의 코돈인 GAG가 알라닌의 코돈인 GCT, 라이신의 코돈인 AAG 또는 발린의 코돈인 GTT로 치환
128번째 라이신의 코돈인 AAG가 알라닌의 코돈인 GCT, 발린의 코돈인 GTT, 또는 글루타민산의 코돈인 GAG로 치환
129번째 글라이신의 코돈인 GGT가 글루타민산의 코돈인 GAA, 라이신의 코돈인 AAG 또는 발린의 코돈인 GTC로 치환
156번째 알라닌의 코돈인 GCC가 아스파라진산의 코돈인 GAC로 치환
157번째 로이신의 코돈인 CTG가 페닐알라닌의 코돈인 TTC로 치환
본 발명의 사람종양괴사인자 뮤테인들을 코우딩하는 DNA는, 변형하고자 하는 부분을, DNA 합성기를 이용하여 화학적으로 합성한 후 사람종양괴사인자 cDNA를 주형(template)으로 삼아 중합요소 연쇄반응(Saiki, R.K. et al., Science1350-1354(1985))을 통해 만들 수 있다.
예를 들어 식[1]에서 8,9,10번째 아미노산들(프로린, 세린, 아스파라진산)이 아르지닌, 라이신, 아르지닌으로 각각 치환되고 아미노 말단에서 7개의 아미노산이 제거된 종양괴사인자 뮤테인을 코우딩하는 DNA는 다음과 같은 방법으로 만들 수 있다.
U937 세포주(Clontech에서 구입)로부터 만들어진 사람 단핵 세포 cDNA 라이브러리로부터 중합효소 연쇄반응을 이용하여 종양괴사인자-알파의 DNA를 준비한다. 5'말단에 제한효소 부위와 변형된 염기 서열을 포함하는 센스 프라이머와 5' 말단에 제한효소 부위를 갖는 안티센스 프라이머를 화학적으로 합성한 후 종양괴사인자-알파의 DNA를 주형으로 삼아 중합효소 연쇄반응을 통해 종양괴사인자 뮤테인의 DNA를 만든다.
준비된 DNA를 적당한 발현 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 적당한 숙주에 도입하여 만들어진 형질전환체를 배양하여 종양괴사인자 뮤테인을 생산할 수 있다.
좀더 상세히 설명하면 종양괴사인자 뮤테인 DNA를등의 적당한 프로모터를 갖는 발현 백터에 직접 삽입하거나, 또는 이들 프로모터와 리보좀 결합부위를 갖는 DNA를 종양괴사인자 뮤테인 DNA와 결합시킨 후 pBR322와 같은 플라스미드에 삽입하여 발현 벡터 시스템을 구축할 수 있다. 본 발명의 종양괴사인자 뮤테인을 생산하기 위한 발현 벡터를 적당한 숙주, 예를 들어 이. 콜라이(E.coli)에 코헨등(Cohen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA2110(1972))의 방법에 의해 도입하여 형질전환체를 만든다. 다음에, 형질전환체를 적당한 배양조건에서 배양하여 아미노 말단에 메티오닌이 결합된 종양괴사인자 뮤테인을 생산할 수 있다. 배양된 세포들은 라이소자임 소화, 동결융해, 초음파 파쇄, 또는 프렌치 프레스(French press)등으로 처리한 후, 원심분리나 여과를 통해 종양괴사인자 뮤테인을 함유하는 추출물을 얻는다. 원하는 종양괴사인자 뮤테인은 추출물을 초여과, 투석, 이온교환크로마토그래피, 겔여과, 전기영동 그리고 친화성 크로마토그래피 등의 일반적인 정제방법을 통해 분리해낼 수 있다. 정제된 종양괴사인자 뮤테인들은 브래드포드 단백질 정량방법(Bradford, M., Anal. Biochem.248(1976))등에 의해 정량할 수 있다.
생체외세포독성 역가검정은 종양괴사인자에 민감한 셈유아세포 L-929 세포주(ATCC CCL1)를 가지고 수행하였다(Ruff, M.R. Gifford, G.E. : Lymphokines(ed. Edgar Pick), Vol. 2, 235-272, Academic press, New York). 실험방법은 다음과 같다. L-929 세포를 96웰(well)마이크로플레이트(microplate)에 웰당 150(3~4×104세포)씩 넣는다. 세포들을 다 넣은 후 잘 흔들어서 37℃, 5% CO2항온기에서 24시간 동안 항온 배양시킨다. 마이크로플레이트의 배양액을 재거한 후 웰당 100씩의 새 배양액 (㎖당 2㎍의 액티노마이신 포함)을 세포가 떨어지지 않도록 조심하여 넣는다. 다른 마이크로플레이트에 2배씩 순차적으로 희석시킨 종양괴사인자 시료를 준비하여 자외선으로 30분간 처리한 후 100씩 세포를 넣은 마이크로플레이트에 옮긴다. 마이크로플레이트를 37℃, 5% CO2항온기에서 18시간 동안 항온배양시킨다. 크리스탈 바이올렛 용액에서 15~20분간 염색한다. 물로 잘 씻은 후 플레이트를 말린다. 540nm에서 마이크로플레이트의 흡광도를 측정한다.
1단위의 종양괴사인자 역가는 50%의 세포괴사에 필요한 양으로 정의한다.
모든 실험에서 단백질 함량은 브래드포드방법으로 측정한다. 크리스탈 바이올렛 용액의 조성은 다음과 같다.
크리스탈 바이올렛 0.5g
에탄올 112㎖
포르말린 101㎖(CaCO3로 포화된 것)
증류수 786㎖
종양괴사인자 또는 종양괴사인자 뮤테인들은 보통 생리적으로 투여 가능한 담체(carrier), 예를들면 물, 완충용액, 링거액(Ringer's solution), 덱스트로스 용액(dextrose solution) 또는 5% 혈청 알부민 등에 섞어 투여하도록 한다. 이 경우 운반체에 아스코르빈산과 같은 항산화제, 낮은 분자량의 폴리펩타이드, 단백질, 아미노산, 포도당 또는 덱스트린과 같은 탄수화물 등을 섞어 투여할 수 있다. 투여는 보통 정맥주사 또는 피하주사를 이용하되 암에 직접 국부투여도 가능하다.
종양괴사인자 또는 종양괴사인자 뮤테인들은 액티노마이신-D, 아드리아마이신 등과 같은 다른 항암제, 감마 글로불린 등과 같은 면역 반응 촉진제, 또는 인터페론 등과 함께 투여할 수 있다. 감마 인터페론과 섞어 투여하는 경우 단위역가대비 0.1 : 1에서 200 : 1(종양괴사인자 : 인터페론)의 비율로 섞어 사용하도록 한다. 종양괴사인자 또는 종양괴사인자 뮤테인들을 투여하는 경우 5-20μg/kg/일의 용량으로 투여가능하다.
실시예 1
사람종양괴사인자의 제조
(1-A) : 사람종양괴사인자 cDNA를 포함하는 플라스미드의 구축
(단계 1) pGHH-TNF 플라스미드의 조립
U937 세포주로부터 만들어진 사람 단핵세포 cDNA 라이브러리를 주형으로 이용하여 중합효소 연쇄반응에 의해 종양괴사인자-알파를 코딩하는 DNA를 준비하였다. 사용한 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다.
만들어진 PCR 산물을 Nco I과 BamH Ⅰ으로 각각 처리하여 5' 말단에 Nco I 제한효소 부위와 3' 말단에 BamH I 제한효소 부위를 갖는 접착말단의 이중가닥 DNA를 준비하였다. 발현 벡터 시스템은 T7 발현 시스템을 갖고 있는 pGEMEX-1(Promega에서 구입)을 이용하였다. pGEMEX-1 벡터는 260개의 아미노산을 포함하는 T7 유전자 10 융합(T7 gene 10 fusion)단백질로 발현되므로 융합 단백질로 발현되는 것을 막기 위해 새로운 제한효소 부위인 NcoⅠ부위를 만들었다. pGEMEX-1 벡터를 BamH I으로 절단하였다.선형으로 된 플라스미드를 다시 Bg1II로 절단하였다.
한편, BamH I으로 절단하여 선형으로 된 플라스미드를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응에 의해 5' 말단에 Nco I제한효소 부위와 3'말단에 Bg1 II 제한효소 부위가 있는 T7 프로모터를 포함하는 아래의 서열의 PCR산물을 만들었다. 아래 밑줄친 부분이 T7 프로모터 영역이다.
이때 사용한 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다.
PCR 산물을 Bg1 II와 NcoⅠ제한효소로 처리한 후 위에서 준비된 종양괴사인자 DNA에 T4 DNA 리가제로 연결하였다. 위에서 만들어진 종양괴사인자 DNA를 포함하는 DNA 절편을 T4 DNA 리가제를 이용하여, BamH I 와 Bg1 II로 절단한 pGEM EX-1 벡터에 삽입하였다(발현 플라스미드 pGHH-TNF). 이 과정을 제1도에 나타내었다.
(단계 2) pT7-TNF 플라스미드의 조립
사람 단핵세포 cDNA 라이브러리로부터 중합효소 연쇄반응을 이용하여 종양괴사인자-알파의 DNA를 준비하였다.
프라이머의 염기 서열은 다음과 같다.
만들어진 PCR 산물을 Nde I 과 BamH I으로 각각 처리하여 5' 말단에 Nde I 제한효소 부위와 3' 말단에 BamH I 제한효소 부위를 갖는 DNA를 준비하였다. 발현 벡터 시스템은 T7 발현 시스템을 갖고 있고 변형을 통해 T7 유전자 10 융합 영역을 제거한 pT7-7(Stanley Tabor Charles C. Richardson, ABacteriophage T7 RNA Poly merase/Promoter System For Controlled Exclusive Expression of Specific Genes, P.N.A.S., vol. 82, 1074-1078(1985), 하바드 위과대학 생물화학과에서 입수가능함)을 이용하였다.
pT7-7 벡터를 BamHⅠ으로 소화시켜 절단한 후 다시 NdeⅠ으로 절단시켰다. 상기 두 제한효소에 의해 절단된 벡터와 위에서 만들어진 종양괴사인자 DNA를 T4 DNA 리가제로 연결하였다(발현 플라스미드 pT7-TNF). 이 과정을 제2도에 나타내었다.
(1-B) : 사람종양괴사인자의 생산
발현 플라스미드 pGHH-TNF 및 pT7-TNF로JM109을 하나한이 기술한 방법에 의해 각각 형질전환시켰다(Hanahan, D., DNA Cloning vol.1(Ed. D.M. Glover), 109-135, IRS Press(1985)). 형질전환후 고체 배지에 생기는, 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하여 1㎖의 LB 배지(LB/ampicillin)에 접종 하였다. 37℃에서 12시간 배양한 후 8000×g에서 2분간 원심분리하여 상층액을 버리고펠렛에 대하여 알칼리 용해 방법을 사용하여 플라스미드를 분리 및 정제하였다. 플라스미드를 50TE(pH 8.0)에 녹인 후, 0.1의 플라스미드 용액을 취하여 2의 10×원-포랄(One-phor-all) 완충액(100mM 트리스-아세테이트, 100mM 아세트산 마그네슘, 500mM 아세트산 칼륨), 1단위의 Nco Ⅰ, 5단위의 BamHⅠ(pGHH-TNF 플라스미드의 경우) 또는 1단위의 NdeⅠ, 5단위의 BamHⅠ(pT7-TNF 플라스미드의 경우) 등과 섞은 후 증류수를 첨가하여 총 용액의 부피를 10가 되도록 맞추었다. 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 1%아가로스 젤 전기영동으로 DNA 절편의 삽입을 확인하였다. DNA 절편이 삽입된 것이 확인된 플라스미드를 발현 균주인JM109(DE3)에 앞서서 동일한 방법으로 형질전환 한 후 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다. pGHH-TNF로 형질전환된 및 pT7-TNF로 형질전환된JM109(D E3)JM109(DE3)을 1993년 1월 28일자로 한국 미생물보존센터에 기탁하였다(JM109(DE3+pGHH-TNF) : 기탁번호 KCCM-10021;JM109( DE3+pT7-TNF) : 기탁번호 KCCM-10020).
(1-C) : 사람종양괴사인자의 정제
상기 (1-B)에서 선별한 콜로니중 pGHH-TNF와 pT7-TNF로 형질전환된 콜로니를 각각 하나씩 1㎖ LB 배지에 접종한 후 12시간 이상 배양하였다. 50㎖의 LB 배지(앰피실린 포함)로 옮기고 600nm에서 흡광도가 0.1~0.4일 때 1PTG(isopropyl thio galactopyranoside)를 최종농도가 1mM 되도록 넣었다. 37℃에서 4시간 동안 200rpm 속도로 진탕한 후 8000×g에서 2분간 원심분리하여펠렛을 얻었다. 이 펠렛을 5㎖의 10mM 인산 나트륨(pH 7.4) 완충액에 현탁시킨 후 초음파 처리방법으로 세포를 파쇄하였다.
초음파처리를 통해 파쇄된 세포 용해액을 4℃에서 15000×g로 30분 동안 원심분리하였다. 상층액만을 모아 브래드포드 단백질 정량방법으로 정량하여 10mg/㎖의 농도로 희석시켰다. 이 용액을 파마시아(Pharmacia) FPLC 시스템과 모노-Q 5/5 음이온 교환수지 컬럼을 이용하여 정제하였다. 이때 정제 조건은 10mM의 인산 나트륨(pH 7.4) 용액 A와 0.5M 농도의 NaCL을 포함하는 10mM의 인산 나트륨 용액 B를 1㎖/분의 속도로 0% B에서 100% B까지 구배로 흘려주어 용출시킨 후 약 17KD 크기의 TNF 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 이때 얻은 TNF의 양은 각각 0.7~0.8mg이었으며 순도는 95% 이상이었다.
실시예 2
사람종양괴사인자 뮤테인의 제조
(2-A) : 사람종양괴사인자 뮤테인 cDNA를 포함하는 플라스미드의 구축
(단계 1) pGHH-TNF 뮤테인 플라스미드의 조립
pGHH-TNFR2-1 뮤테인 플라스미드의 조립
pGHH-TNF 플라스미드를 NcoⅠ으로 소화시킨 후 선형으로 된 플라스미드를 HindIII로 소화시켰다. 만들어진 종양괴사인자 DNA를 주형으로 이용하여 종양괴사인자 아미노산 서열의 내부에 치환을 이루려는 부분을 포함하는 프라이머를 이용하여 변형위치를 포함, 5'-말단쪽의 DNA 절편과 3' 말단쪽의 DNA 절편을 각각 중합효소 연쇄반응으로 준비한 후 두 DNA 절편을 섞어 어닐링(annealing)과 확장(extension)을 통해 뮤테인 DNA를 만들었다. 이때 사용한 프라이머는 다음과 같다.
다음에 5' 말단에 Nco I 제한효소 부위와 3' 말단에 Hind III 제한효소 부위를 갖도록 아래의 프라이머(P 1)를 이용, 중합효소 연쇄반응을 통해 뮤테인 DNA를 증폭하였다.
만들어진 PCR 산물을 Nco I 과 Hind III로 각각 처리하여 5' 말단에 Nco I 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖는 DNA를 준비하였다. pGHH-TNF 플라스미드를 NcoⅠ과 HindIII로 소화시켜 준비한 벡터에 앞에서 만들어진 종양괴사인자 뮤테인의 DNA를 T4 DNA 리가제로 연결하였다.
상기 기술한 방법을 이용하여 다른 뮤테인들을 코우딩하는 플라스미드를 준비하였다. 이때 사용한 프라이머들은 다음과 같다. 뮤테인 DNA의 증폭시 앞서 사용한 프라이머(P1)를 이용하였다.
(단계 2) pT7-TNF 뮤테인 플라스미드의 조립
pT7-TNFR1-1 내지 R1-6 뮤테인 플라스미드의 조립
pT7-TNF 플라스미드를 Nde I으로 소화시킨 후 선형으로 된 플라스미드를 HindⅢ로 소화시켰다. 만들어진 종양괴사인자 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소연쇄반응을 이용하여 pT7-TNFR1-1 뮤테인 DNA를 증폭하였다. 사용한 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다.
만들어진 PCR 산물을 Nde I과 HindⅢ로 각각 처리하여 5' 말단에 Nde I제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII로 소화시켜 준비한 벡터에 앞에서 만들어진 종양괴사인자 R1-1 뮤테인 DNA를 T4 DNA 리가제로 연결하였다.
상기 기술한 방법을 이용하여 다른 R1 뮤테인들을 코우딩하는 플라스미드들을 준비하였다. 이때 사용한 프라이머들은 다음과 같다.
pT7-TNFM1 내지 M2 뮤테인 플라스미드의 조립
pT7-TNF 플라스미드를 Nde I으로 소화시킨 후 선형으로 된 플라스미드를 HindIII로 소화시켰다. 만들어진 종양괴사인자 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응을 이용하여 pT7-TNFM1 뮤테인 DNA를 증폭하였다. 사용한 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다.
만들어진 PCR 산물을 Nde I 과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 Nde I 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖는 DNA를 준비하였다. pT7-TNF를 NdeⅠ과 HindIII로 소화시켜 준비한 벡터에 앞에서 만들어진 종양괴사인자 M1 뮤테인 DNA를 T4 DNA 리가제로 연결하였다. pT7-TNF M2 뮤테인 플라스미드도 상기와 같은 방법으로 준비하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다.
pT7-TNF M3 뮤테인 플라스미드의 조립
pT7-TNF 플라스미드를 Nde I으로 소화시킨 후 선형으로된 플라스미드를 HindIII로 소화시켰다. 만들어진 종양괴사인자 DNA를 주형으로 이용하여 종양괴사인자 아미노산 서열의 내부에 치환을 이루려는 부분을 포함하는 프라이머를 이용하여 변형위치를 포함, 5' 말단쪽의 DNA 절편과 3' 말단쪽의 DNA 절편을 각각 중합효소 연쇄반응으로 준비한 후 두 DNA 절편을 섞어 어닐링(annealing)과 확장(extension)을 통해 뮤테인 DNA를 만들었다. 이 때 사용한 프라이머는 다음과 같다.
다음에 5' 말단에 Nde I 제한효소 부위와 치환시킬 아미노산들의 염기 서열을 갖는 프라이머와 5' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖는 다음의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 뮤테인 DNA를 증폭하였다.
만들어진 PCR 산물을 Nde I 과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 Nde I 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII로 소화시켜 준비한 벡터에 앞에서 만들어진 종양괴사인자 뮤테인의 DNA를 T4 DNA 리가제로 연결하였다.
상기 기술한 방법을 이용하여 M4, M5, M6 뮤테인들을 코우딩하는 플라스미드를 준비하였다. 이대 하기 각 1)항의 프라이머들을 사용했으며 뮤테인 DNA의 증폭시에는 각 2)항의 프라이머들을 이용하였다.
pT7-TNFR 뮤테인 플라스미드의 조립
상기 기술한 pT7-TNFR1 뮤테인 플라스미드를 제외한 나머지 R2부터 R5까지의 뮤테인 플라스미드의 조립은 다음과 같이 실시하였다.
pT7-TNF 플라스미드를 Nde I으로 소화시킨 후 선형으로된 플라스미드를 HindIII로 소화시켰다. 만들어진 종양괴사인자 DNA를 주형으로 이용하여 종양괴사인자 아미노산 서열의 내부에 치환을 하려는 부분을 포함하는 프라이머를 이용하여 변형위치를 포함, 5' 말단쪽의 DNA 절편과 3' 말단쪽의 DNA 절편을 각각 중합효소 연쇄반응으로 준비한 후 두 DNA 절편을 섞어 어닐링(annealing)과 확장(extension)을 통해 뮤테인 DNA를 만들었다. 이 때 사용한 프라이머는 다음과 같다.
다음에 5' 말단에 Nde I 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 아래의 프라이머(P2)를 이용, 중합효소 연쇄반응을 통해 뮤테인 DNA를 증폭하였다.
만들어진 PCR 산물을 Nde I과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 Nde I 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖는 DNA를 준비하였다. pT7-TNF 플라스미드를 Nde I과 HindIII로 소화시켜 준비한 벡터에 앞에서 만들어진 종양괴사인자 뮤테인의 DNA를 T4 DNA 리가제로 연결하였다. 다른 pT7-TNFR 뮤테인 플라스미드들도 상기에서와같은 방법을 이용하여 준비하였다. 사용된 프라이머들은 다음과 같다.
(2-B) ; 사람종양괴사인자 뮤테인의 생산 및 정제
종양괴사인자 뮤테인의 발현 플라스미드 각각으로 실시예(1-B)에서와 동일한 방법으로JM109(DE3)을 형질전환시켜, 엠피실린에 저항성이 있는 배지에서 생기는 콜로니를 선별하고 이 콜로니를 50㎖의 배지에 배양한 후 원심분리 과정을 통해 E. coli 펠렛을 얻었다. 초음파 처리방법으로 세포를 파쇄한 후 실시예(1-C)에서와 동일한 방법으로 정제하여 각각 약 17KD 크기의 TNF를 얻었다. 이때 얻은 사람 종양괴사인자 뮤테인의 양은 뮤테인에 따라 그 차이가 매우 심했으며 뮤테인에 따라 약 70-80㎍ 내지 1mg을 얻을 수 있었다.
C. 세포독성역가검정
만들어진 종양괴사인자 뮤테인들의 세포독성 역가검정은 종양괴사인자에 민감한 쥐 섬유아세포인 L929 세포주를 가지고 상기한 바와 같은 방법으로 수행하였다. 결과는 표2에 요약되어 있다.

Claims (9)

  1. 하기 서열표[1]의 아미노산 서열에서 다음 1) 내지 26)의 치환을 하나 이상 포함하고, 아미노 말단으로부터 1 내지 7개의 아미노산이 절단된 폴리펩타이드.
    1) 위치 4의 세린의 아르지닌으로의 치환 ;
    2) 위치 5의 세린의 아르지닌으로의 치환 ;
    3) 위치 6의 아르지닌을 알라닌으로의 치환 ;
    4) 위치 7의 트레오닌의 히스티딘 또는 라이신으로의 치환;
    5) 위치 8의 프롤린의 아르지닌으로의 치환 ;
    6) 위치 10의 아스파라진산의 아르지닌으로의 치환 ;
    7) 위치 38의 알라닌의 아스파라진으로의 치환 ;
    8) 위치 39의 아스파라진의 아스파라진산, 라이신, 또는 발린으로의 치환 ;
    9) 위치 40의 글라이신의 아스파라진산, 라이신, 또는 발린으로의 치환 ;
    10) 위치 41의 발린의 세린으로의 치환 ;
    11) 위치 52의 세린의 아이소류신으로의 치환 ;
    12) 위치 53의 글루타민산의 라이신 또는 로이신으로의 치환 ;
    13) 위치 54의 클라이신의 아스파라진산으로의 치환 ;
    14) 위치 56의 타이로신의 글루타민산으로의 치환 ;
    15) 위치 85의 발린의 글루타민산, 또는 아르지닌으로의 치환 ;
    16) 위치 86의 세린의 로이신, 라이신, 글루타민산, 또는 아스파라진산으로의 치환 ;
    17) 위치 87의 타이로신의 글루타민산 또는 아르지닌으로의 치환 ;
    18) 위치 88의 글루타민의 글루타민산으로의 치환 ;
    19) 위치 127의 글루타민산의 알라닌, 발린 또는 라이신으로의 치환 ;
    20) 위치 128의 라이신의 알라닌, 발린, 또는 글루타민산으로의 치환 ;
    21) 위치 129의 글라이신의 글루타민산, 라이신 또는 발린으로의 치환 ;
    22) 위치 156의 알라닌의 아스파라진산으로의 치환 ;
    23) 위치 157의 로이신의 페닐알라닌으로의 치환 ;
    24) 위치 8의 프롤린의 아르지닌으로, 위치 9의 세린의 라이신으로, 위치 10의 아스파라진의 아르지닌으로 및 위치 157의 로이신의 페닐알라닌으로의 치환 ;
    25) 위치 52의 세린의 아이소류신으로 및 위치 56의 타이로신의 페닐알라닌으로의 치환 ; 및
    26) 위치 52의 세린의 아이소류신으로, 위치 56의 타이로신의 페닐알라닌으로, 위치 156의 알라닌의 아스파라진산으로 및 위치 157의 로이신의 페닐알라닌으로의 치환.
  2. 제1항에 있어서, 상기 1)의 위치 4의 세린의 아르지닌으로의 치환 및 상기 2)의 위치 5의 세린의 아르지닌으로의 치환을 포함하고 아미노 말단으로부터 3개의 아미노산이 절단된 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 24)의 위치 8의 프롤린의 아르지닌으로, 위치 9의 세린의 라이신으로, 위치 10의 아스파라진의 아르지닌으로 및 위치 157의 로이신의 페닐알라닌으로의 치환을 포함하고 아미노 말단으로부터 7개의 아미노산이 절단된 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 25)의 위치 52의 세린의 아이소류신으로 및 위치 56의 타이로신의 페닐알라닌으로의 치환을 포함하고 아미노 말단으로부터 7개의 아미노산이 절단된 폴리펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 26)의 위치 52의 세린의 아이소류신으로, 위치 56의 타이로신의 페닐알라닌으로, 위치 156의 알라닌의 아스파라진산으로 및 위치 157의 로이신의 페닐알라닌으로의 치환을 포함하고 아미노말단으로부터 7개의 아미노산이 절단된 폴리펩타이드.
  6. 제1항 및 제2항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서,메티오닌이 아미노산 서열의 아미노 말단에 부가된 폴리펩타이드.
  7. 제1항 및 제2항 내지 제6항중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 염기서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 그 배양물로부터 폴리펩타이드를 분리하여 제1항 및 제2항 내지 제6항중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
  8. 제1항 및 제2항 내지 제6항중 어느 한 항의 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 항암제 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 제7항의 방법에 의해 제조된 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 항암제 조성물.
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