JPH01104176A - 遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １泉よＬ皿里会１ 本発明は、医薬として有用なヒトのコロニー刺激因子（
Ｃｏｌｏｎｙ−３ｔｉｍｕｌａｔｉｎａ　　Ｆａｃｔｏ
ｒ　。

Ｃ３Ｆ）をコードする新規な遺伝子に関する。

ｉ−夏一五一五一貨　　　　　　　　□・一般に、造血
細胞の増殖、分化には特定の増殖　　。

及び分化因子が必要とされており、最終的に成熟　　１
した各種の血球、例えば赤血球、顆粒球、マクロファー
ジ、好酸球、血小板、リンパ球等になるま　　・での間
には、数多くの分化、増殖因子が関与している〔三浦恭
定著、血液幹細胞、中外医学社、１９８３年〕。之等の
中で顆粒球系前駆細胞及びマクロファージ系ｔｆＪ駆＃
ｌ胞の増殖、分化を刺激するものとしてＣ３Ｆが知られ
ており、かかるＣ３Ｆには、顆粒球の形成に特異性を有
するＧ型（Ｇ−Ｃ３Ｆ＞　、マクロファージの形成に特
異的なＭ型（Ｍ−Ｃ３Ｆ）及び顆粒球とマクロファージ
の両方の形成を促進するＧＭ型（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）が知ら
れている。また更に多能性幹細胞に作用するＣ３Ｆとし
て、マルチＣＳＦ　（Ｍｕｌｔｉ−Ｃ３Ｆ　：ＩＬ−３
＞も知られている。

上記Ｃ３Ｆは、その生物活性に基づき、癌化学療法及び
放射線療法時の共通した欠点である白血球の減少を軽減
させるものと考えられ、この観点から臨床研究が行なわ
れている。

また、上記Ｃ３Ｆは、白血球の機能を促進させる作用を
有することが知られており〔ロペッツら＜ＬＯｐｅｚ、
　Ａ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、）、Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、。

１３１．２９８３　（１９８３）　、ハンダムら（Ｈａ
ｎｄａｍ、Ｅ、ｅｔ　　ａｌ、）、同１２２．１１３４
（１９７９）及びバダスら（Ｖａｄａｓ、　Ｍ、　Ａ、
　ｅｔａｌ、　）、同１３０，７９５　（１９８３））
、このことから、種々の感染症の予防及び治療薬として
の有効性が確認されている。

更に、Ｃ３Ｆの分化誘導作用〔メットカーフら（Ｍｅｔ
ｃａｌｆ’、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　　ｌ　ｎｔ、　
Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ。

ＪΩ、７７３　（１９８２））に基づき、該Ｃ３Ｆは骨
髄性白血病の治療剤として有効性が認められている。

しかして、Ｃ３Ｆは例えば胎児細胞、牌細胞等の培養液
、人尿、種々の株化培養細胞の培位液等にその活性が認
められ、該活性画分として分離、利用されているが、い
ずれの起源のものも該起源に由来する類似した多口の夾
雑物質等の混在及びＣ３Ｆ自体の濃度の低さが障害とな
り、その製造面で問題を残しており、均質性、収量、操
作等の面から、医薬品としてのＣＳＦを産業的に継続し
て得る手段は、未だ見出されていない。

本発明者らは、先にＣ３Ｆを常時均質な状態で多量産生
することのできる、ヒト白血病下細胞由来のＪ７９．７
７株化細胞であるｒＡＧＲ−ＯＮＪを確立し、該細胞に
係わる発明を特許出願した（特開昭５９−１６９４８９
＠公報）。また、本発明者らは、上記ＡＧＲ−ＯＮの産
生するＣ３Ｆにつき、更にその、精製を重ねた結果、該
Ｃ３Ｆを純粋な形で筒中にしかも高収率で収得する方法
を開発し、またかくして得られるＣ３Ｆの構造的特徴及
び生化学的特徴を解明し、かかる物質としてのＣ３Ｆに
係わる発明を完成し、特許出願した（特願昭６１−１２
８５０＠）。

上記光の発明に係わるＣ３Ｆは、Ｍ−Ｃ３Ｆ、即ち、正
常骨髄細胞に作用してマクロファージの分化増殖を促進
させる活性を有するＭ蛋白質であって、下記の理化学的
性質を有する点において特徴付けられるもので、ｒＡＧ
Ｒ−ＯＮ−Ｃ３ＦＪと呼ばれた。

ａ）分子量： 非還元条件下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
により、３３０００〜４３０００ダルトンであり、 非還元条件且つＳＤＳ存在下でのゲル濾過で、２３００
０〜４００００ダルトンでおる、ｂ）蛋白質部分のＮ端
アミノ酸配列： 次の一次構造式で表わされる配列を有する。

Ｖａｔ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−８ｅｒ−旧
５−Ｎｅｔ−１１ｅ−Ｇｌｖ−ｓｅｒ’−Ｇ＋ｙ−旧５
−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−八ｒｇ−
Ｌｅｕ−ｔｌｅ−＾５ｐ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｅｔ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｈｒ発明が　決しようとする問題１、 本発明の目的は、上記ヒトＭ−ＣＳＦを、遺伝子工学的
手法によって、より容易に且つ大量に製造、供給するた
めの技術、殊に該技術に有用な遺伝子を提供することに
ある。

本発明者らは、引続く研究において、上記ＡＧＲ−ＯＮ
−Ｃ３Ｆの由来細胞であるＡＧＲ−ＯＮからメツセンジ
ｐ−ＲＮＡ　（ｒｒ＋ＲＮＡ）を抽出し、該ｍＲＮＡか
らその相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を調製し、上記ＡＧＲ
−ＯＮ　−、Ｃ３Ｆのアミノ酸配列情報に基づいて所望
のＭ−Ｃ３ＦをコードするｃＤＮＡを選択し、該ＣＤＮ
Ａを含むベクターをｆＭ製し、該ベクターを宿主細胞に
導入して形質転換体を製造し、これを培養して目的の生
物活性を有するＭ−Ｃ３Ｆの生成を確認するに至り、こ
こに本発明を完成した。− ４点を解決するための手。

即ち本発明は、下記式（１）のアミノ酸配列情報に基づ
いた、生物活性のヒトＭ−Ｃ３Ｆ分子をコードすること
を特徴とする遺伝子に係わる。

式（１）： ％式％ １１ｅ−丁ｂｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａ　ｌ−３ｅｒ−
Ｇｌｕ−丁１／ｒ−ＣＶＳ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｎｅｔ−
１１ｅ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｉ　
１ｅ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−）１ｅｔ−Ｇｌｕ−丁
ｈｒ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｉ　１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ
−Ｃｙｓ−丁Ｖｒ−Ｉ−ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ
−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−１ｅｕ−Ｖａｌ　−ｇ？ｎ−しｙｓ
−へｓｎ−へＳｎ−，５ｅｒ−）’ｎｅ−ＡＩａ−［ｊ
ｌＵ−にｙ５−）ｅｒ−＞ｅｌ’−ＧＩｎ−八５ｐ−Ｖ
ａ　Ｉ　−ｖａ　Ｉ−丁ｂｒ（ｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−
Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−丁ｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｙｓ−ＡＩａ−１１ｅ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−８ｅｒ−Δ５
ｐ−Ｐｒｏ−八Ｉａ−３ｅｒ−ＶａＩ−３ｅｒ−Ｐｒｏ
−旧５−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−八Ｉａ−Ｐｒｏ−３
ｅｒ−Ｎｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＧＴ
ｙ−Ｌｅｕ−丁ｈｒ−丁ｒｌ）−Ｇｌｕ−ＡＳｐ−３ｅ
ｒ−ＧＩＵ−ＧＩｙ−丁ｈｒ−Ｍ’ｉ’ｕ−Ｇｌｙ−３
ｅｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−）１ｉｓ−丁ｈｒ−Ｖａ
ｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇ！ｙ−３ｅｒ−八＋ａ−ｔｙｓ
−ＧＩｎ−へｒｇ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−へｒＣ）−５ｅｒ
−丁ｈｒ−ＣｙＳ−Ｇｌｎ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−丁ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖ
ａｌ−Ｌｙｓ−へ５ｐ−３ｅｒ−丁ｂｒ−１１ｅ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−八Ｉａ−Ｐｈｅ−
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−）１ｅｔ−ＧＩＵ−Ａ５１）
−月ｅ−ＬｅｔＪ−ＡＳｐ−３ｅｒ−Ａｌａ−）１ｅｔ
−ＧＩｙ−丁ｈｒ−ＡＳｎ−丁ｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−３ｅｒ−ＧＩｕＪ　Ｉｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−丁ｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒ
−Ｐｒｏ−３ｅｒ−八ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−ＡＳｎ−Ｐｈｅ−ＬｅＵ−３ｅｒ−Ａｌａ−３
ｅｒ−３ｅｒ−ＰｒＯ−Ｌｅｕ−ＰｒＯ−Ａｌａ−３ｅ
ｒ−八Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ
−Ａｌａ−ＩＩ　ｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−３ｅ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｖａ　Ｉ
　−Ｐｈｅ−Ｈｉ　５−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒ
ｏ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｉ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−丁ｙｒ−Ａｒｇ−丁ｒｐ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−八ｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−
へｓｐ−へｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｖａｌ 〔式中、ＸはＴｙｒ又はＡＳＤを示す。〕水開明１ｉｌ
ｌｌ書において、ペプチド及びアミノ酸の表示は、ＩＬ
ＪＰＡＣにより採択されているアミノ酸命名法における
略号乃至当該分野で演用されているそれに従うものとし
、ＤＮＡ塩基配列及び核酸の表示も同様とする。

本発明の遺伝子は、その利用により、遺伝子工学的手法
によって、ヒトＭ−Ｃ３Ｆを容易且つ大■に製造するこ
とができ、かくして得られるＭ−Ｃ３Ｆは、前記したご
とく、その生物活性に基づいて、例えば白血球減少を伴
う疾病もしくは病態の予防及び治療薬として、骨髄移植
の補助剤として、各種感染症の予防及び治療薬として、
更に抗癌剤等として、殊に医薬分野で有用である。

以下、本発明遺伝子につき詳述する。

本発明遺伝子は、例えばＭ−Ｃ３Ｆ産生能を有するヒト
細胞、より具体的且つ有利には＃記ＡＧＲ−ＯＮより分
離されたｍＲＮＡから調製される。以下、この調製の詳
細をＡＧＲ−ＯＮを用いて説明するが、他の細胞でも同
様である。起源細胞として利用されるＡＧＲ−ＯＮは、
特開昭５９−１６９４８９号公報に記載された特性を有
するヒト白血病Ｔ細胞由来の亡ト培養株化細胞であり、
これはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ＡＴＣＣ＞にｒＡＴＣＣ受託Ｎｏ。

ＣＲＬ−８１９９Ｊとして受託されている。

上記ＡＧＲ−ＯＮからのｍＲＮＡの分ｍｔｔ、基本的に
は通常の抽出操作に従い実施される。より詳しくは、上
記ＡＧＲ，ＯＮを、まず例えば０２Ｍ培地、ＣＭＲＬ−
１０６６培地、ＤＭ−１６０培地、イーグルの最小必須
培地（Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ）　、フィッシャーの培地
（Ｆ　１ｓｔ）ｅｒ’ＳＭｅｄｉｕｍ　）　、Ｆ　−１
０培地、Ｆ−１２培地、Ｌ−１５培地、ＮＣ丁Ｃ−１０
９培地、ＲＰＭＩ−１６４０培Ｊ１！１等又は必要に応
じて牛胎児血清（Ｆｅ２）等の血清やアルブミン等の血
清成分を添加した上記培地で、約ｌＸ１０’〜ｌＸｌ０
７個／ｍＱの濃度範囲で、通常の培養法例えば炭酸ガス
培養法等に従い、約３０〜４０’Ｃ程度、好ましくは約
３７°Ｃ前後で１〜５日間を要して培養する。

次いで培養上清中にＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ３Ｆが生産蓄積さ
れる時期に、上記培養細胞を、適当な界面活性剤、例え
ばＳＤＳ、ＮＰ−４０，トリトンＸ１００、デオキシコ
ール酸等を用いて、或いはホモジナイザーを用いる方法
や凍結融解等の物理的方法によって、部分的又は完全に
破壊、可溶化した後、染色体ＤＮＡを、ポリトロン等の
ミキサーもしくは注射筒を用い、ある程度せん断し、そ
の後、蛋白質と核酸分画とを分別して全ＲＮＡの抽出を
行なう。この操作には、特にフェノール・クロロホルム
抽出もしくは超遠心を用いるｅｓｃＱ重層法〔チルブラ
インら（Ｑｈｉｒｇｗｉｎ、Ｊ、　Ｍ、。

ｅｔ　　ａｌ、）、バイオケミストリー（３ｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）。

１旦、５２９４　（１９７９））等が一般に用いられる
。

また上記各方法においては、ＲＮ　ａｓｅによるＲＮＡ
の分解を防ぐために、ＲＮ　ａｓｅインヒビター、例え
ばヘパリン、ポリビニル硫酸、ジエチルピロカーボネー
ト、バナジウム複合体、ベントナイト、マカロイド等を
添加使用することもできる。

上記抽出操作に従い得られるＲＮＡからのｍＲＮＡの分
離、精製は、例えばオリゴｄニーセルロース［コラボレ
イティプ　リサーチ社（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｉｎｃ、　　コ、ポリＵ−セフ
ァロース［ファルマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃ　ｉａ　）
社コセファロース２Ｂ［ファルマシア社］等を用いて吸
着カラム法又はバッチ法により実施できる。

かくして得られるｍＲＮＡからの、目的のＭ−Ｃ３Ｆに
対するｍＲＮＡａ５精製濃縮及び同定は、例えば得られ
たｍＲＮＡをＭＭ密度勾配遠心等によって分画し、その
分画につき、蛋白質のＨｌｔ：Ｊ＋系、例えばアフリカ
ッメガエルの卵母細胞への注入やウサギ網状赤血球ライ
ゼート又は小麦胚芽等の無細胞系で蛋白質に翻訳させ、
その蛋白質のＭ−Ｃ３Ｆ活性を調べることにより実施で
き、かくして目的とするｍＲＮＡの存在を確認できる。

更に目的とするｍＲＮＡの確認は、上記Ｍ−Ｃ３Ｆの活
性測定に代えて、Ｍ−Ｃ３Ｆに対する抗体を用いる免疫
法によっても行ない得る。

上記により得られる精製ｍＲＮＡは、通常不安定である
ため、これを安定なＣＤＮＡに変換し、目的遺伝子の増
幅を可能とするために微生物由来のレプリコンに接続す
る。インごトロでの、上記ｍＲＮＡのＣＤＮＡへの変換
、即ち本発明の目的遺伝子の合成は、一般に次のように
して行なうことができる。

即ち、まずオリゴｄＴをプライマーとしくこのプライマ
ーは遊離のオリゴｄＴもしくは既にベクタープライマー
に付加されたオリゴｄＴのいずれでもよい）　、ｍＲＮ
Ａを鋳型としてｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ又はｄＴＴＰ）の存在下で、逆転写酵素を用いてｍＲ
ＮＡがらこれに相補的な一本鎖ＣＤＮＡを合成する。次
のステップは、上記においてｉ＠のオリゴｄｌ’−を用
いたか、ベクタープライマーに付加されたオリゴｄＴを
用いたｂにより、各々以下の如く異なる。

前者の場合、鋳型としたｍＲＮＡをアルカリ処理等によ
り分解して除去し、その後−本ｌＤＮＡを鋳型として逆
転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖Ｄ　Ｎ
　Ａを作成する。次に得られる二本鎖ＤＮＡの両端をエ
キソヌクレアーゼで処理し、そのそれぞれに適当なリン
カ−ＤＮＡ又はアニーリング可能な組合せの塩基を複数
付加し、これを適当なベクター、例えばＥＫ系プラスミ
ドベクターやλｇｔ系フ１−ジベクター等に組込む。

また、後者の場合、鋳型としたｍＲＮＡを残存させたま
ま、上記と同様のリンカ−を付与した開環状プラスミド
と、リンカ−ＤＮＡ　（Ｌばしば動物細胞で自立復製で
きる領域とｍＲＮＡの転写プロモーター領域を含むＤＮ
Ａ断片が用いられる）とを、アニーリングさせて閉環状
とした後、０丁−ＮＰ存在下で、ＲＮａｓｅとＤＮＡポ
リメラーゼとを共存させて、ｍＲＮＡ８ＤＮＡ鎖に置換
し、完全なプラスミドＤＮＡを作成できる。

上記のごとくして得られるＤＮＡは、これをベクターの
宿主、例えばエシェリヒア　コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉ）　、バチルス　ズブチリス（３ａｃｉｌ
ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、サツカロミセス　セレ
ｅシ７工（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）等の適当な宿主内に導入して、これを形質
転換することができる。このＤＮＡの宿主への導入及び
これによる形質転換の方法としては、一般に用いられて
いる方法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集め
、ＣａＣＱ２処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい状
態にして、プラスミドを取り込ませる方法等を採用でき
る。上記方法においては、通常知られているように形質
転換の効率を一層向上させるためにＭ　ｇＣＱ２やＲｂ
ＣＲを更に共存させることもできる。また、宿主細胞を
スフェロプラスト又はプロトプラスト化してから形質転
換させる方法も採用することができる。

上記により得られる形質転換株から、目的のＭ−Ｃ３Ｆ
のＣＤＮＡを有する株を選出する方法としては、例えば
以下に示す各種方法を採用できる。

（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリ
ーニング法 目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明されて
いる（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、
目的蛋白のどの領域のものでもよい）場合、該アミノ酸
に対応するオリゴヌクレオチドを合成しくこの場合、コ
ドン使用頻度を用いて導いた塩基配列又は考えられる塩
基配列の組合ぜの複数個のどちらでもよく、また後者の
場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこともでき
る）、これをプローブ（３２Ｐ又は３５Ｓでラベルする
）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセ
ルロースフィルターとハイブリダイゼーションし、得ら
れたポジティブ株を検索して、これを選出する。

（２）動物細胞でＭ−Ｃ３Ｆを産生させてスクリーニン
グする方法 形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフェクトしくこの場合、自己複製可
能でｍ　ＲＮＡ転写プロモーター領域を含むプラスミド
もしくは動物細胞染色体にインチグレートするようなプ
ラスミドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋
白質を産生させ、その培養上清もしくは細胞抽出物のＭ
−Ｃ３Ｆ活性を測定するか、又はＭ−Ｃ３Ｆに対する抗
体を用いてＭ−Ｃ３Ｆを検出することにより、元の形質
転換株より目的のＭ−Ｃ３ＦをコードするＣＤＮＡを有
する株を選出する。

（３）Ｍ、−ＣＳＦに対する抗体を用いて選出する方法 予め、ｃＤＮＡを形質転換株内で蛋白質を発現し得るベ
クターに組込み、形質転換株内で蛋白質を産生させ、Ｍ
−Ｃ３Ｆに対する抗体及び該抗体に対する第二抗体を用
いて、Ｍ−Ｃ３Ｆ産生株を検出し、目的株を得る。

（４）セレクテイブ・ハイブリダイゼーション・トラン
スレーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるＣＤＮＡを、ニトロセルロース
フィルター等にプロットし、Ｍ−Ｃ３Ｆ産生細胞からの
ｍＲＮＡをハイブリダイゼーションさせた後、ＣＤＮＡ
に対応するｍＲＮＡを回収する。回収されたｍＲＮＡを
蛋白翻訳系、例えばアフリカッメガエルの卵母細胞への
注入や、ウサギ網状赤血球ライゼートや小麦胚芽等の無
細胞系で蛋白質に翻訳させ、その蛋白質のＭ−Ｃ３Ｆ活
性を調べるか、又はＭ−Ｃ３Ｆに対する抗体を用いて検
出して、目的の株を得る。

得られた目的の形質転換株よりＭ−Ｃ３Ｆをコードする
ＤＮＡを採取する方法は、公知の方法に従い実施できる
。例えば細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分
離し、該プラスミドＤＮＡよりＣＤＮＡ領域を切り出す
ことにより行ない得る。

かくして得られるＤＮＡは、本発明遺伝子の一具体例で
あり、第３図に示される３７２のアミノ酸配列又は第５
図に示される５５４のアミノ酸配列、で特定されるヒト
Ｍ−Ｃ３Ｆ前駆体をコードしている。

しかして、本発明遺伝子を利用して遺伝子工学的手法に
より得られる物質が、ヒトＭ−Ｃ３Ｆの生物活性を発現
するためには、該遺伝子は必ずしも上記ＤＮＡ、即ちヒ
トＭ−Ｃ３Ｆ前駆体のアミノ酸配列のすべてをコードす
るＤＮＡ配列を有するものでおる必要はなく、例えばそ
の部分配列であって、それがヒトＭ−Ｃ３Ｆの生物活性
発現を可能とする限り、それらのＤＮＡもまた本発明遺
伝子に包含される。

ヒトＭ−ＣＳＦの生物活性発現に、必ずしも前記式（１
）に示す全アミノ酸配列を必要としない事実は、例えば
上記前駆体の一方が、その３７２番目のアミノＭ（Ｐｒ
ｏ）をＣ末端アミノ酸としていること、又は前記ＡＧＲ
−ＯＮ−Ｃ３Ｆが、その３５番目のアミノ１（ｖａ＋）
を、Ｎ末端アミノ酸としていること、ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ
３Ｆ製造の際にＤＪ産物（マイナー成分）として、同３
３番目のアミノ酸（ＧＩＵ）又は同３７番目のアミノ酸
（ＧＩＩＪ）をそれぞれＮ、！端アミノ酸とする生物活
性のＭ−Ｃ３Ｆが得られること等からも明白でめる。更
に他のヘモボエチン間の一次構造上の類似性の知見から
、同２７番目の７ミノ１（Ａｌａ）をＮ末端アミノ酸と
するＭ−Ｃ３Ｆも天然に存在すると考えられる（Ｊ、　
Ｗ、　５ｃｈｒａｄｅｒ、ｅｔ　ａｌ、。

ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　、
Ｖｏｌ、　８３゜ｐｐ、２４５８−２４６２　（１９８
６））。

また、後述する実施例に示す通り、＃Ｊ記式（１ンに示
すアミノ酸配列における１７８番目のアミノ１（Ｃｙｓ
）以降のＣ末端側のアミノ酸配列は、ヒトＭ−Ｃ３Ｆの
生物活性発現には必ずしも必要でないことも確認されて
いる。

従って、本発明遺伝子は、式（１）に示されるアミノ酸
配列情報に基づいた、生物活性のヒトＭ−Ｃ５Ｆ分子を
コードする新規なりＮＡ配列を有することにより特徴づ
けられる。これには、より具体的には、式（１）に示す
全アミノ酸配列をコードするＤＮＡのほか、そのＮ末端
側アミノ酸配列の一部、例えばアミノ酸番号１〜２６．
１〜３２．１〜３４及び１〜３６の配列のいずれか、及
び／又はそのＣ末端側アミノ酸配列の一部、例えばアミ
ノ酸番号１７Ｂ以降の配列の全て又は−部、を欠失する
各々のアミノ酸配列をコードする各ＤＮＡ及び之等と実
質的に均等なりＮＡが包含される。

かかる本発明遺伝子は、上記情報に基づいて、例えばホ
スファイト　トリエステル法（Ｎ　ａｔｕｒｅ。

３１０．１０５　（１９８４））等の常法に従い、核酸
の化学合成により製造することもでき、また第３図に示
される３７２の、又は第５図に示される５５４の、アミ
ノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡを原
料として、通常の方法に従い製造することもでき、特に
後者の方法は簡便であり好適である。

この３７２又は５５４のアミノ酸配列からなるポリペプ
チドをコードするＤＮＡを原料とする方法において、一
部ＤＮＡの化学合成やＤＮＡ鎖の切断、削除、付加乃至
は結合を目的とする酵素処理やＤＮＡの単離、精製乃至
複製、選別等の各種操作乃至手段は、いずれも常法に従
うことができ、本発明遺伝子以外の遺伝子もしくはＤＮ
Ａ鎖について当該分野でよく知られている各種方法をい
ずれも採用することができる。例えば上記ＤＮＡの単離
精製は、アガロースゲル電気泳動法等に従うことができ
、核酸配列のコドンの一部の改変は、サイト−スペシフ
ィック　ミュータジエネシス（Ｓｉｔｅ　−３ｐｅｃｉ
ｆ’ｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８ユ、５６６２−５６
６６（１９８４＞）等に従うことができる。尚、上記に
おいて所望のアミノ酸に対応する遺伝暗号の選択は、特
に限定されるものではなく、利用する宿主細胞のコドン
使用頻度等を考慮して常法に従し）決定できる。

また、上記方法に従い得られる本発明遺伝子のＤＮＡ配
列の決定及びＭｌ認は、例えばマキサム−ギルバートの
化学修飾法（Ｍ　ａｘａｍ　−Ｇ　ｔ　ｌ　ｂｅｒｔ　
。

Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、、　６５．４９９−５６０（１
９８０））やＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレ
オチド鎮終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　ａｎｄＶｉ
ｅｉｒａ　、　Ｊ、　、　Ｇｅｎｅ　、■、２６９−２
７６　（１９８２））等により行うことができる。

かくして得られる本発明遺伝子の利用によれ（ま、遺伝
子組換え技術により、ヒトＭ−Ｃ３Ｆを容易に且つ大量
に製造、収得することができる。

このヒトＭ−Ｃ３Ｆの製造方法は、上記特定の本発明遺
伝子（ＤＮＡ）を利用することを除いて、従来公知の一
般的な遺伝子組換え技術に従うことカテきルＩ’３ｃｉ
ｅｎｃｅ、　２２４．１４３１（１９８４）　：　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　３ｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、、　１３０．６９２　（１９８５）　：　Ｐ
ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、８０，５９９
０（１９８３）；ＥＰ特許公開第１８７９９１号公報、
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｑｌｏｎｉｎｇ、　ｂＶ　　Ｔ
、　Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ、、　Ｑｏｌｄ　３１
）ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　、
（１９８２）等参照〕。

より詳細には、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できる
ような粗換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入し
て形質転換し、該形質転換株を培養すればよい。

ここで宿主１胞としては、真核生物及び原核生物のいず
れをも用いることができる。該真核生物のｍ胞には、を
椎動物、酵母等のＩ［ｌ胞が含まれ、を椎動物細胞とし
ては、例えばサルの細胞で必るＣＯＳ細胞（Ｙ、（３１
ｕｚｍａｎ、　Ｃｅ１ｌ、２３．１７５−１８２（１’
９８１））やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒ
ドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｇ、　Ｕｒｌａｕｂ　ａ
ｎｄ　１．　Ａ、　Ｃｈａｓｉｎ　、　ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、３ｃｉ、、ＵＳＡ、互、４２１６−４
２２０　（１９８０））等がよく用いられているが、之
等に限定される訳ではない。を椎動物細胞の発現ベクタ
ーとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置
するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデ
ニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用で
き、これは更に必要により複製起点を保有していてもよ
い。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロ
モーターを保有するｐＳＶ２ｄＭｒ（Ｓ、Ｓａｂｒａｍ
ａｎｉ。

Ｒ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　Ｐ、　Ｂｅｒｒ＋、Ｍ
ｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

［３ｉｏ１．、ユ、８５４−７６４）等を例示できるが
、これに限定されない。

また真核微生物としては酵母が一般によく用いられてお
り、その中でもサツカロミセス屈酵母が有利に利用でき
る。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例
えば酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーターを
持つｐＡＭ８２　（Ａ。

Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ、旦ρ、１−５　（１９８３））等を好ましく利
用できる。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく
用いられている。本発明では例えば該宿主菌中で複製可
能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に本発
明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモー
ター及びＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）塩基配
列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付与した発現プ
ラスミドが使用できる。上記宿主菌としての大腸菌とし
ては、エシェリヒア−１す（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
　ｃｏｌｉ）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとし
ては一般にｐＢＲ３２２がよく用いられるが、これに限
定されず、公知の各種の菌株及びベクターがいずれも利
用できる。プロモーターとしては、例えばトリプトファ
ン・プロモーター、ＰＬプロモーター、Ｉａｃプロモー
ター、Ｉｐｐプロモーター等を使用することができ、い
ずれの場合にも本発明遺伝子を発現させることができる
。

宿主細胞として、ＣＯ８細胞を用いる場合を例にあげる
と、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を保有し
、ｃｏｓｍ胞において自律増殖が可能で必り、更に転写
プロモーター、転写終結シグナル及びＲＮＡスプライス
部位等を備えたものを用いることができ、例えば１多肥
実施例に示すプラスミドｐｃＤＥを用いる場合、ＳＶ４
０初期遺伝子プロモーター下流に位置する制限酵素Ｅ　
ＣＯＲ■部位に、本発明遺伝子を連結することにより、
目的とする発現プラスミドを得ることができる。

かくして１ｑられる所望の組換えＤＮＡの宿主細胞への
導入及びこれによる形質転換の方法としては、一般に用
いられている方法が採用でき、例えば上記プラスミドｐ
ｃＤＥに目的遺伝子が挿入された発現プラスミドは、Ｄ
ＥＡＥ−デキストラン法やリン酸カルシウム−ＤＮＡ共
沈澱法等により、ＣＯ８＄ｌｌｌ胞に取込ませることが
でき、か（して所望の形質転換細胞を容易に得ることが
できる。

かくして得られる所望の形質転換体は、常法に従い培養
することができ、該培養により生物活性のヒトＭ−ＣＳ
Ｆが生産、蓄積される。該培養に用いられる培地として
は、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを
適宜選択でき、例えば上記ＣＯ８細胞であれば、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地、ダルベツコの修正イーグル最小必須
培地（［）ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ　　Ｅ
ａｇｌｅ’ｓ　　ＭＥＭ＞等の培地に必要に応じ牛胎児
血清（Ｆｅ２）等の血清成分を添加したものを使用でき
る。

上記により、形質転換体の細胞内又は細胞外に生産され
るＭ−Ｃ３Ｆは、該Ｍ−Ｃ３Ｆの物理的性質、化学的性
質等を利用した各種の分離操作（「生化学データーブッ
クｌ１ｒＪ、１１７５〜１２５９頁、第１版第１刷、１
９８０年６月２３日、株式会社東京化学同人発行参照）
により、それらより分離、精製することができる。該方
法としては、具体的には例えば通常の蛋白沈澱剤による
処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル
濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマ１
−グラフィー、アフイニテイクロマトグラフィー、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロ
マトグラフィー、透析法、之等の組合せ等を例示できる
。

特に好ましい分離方法においては、まず培養上清より予
め目的とする物質を部分精製する。この部分精製は、例
えばＷｌｔ酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナ
トリウム等の塩析剤を用いる処理及び／又は透析膜、平
板膜、中空繊維膜等を用いろ限外濾過処理等により行な
われろ。之等の各処理の操作及び条件は、通常のこの種
方法のそれらと同様のものとすればよい。

次いで上記で１９られた粗精製物を、吸着クロマトグラ
フィー、アフイニテイクロマトグラフイー、ゲル濾過、
イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー等に付すことにより、又は之等各操作の組合せにより
、目的物質の活性が認められる両分を収得し、かくして
目的物質を均質な物質として単離することができる。

上記吸着クロマトグラフィーは、例えばフェニル−セフ
ァ０−ス、オクチル−セフ１０−ス等を担体として実施
できる。

アフイニテイクロマトグラフイーは、場合により例えば
Ｃ０ｎＡ−セフ１０−ス、レンチルレクチン−セファ０
−ス（ファルマシア社製）等の担体を利用したクロマト
グラフィーにより実施することもできる。

ゲル濾過は、例えばデキストランゲル、ポリアクリルア
ミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガ
ロースゲル、セルロース等を素材として用いて実施でき
る。上記ゲル濾過剤の具体例としては、セファデックス
Ｇタイプ、セファロースタイブ、セファクリルタイプ（
以上、ファルマシア社製）、セルロファイン（チッソ社
製）、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ（バイオラド社
製）、ウルトロゲルＡｃＡ　（ＬＫＢ社製）、ＴＳＫ−
Ｇタイプ（東洋曹達社製）等の市販品を例示できる。

イオン交換クロマトグラフィーは、例えばジエチルアミ
ンエチル（ＤＥ−ＡＥ）等を交換基とする陰イオン交換
体を利用したクロマトグラフィーにより実施できる。

逆相クロマトグラフィーは、例えばＣ１、Ｃ３、Ｃ４等
のアルキル基、シアノプロピル基、フェニル基等の官能
基がシリカゲル等の基体に結合された担体を用いて実施
できる。より具体的には例えばＣ４ハイボア一逆相ＨＰ
Ｌｃカラム（ＲＰ−３０４、バイオラド社製）を用いて
、移動相としてアセトニトリル、トリフルオロ酸１（Ｔ
ＦＡ＞、水等及び之等の混合溶媒を用いて実施できる。

上記方法により、容易に高収率、高純度で所望のＭ−Ｃ
３Ｆを工業的規模で製造できる。

上記で得られるＭ−Ｃ３Ｆは、これを医薬として用いる
に当り、その有効量を、薬理的に許容される通常の無毒
性担体と共に含有する薬理組成物の形態に調製され該形
態に応じた各種投与経路で投与される。その製剤形態と
しては、液状形態例えば溶液、懸濁液、乳濁液等が通常
採用され、之等は一般に経口、静脈内、皮下、皮肉、筋
肉的投与されるが、特に之等の形態及び投与経路に限定
されず、上記Ｍ−Ｃ３Ｆは、他の通常採用される経口、
非経口投与等に適した各種の製剤形態に調製することも
でき、また使用前に適当な担体の添加により液状となし
得る乾燥品とすることもできる。各種形態の製剤の投与
量は、所望の薬理効果、疾病の種類、患者の年齢、性別
、疾患の程度等に応じて適宜決定され、特に限定はない
が、通常有効成分とするＭ−Ｃ３Ｆを蛋白量として約０
．００１〜１ｍｇ、／ｋＭ日となる量で１日に１回乃至
数回に分けて投与すればよい。

実　　　施　　　例 以下、本発明遺伝子の￥Ａ造及びその利用によるＭ−Ｃ
３Ｆの製造、その￥ｆ徴等を、実施例として挙げて、更
に詳述する。

尚、各側で得られる試料のＣ３Ｆ活性は以下の方法によ
り測定されるものとする。

＜Ｃ３Ｆの活性測定法〉 牛胎児血清（Ｆｅ２）２０−１α−培地３０田及び２倍
濃度α−培地２０ｒｒＩＱを混和して得られる溶液を３
７℃にて保温し、その２３．３属を予め５０℃に保温し
た７％寒天（デイフコ社製）溶液”ｌｏｍＱと混合して
３７℃に保温する。

一方８ＡＬＢ／Ｃ系マウス大ＦｆｉＪ骨よりｒｉ取した
骨磨側胞（ＢＭＣ）を、ハンクス液で２回洗浄後、α−
培地にて細胞濃度が１０７個／田となるように調製し、
その１　ｍＱを上記３７°Ｃに保温しである寒天培地に
加え、よく混和した債、３７℃に保温し、次いでその０
．５鵬を、予め５０μＱの供試試料を入れたウェル（テ
ィッシュカルチャークラスター１２、コスタ−社製）に
加えて手早く混和して室温に放置する。各ウェルの寒天
が固化するのを待って炭酸ガスインキュベーターに移し
、更に３７℃で７日間培養する。

かくして生じたコロニー数を実体顕微鏡を用いて計測し
、Ｃ３Ｆ活性の指標とする。尚上記で生じるコロニーは
、形態学的及び酵素化学的観察の結果、いずれもマクロ
ファージコロニーであった。

実施例１ 本発明遺伝子の製造 ■　ＡＧＲ−ＯＮＩＩＩＩ胞の培養 ヒトＴ、ｆｌｌｌ胞培養株化細胞ＡＧＲ−ＯＮ（ＡＴＣ
Ｃ受託Ｎｏ、ＣＲＬ−８１９９＞を、１０％新生子牛血
ｍ　（ＮＣ３＞　、２０ｍＭ　　Ｎ−２−じドロキシエ
チルピペラジン−Ｎ’　−２−エタンスルホン酸（ＨＥ
ＰＥＳ）　、１００μｇ／ｍｌトレ、ブトマイシン、１
００単位／戒ペニシリンＧ、５０ｔｌＱ／ｍＱゲンタマ
イシン、５Ｘ１０−５Ｍ　　２−メルカプトエタノール
及び１ｍＭグルタミンを含むＲＰｆｌ−１６４０培地［
フローラボラトリー社製］にて、約１０５細胞／脱の細
胞濃度に調製した。その１Ｑを、２００ｍＧ容ティッシ
ューカルチャーフラスコ［コーニング社製１５本にて、
３７℃で７２時間培養した。

■　ｍＲＮＡの抽出 上記■で得りＡ　Ｇ　Ｒ−ＯＮ細胞約５Ｘ１０８ｗｉ胞
を、４Ｍ−グアニジンチオシアネート溶液［４Ｍ−グア
ニジンインチオシアネート、５゜ｍＭトリス−ＨＣＱ　
（ｐ）１７．６＞　、１０ｍＭＥＤ丁Ａ、２％ザルコシ
ル（Ｓ　ａｒｋｏｓｙｌ　）、１４０ｍＭ　　２−メル
カプトエタノールに溶解後、６０℃に加温しながら、Ｇ
１８Ｇ注射針をつけた５０鵬注射筒を用いてＤＮＡをせ
ん断した。

この溶液に６０℃に加温した等量のフェノール、１／２
６ｉｔの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（１）Ｈ５、２＞−
１０ｍＭトリス−ＨＣＱ　（ＤＨ７．４＞−１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ溶液及び等量のクロロホルム−イソアミルアル
コール（２４：１）混合液を加え、６０℃の水浴中で１
０分間振盪した後、４℃にて３　０　０　０　ｒａｍで
１５分間遠心分離した。水Ｍを取り、フェノール−クロ
ロホルム抽出を２回、更にクロロホルム抽出を２回行な
った後、２容の冷エタノールを加えて、−２０℃で６０
分間保持した。４℃にて３　０　０　０　ｒ’ＤＩＩｌ
で２０分間遠心し、沈澱したＲＮＡペレットを、１００
ｍＭトリス・ＨＣＱ　　（Ｊ）８７．４＞−５０ｍＭ　
　ＮａＣ！９−１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ−０，２％ＳＤＳ
溶液５０ｍＱに溶解後、プロティナーゼＫ　［ｐｒｏｔ
ｅｉｎａｓｅＫ、メルク社製コを２００μｇ／ｍＱの濃
度で加え、３７°Ｃにて６００分間反応せた。６０℃に
て、フェノール−クロロホルム抽出を２回、更にクロロ
ホルム抽出を２回行なった後、１／１０容の３ＭＦＩＦ
Ｗナトリウム（ｐＨ５，２＞及び２容の冷エタノールを
加えて、−７０’Ｃにて６０分間放置した。４°Ｃにて
３０００　ｒｐｍで２０分間遠心し、沈澱したＲＮＡペ
レットを冷７０％エタノールで洗浄後、丁Ｅ　２ｇ液［
１０ｍＭトリス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，５＞及び１ｍＭ　
　ＥＤ下Ａ］に溶解させた。

かくしてＡＧＲ−Ｏｎ胞５Ｘ１０８．ｆＩＩｌ胞から仝
ＲＮＡＲＮＡ約５得Ｑ。

次いで、上記で得られた全ＲＮＡからｍＲＮＡを塩１弾
するために、オリゴ（０丁）−セルロース「コラボレイ
テイプリサーチ社製Ｊを用いて、カラムクロマトグラフ
ィーを行なった。ｍＲＮＡの吸容は、１０ｍＭトリス−
ＨＣ２（ｐＨ７，５＞−１ｍＭ　　ＥＤＴＡ−０，５Ｍ
　　ＮａＣＱ溶液を用いて行ない、カラムを同溶液及び
１０ｍＭ＋−リス−ＨＣ；Ｑ　　（ｐ）−１７，５＞−
１ｍＭ　　ＥＤＴＡ−０，１Ｍ　　ＮａＣＱｒｍ液にて
洗浄後、１０ｍＭトリス・ＨＣＱ　（ｐＨ７，５＞−１
ｍＭ　　ＥＤＴＡを用いてＲＮＡを溶出させた。

上記により、ｍＲＮＡ約１１０１．ｔｇを得た。

■　ｃＤＮＡライブラリーの作製 上記■で得たｍＲＮＡ５μＣＩから、ＣＤＮＡを、ＣＤ
ＮＡ合成システム［アマジャム社製コを利用して合成し
た。

ｊ！７られたＣＤＮＡ約０．６μｑを、減圧乾燥した後
、５０ｍＭトリス−ＨＣ（２（ｐＨ７，５１１０ｍＭ　
　ＥＤＴＡ−５０ｍＭ　　ＤＴＴ−４０μＭＳ−アゾン
シルーし−メチオニン溶液２０μＱに溶解し、ＥＣＯＲ
′ＴＡイチ？−ゼ［二１−イングランドバイオラブ社製
］１６単位を加え、３７°Ｃにて１５分間反応させた。

この反応液を７０℃で１０分間加熱し、反応を停止させ
た後、フェノール−クロロホルム抽出を行ない、抽出液
に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）及び
２．５容のエタノールを加え、−７０’Ｃにて１５分間
放置した。４℃にて１５０００ｒｐｍで１５分間遠心し
、沈澱させたＤＮＡペレットを、５０ｍＭ　トリス−Ｈ
ＣＱ（ｐＨ７，５＞−１０ｍＭ　　ＭＱＣＱ２　１０ｍ
Ｍ　　ＤＴＴ−１ｍＭ　　ＡＴＰ−１００μＱ／ｍＱＥ
ＣＯＲＩリンカ−［宝酒造社製、５’　−ＧＧＡＡ丁Ｔ
ＣＣ−３’　コ溶液１０μＱＥ溶解後、これにＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ［宝酒造社製３３５０単位を加え、１４°Ｃ
にて１６時間反応させた。

得られた反応液を７０℃で１０分間加熱して反応を停止
させた債、１００ｍＭ　　ＮａＣＱ−５０ｍＭトリス−
ＨＣＱ　（ｐＨ７，５＞−７ｍＭＭＱＣＱ２　１０ｍＭ
　　ＤＴＴ）８液１６ｔ−ｔＱと、制限酵素ＥＣＣ）Ｒ
Ｉ［宝酒造社製］４０単位とを加え、３７℃にて３時間
消化させた。

反応液に０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０＞０．８
μＱを加え、反応を停止させた後、バイオゲルＡ３０ｍ
［バイオ−ラド社製コカラムクロマトグラフィーにて、
余剰のＥＣ０ＲＩリンカ−を除去した。ＣＤＮＡ画分に
、制限酵素ＥＣ０ＲＩで消化後、アルカリフォスファタ
ーゼにて、５′−リン酸基を除去したλｏｔ１１　ＤＮ
Ａ　ＥプロトクローンＧＴ　（Ｐｒｏｔｏｃｌ″−ｏｎ
ｅＧＴ）、プロメガバイオチク社製コ１μＱ、１／１０
容積の３Ｍ＃酸ナトリウム（ｐＨ５，２）及び２．５容
積のエタノールを加え、−７０’Ｃにて３０分間放置し
た。４℃に７１５０００ｒｌ）ｍで１５分間遠心し、沈
澱させたＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄後、
減圧（１乞燥し、水７μＱに溶解させた。

次に、５００ｍＭトリス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，５）１０
０ｍＭ　　ＭｇＣＱ２溶液２ｔｌＱを加え、４２°Ｃに
て１５分間保温した後、字部に戻し、１００ｍＭ　　Ｄ
王下１μＱ、１０ｍＭ　　ＡＴＰ１μＱ及びＴ　４　Ｄ
　Ｎ　Ａリガーゼ１７５単位を加え、１４°Ｃで１６時
間保温した。

次に、この反応液１０μＱにλフアージパッケージング
エクス１〜ラクト［Ｐ　ａｃｋａｏｅｎｅ　ｓｙｓｔｅ
ｍ、プロメガバイオチク社製Ｊを加え、２２°Ｃにて２
時間保温することにより、インビトロでリコンビナント
ファージＤＮＡのパッケージングを行なった。この溶液
に）戸−ジ希釈紺衝液［１００ｍＭＮａＣＱ−１０ｍＭ
トリス・ＨＣＱ（ｐＨ７，９＞−１０ｍＭ　　ＭｇＳＯ
３”７Ｈ２０コ　０．５ｍＱ及びクロロホルム２５μＱ
を加え４°Ｃで保存した。

■　ＣＤＮＡライブラリーのスクリーニング■−１１合
成プローブの作製 ＡＧＲ−ＯＮ培養上清から抽出単離されたＡ＜３Ｒ−Ｏ
Ｎ−ＣＳＦのアミノ酸配列（Ｎ末端より２７残塁〉の情
報に基づいて、合成プローブとして、下記塩基配列を用
いた。

Ｖａｔ　　−３ｅｒ　　−Ｇｌｕ　　−Ｔｙｒ　　−ｃ
ｙｓ　　−５’ＧＴＧ　　丁ＣＧ　　ＧＡＧ　　ＴＡＣ
ＴＧＴ３’　ＣＡＣＡＧＣＣＴＣＡ丁Ｇ　　ＡＣＡ３ｅ
ｒ　−Ｈｉｓ ＡＧＣＣＡＣ３’ 丁ＣＧ　　ＧＴＧ　　５’ 上記式に示した塩基配列に対する相補的な塩基配列（最
下段に示す）を、Ｍ−Ｃ３ＦをコードするＣＤＮＡを有
するリコンビナントファージの選出のためのプローブと
して利用するため、以下の方法により合成した。

即ち、Ｎ、Ｎ−ジアルキルメチルホスホロアミダイドｇ
４体を、縮合ユニットとして用いた同相ホスファイトト
リエステル法〔ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　、　３
１０．１０５（１９８４））にて、自動合成１［３８０
Ａ　　ＤＮＡシンセサイザー、アプライドバイオシステ
ムズ社製］を用０て、目的とする完全保護ＤＮＡを合成
した。続いて該完全保ｌＤＮＡを２８％アンモニア水で
５５℃で１０時間処理することにより５′末端のＯＨ基
に結合している保護基としてのＤＭＴｒ（ジメトキシト
リチル）基以外の保護基（Ａ、Ｇ、Ｃのアミノ基のアシ
ル基をさす）を脱保護させ、部分保護ＤＮＡ　（ＤＭＴ
ｒ休とよぶ）を得た。次いでこのＤＭＴｒ体をＯＤＳ　
（山村化学研究所社製）を担体とする逆相高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製後、８０％酢酸
を用いてｖ課で２０分間処理して、粗オリゴヌクレオチ
ドを得た。これをＯＤＳを担体とする逆相ＨＰＬＣによ
り更に精製して、目的とするオリゴヌクレオチドを得た
。

上記で得たＤＮＡ０．８μＧを、１００１１）反応液［
５０ｍＭトリス−ＨＣＱ　（ｐｌ−１７，６）、１０ｍ
Ｍ　　ＭｑＣ（２２、’ｌｏｍＭ　　２−メルカプトエ
タノール ＡＴＰ＞中で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ［宝酒造
］１Ｂ単位と、３７℃にて１時間反応させ、ＤＮＡの５
′末端を３２ｐで標識した。標識されたＤＮＡと未反応
の〔γ−３２Ｐ）Ａ丁Ｐを分別するために、バイオゲル
Ｐ−３０［バイオ−ラド社製］によるゲル濾過を行なっ
た。標識ＤＮＡ画分をプールし一２０’Ｃで保存した。

１ｑられたプローブの比放射活性は、１０８ｃｐｍ／μ
ｇＤＮＡ以上であった。

■−２．プラークハイブリダイゼーションエシェリヒア
・コリＹ１０９０株を、５０ｐｇ／鵬アンピシリン及び
０．２％マルトースを含むＬＢ培地［バクトドリプトン
１０Ｑ、バクトイ−スト抽出物５ｇ及びＮａＣＱ５ＣＪ
／Ｑコ４ｏｍｏに植菌し、３００ｒｎＱフラスコにて３
７℃で一夜振盪培養した。４℃にて３　０　０　０　ｒ
ｐｍで１５分間遠心して菌体を回収し、菌体のペレット
を２０鵬の８Ｍ培地［１００ｍＭ　　ＮａＣＱ　−５０
ｍＭトリス−ＨＣＱ（ＤＨ７，５＞−１０ｍＭ Ｍ　ＣＪ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２００，０１％ゼラチンコに
懸濁させ、４℃で保存した。

次に、上記菌液０．３鵬に、前記■で得られたりコンピ
ナン１−〕〕１−ジ粒子をＳＭＪＢｆＪ′ｌ！！にて３
、５ｘ１０”　ｐｆｕ　　（プラークフォーミンクユニ
ット）／ｍＱに希釈したちの０．１ｍＱを加え、３７℃
にて１５分間保温した。続いて、予め４７℃に保温して
あいたＬＢ軟寒天培地［バクトドリプトン１０ｇ、イー
スト抽出物５ｇ、ＮａＣＱ　５ＣＪ、アガロース７ｇ＃
　］　７７．５ｍを加えて混和した後、直径１５ｃｍの
シャーレに作ったｌ寒天プレート［バクトドリプトン１
０ｇ、バクトイ−スト抽出物５ｇ、Ｎａ０９５ｇ、バク
ト寒天１５ｇ／９］に重層し、４２℃にて一夜培養した
。尚、同様の傑作を合計２０枚のシャーレで実施した。

プラークの出現した寒天プレート上に、直径１３２ｍｍ
のナイロンフィルター［ＢＮＲＧ１３２、ボール社製コ
を載せることによって、レプリカフィルターを作製した
。寒天プレートはこれをマスタープレートとして４℃に
保存した。

フィルターを、０．５Ｍ　　ＮａＯＨ−１，５ＭＮａＣ
Ｑ、０．５Ｍトリス−ＨＣＱ　（ＤＨ７，５＞−１，５
Ｍ　　ＮａＣＱ及び０．３Ｍ　　ＮａＣＱ−０，０２Ｍ
　　ＮａＨ２ＰＯ４（Ｊ）Ｈ７−４）−０，００２Ｍ　
　ＥＤ下Ａ　（ｐＨ７，４＞にて順次処理し、風乾後、
真空下に８０’Ｃで１時間ベーキングを行なった。

ベーキング済みのフィルターを、０．７５ＭＮａＣＱ−
０，０７５Ｍクエン酸ナトｌ、Ｊウムー１０ｍ（１／＋
ｎ１２フィコール−１０ｍＣｌ／ｍ１２ポリビニルピロ
リドン−１０ｍＭｍｆ２ＢＳＡ−１０ｍＭリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ６，５）−０，２％５ＯＳ−０，１ｍｑ／ｍ
１２サーモンスパーム（Ｓａｌｍｏｎ　Ｓｐｅｒｍ）Ｄ
ＮＡ溶液５０鵬中で軽く振盪しながら、４２℃にて６時
間保温した。次にフィルターを１１０６ＣＤ／ｍＱの濃
度にプローブを加えた同波に移し、４２°Ｃにて２０時
間軽く振盪しながら、ハイブリダイゼーションを行なっ
た。

ハイブリダイゼーションの終わったフィルターを取り出
し、０．９Ｍ　　ＮａＣＱ−０，０９Ｍクエン酸ナトリ
ウムにて室温で３回洗浄し、その後、５６°Ｃで同溶液
にて５分間洗浄した。

フィルターを風乾後、増感紙を用いてＸ線フィルムＥＸ
Ｒ５、コダック社製Ｊに、−７０℃にて２日間オートラ
ジオグラフィーを行なった。

フィルムを現像後、シグナル領域に符合するプラークを
マスタープレートよりかき取り、上記の方法を繰返して
ポジティブシグナルを有するプラークの純化を行ない、
最終的に、代表的なポジティブクローンλＣＭ５及びλ
ｃＭ１１を単離した。

■　クローンの溝道解析 λｃＭ５のＣＤＮＡの制限酵素地図を作製した。

その結果を第１図に示す。

第１図より、ＣＤＮＡは全長的２．５キロベース（ｋｂ
）であり、その中にはＢＳｔＥ］Ｉ［ニューイングラン
ドバイオラブ社］、ＮＣ０Ｉ［宝酒造社Ｊ、５ＩＤａＩ
［宝酒造社コ、ＫｐｎＩ　［宝酒造社コ、ＥＣ０ＲＩ［
宝酒造社］及びＮｄｅ■Ｅニューイングランドバイオラ
ブ社Ｊにより切断される個所がそれぞれ１個所、また５
ＣａＩ［宝酒造社］、５ｔＵＩ［宝酒造社コ及びＢａｍ
ＨＩ［宝酒造社コにより切断される個所がそれぞれ２個
所ずつ存在することが確認された。

次に、上記ＣＤＮＡの塩基配列をマスタ−プレ−トの化
学修飾法及びＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレ
オチド鎖終結法にて決定した。

その結果を、第２図（第２図−１〜第２図−４）に示す
。

第２図より、合成プローブと相補的な領域が、５′末端
より２２７番目）２４７番目に存在（図に下線を付して
示す）した。

また、λｃＭ５のＣＤＮＡ中の最長のリーディングフレ
ーム（ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　）を検索したとこ
ろ、これは５′末端より１２５番目から１２４０２４０
番目にあり、そのコドンのフレームによる２２７番目〜
３０７番目の塩基配列に対応するアミノ酸配列は、ＡＧ
Ｒ−ＯＮ−Ｃ３ＦのＮ末端２７アミノ酸と完全に同一で
おった。このことは、λｃＭ５のＣＤＮＡがＭ−Ｃ３Ｆ
前駆体蛋白質をコードするＣＤＮＡであることを示して
いる。

以上の結果より、決定された２０Ｍ５のコードするＭ−
Ｃ３Ｆ前駆体蛋白質の蛋白−次構造を第３図（第３図−
１〜第３図−２）に示す。

また上記と同様にして決定された２０Ｍ１１ＣＤＮＡの
塩基配列を第４図（第４図−１〜第４図−４）に、その
コードするＭ−Ｃ３Ｆ前駆体蛋白質の蛋白−次構造を第
５図（第５図−１〜第５図−３）にそれぞれ示す。

実施例２ ＣＯ８細胞における組換えＭ−ＣＳＦ （ｒ−ＭＣＳＦ）の製造 この例に利用したＣ０８−１細胞とは、増殖量始点（Ｏ
ｒｉ）欠損の５Ｖ４０ＤＮＡで、サルの腎細胞ＣＶ１を
トランスフオームさせることによって、ＳＶ４０初Ｉｎ
伝子を発現し、■抗原陽性となった細胞である〔セル（
Ｃｅｌｌ　）、　２３゜１７５−１８２　（１９８１）
参照〕。

■　ＣＯ８細胞発現ベクターｐｃＤＥの作製まず、プラ
スミドｐｃＤＶ１（オカヤマら（１」。

Ｏｋａｙａｍａ、　Ｐ、　Ｂｅｒ（］　、　Ｍｏ１．　
Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　３゜２８０−２８９　（１９
８３））を、制限酵素ＫｐｎＩで切断し、次いで５′末
端及び３′末端の突出部分をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ［
ＢＲＬ社コで削り平滑末端とした。

一方、ＥＣ０ＲＩリンカ−（５’　−ＧＧＡＡＴＴＣＣ
−３’　＞［宝酒造社コの５′末端を、Ｔ″４４ポリヌ
クレオチドキナーゼりリン酸化し、これを先の平滑末端
としたＤＮＡ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
した。連結物を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、更に制限
酵素Ｈｉｎｄｌｎで切断し、得られた反応物をアガロー
スゲル電気泳動に付して、２５９０ベースペアー（ｂｐ
）のＥＣ０ＲＩ−Ｈｉｎｄ　ｍＤＮＡ断片を単離精製し
た。

また他方、プラスミドｐＬ１　（オカヤマら（）−１゜
Ｏｋａｙａｍａ、　Ｐ、　Ｂｅ＋ｃ＋　、　Ｍｏ１．　
Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　３゜２８０−２８９　（１９
８３））を、制限酵素ｐＳｔ■［宝酒造社コで切”断接
、５′末端及び３′末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用
いて平滑末端とし、このＤＮＡ断片に、上記と同様にし
てＥＣ０ＲＩリンカ−を連結させ、得られるＤＮＡ断片
を制限酵素）１ｉｎｄｌＩＩにて切断し、反応物をアガ
ロースゲル電気泳動に付して、５８０ｂｌ）のＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎｄｍＤＮＡ断片を単離精製した。

得られたＤＮＡＷｆｒ片と先に調製したＥ　ＣＯＲＩ　
−Ｈ１ｎｄｌＤＮＡ断片とを、丁４　Ｄ　Ｎ　Ａ　１，
１ガーセヲ用いて連結させて、所望のプラスミドｐｃＤ
Ｅを　□得た。

以上の概略を第６図に示す。

■　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＣＤＭ−Ｃ３Ｆの作製 ２０Ｍ５ＤＮＡを、制限酵素ＥＣ０ＲＩで部分澗化させ
、得られる反応物をアガロースゲル電気泳動に付し、Ｃ
ＤＮＡ部分（約２，５ｋｂ）をＥＣＯＲＣＯＲ工部分片
化断片単離精製した。

上記■で得られたＣＯ８細胞発現ベクターｐＣＤＥを制
限酵素ＥＣ０ＲＩで切断し、これを上記で調製したＣＤ
ＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させて、所
望のプラスミドｐＣＤＭ・Ｃ３Ｆを得た。

かくして得られたプラスミドを、エシェリヒア・コリＨ
８１０１株にトランスフオームさせて、目的のトランス
フ４−マントを、アルカリ溶菌法〔マニアナイスら（下
、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｉ）Ｉ）９
０．　Ｃｏ１ｄ　３ｐｒｉｎｇ）−１ａｒｖｏｒ　ｌ　
ａｂｏｒａｔｏｒ’ｙ　　（１９８２）　）によって、
得られるプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選択し
た。

以上の概略を第７図に示す。

■　ｒ−ｖｃｓＦの製造 上記■で得たＤＣＤＭ−Ｃ３Ｆを、Ｃ０８−１細胞に、
ＤＥＡＥ−デキストラン法（ｐｒＯｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、Ｖｏｌ、８
１　。

Ｄ　１０７０　（１９８４））にてトランスフェクトし
、該細胞におけるｒ−ＭＣＳＦの生産を以下の通り試験
した。

即ち、まずＣ０８−１細胞を、１０％牛脂児血清（ＥＣ
８）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で、約２．５Ｘ１０
５細Ｐ１１／　ｍ［２の細胞濃度に調製し、これをティ
ッシュカルチャークラスター６しコースタ−社製］に、
１ウェル当り２脱となる量で入れて、３７°Ｃで一夜、
炭酸ガスインキュベーターにてＪ８養した。

次いで培地を除去し、ＲＰＭＩ−１６４０にて細胞を２
回洗浄後、上記■で調製したｐｃＤＭ・Ｃ３ＦＩＯμｑ
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍＱ［５０ｍＭトリス
−ＨＣｌ２　（ＤＨ７，４）及び４００μ（Ｊ／ｍｆ２
ＤＥＡＥ　・デキストラン（７７）Ｌ／マシ７社製）を
含む］を加え、炭酸ガスインキ１ベーター内に４時間放
置した。更に培地を除去した後、ＲＰＭＩ−１６４０に
て細胞を２回洗浄し、これに１５０μＭクロロキンしシ
グマ礼装コを含むＲＰＭＩ−’１６４０１６４０培地３
え、３時間培養した。次に培地を除去し、細胞をＲＰＭ
Ｉ−１６４０にて洗浄後、１０％ＥＣ８を含むＲＰＭＩ
−１６４０培地にて、３７℃で７２時間、炭酸ガスイン
キュベーター内で培養した。

かくして得られた細胞培養物より培養上清及びその抽出
物を回収して、之等につき、それぞれの希釈倍率でのＣ
３Ｆ活性を測定した。

得られた結果を下記第１表に示す。尚、第１表には、コ
ントロールとしてｌ）　ＣＤＭ　−Ｃ３Ｆに代えて、ｐ
ｃＤＥを用いて上記と同一操作を行なった結果を併記す
る。また各活性測定試験は、同一試料につき各２回行な
った。

第１表 尚、第１表における数値は、プレート当りのコロニー数
（平均値）を示す。以降のＣ３Ｆ活性を示す表において
も同様とする。

■　Ｍ−Ｃ３Ｆ発現プラスミドｐｃＤＭ−ｃｓＦ−１８
５の作製 上記■で得たプラスミドｐｃｏＭ−ｃｓＥを利用して、
サイト−スペシフィック　ミュータジエネシス（Ｓ　ｉ
ｔｅ　−８ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａａｅｎｅｓｉｓ＞
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８１　、
５６６２−５６６６　（１９８４））の方法に従って、
第３図におけるアミノ酸番号１８６のアミノＭ（Ｌｙｓ
）を］−ドするコドン（ＡＡＧ＞を、終止コドン（ＴＡ
Ｇ）に置換して、第３図におけるアミノ酸番号１８５の
アミノ酸（Ｔｈｒ＞をＣ末端アミノ酸とする所望のＭ−
Ｃ３Ｆ発現プラスミドｐｃＤＭ・Ｃ３Ｆ−１８５を得た
。

その詳細は次の通りである。

叩も、まずプラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦよりＥｃｏＲＩ
−ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片（大きざ１．８ｋｂ）を切り出
し、これをＭ１３ｒＴ１１１フアージ（ＲＦ＞のＥＣ０
ＲＩとＥＣ０ＲＩの制限酵素サイトにクローニングし、
これから−重鎖（ｓｓ＞　Ｄ、ＮＡ（Ｍ１３−Ｃ３Ｆ）
を得、これをミュータジエネシスの鋳型とした。

一方、合成オリゴヌクレオチド［５’　−ＧＴＧＧＴＧ
ＡＣＣＴＡＧＣＣＴＧＡＴＴ−３’　　（プライマー）
コを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した後
、上記５ｓＤＮＡ　（Ｍ　１３−ＣＳＦ　）とハイブリ
ダイズし、アニーリング後、ｄＮＴＰＳの存在下に、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ１（クレノー断片）及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで各々処理して、１５°Ｃで１８時間インキュベ
ートした。

得うれたＤＮＡ＠ＪＭ１０５コンピテント細胞にトラン
スフオームし、生じたコロニーの内５０コロニーを、寒
天プレート上に植菌し、３７°Ｃで１８時間培養した。

生育したコロニーを含むフィルターを゛通常の方法によ
りアルカリ変性し、乾燥後、８０°Ｃで２時間ベーキン
グ処理した。このフィルターをプレハイブリダイズした
後、このものと、上記プライマーの５′末端を３２ｐ−
ｒ−Ａ丁Ｐでラベルした３２ｐ−プローベとを、１でハ
イブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたフィルター
を、６ｘｓｓｃ　（ｓａｌｉｎｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉ
ｔｒａｔｅ＞で、室温で１０分間、次いで５６°Ｃで４
分間各々洗浄し、屹燥させた後、−７０’Ｃで１８時間
オー１へラジオグラフィーを行なった。

変異したクローンの内から、Ｍ１３−Ｃ３Ｆ−１８５を
選び、これをＪＭ１０５に感染させて培養して、５ｓＤ
ＮＡ及びＲＦ　　ＤＮＡを調製した。

上記で得られたｓｓＤ　Ｎ　ＡのＭ１３ジデオキシヌク
レオチド鎖終結法により、目的とする遺伝子の変異を確
認した。

また上記ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ　　ＤＮＡよりＥ
ｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を調製し、これを上記■と同
様にして発現プラスミドに組込んで、所望のプラスミド
ｐｃＤＭ−Ｃ３Ｆ−１８５を得た。

このプラスミドを用いて、上記■と同様にして、ＣＯ３
−１１１１胞でｒ−ＭＣ３Ｆを発現させた。その結果を
下記第２表に示す。

第２表 ■　Ｍ−Ｃ３Ｆ発現プラスミドｐＣＤＭ−Ｃ３Ｆ−１７
７の作製 プライマーとして５’　−ＧＣＴＧＡＡＴＧＡＴＣＣＡ
ＧＣＣＡＡ−３’　を用いて、上記■と同様にして、第
３図におけるアミノ酸番号１７８のアミノ酸（Ｃｙｓ）
をコードするコドン（ＴＧＣ＞を終止コドン（ＴＧＡ）
に置換して、第３図におけるアミノ酸番号１７７のアミ
ノ１ｌｆｉ（ＧＩＬＩ）をＣ末端アミノ酸とする所望の
Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＯＯＭ−ＣＳＦ−１７７を
得た。

このプラスミドを用いて、上記■と同様にして、００３
−１細胞でｒ−ＭＣＳＦを発現させた。季古采を同様に
して下記第３表に示す。

Ｍ３表 上記第２表及び第３表に示す結果より、本発明遺伝子を
保有するプラスミドｐｃＤＭ−Ｃ３Ｆ−１８５及び同ｐ
ｃＤＭ−Ｃ３Ｆ−１７７の利用によれば、それぞれＭ−
Ｃ３Ｆの生物活性を示す所望のｒ−ＭＣ３Ｆを発現でき
ることが判る。

このことから、少なくとも第３図に示すアミノ酸配列に
おけるアミノ酸番＠１７８以降のＣ端側のアミノ酸配列
は、目的とする生物活性を有するＭ−Ｃ３Ｆ分子の発現
には、実質的に影響を及ぼさないことが明らかである。

■　上記■において、２０Ｍ３ＣＤＮＡの代わり′にλ
ｃＭ１１　ｃＤＮＡを用いて、プラスミドｐＣＤＭ−Ｃ
３Ｆ１１を得た。該プラスミドを用いて、上記■に従っ
てｒ−ＭＣ３Ｆを製造し、略同様の結果を得た。

即ち、λＣＭＩ−１ＤＮＡを、制限酵素ＥＣｏＲＩで部
分消化させ、得られる反応物をアガロースゲル電気泳動
に付し、ＣＤＮＡ部分（約２．５ｋｂ）をＥＣｏＲＩ部
分消化断片として単離精製した。

前記■で得られたＣＯ８細胞発現ベクターｐＣＤＥを制
限酵素ＥＣｏＲＩで切断し、これを上記で調製したＣＤ
ＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させて、所
望のプラスミドｐＣＤＭ・Ｃ３Ｆ１１を得た。

かくして得られたプラスミドを、エシェリヒア・コリＨ
８１０１株にトランスフオームさせて、目的のトランス
フｔ−マントを、アルカリ溶菌法〔マニアティスら（Ｔ
　９Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎｉｎ（Ｊ、　１１ｐ９
０．　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎ（１Ｈａｒｖｏｒ　Ｌ　ａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　　（１９８２＞　）によって、得ら
れるプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選択した。

また、上記λＣＭ１１ＤＮＡのｃＤＮＡ（ＥＣＯＲＩＣ
ＯＲ化断片）を、クローニングベクターｐＵＣ１９ＤＮ
Ａ　（宝酒造）のＥＣ０ＲＩクロ一ニング部位に挿入し
て、プラスミド ｐＵＣＭＣＳＦ・１１を得た。該プラスミドをエシェリ
ヒア・コリＨ８１０１株にトランスフオームさせた形質
転換体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｌ−１
３１０１／ｐｔＪＣＭＣＳＦ・１１なる名称で、１９８
７年７月１６日に工業技術院微生物工業研究所に微工研
条奇第１４０９号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４０９）とし
−て寄託されている。

■　プラスミドｐｃＤＭ−ｃｓＦ１１を制限酵素ＥＣ０
ＲＩ及びＢＳｔＥＩＩで消化し、約６７０ｂｐのＥｃｏ
ＲＩ−ＢｓｔＥＩＩＤＮＡ断片を単離精製した。

このＤＮＡ断片のＢＳｔＥＩ［切断側に、５′末端を丁
４ポリヌクレオチドキナーゼにてリン酸化した合成りＮ
Ａプリンー： ５°−Ｇ丁ＧＡＣＣ丁ＧＡ丁ＡＡＧＧＡ丁ＣＣＧ−３’
３’−ＧＡＣ丁Ａ丁丁ＣＣ丁ＡＧＧＣ丁丁ＡＡ−５゜を
連結して得られたＤＮＡ断片と、前記したプラスミドｐ
ｃＤＥのＥＣ０ＲＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼによ
り連結して、所望のプラスミドｐｃＤＭ−Ｃ３Ｆ１１−
１８５を得た。該プラスミドは、上記合成リンカ一部位
に翻訳終止コドンＴＧＡＴＡＡをもち、従ってプラスミ
ドｐｃＤＭ・Ｃ３Ｆ１１がコードする第５図に示される
ポリペプチドにおいて、その１８５番目のアミノ酸（Ｔ
ｈｒ）をＣ末端アミノ酸とするＭ−Ｃ３Ｆをコードする
。

以上の概略を第８図に示す。

該プラスミドを用いて、上記■と同様にして発現させた
結果を下記第４表に示す。

第４表 ■　上記ので得たプラスミドＩ）ＣＤＭ−Ｃ３Ｆ１１−
１８５を用い、上記■に従って第５図におけるアミノ酸
番号１７ＢのアミノＭ（Ｃｙｓ）をコードするコドン（
ＴＧＣ）を終止コドン（丁ＧＡ）に胃換して、第５図に
おける１７７番目のアミノＷ　（Ｇｌｕ）をＣ末端アミ
ノ酸とする所望のＭ−Ｃ３Ｆ発現プラスミドｐｃＤＭ−
Ｃ３Ｆ１１−１７７を得た。該プラスミドを用いて上記
■と同様にして発現させた結果を下記第５表に示す。

第５表 ■　プラスミドｐｃＤＭ−ｃｓＦ１１−１８５ＤＮＡを
、ＥＣ０ＲＩ及びＢａｍＨＩで消化してＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩ　　ＤＮＡ断片（約６８０ｂｐ）を単離精製し
、これを分泌型発現ベクターｐＩＮ−ｍ−Ｏｒｒ＋ｐＡ
３　（ＥＭＢＯＪ、、３．２４３７〜２４４２　（１９
８４））のＥＣ０ＲＩ、ＢａｍＨＩクローニングサイト
に挿入して、プラスミドｐＩＮ−Ｉ１１−ＯｍｐＡ３−
ＭＣ３Ｆ１１−１８５を得た。

該プラスミドＤＮＡをＸｂａＩ及びＢａ１ｌｌ）−ＩＩ
で消化してＸｂａＩ−Ｂａｍｔ（Ｉ　　ＤＮＡ断片（約
７７０ｂｐ）を単離精製し、これを−重鎮ＤＮＡ調製用
のクローニングベクターｐＵｃ１１８ＤＮＡ　［宝酒造
１の）（ｂａ■、ＢａｍＨＩクローニングサイトに挿入
して、プラスミドｐＬＩＣ’ｌ−１８−Ｏｍｌ）Ａ３ｌ
−１８−Ｏ１−１８５を得た。

該プラスミドを用い、＃記すイ；−スペシフィック　ミ
ュークジエネシスの方法に従い、ＯｍｐＡシグナルペプ
チドのＣ末端アミノ酸（Ａｌａ）をコードするコドン（
ＧＣＣ）に、第５図に示すポリペプチドの３５番目のア
ミノ酸（Ｖａｔ＞をコードするコドン（ＧＴＧ＞が連結
して位置するように改変して、プラスミドＤＵＣ１１８
−○ｍｐＡ−ＭＣ３Ｆ１１−ＮＶｌ　５１を得た。

ＤＯら、プラスミドＤＬＩＣ１１８−ＯｍｐＡ３−ＭＣ
３Ｆ１１−１８５　　ＤＮＡにてトランスフオームした
大腸菌ＪＭ１０５に、ヘルパーファージＫＯ７Ｅ宝酒造
］を感染させ、３７°Ｃで１４時間振盪培養シ、−重鎖
（ｓｓ）ｐＵｃｌ　１８−ＯｍｐＡ３−ＭＣ３Ｆ１１−
１８５ＤＮＡを得、これをミュータジエネシスの鋳型と
して用い、またプライマーとして５′−丁ＡＣＣＧＴＡ
ＧＣＧＣＡＧＧＣＣＧＴＧＴＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＡ
ＧＣ−３′を用いて、上記■と同様にして所望のプラス
ミドＤＵＣ１１８−ＯｍｐＡ−ＭＣ３Ｆ１１−ＮＶ１５
１を得た。

該プラスミドＤＮＡをｘｂａＩ及びＢａ１ＩＩＨ工テ消
化してＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ　　ＤＮＡ断片（約５４０
ｂｐ）をＩｔ離精製し、これを発現ベクターｐＩＮ−Ｉ
［１（Ｉｆ）ｌ）　ｐ−５＞　−Ａ３のＸｂａＩ−Ｂａ
ｍＨＩサイトに挿入して、第５図における３５番目のア
ミノ酸（Ｖａｌ）から１８５番目の７ミ／酸（Ｔｈｒ）
　マでからなるポリペプチド発現用の、所望の分泌型発
現プラスミドｐＩ　Ｎ−１［１（ＩＩ）Ｉ）　ｐ−５＞
　−ＯｍｐＡ−ＭＣ３Ｆ１１−ＮＶｌ　５１を得た。

以上の概略を第９図−１，２及び３に示す。

また、上記分泌型発現プラスミドにコードされるアミノ
酸配列を第１０図に示す。第１０図中、下線を付した配
列はＯｍＣ）Ａシグナルペプチドを、マはプロセッシン
グ部位をそれぞれ示す。

ｐ〜 ［相］　上記■で得たｐＩＮ−ＩＩＩ（Ｉｔ）ｐ　　５
ｉ０ｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶｌ　５１を大腸菌ＨＢ
１０１及びＪＭＩ０９にトランスフオームして分泌生産
を行ない、ペリプラズム画分としてＣ３Ｆ活性を示す上
清を回収した。

即ち、上記のＭ−Ｃ３Ｆ分泌型発現ベクターを保有する
菌株を２Ｑ容フラスコにて、５０μｇ／購アンピシリン
を含有するＬＢ培地５００ｍｆ２にて３７℃で１４時間
振盪培養した後、遠心（５００Ｏｒ凹、５分間、室温）
して菌体をペレットとした。

この菌体ペレットを、５０ｍＭトリス・ＨＣＱ（ｐＨ８
，０）−２５％シ１−クロース溶液５０或に再浮遊させ
、更に２５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）を１．２
５＋ｎＱ加えた後、ゆっくりと振盪しながら室温に３０
分間装いた。同様に遠心して得られた菌体ペレットを、
氷冷した蒸留水２５ｍＱに再浮遊させ、ゆっくりと振漕
しながら、３０分間氷冷し、４°Ｃにて、１０１０００
０ｐｐ分間遠心して、ペリプラズム画分として上清を回
収した。

■　上記■において、ｏｃＤＭ−ＣＳＦ１１−１８５の
代りにＤＣＤＭ−ＣＳＦＩ　１−１７７を用いることに
より、第５図における３５番目のアミノ酸（Ｖａｌ）か
ら同１７７番目のアミノ酸（ＧＩＩＪ）までからなるポ
リペプチド発現用の所望のＭ−Ｃ３Ｆ分泌型発現プラス
ミド、ｐＩ　Ｎ−ＩＩＩ一 （ｌｐｐ　　　５）−０ｍｐＡ−ＭＣ３Ｆ１１−ＮＶ１
４３を得た。

該プラスミドにコードされるアミノ酸配列を第１１図に
示す。第１１図中、下線を付した配列はＯｍｐＡシグナ
ルペプチドを、マはプロセッシング部位をそれぞれ示す
。該プラスミドを上記■と同様にして大腸菌に１〜ラン
スフｔ−ムさせて、該大腸菌よりペリプラズム画分とし
てＣ３Ｆ活性を示す上清を得た。

■　上記■、■、■及び［株］で得た各上清を、下記条
件のｌ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃに付した。

カラム：ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ　（６０ｃｍｘ７．
５ｍｍ直径、東洋四速工業） 溶離液：０．００５％ポリエチレングリコール及び０．
１５Ｍ　　ＮａＣＱ含右Ｐ　Ｂ　Ｓ−流　速：０，８ｍ
Ｑ／分 フラクション容積：０，８ｍ［２／チユ一ブ／分分子量
マーカー（グルタミン酸脱水素酵素：２９万、乳酸脱水
素酵素：１４，２万、エノラーゼ：６．フ万、アデニル
酸キナーゼ：３．２万、チトクロムＣ１，２４万）を基
準として、各Ｉナンプルにつき、以下の結果を得た。

０サンプル：前記■で得た培養上清の４ｍ１２をセント
リコン−１０（アミコン社製）に て約１５０μに濃縮したもの。

分子量３２〜７０万（平均４８万）に相当する範囲の溶
出画分に、Ｃ３Ｆ活性をル２めた。

、　Ｏサンプル：前記■で得たＪｇ菩上清４鵬を上記と
同様に処理したもの。

分子Ｍ６．６万から８．６万（平均７．６万）に相当す
る範囲の溶出画分に、Ｃ３Ｆ活性を認めた。

Ｏサンプル：前記■で得た培養上清４脱を上記と同様に
処理したもの。

分子量５．２万から８，６万（平均６，７万）に相当す
る範囲の溶出画分に、Ｃ３Ｆ活性を認めた。

Ｏサンプル：前記［株］で得たペリプラズム画分の上清
２ｍｆ２を上記と同様にして約１１０μＱに濃縮したも
の。

分子量３〜４万（平均３，５万）に相当する位置に、Ｃ
３Ｆ活性を認めた。

［相］　前記■、■又は■で得た培養上清の１０戒を、
１　ｍＱのＣ０ｎＡ−セファロースを充填したカラムに
供した後、ＰＢＳ−（５＋＋＋Ｑ）にて洗浄後、０．５
Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシド含ＮＰＢＳ−（１０ｍＱ
＞にて溶出した。得られた溶出液の４．　ｍＱをセント
リコン−１０にて濃縮し、これを下記５ＤＳ−ＰＡＧＥ
用サンプルとした。

また、前記■で得たペリプラズム画分の上清は、これを
そのまま、同サンプルとした。

Ｍ−Ｃ３Ｆの検出は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをウェ
スタンブロッティングに供し、常法に従って製造したＭ
−Ｃ３Ｆに対する家兎抗血清を使用することにより行な
った。

即ち、５ＤＳ−ＰＡＧＥはレムリの方法（１−ａｅｍｍ
ｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、、Ｎａｔｕｒｅ　、　２７７、６８
０（１９７０））に従い、ミニスラブ（ゲル濃度１５％
）を用い、またウェスタンブロッティングは、バイオラ
ッド社のトランスプロットセルを用いて行なった。トラ
ンスファーされたニトロセルロース膜を１％牛血清アル
ブミン含＊ＰＢＳ”″にてブロッキング復、Ｍ−Ｃ３Ｆ
に対する上記家兎抗血清と反応させ、更にパーオキシダ
ーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体（バイオラッド社製）を作用
させた。Ｍ−Ｃ３Ｆハンドの検出は、かくして得られた
ニトロセルロースｆＩりと発色基質で必る４−クロ０−
１−ナフトール液を反応させることにより行なった。

結果を下記第６表に示す。

第６表 ［相］　プラスミドｐＳＶ２−ｄＭｒ（Ｍｏ１．Ｃｅ１
ｌ。

Ｂｉｏ＋、、ユ、８５４　（１９８１））を、制限＃素
）−１ｉｎｄｆｆｌとＢａ１ｌｌＨＩにより２つの断片
に切断して、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ＞！信子
を含む断片を単離精製した。

次に、プラスミドｐＲ３Ｖ−ＣＡ丁（ｐ　ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７９．６７７
７（１９８１））を、同じ＜　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩとＢａ
ｍＨＩとで切断してラウス肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ）のＬ
ＴＲ（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ）部
分を含む断片を単離精製した。

上記で精製された２種の断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
反応させることにより連結させた。

この反応物を大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル（宝酒
造）にトランスフオームし、得られたアンピシリン耐性
を示すコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵
素地図を作成して、目的のプラスミドｐＲＳ　Ｖ−ｄｈ
ｆｒを得た。

該プラスミドはＲ３ＶのしＴＲ部分、ＤＨＦＲ遺伝子、
ＳＶ４０由来の介在配列と１）０１　ｙＡ付加シグナル
、更に大腸菌プラスミドＤＢＲ３２２由来の複製開始点
とアンピシリン耐性遺伝子を含有し、上記しＴＲ部分に
含有されるプロモーターのコントロール下にＤＨＦＲを
発現するものでおる。

このプラスミドｐＲＳ　Ｖ−ｄＭｒをＮｄｅ■とＢａｍ
ＨＩとで２つの断片に切断して、ＤＨＦＲ３ｆｆ伝子を
含む断片を単離精製した。得られたＤＮＡ断片を、ＤＮ
Ａポリメラーゼ■（フレノウ　フラグメント）で処理し
て両末端を平滑末端とした。

一方、前記■で得たプラスミドｌ）ＣＤＭ・Ｃ３Ｆ１１
を、３ａｌｌで切断後、この切断部位を同様にＤＮＡポ
リメラーゼＩで処理して平滑末端とした。

以上により得られた両断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結させ、この反応物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテ
ントセルにトランスフオームした。

得られたアンピシリン耐性を示すコロニーからプラスミ
ドＤＮＡを調製し、！ｌＩ限酵素地図を作成して、目的
のＭ−Ｃ３ＦとＤＨＦＲの両遺信子の発、現プラスミド
Ｉ）ＣＤＭ−Ｃ３Ｆ１１−ｄＭｒを得た。

該プラスミドは、Ｍ−Ｃ３Ｆ発現に係わる５ｖ４０由来
の初期プロモータ一部分、介在配列、Ｍ−Ｃ３Ｆ遭伝子
、ｐｏｌｙＡ付加シグナル、ＤＨＦＲ発現に係わるＲ３
ＶのＬＴＲ部分、Ｄ　Ｈ’　Ｆ　Ｒ遺伝子、ＳＶ４０由
来の介在配列、ＤＯＩＶＡ付加シグナルを含有し、更に
大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点及びア
ンピシリン耐性遺伝子を含有する。

以上の概略を第１２図−１及び−２に示す。

■　上記で得たプラスミドｌ）ＣＤＭ−Ｃ３Ｆ１１−ｄ
ｈｆｒを用いて、前記■に従って、ｒ−ＭＣＳＦを製造
した。

その結果、培持上清のＣ３Ｆ活性は、プレート当たりの
コロニー数（平均値）として６８（プラスミドｐＣＤＥ
を用いた対照はＯ）でおった。

［相］　７５　ｃｍ２Ｐｔｆｌフラスコ（コスタ−社製
）でｆｇ養されたチャイニーズハムスター卵巣ｄＭｒ欠
損側胞（Ｃ）−ＩＱ−ＤｕｋｄＭｒ−細胞：　Ｐ　ｒｏ
ｃ、　Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、３ｃｊ−ＩＪｓＡ、＋　７７．４２１６（１
９８０＞）を、常法に従ってトリプシン（フローラボラ
トリー社製）処理し、１０％透析牛脂児血清（ＧＩＢＣ
Ｏ社製）を含むダルベツコ改良最小必須培地（ＤＭＥＭ
培地、ＧＩＢＣＯ社製）に懸濁させ、同培地にて細胞を
洗浄した接、培地を除いた。

この細胞を、ＤＮＡ注入溶液（０，２５Ｍマンニトール
−０，１ｍＭ　　ＣａＣＱ２”　２Ｈ２０−０，１ｍＭ
　　ＭｑＳＯ４’　７Ｈ２００，２ｍＭトリスｌ−ｌＣ
ｌ　ＤＨ７，２、和光紬薬工業社製）に懸濁させた。

前記■で１ｑたＭ−Ｃ３Ｆ発現プラスミドＤＣＤＭ−Ｃ
ＳＦ１１−ｄｈｆｒを、ＣＩａ工により切断し、線状化
した後、ＤＮＡ注入溶液に溶解させた。

上記の細胞懸濁液２００μＱ　（２Ｘ１０Ｂ細胞）とＤ
ＮＡ溶液２００μＱ　（３０μＣＩＤＮＡ）を混合し、
融合チャンバーＣＨ−’２（島津製作所社製）に入れ、
電気融合装置５ＳＨ−１（島津製作所社製）に接続して
、４．２ＫＶ／ｃｍ２パルスを１秒間隔で２回繰返し、
電気的に、細胞内にＤＮＡを導入した。

ＤＮＡを導入した細胞を１０％透析牛脂児而潰−１％非
必須アミノ酸溶液（フローラボラトリーズ社製）−２％
１−ＩＴ温溶液同上社製）　−ＤＭＥＭ培地に懸濁させ
、２４穴プレート（コスタ−社製）にて培養した。

４８時間培養後、培地を選択培地（１０％透析牛脂児血
清及び１％非必須アミノ酸溶液を含むＤＭＥＭ培地）に
交換し、その後、３〜４日毎に培地を新鮮なものと交換
した。

１０〜１４日間培養して得られた約２００クローンの形
質転換ｌ！ｉＩ胞より５０クローンを選んで、常法通り
トリプシン処理後、新しい２４穴プレートに移した。

ＤＩ−ＩＦＲ遺伝子の増幅は、高濃度のメトトレキセー
ト（ＭＴＸ＞に対する耐性を与え（Ｊ、Ｂ。

Ｃ，，２５３，１３５７（１９７８））、同時に形質転
換された近接の遺伝子はＭＴＸにより増幅を示す。

上記５０クローンの形質転換細胞を、２０ｎＭＭＴＸを
含む選択培地で培養し続け、増殖のみられた耐性クロー
ンをトリプシン処理後、５０ｎＭＭＴＸを含む選択培地
に懸濁させて培養を行なった。同様に増殖のみられた耐
性クローンを、１１００ｎ　　ＭＴＸを含む選択培地で
培養し続け、最終的に４００ｎＭ　　ＭＴＸに耐性を示
すり０−ンを得た。

これらの耐性クローンの培養上清のＣＳＦ活性を下記第
７表に示す。

第７表 上記で１ｑたＣＨＯ細胞培養上漬上清そのまま、５ＤＳ
−ＰＡＧＥのサンプルとして、前記０と同様にして、５
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の検討を行なった。

その結果、非還元条件下で９万、還元条件下で４．４万
に相当する位置にＭ−ＣＳＦのバンドが検出された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、２０Ｍ５のＣＤＮＡの制限酵素地図を示す。 第２図（第２図−１〜第２図−４）は、マキサム−ギル
バートの化学修飾法及びＭ”１３フアージを用いるジデ
オキシヌクレオチド鎖終結法にて決定された上記ＣＤＮ
Ａの塩基配列を示す。 第３図（第３図−１〜第３図−２）は、上記ＣＤＮＡに
よりコードされているＭ−Ｃ３Ｆ前１駆体蛋白質の蛋白
−次４？Ａ造を示す。 第４図（第４図−１〜第４図−４）は、２０Ｍ１１のＣ
ＤＮＡの塩基配列を示す。 第５図（第５図−１〜第５図−３）は、λｃＭ１１　Ｃ
ＤＮＡによりコードされているＭ−Ｃ３Ｆ前駆体蛋白質
の蛋白−次構造を示す。 第６図は、ＣＯ８細胞発現ベクターｐｃＤＥの作γＪの
概略図を示す。 第７図は、Ｍ−Ｃ３Ｆ発現プラスミドｐＣＤＭ・Ｃ３Ｆ
の作製の概略図を示す。 第８図は、Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＣＤＭ・Ｃ３Ｆ
１１−１８５の作製の概略図を示す。 第９図（第９図−１〜第９図−３）は、Ｍ−Ｃ３Ｆ発現
プラスミドｐＩＮ−Ｉ［１（Ｉｐｐ　　　５）−Ｏｍｐ
Ａ−ＭＣ３Ｆ１１−ＮＶｌ　５１の作製の概略図を示す
。 第１０図は、Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドＤＩＮ−ＩＩＩ
（ｌｐｐ　　　５）−ＯｍｐＡ−ＭＣ３Ｆ１１−ＮＶ１
５１によりコードされるアミノ酸配列を示す。 第１１図は、Ｍ−Ｃ３Ｆ発現プラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ
　（ｌｐｐ　’−５＞−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ
１４３によりコードされるアミノ酸配列を示す。 第１２図（第１２図−１及び第１２図−２）は、Ｍ−Ｃ
ＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ−Ｃ３ＦＩ　１−ｄｈｆｒ
の作製の概略図を示す。 （ＩＸ　　上） 第２図 ＧＣＣＣＣＴＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣＡＴＧＧ　ＣＣＣＣ
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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］下記式（１）の全アミノ酸配列またはその一部を
   欠損した部分アミノ酸配列をコードする核酸配列を有す
   ることを特徴とするヒトＭ−ＣＳＦの遺伝子。 式（１）： 【遺伝子配列があります】 〔式中、ＸはＴｙｒ又はＡＳＰを示す。〕