JPH03277284A - 遺伝子及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は遺伝子工学に関し、特にＭ−ＣＳＦ活性を有す
るポリペプチドをコードする遺伝子（ＤＮＡ）及びその
製造に関する。

本発明は、さらにこうして得られた遺伝子を利用しての
Ｍ−ＣＳＦ活性を有するタンパク賞及びその製造法に間
する。

さらにまた、本発明はヒト尿由来！１２Ｍ−ＣＳＦ遺伝
子配列と動物細胞で機能するプロモーター配列および増
幅可能な遺伝子のＤＮＡ配列を含むＭ−ＣＳＦ発現ベク
ター、該Ｍ−ＣＳＦ発現ベクターによる動物細胞の形質
転換体を利用したヒト尿由来！！ｆ！Ｍ−ＣＳＦの製造
方法及びこうして得られた生産物に間する。

本発明はまた太陽薗等の微生物を利用して効率的に天然
のヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦ′１ｔｌｌ造する方法、特に
はそのＭ−ＣＳＦのカルボキシル末端を有するポリペプ
チドの遺伝子工学的製造法にも関する。

Ｍ−ＣＳＦは抗癌剤投与や放射線照射による白血球減少
の回復促進剤、あるいは種々の感染症の治療剤、抗腫瘍
剤、骨髄移植後の白血球増加剤また高コレステロール症
治療薬、動脈硬化治療薬として医薬への応用の他、白血
球減少症、再生不良性貧血等の診断剤としての用途が期
待される物質である（Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉ、　Ｋ、　ｅ
ｔ　ａｔ、：　Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　２１１８
７　（１９Ｂ２））。

（従来の技術） ＣＳＦは、哺乳動物の骨髄白血球＊Ｗ細胞に作用して、
このＩＩＷｌｌを顆粒球又はマクロファージへ分化増殖
させる物質といわれている。ＣＳＦは、ｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏで骨髄細胞を培養するときに、骨髄白血球前駆細胞が
分化及び増殖してコロニーを形成するために必須な因子
であり、この物質が存在すると骨髄白血球前駆細胞は分
化増殖して、より成熟した細胞の集落（コロニー）を形
成する（Ｐｌｕｚｎｉｋ、　Ｄ、Ｈ，ｌ　５ａｃｈｓ、
　Ｈ，：　Ｊ。

Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　ｆＬｆＬ３１９　（
１９６５）、Ｂｒａｄｌｅｙ、　Ｔ、Ｒ。

ｌ　　Ｍｅｔｃａｌｆ、　Ｄ、：＾ｕｓｔ、　Ｊ、　Ｅ
ｘｐ＋　Ｂ＋ｏ１．　Ｍｅｄ、、　１ｉ２８７（１９６
６）”）。

ＣＳＦは種々の動物細胞や組織が産生ずる糖蛋白買であ
り、Ｉｎ　ｖｌｔｒｏの機能、即ち半個形培地中で骨髄
白血球前駆細胞から分化及び増殖したコロニーの形態に
よって４種に分類されている。即ち、顆粒球コロニー刺
激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、単球−マクロファージコロニー
刺激因子（Ｍ−ＣＳＦまたはＣＳＦ−１）、顆粒球、マ
クロファージまたは両者の混合コロニーを生じさせる顆
粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ
）　、及びより未分化な骨髄白血球前駆細胞に作用する
マルチＣＳＦ　（ＩＬ−３）である。

従来、報告されているヒト由来単球−マクロファージコ
ロニー刺激因子の起源としては、ヒト尿（Ｄａｓ、　Ｓ
、に、＆５ｔａｎｌｅｙ、　　Ｅ、Ｒ，：　　Ｊ、　　
Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｗ、、　　二Ｌ」Σニアー　　　
１３６７９（１９Ｂ２））　　及び、膵蕨癌株化細胞Ｍ
　Ｉ　Ａ　−Ｐ　ａ　Ｃａ　−２の培養上清（Ｓｈｉｅ
ｎ、　Ｊ、Ｈ，ｅｔ　ａｔ、：　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｓ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　ｚ１旦２０５　（１９８７）　）
からのものが知られている。

また最近遺伝子りａ−ニング技術により、その遺伝子が
単離されているが、そのクローニングによるヒト起源の
単球−マクロファージコロニー刺激因子の遺伝子として
は、ＭｒＡ−ＰａＣａ細胞由来の約１．６ｋｂＯもの（
にａｗａｓａｋｉ、　Ｅ、Ｓ。

ｅｔ　ｍｌ、；　５Ｃ１ｅｎＣｅ、　ｚ１旦２９１　（
１９８５）　）　、　ＳＶ　−４０ｔｒａｎｓｆｏｒｓ
ｅｄ　ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ由
来の約４．Ｏｋｂのもの（Ｗｏｎｇ、　Ｇ、Ｇ、　ｅｔ
　ａｔ、：　５ｃｉｅｎｃｅ　　２１ｊ−１５０４（１
９８７）、ＷＯ３７１０６９５４）　、並びにＭＩＡ−
ＰａＣａ纏１１！　（Ｃｅｒｒｅｔｔｉ、　Ｄ、Ｐ、　
ｅｔ　ａｔ、：　Ｍｏ１．　Ｉ＋＋ｎｕｎｏ１．。

２ＪＬ　７６１　（１９８８））から３９非曙訳領域の
配列は明示されていないが４３８アミノ酸の■訳領域を
持つｃＤＮＡが知られている。また、特開平１−１０４
１７６ではヒト白血病Ｔ細胞由来培養株化細胞ＡＧＲ−
ＯＮ　（ＡＴＣＣＣＲＬ８１９９）由来の約２．５Ｋｂ
ｐの遺伝子が得られている。

さらに、公表特許公報平１−５０１２８３にもヒトＭ−
ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列が記軟されている。

こうして、従来種々の大きさのＭ−ＣＳＦとみられるも
のが得られているが、天然に得られるＭ−ＣＳＦタンパ
ク貿とできるだけ近似したものが好ましいとか、マウス
骨髄細胞をマクロファージへ分化増殖するのみならず、
ヒト骨髄細胞をマクロファージへ分化増殖したり、ヒト
単球／マクロファージの分化増殖作用を有するものがよ
り好ましいと考えられることを考えると、ヒト尿由来型
のものが望ましいと考えられる。

さらにまた特公表昭６２−５０１６０７、ＷＯ８７１０
６９５４、特開昭６３−６８０９５並びに小林（１１６
回次世代シンポジウムバイオテクノロジー予稿集　ｐ７
９　（１９８Ｂ））、及び電橋ら（第１６回日本免疫学
会総会、学術集会記録第１７看ｐ２５１、（１９８７）
）には、遺伝子産物とじてのＭ−ＣＳＦＯＣ末アミノ酸
が不確定であること及びその欠失等の問題が、指摘され
ている。

（発明が解決しようとする問題点） 尿や細胞の培養上清を原料とする場合、その含量が掻め
て少ない、あるいは大量の出発材輯が必要となることな
どの間層がある。尿の場合は先ず大量の人手が困難であ
り、尿中に含まれるＭ−ＣＳＦ含量が低いことからその
精製単離が非常にコストがかかると共に操作が繁雑とな
るという問題がある。

又細胞培養の場合、その生産量が少ないばかりでなく、
培養には高価な栄養Ｒ（例えば牛胎児血清）を必要とす
る、その細胞の培養条件の設定が難しいこと、その細胞
の目的物生産性を維持させるのが廻しい等の間層がある
。したがっていずれの方法もＭ−ＣＳＦを高純度かつ経
済的に取得することは非常に困難である。

前記したようにＭ−ＣＳＦを大量に得るための他の方法
として、いわゆる遺伝子操作の手法を用い、Ｍ−ＣＳＦ
に対する遺伝子をベクターに組込み、細菌、カビ、酵母
又は動物細胞内で複製、転写、■訳せしめて、これら細
胞に生産させることが試みられてきている。このような
例としてＫａｉｚａｓａｋらは、クローニングを行ない
約１．６ｋｂの遺伝子を得ているが、彼らの文献中には
ヒト骨髄細胞の分化増殖に対するデータは明示されてい
ない、さらに、Ｃｅｒｒｅｔｔｉら（＾ｄｖａｎｃｅｓ
ｎ　　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　　ｌ　　Ｌｙｍｐｈｏｇ＊ａ
　　ｐ２３９　　（１９８７）　　　Ａｊａｎ　　Ｒ。

Ｌｉ５ｓ　Ｉｎｃ、）は、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２總胞由
来の！、６ｋｂの遺伝子を酵母あるいはサルの腎細胞で
発現したＭ−ＣＳＦが、マウス骨髄細胞に対する効果は
あるがヒト骨髄細胞に対する効果のないことを示してい
る。また、Ｃｅｒｒｅｔｔｉら（Ｍｏ１．　ｌ＊ｗｕｎ
ｏ１．、２３Ｌ７６１　（１９８Ｂ）　）は、サルの腎
細胞で発現した３種のＭ−ＣＳＦ　（２５６，４３８，
６５４個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ由来のＭ−Ｃ
ＳＦ）がヒト骨＊＊胞の増殖作用のないことを報告して
いる。一方、Ｗｏｎｇら（５ｃｉｅｎｃｅ、ｚ１旦　１
５０４　（１９８７））は４．ＯｋｂのＭ−ＣＳＦ遺伝
子をサルの腎細胞で発現した場合には、ヒト骨髄細胞に
対する作用を有することを示していることから、これは
、Ｃｅｒｒｅｔｔｉらの報告と一致していないという問
題がある。そのためこれらＭ−ＣＳＦのヒト骨髄細胞に
対する作用、並びに医薬品としての有効性を確立するこ
とができず、新しいタイプのＭ−ＣＳＦ遺伝子の取得が
望まれている。

さらにまた、天然のヒト尿由来型のＭ−ＣＳＦと類似性
を有するものがより望まれる一方、比較的簡単な培養方
法が採用でき、安価で経済的な培地を用いることができ
、更にその生産性の高い、大腸菌で代表される微生物を
用いた製造法も求められている。

（問題点を解決するための手段） 本発明は新規なＭ−ＣＳＦ及び該ＣＳＦを多量に製造す
ることのできる方法を与え３手段としてのＭ−ＣＳＦを
コードする新規なりＮＡを提供することをまず第一の目
的としている。Ｅち、本発明はＭ−ＣＳＦ活性を有する
ポリペプチドをコードする新規な遺伝子及びその製造法
を提供するものである。

本発明は、細胞刺激剤で刺激したヒト単球系細胞より分
離されたメツセンジャーＲＮＡより、Ｍ−ＣＳＦ活性を
有するポリペプチド配列をコードする遺伝子を得ること
を特徴とする該遺伝子及びその製造法に関する。

更に本発明は該遺伝子を使用した新規Ｍ−ＣＳＦ活性を
有する蛋白貢の製造法、あるいは種脅の細胞の形質転換
法、さらには遺伝子あるいは生理活性物質等の分析の手
段を与えることにもｗｌする。

本発明は、さらに上記のようにして得た遺伝子を用い、
遺伝子操作の手法により、ヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦと同等
の生物活性を有し、かつ同一のアミノ酸配列を有する大
量の糖タンパク賀の製造方法にも関する。

さらにまた、本発明は、大腸菌等の微生物内で効率よく
発現して大量にヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦタンパク質を得
ることにも間するものである。

先ず最初に本発明の第一の目的であるＭ−ＣＳＦ活性を
有するポリペプチドをコードする新規な遺伝子及びその
製造法について以下説明する。

本発明は、ヒト単球系細胞を準備し、次いで該細胞を刺
激剤で処理し、ついで刺激された該細胞からメツセンジ
ャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を単離し、次に該ｍＲＮＡか
らその相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製し、次いて該ｃＤ
ＮＡから得られた遺伝子ライブラリーを特定プローブを
用いて分析し所望のＭ−ＣＳＦ活性を有する物質をコー
ドするｃＤＮＡを選択し、次いでこうして選択されたＤ
ＮＡの塩基配列を決定すると共に、該所望Ｍ−ＣＳＦ活
性を有する物質をコードするＤＮＡを適当な形質発現ベ
クターに組み込んで胡換えベクターを得、これで宿主細
胞を形質転換して、形質転換体を得、この得られた形質
転換体を適切な発現条件下に処理して、目的とする生物
的及び生理的な活性を有するＭ−ＣＳＦ活性を有する物
質を得ることを確認して完成されたものである。

本発明の遺伝子は、ヒト単球系細胞より分離されたｍＲ
ＮＡより調製されるが、その遺伝子は一旦このようにし
てその取得が確認され、その配列が明かにされた後は何
らその一番当初の採取源に間係なくあらゆる細胞から分
離採取することが可能である。

該本発明で使用され、ｍ　ＲＮ　Ａの採取源たるヒト単
球系細胞は、ヒト血液を公知の様々な方法で分離して得
られた単球細胞であってよいし、あるいは骨髄前駆細胞
を適当な誘導剤で処理して単球細胞に導いたものであっ
てもよいし、あるいはヒト亜性リンパ腫組織球型白血病
細胞、急性骨髄単球白血病細胞、急性骨髄単球白血病細
胞であってよい、該白血病細胞としては、株化細胞化さ
れているものが好適に使用でき、更に増殖性に優れてい
るものが好適に使用できる。このようなものの例として
は、Ｕ９３７、ＨＬ−６０、ＲＣ２ａというＪＩ１１！
株があげられる。該白血病細胞として特に好ましいもの
は、Ｕ９３７である０本発明のｍＲＮＡ採取源として特
に好ましいヒト単球系細胞は、ヒト単球系細胞株であっ
て、Ｕ９３７と呼ばれる細胞株である。

前記骨髄前駆細胞を単球細胞に導くために使用される誘
導剤としては、多くのコロニー刺激因子、例えばＧＭ−
ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ等のほか、刺激リンパ球由来のＩＬ
−３などがあげられる。

本発明で使用するｍ　ＲＮ　Ａをヒト単球系細胞から取
得するにあたっては、種々の免疫刺激性物質でその細胞
を前もって処理しておくことが好ましい、このような免
疫刺激性物質としては、リポ多糖体（ｌｉｐｏｐｏｌｙ
ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、　Ｌ　Ｐ　Ｓ　）　、Ｂ　ＣＧ
　（ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａ１ｓｅｔｔｅ−Ｇｕ’ｅｒ
ｉｎ）　、精製ツベルクリンタンパク貿（ｐｕｒｉｆｉ
ｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　ｏｆ　
ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ、　ＰＰＤ）、ホルボール−１２
−ミリステート−１３−アセテ−）　（ＰＭＡ）　、コ
ンカナバリンＡ（Ｃｏｎ　　Ａ）、フィトヘマグルチニ
ン（ＰＩ（Ａ）　、アメリカヤマゴボウマイトーゲン（
ＰＷＭ）　、コリネバクテリウムバルプム（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒ　ｉｕｗｐａｒｖｕ■、ＣＰ）、コリネ
バクテリウム　グラヌロスム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕ＊　ｇｒａｎｕｌｏｓ＊）、レバミゾール（Ｉｅ
ｖａｓｉｓｏｌｅ）、レンチナン（Ｉｅｎｔｉｎａｎ）
　、インターフェロン、リンホカイン、胸腺ホルモン、
溶連菌体、たとえばビシバニール等のマイトジェン、細
菌画体成分、生理活性物質をあげることができる。

さらにこの免疫刺激性物質としてはシクロヘキシミド等
であってもよい、これらの免疫刺激性物質は単独で用い
てもよいし、あるいは任意に組み合わせて用いてもよい
。

本発明で使用しうるこの免疫刺激性物質として、特に好
ましいものは、ホルボール−１２−ミリステート−１３
−アセテ−）　（ＰＭＡ）　、コンカナバリンＡ（Ｃｏ
ｎ　　Ａ）等のマイトジェン及び／又はシクロヘキシミ
ド等である。これらの免疫刺激性物質によるヒト単球系
細胞の刺激は、ｍＲＮＡを採取する直前であっても、あ
るいは、ヒト単球系細胞、特にヒト単球系細胞株を増殖
させる過程において行なってもよい。

本発明においては、ｍＲＮＡを採取する前にヒト単球系
細胞を、好ましくはθ〜２００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ瀾度
下に０〜３０時間培養後、更に０〜２０時間シクロヘキ
シミド０〜２００μｇ／■１の濃度下に培養することが
好ましい、より好ましくは、ｍ　ＲＮ　Ａを採取する前
にヒト単球系細胞株Ｕ９３７を、基礎培地、例えばダル
ベツコ変法イーグル、ＲＰＭＩ−１６４０、ＡＳＦ１０
３、ＢＭＥハンクス、ＢＭＥアール、ダイコＴ培地等に
、必要ならば血清、例えば牛胎児血清、新生中血清、人
血清、仔牛血清等、及び細胞成長因子類、例えばヒトイ
ンターロイキン２、γ−インターフェロン、ソマトメジ
ンＣ、ヒトＥＧＦ等各種成長因子畷、例えばトランスフ
ェリン、インターロイキン■、インターロイキンｒ、Ｃ
ＳＦ。

アルブミン、ＧＭ−ＣＳＦ等を添加し、ｌＸ１０３〜ｌ
Ｘｌ０１個／■１まで、好ましくは　ｌＸｌ０’−ＩＸ
１０７個／−１まで培養した細胞培養液中に、最終濃度
Ｏ〜２００ｎｇ／ｓｌになるようにＰＭＡ等のマイトジ
ェンを添加して、０．１０〜３０時間、好ましくは０．
２５〜２０時間培養した後、シクロヘキシミドを最終濃
度Ｏ〜１００μｇ／−１となるように添加してさらに０
．１０〜２４時間、好ましくは０．２５〜１２時間培養
する。

このようにして得られた細胞は、培養液を遠心分離して
最終的に細胞を取得する。こうして得られた細胞は、リ
ン酸緩衝生理食塩溶液等に細胞を懸濁した後遠心分離す
るという操作を繰り返して、２回〜１０回更に洗浄操作
を行なってもよい。

上記細胞の培養条件は、種々の条件で培養後回収した細
胞を溶解し、ドツトハイブリダイゼーション（Ｗｈｉｔ
ｅ、　ｅ、＾、＆Ｂａｎｃｒｏｆｔ、　Ｆ、Ｃ，：Ｊ、
　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　２ＪＬＬ＋　８５６９　（
１９８２））を行なうか、あるいはその細胞から得られ
たｍＲＮＡ−分をアフリカッメガエル（■ｍ＞の卵母細
胞、綱状赤血球ライゼート、小麦胚芽ラット肝臓の系等
（参画、梶昭他、生化学実験講１ｉ（日本生化学会１１
）７巻、タンパク質の生合成（上）１章、東京化学同人
、１９７５年）の蛋白合成系で■訳させ、その得られた
蛋白質の生物活性を検知したりまたはそのものをイムノ
アッセイ等で検知することにより検定でき墨９本発明で
は、より好ましくｒｉＵ９３７細胞を使用し、ＲＰＭＩ
−１６４０培地を基礎培地として、最終濃度が１０％に
なるように牛胎児血清（Ｆｅ２）を加えて、Ｉ　Ｘ　１
０’個／ｗｉｔでになるようにＵ９３７細胞を１０１ジ
ャーファーメンタ−で培養し、次に最終濃度５０　ｎ　
ｇ／ｍｌになるまでＰＭＡを添加して６時間培養し、次
にシクロヘキシミドを終−度２０μｇ／ｍｌになるよう
に添加して更に４時間培養し、ついで培養液を遠心分離
して細胞を取得する。

零ｌ＠明において使用できる基礎培地としては、糖類、
アミノ酸、ビタミン類、ホルモン類、蛋白質、抗生物質
、成長因子、核酸またはそのｌｅｔ！Ｉ！体、無接塩類
、重金属類等から選ばれた一種以上を含有する基礎培地
またはその基礎培地に動物血清等を添加した培地から適
宜選択して用いることができる。

このような基礎培地としては上記したような市販されて
いるＲＰＭＩ−１６４０培地、イーグル培地、ダルベツ
コ変法ＭＥＭ培地等が挙げられる。

また上記動物血清としては上記したような牛胎児血清、
新生中血清、牛血清、馬血清、ヤギ血清、ブタ血清、ウ
サギ血清、ニワトリ血清、人血清等を挙げることができ
、それらは基礎培地に適宜加えて用いることができるが
、好ましくは２０％まで添加して用いることができる。

なお、基礎培地、血清の種類と濃度、細胞の密度、培養
時間及び刺激特賞の種類、濃度、ざらには培ａ装置等に
ついてはそのａｔ萱通に使用され石ものであれば目的に
応じて種々選択して、好適な条件を選んで用いることが
でき、ここに記職のものに限定するものではない。

以上のようにして単離された単球系細胞は、そのＭ−Ｃ
ＳＦ活性を有する物質の産生の上昇期に、部分的あるい
は完全にそのＪＩ＃１を破壊し、その細胞質を可溶化し
た後、各細胞質物質を分別して全ＲＮＡの抽出を行なう
。

このような細胞の破壊可溶化法としては適当な界面活性
剤による方法、ホモジナイザーを用いる方法、凍結融解
による方法等の化学的あるいは物理的処理があげられる
。また各細胞質の分別には、フェノール、クロロホルム
等による抽出、硫安等の沈殴剤による方法、あるいはシ
ョ糖あるいはＣｓＣ１を用いた密度勾配遠心による方法
などがあげられる。

このような処理にあたってはＲＮａｓｅの作用を防ぐた
めに、ＲＮａｓｅインヒビターを添加して行なうことも
できる。

より好ましい方法としては該単球系！Ｉ胞をグアニジン
チオシアネート法で処理して、例えば、Ｃｈｉｒｇ＆ｉ
ｒ＋、　Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、：Ｂｉｏｃｈｅｓ＋１
ｓｔｒｙ、　１旦、　５２９４　（１９７９）の方法に
従ってグアニジンチオシアネート処理後、ＣｓＣＩ密度
勾配遠心分離処理を加えて、全ＲＮＡ１ｉ１分を得たの
ち、その全ＲＮＡ画分をｏ　Ｉ　ｊ　ｇｏ　（ｄＴ）セ
ルロースカラムあるいはｐｏｌｙＵ−セファ０−ス力ラ
ム等のアフィニティークロマトグラフィーにかけ、ｐ　
ｏ　Ｉ　ｙ　Ａ゛−ＲＮＡ画分を得る。

こうして得られたｍ　−ＲＮ　Ａは更に濃縮するために
ショ糖密度勾配遠心法、例えば１ｓｈｉｉ、　Ｖ、　ｅ
ｔ　ａｌ、：　ｌｓ＋ｍｕｎｏｌ。

ｎｖｅｓｔ、　Ｌｉ、９５　（１９８５）等の方法にか
け、細分−することができる。

以上のようにして、得られたｍＲＮＡから目的とするＭ
−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードしているｍ
ＲＮＡを濃縮するためには、そのｍＲＮＡをショ糖密度
勾配遠心あるいはゲル電気泳動等により分画し、その分
画につき、アフリカッメガエルの卵母細胞への注入、ウ
サギ網状赤血球ライゼート又は小麦胚芽系等の蛋白質の
■訳系にかけ、生成する蛋白質について、そのイムノ分
析をするかあるいは活性を測定することにより行なうこ
とができる。その他には、天然のＭ−ＣＳＦ中のへブチ
ド配列のうちの一部に相当する合成りＮＡブロー７を作
成し、このプローブ数種にそれぞれハイブリダイズする
ものを選ぶことによっても行なうことができる。

このようなｒｎＲＮＡの選別に使用されるプローブは、
天然のＭ−ＣＳＦの配列のうち、公知の配列部、あるい
は特に活性に関係する部分、あるいは互いに近情でない
部分から複数個作成するのが望ましく、例えば、ホスフ
ァイトトリエステル法、ホスホアミダイト法、等の面相
あるいは液相によるヌクレオチドの化学合成法を適用し
て製造することができる。次にこのようにして合成され
たプローブ用ＤＮＡはポリヌクレオ子ドキナーゼ、例え
ばＴ４ファージに感染した大腸菌由来のＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ等を用いて、その５°末端に標識リン酸
基、たとえば３２ｐを転移して標識化することができる
。

この標識化プローブを用いて、ｍＲＮＡとのノーザンハ
イブリダイゼーションを行なうには、先ずｍＲＮＡを変
性剤の存在下に電気泳動、たとえばアガロースホルムア
ルデヒドゲル上での電気泳動を行ない、（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｔ、：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｐ、　２０２　（１９８０）　、　
Ｃｏ１ｄ釦ｒｉｎｇ１１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｒ
ｙ）　、次にニトロセルロースに移行させ、ついで標識
合成りＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせるこ
とによって行なうことができる。

このようにして得られた本発明の（Ｍ−ＣＳＦ活性を有
するポリペプチドをコードする）ｍＲＮＡは、次の性貢
により特徴づけられる。

■　ヒト単球系細胞、特にヒト単球系繍胞株Ｕ９３７よ
り調製されたものであること。

■　２４．７Ｓ〜２７．Ｏ３、特に２６．２−２６．６
５のＳ値を有すること。

■　３′末端にポリアデニル酸構造を有すること。

■　Ｍ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードする
こと。

次にこのようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、２
末鎖ｃＤＮＡを合成する。このようなためには公知の様
々の方法を使用することができる。

好ましい方法としては、オリゴｄＴあるいは天然Ｍ−Ｃ
ＳＦ活性を有するタンパク賞のアミノ酸配列に相当する
オリゴヌクレオチドを合成し、これをブライマーとして
ｍ−ＲＮＡを鋳型としてｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
及びｄＴＴＰ存在下で逆転写酵素、例えば、ＡＭＶの逆
転写ＩＩ禦等を用いて相補的な一本鎖ｃＤＮＡを合成す
る０次に、鋳型としたｍＲＮＡをアルカリ処理して分解
除去し、その後得られた一本鎖ＤＮＡｔｔ＆Ｉ型として
逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｅ、Ｃｏ
１１　　ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウフラグメント
）を用いて二本鎖ＤＮＡを作成する。また別の好ましい
方法としては、ベクターに結合されたオリゴｄＴをブラ
イマーとして用い、同じ＜ｍＲＮＡを鋳型として逆転写
酵素により、相補的な一本鎖ｃＤＮＡの付加されたベク
ターを合成し、次にリンカ−付与した開環状プラスミド
及びリンカ−ＤＮＡとを７ニーリングさせ、ｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ存在下でＲＮａｓｅと
ＤＮＡポリメラーゼを共存させて、完全なプラスミドを
一気に形成させることもできる。

ざらに、特に好ましい方法は、オリゴｄＴをブライマー
ｍＲＮＡを鋳型として市販のｃＤＮＡ合成キット、例え
ばファルマシアｌ１ｃＤＮＡ合成キットを用い、先ずＦ
ｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄＲｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ中で
反応後、５ｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ　Ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ　Ｍｉｘて処理し、ついでＤＮＡポリメラーゼ、例え
ばＥ、Ｃｏ１１ＤＮＡポリメラーゼＩ（りしノウフラグ
メント）を反応させて、二本鎖ＤＮＡを合成する。そし
てこうして得られた二本鎖ＤＮＡを次の工程でｌ当なベ
クターと連結させて用いる。

この二本鎖ｃＤＮＡをベクターと連結させるためにはそ
のＤＮＡ末端に連結可能な末端；リンカ一部をつけるこ
とが望ましい、このようなリンカ一部は適当に化学合成
りＮＡ断片を付加する等の方法により行なうことができ
る。

このようにしてリンカ一部を付加されたｃＤＮＡは、予
め制限１１素で所望の位置で開裂されたベクターＤＮＡ
及びＴ４ファージＤＮＡリガーゼでＡＴＰ存在下で処理
すること等により、組換えＤＮＡ体とすることができる
。

さらに別の好ましい方法としては二本鎖ｃＤＮＡと予め
制限酵素で所望の位置で開裂されたベクターＤＮＡのそ
れぞれにｄＧ及びｄｃｉｌあるいはｄＡ及びｄＴ鎖を付
加した後その接着端を連結させることにより、組換え用
ＤＮＡを得ることができる。

このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡは、適当なベク
ター、ＥＫ！！［プラスミドベクター、例えばｐＢＲ３
２７、ｐＢＲ３２２、ｐＤＦ４１．Ｃｏｌ　　Ｅｌ、ｐ
ＭＢ９、ｐＡＣＹＣｌ、ｐＭＩｓ４、ｐＭＩＨ１７、ｐ
ＭＩＨｌＢ、ｐＭｌｏ、ｐＭＦ２０、ｐＭＣＲ７３５等
、酵母用ベクター、例えばＹＩｐ盟、ＹＲｐ型、ＹＲｐ
型、ＹＣｐ！！１等、ｐＬＳ１０２、ｐＬｓ１０３、ｐ
ＵＢｌｌｏ、ｐＥ１９４、ｐＴＰ４、ｐＴＰ５、ｐＴＡ
１３０２、ｐＴＡ１３２１、ｐＳＣＰ、ｐＳＬＰ、ｐ　
Ｉ　Ｊ、ｐＭＳ等、あるいはファージ由来のベクター例
えばλｇｔ、λｃ１人ｇｔｌｏ、λｇｔＷＥＳ等ニ絽ミ
込んで、宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ、Ｃｏ　１　ｉ
）　、枯草１、酵母、シュードモナス１、放線曹等を形
質転換して、ＣＤＮＡライブラリーを作成することがで
きる。ここで使用される宿主細胞としては、大腸菌、例
えばＸ１７７６、ＨＢＩｏｌ、ＤＨＩ、ＭＭ２９４、Ｊ
Ｍ１０９、Ｋ１２ＭＣ１０００λ溶原薗、Ｃ６００株、
例えばＣ６００Ｈｆ　Ｉ等、枯草菌、例えばバチルスス
ブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＭ
Ｉ　２５あるいはＭ７１２０等、酵母、例えばサツ力ロ
ミセスセレビシアｘ　（Ｓａｃｃｈａｒｏｓｙｃｅｓ　
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　、例えばＳＨＹ株、ＡＨ２２
、ＡＭ２２ｐｈｏ８０等、が特に好適に使用できる。

ここで使用されるベクターは各宿主に適合する各種の複
製開始点、例えばＳｈ＋ｎｅ−ＤａｌｘａｒｎｏＷ４Ｎ
　（Ｓ　Ｄ配列）等、及び制御配列を含むものが好まし
い。

このようなベクターに利用されるプロモーター類として
は、例えばペリシナーゼ等のβ−ラクタマーゼに関する
プロモーター、及びコリシンＥｌプロモーター、ラクト
ース（ｌａｃ）プロモーター系、トリプトファン（ｔｒ
ｐ）プロモーター系タンパク合成の延長因子ＥＦ−Ｔｕ
遺伝子（ｔｕｆ　　Ｂ）、外膜リポタンパク遺伝子（ｊ
ｐｐ）、ｒｅｃ　　Ａ遺伝子のプロモーター、ｔａｃプ
ロモーターおよび入ファージ由来のＰＬプロモーター系
のようなものがあげられる。

その他特に酵母に適したプロモーターとしては、グリセ
リン酸−３−リン酸キナーゼのプロモーター系、グリセ
リルアルデヒド−３−リン酸テヒドロゲナーゼ、ヘキソ
キナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、フルクトー
スリン酸キナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラー
ゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ２、チトクロームＣ１
酸性ホスフアターゼ１ｌｌＷＩＪ系等の解糖酵素系に関
係したプロモーターがあげられる。

さらにこのようなベクターに利用されるマーカーとして
はアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニー
ルのような抗生特賞に対する耐性が用いられつる。また
枯草菌に適したプロモーターとしては５ＰＯ２プロモー
ター、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ「）エリ
スロマイシン耐性遺伝子（Ｅｍｒ）などがあげられるほ
か、更に枯草菌では分泌ベクター、例えばアミラーゼ遺
伝子、ペニシリナーゼ遺伝子などを利用することもでき
る。

本発明において、特に好ましい組換え用ＤＮＡは、上記
のようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡの両端にＥｃｏＲ
Ｉリンカ−を付加し、ついでλｇｔ１０のＥｃｏＲＩ部
に組み込むことにより得られる。

このようにして得られた紹換え体は好適にはパッケージ
ングの後Ｃ６００Ｈｆ　ｌのような大腿曹宿主に導入し
、ついで組換え体ファージライブラリーを作成すること
により、ｃＤＮＡライブラリーを得ることができる。

本発明では、得られたｃＤＮＡライブラリーについて、
合成りＮＡプローブを用いてコロニーまたはプラークハ
イブリダイゼーション試験、例えば−ｏｏ、　Ｓ、Ｌ、
Ｃ，：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＥｎｚｙ＊ｏｌｏｇｙ、
　　Ｌｌ、　　３８９　　（１９７９）　　：　　　５
ｚｏｓｔａｋ、　　Ｊ、Ｗ、。

ｅｔ　ａｔ、；　１ｂｉｄ、　Ｌ旦、４１９　（１９７
９）によりスクリーニングして目的とするコロニーまた
は、プラークを選別する。

この他にも、プラスマイナス法あるいはハイブリダイゼ
ーショントランスレーションアッセイ法などによって同
定することができる。

こうして選別されたコロニーまたはプラークから組換え
ファージＤＮＡを調製する。この組換えファージＤＮＡ
から制ｗＩｗＩ素を用いて所望のインサート部分を含む
ＤＮＡ配列部を切り出し、さらに適当なプラスミドベク
ターに組み込んで、増幅を行なう、このような処理は必
要に応じ適宜複数回行なうことができる。

このようにして最終的に得られたクローン化されたＤＮ
Ａ断片についての塩基配列の決定を行った。先ず得られ
たクローン化されたＤＮＡ断片に制限酵素を作用させて
、それぞれ制限＃素地図を作成する。

次にクローン化されたＤＮＡ断片をＭ１３ファージ、好
ましくはＭｔａｍｐｉｓまたはｍｐ１９にサブクローニ
ングした後、ジデオキシシーフェンス法、例えばＳａｎ
ｇｅｒらの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、ヱｉ、５４６３　（１９７７）、
Ｊ、門ｏｆ、　８ｉｏ１．、　ＬＬＬ、　７２９　（１
９８２）等によって塩基配列を解析する。

このような塩基配列の解析はまたマクサム−ギルバート
法等によっても行うことができる。

これら、側限−禦地図、解析塩基配列、及び既に明かに
したＭ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質中の部分アミノ配列
に対応する塩基配列とから、最終的に所望の塩基配列部
分を含むＣＤＮＡを選択することにより、Ｍ−ＣＳＦ活
性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードす
る塩基配列を有するクローン化ＤＮＡを決定することが
できる。

本発明において特に好ましい、ｃＤＮＡライブラリーか
ら所望のＭ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコード
するクローン化ＤＮＡを得る方法は、前記ｍ　ＲＮ　Ａ
を選別するために用いた３２ｐ標識合成りＮＡプローブ
を用いて、プラークハイブリダイゼーション試験、例え
ばＭａｎｉａｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ　ｐ、　３２６　（１９８２）　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙの方法
を行ない、次いで選別された各プラークから鞘換えファ
ージＤＮＡを調製し、例えばＰｅｒｂａｌの方法（Ａｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ　　ｇｕｉｄｅ　　ｔｏ　　ｇｏｌｅ
ｃｕＬａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　　ｐ　、　　１　７　
１　　（１９８５）　　Ｊｏｈｎ　ｌ／１ｌｅｙ　Ｉ　
５ｏｎｓ　Ｉｎｃ、）次いで、サザンハイプリダイゼー
ションを行ない、こうして選択されたファージクローン
から所望のＤＮＡ断片を切り出し、これを適当なプラス
ミド、例えばｐ　ＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　Ｓ　Ｋ　
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にライゲーションし、太陽薗
、例えばＥ、Ｃｏ１１　　ＪＭ１０９に導入し、得られ
た組換え体からプラスミドを調製し、例えばＢｉｒｎｂ
ｏｉｓ、　Ｈ，Ｃ，轟Ｄｏｌｙ、　Ｊ、；　Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、＋ヱ、１５１．３（１９７９
）に配置のアルカリ−５ＤＳ法、次いで電気泳動を行な
って所望の断片を有することを指標に目的りａ−ンを選
択する。このクローンから所望断片を含むプラスミドを
得、これを適当に制限酵素で処理し、得られた断片を再
度プラスミド、例えばｐ　Ｂ　Ｓ　＋　（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）の適当な断片にライゲーションし、大腸菌、
例えばＥ、Ｃｏ１１　　ＪＭＩＯ９に導入し、得られた
クローンを選択する。こうして最終的に目的とする断片
を含むクローン化ＤＮＡが大量に得られる。

こうして大量に取得されたＤＮＡ断片はＭ１３ｍｐ１８
あるいはｍｐ１９にサブクローン化して、ジデオキシ、
チエイン、ターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ等、Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、’：ｌ生、　５４６３　（１９７７）
　、　Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、。

１旦ｕ、７２９　（１９８９））にしたがフて、ブライ
マーをアニールした後シークエナーゼ（商標　Ｌｌｎｉ
ｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ８ｉｏｃｈｅｓｉｃａｌ　Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ）による相補鎖合成にかけ、ついでゲ
ル電気泳動及びオートラジオグラフィーにかけることが
できる。

このようにして得られた結果にもとづいてＭ−ＣＳＦ活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む
遺伝子の塩基配列を決定した。

その結果を第１図に示す。

本遺伝子は、第１図の塩基配列を有し、第２図に示す塩
基配列が■訳領域であり、第３図のポリペプチドをコー
ドする。

本発明の遺伝子は、その第１８６ないし１８４７８目は
Ｍ−ＣＳＦの前駆体をコードすると推定される塩基配列
を有する。

このうち第２８２番目からがＭ−ＣＳＦをコードしてい
ると考えられる。終止コドン（ＴＡＧ）は第５２２番目
のアミノ＃（ＶａＪ）のコドンに続いて存在する。尚、
ヒトＭ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子の塩基配列及びポリペプチドのアミノ酸配列に間
してはりｏｎｇらの報告がある（Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｚ１
旦、　１５０４　（１９８７）　）が、本発明者らは遺
伝子の塩基配列及びポリペプチドのアミノ酸配列が異な
ることを見出した。ＩＩＴち、Ｗｏｎｇらではアミノ酸
配列の３７６番目のアミノ酸がＬｅｕであるのに対し、
本発明ではＰｒｏであり、対応する遺伝子もＷｏｎｇら
ではＣＴＧであるのに対し、本発明ではＣＣＧである点
が異なフている。さらに第１２８０番目のＡがＣに、第
１７１８番目のＴがＣになって異なフている。しかし、
この部分ではコドンの縮重のためアミノ酸の違いはない
こととなっている。また第１〜４０番目の配列はりｏｎ
ｇらの配列には含まれない配列であり、他にペプチドコ
ード部位以外で第２２９６番目のＣがＴに、第３０９１
番目のＣがＴに、第３３４６番目のＴがＧになっており
異なっている。そしてこれらの塩基配列の違いにより新
たな制限ＩＩ業部位が出現している。

又遺伝子の製造法に関してはＷｏｎｇらはＳＶ４０でト
ランスフオームしたヒトトロポプラスト細胞からｍＲＮ
Ａを抽出、精製し、このｍＲＮＡから遺伝子を製造して
いるのに対し、本発明てはヒト単球系細胞、特にヒト単
球系細胞株Ｕ９３７をＰＭＡ及びシクロヘキシミドの存
在下に０，５〜２４時間培養して得た細胞よりｍ　ＲＮ
　Ａを抽出し、精製し、次にこのｍＲＮＡから遺伝子を
製造することを特徴とする点で違いがある。

また、特開平１−１０４１７６号にもヒトＭ−ＣＳＦ遺
伝子の報告があるが、それとはその塩基数並びに塩基配
列において著しい相違があり、用いた細胞もヒト白血病
Ｔ細胞株である点で、本発明のヒト単球系細胞、特にヒ
ト単球系細胞株であるのと全く異なっている。

さらに公表特許公報子１−５０１２８３号にもヒ）Ｍ−
ＣＳＦ遺伝子の報告があるが、それともそのコードする
ポリペプチドのアミノ酸配列に大きな違いがあり、その
塩基数並びに塩基配列においても著しい相違がある。

このようにして得られた本ｌＩ！明のＭ−ＣＳＦ活性を
有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、その得られ
た塩基配列に基づいて公知の自動核酸合成装置等により
製造したり、あるいは部分的にそのような化学合成した
ものを酵素的に結合して製造することもできる。

本発明の遺伝子は、利用する宿主におけるコドンの使用
頻度等に応じて適切に変換して用いることができる。こ
のような変換法としては、その目的に適したＤＮＡ鎖の
切断、削除、付加あるいは結合のための手法を用いるこ
とができる。

本発明のＭ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコード
する遺伝子は天然の細胞系に近い単球系細胞由来のもの
であるためその機能がより天然のものに近いことから、
それを用いて得られるペプチドは、医薬として使用する
場合に、非常な利点を有することが期待できる。

また、本発明の遺伝子は、従来にない長いものであるこ
とから、その取得には特別な工夫をこらす必要があるが
、−旦取得後にはその配列中に多機能を含んだ領域があ
ることから、それをもとに組換えプラスミドを作成した
場合、効率よく形質転換細胞を作成できる。特に本発明
の遺伝子を用いると高等生物由来の細胞に刻する親和性
のすぐれた組換えプラスミドを得ることができる。より
特別には、本発明の遺伝子を用いると動物細胞由来のＪ
ＩＩｍ！を形質転換するのに適した組換えプラスミドを
得ることができる。

本発明の遺伝子はその塩基配列が、Ｍ−ＣＳＦ活性を有
するポリペプチドの細胞内発現に、より適Ｑたものであ
ることから、−旦細胞内に組換え手法で導入された場合
にその目的とするポリペプチドを効率よく産生させるこ
とができると共に、その遺伝子の欠失も大変少ない。

さらに、本発明の遺伝子は、その塩基配列が特殊であり
さらに従来にない長いものであることから、それを用い
て絹換え体を作成させて発現した場合、特に目的とする
ポリペプチドに糖が付加される条件の場合従来にないす
ぐれた結果が得られる。すなわちポリペプチドへの糖の
付加が、その活性を高める方向であるいはその安定生を
高める方向で起こりうる本発明の遺伝子は、より天然の
型に近いことから、それを動物細胞宿主に組み換えで導
入することが非常に容易であるまた、その組み換えられ
た遺伝子の発現の制御も容易になし得る。またより動物
ＩＪＩＷ！１宿主に遺した構造を有することから安定し
た目的ポリペプチドの産生が期待でき、工業的にすぐれ
たものである。

本発明の遺伝子を用いて作られたポリペプチド生成物は
、より天然に近い形態で散得できることから医薬等に用
いる場合に非常に有用である。たとえば抗原性が従来の
ものに比して低いとか、あるいは体内投与した場合の代
謝性が非常にすぐれているとかあるいは製剤上の加工性
が優れている等の利点が期待されつる。

上記本発明の遺伝子の利点は、その塩基配列自身の特性
がすぐれるのみてなく、その立体配位上あるいは遺伝子
制御ｌ＠同志の配位１優れていることが指摘しうる。

こうして得られた本発明のＭ−ＣＳＦ活性を有するポリ
へブチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は適当な
ベクターＤＮＡに再び朝み込むことにより、再び適当な
宿主に作用させて、それを形質転換させることができる
。このＤＮＡ断片を適当なベクターＤＮＡｃ４：組み込
むにあたフては適当なプロモーター及び形質発現誘導の
ための配列等を付加して埴換えベクターを作成すること
ができる。

本発明の形質転換に用いられる宿主としては原核細胞ま
たは真核ｗＩ＃１等を用いることができる。このような
細胞の具体例としては、例えば大＠Ｍ、　１９１えば、
Ｋ１２株、枯草菌、放線菌、酵母などの微生物、昆虫細
胞、動物Ｊｌ胞、例えばＣＨＯ細胞、ＣａＳｘ胞、マウ
スミエローマ細胞Ｎ５１、ＶＥＲＯ１Ｈｅｌａ繍胞、サ
ルＣＶＩ、サルＡＧＭＫ、マウスＬ細亀、ＦＭ３Ａ、Ｎ
ＩＨ３Ｔ３、Ｃ１２７、フレンド白血病細胞、ヒト２９
３、サルＷ１Ｂ２、ハムスターＢＨＫ、ヒト１４３等の
動物細胞が挙られる。

上記大腸菌等を形質転換するのに使用することのできる
ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＫＫ２２３−３、ラ
ムダファージ由来のベクター、ＳＶ４０などのウィルス
由来のベクター、あるいはシャトルベクターとして知ら
れたものがあげられ、＊＊などの真核微生物を形質転換
するのによく使用されるものとしてはｐＡＭ８２等があ
げられ、前記ｃＤＮＡライブラリーを作成するざいに用
いられる、宿主膿胞及びベクター類が同様に使用できる
。

上記動物細胞を形質転換するのに使用することのできる
ベクターとしては、ＳＶ４０の初期及び／又は後期プロ
モーターを含んだもの、ポリオーマウィルス由来のベク
ター、ワクシニアウィルス系のベクター、アデノウィル
ス系のベクター牛パピローマウィルス（ＢＰＶ）由来の
ベクターの他に、マウスメタロチオネイン遺伝子プロモ
ーター、トリ等の動物のレトロウィルス由来のプロモー
ター、免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプ
ロモーター等を適当に組み込んだベクターが使用できる
。このようなものの例としては、ｐＮＥＯ５、ｐＬ２Ｂ
Ｐｖ、ｐＭＳＶ　　ｇｐｔ、ｐＳＶ２−ｇｐｔ、ＳＶ４
０　　ｏｒｉ、ｐｓＶ２　　ｎｅｏ、ｐｓＶ２　　ｃａ
ｔ、ｐＭＤＳＧ、ＢＰＶａ＊ｙＤＮＡ、ｐＳＶ２　　ｄ
ｈｆ　ｒ、ｐＬＴＲｄｈｆｒ２ａ、ｐＣＶＳＶＥ、ｐＭ
ｇ　　４、ΔＥ１ｄ／ｄ　ｌ　３０９、ｐＺＩＰ−ｎｅ
ｏｓＶ、ｐＭｏｖ−ψ−等をあげることができる。

上記昆虫細胞での形質発現に利用することのできるベク
ターとしては核多角体病ウィルス由来のものがあげられ
る。上記ベクター類に納み込まれる選択マーカーとして
は、チミジンキナーゼ（Ｔ　Ｋ）遺伝子、ヒボキサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（）Ｉ
ＰＰＴ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺
伝子、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ａ
ＰＲＴ）遺伝子等があげられる。

これらのベクターは、本発明のＭ−ＣＳＦ活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子の前に、プロモーター
、エンハンサ一部位、ＲＮＡスプライシング部位等が付
与されたり、あるいは転写終了配列を最後にもったり、
複製起源あるいは選択マーカーを付与されているものが
好適に使用できる。

本発明で好適に利用することのできる形質転換オペロン
としては、例えばトリプトファン、β−ガラクトシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、β−ラクタマーゼなどの
オペロンがあげられる。

このようにして得られた発現ベクターを細胞内に導入す
る方法としては次のような方法を使用することができる
。

原核細胞あるいはｗ１＠壁を有するような細胞にあって
は、塩化カルシウムによる処理があげられる。特に、大
腸菌にあっては塩化カルシウム、塩化マグネシウム、又
は塩化ルビジウム存在下に処理すること等が好ましい、
またある種の細胞ではポリエチレングリコールあるいは
ポリオルニチンによるプロトプラストへの直接導入法、
リポソーム法、共存培養法、スフェロプラスト法、等が
あげられる。鴫乳動物などの場合にはウィルス感染法、
ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム沈降法、
微注入法、リポソーム融合法、プロトプラスト融合法、
センダイウィルスを用いた細胞融合法、微小核体融合法
、染色体移入法などがあげられる。

本発明の動物細胞での発現目的のベクターは、好ましく
は、前記のようにして得られたＭ−ＣＳＦ活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子部を有するプラスミド
をＤＮＡポリメラーゼ例えば、Ｅ、Ｃｏ１１　　ＤＮＡ
ポリメラーゼ■（クレノーフラグメント）で処理して、
末端プラントエンド化した後、ベクターｐＳＶＬの断片
にライゲーションし、これを大腸菌、例えばＨＢＩＯＩ
に導入し、組換クローンを取得し、ついでそのクローン
よりＤＮＡを得る。このＤＮＡｔｉ制隈酵素によるマツ
ピングで挿入方向が調べられる０本発明では好ましくは
このプロモーターと同方向に挿入されたベクター及び逆
方向に挿入されたベクターをそれぞれ選択し、それをリ
ン酸カルシウム法、例えば０ｋａｙａｓ＋ａ、　ｅｔ　
ａｔ−、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、ヱ、２７４５　（１９８７）等により動物細
胞に導入できる。

本発明により得られた形賀転換体を発現させることによ
りその細胞内又は細胞外に得られる組換えＭ−ＣＳＦ活
性を有する物質は、各種の分離操作により、単離精製す
ることができる。このような方法としては、蛋白質沈殿
による方法、電気泳動による方法、ゲル濾過あるいは分
子ふるいクロマトグラフィー法、限外濾過による方法、
逆相クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィ
ーによる方法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフ
ィニティクロマトグラフィー法、吸着クロマトグラフィ
ー法などがあげられる。上記蛋白質沈殿による方法では
硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用い
ることが好ましい、ゲル濾過に用いることのできる分離
剤としては、例えばポリアクリルアミドゲル、アガロー
スゲル、デキストランゲル等があげられる。

逆相クロマトグラフィーとしては、Ｃ＋−２ｅのアルキ
ル基、シアノプロピル基、フェニル基等がシリカゲル基
体上に結合されたものを使う方法があげられる。イオン
交換クロマトグラフィー法では、例えばジメチルアミノ
エチルあるいはジエチルアミノエチル基を官能基として
有する陰イオン交換体、カルボキシルメチル基を官能基
として有する陽イオン交換体を用いることができる。ア
フィニティークロマトグラフィー法に利用できるものと
しては、Ｃａｎ　　Ａ−セファロース、レクチンセファ
０−スあるいは抗体結合セファロース等を用いることが
でき、特に抗体としてモノクローナル抗体を用いたもの
は、好適に使用することができる。該吸着クロマトグラ
フィーに用いることができるものとしては、フェニルセ
ファ０−ス、オクチルセファ０−スなどがあげられる。

本発明で得られる組換えＭ−ＣＳＦ活性を有する物質は
上記精製分離法を単独であるいは適宜組み合せて用いる
ことにより容易に高純度で取得することができる。

このようにして得られたＭ−ＣＳＦ活性を有する物質は
それを医薬として用いる場合、通常の蛋白質製剤に許容
される方法で投与することができる。

このような形態の代表的なものは、静脈経由、筋肉内経
由、経鼻、皮下あるいは皮内殺与、さらには経口で投与
することもてきる。非経口投与のための調剤としては無
菌溶液または非水溶液剤、懸濁剤またはエマルジョン剤
としてもよい、それらはまた無菌水、生理的食塩水ある
いは使用直前に憲薗注射用媒体に溶解して用いられる凍
結乾燥製剤のかたちのものであってよい。

本発明により得られたＭ−ＣＳＦ活性を有する物質は、
種々の感染症の治療剤、抗癌剤あるいは放射線照射時及
び照射後の副作用の防止及び治療剤、白血球減少症治療
剤あるいは抗腫瘍剤として有用である。

本発明により得られたＭ−ＣＳＦ活性を有する物質はま
た再生不良性貧血等の診断剤としても有用である。

さらに本発明により得られたＭ−ＣＳＦ活性を有する物
質はインターロイキン２、ＴＮＦ、インターフェロン、
アドリアマイシン、マイトマイシン、５−ＦＵ等に配合
して用いられて優れた作用を示す。

特に、本発明のＭ−ＣＳＦ活性を有する物質を含んでな
る薬剤は、放射線照射や抗癌剤投与により骨髄組織の機
能が低下している場合、抵抗力を失った重度の腫瘍患者
に、更に抗生物質治療の困難な重症感染症患者に用いて
有用である。

本発明により得られるＭ−ＣＳＦ活性を有する物質を上
記したような治療目的に用いる場合、その投与量、投与
回数、投与開隔は、患者の症状に応じて適宜選択して決
めることができる。

以下、本発明の更なる目的であるヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦ
と同等の生物活性を有し、かつ同一のアミノ酸配列を有
する大量の糖タンパク質の製造法について説明する。

本発明によれば、図１０に示されたヒト尿由来Ｍ−ＣＳ
Ｆのアミノ酸配列を有する遺伝子生産物が得られ、さら
に図１０に示されたヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦのアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ配列と動物細胞でＷ能するプロモ
ーター配列および増幅可能な遺伝子のＤＮＡ配列を含む
Ｍ−ＣＳＦ発現ベクターが提供される。

さらにまた、本発明によれば、上記のようにして得た発
現ベクターを動物細Ｗ１１！４：導入することによって
得られた形質転換体を培養することにより、効率よく且
つ大量にＭ−ＣＳＦを製造する方法が提供される。

以下さらに詳しく説明する。

二の目的に用いるＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ヒトＭ−Ｃ５Ｐ
ｃＤＮＡと一＃ＤＮＡとを、それらの化学合成や側限＊
＊による切断、修飾ｓ業による削除、付加や結合により
作製可能である。ざらには目的の遺伝子を完全化学合成
によって作製することもできる。前記したヒトＭ−ＣＳ
ＦｃＤＮＡはこの目的に好適に用いることができる。こ
の約４．０Ｋｂｐの遺伝子を含むプラスミドｐＢｓＩＩ
ｃｓＦを使用することが好ましくこのものは以下のよう
に適宜処理される。

５２２個のアミノ酸（シグナルペプチドを除く）をコー
ドするｃＤＮＡを含む発現ベクターを適当な制限酵素で
消化後、ＤＮＡ断片を分離精製する０次に２１４個と２
３８個のアミノ酸となるようにＤＮＡ化学合成する。Ｄ
ＮＡの化学合成法としては、例えばβ−シアノエチルア
ミダイド法あるいはＨ−ホスホネート法がある。上記ベ
クターと合成りＮＡｔｔＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合
させた後、この結合物を大腸菌に導入し、目的の形質転
換体を得ることができる。

これらＤＮＡ断片の分離精製、制限酵素や修飾防禦の処
理方法及び大腸菌への導入方法等の一般的な遺伝子組換
え技術は、前記したように（Ｍａｎ＋ａｔｉｓ、　Ｔ、
　ｅｔ　ａｌ、；　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　　（１９８９）　　）に記載
されている方法に従うことができる。

またアミノ酸の一部改変は、部位特異豹変Ｊｌｌ　（Ｋ
ｕｎｋｅｌ、　Ｔ。

Ａ、　ｅｔ　ａｔ、：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃｈ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　ｆＬＸ４８８（１９８５）
）等に従うことができる。得られる遺伝子配列の１ｗ５
ｇは上記と同権ジデオキシ・チエイン・ターミネーショ
ン法＜Ｓｌｌｎｇｅｒ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、：　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡヱ］
、５４６３　（］　９７７））　、あるいはマクサム−
ギルバー　Ｆ法　（Ｍａｘａｌｌ＋　　＾、Ｍ、　　Ｉ
　　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　　Ｗ、、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
　Ｅｎｚｙｓｏｌ。

１％、４９９　（１９８０））によって行うことができ
る。

得られたヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦ遺伝子は、動物細胞内
で発現できるようにＤＮＡを組み換え、次にそれを用い
形賞転換し、該形質転換体を培養すればよい。

ここで動物細胞用発現ベクターとしては通常発現しよう
とする遺伝子の上流にプロモーター、下流にスプライス
部位、ポリ（Ａ）シグナル、ポリ（Ａ）部位を有するも
のを使用すればよい、さらにベクター上にエンへンサー
配列を導入することで遺伝子産物の生産増加が可能であ
る。プロモーターとしてはウィルス由来のものが通常使
用されることが多く、例えばＳＶ４０の初期および後期
プロモーター、ヒトアデノウィルスの主要後期プロモー
ター、ヒトサイトメガロウィルスの０時初期プロモータ
ー等があるが、これらに限定されるものではない。

この目的に使用する動物細胞としては、例えばサルの腎
細胞ＣＯＳ　（Ｇｌｕｚｓａｎ、　■、：　Ｃｅ１１７
旦　１７５（１９８１））やチャイニーズハムスター卵
巣細胞のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株ＣＨＯｄ　ｈ　ｆ
　ｒ　−（Ｕｒｌａｕｂ、　Ｇ、　！　Ｃｈａｓｉｎ、
　Ｌ、Ａ、；Ｐｒｏｃ。

Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　Ｌヱ　
４２１６　（１９８０））等がよく用いられ、好ましく
は、ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞である。

宿主細胞としてＣＯ８細胞を用いる場合、ＳＶ４０の複
製起点を有し、ＳＶ４０複製を阻害する配列、いわゆる
有毒配列を除去したプラスミドに上記の発現単位を組み
込んだ発現ベクターを使用すればよい、ＣＨＯｄｈｆｒ
−細胞を用いる場合、優性マーカーとして好ましくは、
マウスｄｈｆｒ遺伝子を有したベクターｐＳ　Ｖ　２−
ｄ　ｈ　ｆ　ｒ　（Ｓａｂｒａ−ａｎｉ、　Ｓ、　ｅｔ
ａｔ、：　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　、Ｌ　
　８５４　（１９８１）　）を利用することができる。

ｄｈｆｒ遺伝子（ジヒドロ葉酸還元ｌＩ素）はメトトレ
キセート（ＭＴＸ）による遺伝子増幅が可能であり、高
生産株の取得に利用される。（にａｕｆｍａｎ、Ｒ，Ｊ
、　ｅｔ　ｉｆ、；Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、
　ｆｌ　　１７５０　（１９８５）　）　、優性マーカ
ーを使用して染色体へのＣＳＦ遺伝子導入方法には、優
性マーカーとＣＳＦ遺伝子を連結しないで導入するコ・
トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏ
ｎ）法と同一ベクター上にＣＳＦ遺伝子を連結して導入
する方法があるが、本発明では後者の方法を好適に用い
ることができる。さらにポリシストロン法による発現に
より翻訳効率を上昇させることが可能である（Ｋａｕｆ
ｍａｎ、　Ｒ，Ｊ、　ｅｔａｌ−：　ＥＭＢＯＪ−ｆｌ
　　１８７　（１９８７））。

得られた発現ベクターを動物細胞に導入し形質転換体を
得る方法としては一般に使用されている方法でよく、例
えばＤＥＡＥ−デキストラン法（Ａｒａｉ、　Ｈ，ｅｔ
　ｉｆ、、実験医学　旦１０１９　（１９８７））やリ
ン酸カルシウム法（ＯｋＢａｍａ、　Ｈ、ｅｔ　ａｔ、
：　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、ヱ２７２４　（
１９８７）　）で容易に行うことができる。

かくして得られた形質転換体は常法により培養すること
ができ、培養液中にヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦが蓄積され
る。該培養に用いられる培地としては、例えばＣａＳｘ
胞であればダルベツコ変法ＭＥＭ培地（Ｄ−ＭＥＭ）に
必要に応じ牛胎児血清（Ｆｅ２）等の血清成分を添加し
たものを使用し、３５〜３７℃、θ〜１０％ＣＯＰ下で
２〜５日間培養する。ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞であれば核
酸不含のＭＥＭアルファー培地（ＭＥＭα（−））に、
必要に応じ牛胎児血清（Ｆｅ２）等の血清成分を添加し
たものを使用し、３５〜３７℃、０〜１０％ＣＯ２下で
２〜５日間培養する。

上記の方法で得られる培養上清中のＭ−ＣＳＦ含量は、
ｌｌ当り１〜１０■であり、これはヒト尿中に含まれる
Ｍ−ＣＳＦの含量の約１０．０００倍に相当し、工業的
生産が可能である。

培養上清よりＭ−ＣＳＦを分離精製するには、例えば上
記したような方法等により行うことができる。

この方法としては、具体的には酸処理、熱処理、限外濾
過、塩析、イオンクロマトグラフィー、分子ふるいクロ
マトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー等の組合せを例示できる。

より具体的には、まず培養上清を限外濾過方式で濃縮し
、それをリン酸等によりｐＨ４，０〜５．０に調整、析
出物を除去する０次に陰イオン交換体、例えばＤＥＡＥ
−セルロースと接触させ、Ｍ−ＣＳＦ活性が認められる
画分を取得する。

この活性画分を疎水性クロマトグラフィー、例えばフェ
ニルセファロースなどに接触させ、活性画分を取得する
。さらに分子ふるいクロマトグラフィー、例えばスーパ
ーローズ１２などを充填したカラムに通液して分画し、
脱塩、濃縮する。

上記の方法により高収率、高純度でヒト尿由来Ｍ−ＣＳ
Ｆを取得することができる。

本発明においては、さらに太陽菌内で効率よく大量にヒ
ト尿由来型Ｍ−ＣＳＦモノマータンパク質を発現させる
ことに成功すると共にざらにその効率的な分離再生を含
む製造法を確立した。またさらに、これらの方法によっ
てヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦの誘導体も効率よく製造しう
ろことを見出した。

以下、詳細に説明する。

この方法によれば、代表的には、（１）下記式（Ｉ）ア
ミノ酸配列で示されるヒ）Ｍ−ＣＳＦ活性を有するポリ
ペプチド 式（１） （Ｎｅｔ）ｎ　Ｘ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　
Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｍｅｔ　ｌ　ｌｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　
ＧｌｙＨｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌ
ｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　　ｌ　ｌｅ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｎ　ＭｅｔＧｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ
　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　（Ｙ）　Ｖａｔ　
Ａｓｐ　ＧｌｎＧｌｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓ
ｐ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙ
ｓ　Ｌｙｓ　ＡｌａＰｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　
　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　　Ｉ　Ｉｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｓ
ｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　＾「ｇＰｈｅ　　Ａｒｇ　　Ａｓ
ｐ　　Ａｓｎ　　丁ｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　　Ａｌ
ａ　　Ｉｌｅ　　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　　Ｖａｔ　　Ｇｌ
ｎＬｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　
Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔ
ｈｒＬｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ
　Ａｓ０Ｌｙｓ＾ｌａ　Ｃｙｓ　Ｖａｔ　　Ａｒｃ　Ｔ
ｈｒＰｈｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ
　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｔ　
　ＬｙｓＡｓｎ　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　
Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌ
ｙｓ　ＡｓｐＴｒｐ　Ａｓｎ　　ｌ　ｌｅ　Ｐｈｅ　Ｓ
ｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｓｅ
ｒ　Ｐｈｅ　＾１ａＧｌｕ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　
Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｖａｔ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ
　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ＾ｓｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔ
ｙｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　　Ｉ　ｌｅ　Ｐｒｏ　
Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｒ。

Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｈａｓ　
Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｍ
ｅｔ＾１ａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅ
ｕ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　ＡＳＣＩ　Ｓｅｒ　Ｇｌ
ｕ　ＧｌｙＴｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　
Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｐ
ｒｏ　ＬｅｕＨｉｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ
　（Ｚ）（式中ＸはＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−または０
個のアミノ酸を示し、ｎ＝０または１を示す、ＹはＰｈ
ｅまたはＳｅｒを示し、ＺはＧｌｙ−５ｅｒ−＾１ａ（
、ｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−５
ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌ
ｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖｉｌ
−Ｖａｌ−Ｌｙｓで示され３アミノ酸配列または０１１
のアミノ酸を示す、）及びそのポリペ１チドをコードす
るＤＮＡ配列、さらにはそのＤＮＡ配列及び微生物中で
機能するレプリコンを含んで成る複製可能なりローニン
グベクター、その発現系及びそれで形質転換された組換
え宿主微生物が与えられる。

また本発明から明らかなように上記式（１）のアミノ酸
配列で示されるヒトＭ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチ
ドは、そのホモダイマ一体で存在することもできる。

本発明の別の目的は遺伝子工学的な手法を駆使して、ヒ
トＩｌ型Ｍ−ＣＳＦを大腸曹発現系を用いて効率よく大
量に製造供給する方法を与えることである。

この目的のために用いるＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ヒ）Ｍ−
ＣＳＦｃＤＮＡと一部ＤＮＡを用いてその化学合成、制
限酵素による切断、修飾酵素による削除、付加、結合等
により作製できる。また、その目的遺伝子をそれを完全
化学合成することによっても取得できる。前記で取得し
たヒトＭ−ＣＳＦｃＤＮＡ（１！ＩＩ）は本発明の目的
に好適に使用することができ、この約４Ｋｂｐの遺伝子
を含むプラスミドｐＢｓＩＩｃｓＦを保有する大１１１
１ＪＭ】ｏ９株は、上記したように工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている（ＩＩ工研条寄第２５２
６号［ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２５２６３）、さらにまた動
物細胞発現ベクターに組み込まれ３２個のシグナルペプ
チドとヒト尿由来型の２１４または２３８アミノ酸をコ
ードするｐＳＶＬ−ＣＳＦ２１４あるいはｐＳＶＬ−Ｃ
ＳＦ２３Ｂもコノ方法の目的に好適に使用することがで
きる。

本発明に従い、具体的には３２個のシグナルペプチドと
２１４または２３８個のアミノ酸をコードするｐＳＶＬ
−ＣＳＦ２１４＆るいはｐＳＶＬ−ＣＳＦ２３８を利用
し、適当な制限酵素で切断してマルチクローニング部位
を持つベクターに組換え後の組換えが行い易いようにす
る０次に、シグナルペプチド部分をまったく含まず、ヒ
ト尿由来型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端に最も近い部分を適当な
制限酵素で消化後、Ｍ−ＣＳＦアミノ酸をコードするＤ
ＮＡ断片を分離回収する。この操作によって生ずる不足
したＤＮＡ配列を補うようにｆＭｅｔ（ｌＩ訳閤始コド
ン）と、不足しているＮ末端アミノ酸をコードするＤＮ
Ａをそれぞれ化学合成する。ＤＮＡの化学合成法として
は、例えばβ−シアノエチルアミダイド法あるいはＨ−
ホスホネート法を使用することができるが、他に一般的
に切られた方法も適宜使用することができる。

次に、大ａ１ｍで発現可能なベクターを構築する。

先ず、上記Ｍ−ＣＳＦアミノ酸をコードする回収ＤＮＡ
及び合成りＮＡと結合可能なように適当な制Ｆｉｌｌ素
で、発現ベクターを切断し、これら得られた断片をＴ４
ＤＮＡリガーゼで結合した後、この結合物を大腸曹に導
入し、目的の形質転換体を得ることができる。

ＤＮＡ断片の分離精製並びに回収、制限酵素や修飾酵素
の処理方法及び大■曽への導入方法等の一般的な遺伝子
組換え技術は（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ
、；　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎＬ　Ｃｏｌｄ
ｓｐｒｉｎｇ　Ｈｒａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
　（１９８９）　）に記載されている方法に従うことが
できる。

またアミノ酸配列の一部改変は、部位特異的変異（にｕ
ｎｋｅｌ。

Ｔ、＾、　ｅｔ　ａｌ、：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　ｆＬ２Ｌ４８８（１９
８５））や一部化学合成したＤＮＡを制限酵素による切
断部位を利用して導入することで行うことができる。得
られる遺伝子配列の確認はジデオキシ・チエイン・ター
ミネーションｔ＊　（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　ｅｔ　ａ
ｔ、；　Ｐｒｏｃ、　）ｌａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ
。

ＵＳＡ　　ヱム　５４６３　（１９７７））あるいはマ
クサム−ギルバート法（Ｍａｘａｇ、＾−Ｍ、ｌ　Ｇｔ
ｌｂｅｒｔ、　ｖ−：　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｓｏｌ
、　６旦　４９９　（１９８０））によって行うことが
できる。

得られた形質転換穴ＩＩＩを培養すれば、ヒト尿由来型
のＭ−ＣＳＦモノマーを製造することができる。

ここで大腿薗発現用ベクターとして利用できるものとし
ては、通常発現させようとする遺伝子の上流にプロモー
ター・オペレーター系、ＳＤ（シャインーダルガーノ）
配列、及び蛋白合成開始コドン（例えばＡＴＧ）　、下
流にターミネータ−を有するものがあげられる。

プロモーター・オペレーター系としてはＩａｃプロモー
ター・オペレーター系、ｔｒｐプロモーター・オペレー
ター系、λファージのＰＬプロモーター・オペレーター
系、ｔａｃプロモーター・オペレーター系等が用いられ
るが、ここに挙げたプロモーター・オペレーター系に限
定されるものではなく、本発明の目的を達成しうる限り
公知のものを広く使用できる。

本発明においては、発現制御のためにリブしツサー遺伝
子を導入したプラスミドを構築したり、リプレッサー遺
伝子を染色体上に持つ宿主大ａｔｉｉｉを使用すること
が有効である０例えばＩａｃプロモーター・オペレータ
ー系、ｔａｃプロモーター・オペレーター系に対するラ
クトースリプレッサー（ｌａｃｌ）や入ファージのＰＬ
プロモーター・オペレーター系に対するｃｌリプレッサ
ー及びその変異型であるｃ　Ｉ　８５７リブレツサーあ
るいはｔｒｐプロモーター・オペレーター系に対するｔ
ｒｐＲなとは広く知られており、本発明において好適に
使用できるが、さらに、使用するプロモーター・オペレ
ーター系に対応するリプレッサーを用いることが良く、
そしてここに上げたプロモーター・オペレーター系とリ
プレッサーの組み合わせだけに限定するものではなく、
本発明においては広く一般に知られている系が使用でき
る。

本発明においては、このようなリプレッサーで制御され
た大腸菌の形質発現は、種々の条件でその発現を誘発で
きる。

例えば、ラクトースリプレッサーの場合にはラクトース
またはＩ　Ｐ　Ｔ　Ｇ　（ｌ５ｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ
　ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）で、ｃＩリプレッサーある
いはｃ　１８５７リブレツサーの場合にはＤＮＡ合成阻
害剤または高温条件、例えば４２℃で、ｔｒｐＲの場合
にはＩｎｄｏｌｙｌ−３−ａｃｒｙｌｉｃ　ａｃｉｄあ
るいは１ｎｄｏｌｙｌ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉ
ｄ又はトリプトファンの枯渇で発現を誘発できるが、本
発明においては使用するリプレッサーに対応する形質発
現の誘発方法を用いれば良く、例示のみに限定するもの
ではない。

さらに、使用する発現ベクターやクローニングベクター
に前もって薬剤耐性遺伝子などを組み込み、組換え体の
選択を容易にすることもできる。この様なマーカー遺伝
子としては、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラ
ムフェニコール、カナマイシンなどの抗生物質耐性遺伝
子、あるいはラクトースオペロンのα−相補性によりＸ
−ｇａｌの分解による青色呈色反応でＤＮＡの挿入の有
無を判定できる１ａｃＺ遺伝子などがあげられるが、こ
れらに限定されるわけではなく、その目的に応じて適宜
選択して用いることができる。

本発明において得られた発現ベクターを大腸菌に導入し
形質転換体を得る方法としては一般に使用されている方
法を広く適用でき、例えば宿主大−曹を塩化カルシウム
による処理、あるいは塩化カルシウム、塩化マグネシウ
ム、塩化ルビジウム存在下に処理した後に、プラスミド
ＤＮＡと混合することで容易に行うことができる（Ｎａ
ｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ＋　Ｃｏ１ｄ釦ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　（１９８９）　）　ｅか
くして得られた形質転換体は常法に従フて培養すること
ができ、適当な発現誘導により大−菌体内にヒト尿由来
型Ｍ−ＣＳＦを生産蓄積せしめることができる。該培養
に用いられる培地としては、ＬＢ培地、Ｅ培地、Ｍ９培
地、Ｍ６３培地のような一般的に大腸菌の培養に用いら
れる培地でよく、必要に応じて通常知られている各種の
窒素源、炭素源、無機塩、ビタミン類等を添加できる。

さらに宿主大腿部の培養条件は、ｐＨ５〜９、好ましく
は７またはその付近の培地で、培養温度２０〜４６℃、
好ましくは２８〜４２℃を採用できるが、これらは目的
に応じて適宜選ぶことができる。

上記の方法で得られた培養穴ａｍは回収せしめられ、画
体中のヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦ蛋白が回収される。

本発明においてＭ−ＣＳＦＩＩ造のための好ましい方法
としては、２・シストロン法によりＭ−ＣＳＦを効率よ
く発現させる方法が例示できる。

したがって、本発明の別の目的は、２・シストロン法を
駆使してＭ−ＣＳＦを大ｍＷ等の微生物中で効率よく得
るにもある。

この２・シストロン法とは、２つの連続するシストロン
からなる遺伝子発現系であり、宿主大ｌＩＭ内に安定か
つ大量にＭ−ＣＳＦを生産蓄積できうる。

該発現方法に従う本発明の詳細な説明すれば、ファース
トシストロン（Ｆｉｒｓｔ　ｃｉｓｔｒｏｎ）　　とし
て適当なポリペプチドあるいはその一部をコードする遺
伝子と、セカンドシストロン（Ｓｅｃｏｎｄ　ｃｉｓｔ
ｒｏｎ）としてＭ−ＣＳＦ遺伝子を持つものからなる発
現プラスミドを作製する。該プラスミドのファーストシ
ストロン上流には該遺伝子発現のためのプロモーター及
びＳＤ配列が配置されているとともに、ファーストシス
トロンの終始コドンとセカンドシストロンの間にセカン
ドシストロン発現のためのＳＤ配列と開始コドンが配さ
れていることが重要である。

上記のファーストシストロンとして利用する遺伝子とし
ては宿主内で発現されるものであれば、特に制限はない
、しかし、そのファーストシストロン部により産生され
るものは本発明Ｍ−ＣＳＦと同一系内に産生されるポリ
ペプチドであるため、本発明Ｍ−ＣＳＦと容易に分離で
きる性質のものが好ましい、さらに使用するプロモータ
ー系が直接支配している遺伝子である方が好ましい、よ
り具体的にはＰＬプロモーターとＰＬプロモーターの支
配下にあるＮｉｉ白が例示できる。

使用にあたってはこのＮｔ白を最大でも１００個以下の
アミノ酸残基しかコードしないように制限酵素で切断し
、不要のＤＮＡ配列を除去後、合成りＮＡを導入して改
変する。この合成りＮＡには、改変したＮ蛋白の終止コ
ドンとセカンドシストロン発現用のＳＤ配列と開始コド
ンが含まれるようにする。さらに上流からのリードスル
ーを防ぐために、３つの読み枠（リーディングフレーム
）全てに終止コドンを導入しておくことが望ましい０本
発明においては合ｆｆＤＮＡ中の終止コドンと開始コド
ンは天然界に存在する全てのものが利用できる。

特に好ましい方法によれば、まずＰ（ブロモ−ターとＰ
ｔプａモーターの支配下にあるＮ蛋白を含む発現ベクタ
ーを作製し、該ベクターをｍ＊＊素で切断し不要のＤＮ
Ａ配列を除去後、単厘精ａする。一方ヒト尿由来ｆｆ１
Ｍ−ＣＳＦをクローニングしたベクターより、適当な刺
ｗＩ＃素で処理してＭ−ＣＳＦ遺伝子部分を回収する。

上記両回収断片のうちの不足なりＮＡ部分（Ｎａ白の終
止コドンとセカンドシストロン発現用のＳＤ配列と閤始
コドン及び刺隈＊＊処理のために不足したコドン）を補
うための合成りＮＡと、上記両回収断片を、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ等を用いて連結させることにより所望の発現ベ
クターを得ることができる。この様にして構築した発現
ベクターはすでに述べたように、Ｎ蛋白の一部をファー
ストシストロンとし、Ｍ−ＣＳＦをセカンドシスドロン
としている。この方法は、新規発現ベクターを使用した
Ｍ−ＣＳＦの発現方法であり、かつ従来発現量が少ない
といわれたＭ−ＣＳ　Ｆ　　（ｌｌａｔｅｎｂｅｃｋ、
Ｒ，ｅｔ　ａｔ　、：　　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ　　ヱ　７１１（１９８９））　、特に式（１）でＸ
＝Ｏのアミノ駿配列の発現量を増加させた点で効果が大
きい。

本発明では、好ましくは上記で得られる発現ベクターを
Ｃｌ８５７リブレツサーを持つ宿主大腸菌（例えばＮ４
８３０−１．に１２ｄｅｌｔａＨ１）に導入して形質転
換し、２・シストロン法にもとづく所望の形質転換体を
取得てきる。

かくして得られた形質転換体は、常法に従い培養できる
。

例えば、ＬＢ培地中で２６〜３７℃、より好ましくは２
８〜３２℃で振どうあるいは撹はんしながら培養し、対
数増殖期の適当な時期で培養温度を３７〜４２℃に上昇
させ、更に、一定時間例えば２〜２４時間、３７〜４２
℃で培養を行うことができる。この様な培養を行なって
宿主大ｉｉｍｔ体内に、Ｍ−ＣＳＦの凝集塊を形成せし
めることができる。この菌体を遠心で回収し、菌体を破
壊して不溶性画分としてＭ−ＣＳＦを得る。菌体の破壊
方法としては、例えば超音波処理による破壊やＮａｇａ
ｔらの方法（Ｎａｇａｉ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、：　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　ＩＬ２Ｌ７２５２　
（１９８５）　）　　によって行うことができる。

この様にして得られたＭ−ＣＳＦ凝集塊の可溶化（ここ
でいう可溶化とは蛋白實の三次構造を破壊することを意
味する）は、２〜８Ｍ尿素、４〜７Ｍ塩酸グアニジンあ
るいは０．１％（Ｗ／Ｖ）以上のドデシル硫酸ナトリウ
ムを含む緩衝液を添加し、ホモジナイザー等を使用する
ことによフて行うことができる。この柵にして得たＭ−
ＣＳＦモノマーは、種々の方法によ７て可溶化条件下に
処理して精製することができる。

この精製法としては、例えば逆相クロマトグラフィー法
、イオン交換クロマトグラフィー法、高速液体クロマト
グラフィー法、吸着クロマトグラフィー法、ゲルろ適法
などが例示できるが、前記したような方法も適用しうる
。

本発明ではさらに、この様な方法を駆使してＭ−ＣＳＦ
モノマーを精製した後、Ｍ−ＣＳＦダイマーへの再構成
（Ｒｅ−ｆｏｌｄｉｎｌりを行うことができる。この再
構成は上記のような可溶化剤を徐々にあるいは急速に除
去することによって達成される。この場合形成されるジ
スルフィド結合は自然酸化あるいは適当な酸化−還元試
薬を再構成条件下に加えることによって達成される。

まず再構成を始めるにあたり、Ｍ−ＣＳＦモノマーを上
記のような可溶化剤で可溶化変性し、還元剤を添加して
システィン残基同士のランダムなジスルフィド結合を開
裂させ、遊離のスルフィドリル基に還元することが好ま
しい、この場合のＭ−ＣＳＦモノマー蛋白の温度は５〜
］Ｏ■／１１が好ましく、以下の反応条件下で、最終の
Ｍ−ＣＳＦモノマー蛋臼濃度が０．０６〜１．０■／■
Ｉの温度範囲となることが好ましい。可溶化変性時に添
加する還元試薬として一般的なものは、２−メルカプト
エタノール（２ＭＥ）−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）
のような子オール含有成分が使用でき、使用濃度は１０
０ｍＭ以下、より好ましくは０〜２０ｍＭである。再構
成は上記のような還元試薬入りの可溶化剤を希釈、透析
等の方法を用いて、徐々にあるいは急速に除去すること
によフて達成される。この操作は通常０〜２５℃、より
好ましくは２〜１０℃で行うことができ、反応は２時閉
〜１週閏より好ましくは３時間〜６日間で達成される。

ｔた可溶化剤の濃度は尿素ならば１Ｍ以下、より好まし
くは０．５Ｍ以下で、塩酸グアニジンならば２Ｍ以下、
より好ましくは１Ｍ以下である。可溶化剤がこの濃度以
下になると破壊されていたＭ−ＣＳＦモノマー蛋白の三
次構造が戻りはじめ、Ｍ−ＣＳＦダイマー形成に好適な
条件となる。ジスルフィド結合の形成は自然酸化あるい
は上記再構成条件下に適当な酸化−還元試薬を加えるこ
とにで達成される。

この方法に一般に用いることのできる試薬としては、酸
化型及び還元型グルタチオンあるいはＤＴＴなどを例示
することができる。また、ｔｈ　ｉ　ｏｒｅｄｏｘ　ｉ
　ｎのようなｌ！業によっても再構成をおこなうことが
できる。

酸化型及び還元型グルタチオンは、１０ｍＭ以下、より
好ましくは０〜５ｍＭで使用される。また酸化型と還元
型のモル比は、ｌ：１〜ｌ：５０が使用でき１：２〜１
：１δが好適に用いられる。

こうして得られた生成物は、医薬としての有用性が前記
で説明したように期待できる。

以下実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（実施例） ！１最１ Ｍ−ＣＳＦ産生ヒト単球系ｍｔａ株（Ｕ９３７ＪＩ胞）
＃！養条件の設定 ■　細胞培養 Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９３）を５％ＣＯ２
−９５％Ａｊｒ中でｌＸ１０６個／ｓｌになるように１
０％ＦＣ５を含むＲＰＭＩ−１６４０培地２０１で培養
しく約７２時間）、ＰＭＡを最終濃度でそれぞれ０．１
Ｏ１５０，１００，２００ｎｇ／ｗｌで添加し０．２５
．０．５．１．２．４．６．１２．２０時間培養した。

更にシクロヘキシミドを最終−度０１２０．４０．６０
，８０．１１００ｕ／ｍｌで添加して、更に０．２５．
１．２．４．６．１２時間培養した。培養液を８００Ｘ
ｇで５分間遠心分離して細胞を回収し、ＰＢＳ（１５ｍ
Ｍリン酸緩衝液、０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ含有ｐＨ７゜
２）１０ｍｌに懸濁した。再度８００Ｘｇで５分間遠心
して上清を捨て、細胞を回収した。

■　ドツトハイブリダイゼーション試験上記■で得た細
胞をＷｈｉｔｅとＢａｎｃｒｏｆｔの方法（Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ。

Ｃｈｅｓ、＋　　ｚ旦ヱ　８５６９　（１９Ｂ２））に
従って１０ｍＭＴｒｉｓ−ＭＣＩ　（ｐＨ７，０）−１
ｍＭ　　ＥＤＴＡ４５μｌに懸濁し、６％ＮＰ−４０溶
液を５μｍ加えて溶解後１５０００ｒｐｍで遠心した。

この遠心上清５０ｕ　Ｉに２０ＸＳＳＣ（ＩＸＳＳＣは
０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍｔｒｉｓｏｄｉ
ｕ＋ｓ　ｃｉｔｒａｔｅ）　　３０　ｕ　１と３７％（
Ｗ／Ｖ）ホルムアルデヒド２０μｌを加え６０℃、１６
分間熱処理した後に、４倍希釈列をとってニトロセルロ
ースフィルターにプロットし、実施９４３の方法に従っ
て”Ｐｌ［１〜ｌシた合成りＮＡプローブを２Ｘ１０＠
ｃｐｍ／−１の濃度で含むハイブリダイズ溶液を用いて
５４℃２０時閏ハイブリダイゼーションを行った。

オートラジオグラフィーの結果ＰＭＡ　　５０ｎｇ／■
１で６時ｒＩ！ｆ培ＩＩＩシクロヘキシミド２０μｇ／
ｌで４時閏培養するという条件で、最も希釈されたドツ
トまでシグナルが得られた。

犬施璽部− Ｕ９３７細胞からのｍ　ＲＮ　Ａ画分の調製■　ｍＲＮ
Ａ１ｌＩ用Ｕ９３７細胞）培養実施例１−■の結果より
、Ｕ９３７細胞を５％ＣＯ２９５％Ａｉｒ中でＩ　Ｘ　
１０６個／■１の細胞濃度になるまで１０％ＦＣ５含有
ＲＰＭｒ−１６４０培地で培養（約７２時間）し、ＰＭ
Ａを終濃度５０ｎｇ／■１で添加して６時間培養した後
に、シクロヘキシミドを終濃度２０μｇ／霞１で添加し
て、さらに４時閏培養した。こうして得られた細胞を８
００Ｘｇの連続遠心機（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　
Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　Ｃｏ、製）で回収し。

ＰＢＳ　（５ｍＭリン酸緩衝液、０．１５Ｍ　　ＮａＣ
ｌ含有ｐＨ７，２）５００ｍｌに１！濁した後更に１１
０００ｒｐで５分間遠心して上清を捨てるという方法で
洗浄した。同様の洗浄操作を２回行フた後に、回収纏１
！（約７．６ｇ）を−８０℃で使用時まで保存した。

■　ｍ　ＲＮ　Ａの抽出 細胞の全ＲＮＡを抽出する方法は主に既知のグアニジン
チオシアネート法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ、Ｍ、　ｅ
ｔ　ａｌ、：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

、Ｌｆｌ　５２９４　（１９７９））て行った。７．６
ｇの細胞を出発材料として６Ｍ　　Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ
Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−５ｍＭＳｏｄｉｕ■Ｃ１ｔｒ
ａｔｅ−０，５％　Ｎ　−Ｌａｕ　ｒｙ　ｌ　５ａｒｃ
ｏｓ　ｉ　ｎｅ　ｓｏｄ　ｉ　ｕ＋ｌ５ａｌｔ−０，１
Ｍ　　２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ溶液６０１
に懸濁し、ホモジネート後５．７Ｍ　Ｃｅｓｉｃｎｇ　
Ｃｈｌｏｒｉｄｅ−０，２Ｍ　　ＥＤＴＡ溶＊５ｍｌを
含む１６１の遠心チューブに各々１０１ずつ重層し、２
７００Ｏｒｐｍで２４時間遠心分ＩＩ（ＳＲＰ２８ＳＡ
Ｉローター、日立製作所１ｍ）を行い６．Ｅｌ＊ｇの全
ＲＮＡ画分を得た。得られた全ＲＮＡ画分的６．８■を
２０ｍＭＴｒｉｓ−ＭＣＩ　　（ｐＨ７，５＞−５００
ｍＭ　　ＮａＣｌ−１ｍＭＥＤＴＡ−０，１％　Ｎ−Ｌ
ａｕｒｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ　ｓｏｄ＋ｕ＠５ａｌｔ
溶液３０１１に溶解し、前記の緩衝液で予め平衡化して
おいたオリゴｄＴ＋２−＋＠ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（１，
ＯＸ２．　Ｏｃｓ、ファルマシア１ｉＴｙｐｅ？）のカ
ラムクロマトグラフィーを行いＰｏ１ｙＡ″ＲＮＡ画分
として２０ｍＭ　　Ｔｒｙｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）
１００ｍＭ　　ＮａＣ１１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　０．１
％　Ｎ−Ｌａｕｒｙｉｓａｒｃｏｓｉｎｅ　ｓｏｄｉｕ
ｍ　５ａｌｔで洗浄した後１ｍＭＥＤＴＡ−０，１％　
Ｎ−Ｌａｕｒｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ　ｓｏｄｉｕｍ　
５ａｌｔ溶液で溶出することで回収（約２９０μｇ）し
た。

ここで得たｍ　ＲＮ　Ａの１５０ｔ１ｇを５〜３０％の
ショ糖密度勾配（１３ｍｌ）の上に重層し、５ＰＲ２Ｂ
ＳＡＩローター（日立製作新製）で１５℃、２４００Ｏ
ｒｐｍ、１８時間遠心分離した０次いで内容物を３０本
（各４５０μｌ）に分画した。各画分に１７２等量の７
．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え混合後２等量のエタノー
ルを加えて一２０℃で一夜放置し、ｍ　ＲＮ　Ａを沈殿
回収した。

沈降定数の標準マーカーとしては１６Ｓ、１８５．２３
Ｓ、２８Ｓ、のりボソームＲＮＡを使用した。

ン 実施例２−■のｍＲＮＡ中にＭ−ＣＳＦ遺伝子をコード
するｍＲＮＡがどの様なサイズの画分に含まれているか
検討するために３２ｐ標識合成りＮＡプローブを用いる
ノザンハイブリダイゼーションを行った・ 特開昭６４−３４９９８号に記載のヒト尿中から精製し
たＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列（Ｎ末端より４４残基）の
情報に基づいて、合成プローブとして下記の塩基配列を
用いた。

’Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−
１１ｅ”Ｓ　’ＧＡＧ−ＴＡＣ−ＴＧＴ−ＡＧＣ−ＣＡ
Ｃ−ＡＴＧ−ＡＴＴ３’３　’　ＣＴＣ−ＡＴＧ−ＡＣ
Ａ−ＴＣＧ−ＧＴＧ−ＴＡＣ−ＴＡＡ　Ｓ　’２６Ｇ　
Ｉ　ｎ−Ｍｅｔ−Ｇ　ｌｕ　−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｃｙｓ
−Ｇ　ｌ　ｎ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｕ　”
Ｓ　’　ＣＡＧ−ＡＴＧ−ＧＡＧ−Ａ　ＣＣ−ＴＣＧ−
ＴＧＣ−ＣＡＧ−Ａ　ＴＴ　−ＡＣＡ−ＴＴＴ−ＧＡＧ
　３　’３　’ＧＴＣ−ＴＡＣ−ＣＴＣ−ＴＧＧ−ＡＧ
Ｃ−＾ＣＧ−ＧＴＣ−ＴＡＡ−ＴＧＴ−ＡＡＡ−ＣＴＣ
５’上記式に示した塩基配列に対する相補的な塩基配列
（各々３段目に示す）を、プローブとして合成した。こ
の塩基配列を合成するにあってはＢｉｏｓｅｒｃｈ　　
８６００　Ｄ　Ｎ　Ａ合成装置（Ｍｉ　Ｉ　ｌ　１ｐｏ
ｒｅ社製）を用い２〜３．５時間反応させた。得られた
ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド精製カートリッ
ジ（アブライドバイオシステムズジャパン社製）で精製
した。

このようにして化学合成により得られた相補的な塩基配
列各２ｎ習ａｌｅ／ｍｌを、ポリヌクレオチドキナーゼ
２００ｕｎｉｔ／−（Ｔ４ファージが感染した大ｌｉｍ
由来Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）で３７℃、３０分
間５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７，６）−０，
ＯＩＭ　　ＭｇＣ１２−５ｍＭ　　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒ
ｅｉｔｏｆ−０，１ｍＭ　　Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ−０
，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ緩衝濯中で処理しプローブとなる
これら２１及び３３塩基の５゛末端の水酸基に〔γ−ｆ
ｆ２Ｐ）ＡＴＰのリン酸基を転移させ、３２ｐ標識した
２種類のプローブを作製する。各々の比放割活性は６Ｘ
１０６　ｃｐｍ／ｐｏｏｌである。

一方、実施例２−■で取得したｔｏｔａｌ　Ｐｏ１ｙ　
Ａ”ＲＮ　Ａ２８ｇづつをＭＯＰＳ　（２０ｍＭ）−ホ
ルムアルデヒド（２，２Ｍ）を含むアガロース電気泳動
（６０Ｖ、６時間）（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　ｅ
ｔ　ａｔ、；　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｒ＋＋ｎｇ
、　　ｐ　２０２（１９８０）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を行い、ニ
トロセルロースフィルターに２０ＸＳＳＣ（Ｉ　Ｘ５Ｓ
Ｃは１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ　　Ｎａ
ＣＩ）の条件でトランスファーし、８０℃、５時間の加
熱処理下にて固定しプレハイブリダイズ液（０，９Ｍ　
　ＮａＣｌ、帆０９ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　　ｐＨ７−５
，６ｍＭ　　ＥＤＴＡ、２Ｎａ、０．５％Ｎ−ラウロイ
ルサルコシン酸ナトリウム、０．４１℃ｇ／−１変性サ
ケ精子キヤリアＤＮＡ）５０ｗｌ中５４℃で一夜処理し
た。これに前記の３２ｐ標識した合成りＮＡプローブ６
×１１０６ｃｐを含むプレハイブリダイズ液３−１中５
４℃で２０〜４０時間ハイブリダイズさせた。

ｅｘｓｓｃ、０．６％Ｎ−ラウリルサルコシン酸ナトリ
ウム溶液５００ｓｌｌ？室温で２回、５４℃で２回洗浄
、風乾燥後コダックＸＡＲ−５フィルムを使用してオー
トラジオグラフィー（−８０℃、−Ｓ露光）を行った。

マーカーとしては１６５．１８５．２３Ｓ、２８Ｓ、の
りボゾームＲＮＡを使用した。その結果２６．２−２６
．６Ｓ付近（４，４５−４゜７Ｋｂｐ付近）に、２本の
プローブともに反応するバンドを認めた。

犬胤医産 ｃＤＮＡライブラリーの作製とスクリーニング■　ＣＤ
ＮＡ合成とｃＤＮＡライブラリーの作製実施例３の結果
から、実施例２−■て分画した画分２２．２３　（２４
，７Ｓ−２７，Ｉｓ）のｍ　ＲＮ　ＡをｕＩ型としてＣ
ＤＮＡ合成を行った。即ち、実施例２−■で得られたｍ
ＲＮＡ画分５ｕｇ１ｔＲＮａｓｅ　　ｆｒｅｅ水２０μ
ｍに溶解し鋳型とし、オリゴ（ｄＴ）　＋２−１８をブ
ライマーとする、ファルマシア製のＣＤＮＡ合成キット
を用いて　Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄＲｅａｃｔｉｏｎ
　Ｍｉｘ中３７℃、６０分間反応させ、続いてこの反２
液３２　ｕ　Ｉ　Ｉｔ　５ｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ　
Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘに入れ１２℃、６０分間、次
に２２℃６０分間反応した。次に１μｌのＤＮＡポリメ
ラーゼ■クレノウフラグメントを力え３７℃３０分間反
応させ２末鎖ｃＤＮＡを合成した０反応は等量のフェノ
ールクロロホルムイソアミルアルコール（５０：５０：
１）混液を加えて止め、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心
分離し、上清を分取した。この上清に半量の７．５Ｍ酢
酸アンモニウムを加え、次に２．５等量のエタノールを
加えて一８０℃で３０分間エタノール沈殿を行い、次に
１５００Ｏｒｐｍ、３０分間遠心分離して２末鎖ｃＤＮ
Ａ（約１．５ｇｇ）を沈殿として回収した。この２末鎖
ｃＤＮＡ１μｇとＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　’Ｊンカー５μｍ
をライゲーションキット（宝酒造社１ｍ）のＡ液３０μ
１．Ｂ液７．５μｌ中１２℃、−晩ライゲーション後、
前記のエタノール沈殿を行い、ＤＮＡを回収した。この
ＤＮＡを０．８％アガロースゲルでラムダファージの）
（ｉｎｄｍカットをマーカーとして電気泳動（１００Ｖ
、２時間）を行い、３−５Ｋｂｐの部分のゲルを切り出
し、２末鎖ｃＤＮＡを回収した。前記のライゲーション
キットを用いて、この回収ｃＤＮＡを入ｇｔｌｏ（ｌｕ
ｇ）のＥｃｏＲＩ部位に１６℃、−晩のライゲーション
を行って組込み、次にエタノール沈殿して回収し、５μ
ｍの１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７゜５）−
１ｍＭ　　ＥＤＴＡに溶解した。この内５μｌをガイガ
バックゴールド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｌ！　）のＦｒ
ｅｅｚｅ／　Ｔｈａｗ　ｅｘｔｒａｃｔに氷冷下で加え
、ざらに５ｏｎｉｃ　ｅｘｔｒａｃｔ　１５　ｕ　Ｉを
加えて２２℃で２時間インキュベートしてパッケージン
グ後、０．５ｇｍのＳＭ培地（５，８ｇ　　ＮａＣｌ、
２．Ｏｇ　　Ｍｇ５Ｏａ、５０ｍ１１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　　（ｐＨ７，５）　、５ｍ１２％Ｇｅｒａｔｎ
をｌｌ中に含む）を加え、２０μｌのクロロホルムを添
加した後に１５００Ｏｒｐｍで３０秒遠心し、上清を回
収し４℃で保存した０次に大ｌＩ曹Ｃ６００Ｈｆ　Ｉの
単一コロニーを１０ｍＭ　　Ｍｇ５Ｏａと０．２％Ｍａ
　Ｉ　ｔｏｓｅを含むＴ　Ｂ　［ｔｒｏｔｈ（１１中に
５ｇ　　ＮａＣｌ、　１０ｇ　Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏ
ｎｅ）　５００■１に接種し３０℃で一晩培養した。２
００Ｏｒｐｍ、１０分間遠心して集菌し、Ｏ，Ｄ、ａ＊
＠ｎｍが０．５となるように１０　ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｓ
　Ｏａ　ｌ！ＩＩした。この大膓薗懸濁液０．２−に、
前記のリコンビナントファージ保存液をＳＭ培地で５×
１０’　ｐｆｕ／ｍｌに希釈したものを０．１１加えて
、３７℃１５分間保温した。続いて予め４８℃に保温し
ておいたＮＺＹ軟寒天培地（５ｇ　　ＮａＣｌ−２ｇ　
　Ｍｇ５Ｏａ７Ｈ２０，５ｇＹｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃ
ｔ、　１０ｇ　　ＮＺ　　ａｗｕｎｅ、　７ｇ　Ｂａｃ
ｔｏａｇａｒを１１中に含む）３−１を加えて混合した
後、直径１０ｃｍのシャーレに作ったＮＺＹ寒天プレー
ト（５ｇ　　ＮａＣ１，２ｇＭｇ５Ｏｎ７Ｈ２０，５ｇ
　　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、　１０　ｇ　　Ｎ　
Ｚａｍｉｎｅ、　１５　ｇ　Ｂａｃｔｏａｇａｒをｌｌ
中に含む）に重層し３７℃にて一晩培養した。尚、同様
の操作を合計１０枚のシャーして実施しｃＤＮＡライブ
ラリーを作製した。約５０．０００個のプラークを得た
。

■　ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング前記のｃＤ
ＮＡライブラリーについて、Ｍ−ＣＳＦ活性を有するポ
リペプチドをコードするｃＤＮＡを含むファージのプラ
ークをスクリーニングするために１２ｐ標識合成りＮＡ
プローブを用いるプラークハイブリダイゼーション試験
を行った。プラークハイブリダイゼーションはＭａｎｉ
ａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　
ｐ　３２６　（１９Ｂ　２）　　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇｌ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の方法に従
フて行フた０部ち、前記■で得たプレート上のファージ
プラークにニトロセルロースフィルターを乗せてファー
ジを写し取り、０．Ｆ５Ｍ　　ＮａＯＨ−１，５Ｍ　　
ＮａＣｌを染み込ませた濾紙の上に置いて５分間処理し
た０次に０．５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（Ｅ）８７．
５）　−１，５ＭＮａＣｌで５分間中和し、２ｘＳＳＣ
で６００１で６分間処理した後に、８０℃２時間の処理
をして組換え体ファージＤＮＡをニトロセルロースフィ
ルターに固定した。

このフィルターをブレハイブリダイズ液１００ｓｌ中で
５４℃−晩ブレハイプリダイズを行った後に、４ＸＩＯ
’ｃｐｍのプローブを含有するブレハイブリダイズ液２
０１中で５４℃、４０時間ハイブリダイズさせた。フィ
ルターの洗浄及びオートラジオグラフィーは実施例３の
方法に従って行った。３２Ｐ標識合成りＮＡプローブは
実施例３の方法で合成されたものを用いた。その結果的
５０．０００個のプラークから２種のプローブの両方に
ともに反応する１０個のプラークを得た。

各々のプラークからＰｅｒｂａｌの方法（Ａ　ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ　ｇｕｉｄｅ　ｔ。

ｓ＋ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｐ　１７１　
（１９８５）　　Ｊｏｈｎ　ｌ＋ｆｉｌｅｙ　＆５ｏｎ
ｓ　Ｉｎｃ、）に従って朝換えファージＤＮＡを！１ｌ
ＩＩｌシ、ＥｃｏＲＩで部分消化後、０．８％アガロー
スゲル電気泳動を行い、ゲルを０．２５Ｍ　　ＨＣ１５
００ｍ１で１５分間、２回酸処理後、蒸留水５００１て
２回、５分間洗浄した。さらに、５００１００．５Ｍ　
　ＮａＯＨ−ＩＭ　　ＮａＣｌで１５分間、２回アルカ
リ処理し、５００１の０．５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（
ｐＨ７，５）　　３Ｍ　　ＮａＣｌで１５分間、２回中
和し、２０ＸＳＳＣの条件下でニトロセルロースフィル
ターにトランスファーした。８０℃で２時間処理をし、
ＤＮＡを固定した後、サザンハイプリダイゼーション（
ハイブリダイズの条件は前記のプラークハイブリダイゼ
ーションと同＄１）を行い、最も長いインサートを持つ
ファージクローンλＣＳＦ１−１を選択した。

実１１１迂 プラスミドへのクローニング ■　プラスミドへの總換え 実施例４で得た胡換え体ファージ入ＣＳＦ１−ＩＤＮＡ
５０μｇｌｔＥｃｏＲＩ　　２ｕｎｉｔｓ、３７℃で５
分間反応し部分切断後、０．８％アガロースゲル電気泳
動（１００Ｖ、２時間）を行い約４．０ＫｂｐのＤＮＡ
断片２．５μｇを回収した。

この断片をプラスミドｐ　ＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔＵ　Ｓ
　Ｋ　＋　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲ１部位
にライゲーションキット（宝酒造社１１）を用いて１６
℃−晩ライゲーションした。一方、予め０−　Ｄ−＊ｓ
＊ｎｍが０．５になるまでＬＢ培地（５ｇ　　ＮａＣ１
，１０ｇ　　Ｂａｃｔｏｔｒｙｏｕｔｏｎｅ、　　５　
ｇ　　Ｙｅａｓｔ　ＥｘｔｒａｃｔをＩＩ中に含む）２
００ｍｌで培養しａｏｏｏｒｐｍ、１０分間遠心して集
菌した大躇薗ＪＭＩ０９を、５０ｍＭ　　ＣａＣｌ２１
００１に懸濁し水冷下で１時間おき、再度４００Ｏｒｐ
ｍ、１０分間遠心して集菌し、次に０　、　Ｉ　Ｍ　　
Ｃ＆　Ｃｌ　２−１４％ｇｌｙｃｅｒｏ１２０ｍｌに懸
濁し１１１づつ小分けして一８０℃で保存しておいた。

この大１１１ｒＪＭ１０９のコンピテントセル０゜２１
に上記のようにして製造した組換えベクターを導入し、
１０μｇ／１１のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にＩ
ＰＴＧ５ｍＭ、Ｘ−ｇａ　ｌ　４０μｇ／ｍｌ存在下で
まき、３７℃で一夜培養した。白色のコロニーとして組
換え体を得た。

■　組換え体の選択 前記で得たコロニーを５個無作為に選択し、１０−１の
ＬＢ培地中、３７℃で一夜培養した。この菌体からアル
カリ−５ＤＳ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，ｉ　Ｄ
ｏｌｙ、　Ｊ、：　１ｌｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、。

ヱ　１５１３　（１９７９）　）でプラスミドを調整し
た。まず１５０００ｒ　ｐｍ、３０秒遠心して菌体を回
収し、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ緩衝液（５０ｍＭ　　Ｇｌｕｃ
ｏｓｅ、　　２５ｍＭ　　Ｔｒｙｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８
，０）、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ）６００μｌに懸濁した
。

この懸濁液に１０ｗ／ｍｌ　Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　４００
　ｕ　ｌと１０ｍｇ／ｍ１ＲＮａｓｅ　　ＡＩＯμ！を
加え室温で５分間おいた後に、０゜２ＮＮａＯＨ−１％
５ＤＳ２０００μＩを加え氷上に５分間おき、さらに５
Ｍ酢酸カリウム１５００μｌを加えて氷上に５分間おい
た。１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心して上清を回収し
、フェノールクロロホルム処理後、エタノール沈殿によ
りプラスミドを回収した。各々約１０μｇのプラスミド
が得られた。得られたプラスミドｌμｇｉｅＥｃｏＲＩ
ｏ、０１ｕｎｌｔで３７℃、５分間部分消化あるいはＸ
ｂａｌ１０ｕｎｉｔとＨｉｎｄｍｌｏｕｎｉｔで３７℃
１２０分間切断した後、０゜８％アガロースゲル電気泳
動（１００Ｖ、２時間）を行い、目的とする断片（約４
．０Ｋｂｐ）を含むクローンを選択した。約４．０Ｋｂ
ｐの断片を含むプラスミドをｐＢｓＩＩｃｓＦと命名し
た。（第４図）このプラスミドｐＢｓ［ｒｃｓＦを保有
するＥ、ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９株は工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。（微工研条寄第２５
２６号［ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２５２６１）。

■　ｐＢｓＵｃｓＦの再クローニング 上記■で得たｐＢｓＩＩｃｓＦを５ｊｊｇをＥｃｏＲｌ
ｌｏｕｎｌｔで３７℃、１２０分間で完全消化し、０．
８％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２ＷｔＩ問）
を行い約１．８５Ｋｂｐと約２．１Ｋｂｐの２本の断片
を回収した。各々１μｇをプラスミドｐＢＳ　（１）　
　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｌｌ）のＥｃｏＲＩ消化した
もの０，１μｇと実施例５−■の方法に従ってライゲー
ションし、Ｈ４」Ｌ立１」−ＪＭ１０９コンピテントセ
ルに導入し、実施例５−■の方法に従って処理し白色の
コロニーとして検出される組換え体を得た。ここで得た
コロニーを各々４個ずつ無作為に選択し、上記■の方法
でプラスミドを調整した。このプラスミドＤＮＡ１μｇ
をＥｃｏＲｌｌｏｕｎｉｔで３７℃、１２０分間消化後
、０．８％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間
）を行い、目的とする断片（約１．８５Ｋｂｐあるいは
２．１Ｋｂｐ）を含むクローンを選択した。

１．８５ＫＭ断片を含むプラスミドをｐＢＳＳ、２．Ｉ
Ｋｂｐ断片を含むプラスミドをｐＢＳＬと命名した（第
５図）。

文胤医旦 クローン化ＤＮＡの塩基配列の決定 ■　制限酵素地図の作製 実施例５−■及び５−■で得られたｐＢｓ［Ｉｃ５Ｆ、
ｐＢＳＳ及びｐＢｓｔ、を含む菌株をそれぞれ１００μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１リットルで３
７℃、−晩培養し、次に６００Ｏｒｐｍ、１０分間遠心
して菌体を得た。この菌体からプラスミドｐＢｓ］Ｉｃ
５Ｆ、ｐＢＳＳ及びｐＢＳＬを大量に回収した（Ｍａｔ
ｓｕｂａｒａ、に、　ｅｔ　ａｌ、：　Ｊ、　Ｖ＋ｒｏ
１．、　Ｌ旦４７９　（１９７５）　、松原謙−１蛋白
質　核ａｔｅ素　別冊核酸実験法、下、ｐ９共立出版（
１９７３）　）、まず回収した菌体をＴＢＳ緩衝液（３
０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　＜ｐＨ８゜０）　、５０
ｍＭ　　ＮａＣ１，５ｍＭ　　ＥＤＴＡ）３０＋ｌに懸
濁し、６０００ｒｐｍ、１０分間遠心して再度菌体を回
収した。この菌体を２５％５ｕｃｒｏｓｅを含むＴＥＳ
ＩＩ衝液３０−１に１！１１し、２５０ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ５ｍｌと５　ｗｓ　／−Ｉ　　Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　１
０１を加え３７℃、４０分間インキニーベートし６■／
１Ｐｒｏｎａｓｅ　５＊Ｉを加え、さらに３７℃、３０
分閏処理した。この溶液に１０％ＳＤ５５ｍｌと５Ｍ　
　ＮａＣ１ｆ３＋Ｉを加え４℃で一晩保存した。この溶
液を５０００Ｏｒｐｍ、２時間遠心して上清を回収後、
２．５倍量のエタノールを加えることによりエタノール
沈殿した０次に１１００００ｒｐ、５分間遠心して沈殿
を回収した。この沈殿を０．４％Ｎ　−Ｌａｕｒｙｌｓ
ａｒｕｃｏｓｉｎｅ　Ｓｏｄｉｕｍ　５ａｌｔを含むＴ
ＥＳＩ［衝液２０１に３７℃で完全に溶解させた。この
＠＠２０ｇ１に２０ｇのＣｓＣ１を加え、さらに１０■
／１のエチジウムブロマイド１ｍｌを加え、次に１２Ｐ
Ａシ一ルチユーブ２本に分けて４５０００ｒｐｍ、２０
時間遠心しプラスミドを回収した。各々２．０■、２．
４−１２．２■のプラスミドを得た。

各々のプラスミドを次項で述べるＭ１３ｍｐ１Ｂ、１９
に導入できる制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳
動を行い、制限酵素地図を作製した（第６ｒＭ）。

すなわち各プラスミド２μｇをとり各制限酵素用の緩衝
液１００μｍに入れ、次に各制限酵素１０ｕｎｉｔを加
え１２０分間反応し、次にアガロースゲル電気泳動（１
００Ｖ、２時間）にかけ、断片の大きさを分析した。

■　クローン化ＤＮＡの塩基配列の決定各プラスミド５
μｇを各制限酵素用緩衝液１００μＩに溶解し各制限酵
素を１０ｕｎｉｔ反応させて、断片化させた後に０゜７
．１．０．１．２．１．５．１．８％のアガロースゲル
電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、目的の断片の部
分をゲルから切り出しＧｅｎｅｃｌｅａｎ”（Ｂｉｏ　
　１０１社製）に従ってＮａｌ溶液でゲルを溶解し、ガ
ラスミルクにＤＮＡを吸着させ、洗浄液で洗浄し、菖留
水で溶出した。この断片と、Ｍ１３ｍｐ　１８ＲＦある
いはｍｐ１９８Ｆのマルチクローニング部位を各断片が
導入可能なように制限酵素で切断したものとを、前述の
ライゲーションキットの方法でライゲーションし、次に
大１１１１ＪＭ１０９のコンピテントセル（前述）に導
入し、ＪＭＩ０９を指示菌として用いＬＢ寒天プレート
上にＬＢ軟寒天に混合してまいた。３７℃で一晩培養し
、得られた組換え体ファージプラークから一本鎖組換え
体ファージを調製した。クローン化ＤＮＡの塩基配列の
決定はＭｅｓｓｉｎｇらの方法（Ｇｅｎｅ、　ＬＥＬ　
　２６９　（１９Ｂ２）　）に従ってｃＤＮＡ断片をＭ
１３ｍｐ１８またはｍｐ１９にサブクローニングした後
、Ｓａｎｇｅｒらの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃ
ａｄ　。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　’Ｌ！Ｊ、−５４６３（１９７７）
　、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

迂λ７２９　（１９８２）　）に従ってジデオキシ・チ
エイン・ターミネーション法により、ブライマーをアニ
ール、Ｓｅｑ　ｕ　ｅ　ｎ　ａ　ｓ　ｅ　”　（Ｕｎｉ
ｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉ。

ｎ）による相補鎖合成（Ｃａ−”５）ｄＣＴＰ　（１５
００Ｃｊ／−５ｏｌ）で標識）、ゲル電気泳動及びオー
トラジオグラフィーをそれぞれ行ってなされた。

第７図に塩基配列の決定に用いた制限酵素切断部位と塩
基配列を決定した方向及び範囲を矢印で示す、矩形で描
いた部分はＭ−ＣＳＦの■訳霞域をコードする部分を示
す。

その塩基配列は第１１！ｌの通りである。第１８６ない
し１８４７番目はＭ−ＣＳＦの前駆体をコードすると推
定される塩基配列である。

このうちｌｌ１２８２番目からがＭ−ＣＳＦをコードし
ていると考えられ、Ｗｏｎｇらが５ｃｉｅｎｃｅ　　ｚ
ユ旦１５０４　（１９８７）に報告したＭ−ＣＳＦとは
、第３７６番目のアミノ酸がＬｅｕ　（ＣＴＧ）である
のに対し、Ｐｒｏ（ＣＣＧ）である点が異なっている。

終止コドン（ＴＡＧ）は第５２２を目のアミノＩＩ（Ｖ
ａｌ）のコドンに続いて存在する。またコドンの縮重の
ためペプチドコード部位でアミノ酸の違いは認められな
いが、第１２８０番目のＡがＣに、第１７１８番目のＴ
がＣにと異なっている。また第１〜４０番目の配列はり
ｏｎｇらの配列中には全くない配列である。ペプチドコ
ード部位以外では他に第２２９６番目のＣがＴに、第３
０９１番目のＣがＴに、第３３４６番目のＴがＧにと異
なっている。これらの塩基配列の違いにより新たな制限
酵素部位が出現している。

宜Ｊ！Ｊ［。

ＣＯ５−７細胞での発現 ■　発現ベクターの構築 実施例５−■で得たプラスミドｐＢＳＳ２μｇをＥｃｏ
Ｒｌ　１０ｕｎｉｔで１２０分間消化し０．８％アガロ
ースゲル電気泳動（１００Ｖ、２Ｍ１問）を行いＭ−Ｃ
ＳＦｃＤＮＡを含む断片（約１．８５Ｋｂｐ、２００ｎ
ｇ＞を回収した。この断片２００ｎｇをプランティング
キット（宝酒造社製）を用いて３７℃、５分間Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ存在下で反応させ、末端をプラントエン
ド化し、フェノール抽出後エタノール沈殿により回収し
た。一方、動物細胞用発現ベクターｐＳＶＬ（ファルマ
シアＩＩ）　２　ａ　ｇｔｔｓｍａ　Ｉ　１０ｕｎ＋ｔ
で３０℃１２０分間消化し、上記Ｍ−ＣＳＦｃＤＮＡ断
片と実施例５−■の方法に従ってライゲーションさせた
。このライゲーション物を大腸菌ＨＢＩＯＩコンピテン
トセルｏ、３１に導入し、ＬＢ寒天プレートにまき３７
℃−晩培養しクローンを得た。

クローンより前出のアルカリ−５ＤＳ法でプラスミドＤ
ＮＡを約２０ｔｔｇ精製し、制限酵素によるマツピング
にてＭ−ＣＳＦｃＤＮＡ断片の挿入方向を調べた。その
結果プロモーターと同方向にＭ−ＣＳＦｃＤＮＡ断片が
挿入されたベクターｐＳＶＬ−ＣＳＦと逆方向に挿入ざ
レタヘク９−　ｐ　Ｓ　Ｖ　Ｌ　−ＣＳＦ（−）を得た
（第８１！Ｉ）。

■　ＣＯ５−７細胞での一過的発現 ２０μｇ（ＤＤＮＡ　（ｐＳＶＬ−ＣＳＦ、ｐＳＶＬ−
ＣＳＦ（−）　、ｐＳＶＬ）　を’）’、を酸カルシウ
ム法（Ｏｋａｙａｍａ、　ｅｔａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃ
ｅ１１．　Ｂｉｏｌ、ヱ　２７４５　（１９８７）　）
によりＣＯ５−７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）に導
入した。

即ち、１００ｍプレート上にＩＯ％ＦＣ５を含むＤ−Ｍ
ＥＭ培地１０１中にｌＸ１０”個のＣＯ５−７Ｊ１１胞
をｒきコミ、３７℃、５％ＣＯＲ下で終夜培養した。！
日、２０ｕｇ（ｆＪＤＮＡを１ｇ＋１１７）ＣａＣ１２
ＢＢＳバッフ７−（０，１２５ＭＣａＣ１２，２５ｍＭ
　　ＢＥＳ　（ｐＨ８，９５）　、１４０ｍＭ　　Ｎａ
Ｃ１，０，７５ｍＭ　　Ｎａ２ＨＰＯａ）に１！濶後、
室温で２０分放置し、共沈殿物を作成した。これをＣＯ
５−７細胞に加え、３７℃、３％ＣＯ２下で約１０時間
培養した。

約１０時間後４％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地で２回細
胞を洗浄後、５１０４％ＦＣ３を含むＤ−ＭＥＭ培地を
加え３７℃、５％ＣＯ２下で３日問培養した０回収した
培養上清につき、ＣＳＦ活性と形成されたコロニーの形
態を調べた（第１表）。

第１表 ＥＩＳＶＬ−ＣＳＦ　　　　　　１．４００　　９８．
５　　０．０　　　＋、５９ＳＶＬ−ＣＳＦ（−＞　　
　　　　２５　　８４．０　　４．０　　　＋２．０Ｃ
ＳＦ活性測定法 基本的にはＰｌｕｚｎｉｋ、　５ａｃｈｓ　（Ｊ、　Ｃ
ｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　ｆＪ−旦。

３１９　（１９６５）　）　、８ｒａｄｌｅｙ、　Ｍｅ
ｔｃａｌｆ　（Ａｕｓｔ、　Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｂｉｏｔ、　Ｍｅｄ、、　■、　２８７　（１９６６）
　）　、Ｔｓｕｎｅｏｋａ。

５ｈｉｋｉｔａ（ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ、ヱヱ、
２４３　（１９７７））の方法に準拠して行なフた。ウ
マ血清０．２ｍ１（終濃度２０％）、Ｌ、６％寒天０．
２ｍ１（終濃度０．３２％）、等張の２倍濃度のマツコ
イ５Ａ培地ｏ、２１、Ｉ　Ｘ　１０’ｃｅｌｌｓ／ｍの
マウス骨髄細胞浮遊液０．１１の割合で混合した軟寒天
培地を調製し、Ｍ−ＣＳＦ　（１００１１位）または検
体０．３ｍを含む直径３５−のプラスチックベトリ血に
０１７１ずつ播いた。寒天が固化した後に３７℃の５％
炭酸ガスインキュベーター内で７日間培養した。７日後
に倒立１ＩＩＩＨ下で、細胞数５０個以上の集落をコロ
ニーとして計数した。なおＣＳＦの１単位とは上記培養
条件下で１個のコロニーを形成するＣＳＦ活性を表わす
、なおコロニーの同定は下記の二つの方法に従って行っ
た。

（Ｉ）　ヘマトキシリン染色法（Ｍ、Ｃ，Ｍｕ　ｌ　Ａ
、Ａ、　Ｖｕｎｉｓ、　Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　比丘７７　（１９８０
）　　：以下の操作による。まず−週間培養した細胞を
軟寒天培地とともに３０％酢酸−エタノール溶液中で３
０分１１１ｆｆ固定しｋ。

固定後１００％、７０％、５０％の各エタノール溶液で
順次洗浄した後、寒天をガラス板に移しフィルム状にな
るまで室ｔｇで乾燥した。ヘマトキシリン溶液（武藤）
で染色後、顕微鏡下で細胞の大きさと核形を観察し単級
−マクロファージ系の細胞と顆粒球系の細胞の分別を行
なった。

（ｎ）　　エステラーゼ二重染色法（Ｌ、Ｔ、Ｖ＆ｌｌ
　ｅｔ、ａｌ、、＾―、Ｊ。

（ｄｉｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、、　ｆ：＋２−、２８３　
（１９７９）　；実験動物の血液学、ソフトサイエンス
社（１９８１））軟寒天のプレートをリン酸緩衝ホルマ
リン−ア七トン冷溶液（ｐＨ６，６）中に３０秒問浸し
て細胞を固定した。水洗、風乾後、１−ナフチルブチレ
ートを特徴とする特異的エステラーゼ染色と、２−ナフ
トールＡｓ−Ｄクロルアセテートを基賀とするクロルア
セテートエステラーゼ染色を行ない、その染色の色調か
らコロニーの形態をＩＩ微鏡下で判定した。

その結果、回収した培養上清を作用させると得られたコ
ロニーを形成する細胞の９８％以上が電球−マクロファ
ージ系の細胞であった。

ｉ胤−旦 ＣＨＯ細胞での発現 ■　発現ベクターの構築 実＃Ｉ！例７−■で得たプラスミドｐＳＶＬ−ＣＳＦ２
μｇをＸｈ　ｏ　Ｉ　１０ｕｎｉｔとＳａｃ　Ｉ　１０
ｕｎｉｔで３７℃、１２０分間消化し、０．８％アガロ
ースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、約１．
９ＫｂのＭ−ＣＳＦ断片を切り出し回収した。＠収ＤＮ
Ａ断片３００ｎｇを前出のプランティングキット（室温
ｙｙｔ＊＞を用いて末端を平滑末端とした。一方動物細
胞発現ベクター改良型ｐＳＶ２−ｄｈｆ　ｒ　（ｐＳＶ
２”−ｄｈｆｒと命名、５ｃａｈｉ１１．　ＳＪ、　ｅ
ｔ　ａｔ、；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　ＢＩＬ　　４６５４
　（１９８３）　）　２ａｇをＨｉｎｄｍ　１０ｕｎｉ
ｔで３７℃１２０分間消化後、プランティングキットを
用いて平滑末端とした。上記Ｍ−ＣＳＦの断片とベクタ
ーをライゲーションし、大腸菌ＨＢ　１０１コンピテン
トセルに導入、クローンを得た。クローンよりＤＮＡを
精製し制限酵素によるマツピングにてＭ−ＣＳＦｃＤＮ
Ａ断片の挿入方向を調べた。その結果プロモーターと同
方向にＭ−ＣＳＦｃＤＮＡ断片が挿入されたベクターｐ
ｓＶ２”−ｈＣＳＦ−ｍｄｈｆｒを得たく第９図）。

■　ＣＨＯ＊胞での構成的発現 ＣＨＯｄｂｆｒ欠損株（Ｕｒｌａｎｂ、Ｇ、　ｌ　Ｃｈ
ａｓｉｎ、　Ｌ、Ａ、：Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　ヱヱ　４
２１８　（１９８０））にｐＳＶ２”−ｈＣＳＦ１−ｍ
ｄｈｆｒをリン酸カルシウム法（Ｏｋａｙａ■ｈ、　ｅ
ｔ　ａｔ前述）で実施例７−■と同様にして導入後、Ｋ
ａｕｆｓａｎらの方法Ｑａｕｆｍａｎ、　Ｒ，Ｊ、　ｅ
ｔ　ａｌ、；　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｒｉａｌ、　ｆｌ　　１７５０　（１９８
５）　）に従って培養した。

約２週間後、コロニーが出現し始めコロニーを混合の形
で回収した。混合コロニーを３〜５日間培養後、培養上
清を回収した。

次にメトトレキレート（ＭＴＸ）０．０２ｂＭになるよ
うに培地に加え、約２週間後に得られたコロニーの培養
上清を回収した０回収した培養上清につきＣＳＦ活性を
実施１９１？−■と同様にして測定したく第２表）。

第２表 ＭＴＸ　（μＭ）　　　活性（Ｕ／ｍ１）０．０　　　
　　　　　　　１．００００．０２　　　　　　　１０
．０００ 更に高濃度のＭＴＸを添加することによってＭ−ＣＳＦ
活性を有するポリペプチドの産生量の増加が望まれ、得
られた混合コロニーを限界希釈法にてクローニングする
ことによって、Ｍ−ＣＳＦ活性を有する物質高生産ＣＨ
Ｏ細胞クローンを得ることが出来る。このように本発明
の遺伝子を用いると非常に優れたＭＴＸに対する応答性
が得られ、Ｍ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを簡単
にかつ短時間で得ることができる。

また高い比活性の培養上清が得られることから、高純度
の目的物が簡単な操作で大量に得られ、医薬品の製造に
非常に適している。

宜１１１ユ ■　ヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦ（２１４個と２３８個のア
ミノ酸）遺伝子の作製 実施例７−■のＭ−ＣＳＦ発現ベクターｐｓｖＬ−ＣＳ
Ｆ５ｕｇｔｉ：制限酵素ＢａｍＨＩ（室温造Ｉり１０１
０℃３７℃、２時間消化し、１％アガロース電気泳動で
分画し、５．８ｋｂの断片を回収した０次に図１０に記
載のアミノ酸配列中の２１３〜２１４番アミノ酸と２１
３〜２３８番アミノ酸に相当するオリゴヌクレオチドを
Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　８６００　Ｄ　Ｎ　Ａ合成装ｆｆ
１Ｆ　（Ｍｉｌｌｉ−ｐｏｒｅ社１１）を用い下記に示
す通りに合成した。

［２１３−２１４］Ｕ　Ｓ’　　−ＧＡＴＣＣＡＴＡＡ
ＣＴＣＧＡＧＴ−３’［２＋３−２１４］Ｌ　　　　３
“　−ＧＴＡＴＴＧＡＧＣＴＣＡＣＴＡＧ−５’［２＋
３−２３８］ＩＪ　５’　−ＧＡＴＣＣＡＧＧＣＡＧＴ
ＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣ［２＋３−２１４］Ｌ　　　　３
’−ＧＴＣＣＧＴＣＡＣＧＧＴＴＣＧＴＣＧＧＧＣＣＧ
ＣＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＧＴＧＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＧ
ＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＣＴＣＧＴＧＣ
ＡＣＧＧＴＣＴＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＧＴＧＡＧＡ
ＣＣＣＣＡＧＴＴＧＴＣＡＡＧＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴ−
３’ＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣ＾＾ＣＡＧＴＴＣＡＴＴＧＡ
ＧＣＴＣＡＣＴＡＧ−５’合成オリゴヌクレオチドの精
製はオリゴヌクレオチド精製カートリッジ（アプライド
・バイオシステムズ・ジャパン社ｍ＞あるいはＫｈｏｒ
ａｎａらの方法（Ｋｈｏｒａｎａ、　Ｈ，Ｇ、　ｅｔ　
ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　ｆＬＬ、２２
８５　（１９８４））に従って行った。精製オリゴヌク
レオチドｌｊｊｇをそれぞれＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（室温造ＩＩ）１０単位で３７℃、１時間反応させ
、５′末端をリン酸化後アニールを行った。（２１３−
２３８）についてはさらに７．５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行い、８８ｂ、ｐ、に相当するバンドを
切り出し、電気的溶出し、精製した。上記の５．８ｋｂ
の断片と合成りＮＡ　（２１３−２１４）およびＣ２１
３−２３８〕を７４ＤＮＡリガーゼ（室温造１り２１１
位で１６℃、２時間それぞれライゲーションさせ、大腸
菌ＨＢ　１０１に導入し、形質転換体を得た。制限ｌＩ
Ｉ業マツピングとジデオキシ・チエイン・ターミネーシ
ョン法により合成りＮＡが正しくクローニングされたブ
ラスミＦｐＳＶＬ−ＣＳＦ２１４　（２１４個のアミノ
酸を有するＭ−ＣＳＦ）とｐＳＶＬ−ＣＳＦ２３８　（
２３８個のアミノ酸を有するＭ−ＣＳＦ）を得た（第１
１図）。

■　変異体（３７Ｐ　１１　ｅ−＋”Ｓ　ｅ　ｒ　）の
作製変異の導入はＭ　ｕ　ｔ　ａ　ｎ　”−Ｋ　（ｓｉ
ｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｓｕｔａ−ｇｅｎｅｓｉｓ　
５ｙｓｔｅ（室温造ＩＩ）に従ったー実施例５−■に記
載のプラスミドｐＢＳＳ　（５，０７１ｂ。

ｐ−）１０４ｇｔｔＥｃｏＲ１２０単位と５ｐｈｌ　　
２０単位（共に室温造ｔＳ＞で消化後、１％アガａ−ス
ゲルミ気泳動で１．１９５ｂ、ｐ、断片を回収した。こ
の断片をＭ１３ｍＤ１８のＥｃｏＲｒ、５ｐｈｌ部位に
ライゲーションさせ、大腸菌ＢＷ３１３　（ｄ＋Ｊｔ−
、Ｕｎｇ−）に導入した。得られた組換体より常法に従
い一零値ファージＤＮＡを調整した。

この−零値ＤＮＡと変異導入ブライマー（５’　−ＡＴ
ＴＡＣＡＴＴＴＧ＾ＧＴＣＴＧＴＣＧＡＣＣＡＧＧＡＡ
ＣＡＧ　−３”）をアニールさせた後、大腸菌リガーゼ
並びにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖合成を行っ
て完全な二本鎖ＤＮＡとし大腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍｕ
ｔＳに導入した。大腸菌ＭＶ１１Ｂ４を指示筒として得
られたプラークを大１１１［ＪＭ１０９に再感染させ、
−零値および二本鎖ＤＮＡｔｔｌｌｌ整した。二本１１
ＤＮＡＩＨｉ　ｎ　ｃ　ＩＩ　（ＢＲＬ社１ｍ）で消化
されるクローンにつき、さらにジオデキシ・チエイン・
ターミネーション法により目的とする変異の導入された
クローンを得た。変異の導入されたクローンのＤＮＡを
ＥｅｏＲＩとＮｃｏｌ（室温造製）で消化し８３９ｂ、
Ｉ）。

断片を回収した。一方ｐＢＳＳのＮｃｏｌ完全消化、Ｅ
ｃ。

Ｒ１部分消化し、４．１７８ｂ、ｐ、の断片を回収した
０両断片をライゲーションさせ大腸菌ＪＭ１０９に導入
し形質転換体を得た。これらの形質転換体について制限
酵素マツピングにより目的の形質転換体ｐＢＳＳＥＲを
得た（第１２図）。

■　変異体ＣＳＦの作製 ｐＢｓｓＥＲ１０μｇを５ｔｎａｌ（室温造ａ）２０単
位とＢａｍＨ１２０単位で消化し８９８ｂ、ｐ、の断片
を回収した０次にｐＳＶＬ−ＣＳＦ２１４とｐＳＶＬ−
ＣＳＦ２３８をＳｍａｌとＢａｍＨＩて消化し４．９２
７ｂ、ｐ、と４゜９９９ｂ、ｐ、の断片を回収後それぞ
れ８９８ｂ、ｐ、の断片とライゲーションさせ大１１１
１ＨＢ１０１に導入した。得られた形質転換体を制限酵
素マツピングにより目的とする形質転換体ｐＳＶＬ−Ｃ
ＳＦ２１４ＳとｐＳＶＬ−ＣＳＦ２３ＢＳを得た（第１
３１！！Ｉ）。

爽胤五工立 ■　ＣＯＳ細胞におけるＭ−ＣＳＦの発現実施Ｆｐ４９
で作製し・たプラスミドｐＳＶＬ−ＣＳＦ、ｐＳＶＬ−
ＣＳＦ２１４、ｐＳＶＬ−ＣＳＦ２３８、ｐＳＶＬ−Ｃ
ＳＦ２１４ＳとｐＳＶＬ−ＣＳＦ２３８ＳｔｔＤＥＡＥ
−デキストラン法（Ａｒａｉ、　＋１．　ｅｔ　ａｔ、
＋前述）によりＣＯ５７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１
）に導入した。

即ちｌＸ１０８個（７）ＣＯ３７細胞を１０１シャーレ
上に１０％ＦＣ５を含むＤ−ＭＥＭ培地にまきこみ、３
７℃、６％ＣＯ２下で一夜培養した０次いで培地を除去
し、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｆｅ２は含まない）で細胞を２回
洗浄後、各々のＤＮＡ２０μｇを含むＤ−ＭＥＭ培地（
５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７，４）及び４０
０μｇ／麿ＩＤＥＡＥ−デキストランを含む）４１を加
え、３７℃、５％ＣＯ２下で４時間培養した０次にＤ−
ＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄後、２％ＦＣＳを含むＤ−
ＭＥＭ培地（１００μＭクロロキンを含む）７１を加え
、ざらに３時間培養した。Ｄ−ＭＥＭ培地で細胞を２回
洗浄後、４％ＦＣ３を含むＤ−ＭＥＭ培地５１を加え、
３日間培養した。その培養上清を回収し、ＣＳＦ活性と
形成されたコロニーの形態を第３表に示した。

第 表 その結果、得られたコロニーを形成する細胞の９８％以
上が単球−マクロファージ系であった。

！崖医上土 ■　ＣＨＯ細胞用発現ベクターの作製 実施例８−■に記載の発現ベクターｐｓＶ２’−ｄｈｆ
ｒ２ｕｇをＨｉｎｄｍ（室温造１１）４単位で３７℃、
２時間消化後、Ｔ４ポリメラーゼ（室温造１り　２１１
位で３７℃、３０分間反応させて平滑末端とした０次に
実施例９で作製したベクターｐＳＶＬ−ＣＳＦ２１４を
１０ａｇとｐｓｖｔ、−ｃｓＦ２３８を１０μｇそれぞ
れＸｈｏ！（宝１１！ｌｊ！ｆｉｌ）　２０単位で消化
Ｌ／ＣＳＦ遺伝子を含む断片（０，９５Ｋｂｐと１．０
３Ｋｂｐ）を回収し、ざらにＴ４ポリメラーゼ２単位で
３７℃、３０分間反応させて平滑末端とした。上記のベ
クターｐＳＶ２’−ｄｈｆｒとＣＳＦ遺伝子を含む断片
０．９５Ｋｂｐと１．０３Ｋｂｐをそれぞれライゲーシ
ョンさせ、大腸菌ＨＢ　１０１に導入し形質転換体を得
た。プロモーターと同方向にＣＳＦ遺伝子がクローニン
グされたベクターｐＳＶ２ｄ−ＣＳＦ２１４とｐＳＶ２
ｄ−ＣＳＦ２３Ｂを得た（第１４図）。

■　ＣＨＯｉｌ胞におけるＭ−ＣＳＦの発現実施例」１
−■で作製したプラスミドｐＳＶ２ｄ−ＣＳＦ２１４と
ｐＳＶ２ｄ−ＣＳＦ２３Ｂをリン酸カルシウム法（Ｏｋ
ａｙａｓａ、　Ｈ，ｅｔ　＆＋、、前述）によりＣＨＯ
ｄｈｆｒ−株に導入した。細胞の選択方法並びに遺伝子
増幅はＫａｕｆｓａｎらの方法（にａｕｆｓａｎ、　Ｒ
，Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、前述〉に従）た。

即ち５Ｘ１０’個のＣＨＯｄｈｆｒ−株を１０（？Ｉｌ
シャーレ上に１０％ＦＣ９を含むＦ−１２培地にまきこ
み、３７℃、５％ＣＯ２下で一夜培養した２次に各々の
ＤＮＡ２５μｇを含むリン酸カルシウム共沈殿物（２５
ｍＭ　　ＢＥＳ　（ｐＨ６゜９６））　、１４０ｍＭ　
　ＮａＣ！、０．７５ｍＭ　　Ｎ８２ＨＰ　Ｏａ、１２
５ｍＭ　　ＣａＣｌ２）を細胞にまきこみ、３５℃、３
％ＣＯ２下で一夜培養した。１０％ＦＣ５を含むＦ−１
２培地で細胞を２回洗浄後、同培地を１０１加え、３７
℃、６％ＣＯ２下で一夜培養した。０．２５％のトリプ
シンを含むバーセン（ＧｒＢＣＯ社ＩＩ）で細胞をはが
し、新しい１０楕シヤーレ上に５Ｘ１０’個の細胞を１
０％ＦＣ５を含むＦ−１２培地にまき直し、３７℃、６
％ＣＯ２下で一夜培養した。１０％透析ＦＣ３を含むＭ
ＥＭα（−）培地で２回細胞を洗浄後、同培地を１０１
加え、３７℃、５％ＣＯ２下で約２週間培養した。その
間通２〜３回の割合で培地を交換した。

約２１！１間後出現したクローンをクローニングし、Ｍ
−ＣＳＦ産生純の高い４クローンにつきＭＴＸによる増
幅を行なった。上記４７０−ンを０．０２μＭＭＴＸを
含むＭＥＭα（−）培地（１０％透析ＦＣ５を含む）で
培養し、得られた耐性クローンをさらに０．１μＭＭＴ
Ｘを含む同培地で培養した。

得られた耐性クローンの培養上清中のＭ−ＣＳＦ活性を
第４表（ｐＳＶ２ｄ−ＣＳＦ２１４）と第５表（ｐＳＶ
２ｄ−ＣＳＦ２３Ｂ）に示す。

第 表 第 表 表中の数値は活性（Ｕ／ｍｌ） を示す。

宜畿ＪＬ［２ ヒト尿２１４アミノ酸型Ｍ−ＣＳＦの大腸菌発現ベクタ
ーの作製 ■　ＰＬプロモーターを持つベクターの作製最初にコピ
ー数の増加とより高い生物学的封じ込めを目的として、
発現ベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社１１）
とｐＡＴ１５３（アマジャム社Ｗ）との複製起点を含む
領域の交換を行った。すなわち、ｐＫＫ２２３−３　（
５μｇ）を制限１１素ＥｃｏＴ１４＋　（室温造社Ｉｔ
）とＡｌｗＮＩ　ＣＮＥＢ社ｍ＞の各々１０単位て３７
℃、２時閏反応させ、完全に消化し、ＬＯ％アガロース
ゲル電気泳動（１００Ｖ、２μ間〉を行い、ＧＥＮＥＣ
ＬＥＡＮ”（ＢＩｏ　　１０１社ＩＩ）を用いて約３Ｋ
ｂｐの断片を回収した。一方、ｐＡＴ１５３（５μｇ）
も同様の制限酵素で消化し、複製起点を含む約８００ｂ
ｐの領域を同様の電気泳動及び回収操作を行い回収した
。こうして回収した両断片をＤＮＡライゲーションキッ
ト（室温造社製）の方法に従ってライゲーションを行い
、ついで、大腸菌ＨＢＩＯＩのコンピテントセルに導入
した。この大腸菌をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）
を含むＬＢ寒天培地にまき、３７℃で一夜培養した。こ
こで得たコロニーを無作為に１２個選択し、アンピシリ
ン（１００μｇ／■１）を含むＬＢ培地中、３７℃で一
夜培養した。この菌体から既出のフルカリ−５ＤＳ法を
用いてプラスミドを＊ｍｔ、た。このプラスミドを制限
ＩＩ素ＰｖｕｌＩ　（室温造社１１）１０単位で３７℃
、２時閏反応させ、完全に消化し、１．０％アガロース
ゲル電気泳動を行い、目的とする約３．８ＢＫｂｐを与
えるクローンを選択し、これをｐＡＴ２２３−３と命名
した（第１６図）。

次にＰＬプロモーターを持つ熱誘導性発現ベクターｐＫ
Ｃ３０（ＣＬＯＮＴＥＣＨＬａｂ社１りのＰＬプロモー
ターを含む領域と、ｐＡＴ２２３−３のｐＫＫ２２３−
３由来のＴａｃプロモーターを含む領域との交換を行っ
た。すなわち、ｐＡ、Ｔ２２３−３　＜５ｔｔｇ＞を制
限酵素ＢａｍＨＩ（室温造社製）とＮｒｕｌ（宝ｆｉ造
社製）各々１０単位で３７℃、２時闇反応させ、完全に
消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、
２時閏）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＹＩ′Ｉを用いて
、約３Ｋｂｐの断片を回収した。一方、ｐＫｃ３０（５
μｇ）を制限酵素ｐｖｕ＋（室温造社製）１０単位で３
７℃、２時間反応させ、完全に消化した。これをプラン
ティングキット（室温造社製）のＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼを用いて、３７℃、５分間反応させ平滑末端とし、フ
ェノール抽出後エタノール沈殿により回収した。ざらに
、制限ｉ１１素ＢａｍＨＩＩＯ単位で３７℃、２時間反
応させ、完全に消化した。

次に、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２
時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴ汽を用いて、約１
．３Ｋｂｐの断片を回収した。こうして回収した両断片
をＤＮＡライゲーションキットの方法に従ってライゲー
ションを行い、次に大１１１ｒＮ９９ｃｌ′のコンピテ
ントセルに導入した。この大腸菌をアンピシリン（１０
０μｇ／ｌ）を含むＬＢ寒天培地にまき、３７℃で一夜
培養した。ここで得たコロニーを無作為に１２個選択し
、アンピシリン（５０μｇ／■１）を含むＬＢ培地中、
３７℃で一夜培養した。この菌体からアルカリ−８ＤＳ
法を用いてプラスミドをｇ４１！シた。このプラスミド
を制限酵素Ｈｐａｌ　（室温造社１り１０１０℃３７℃
、２時間反応させ、完全に清化し、１．０％アガロース
ゲル電気泳動を行い、目的とする約４．３ＫＭを与える
りＣ−ンを選択しそれをｐＰＬＮと命名した（第１５１
！ｌ）。

■　ｐＳＶＬ−ＣＳＦ２１４とｐＵＣ１９の絹換え前記
の動物細胞発現用ベクターｐＳＶＬ−ＣＳＦ２１４のＭ
−ＣＳＦＤＮＡ部分を、ｐＵｃ１９にッポンジーン社製
）のマルチクローニング部位に組換えた。すなわち、ｐ
ＳＶＬ−ＣＳＦ２１４　（５μｇ）を制限酵素Ｘｂａｌ
　（室温造社Ｉｍ）とＸｈｏｌ（室温造社ｍ＞各々１０
単位で３７℃、２時間反応させ、完全に消化し、１．０
％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時閏〉を行い
、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ’門を用いて、約９５０ｂｐの断
片を回収した。一方、ｐＵＣ１９（５μｇ）を制限酵素
Ｘｂａｌと５ａｌｌ（室温造社１り各々１０単位で３７
℃、２時間反応させ、完全に消化し、１．０％アガロー
スゲル電気泳動（１００Ｖ、２時閏）を行い、ＧＥＮＥ
ＣＬＥＡＮＴにを用いて、約２．７Ｋｂｐの断片を回収
した。回収した両断片をＤＮＡライゲーションキットの
方法に従フてライゲーションを行い、次に大腸菌ＪＭＩ
　０９のコンピテントセルに導入した。この大腸菌をア
ンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とＸ−ｇ　ａ　ｌ　（
４０ａ　ｇ／ｍＯ及びＩ　ＰＴＧ（６ｍＭ）を含むＬＢ
寒天培地にまき、３７℃で一夜培養した。白色コロニー
として組換え体を得た。ここで得たコロニーを無作為に
１２個選択し、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む
ＬＢ培地中、３７℃で一夜培養した。この菌体からアル
カリ−５ＤＳ法を用いてプラスミドを調製した。このプ
ラスミドを制限１１素Ｘｂａ　ＩとＸｈｏｌの２種類と
個別に、１０単位、３７℃、２時閏の条件で反応させ、
次に１．０％アガロースゲル電気泳動を行った。制限酵
素Ｘｂａ　ｌて切断されず、制限酵素Ｘｈｏ　［で−カ
所だけ切断され、目的とする約３．６Ｋｂｐの断片のみ
を与えるクローンを、選択した。

これをｐＵＣ−ＣＳＦ２１４と命名した（第１６図）。

■　合成りＮＡの作製 下記■での組換えの際の接続を行うためのリンカ−とし
て利用するために、オリゴヌクレオチドをＢｉｏｓｅａ
ｒｃｈ　８６００ＤＮＡ合成装置（Ｍｉ　ｌ　ｌ　１ｐ
ｏｒｅ社製）で合成した。その配列は以下に示す通りで
ある。

５　’　−ＴＡ　ＡＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡ　ＣＡ
　ＴＡＴＧＧＡ　ＡＧＡＡＧＴＴＴＣＴＧＡ　ＡＴ　Ａ
ＴＴＧＴＴＣＣＣＡ　ＣＡＴＧＡ−３″　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　−く１）５　’−ＧＴＧＧＧＡＡＣＡＡ丁ＡＴＴＣ
ＡＧＡＡＡＣ’丁ＴＣＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＴＡＣＣＴ
ＣＣＴＴＡＡＧＴＴＡ−３’　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　−（２）５　’　−ＴＡＡＣＴＴ
ＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＣＡＴＡＴＧＴＣＴＧＡＡＴＡＴ
ＴＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＧＡ−３’５’−ＧＴＧＧＧＡ
ＡＣＡＡＴＡＴＴＣＡＧＡＣＡＴＡＴＧＴＴＡＣＣＴＣ
ＣＴＴＡＡＧＴＴＡ−３’　　−（４）合成オリゴヌク
レオチドの精製は既出のオリゴヌクレオチド精製カート
リッジ（アプライド・バイオシステムズ・ジャパン社Ｋ
ｌ）あるいはＫｈｏｒａｎａらの方法（Ｋｈｏｒａｎａ
、　Ｈ，Ｇ、　ｅｔａｌ、：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　旦１２２８５（１
９８４））に従って行った。

精製後のオリゴヌクレオチドはそれぞれＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（室温造社ＩＩ）を用いて、６′末端の
リン酸化を行った。続いて上記（１）と（２）及び上記
（３）と（４）をアニールさせて、２本鎖ＤＮＡリンカ
−を２種ｍ（前者をＮ末すンカ−５後者をＮ末Δ３リン
カ−とする）作製した。

■　ｐＵＣ−ＣＳＦ２１４とｐＰＬＮの組換えまず発現
ベクターｐＰＬＮ（５μｇ）を制限酵素１（ｐａｌ（室
温造社ＩＩ）と）ｆｉｎｄｍ（室温造社Ｉｌ）各々１０
単位で３７℃、２時間反応処理し、完全に消化し、１．
０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行
い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ”を用いて、約３．５Ｋｂｐの
断片を回収した。

次にｐＵＣ−ＣＳＦ２１４　（５μｇ）を制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩ１１１０単位で３７℃、２時間反応処理し、完全
に消化した。

続いて、制限酵素ＢｓｔＸＩ　（ＮＥＢ社Ｗ）１０単位
テ５５℃、２時間反応後、１．０％アガロースゲル電気
泳動（１００■、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ
Ｔ”を用いて、約６４０　ｂ　りの断片を回収した。

こうして回収した両断片と、■記載のＮ末すンカ−ある
いはＮ末△３リンカ−との３断片を、ＤＮＡライゲーシ
ョンキットの方法に従ってライゲーションを行い、次に
大腸菌Ｎ４８３０−１のコンピテントセルに導入した。

この大腸菌をアンピシリン（１００μｇ　／　ｍ　ｌ　
）を含むＬＢ寒天培地にまき、３２℃で一夜培養した。

ここで得たコロニーを無作為に１２個選択し、アンピシ
リン（５０μｇ／■１）を含むＬＢ培地中、３２℃で一
夜培養した。この菌体からアルカリ−５ＤＳ法を用いて
プラスミドを調製した。このプラスミドを制限酵素Ｎｄ
ｅｌ（ＢＲＬ社１１）あるいはＢｓｔＸＩで消化し、１
．０％アガロースゲル電気泳動を行い、目的とする約４
．２Ｋｂｐを与えるクローンを、各々３クロ一ン選択し
た。

■　ＤＮＡ配列の確認 ■で得た各クローンからアルカリ−５ＤＳ法を用いてプ
ラスミドを調製し、各々その５μｇを制限ｆｉ１素Ｐｓ
ｔｌ（室温造社ＩＩ）とＢｇｌｌｌ（室温造社Ｉｔ）各
々１０単位で３７℃、２時間消化し、１．０％アガロー
スゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥ
ＣＬＥＡＮＴ”を用イテ、約５００ｂｐの断片を回収し
た。一方、Ｍｌ　３ｍｐ　１８ＲＦ　（室温造社１１＞
を制限酵素Ｐｓｔｌと制限酵素ＢａｍＨＩ（室温造社１
１）各々１０単位で３７℃、２時間消化し、１．０％ア
ガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、Ｇ
ＥＮＥＣＬＥＡＮ”を用いて、約７．２Ｋｂｐの断片を
回収した。こうして回収した両断片をＤＮＡライゲーシ
ョンキットの方法に従ってライゲーションを行い、次に
大１１１１１ＪＭ１０９のコンピテントセルに導入した
。この大ｉＩｗをＪＭＩ　０９を指示菌としてＸ−ｇａ
ｌ及びＴＰＴＧを含むＢｂｒｏｔｈ塞天培地にまき、３
７℃で一夜培養した。白色プラークとして胡換え体を得
た。ここで得たプラークを無作為に各々４個選択し、常
法に従って一零値絹換え体ファージをＩＩＷＬ、た、塩
基配列の決定はジデオキシ・チエイン・ターミネーショ
ン法で行い、目的とする絹換え体の確認と選択を行った
。

この結果■で得られた朝換え体のうち、正しいことの確
認できた発現ベクター２種類を、ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１
４　（第１７図（ａ））及びｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Δ
３と命名した（第１７１！Ｉ（ｂ））。

裏胤叢工ｌ ヒト尿２３８アミノ酸型Ｍ−ＣＳＦの大ｉ＊ｉｉ発現ベ
クターの作製 ■　ｐＳＶＬ−ＣＳＦ２３ＢとｐＵＣ１９の組換え上記
に記載の動物細胞発現ベクターｐＳＶＬ−ＣＳＦ２３８
のＭ−ＣＳＦＤＮＡ部分を、ｐＵｃ１９のマルチクロー
ニング部位に実施例１２−■と同様の操作で絹換えた。

すなわち、ｐＳＶＬ−ＣＳＦ２３８　（５μｇ）を制限
Ｗｌ素ＸｂａｌとＸｈｏｌ各々ｌ各々ｌ万単位℃、２時
閏反応処理し、完全に消化し、１．０％アガロースゲル
電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥ
Ａ、ＮＴＴＸを用いて、約ＩＫｂｐの断片を回収した。

一方、ｐＵｃ１９（５μｇ）を制限酵素Ｘｂａｌと５ａ
ｌＴ各々１０１１位で３７℃、２時閏反応処理し、完全
に消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ
、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴ門を用いて、
約２．７Ｋｂｐの断片を回収した。こうして回収した両
断片を、ＤＮＡライゲーションキットの方法に従ってラ
イゲーションを行い、次に大腸菌ＪＭ１０９のコンピテ
ントセルに導入した。この大ｉＩｗをアンピシリン（１
００ＬＬｇ／ｌ）とＸ−ｇａ　ｌ　（４０℃１ｇ／ｍｌ
）及びＩＰＴＧ（５ｍＭ）を含むＬＢ＊天培地にまき、
３７℃で一夜培養した。白色コロニーとして朝換え体を
得た。ここで得たコロニーを無作為に１２個選択し、ア
ンピシリン（５０μｇ／■１）を含むＬＢ培地中、３７
℃で一夜培養した。この菌体からアルカリ−５ＤＳ法を
用いてプラスミドをｒ１４１！シた。このプラスミドを
制限酵素Ｘｂａ■とＸｂｏｌの２種類と個別に、１０単
位、３７℃、２時耐の条件で反応させ、ついで！、θ％
アガロースゲル電気泳史を行った。制限酵＊ＸｂｏＩで
切断されず、制限酵素Ｘｈａ■で一カ所だけ切断され、
且つ目的とする約３．７Ｋｂｐの断片のみを与えるクロ
ーンを、選択した。これをｐＵＣ−ＣＳＦ２３８と命名
したく第１８図）。

■　ｐＵＣ−ＣＳＦ２３８とｐＰＬＮの岨換え実施例１
２−■に記載した方法と同様の操作て組換えを行フた。

すなわち、発現ベクターのｐＰＬＮ　（５μｇ）を、制
限酵素ＨｐａＴとＨｉｎｄｔ［Ｉ各々１０単位で３７℃
、２時間反応処理し、完全に消化し、１．０％アガロー
スゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥ
ＣＬＥＡＮＴ”を用いて、約３．５Ｋｂｐの断片を回収
した。

次にｐＵｃ−ＣＳＦ２３８　（５μｇ）を制限Ｗ＃素Ｈ
ｉｎｄｍ１０単位で３７℃、２時間反応処理し、完全に
消化した。

続いて、制限酵素ＢｓｔＸ１１０単位で５５℃、２時間
反応後、１．０％７ガｏ−スゲルミ気泳動（１００Ｖ、
２時ｆｆｊ）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ”−を用いて
、約７１０ｂｐの断片を回収した。

こうして回収した両断片と実施Ｗ４１２−■記載のＮ末
すンカ−あるいはＮ末Δ３リンカ−との３断片を、ＤＮ
Ａライゲーションキットの方法に従フてライゲーション
を？テい、次に大腸菌Ｎ４８３０−１のコンピテントセ
ルに導入した。この大ｉＩｗをアンピシリン（１００μ
ｇ／ｌ）を含むＬＢ寒天培地にまき、３２℃で一夜培養
した。ここで得たコロニーを無作為に１２個選択し、ア
ンピシリン（５０μｇ／ｌ〉を含むＬＢ培地中、３２℃
で一夜培養した。この厘体からアルカリ−５ＤＳ法を用
いてプラスミドを調製した。このプラスミドを制限酵素
ＮｄｅｌあるいはＢｓｔＸＩで消化し、１．０％アガロ
ースゲル電気泳動を行い、目的とする約４．ａＫｂｐを
与えるクローンを、選択した。

■　ＤＮＡ配列の確認 実施例１２−■と同様の操作を行って、■て得た各クロ
ーンの制限酵素ＰｓｌｌとＢｇｌＵて切断される約５０
０ｂｐ断片の塩基配列の確認を行った。この結果■て得
られた組換え体のうち、正しいことの確認できた発現ベ
クター２種類を、ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８　（第１９１
！ｌ　（ａ）　）及びｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８△３と命
名した（第１９図＜ｂ））。

ｉ施■１ユ ヒト尿２１４型Ｍ−ＣＳＦの大ｉＩＭでの発現■　形賞
転換体の培養 実施例１２−■で作製した発現ベクターｐＰＬＮ−ＣＳ
Ｆ２１４で形質転換した大腸菌Ｎ４８３０−１を用いて
、２１４型Ｍ−ＣＳＦの発現を行フた。なおｐＰＬＮ−
ＣＳＦ２１４で形質転換した大腸菌は、ＰＬＮ２１４と
命名した。

まず上記形質転換菌をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）
を含む５０１１のＬＢｔ＆地中、３２℃で一夜前培養し
た。この前培養液をアンピシリン（５０μｇ／ｌ）を含
む１１のＬＢ培地に加え、３２℃でＯ，Ｄ、５ｆ５０ｎ
ｍが０．５になるまで培養し、６５℃の水浴中で培養液
温度が４２℃になるまで加温熱処理した。その後、４２
℃で６１１１間培養した。この段階で厘体の一部を採取
し位相差顕微鏡下で観察すると、厘体内に、形質転換し
ていない大腸菌Ｎ４８３０〜１には存在しないところの
凝集塊（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）が認められた
。

この凝集塊を含む菌体を５，０００ｒｐｍ、１０ｍ１ｎ
遠心して集菌し、ＰＢＳ　（リン酸緩衝生理食塩水）１
００ｍｌに懸濁した。再度５．ＯＯＯｒｐｍ、ｉｏｍｉ
ｎ達心して集菌した。

この厘体を超音波破砕し、還元下で５ＤＳ−ＰＡＧＥを
行いクロマトスキャナー（島津社ｍｌ）で分析した。そ
の結果、２１４！１２Ｍ−ＣＳ　Ｆモノマーの生産量は
、全菌体タンパク質の１０％以上であった。

■　凝集塊の回収 上記■で集菌した菌体からＮａｇａ　ｉらの方法（Ｎａ
ｇａｉ、　Ｋ、　ｅｔａｔ、：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１
．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　ｆＬ２Ｌ７２５
２　（１９８５））に従って、凝集塊を回収した。

すなわち、厘体を湿態Ｉｔ　１０　ｇあたり８１の５０
ｍＭ）リス塩酸緩衝液（２５％（Ｗ　／　Ｖ　）　５ｕ
ｃｒｏｓｅと１ｍＭＥＤＴＡを含む；ｐＨ８，０）に図
濁した１次に菌体湿重量１０ｇあたり２０鴫のりゾチー
ムを加え、氷上で約３０ｍ１ｎ放置した。

ＭｇＣｌ２及びＭｎＣｌ２をそれぞれ最終濃度１０ｍＭ
。

１ｍＭとなるように加え、ＤＮａｓｅｌも最終濃度１０
１１ｇ／■ｌとなるように添加し、４℃で約３０ｍ１ｎ
放置した。さらに、画体湿重量１０ｇあたり２ｏ−１の
２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（０，２Ｍ　　ＮａＣ＋、２
ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１．６％ＮＰ−４０．１％デオキシ
コール酸を含む：ｐＨ７，ｆ５）を加えた。４℃で約３
０ｍ１ｎ放置した後、５，０００ｘｇ１０ｍｉｎ遠心し
て沈殿を回収した。この沈殿に５０ｍＭ）リス塩＊＊衝
液（５０ｍＭ　　ＮａＣ１，１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

０．６％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む；ｐＨ８，０）
を沈Ｗｉ湿璽量の１０倍の量加えて懸濁し、４℃で５ｍ
１ｎ放置後、５゜０００ｚｇ、１０ｍ１ｎ遠心して沈殿
を回収した。このＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むトリス
塩酸緩衝液での操作を３回行い、凝集塊の沈殿を得た。

■　凝集塊の可溶化と２１４型Ｍ−ＣＳＦモノマーの分
離精製 上記■で調製した凝集塊の湿重量ｌｏｇあたり９０１の
５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（８ＭＵｒｅａ、１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ。

１０ｍＭＤＴＴを含む：ｐＨ８，０＞を添加し、ポリト
ロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を使
用して可溶化した。

この溶液にトリフルオロ酢酸を最終濃度０．１％になる
ように添加し、０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化した
ＹＭＣ５Ｈ−８４３−１５−３０［５−１５３００人　
Ｃ４（ＹＭＣ社１１）］カラム（２０Ｘ２５０−＞に通
液した。吸着後０．１％トリフルオロ酢酸を含む４０〜
７０％アセトニトリルによる直線濃度勾配溶出を行い、
アセトニトリル６２〜６８％の分画を回収した。この溶
液を０．０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透析を行い
、１５．００Ｏｒｐｍ、１０ｍ１ｎ遠心し、沈殿として
２１４！１２Ｍ−ＣＳＦモノマーの再凝集塊を得た。こ
の段階で２１４型Ｍ−ＣＳＦモノマーの純度は、９０％
以上であった。なお、この２１４！！ＩＩＭ−ＣＳ　Ｆ
モノマーの還元下で行った５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子
量は、約２ｓ、ｏｏｏであった。

■　２１４型Ｍ−ＣＳＦダイマーの形成■で得た２　１
４型Ｍ−ＣＳ　Ｆモノマーの再凝集塊を、最少量の５０
ｍＭ）リス塩酸緩衝液（８ＭＵｒｅａ、１ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ、１０ｍＭ　　ＤＴＴを含む；ｐＨ８，０）で再度
可溶化し、Ｏ，Ｄ、２８０ｎｍが０，１６となるように
再構成緩衝＊［５０ｍＭ）リス塩酸、５ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ、２ｍＭ　　ＧＳＨ（還元型グルタチオン）、１ｍＭ
　　Ｇ５５Ｇ　（酸化型グルタチオン）：ｐＨ８゜５］
で希釈し、４℃で３日間撹拌した０反応終了後、この溶
液を０．０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透析を行い
、直接ＣＳＦ活性測定を行った。

その結果、比活性は、１０？単位／＠ｇ　ｐｒｏｔｅｉ
ｎ以上であった。

さらに形成されたコロニーの形態をエステラーゼ二重染
色法で調べた結果、全てが単球−マクロファージのコロ
ニーであり、得られたＣＳＦがＭ−ＣＳＦであることが
証明された。

また形成された２１４型Ｍ−ＣＳＦダイマーの分子量は
、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで約ｓｏ、ｏｏｏであっ
た。

■　Ｎ末端アミノ酸配列の分析 Ｎ末端アミノ酸配列の分析は、■で得た２１４型Ｍ−Ｃ
ＳＦモノマーの分画の一部をそのまま４７７　Ａ　　Ｐ
ｒｏｔｅｉｎＳｅａｕｅｎｃｅｒ　　（Ａ　Ｂ　１社ｌ
りに供し、エドマン分解後に得られるＰＴＨ（フェニル
ヒダントイン）アミノ酸を分析することで確認した。

２０サイクル分析した結果、ＰＬＮ２１４の生産する２
１４型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からのアミノ酸配列は、以下
の通りであった。

Ｍｅｔ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　Ｉｕ−Ｖａｔ　−５ｅｒ−Ｇ
　１ｕ−Ｔｙｒ−Ｘ−５ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−ｌ　ｌ
　ｅ−Ｇ　Ｉｙ−５ｅｒ　−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕなお、８サイクル目の未同定ア
ミノ酸は、２１４型Ｍ−ＣＳＦモノマーをＣｒｅｓｔｆ
ｉｅｌｄらの方法（Ｃｒｅｓｔｆｉｅｌｄ、　Ａ、Ｍ、
　ｅｔ＆１．：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　ｚｌ
旦　６２２　（１９６３））に従ってカルボキシメチル
化し、プロティンシーケンサ−にかけることによりシス
ティンであることを確認した。

裏胤医１旦 ヒト尿２１４Δ３型Ｍ−ＣＳＦの大腸菌での発現■　形
質転換体の培養 実施例１２−■で作製した発現ベクターｐＰＬＮ−ＣＳ
Ｆ２１４Δ３で形質転換した大腸菌Ｎ４８３０−１を用
いて、２１４Δ３型Ｍ−ＣＳＦの発現を行った。なおｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Δ３’ｔ’形質転換シタ大ｖｈｍ
は、ＰＬＮ２１４Δ３と命名した。

ＰＬＮ２１４Δ３の培養は、実施例１４−■の方法に準
じて行った。熱処理後、４２℃で６時間培養した菌体の
一部を、実施例１４−■と同様に位相差顕微鏡で観察し
た結果、菌体内にＰＬＮ２１４と同様の凝集塊（Ｉｎｃ
ｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）が認められた。

実施例１４−■の方法に準じてこの凝集塊を含む菌体を
集菌した。

この菌体を超音波破砕し、還元下で５ＤＳ−ＰＡＧＥを
行いクロマトスキャナーで分析した。その結果、２１４
Δ３型Ｍ−ＣＳＦモノマーの生産量は、２１４型Ｍ−Ｃ
ＳＦ七ツマ−と同様に全画体タンパク賞の１０％以上で
あった。

■　凝集塊の回収 上記■て集菌した菌体の凝集塊の回収は、実施例１４−
■の記載と同様に行った。

■　凝集塊の可溶化と２１４Δ３型Ｍ−ＣＳＦモノマー
の分離精製 上記■で調製した凝集塊を実施例１４−■の方法に従っ
て可溶化処理を行った。ざらに同様に逆相クロマトを行
い、アセトニトリル６２〜６８％の分画を回収した。こ
の溶液を０゜０６％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透析管
行い、沈殿として２１４Δ３型Ｍ−ＣＳＦモノマーの再
凝集塊を得た。この段階の２１４Δ３型Ｍ−ＣＳＦモノ
マーの純度も、やはり９０％以上であった。なお、この
２１４Δ３型Ｍ−ＣＳＦモノマーの分子量を還元下の５
ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果は、約２８，０００であ
った。

■　２１４Δ３璽Ｍ−ＣＳＦダイマーの形成■で得た２
１４Δ３豐Ｍ−ＣＳＦモノマーの再構成反応は、実施＊
１４−■に記載の方法で行った０反応終了後、この溶液
を０．０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透析を行い、
直接ＣＳＦ活性測定を行った。

その結果、比活性は、１０７単位／ｓ＋ｇ　１）ｒｏｔ
ｅｉｎ以上であった。さらに形成されたコロニーの形態
を実施例３−■と同様にエステラーゼ二重染色法で調べ
た結果、全てが単球−マクロファージのコロニーであり
、得られたＣＳＦがＭ−ＣＳＦであることが証明された
。

また形成された２１４Δ３型Ｍ−ＣＳＦダイマーの分子
量は、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで約６０．０００で
あった。

■　Ｎ末端アミノ酸配列の分析 Ｎ末端アミノ酸配列の分析は、■で得た２１４Δ３型Ｍ
−ＣＳＦモノマー分画の一部を使用し、実施１５！１４
−■に記載の方法に従って行った。

２０サイクル分析した結果、ＰＬＮ２１４Δ３の生産す
る２１４△３盟Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からのアミノ酸配列
は、以下の通りであった。

５ｅｒ−Ｇｌｕ−丁ｙｒ−Ｘ−５ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ
−１１ｅ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−ＧＩｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−
ＧｌｎＳｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１
ｅなお、４サイクル目の未同定アミノ酸は、２１４Δ３
型Ｍ−ＣＳＦモノマーを実施ｆＮ３−■と同憚にカルボ
キシメチル化することによって、システィンであること
を確認した。

！１叢１旦 １：　）　１２３８型Ｍ−ＣＳ　ＦＯ）大１１１Ｔ（１
）発現■　形質転換体の培養 実施例１３−■で作製した発現ベクターｐＰＬＮ−ＣＳ
Ｆ２３８て形質転換した大１ｍｌＮ４８３０−１を用い
て、２３８型Ｍ−ＣＳＦ（７）発現を行った。；Ｉ：１
ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８で形質転換した大ＩＩＭは、Ｐ
ＬＮ２３Ｂと命名した。

ＰＬＮ２３Ｂの培養は、実施例１４−■の方法に準じて
行った。ｌｌｌ８処理後、４２℃で６蒔ｒ′ｒＩ培養し
た菌体の一部を、実施例１４−のと同様に位相差顕ｖＩ
！鐘で観察した結果、菌体内にＰＬＮ２１４と同様の凝
集塊（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）が認められた。

実施例１４−■の方法に準じてこの凝集塊を含む菌体を
集菌した。

この菌体を超音波破砕し、還元下で５ＤＳ−ＰＡＧＥを
行いクロマトスキャナーで分析した。その結果、２３８
型Ｍ　−ＣＳＦモノマーの生産量は、２１４型Ｍ−ＣＳ
Ｆモノマーと同様に全菌体タンパク質の１０％以上であ
った。

■　凝集塊の回収 上記■で集菌した菌体の凝集塊の回収は、実施例１４−
■の記載と同様に行った。

■　凝集塊の可溶化と２３８型Ｍ−ＣＳＦモノマーの分
離精製 上記■て調製した凝集塊を実施例１４−〇の方法に従っ
て可溶化処理を行フた。さらに同様に逆相クロマトを行
い、アセトニトリル６２〜６８％の分画を回収した。こ
の溶液を０゜０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透析を
行い、沈殿として２３８型Ｍ−ＣＳＦモノマーの再凝集
塊を得た。この段階の２３８型Ｍ−ＣＳＦモノマーの純
度も、やはり９０％以上であった。なお、この２３８型
Ｍ−ＣＳＦモノマーの分子量を還元下の５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分析した結果は、約３２．０００であった。

■　２３８型Ｍ−ＣＳＦダイマーの形成■で得た２３８
型Ｍ−ＣＳＦモノマーの再構成反応は、実施例１４−■
に記載の方法で行った０反応終了後、この溶液を０．０
５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透析を行い、直接ＣＳ
Ｆ活性銅定を行った。

その結果、比活性は、１０７単位／［ｐｒｏｔｅｉｎ以
上であった。さらに形成されたコロニーの形態を実施例
３−■と同様にエステラーゼ二重染色法で調べた結果、
全てが華球〜マクロファージのコロニーであり、得られ
たＣＳＦがＭ−ＣＳＦであることが証明された。

また形成された２３８型Ｍ−ＣＳＦダイマーの分子量は
、非’Ｉ１元下＋７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約６４．００
０ｍ’あった。

■　Ｎ末端アミノ酸配列の分析 Ｎ末端アミノ酸配列の分析は、■で得た２３Ｂ！１２Ｍ
−ＣＳＦモノマー分画の一部を使用し、実施例１４−〇
に記載の方法に従って行った。

２０サイクル分析した結果、ＰＬＮ２３Ｂの生産する２
３Ｂ型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からのアミノ酸配列は、以下
の通りであった。

Ｍｅｔ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　１ｕ−Ｖａｔ　−５ｅｒ−Ｇ
　Ｉｕ−Ｔｙｒ−Ｘ−５ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−１１ｅ
−Ｇｌｙ−５ｅｒ　−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ
−５ｅｒ−Ｌｅｕなお、８サイクル目の未同定アミノ酸
は、２３８！１２Ｍ−ＣＳＦモノマーを実施例１４−■
と同様にカルボキシメチル化することによって、システ
ィンであることを確認した。

支影■１ヱ ヒト尿２３８△３型Ｍ−ＣＳＦの大腸菌ての発現■　形
質転換体の培養 実施１９１１３−■で作製した発現ベクターｐＰＬＮ−
ＣＳＦ２３８Δ３て形質転換した大ｉｔ菌Ｎ４８３０−
１を用いて、２３８Δ３型Ｍ−ＣＳＦの発現を行った。

なおｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Δ３で形質転換シタ大１ｉ
ｓｉハ、ＰＬＮ２３８Δ３と命名した。

ＰＬＮ２３８Δ３の培養は、実施例１４−■の方法に準
じて行った。熱処理後、４２℃で６時間培養した菌体の
一部を実施例１４−■と同様に位相差顕微鏡で観察した
結果、菌体内にＰＬＮ２１４と同様の凝集塊（Ｉｎｃｌ
ｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）が認められた。

実施例１４−■の方法に準じてこの凝集塊を含む菌体を
集菌した。

この菌体を超音波破砕し、還元下で５ＤＳ−ＰＡＧＥを
行いクロマトスキャナーで分析した。その結果、２３８
Δ３盟Ｍ−ＣＳＦモノマーの生産量は、２１４型Ｍ−Ｃ
ＳＦモノマーと同様に全菌体タンパク質の１０％以上で
あった。

■　凝集塊の回収 上記■で集菌した菌体の凝集塊の回収は、実施例１４−
■の記載と同様に行った。

■　凝集塊の可溶化と２３８Δ３型Ｍ−ＣＳＦモノマー
の分離精製 上記■でＳａｔ、た凝集塊を実施Ｗ４１４−〇の方法に
従って可溶化処理を行った。さらに同様に逆相クロマト
を行い、アセトニトリル６２〜６８％の分画を回収した
。この溶液を０゜０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透
析を行い、沈殿としてＭ−ＣＳＦモノマーの再凝集塊を
得た。この段階の２３８Δ３型Ｍ−ＣＳＦモノマーの純
度も、やはり９０％以上であった。なお、この２３８Δ
３習Ｍ−ＣＳＦモノマーの分子量を還元下の５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで分析した結果は、約３２．０００であった。

■　２３８Δ３型Ｍ−ＣＳＦダイマーの形成■で得た２
３８Δ３型Ｍ−ＣＳＦモノマーの再構成反応は、実施ｆ
Ｎ１４−■に記載の方法で行った０反応終了後、この溶
液を０．０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透析を行い
、直接ＣＳＦ活性測定を行った。

その結果、比活性は、１０７単位／ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ
以上であフた。さらに形成されたコロニーの形態を実施
例Ｉ４−■と同様にエステラーゼ二重染色法で調べた結
果、全てが単球−マクロファージのコロニーであり、得
られたＣＳＦがＭ−ＣＳＦであることが証明された。

また形成された２３８Δ３型Ｍ−ＣＳＦダイマーの分子
量は、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで約６４，０００で
あった。

■　Ｎ末端アミノ酸配列の分析 Ｎ末端アミノ酸配列の分析は、■て得た２３８Δ３型Ｍ
−ＣＳＦモノマーＪＡ１１の一部を使用し、実施例１４
−■に記載の方法に従って行った。

２０サイクル分析した結果、ＰＬＮ２３８Δ３の生産す
る２３８Δ３！１２Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からのアミノ酸
配列は、以下の通りであった。

５ｅｒ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−Ｘ−５ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅ
ｔ−１１ｅ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｇ　１ｙ−Ｈ１ｓ−Ｌｅ
ｕ　−Ｇ　ｌｎ−５ｅｒ−ｌｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｎ−Ａｒ　ｌｅなお、４サイクル目の未同定アミノ酸は
、２３８△３型Ｍ−ＣＳＦモノマーを実施ｆｐ４３−■
と同様にカルボキシメチル化することによって、システ
ィンであることを確認した。

（発明の効果） 本発明のＭ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコード
する遺伝子は新規な塩基配列を有するとともに、新規な
Ｍ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを大量に生産する
ために大変重要なものである０本発明の遺伝子は適当な
ベクターに紹込み、適当な宿主例えば微生物、カビ、酵
母、動物細胞に導入し、次いでこれを培養することによ
り高純度、高品質のＭ−ＣＳＦを大量に製造することが
でき、医薬への応用の道が間かれる。

さらにまた、本発明の方法により、ヒト尿由来型Ｍ−Ｃ
ＳＦ遺伝子を適当な発現ベクターに朝込み、動物細胞及
び大腸菌に導入し、次いでこれを培養することにより高
純度、高品質のヒト尿由来型Ｍ−Ｃ５Ｍを大量に製造す
ることができ、これまた医薬への応用の道が間かれる。

以下明細書及び図中のポリペプチド及び塩基配列等の符
号及び略号は以下のとおりであるほか、慣用的に当該分
野で用いられるものである。

Ａｌａ　：　Ａｌａｎｉｎｅ　　　　　　＾ｒｇ　：　
ＡｒｇｉｎｉｎｅＡｓｎ　：　Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ　
　　　Ａｓｐ　：　Ａｓｐａｒａｔｉｃ　ａｃｉｄＣｙ
ｓ　：　Ｃｙｓｔｅｉｎｅ　　　　　Ｇｌｕ　：　ＧＩ
ｕｔ、ａｓｉｃ　ａｃｉｄＧｌｎ　：　Ｇｌｕｔａｍｉ
ｎｅ　　　　　Ｇｌｙ　：　Ｇｌｙｃｉｎｅ）ｌｉｓ　
：　Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　　　　　Ｉｌｅ　：　ｌ５ｏ
ｌｅｕｃｉｎｅＬｅｕ　：　Ｌｅｕｃｉｎｅ　　　　　
　Ｌｙｓ　：　ＬｙｓｉｎｅＭｅｔ　：　Ｍｅｔｈｉｏ
ｎｉｎｅ　　　　　Ｐｈｅ　：　Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎ
ｉｎｅＰｒｏ　：　Ｐｒｏｌｉｎｅ　　　　　　Ｓｅｒ
　：　５ｅｒｉｎｅＴｈｒ　：　ＴｈｒｅｏｎＩｎｅ　
　　　　Ｔｒｐ　：　ＴｒｙｐｔｏｐｈａｎｅＴｙｒ　
　：　　丁ｙｒｏｓＩｎｅ　　　　　　　　　　Ｖａｌ
　　：　　ＶａｌｉｎｅＢ、、、ＢａｔａＨＩ　　Ｅ、
、、ＥｃｏＲＩ　　Ｋ１９．にｐｎ　Ｉ　　Ｐ、、、Ｐ
ｓｔ　ＴＳ、、、Ｓ層ａ　Ｉ　　Ｓａ、、、Ｓａｃ　Ｔ
　　Ｓａｌ、、、Ｓａｌ　　Ｉ　　Ｓｃ、、、Ｓｃａ　
１ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ二相補鎖デオキシリボ核酸 Ａ　　　：アデニン Ｔ　　　：チミン Ｇ　　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ　　：リボ核酸 ｄＡＴＰ　：デオキシアデノシン三すン酸ｄＴＴＰ　：
デオキシチミジン三すン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシ
ン三リン酸ｄＣＴＰ　：デオキシシチジン三すン酸ＡＴ
Ｐ　　：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウム ＣＳＦ　　：ＣＳＦ遺伝子 Ａｍｐ「またはＡｐｒ：アンビシリン耐性遺伝子Ｔｃｒ
　　：テトラサイクリン耐性遺伝子Ｎ　　　：入ファー
ジＮタンパク質遺伝子Ｎ’　　　　：Ｎタンパク質のＮ
末端の３３個のアミノ酸に対応するλファージＮタンパ
ク質遺伝子 Ｐｔａｃ　：Ｔａｃプロモーター ＰＬ　　　　：　ＰＬプロモーター Ｔ４Ｐｏｌ：Ｔ４　　ＤＮＡポリメラーゼＬａｃ　　Ｚ
：Ｌａｃプロモーターオペレーター領域及びβ−ガラク
トシダーゼの最初の１４５個のアミノ酸の領域 またＣＳＦの後の３桁の数字は、Ｃ末端アミノ酸の部位
を、ΔはＮ末端の欠損を意味し、そのうしろの数字は欠
損のアミノ酸配列を表わす。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の遺伝子のＤＮＡ断片の塩基配列を示
す。 第２図は、本発明の遺伝子のＤＮＡ断片の翻訳領域の塩
基配列を示す。 第３図は、本発明の遺伝子のＤＮＡ断片がコードするポ
リペプチドのアミノ酸配列を示す。 第４図は、本発明実施例５０Ｍ−ＣＳＦ活性を有するポ
リペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むｐ
ＢｓＩＩＣＳＦの構築工程を示す、　ＭＣＳ　−−−Ｍ
ｕｌｔｉｃｌｏｎｉＢ　５ｉｔｅ第５図は、ｐＢＳｎＣ
ＳＦからｐＢＳＳ及びｐＢＳＬ（１）再構築工程を示す
。 第６図は、本発明実施例６の制限酵素地図を示す概略線
図である。 第７図は、本発明実施例６による塩基配列の決定に用い
た制限酵素切断部位と塩基配列を決定した方向及び範囲
を示す概略線図である。 第８図は、本発明実施例７におけるＭ−ＣＳＦ活性を有
するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を
含む発現ベクターｐＳＶＬ−ＣＳＦの構築工程を示す。 矢印はプロモーターの働く方向を示す。 第９１！ｌは、本発明実施例８におけるＭ−ＣＳＦ活性
を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝
子を含む発現ベクターｐＳＶ２￥−ｈｃｓＦ１−ｍｄｈ
　ｆ　ｒの構築工程を示す、矢印はプロモーターの働く
方向を示す。 第１Ｏ図は、ヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦのアミノ酸配列を示
す。 第１１図は、ヒ）Ｍ−ＣＳＦｃＤＮＡの全塩基配列を示
す。 第１２図は、ブー＞スミドｐＳＶＬ−ＣＳＦ２１４及び
プラスミドｐＳＶＬ−ＣＳＦ２３８構築の模式図、第１
３図は、プラスミドｐＢｓｓＥＲ１１築の模式図、第１
４図は、ブラスミＦｐＳＶＬ−ＣＳＦ２１４Ｓ及ＵｐＳ
ＶＬ−ＣＳＦ２３ＢＳ構築の模式図、第１５図は、プラ
スミドｐＳＶ２ｄ−ＣＳＦ２１４及びプラスミドｐＳＶ
２ｄ−ＣＳＦ２３Ｂ構築の模式第１６図は、ｐＵＣ−Ｃ
ＳＦ２１４の構築の模式図である。 第１７ａ図は発現ベクターｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４の構
築の模式図で、第１７ｂ図は発現ベクターｐＰＬＮ−Ｃ
ＳＦ２１４△３の構築の模式図である。 第１８図は、ｐＵＣ−ＣＳＦ２３８の構築の模式図であ
る。 ｌＦＩ　１９　ａ図は発現ベクターｐＰＬＮ−ＣＳＦ２
３Ｂの構築の模式図で、第１９ｂ図は発現ベクターｐＰ
ＬＮ−ＣＳＦ２３８△３の構築の模式図である。 第２０図は、大腸菌より得られるＭ−ＣＳＦのアミノ酸
配列を示す。 ○　　　　ｏ　　　　Ｏ Ｑ　　　　Ｏ。 ＣＪＯｏｃ ｏｃ　　　ｏｔ−ｏｃ ＜＜　　　１−１−　　　ＣｕＱ＋ Ｃ）ｌ− ＣＪ４＋ ←φ Ｉ＋ＩＩｏｌｏ　　　　　ロＩ：　　　　（Ｊｅ（−＜
　＞　　＜　＠　　　（ｍ Ｑｚ　　　＜Ｊ　　　＜＜　　　＜＜ Ｑ　ロ （ＪＩ＋ ＣＪＩＩ＋ Ｃ：ｌｌ１ＩｃＪＩ＋ ＜飄　　　　Ｕａ＋ く−←φ ｏｂｏＱ− マＱｇ　ロ←− ｈ＜ｌ＋ａｏ口〉 ｏ−トｂ ←ｓ＋　　　ＣＪ＆１ ０＞　　　＋の ロー　　Ｑ＠ ←嬬　　Ｑ− 〇＞　　ロく ０＋ｅＯコ ＜−ａ。 ←り ←　Ｃ Ｑ　＞ Ｃ３ ロ　！〉　　り　　く 第４図 ｃｏＲＩ Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　ＡＳｐ Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌ３／３ Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　５ｅｒ Ａｌａ　Ｃｙｓ　ＶａＩ　Ａｒｇ Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｌａ Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ａｌａ Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　５ｅｒ Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　５ｅｒ １１ｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　５ｅｒ Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ Ｈｉｓ　Ｍｅｔ　］ Ｔｈｙ　Ｓｅｒ　（ Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｉ Ａｓｐ　Ａｓｎ　ｌ ５ｅｒ　Ｃｙｓ　Ｆ Ｔｈｒ’　Ｐｒｏ　Ｌ Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａ Ｇｌｎ　ＡＳＩ）　Ｖ Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａ Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔ Ｘ　＝　ＰｈＣ又ｒｉ　５ｅｒ Ｙ　＝　Ｇｌｙ　ＳＣｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａ
ｒｇ　Ｐｒ。 Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ ｎ＝ｏ又は１ Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｓ 第１０図 Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ｔｈｉｓ Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｌａ　ｌ１ｅ Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ ｓｐ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅａｌ　Ｖａｌ　
Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。 ｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。 ｒｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ＧｌｕＶａｌ　Ａｓｐ
　Ｐｒｏ［Ｙ］、 Ｌｅａ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌ、ｅｕ　ＧｌルＧｌｕ　　
Ｘ　　Ｖａｔ　Ａｓｐ　ＧｉｎＬｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ
　Ａｓｐ　ｌ１ｅＡｌａ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌ
ｅｕＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　ＬｙｓＬｙｓ　
Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ＶａｌＳｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓ
ｎ　Ｃｙｓ　ＡｓｎＡＳｌ）　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ
　ＬｅｕＨｉｓ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＡｌａＧＩ
ｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ巳ｒ　　Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｉｎ ＳＣｒ ｈｅ １ｕ Ｐｒ。 Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ 第 図 服 （Ｎｅｔ）ｎ　　Ｘ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　
　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　ｌ１ｉｓ　　ＭｅｔＬｅｕ　Ｇ
ｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌ
ｎ　ＭｅｌＧｌｕ　（Ｙ）　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　
Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ八ｌへ　　Ｐｈｅ　　
Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｇｉｎ　　Ａｓｐ　　
Ｉｌｅ　　ＭｅｔＡｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａ
ｌａ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　ＶａｌＬｅｕ　Ｌｙｓ
　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　
ＴｙｒＡｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｔ＋ｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔ
ｈｒ　Ｉ’ｒｏ　Ｌｅｕ　ＧｌｎＰｂｅ　Ａｓｎ　Ｇｌ
ｕ　Ｔｈｒ　ＬｙｓΔｓｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＡ
ｓｎ　　Ｃｙｓ　　Ａｓｎ　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ｐｔ
１ｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　　ＣｙｓＰｒｏ　　Ａｓｐ　　
Ｃｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　　
Ｐｒｏ　　ＬｙｓＳｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ｌ
１ｉｓ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＡｌａＬＣｕ　Ｔｈ
ｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｃｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ
　ＴｈｒＧＩＬＩ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｌｃｕ　ｌ１ｉｓ
　Ｔｌ＋ｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｒ。 ：＜　＝　Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−又Ｉｊ　ＮＯＡｍ
ｉｎｏ　Ａｃ１ｄｎ＝ｏ又はＩ ＹＰｔ追又は９ｘ Ｚ　＝　ＧＬｙ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａ
ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ　ｌｄ　Ｎｏ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ五
Ｃし　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ し　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ ；　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ ？　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ ’、　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ ・Ｇ１ｆｔ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ ＩＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ ＋　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｔｒｐ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｅｒａ Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｉイｅｔ Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　５ｃｒ （Ｚ） Ｇｌｙ　ｌ１ｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　５ｅｒＣｙｓ　Ｇ
ｉｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　ＰｈｅＣｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ
　Ｌｙｓ　ＬｙｓＭｅｔ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ　　Ａｒ
ｇ　　ＡｓｐＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　、Ａｒ
ｇＡｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　ＶａＬＬｙｓ　ｖ
ａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ＶａｌＡｓｎ　Ｉｌｅ　Ｐｔ＋
ｅ　Ｓｃｒ　ＬｙｓＡｓｐ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｔ
ｈｒ　　ＬｙｓＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｌ
ａＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ＧｌｙＳｅｒ　Ｌ
ｃｕ　Ｌｃｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙ
ｓ　−Ｇｉｎ−５ｃｒ−Ｆ’ｒ℃−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｕ−手 続 補 正 書 平成２年１０月２２日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）次式のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
   ドする塩基配列を含有し、Ｍ−ＣＳＦ活性を有するポリ
   ペプチドをコードする遺伝子 【遺伝子配列があります。】 または、次式に示すヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦのアミノ酸配
   列を有するポリペプチドをコードする遺伝子 【遺伝子配列があります。】 （式中、ＸはＰｈｅまたはＳｅｒ、Ｙは【遺伝子配列が
   あります。】で示されるアミノ酸配列を示し、 ｎは０又は１を示す。） または、次式に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド
   をコードする遺伝子 【遺伝子配列があります。】 （式中ＸはＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−または０個のアミ
   ノ酸を示し、ｎ＝０または１を示す。ＹはＰｈｅまたは
   Ｓｅｒを示し、Ｚは【遺伝子配列があります。】で示さ
   れるア ミノ酸配列または０個のアミノ酸を示す。）あるいはそ
   れらの相補鎖遺伝子。 （２）Ｍ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードす
   る遺伝子が次式で示されるアミノ酸配列をコードするも
   のであることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子又は
   その相補鎖遺伝子。 【遺伝子配列があります。】 （３）Ｍ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードす
   る遺伝子が次式で示される塩基配列を有するものである
   ことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子又はその相補
   鎖遺伝子。 【遺伝子配列があります。】 （４）Ｍ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードす
   る遺伝子が次式で示される塩基配列またはその一部を有
   するものであることを特徴とする請求項１に記載の遺伝
   子又はその相補鎖遺伝子。 【遺伝子配列があります。】 （５）ヒト単球系細胞から得られたメッセンジャーＲＮ
   Ａより作製されたものであるＭ−ＣＳＦ活性を有するポ
   リペプチドをコードする遺伝子又はその相補鎖遺伝子。 （６）Ｍ−ＣＳＦ産生ヒト単球系細胞株Ｕ９３７から得
   られたメッセンジャーＲＮＡより作製されたものである
   ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一つに記載の
   遺伝子又はその相補鎖遺伝子。 （７）Ｍ−ＣＳＦ産生ヒト単球系細胞株Ｕ９３７から分
   離され、シヨ糖密度勾配達心法による分画により２４．
   ７Ｓ〜２７．０Ｓ画分として得られるメッセンジャーＲ
   ＮＡより作製されたものであることを特徴とする請求項
   １〜６のいずれか一つに記載の遺伝子又はその相補鎖遺
   伝子。 （８）ヒト単球系細胞からメッセンジャーＲＮＡを得、
   ついでこれからＭ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを
   コードする遺伝子又はその相補鎖遺伝子を製造すること
   を特徴とする請求項１〜７のいずれか一つに記載の遺伝
   子又はその相補鎖遺伝子の製造法。 （９）ホルボールミリステートアセテート及びシクロヘ
   キシミドを加えた培地中で、Ｍ−ＣＳＦ産生ヒト単球系
   細胞株Ｕ９３７を培養することを特徴とする請求項８に
   記載の方法。 （１０）請求項１〜７のいずれか一つに記載の遺伝子又
   はその相補鎖遺伝子と実質的に完全なかたちでハイブリ
   ダイズするＤＮＡ。 （１１）請求項１〜７のいずれか一つに記載の遺伝子を
   含有する塩基配列により形質転換された生物体。 （１２）検出可能な標識物質の結合した請求項１〜７の
   いずれか一つに記載の遺伝子又はその相補鎖遺伝子。 （１３）請求項１〜７のいずれか一つに記載の遺伝子を
   含有する生物学的機能を有するプラスミド又はベクター
   。 （１４）請求項１〜７のいずれか一つに記載の遺伝子か
   ら誘導された発現ベクターで形質転換された宿主細胞に
   よって産生されるＭ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド
   。 （１５）該宿主細胞がＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞から
   成る群から選ばれたものである請求項１４に記載のポリ
   ペプチド。 （１６）該発現ベクターが、λＣＳＦ１−１、ｐＢＳI
   IＣＳＦ、ｐＢＳＳ、ｐＳＶＬ−ＣＳＦ及びｐＳＶ２＾
   ＊−ｈＣＳＦ１−ｍｄｈｆｒから成る群から選ばれたも
   のである請求項１４または１５に記載のポリペプチド。 （１７）図３の１位から５２２位までのアミノ酸配列を
   有する請求項１４〜１６のいずれか一つに記載のポリペ
   プチド。 （１８）次式に示すヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦのアミノ酸配
   列を有するものである請求項１４または１５に記載のポ
   リペプチド。 【遺伝子配列があります。】 （式中、ＸはＰｈｅまたはＳｅｒ、Ｙは【遺伝子配列が
   あります。】で示されるアミノ酸配列を示し、 ｎは０又は１を示す。） （１９）該遺伝子が、第１０図で示されるヒト尿由来Ｍ
   −ＣＳＦのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、動
   物細胞で機能するプロモーター配列および増幅可能な遺
   伝子のＤＮＡ配列を含むＭ−ＣＳＦ発現ベクターである
   請求項１３に記載のベクター。 （２０）請求項１３または１９に記載の発現ベクターを
   細胞に導入し得られた形質転換体を培養し、生産される
   Ｍ−ＣＳＦを採取することを特徴とするＭ−ＣＳＦの製
   造方法。 （２１）次式に示すアミノ酸配列を有し、ホモダイマー
   形態となっていてもよい請求項１４に記載のポリペプチ
   ド。 【遺伝子配列があります。】 （式中ＸはＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−または０個のアミ
   ノ酸を示し、ｎ＝０または１を示す。ＹはＰｈｅまたは
   Ｓｅｒを示し、Ｚは【遺伝子配列があります。】で示さ
   れるア ミノ酸配列または０個のアミノ酸を示す。）（２２）該
   遺伝子が図２０に示されるアミノ酸配列を有するポリペ
   プチドをコードするＤＮＡ配列及び微生物中で機能する
   レプリコンを含んでなる複製可能なクローニングベクタ
   ーである請求項１３に記載のベクター。 （２３）適当な制御配列に作用可能に連結された図２０
   に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
   するＤＮＡ配列を含んでなる発現系である請求項１３に
   記載のベクター。 （２４）ヒトＭ−ＣＳＦモノマー蛋白質の発現が、２シ
   ストロン法によっている請求項２３に記載のベクター。 （２５）請求項２３または２４に記載のベクターを用い
   て形質転換せしめられた微生物である請求項１１に記載
   の生物体。 （２６）図２０に示されるアミノ酸配列を有するポリペ
   プチドをコードするＤＮＡ配列を含み、ヒトＭ−ＣＳＦ
   モノマータンパク質を発現可能なプラスミドを保有する
   形質転換体を培養し、生産されるヒトＭ−ＣＳＦモノマ
   ータンパク質を採取し、必要に応じその得られたヒトＭ
   −ＣＳＦモノマータンパク質を生物学的に活性なホモダ
   イマーに再構成することからなる請求項２０に記載の方
   法。