JP2660332B2 - ヒトｍ−ｃｓｆの製造方法 - Google Patents
ヒトｍ−ｃｓｆの製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、医薬として有用な
ヒトのコロニー刺激因子（Colony-Stimulating Factor,
ＣＳＦ）の製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】一般に、造血細胞の増殖、分化には特定
の増殖及び分化因子が必要とされており、最終的に成熟
した各種の血球、例えば赤血球、顆粒球、マクロファー
ジ、好酸球、血小板、リンパ球等になるまでの間には、
数多くの分化、増殖因子が関与している〔三浦恭定著、
血液幹細胞、中外医学社、１９８３年〕。之等の中で顆
粒球系前駆細胞及びマクロファージ系前駆細胞の増殖、
分化を刺激するものとしてＣＳＦが知られており、かか
るＣＳＦには、顆粒球の形成に特異性を有するＧ型（Ｇ
−ＣＳＦ）、マクロファージの形成に特異的なＭ型（Ｍ
−ＣＳＦ）及び顆粒球とマクロファージの両方の形成を
促進するＧＭ型（ＧＭ−ＣＳＦ）が知られている。また
更に多能性幹細胞に作用するＣＳＦとして、マルチＣＳ
Ｆ（Multi-CSF ：ＩＬ−３）も知られている。 【０００３】上記ＣＳＦは、その生物活性に基づき、癌
化学療法及び放射線療法時の共通した欠点である白血球
の減少を軽減させるものと考えられ、この観点から臨床
研究が行なわれている。 【０００４】また、上記ＣＳＦは、白血球の機能を促進
させる作用を有することが知られており〔ロペッツら(L
opez,A.F. et al.), J.Immunol., 131, 2983 (1983),
ハンダムら(Handam,E. etal.), 同122, 1134 (1979)及
びバダスら(Vadas,M.A. et al.),同130, 795 (1983)
〕、このことから、種々の感染症の予防及び治療薬と
しての有効性が確認されている。 【０００５】更に、ＣＳＦの分化誘導作用〔メットカー
フら(Metcalf,D. et al., Int. J.Cancer, 30, 773 (19
82)〕に基づき、該ＣＳＦは骨髄性白血病の治療剤とし
て有効性が認められている。 【０００６】しかして、ＣＳＦは例えば胎児細胞、脾細
胞等の培養液、人尿、種々の株化培養細胞の培養液等に
その活性が認められ、該活性画分として分離、利用され
ているが、いずれの起源のものも該起源に由来する類似
した多量の夾雑物質等の混在及びＣＳＦ自体の濃度の低
さが障害となり、その製造面で問題を残しており、均質
性、収量、操作等の面から、医薬品としてのＣＳＦを産
業的に継続して得る手段は、未だ見出されていない。 【０００７】本発明者らは、先にＣＳＦを常時均質な状
態で多量産生することのできる、ヒト白血病Ｔ細胞由来
の培養株化細胞である「ＡＧＲ−ＯＮ」を確立し、該細
胞に係わる発明を特許出願した（特開昭５９−１６９４
８９号公報）。また、本発明者らは、上記ＡＧＲ−ＯＮ
の産生するＣＳＦにつき、更にその精製を重ねた結果、
該ＣＳＦを純粋な形で簡単にしかも高収率で収得する方
法を開発し、またかくして得られるＣＳＦの構造的特徴
及び生化学的特徴を解明し、かかる物質としてのＣＳＦ
に係わる発明を完成し、特許出願した（特開昭６２−１
６９７９９号）。 【０００８】上記先の発明に係わるＣＳＦは、Ｍ−ＣＳ
Ｆ、即ち、正常骨髄細胞に作用してマクロファージの分
化増殖を促進させる活性を有する糖蛋白質であって、下
記の理化学的性質を有する点において特徴付けられるも
ので、「ＡＧＲ−ＯＮ・ＣＳＦ」と呼ばれた。 【０００９】ａ）分子量：非還元条件下でＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動により、３３０００〜４３０
００ダルトンであり、非還元条件且つＳＤＳ存在下での
ゲル濾過で、２３０００〜４００００ダルトンである、 ｂ）蛋白質部分のＮ端アミノ酸配列：次の一次構造式で
表わされる配列を有する。 【００１０】Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gl
y-Ser-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-
Ser-Gln-Met-Glu-Thr 【００１１】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、遺伝
子工学的手法によって、容易に且つ大量に新しい組換え
ヒトＭ−ＣＳＦを製造、供給する方法を提供することに
ある。 【００１２】本発明者らは、引続く研究において、上記
ＡＧＲ−ＯＮ・ＣＳＦの由来細胞であるＡＧＲ−ＯＮか
らメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出し、該ｍＲ
ＮＡからその相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製し、上記Ａ
ＧＲ−ＯＮ・ＣＳＦのアミノ酸配列情報に基づいて所望
のＭ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを選択し、該ｃＤＮ
Ａを含むベクターを創製し、該ベクターを宿主細胞に導
入して形質転換体を製造し、これを培養して目的の生物
活性を有するＭ−ＣＳＦの生成を確認するに至り、ここ
に本発明を完成した。 【００１３】 【課題を解決するための手段】即ち、本発明によれば、
下式（１）のアミノ酸配列の３３位Ｇｌｕから３７位Ｇ
ｌｕのいずれかをＮ端アミノ酸とし、同１８５位Ｔｈｒ
をＣ端アミノ酸とする部分アミノ酸配列をコードする核
酸配列を有するヒトＭ−ＣＳＦ遺伝子を含有する組換え
ベクターで形質転換された宿主を培養し、得られるヒト
Ｍ−ＣＳＦを採取することを特徴とするヒトＭ−ＣＳＦ
の製造方法が提供される。 【００１４】式（１）：Met-Thr-Ala-Pro-Gly-Ala-Ala-
Gly-Arg-Cys-Pro-Pro-Thr-Thr-Trp-Leu-Gly-Ser-Leu-Le
u-Leu-Leu-Val-Cys-Leu-Leu-Ala-Ser-Arg-Ser-Ile-Thr-
Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Se
r-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-
Gln-Met-Glu-Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Va
l-Asp-Gln-Glu-Gln-Leu-Lys-Asp-Pro-Val-Cys-Tyr-Leu-
Lys-Lys-Ala-Phe-Leu-Leu-Val-Gln-X -Ile-Met-Glu-Asp
-Thr-Met-Arg-Phe-Arg-Asp-Asn-Thr-Pro-Asn-Ala-Ile-A
la-Ile-Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-Lys
-Ser-Cys-Phe-Thr-Lys-Asp-Tyr-Glu-Glu-His-Asp-Lys-A
la-Cys-Val-Arg-Thr-Phe-Tyr-Glu-Thr-Pro-Leu-Gln-Leu
-Leu-Glu-Lys-Val-Lys-Asn-Val-Phe-Asn-Glu-Thr-Lys-A
sn-Leu-Leu-Asp-Lys-Asp-Trp-Asn-Ile-Phe-Ser-Lys-Asn
-Cys-Asn-Asn-Ser-Phe-Ala-Glu-Cys-Ser-Ser-Gln-Asp-V
al-Val-Thr-Lys-Pro-Asp-Cys-Asn-Cys-Leu-Tyr-Pro-Lys
-Ala-Ile-Pro-Ser-Ser-Asp-Pro-Ala-Ser-Val-Ser-Pro-H
is-Gln-Pro-Leu-Ala-Pro-Ser-Met-Ala-Pro-Val-Ala-Gly
-Leu-Thr-Trp-Glu-Asp-Ser-Glu-Gly-Thr-Glu-Gly-Ser-S
er-Leu-Leu-Pro-Gly-Glu-Gln-Pro-Leu-His-Thr-Val-Asp
-Pro-Gly-Ser-Ala-Lys-Gln-Arg-Pro-Pro-Arg-Ser-Thr-C
ys-Gln-Ser-Phe-Glu-Pro-Pro-Glu-Thr-Pro-Val-Val-Lys
-Asp-Ser-Thr-Ile-Gly-Gly-Ser-Pro-Gln-Pro-Arg-Pro-S
er-Val-Gly-Ala-Phe-Asn-Pro-Gly-Met-Glu-Asp-Ile-Leu
-Asp-Ser-Ala-Met-Gly-Thr-Asn-Trp-Val-Pro-Glu-Glu-A
la-Ser-Gly-Glu-Ala-Ser-Glu-Ile-Pro-Val-Pro-Gln-Gly
-Thr-Glu-Leu-Ser-Pro-Ser-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser-M
et-Gln-Thr-Glu-Pro-Ala-Arg-Pro-Ser-Asn-Phe-Leu-Ser
-Ala-Ser-Ser-Pro-Leu-Pro-Ala-Ser-Ala-Lys-Gly-Gln-G
ln-Pro-Ala-Asp-Val-Thr-Gly-Thr-Ala-Leu-Pro-Arg-Val
-Gly-Pro-Val-Arg-Pro-Thr-Gly-Gln-Asp-Trp-Asn-His-T
hr-Pro-Gln-Lys-Thr-Asp-His-Pro-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg
-Asp-Pro-Pro-Glu-Pro-Gly-Ser-Pro-Arg-Ile-Ser-Ser-P
ro-Arg-Pro-Gln-Gly-Leu-Ser-Asn-Pro-Ser-Thr-Leu-Ser
-Ala-Gln-Pro-Gln-Leu-Ser-Arg-Ser-His-Ser-Ser-Gly-S
er-Val-Leu-Pro-Leu-Gly-Glu-Leu-Glu-Gly-Arg-Arg-Ser
-Thr-Arg-Asp-Arg-Arg-Ser-Pro-Ala-Glu-Pro-Glu-Gly-G
ly-Pro-Ala-Ser-Glu-Gly-Ala-Ala-Arg-Pro-Leu-Pro-Arg
-Phe-Asn-Ser-Val-Pro-Leu-Thr-Asp-Thr-Gly-His-Glu-A
rg-Gln-Ser-Glu-Gly-Ser-Ser-Ser-Pro-Gln-Leu-Gln-Glu
-Ser-Val-Phe-His-Leu-Leu-Val-Pro-Ser-Val-Ile-Leu-V
al-Leu-Leu-Ala-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Phe-Tyr-Arg-Trp
-Arg-Arg-Arg-Ser-His-Gln-Glu-Pro-Gln-Arg-Ala-Asp-S
er-Pro-Leu-Glu-Gln-Pro-Glu-Gly-Ser-Pro-Leu-Thr-Gln
-Asp-Asp-Arg-Gln-Val-Glu-Leu-Pro-Val 〔式中、ＸはＴyr又はＡspを示す。〕本明細書におい
て、ペプチド及びアミノ酸の表示は、ＩＵＰＡＣにより
採択されているアミノ酸命名法における略号乃至当該分
野で慣用されているそれに従うものとし、ＤＮＡ塩基配
列及び核酸の表示も同様とする。 【００１５】本発明方法によれば、目的とする新規なヒ
トＭ−ＣＳＦは、これをコードする遺伝子（以下「本発
明遺伝子」という）を利用して、遺伝子工学的手法によ
り、容易且つ大量に製造することができ、前記したごと
く、その生物活性に基づいて、例えば白血球減少を伴う
疾病もしくは病態の予防及び治療薬として、骨髄移植の
補助剤として、各種感染症の予防及び治療薬として、更
に抗癌剤等として、殊に医薬分野で有用である。 【００１６】 【発明の実施の形態】以下、本発明遺伝子につき詳述す
る。 【００１７】本発明遺伝子は、例えばＭ−ＣＳＦ産生能
を有するヒト細胞、より具体的且つ有利には前記ＡＧＲ
−ＯＮより分離されたｍＲＮＡから調製される。以下、
この調製の詳細をＡＧＲ−ＯＮを用いて説明するが、他
の細胞でも同様である。起源細胞として利用されるＡＧ
Ｒ−ＯＮは、特開昭５９−１６９４８９号公報に記載さ
れた特性を有するヒト白血病Ｔ細胞由来のヒト培養株化
細胞であり、これはアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ＡＴＣＣ）に「ＡＴＣＣ受託Ｎo.ＣＲＬ
−８１９９」として受託されている。 【００１８】上記ＡＧＲ−ＯＮからのｍＲＮＡの分離
は、基本的には通常の抽出操作に従い実施される。より
詳しくは、上記ＡＧＲ−ＯＮを、まず例えばＣＥＭ培
地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、ＤＭ−１６０培地、イー
グルの最小必須培地（Eagle's MEM ）、フイッシャーの
培地（Fisher's Medium ）、Ｆ−１０培地、Ｆ−１２培
地、Ｌ−１５培地、ＮＣＴＣ−１０９培地、ＲＰＭＩ−
１６４０培地等又は必要に応じて牛胎児血清（ＦＣＳ）
等の血清やアルブミン等の血清成分を添加した上記培地
で、約１×１０4 〜１×１０7 個／ｍｌの濃度範囲で、
通常の培養法例えば炭酸ガス培養法等に従い、約３０〜
４０℃程度、好ましくは約３７℃前後で１〜５日間を要
して培養する。次いで培養上清中にＡＧＲ−ＯＮ・ＣＳ
Ｆが生産蓄積される時期に、上記培養細胞を、適当な界
面活性剤、例えばＳＤＳ、ＮＰ−４０、トリトンＸ１０
０、デオキシコール酸等を用いて、或いはホモゲナイザ
ーを用いる方法や凍結融解等の物理的方法によって、部
分的又は完全に破壊、可溶化した後、染色体ＤＮＡを、
ポリトロン等のミキサーもしくは注射筒を用い、ある程
度せん断し、その後、蛋白質と核酸分画とを分別して全
ＲＮＡの抽出を行なう。この操作には、特にフエノール
・クロロホルム抽出もしくは超遠心を用いるＣｓＣｌ重
層法〔チルグウィンら（Chirgwin,J.M., et al.), バイ
オケミストリー(Biochemistry), 18, 5294 (1979) 〕等
が一般に用いられる。 【００１９】また上記各方法においては、ＲＮaseによ
るＲＮＡの分解を防ぐために、ＲＮaseインヒビター、
例えばヘパリン、ポリビニル硫酸、ジエチルピロカーボ
ネート、バナジウム複合体、ベントナイト、マカロイド
等を添加使用することもできる。 【００２０】上記抽出操作に従い得られるＲＮＡからの
ｍＲＮＡの分離、精製は、例えばオリゴｄＴ−セルロー
ス〔コラボレィティブ リサーチ社（Collaborative Re
search Inc.〕、ポリＵ−セフアロース〔フアルマシア
(Pharmacia）社〕、セフアロース２Ｂ〔フアルマシア
社〕等を用いて吸着カラム法又はバツチ法により実施で
きる。 【００２１】かくして得られるｍＲＮＡからの、目的の
Ｍ−ＣＳＦに対するｍＲＮＡの精製濃縮及び同定は、例
えば得られたｍＲＮＡを蔗糖密度勾配遠心等によつて分
画し、その分画につき、蛋白質の翻訳系、例えばアフリ
カツメガエルの卵母細胞への注入やウサギ網状赤血球ラ
イゼート又は小麦胚芽等の無細胞系で蛋白質に翻訳さ
せ、その蛋白質のＭ−ＣＳＦ活性を調べることにより実
施でき、かくして目的とするｍＲＮＡの存在を確認でき
る。更に目的とするｍＲＮＡの確認は、上記Ｍ−ＣＳＦ
の活性測定に代えて、Ｍ−ＣＳＦに対する抗体を用いる
免疫法によつても行ない得る。 【００２２】上記により得られる精製ｍＲＮＡは、通常
不安定であるため、これを安定なｃＤＮＡに変換し、目
的遺伝子の増幅を可能とするために微生物由来のレプリ
コンに接続する。インビトロでの、上記ｍＲＮＡのｃＤ
ＮＡへの変換、即ち本発明遺伝子の合成は、一般に次の
ようにして行なうことができる。 【００２３】即ち、まずオリゴｄＴをプライマーとし
（このプライマーは遊離のオリゴｄＴもしくは既にベク
タープライマーに付加されたオリゴｄＴのいずれでもよ
い）、ｍＲＮＡを鋳型としてｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰ又はｄＴＴＰ）の存在下で、逆転写酵素
を用いてｍＲＮＡからこれに相補的な一本鎖ｃＤＮＡを
合成する。次のステツプは、上記において遊離のオリゴ
ｄＴを用いたか、ベクタープライマーに付加されたオリ
ゴｄＴを用いたかにより、各々以下の如く異なる。 【００２４】前者の場合、鋳型としたｍＲＮＡをアルカ
リ処理等により分解して除去し、その後一本鎖ＤＮＡを
鋳型として逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼを用いて
二本鎖ＤＮＡを作成する。次に得られる二本鎖ＤＮＡの
両端をエキソヌクレアーゼで処理し、そのそれぞれに適
当なリンカーＤＮＡ又はアニーリング可能な組合せの塩
基を複数付加し、これを適当なベクター、例えばＥＫ系
プラスミドベクターやλgt系ファージベクター等に組込
む。 【００２５】また、後者の場合、鋳型としたｍＲＮＡを
残存させたまま、上記と同様のリンカーを付与した開環
状プラスミドと、リンカーＤＮＡ（しばしば動物細胞で
自立複製できる領域とｍＲＮＡの転写プロモーター領域
を含むＤＮＡ断片が用いられる）とを、アニーリングさ
せて閉環状とした後、ｄＴＮＰ存在下で、ＲＮase とＤ
ＮＡポリメラーゼとを共存させて、ｍＲＮＡをＤＮＡ鎖
に置換し、完全なプラスミドＤＮＡを作成できる。 【００２６】上記のごとくして得られるＤＮＡは、これ
をベクターの宿主、例えばエシェリヒア コリ（Esheri
chia coli）、バチルス ズブチリス（Bacillus subtil
is）、サッカロミセス セレビシアエ（Saccharomyces
cerevisiae）等の適当な宿主内に導入して、これを形質
転換することができる。このＤＮＡの宿主への導入及び
これによる形質転換の方法としては、一般に用いられて
いる方法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集
め、ＣａＣｌ2 処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい
状態にして、プラスミドを取り込ませる方法等を採用で
きる。上記方法においては、通常知られているように形
質転換の効率を一層向上させるためにＭｇＣｌ2 やＲｂ
Ｃｌを更に共存させることもできる。また、宿主細胞を
スフェロプラスト又はプロトプラスト化してから形質転
換させる方法も採用することができる。 【００２７】上記により得られる形質転換株から、目的
のＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡを有する株を選出する方法とし
ては、例えば以下に示す各種方法を採用できる。 【００２８】（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを
用いるスクリーニング法 目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明されて
いる（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、
目的蛋白のどの領域のものでもよい）場合、該アミノ酸
に対応するオリゴヌクレオチドを合成し（この場合、コ
ドン使用頻度を用いて導いた塩基配列又は考えられる塩
基配列の組合せの複数個のどちらでもよく、また後者の
場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこともでき
る）、これをプローブ（32Ｐ又は35Ｓでラベルする）と
して、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロ
ースフィルターとハイブリダイゼーションし、得られた
ポジティブ株を検索して、これを選出する。 【００２９】（２）動物細胞でＭ−ＣＳＦを産生させて
スクリーニングする方法 形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフェクトし（この場合、自己複製可
能でｍＲＮＡ転写プロモーター領域を含むプラスミドも
しくは動物細胞染色体にインテグレートするようなプラ
スミドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋白
質を産生させ、その培養上清もしくは細胞抽出物のＭ−
ＣＳＦ活性を測定するか、又はＭ−ＣＳＦに対する抗体
を用いてＭ−ＣＳＦを検出することにより、元の形質転
換株より目的のＭ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを有す
る株を選出する。 【００３０】（３）Ｍ−ＣＳＦに対する抗体を用いて選
出する方法 予め、ｃＤＮＡを形質転換株内で蛋白質を発現し得るベ
クターに組込み、形質転換株内で蛋白質を産生させ、Ｍ
−ＣＳＦに対する抗体及び該抗体に対する第二抗体を用
いて、Ｍ−ＣＳＦ産生株を検出し、目的株を得る。 【００３１】（４）セレクティブ・ハイブリダィゼーシ
ョン・トランスレーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロース
フィルター等にブロットし、Ｍ−ＣＳＦ産生細胞からの
ｍＲＮＡをハイブリダイゼーションさせた後、ｃＤＮＡ
に対応するｍＲＮＡを回収する。回収されたｍＲＮＡを
蛋白翻訳系、例えばアフリカツメガエルの卵母細胞への
注入や、ウサギ網状赤血球ライゼートや小麦胚芽等の無
細胞系で蛋白質に翻訳させ、その蛋白質のＭ−ＣＳＦ活
性を調べるか、又はＭ−ＣＳＦに対する抗体を用いて検
出して、目的の株を得る。 【００３２】得られた目的の形質転換株よりＭ−ＣＳＦ
をコードするＤＮＡを採取する方法は、公知の方法に従
い実施できる。例えば細胞よりプラスミドＤＮＡに相当
する画分を分離し、該プラスミドＤＮＡよりｃＤＮＡ領
域を切り出すことにより行ない得る。 【００３３】かくして得られるＤＮＡは、本発明遺伝子
の一具体例であり、第３図に示される３７２のアミノ酸
配列又は第５図に示される５５４のアミノ酸配列、で特
定されるヒトＭ−ＣＳＦ前駆体をコードしている。 【００３４】しかして、本発明遺伝子を利用して遺伝子
工学的手法により得られる物質が、ヒトＭ−ＣＳＦの生
物活性を発現するためには、該遺伝子は必ずしも上記Ｄ
ＮＡ、即ちヒトＭ−ＣＳＦ前駆体のアミノ酸配列のすべ
てをコードするＤＮＡ配列を有するものである必要はな
く、例えばその部分配列であって、それがヒトＭ−ＣＳ
Ｆの生物活性発現を可能とする限り、それらのＤＮＡも
また本発明遺伝子に包含される。 【００３５】ヒトＭ−ＣＳＦの生物活性発現に、必ずし
も前記式（１）に示す全アミノ酸配列を必要としない事
実は、例えば上記前駆体の一方が、その３７２番目のア
ミノ酸（Ｐro）をＣ端アミノ酸としていること、又は前
記ＡＧＲ−ＯＮ・ＣＳＦが、その３５番目のアミノ酸
（Ｖal）を、Ｎ端アミノ酸としていること、ＡＧＲ−Ｏ
Ｎ・ＣＳＦ製造の際に副産物（マイナー成分）として、
同３３番目のアミノ酸（Ｇlu）又は同３７番目のアミノ
酸（Ｇlu）をそれぞれＮ端アミノ酸とする生物活性のＭ
−ＣＳＦが得られること等からも明白である。更に他の
ヘモポエチン間の一次構造上の類似性の知見から、同２
７番目のアミノ酸（Ａla）をＮ端アミノ酸とするＭ−Ｃ
ＳＦも天然に存在すると考えられる〔J.W.Schrader, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, Vol.83, pp.2458-
2462 (1986) 〕。 【００３６】また、後述する実施例に示す通り、前記式
（１）に示すアミノ酸配列における１７８番目のアミノ
酸（Ｃys）以降のＣ末端側のアミノ酸配列は、ヒトＭ−
ＣＳＦの生物活性発現には必ずしも必要でないことも確
認されている。 【００３７】従って、本発明遺伝子は、式（１）に示さ
れるアミノ酸配列情報に基づいた、生物活性のヒトＭ−
ＣＳＦ分子をコードする新規なＤＮＡ配列を有すること
により特徴づけられる。これには、より具体的には、式
（１）に示す全アミノ酸配列をコードするＤＮＡのほ
か、そのＮ末端側アミノ酸配列の一部、例えばアミノ酸
番号１〜２６、１〜３２、１〜３４及び１〜３６の配列
のいずれか、及び／又はそのＣ末端側アミノ酸配列の一
部、例えばアミノ酸番号１７８以降の配列の全て又は一
部、を欠失する各々のアミノ酸配列をコードする各ＤＮ
Ａ及び之等と実質的に均等なＤＮＡが包含される。 【００３８】かかる本発明遺伝子は、上記情報に基づい
て、例えばホスファイト トリエステル法〔Nature, 31
0, 105 (1984) 〕等の常法に従い、核酸の化学合成によ
り製造することもでき、また第３図に示される３７２
の、又は第５図に示される５５４の、アミノ酸配列から
なるポリペプチドをコードするＤＮＡを原料として、通
常の方法に従い製造することもでき、特に後者の方法は
簡便であり好適である。 【００３９】この３７２又は５５４のアミノ酸配列から
なるポリペプチドをコードするＤＮＡを原料とする方法
において、一部ＤＮＡの化学合成やＤＮＡ鎖の切断、削
除、付加乃至は結合を目的とする酵素処理やＤＮＡの単
離、精製乃至複製、選別等の各種操作乃至手段は、いず
れも常法に従うことができ、本発明遺伝子以外の遺伝子
もしくはＤＮＡ鎖について当該分野でよく知られている
各種方法をいずれも採用することができる。例えば上記
ＤＮＡの単離精製は、アガロースゲル電気泳動法等に従
うことができ、核酸配列のコドンの一部の改変は、サイ
ト−スペシフィック ミュータジェネシス(Site-Specif
ic Mutagenesis) 〔Proc. Natl. Acad.Sci., 81, 5662-
5666 (1984)〕等に従うことができる。尚、上記におい
て所望のアミノ酸に対応する遺伝暗号の選択は、特に限
定されるものではなく、利用する宿主細胞のコドン使用
頻度等を考慮して常法に従い決定できる。 【００４０】また、上記方法に従い得られる本発明遺伝
子のＤＮＡ配列の決定及び確認は、例えばマキサム−ギ
ルバートの化学修飾法〔Maxam-Gilbert, Meth. Enzym.,
65,499-560 (1980) 〕やＭ１３ファージを用いるジデ
オキシヌクレオチド鎖終結法〔Messing, J. and V ieir
a,J., Gene, 19, 269-276 (1982)〕等により行なうこと
ができる。 【００４１】かくして得られる本発明遺伝子の利用によ
れば、遺伝子組換え技術により、ヒトＭ−ＣＳＦを容易
に且つ大量に製造、収得することができる。 【００４２】このヒトＭ−ＣＳＦの製造方法は、上記特
定の本発明遺伝子（ＤＮＡ）を利用することを除いて、
従来公知の一般的な遺伝子組換え技術に従うことができ
る〔Science, 224, 1431 (1984) ；Biochem. Biophys.
Res. Comm., 130, 692 (1985) ；Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA, 80, 5990 (1983) ；ＥＰ特許公開第１８７９
９１号公報、Molecular Cloning, by T.Maniatis et a
l., Cold Spring Harbor Laboratory (1982) 等参
照〕。 【００４３】より詳細には、本発明遺伝子が宿主細胞中
で発現できるような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主
細胞に導入して形質転換し、該形質転換株を培養すれば
よい。 【００４４】ここで宿主細胞としては、真核生物及び原
核生物のいずれをも用いることができる。該真核生物の
細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物
細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Y.
Gluzman, Cell, 23, 175-182(1981)〕やチヤイニーズ・
ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株
〔G.Urlaub and L.A.Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA, 77, 4216-4220 (1980)〕等がよく用いられている
が、之等に限定される訳ではない。脊椎動物細胞の発現
ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流
に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポ
リアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを
使用でき、これは更に必要により複製起点を保有してい
てもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初
期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr〔S.Sabramani,
R.Mulligan and P.Berg, Mol. Cell. Biol., 1, 854-7
64〕等を例示できるが、これに限定されない。 【００４５】また真核微生物としては酵母が一般によく
用いられており、その中でもサッカロミセス属酵母が有
利に利用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクター
としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプ
ロモーターを持つｐＡＭ８２〔A.Miyanohara et al, Pr
oc. Natl. Acad. Sci.,USA., 80, 1-5 (1983)〕等を好
ましく利用できる。 【００４６】原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌
が一般によく用いられている。本発明では例えば該宿主
菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベク
ター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上
流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガ
ーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付
与した発現プラスミドが使用できる。上記宿主菌として
の大腸菌としては、エシエリヒア・コリ（Escherichia
coli）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一
般にｐＢＲ３２２がよく用いられるが、これらに限定さ
れず、公知の各種の菌株及びベクターがいずれも利用で
きる。プロモーターとしては、例えばトリプトフアン・
プロモーター、ＰL プロモーター、lac プロモーター、
lpp プロモーター等を使用することができ、いずれの場
合にも本発明遺伝子を発現させることができる。 【００４７】宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合
を例にあげると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製
起点を保有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であ
り、更に転写プロモーター、転写終結シグナル及びＲＮ
Ａスプライス部位等を備えたものを用いることができ、
例えば後記実施例に示すプラスミドｐｃＤＥを用いる場
合、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター下流に位置する制
限酵素ＥcoＲＩ部位に、本発明遺伝子を連結することに
より、目的とする発現プラスミドを得ることができる。 【００４８】かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿
主細胞への導入及びこれによる形質転換の方法として
は、一般に用いられている方法が採用でき、例えば上記
プラスミドｐｃＤＥに目的遺伝子が挿入された発現プラ
スミドは、ＤＥＡＥ−デキストラン法やリン酸カルシウ
ム−ＤＮＡ共沈澱法等により、ＣＯＳ細胞に取込ませる
ことができ、かくして所望の形質転換細胞を容易に得る
ことができる。 【００４９】かくして得られる所望の形質転換体は、常
法に従い培養することができ、該培養により生物活性の
ヒトＭ−ＣＳＦが生産、蓄積される。該培養に用いられ
る培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される
各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＣＯＳ細胞であ
れば、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ダルベッコの修正イー
グル最小必須培地（Dulbecco's modified Eagle's MEM
）等の培地に必要に応じ牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血
清成分を添加したものを使用できる。 【００５０】上記により、形質転換体の細胞内又は細胞
外に生産されるＭ−ＣＳＦは、該Ｍ−ＣＳＦの物理的性
質、化学的性質等を利用した各種の分離操作（「生化学
データーブックII」、１１７５〜１２５９頁、第１版第
１刷、１９８０年６月２３日、株式会社東京化学同人発
行参照）により、それらより分離、精製することができ
る。該方法としては、具体的には例えば通常の蛋白沈澱
剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィ
ー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種
液体クロマトグラフィー、透析法、之等の組合せ等を例
示できる。 【００５１】特に好ましい分離方法においては、まず培
養上清より予め目的とする物質を部分精製する。この部
分精製は、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、
リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理及び／又は透
析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外濾過処理等に
より行なわれる。之等の各処理の操作及び条件は、通常
のこの種方法のそれらと同様のものとすればよい。 【００５２】次いで上記で得られた粗精製物を、吸着ク
ロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、
ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマ
トグラフィー等に付すことにより、又は之等各操作の組
合せにより、目的物質の活性が認められる画分を収得
し、かくして目的物質を均質な物質として単離すること
ができる。 【００５３】上記吸着クロマトグラフィーは、例えばフ
エニル−セファロース、オクチル−セファロース等を担
体として実施できる。 【００５４】アフィニティクロマトグラフィーは、場合
により例えばＣonＡ−セファロース、レンチルレクチン
−セファロース（フアルマシア社製）等の担体を利用し
たクロマトグラフィーにより実施することもできる。 【００５５】ゲル濾過は、例えばデキストランゲル、ポ
リアクリルアミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリル
アミド−アガロースゲル、セルロース等を素材としたゲ
ル等を用いて実施できる。上記ゲル濾過剤の具体例とし
ては、セフアデックスＧタイプ、セフアロースタイプ、
セフアクリルタイプ（以上、フアルマシア社製）、セル
ロファイン（チッソ社製）、バイオゲルＰタイプ、同Ａ
タイプ（バイオラド社製）、ウルトロゲルＡｃＡ（ＬＫ
Ｂ社製）、ＴＳＫゲルＳＷタイプ（東洋曹達社製）等の
市販品を例示できる。 【００５６】イオン交換クロマトグラフィーは、例えば
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等を交換基とする陰
イオン交換体を利用したクロマトグラフィーにより実施
できる。 【００５７】逆相クロマトグラフィーは、例えばＣ1 、
Ｃ3 、Ｃ4 等のアルキル基、シアノプロピル基、フエニ
ル基等の官能基がシリカゲル等の基体に結合された担体
を用いて実施できる。より具体的には例えばＣ4 ハイポ
アー逆相ＨＰＬＣカラム（ＲＰ−３０４、バイオラド社
製）を用いて、移動相としてアセトニトリル、トリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）、水等及び之等の混合溶媒を用いて
実施できる。 【００５８】上記方法により、容易に高収率、高純度で
所望の本発明ヒトＭ−ＣＳＦを工業的規模で製造でき
る。 【００５９】上記で得られるＭ−ＣＳＦは、これを医薬
として用いるに当り、その有効量を、薬理的に許容され
る通常の無毒性担体と共に含有する薬理組成物の形態に
調製され該形態に応じた各種投与経路で投与される。そ
の製剤形態としては、液状形態例えば溶液、懸濁液、乳
濁液等が通常採用され、之等は一般に経口、静脈内、皮
下、皮内、筋肉内投与されるが、特に之等の形態及び投
与経路に限定されず、上記Ｍ−ＣＳＦは、他の通常採用
される経口、非経口投与等に適した各種の製剤形態に調
製することもでき、また使用前に適当な担体の添加によ
り液状となし得る乾燥品とすることもできる。各種形態
の製剤の投与量は、所望の薬理効果、疾病の種類、患者
の年齢、性別、疾患の程度等に応じて適宜決定され、特
に限定はないが、通常有効成分とするＭ−ＣＳＦを蛋白
量として約０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ／日となる量で１
日に１回乃至数回に分けて投与すればよい。 【００６０】 【実施例】以下、本発明遺伝子の製造及びその利用によ
る本発明ヒトＭ−ＣＳＦの製造、その特徴等を、実施例
として挙げて、更に詳述する。 【００６１】尚、各例で得られる試料のＣＳＦ活性は以
下の方法により測定されるものとする。 【００６２】〈ＣＳＦの活性測定法〉牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）２０ｍｌ、α−培地３０ｍｌ及び２倍濃度α−培地
２０ｍｌを混和して得られる溶液を３７℃にて保温し、
その２３．３ｍｌを予め５０℃に保温した１％寒天（デ
ィフコ社製）溶液１０ｍｌと混合して３７℃に保温す
る。 【００６３】一方ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス大腿骨より採取
した骨髄細胞（ＢＭＣ）を、ハンクス液で２回洗浄後、
α−培地にて細胞濃度が１０7 個／ｍｌとなるように調
製し、その１ｍｌを上記３７℃に保温してある寒天培地
に加え、よく混和した後、３７℃に保温し、次いでその
０．５ｍｌを、予め５０μｌの供試試料を入れたウェル
（ティッシュカルチャークラスター１２、コスター社
製）に加えて手早く混和して室温に放置する。各ウェル
の寒天が固化するのを待って炭酸ガスインキュベーター
に移し、更に３７℃で７日間培養する。 【００６４】かくして生じたコロニー数を実体顕微鏡を
用いて計測し、ＣＳＦ活性の指標とする。尚上記で生じ
るコロニーは、形態学的及び酵素化学的観察の結果、い
ずれもマクロファージコロニーであつた。 【００６５】 【実施例１】本発明遺伝子の製造 イ） ＡＧＲ−ＯＮ細胞の培養 ヒトＴ細胞培養株化細胞ＡＧＲ−ＯＮ（ＡＴＣＣ受託Ｎ
o.ＣＲＬ−８１９９）を、１０％新生子牛血清（ＮＣ
Ｓ）、２０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン
−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１００
μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００単位／ｍｌペニ
シリンＧ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、５×１０-5
Ｍ ２−メルカプトエタノール及び１ｍＭグルタミンを
含むＲＰＭＩ−１６４０培地〔フローラボラトリー社
製〕にて、約１０5 細胞／ｍｌの細胞濃度に調製した。
その１ｌを、２００ｍｌ容ティッシュ−カルチャ−フラ
スコ〔コーニング社製〕５本にて、３７℃で７２時間培
養した。 【００６６】ロ） ｍＲＮＡの抽出 上記イ）で得たＡＧＲ−ＯＮ細胞約５×１０8 細胞を、
４Ｍ−グアニジンチオシアネート溶液〔４Ｍ−グアニジ
ンイソチオシアネート、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ザルコシル（Ｓar
kosyl ）、１４０ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕５
０ｍｌに溶解後、６０℃に加温しながら、Ｇ１８Ｇ注射
針をつけた５０ｍｌ注射筒を用いてＤＮＡをせん断し
た。 【００６７】この溶液に６０℃に加温した等量のフェノ
ール、１／２容量の１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．２）−１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）−１
ｍＭＥＤＴＡ溶液及び等量のクロロホルム−イソアミル
アルコール（２４：１）混合液を加え、６０℃の水浴中
で１０分間振盪した後、４℃にて３０００rpm で１５分
間遠心分離した。水層を取り、フェノール−クロロホル
ム抽出を２回、更にクロロホルム抽出を２回行なった
後、２容の冷エタノールを加えて、−２０℃で６０分間
保持した。４℃にて３０００rpm で２０分間遠心し、沈
澱したＲＮＡペレットを、１００ｍＭトリス・ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）−５０ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ−０．２％ＳＤＳ溶液５０ｍｌに溶解後、プロティ
ナーゼＫ〔proteinaseＫ、メルク社製〕を２００μｇ／
ｍｌの濃度で加え、３７℃にて６０分間反応させた。６
０℃にて、フェノール−クロロホルム抽出を２回、更に
クロロホルム抽出を２回行なった後、１／１０容の３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２容の冷エタノール
を加えて、−７０℃にて６０分間放置した。４℃にて３
０００rpm で２０分間遠心し、沈澱したＲＮＡペレット
を冷７０％エタノールで洗浄後、ＴＥ溶液〔１０ｍＭト
リス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ〕に
溶解させた。 【００６８】かくしてＡＧＲ−ＯＮ細胞５×１０8 細胞
から全ＲＮＡ約５ｍｇを得た。 【００６９】次いで、上記で得られた全ＲＮＡからｍＲ
ＮＡを取得するために、オリゴ（ｄＴ）−セルロース
〔コラボレイティブリサーチ社製〕を用いて、カラムク
ロマトグラフィーを行なった。ｍＲＮＡの吸着は、１０
ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
−０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いて行ない、カラムを同
溶液及び１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ−０．１ＭＮａＣｌ溶液にて洗浄後、１０
ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍＭＥＤＴＡを
用いてＲＮＡを溶出させた。 【００７０】上記により、ｍＲＮＡ約１１０μｇを得
た。 【００７１】ハ） ｃＤＮＡライブラリーの作製 上記ロ）で得たｍＲＮＡ５μｇから、ｃＤＮＡを、ｃＤ
ＮＡ合成システム〔アマシャム社製〕を利用して合成し
た。 【００７２】得られたｃＤＮＡ約０．６μｇを、減圧乾
燥した後、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１
０ｍＭ ＥＤＴＡ−５０ｍＭ ＤＴＴ−４０μＭ Ｓ−
アデノシル−Ｌ−メチオニン溶液２０μｌに溶解し、Ｅ
coＲＩメチラーゼ〔ニューイングランドバイオラブ社
製〕１６単位を加え、３７℃にて１５分間反応させた。 【００７３】この反応液を７０℃で１０分間加熱し、反
応を停止させた後、フェノール−クロロホルム抽出を行
ない、抽出液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．２）及び２．５容のエタノールを加え、−７０℃に
て１５分間放置した。４℃にて１５０００rpm で１５分
間遠心し、沈澱させたＤＮＡペレットを、５０ｍＭトリ
ス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 −１
０ｍＭ ＤＴＴ−１ｍＭ ＡＴＰ−１００μｇ／ｍｌＥ
coＲＩリンカー〔宝酒造社製、５′−ＧＧＡＡＴＴＣＣ
−３′〕溶液１０μｌに溶解後、これにＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ〔宝酒造社製〕３５０単位を加え、１４℃にて１６
時間反応させた。 【００７４】得られた反応液を７０℃で１０分間加熱し
て反応を停止させた後、１００ｍＭＮａＣｌ−５０ｍＭ
トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−７ｍＭ ＭｇＣｌ2 −
１０ｍＭ ＤＴＴ溶液１６μｌと、制限酵素ＥcoＲＩ
〔宝酒造社製〕４０単位とを加え、３７℃にて３時間消
化させた。 【００７５】反応液に０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）０．８μｌを加え、反応を停止させた後、バイオゲ
ルＡ５０ｍ〔バイオ−ラド社製〕カラムクロマトグラフ
ィーにて、余剰のＥcoＲＩリンカーを除去した。ｃＤＮ
Ａ画分に、制限酵素ＥcoＲＩで消化後、アルカリフォス
ファターゼにて、５′−リン酸基を除去したλｇｔ１１
ＤＮＡ〔プロトクローンＧＴ（Ｐrotoclone ＧＴ）、プ
ロメガバイオテク社製〕１μｇ、１／１０容積の３Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２．５容積のエタノー
ルを加え、−７０℃にて３０分間放置した。４℃にて１
５０００rpm で１５分間遠心し、沈澱させたＤＮＡペレ
ットを７０％エタノールで洗浄後、減圧乾燥し、水７μ
ｌに溶解させた。 【００７６】次に、５００ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）−１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 溶液２μｌを加え、
４２℃にて１５分間保温した後、室温に戻し、１００ｍ
Ｍ ＤＴＴ１μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ１μｌ及びＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１７５単位を加え、１４℃で１６時間保温
した。 【００７７】次に、この反応液１０μｌにλファージパ
ッケージングエクストラクト〔Packagene system 、プ
ロメガバイオテク社製〕を加え、２２℃にて２時間保温
することにより、インビトロでリコンビナントファージ
ＤＮＡのパッケージングを行なった。この溶液にファー
ジ希釈緩衝液〔１００ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭトリス
・ＨＣｌ（ｐＨ７．９）−１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ〕０．５ｍｌ及びクロロホルム２５μｌを加え４℃
で保存した。 【００７８】ニ） ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ング ニ）-1. 合成プローブの作製 ＡＧＲ−ＯＮ培養上清から抽出単離されたＡＧＲ−ＯＮ
・ＣＳＦのアミノ酸配列（Ｎ末端より２７残基）の情報
に基づいて、合成プローブとして、下記塩基配列を用い
た。 【００７９】 Ｖal −Ｓer −Ｇlu −Ｔyr −Ｃys − Ｓer− Ｈis 5′ＧＴＧ ＴＣＧ ＧＡＧ ＴＡＣ ＴＧＴ ＡＧＣ ＣＡＣ 3′ 3′ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＴＣ ＡＴＧ ＡＣＡ ＴＣＧ ＧＴＧ 5′ 上記式に示した塩基配列に対する相補的な塩基配列（最
下段に示す）を、Ｍ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを有
するリコンビナントファージの選出のためのプローブと
して利用するため、以下の方法により合成した。 【００８０】即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルメチルホスホロ
アミダイド誘導体を、縮合ユニツトとして用いた固相ホ
スフアイトトリエステル法〔ネーチヤー(Nature), 310,
105(1984) 〕にて、自動合成機〔３８０Ａ ＤＮＡシ
ンセサイザー，アプライドバイオシステムズ社製〕を用
いて、目的とする完全保護ＤＮＡを合成した。続いて該
完全保護ＤＮＡを２８％アンモニア水で５５℃で１０時
間処理することにより５′末端のＯＨ基に結合している
保護基としてのＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）基以外
の保護基（Ａ、Ｇ、Ｃのアミノ基のアシル基をさす）を
脱保護させ、部分保護ＤＮＡ（ＤＭＴｒ体とよぶ）を得
た。次いでこのＤＭＴｒ体をＯＤＳ（山村化学研究所社
製）を担体とする逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）により精製後、８０％酢酸を用いて室温で２０
分間処理して、粗オリゴヌクレオチドを得た。これをＯ
ＤＳを担体とする逆相ＨＰＬＣにより更に精製して、目
的とするオリゴヌクレオチドを得た。 【００８１】上記で得たＤＮＡ０．８μｇを、１００μ
ｌの反応液〔５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、２００μＣｉ〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰ）中で、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ〔宝酒造〕１８単位と、３
７℃にて１時間反応させ、ＤＮＡの５′末端を32Ｐで標
識した。標識されたＤＮＡと未反応の〔γ−32Ｐ〕ＡＴ
Ｐを分別するために、バイオゲルＰ−３０〔バイオ−ラ
ド社製〕によるゲル濾過を行なつた。標識ＤＮＡ画分を
プールし−２０℃で保存した。 【００８２】得られたプローブの比放射活性は、１０8
cpm ／μｇＤＮＡ以上であった。 【００８３】ニ）-2. プラークハイブリダイゼーション エシェリヒア・コリＹ１０９０株を、５０μｇ／ｍｌア
ンピシリン及び０．２％マルトースを含むＬＢ培地〔バ
クトトリプトン１０ｇ、バクトイースト抽出物５ｇ及び
ＮａＣｌ５ｇ／ｌ〕４０ｍｌに植菌し、３００ｍｌフラ
スコにて３７℃で一夜振盪培養した。４℃にて３０００
rpm で１５分間遠心して菌体を回収し、菌体のペレット
を２０ｍｌのＳＭ培地〔１００ｍＭ ＮａＣｌ−５０ｍ
Ｍトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１０ｍＭ ＭｇＳＯ
4 ・７Ｈ2 Ｏ−０．０１％ゼラチン〕に懸濁させ、４℃
で保存した。 【００８４】次に、上記菌液０．３ｍｌに、前記ハ）で
得られたリコンビナントファージ粒子液をＳＭ培地にて
３．５×１０5 pfu （プラークフォーミングユニット）
／ｍｌに希釈したもの０．１ｍｌを加え、３７℃にて１
５分間保温した。続いて、予め４７℃に保温しておいた
ＬＢ軟寒天培地〔バクトトリプトン１０ｇ、バクトイー
スト抽出物５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、アガロース７ｇ／ｌ〕
７．５ｍｌを加えて混和した後、直径１５ｃｍのシャー
レに作ったＬＢ寒天プレート〔バクトトリプトン１０
ｇ、バクトイースト抽出物５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、バクト
寒天１５ｇ／ｌ〕に重層し、４２℃にて一夜培養した。
尚、同様の操作を合計２０枚のシャーレで実施した。 【００８５】プラークの出現した寒天プレート上に、直
径１３２ｍｍのナイロンフィルター〔ＢＮＲＧ１３２、
ポール社製〕を載せることによって、レプリカフィルタ
ーを作製した。寒天プレートはこれをマスタープレート
として４℃に保存した。 【００８６】フィルターを、０．５Ｍ ＮａＯＨ−１．
５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）−１．５Ｍ ＮａＣｌ及び０．３Ｍ ＮａＣｌ−
０．０２Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 （ｐＨ７．４）−０．００
２Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）にて順次処理し、風乾
後、真空下に８０℃で１時間ベーキングを行なった。 【００８７】ベーキング済みのフィルターを、０．７５
Ｍ ＮａＣｌ−０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム−１ｍ
ｇ／ｍｌフィコール−１ｍｇ／ｍｌポリビニルピロリド
ン−１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ−１０ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ６．５）−０．２％ＳＤＳ−０．１ｍｇ／ｍｌサ
ーモンスパーム（Ｓalmon Ｓperm）ＤＮＡ溶液５０ｍｌ
中で軽く振盪しながら、４２℃にて６時間保温した。次
にフィルターを１０6 cpm ／ｍｌの濃度にプローブを加
えた同液に移し、４２℃にて２０時間軽く振盪しなが
ら、ハイブリダイゼーシヨンを行なった。 【００８８】ハイブリダイゼーシヨンの終わったフィル
ターを取り出し、０．９Ｍ ＮａＣｌ−０．０９Ｍクエ
ン酸ナトリウムにて室温で３回洗浄し、その後、５６℃
で同溶液にて５分間洗浄した。 【００８９】フィルターを風乾後、増感紙を用いてＸ線
フイルム〔ＸＲ５、コダック社製〕に、−７０℃にて２
日間オートラジオグラフィーを行なった。 【００９０】フイルムを現像後、シグナル領域に符合す
るプラークをマスタープレートよりかき取り、上記の方
法を繰返してポジティブシグナルを有するプラークの純
化を行ない、最終的に、代表的なポジティブクローンλ
ｃＭ５及びλｃＭ１１を単離した。 【００９１】ホ） クローンの構造解析 λｃＭ５のｃＤＮＡの制限酵素地図を作製した。その結
果を第１図に示す。 【００９２】第１図より、ｃＤＮＡは全長約２．５キロ
ベース（kb）であり、その中にはＢstＥＩＩ〔ニューイ
ングランドバイオラブ社〕、ＮcoＩ〔宝酒造社〕、Ｓma
Ｉ〔宝酒造社〕、ＫpnＩ〔宝酒造社〕、ＥcoＲＩ〔宝酒
造社〕及びＮdeＩ〔ニューイングランドバイオラブ社〕
により切断される個所がそれぞれ１個所、またＳcaＩ
〔宝酒造社〕、ＳtuＩ〔宝酒造社〕及びＢamＨＩ〔宝酒
造社〕により切断される個所がそれぞれ２個所ずつ存在
することが確認された。 【００９３】次に、上記ｃＤＮＡの塩基配列をマキサム
−ギルバートの化学修飾法及びＭ１３フアージを用いる
ジデオキシヌクレオチド鎖終結法にて決定した。その結
果を、第２図（第２図−１〜第２図−４）に示す。 【００９４】第２図より、合成プローブと相補的な領域
が、５′末端より２２７番目〜２４７番目に存在（図に
下線を付して示す）した。 【００９５】また、λｃＭ５のｃＤＮＡ中の最長のリー
デイングフレーム（reading frame）を検索したとこ
ろ、これは５′末端より１２５番目から１２４０番目の
領域にあり、そのコドンのフレームによる２２７番目〜
３０７番目の塩基配列に対応するアミノ酸配列は、ＡＧ
Ｒ−ＯＮ・ＣＳＦのＮ末端２７アミノ酸と完全に同一で
あった。このことは、λｃＭ５のｃＤＮＡがＭ−ＣＳＦ
前駆体蛋白質をコードするｃＤＮＡであることを示して
いる。 【００９６】以上の結果より、決定されたλｃＭ５のコ
ードするＭ−ＣＳＦ前駆体蛋白質の蛋白一次構造を第３
図（第３図−１〜第３図−２）に示す。 【００９７】また上記と同様にして決定されたλｃＭ１
１ｃＤＮＡの塩基配列を第４図（第４図−１〜第４図−
４）に、そのコードするＭ−ＣＳＦ前駆体蛋白質の蛋白
一次構造を第５図（第５図−１〜第５図−３）にそれぞ
れ示す。 【００９８】 【実施例２】 ＣＯＳ細胞における組換えＭ−ＣＳＦ（ｒ−ＭＣＳＦ）
の製造 この例に利用したＣＯＳ−１細胞とは、増殖開始点（Ｏ
ri）欠損のＳＶ４０ＤＮＡで、サルの腎細胞ＣＶ１をト
ランスフォームさせることによって、ＳＶ４０初期遺伝
子を発現し、Ｔ抗原陽性となった細胞である〔セル(Cel
l), 23, 175-182 (1981)参照〕。 【００９９】イ） ＣＯＳ細胞発現ベクターｐｃＤＥの
作製 まず、プラスミドｐｃＤＶ１〔オカヤマら(H.Okayama,
P.Berg, Mol.Cell.Biol., 3, 280-289 (1983) 〕を、制
限酵素ＫｐｎＩで切断し、次いで５′末端及び３′末端
の突出部分をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ〔ＢＲＬ社〕で削
り平滑末端とした。 【０１００】一方、ＥcoＲＩリンカー（５′−ＧＧＡＡ
ＴＴＣＣ−３′）〔宝酒造社〕の５′末端を、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、これを先の平
滑末端としたＤＮＡ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結した。連結物を制限酵素ＥcoＲＩで切断し、更に
制限酵素Ｈind ＩＩＩで切断し、得られた反応物をアガ
ロースゲル電気泳動に付して、２５９０ベースペアー
（bp）のＥcoＲＩ−Ｈind ＩＩＩＤＮＡ断片を単離精製
した。 【０１０１】また他方、プラスミドｐＬ１〔オカヤマら
(H.Okayama, P.Berg, Mol.Cell.Biol., 3, 280-289 (19
83) 〕を、制限酵素ＰstＩ〔宝酒造社〕で切断後、５′
末端及び３′末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平
滑末端とし、このＤＮＡ断片に、上記と同様にしてＥco
ＲＩリンカーを連結させ、得られるＤＮＡ断片を制限酵
素Ｈind ＩＩＩにて切断し、反応物をアガロースゲル電
気泳動に付して、５８０bpのＥcoＲＩ−Ｈind ＩＩＩＤ
ＮＡ断片を単離精製した。 【０１０２】得られたＤＮＡ断片と先に調製したＥcoＲ
Ｉ−Ｈind ＩＩＩＤＮＡ断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結させて、所望のプラスミドｐｃＤＥを得
た。 【０１０３】以上の概略を第６図に示す。 【０１０４】ロ） Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ
・ＣＳＦの作製 λｃＭ５ＤＮＡを、制限酵素ＥcoＲＩで部分消化させ、
得られる反応物をアガロースゲル電気泳動に付し、ｃＤ
ＮＡ部分（約２．５kb）をＥcoＲＩ部分消化断片として
単離精製した。 【０１０５】上記イ）で得られたＣＯＳ細胞発現ベクタ
ーｐｃＤＥを制限酵素ＥcoＲＩで切断し、これを上記で
調製したｃＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結させて、所望のプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦを得た。 【０１０６】かくして得られたプラスミドを、エシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１株にトランスフォームさせて、目
的のトランスフォーマントを、アルカリ溶菌法〔マニア
ティスら（T.Maniatis et al. Molecular Cloning, pp9
0, Cold Spring Harvor Laboratory (1982) 〕によっ
て、得られるプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選
択した。 【０１０７】以上の概略を第７図に示す。 【０１０８】ハ） ｒ−ＭＣＳＦの製造 上記ロ）で得たｐｃＤＭ・ＣＳＦを、ＣＯＳ−１細胞
に、ＤＥＡＥ−デキストラン法〔Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, Vol.81, p1070 (1984)〕にてトランスフェクト
し、該細胞におけるｒ−ＭＣＳＦの生産を以下の通り試
験した。 【０１０９】即ち、まずＣＯＳ−１細胞を、１０％牛胎
児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で、約
２．５×１０5 細胞／ｍｌの細胞濃度に調製し、これを
ティッシュカルチャークラスター６〔コースター社製〕
に、１ウェル当り２ｍｌとなる量で入れて、３７℃で一
夜、炭酸ガスインキュベーターにて培養した。 【０１１０】次いで培地を除去し、ＲＰＭＩ−１６４０
にて細胞を２回洗浄後、上記ロ）で調製したｐｃＤＭ・
ＣＳＦ１０μｇを含むＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌ
〔５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）及び４００μ
ｇ／ｍｌＤＥＡＥ・デキストラン（ファルマシァ社製）
を含む〕を加え、炭酸ガスインキュベーター内に４時間
放置した。更に培地を除去した後、ＲＰＭＩ−１６４０
にて細胞を２回洗浄し、これに１５０μＭクロロキン
〔シグマ社製〕を含むＲＰＭＩ−１６４０培地３ｍｌを
加え、３時間培養した。次に培地を除去し、細胞をＲＰ
ＭＩ−１６４０にて洗浄後、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地にて、３７℃で７２時間、炭酸ガスイ
ンキュベーター内で培養した。 【０１１１】かくして得られた細胞培養物より培養上清
及びその抽出物を回収して、之等につき、それぞれの希
釈倍率でのＣＳＦ活性を測定した。 【０１１２】得られた結果を下記表１に示す。尚、表１
には、コントロールとしてｐｃＤＭ・ＣＳＦに代えて、
ｐｃＤＥを用いて上記と同一操作を行なった結果を併記
する。また各活性測定試験は、同一試料につき各２回行
なった。 【０１１３】 【表１】 【０１１４】尚、表１における数値は、プレート当りの
コロニー数（平均値）を示す。以降のＣＳＦ活性を示す
表においても同様とする。 【０１１５】ニ） Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ
・ＣＳＦ−１８５の作製 上記ロ）で得たプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦを利用し
て、サイト−スペシフィック ミュータジェネシス（Si
te-Specific Mutagenesis ）〔Proc. Natl. Acad. Sc
i., 81, 5662-5666 (1984)〕の方法に従って、第３図に
おけるアミノ酸番号１８６のアミノ酸（Ｌys）をコード
するコドン（ＡＡＧ）を、終止コドン（ＴＡＧ）に置換
して、第３図におけるアミノ酸番号１８５のアミノ酸
（Ｔhr）をＣ端アミノ酸とする所望のＭ−ＣＳＦ発現プ
ラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ−１８５を得た。 【０１１６】その詳細は次の通りである。 【０１１７】即ち、まずプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦよ
りＥcoＲＩ−ＥcoＲＩＤＮＡ断片（大きさ１．８kb）を
切り出し、これをＭ１３ｍｐ１１ファージ（ＲＦ）のＥ
coＲＩとＥcoＲＩの制限酵素サイトにクローニングし、
これから一本鎖（ss）ＤＮＡ（Ｍ１３−ＣＳＦ）を得、
これをミュータジェネシスの鋳型とした。 【０１１８】一方、合成オリゴヌクレオチド〔５′−Ｇ
ＴＧＧＴＧＡＣＣＴＡＧＣＣＴＧＡＴＴ−３′（プライ
マー）〕を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化
した後、上記ssＤＮＡ（Ｍ１３−ＣＳＦ）とハイブリダ
イズし、アニーリング後、ｄＮＴＰｓの存在下に、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）及びＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで各々処理して、１５℃で１８時間インキュベート
した。 【０１１９】得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント
細胞にトランスフォームし、生じたコロニーの内５０コ
ロニーを、寒天プレート上に植菌し、３７℃で１８時間
培養した。生育したコロニーを含むフィルターを通常の
方法によりアルカリ変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベ
ーキング処理した。このフィルターをプレハイブリダイ
ズした後、このものと、上記プライマーの５′末端を32
Ｐ−ｒ−ＡＴＰでラベルした32Ｐ−プローベとを、室温
でハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたフィル
ターを、６×ssc (saline sodium citrate）で、室温で
１０分間、次いで５６℃で４分間各々洗浄し、乾燥させ
た後、−７０℃で１８時間オートラジオグラフィーを行
なった。 【０１２０】変異したクローンの内から、Ｍ１３−ＣＳ
Ｆ−１８５を選び、これをＪＭ１０５に感染させて培養
して、ssＤＮＡ及びＲＦ ＤＮＡを調製した。 【０１２１】上記で得られたssＤＮＡのＭ１３ジデオキ
シヌクレオチド鎖終結法により、目的とする遺伝子の変
異を確認した。 【０１２２】また上記ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ Ｄ
ＮＡよりＥcoＲＩ−ＥcoＲＩ断片を調製し、これを上記
ロ）と同様にして発現プラスミドに組込んで、所望のプ
ラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ−１８５を得た。 【０１２３】このプラスミドを用いて、上記ハ）と同様
にして、ＣＯＳ−１細胞でｒ−ＭＣＳＦを発現させた。
その結果を下記表２に示す。 【０１２４】 【表２】 【０１２５】ホ） Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ
・ＣＳＦ−１７７の作製 プライマーとして５′−ＧＣＴＧＡＡＴＧＡＴＣＣＡＧ
ＣＣＡＡ−３′を用いて、上記ニ）と同様にして、第３
図におけるアミノ酸番号１７８のアミノ酸（Ｃys）をコ
ードするコドン（ＴＧＣ）を終止コドン（ＴＧＡ）に置
換して、第３図におけるアミノ酸番号１７７のアミノ酸
（Ｇlu）をＣ端アミノ酸とする所望のＭ−ＣＳＦ発現プ
ラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ−１７７を得た。 【０１２６】このプラスミドを用いて、上記ハ）と同様
にして、ＣＯＳ−１細胞でｒ−ＭＣＳＦを発現させた結
果を同様にして下記表３に示す。 【０１２７】 【表３】 【０１２８】上記表２及び表３に示す結果より、本発明
遺伝子を保有するプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ−１８５
及び同ｐｃＤＭ・ＣＳＦ−１７７の利用によれば、それ
ぞれＭ−ＣＳＦの生物活性を示す所望のｒ−ＭＣＳＦを
発現できることが判る。 【０１２９】このことから、少なくとも第３図に示すア
ミノ酸配列におけるアミノ酸番号１７８以降のＣ端側の
アミノ酸配列は、目的とする生物活性を有するＭ−ＣＳ
Ｆ分子の発現には、実質的に影響を及ぼさないことが明
らかである。 【０１３０】ヘ） 上記ロ）において、λｃＭ５ｃＤＮ
Ａの代わりにλｃＭ１１ｃＤＮＡを用いて、プラスミド
ｐｃＤＭ・ＣＳＦ１１を得た。該プラスミドを用いて、
上記ハ）に従ってｒ−ＭＣＳＦを製造し、略同様の結果
を得た。 【０１３１】即ち、λｃＭ１１ＤＮＡを、制限酵素Ｅco
ＲＩで部分消化させ、得られる反応物をアガロースゲル
電気泳動に付し、ｃＤＮＡ部分（約２．５kb) をＥcoＲ
Ｉ部分消化断片として単離精製した。 【０１３２】前記イ）で得られたＣＯＳ細胞発現ベクタ
ーｐｃＤＥを制限酵素ＥcoＲＩで切断し、これを上記で
調製したｃＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結させて、所望のプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ１１を得
た。 【０１３３】かくして得られたプラスミドを、エシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１株にトランスフォームさせて、目
的のトランスフォーマントを、アルカリ溶菌法〔マニア
ティスら（T.Maniatis et al. Molecular Cloning, pp9
0, Cold Spring Harvor Laboratory (1982) 〕によっ
て、得られるプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選
択した。 【０１３４】また、上記λｃＭ１１ＤＮＡのｃＤＮＡ
（ＥcoＲＩ部分消化断片）を、クローニングベクターｐ
ＵＣ１９ＤＮＡ（宝酒造）のＥcoＲＩクローニング部位
に挿入して、プラスミドｐＵＣＭＣＳＦ・１１を得た。
該プラスミドをエシェリヒア・コリＨＢ１０１株にトラ
ンスフォームさせた形質転換体は、Ｅscherichia coli
ＨＢ１０１／ｐＵＣＭＣＳＦ・１１なる名称で、１９８
７年７月１６日に工業技術院微生物工業研究所に微工研
条寄第１４０９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４０９）として
寄託されている。 【０１３５】ト） プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ１１を
制限酵素ＥcoＲＩ及びＢstＥＩＩで消化し、約６７０bp
のＥcoＲＩ−ＢstＥＩＩＤＮＡ断片を単離精製した。 【０１３６】このＤＮＡ断片のＢstＥＩＩ切断側に、
５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにてリン酸化
した下記合成ＤＮＡリンカー； を連結して得られたＤＮＡ断片と、前記したプラスミド
ｐｃＤＥのＥcoＲＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼによ
り連結して、所望のプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ１１−
１８５を得た。該プラスミドは、上記合成リンカー部位
に翻訳終止コドンＴＧＡＴＡＡをもち、従ってプラスミ
ドｐｃＤＭ・ＣＳＦ１１がコードする第５図に示される
ポリペプチドにおいて、その１８５番目のアミノ酸（Ｔ
hr）をＣ端アミノ酸とするＭ−ＣＳＦをコードする。 【０１３７】以上の概略を第８図に示す。 【０１３８】該プラスミドを用いて、上記ハ）と同様に
して発現させた結果を下記表４に示す。 【０１３９】 【表４】 【０１４０】チ） 上記ト）で得たプラスミドｐｃＤＭ
・ＣＳＦ１１−１８５を用い、上記ホ）に従って第５図
におけるアミノ酸番号１７８のアミノ酸（Ｃys）をコー
ドするコドン（ＴＧＣ）を終止コドン（ＴＧＡ）に置換
して、第５図における１７７番目のアミノ酸（Ｇlu）を
Ｃ端アミノ酸とする所望のＭ−ＣＳＦ発現プラスミドｐ
ｃＤＭ・ＣＳＦ１１−１７７を得た。該プラスミドを用
いて上記ハ）と同様にして発現させた結果を下記表５に
示す。 【０１４１】 【表５】 【０１４２】リ） プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ１１−
１８５ ＤＮＡを、ＥcoＲＩ及びＢamＨＩで消化してＥ
coＲＩ−ＢamＨＩ ＤＮＡ断片（約６８０bp）を単離精
製し、これを分泌型発現ベクターｐＩＮ−ＩＩＩ−Ｏｍ
ｐＡ３〔EMBO J., 3, 2437〜2442 (1984)〕のＥcoＲ
Ｉ、ＢamＨＩクローニングサイトに挿入して、プラスミ
ドｐＩＮ−ＩＩＩ−ＯｍｐＡ３−ＭＣＳＦ１１−１８５
を得た。 【０１４３】該プラスミドＤＮＡをＸbaＩ及びＢamＨＩ
で消化してＸbaＩ−ＢamＨＩ ＤＮＡ断片（約７７０b
p）を単離精製し、これを一本鎖ＤＮＡ調製用のクロー
ニングベクターｐＵＣ１１８ＤＮＡ〔宝酒造〕のＸba
Ｉ、ＢamＨＩクローニングサイトに挿入して、プラスミ
ドｐＵＣ１１８−ＯｍｐＡ３−ＭＣＳＦ１１−１８５を
得た。 【０１４４】該プラスミドを用い、前記サイト スペシ
フィック ミュータジェネシスの方法に従い、ＯｍｐＡ
シグナルペプチドのＣ末端アミノ酸（Ａla）をコードす
るコドン（ＧＣＣ）に、第５図に示すポリペプチドの３
５番目のアミノ酸（Ｖal）をコードするコドン（ＧＴ
Ｇ）が連結して位置するように改変して、プラスミドｐ
ＵＣ１１８−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５１を得
た。 【０１４５】即ち、プラスミドｐＵＣ１１８−ＯｍｐＡ
３−ＭＣＳＦ１１−１８５ ＤＮＡにてトランスフォー
ムした大腸菌ＪＭ１０５に、ヘルパーファージＫ０７
〔宝酒造〕を感染させ、３７℃で１４時間振盪培養し、
一本鎖（ss）ｐＵＣ１１８−ＯｍｐＡ３−ＭＣＳＦ１１
−１８５ＤＮＡを得、これをミュータジェネシスの鋳型
として用い、またプライマーとして５′−ＴＡＣＣＧＴ
ＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＧＴＧＴＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴ
ＡＧＣ−３′を用いて、上記ニ）と同様にして所望のプ
ラスミドｐＵＣ１１８−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ
１５１を得た。 【０１４６】該プラスミドＤＮＡをＸbaＩ及びＢamＨＩ
で消化してＸbaＩ−ＢamＨＩ ＤＮＡ断片（約５４０b
p）を単離精製し、これを発現ベクターｐＩＮ−ＩＩＩ
（lppp −５）−Ａ３のＸbaＩ−ＢamＨＩサイトに挿入
して、第５図における３５番目のアミノ酸（Ｖal）から
１８５番目のアミノ酸（Ｔhr）までからなるポリペプチ
ド発現用の、所望の分泌型発現プラスミドｐＩＮ−ＩＩ
Ｉ（lpp p −５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５
１を得た。 【０１４７】以上の概略を第９図−１、２及び３に示
す。 【０１４８】また、上記分泌型発現プラスミドにコード
されるアミノ酸配列を第１０図に示す。第１０図中、下
線を付した配列はＯｍｐＡシグナルペプチドを、▼はプ
ロセッシング部位をそれぞれ示す。 【０１４９】ヌ） 上記リ）で得たｐＩＮ−ＩＩＩ（lp
p p −５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５１を大
腸菌ＨＢ１０１及びＪＭ１０９にトランスフォームして
分泌生産を行ない、ペリプラズム画分としてＣＳＦ活性
を示す上清を回収した。 【０１５０】即ち、上記のＭ−ＣＳＦ分泌型発現ベクタ
ーを保有する菌株を２ｌ容フラスコにて、５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地５００ｍｌにて３７
℃で１４時間振盪培養した後、遠心（５０００rpm 、５
分間、室温）して菌体をペレットとした。 【０１５１】この菌体ペレットを、５０ｍＭトリス・Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）−２５％シュークロース溶液５０ｍ
ｌに再浮遊させ、更に２５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）を１．２５ｍｌ加えた後、ゆっくりと振盪しながら
室温に３０分間置いた。同様に遠心して得られた菌体ペ
レットを、氷冷した蒸留水２５ｍｌに再浮遊させ、ゆっ
くりと振盪しながら、３０分間氷冷し、４℃にて、１０
０００rpm 、５分間遠心して、ペリプラズム画分として
上清を回収した。 【０１５２】ル） 上記リ）において、ｐｃＤＭ・ＣＳ
Ｆ１１−１８５の代りにｐｃＤＭ−ＣＳＦ１１−１７７
を用いることにより、第５図における３５番目のアミノ
酸（Ｖal）から同１７７番目のアミノ酸（Ｇlu）までか
らなるポリペプチド発現用の所望のＭ−ＣＳＦ分泌型発
現プラスミド、ｐＩＮ−ＩＩＩ（lpp p −５）−Ｏｍｐ
Ａ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１４３を得た。 【０１５３】該プラスミドにコードされるアミノ酸配列
を第１１図に示す。第１１図中、下線を付した配列はＯ
ｍｐＡシグナルペプチドを、▼はプロセッシング部位を
それぞれ示す。該プラスミドを上記ヌ）と同様にして大
腸菌にトランスフォームさせて、該大腸菌よりペリプラ
ズム画分としてＣＳＦ活性を示す上清を得た。 【０１５４】ヲ） 上記ヘ），ト）、チ）及びヌ）で得
た各上清を、下記条件のＨＰＬＣに付した。 【０１５５】カラム：ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（６０
ｃｍ×７．５ｍｍ直径、東洋曹達工業） 溶離液：０．００５％ポリエチレングリコール及び０．
１５Ｍ ＮａＣｌ含有ＰＢＳ 流速：０．８ｍｌ／分 フラクション容積：０．８ｍｌ／チューブ／分 分子量マーカー（グルタミン酸脱水素酵素：２９万、乳
酸脱水素酵素：１４．２万、エノラーゼ：６．７万、ア
デニル酸キナーゼ：３．２万、チトクロムＣ：１．２４
万）を基準として、各サンプルにつき、以下の結果を得
た。 【０１５６】・サンプル：前記ヘ）で得た培養上清の４
ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）にて約１５
０μｌに濃縮したもの。 【０１５７】分子量３２〜７０万（平均４８万）に相当
する範囲の溶出画分に、ＣＳＦ活性を認めた。 【０１５８】・サンプル：前記ト）で得た培養上清４ｍ
ｌを上記と同様に処理したもの。 【０１５９】分子量６．６万から８．６万（平均７．６
万）に相当する範囲の溶出画分に、ＣＳＦ活性を認め
た。 【０１６０】・サンプル：前記チ）で得た培養上清４ｍ
ｌを上記と同様に処理したもの。 【０１６１】分子量５．２万から８．６万（平均６．７
万）に相当する範囲の溶出画分に、ＣＳＦ活性を認め
た。 【０１６２】・サンプル：前記ヌ）で得たペリプラズム
画分の上清２ｍｌを上記と同様にして約１１０μｌに濃
縮したもの。 【０１６３】分子量３〜４万（平均３．５万）に相当す
る位置に、ＣＳＦ活性を認めた。 【０１６４】ワ） 前記ヘ），ト）又はチ）で得た培養
上清の１０ｍｌを、１ｍｌのＣonＡ−セファロースを充
填したカラムに供した後、ＰＢＳ−（５ｍｌ）にて洗浄
後、０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシド含有ＰＢＳ−
（１０ｍｌ）にて溶出した。得られた溶出液の４ｍｌを
セントリコン−１０にて濃縮し、これを下記ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ用サンプルとした。 【０１６５】また、前記ヌ）で得たペリプラズム画分の
上清は、これをそのまま、同サンプルとした。 【０１６６】Ｍ−ＣＳＦの検出は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後
のゲルをウエスタンブロッティングに供し、常法に従っ
て製造したＭ−ＣＳＦに対する家兎抗血清を使用するこ
とにより行なった。 【０１６７】即ち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥはレムリの方法
〔Laemmli, U.K., Nature, 277, 680(1970)〕に従い、
ミニスラブ（ゲル濃度１５％）を用い、またウエスタン
ブロッティングは、バイオラッド社のトランスブロット
セルを用いて行なった。トランスファーされたニトロセ
ルロース膜を１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳ−にてブ
ロッキング後、Ｍ−ＣＳＦに対する上記家兎抗血清と反
応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体
（バイオラッド社製）を作用させた。Ｍ−ＣＳＦバンド
の検出は、かくして得られたニトロセルロース膜と発色
基質である４−クロロ−１−ナフトール液を反応させる
ことにより行なった。 【０１６８】結果を下記表６に示す。 【０１６９】 【表６】【０１７０】カ） プラスミドｐＳＶ２−dhfr〔Mol. C
ell. Biol., 1, 854 (1981) 〕を、制限酵素Ｈind ＩＩ
ＩとＢamＨＩにより２つの断片に切断して、ジヒドロ葉
酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む断片を単離精製し
た。 【０１７１】次に、プラスミドｐＲＳＶ−ＣＡＴ〔Pro
c. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6777 (1981) 〕を、同
じくＨinｄＩＩＩとＢamＨＩとで切断してラウス肉腫ウ
イルス（ＲＳＶ）のＬＴＲ（long terminal repeat）部
分を含む断片を単離精製した。 【０１７２】上記で精製された２種の断片を、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを反応させることにより連結させた。 【０１７３】この反応物を大腸菌ＨＢ１０１コンピテン
トセル（宝酒造）にトランスフォームし、得られたアン
ピシリン耐性を示すコロニーからプラスミドＤＮＡを調
製し、制限酵素地図を作成して、目的のプラスミドｐＲ
ＳＶ−dhfrを得た。 【０１７４】該プラスミドはＲＳＶのＬＴＲ部分、ＤＨ
ＦＲ遺伝子、ＳＶ４０由来の介在配列とpolyＡ付加シグ
ナル、更に大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開
始点とアンピシリン耐性遺伝子を含有し、上記ＬＴＲ部
分に含有されるプロモーターのコントロール下にＤＨＦ
Ｒを発現するものである。 【０１７５】このプラスミドｐＲＳＶ−dhfrをＮdeＩと
ＢamＨＩとで２つの断片に切断して、ＤＨＦＲ遺伝子を
含む断片を単離精製した。得られたＤＮＡ断片を、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（クレノウ フラグメント）で処理し
て両末端を平滑末端とした。 【０１７６】一方、前記ヘ）で得たプラスミドｐｃＤＭ
・ＣＳＦ１１を、ＳalＩで切断後、この切断部位を同様
にＤＮＡポリメラーゼＩで処理して平滑末端とした。 【０１７７】以上により得られた両断片を、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結させ、この反応物を大腸菌ＪＭ１
０９コンピテントセルにトランスフォームした。得られ
たアンピシリン耐性を示すコロニーからプラスミドＤＮ
Ａを調製し、制限酵素地図を作成して、目的のＭ−ＣＳ
ＦとＤＨＦＲの両遺伝子の発現プラスミドｐｃＤＭ・Ｃ
ＳＦ１１−dhfrを得た。 【０１７８】該プラスミドは、Ｍ−ＣＳＦ発現に係わる
ＳＶ４０由来の初期プロモーター部分、介在配列、Ｍ−
ＣＳＦ遺伝子、polyＡ付加シグナル、ＤＨＦＲ発現に係
わるＲＳＶのＬＴＲ部分、ＤＨＦＲ遺伝子、ＳＶ４０由
来の介在配列、polyＡ付加シグナルを含有し、更に大腸
菌プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点及びアンピ
シリン耐性遺伝子を含有する。 【０１７９】以上の概略を第１２図−１及び−２に示
す。 【０１８０】ヨ） 上記で得たプラスミドｐｃＤＭ・Ｃ
ＳＦ１１−dhfrを用いて、前記ハ）に従って、ｒ−ＭＣ
ＳＦを製造した。 【０１８１】その結果、培養上清のＣＳＦ活性は、プレ
ート当たりのコロニー数（平均値）として６８（プラス
ミドｐｃＤＥを用いた対照は０）であった。 【０１８２】タ） ７５ｃｍ2 培養フラスコ（コスター
社製）で培養されたチャイニーズハムスター卵巣dhfr欠
損細胞〔ＣＨＯ−Ｄｕｋdhfr−細胞：Proc. Natl. Aca
d. Sci., USA., 77, 4216 (1980) 〕を、常法に従って
トリプシン（フローラボラトリー社製）処理し、１０％
透析牛胎児血清（GIBCO 社製）を含むダルベッコ改良最
小必須培地（ＤＭＥＭ培地、GIBCO 社製）に懸濁させ、
同培地にて細胞を洗浄した後、培地を除いた。 【０１８３】この細胞を、ＤＮＡ注入溶液（０．２５Ｍ
マンニトール−０．１ｍＭ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ−
０．１ｍＭ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ−０．２ｍＭトリス
ＨＣｌ、ｐＨ７．２、和光純薬工業社製）に懸濁させ
た。 【０１８４】前記カ）で得たＭ−ＣＳＦ発現プラスミド
ｐｃＤＭ・ＣＳＦ１１−dhfrを、ＣlaＩにより切断し、
線状化した後、ＤＮＡ注入溶液に溶解させた。 【０１８５】上記の細胞懸濁液２００μｌ（２×１０6
細胞）とＤＮＡ溶液２００μｌ（３０μｇＤＮＡ）を混
合し、融合チャンバーＣＨ−２（島津製作所社製）に入
れ、電気融合装置ＳＳＨ−１（島津製作所社製）に接続
して、４．２ＫＶ／ｃｍ2 パルスを１秒間隔で２回繰返
し、電気的に、細胞内にＤＮＡを導入した。 【０１８６】ＤＮＡを導入した細胞を１０％透析牛胎児
血清−１％非必須アミノ酸溶液（フローラボラトリーズ
社製）−２％ＨＴ溶液（同上社製）−ＤＭＥＭ培地に懸
濁させ、２４穴プレート（コスター社製）にて培養し
た。 【０１８７】４８時間培養後、培地を選択培地（１０％
透析牛胎児血清及び１％非必須アミノ酸溶液を含むＤＭ
ＥＭ培地）に交換し、その後、３〜４日毎に培地を新鮮
なものと交換した。 【０１８８】１０〜１４日間培養して得られた約２００
クローンの形質転換細胞より５０クローンを選んで、常
法通りトリプシン処理後、新しい２４穴プレートに移し
た。 【０１８９】ＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、高濃度のメトト
レキセート（ＭＴＸ）に対する耐性を与え〔J. B. C.,
253, 1357 (1978)〕、同時に形質転換された近接の遺伝
子はＭＴＸにより増幅を示す。 【０１９０】上記５０クローンの形質転換細胞を、２０
ｎＭ ＭＴＸを含む選択培地で培養し続け、増殖のみら
れた耐性クローンをトリプシン処理後、５０ｎＭ ＭＴ
Ｘを含む選択培地に懸濁させて培養を行なった。同様に
増殖のみられた耐性クローンを、１００ｎＭ ＭＴＸを
含む選択培地で培養し続け、最終的に４００ｎＭ ＭＴ
Ｘに耐性を示すクローンを得た。 【０１９１】これらの耐性クローンの培養上清のＣＳＦ
活性を下記表７に示す。 【０１９２】 【表７】 【０１９３】上記で得たＣＨＯ細胞培養上清を、そのま
ま、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルとして、前記ワ）と同
様にして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の検討を行な
った。 【０１９４】その結果、非還元条件下で９万、還元条件
下で４．４万に相当する位置にＭ−ＣＳＦのバンドが検
出された。
ヒトのコロニー刺激因子（Colony-Stimulating Factor,
ＣＳＦ）の製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】一般に、造血細胞の増殖、分化には特定
の増殖及び分化因子が必要とされており、最終的に成熟
した各種の血球、例えば赤血球、顆粒球、マクロファー
ジ、好酸球、血小板、リンパ球等になるまでの間には、
数多くの分化、増殖因子が関与している〔三浦恭定著、
血液幹細胞、中外医学社、１９８３年〕。之等の中で顆
粒球系前駆細胞及びマクロファージ系前駆細胞の増殖、
分化を刺激するものとしてＣＳＦが知られており、かか
るＣＳＦには、顆粒球の形成に特異性を有するＧ型（Ｇ
−ＣＳＦ）、マクロファージの形成に特異的なＭ型（Ｍ
−ＣＳＦ）及び顆粒球とマクロファージの両方の形成を
促進するＧＭ型（ＧＭ−ＣＳＦ）が知られている。また
更に多能性幹細胞に作用するＣＳＦとして、マルチＣＳ
Ｆ（Multi-CSF ：ＩＬ−３）も知られている。 【０００３】上記ＣＳＦは、その生物活性に基づき、癌
化学療法及び放射線療法時の共通した欠点である白血球
の減少を軽減させるものと考えられ、この観点から臨床
研究が行なわれている。 【０００４】また、上記ＣＳＦは、白血球の機能を促進
させる作用を有することが知られており〔ロペッツら(L
opez,A.F. et al.), J.Immunol., 131, 2983 (1983),
ハンダムら(Handam,E. etal.), 同122, 1134 (1979)及
びバダスら(Vadas,M.A. et al.),同130, 795 (1983)
〕、このことから、種々の感染症の予防及び治療薬と
しての有効性が確認されている。 【０００５】更に、ＣＳＦの分化誘導作用〔メットカー
フら(Metcalf,D. et al., Int. J.Cancer, 30, 773 (19
82)〕に基づき、該ＣＳＦは骨髄性白血病の治療剤とし
て有効性が認められている。 【０００６】しかして、ＣＳＦは例えば胎児細胞、脾細
胞等の培養液、人尿、種々の株化培養細胞の培養液等に
その活性が認められ、該活性画分として分離、利用され
ているが、いずれの起源のものも該起源に由来する類似
した多量の夾雑物質等の混在及びＣＳＦ自体の濃度の低
さが障害となり、その製造面で問題を残しており、均質
性、収量、操作等の面から、医薬品としてのＣＳＦを産
業的に継続して得る手段は、未だ見出されていない。 【０００７】本発明者らは、先にＣＳＦを常時均質な状
態で多量産生することのできる、ヒト白血病Ｔ細胞由来
の培養株化細胞である「ＡＧＲ−ＯＮ」を確立し、該細
胞に係わる発明を特許出願した（特開昭５９−１６９４
８９号公報）。また、本発明者らは、上記ＡＧＲ−ＯＮ
の産生するＣＳＦにつき、更にその精製を重ねた結果、
該ＣＳＦを純粋な形で簡単にしかも高収率で収得する方
法を開発し、またかくして得られるＣＳＦの構造的特徴
及び生化学的特徴を解明し、かかる物質としてのＣＳＦ
に係わる発明を完成し、特許出願した（特開昭６２−１
６９７９９号）。 【０００８】上記先の発明に係わるＣＳＦは、Ｍ−ＣＳ
Ｆ、即ち、正常骨髄細胞に作用してマクロファージの分
化増殖を促進させる活性を有する糖蛋白質であって、下
記の理化学的性質を有する点において特徴付けられるも
ので、「ＡＧＲ−ＯＮ・ＣＳＦ」と呼ばれた。 【０００９】ａ）分子量：非還元条件下でＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動により、３３０００〜４３０
００ダルトンであり、非還元条件且つＳＤＳ存在下での
ゲル濾過で、２３０００〜４００００ダルトンである、 ｂ）蛋白質部分のＮ端アミノ酸配列：次の一次構造式で
表わされる配列を有する。 【００１０】Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gl
y-Ser-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-
Ser-Gln-Met-Glu-Thr 【００１１】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、遺伝
子工学的手法によって、容易に且つ大量に新しい組換え
ヒトＭ−ＣＳＦを製造、供給する方法を提供することに
ある。 【００１２】本発明者らは、引続く研究において、上記
ＡＧＲ−ＯＮ・ＣＳＦの由来細胞であるＡＧＲ−ＯＮか
らメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出し、該ｍＲ
ＮＡからその相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製し、上記Ａ
ＧＲ−ＯＮ・ＣＳＦのアミノ酸配列情報に基づいて所望
のＭ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを選択し、該ｃＤＮ
Ａを含むベクターを創製し、該ベクターを宿主細胞に導
入して形質転換体を製造し、これを培養して目的の生物
活性を有するＭ−ＣＳＦの生成を確認するに至り、ここ
に本発明を完成した。 【００１３】 【課題を解決するための手段】即ち、本発明によれば、
下式（１）のアミノ酸配列の３３位Ｇｌｕから３７位Ｇ
ｌｕのいずれかをＮ端アミノ酸とし、同１８５位Ｔｈｒ
をＣ端アミノ酸とする部分アミノ酸配列をコードする核
酸配列を有するヒトＭ−ＣＳＦ遺伝子を含有する組換え
ベクターで形質転換された宿主を培養し、得られるヒト
Ｍ−ＣＳＦを採取することを特徴とするヒトＭ−ＣＳＦ
の製造方法が提供される。 【００１４】式（１）：Met-Thr-Ala-Pro-Gly-Ala-Ala-
Gly-Arg-Cys-Pro-Pro-Thr-Thr-Trp-Leu-Gly-Ser-Leu-Le
u-Leu-Leu-Val-Cys-Leu-Leu-Ala-Ser-Arg-Ser-Ile-Thr-
Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Se
r-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-
Gln-Met-Glu-Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Va
l-Asp-Gln-Glu-Gln-Leu-Lys-Asp-Pro-Val-Cys-Tyr-Leu-
Lys-Lys-Ala-Phe-Leu-Leu-Val-Gln-X -Ile-Met-Glu-Asp
-Thr-Met-Arg-Phe-Arg-Asp-Asn-Thr-Pro-Asn-Ala-Ile-A
la-Ile-Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-Lys
-Ser-Cys-Phe-Thr-Lys-Asp-Tyr-Glu-Glu-His-Asp-Lys-A
la-Cys-Val-Arg-Thr-Phe-Tyr-Glu-Thr-Pro-Leu-Gln-Leu
-Leu-Glu-Lys-Val-Lys-Asn-Val-Phe-Asn-Glu-Thr-Lys-A
sn-Leu-Leu-Asp-Lys-Asp-Trp-Asn-Ile-Phe-Ser-Lys-Asn
-Cys-Asn-Asn-Ser-Phe-Ala-Glu-Cys-Ser-Ser-Gln-Asp-V
al-Val-Thr-Lys-Pro-Asp-Cys-Asn-Cys-Leu-Tyr-Pro-Lys
-Ala-Ile-Pro-Ser-Ser-Asp-Pro-Ala-Ser-Val-Ser-Pro-H
is-Gln-Pro-Leu-Ala-Pro-Ser-Met-Ala-Pro-Val-Ala-Gly
-Leu-Thr-Trp-Glu-Asp-Ser-Glu-Gly-Thr-Glu-Gly-Ser-S
er-Leu-Leu-Pro-Gly-Glu-Gln-Pro-Leu-His-Thr-Val-Asp
-Pro-Gly-Ser-Ala-Lys-Gln-Arg-Pro-Pro-Arg-Ser-Thr-C
ys-Gln-Ser-Phe-Glu-Pro-Pro-Glu-Thr-Pro-Val-Val-Lys
-Asp-Ser-Thr-Ile-Gly-Gly-Ser-Pro-Gln-Pro-Arg-Pro-S
er-Val-Gly-Ala-Phe-Asn-Pro-Gly-Met-Glu-Asp-Ile-Leu
-Asp-Ser-Ala-Met-Gly-Thr-Asn-Trp-Val-Pro-Glu-Glu-A
la-Ser-Gly-Glu-Ala-Ser-Glu-Ile-Pro-Val-Pro-Gln-Gly
-Thr-Glu-Leu-Ser-Pro-Ser-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser-M
et-Gln-Thr-Glu-Pro-Ala-Arg-Pro-Ser-Asn-Phe-Leu-Ser
-Ala-Ser-Ser-Pro-Leu-Pro-Ala-Ser-Ala-Lys-Gly-Gln-G
ln-Pro-Ala-Asp-Val-Thr-Gly-Thr-Ala-Leu-Pro-Arg-Val
-Gly-Pro-Val-Arg-Pro-Thr-Gly-Gln-Asp-Trp-Asn-His-T
hr-Pro-Gln-Lys-Thr-Asp-His-Pro-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg
-Asp-Pro-Pro-Glu-Pro-Gly-Ser-Pro-Arg-Ile-Ser-Ser-P
ro-Arg-Pro-Gln-Gly-Leu-Ser-Asn-Pro-Ser-Thr-Leu-Ser
-Ala-Gln-Pro-Gln-Leu-Ser-Arg-Ser-His-Ser-Ser-Gly-S
er-Val-Leu-Pro-Leu-Gly-Glu-Leu-Glu-Gly-Arg-Arg-Ser
-Thr-Arg-Asp-Arg-Arg-Ser-Pro-Ala-Glu-Pro-Glu-Gly-G
ly-Pro-Ala-Ser-Glu-Gly-Ala-Ala-Arg-Pro-Leu-Pro-Arg
-Phe-Asn-Ser-Val-Pro-Leu-Thr-Asp-Thr-Gly-His-Glu-A
rg-Gln-Ser-Glu-Gly-Ser-Ser-Ser-Pro-Gln-Leu-Gln-Glu
-Ser-Val-Phe-His-Leu-Leu-Val-Pro-Ser-Val-Ile-Leu-V
al-Leu-Leu-Ala-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Phe-Tyr-Arg-Trp
-Arg-Arg-Arg-Ser-His-Gln-Glu-Pro-Gln-Arg-Ala-Asp-S
er-Pro-Leu-Glu-Gln-Pro-Glu-Gly-Ser-Pro-Leu-Thr-Gln
-Asp-Asp-Arg-Gln-Val-Glu-Leu-Pro-Val 〔式中、ＸはＴyr又はＡspを示す。〕本明細書におい
て、ペプチド及びアミノ酸の表示は、ＩＵＰＡＣにより
採択されているアミノ酸命名法における略号乃至当該分
野で慣用されているそれに従うものとし、ＤＮＡ塩基配
列及び核酸の表示も同様とする。 【００１５】本発明方法によれば、目的とする新規なヒ
トＭ−ＣＳＦは、これをコードする遺伝子（以下「本発
明遺伝子」という）を利用して、遺伝子工学的手法によ
り、容易且つ大量に製造することができ、前記したごと
く、その生物活性に基づいて、例えば白血球減少を伴う
疾病もしくは病態の予防及び治療薬として、骨髄移植の
補助剤として、各種感染症の予防及び治療薬として、更
に抗癌剤等として、殊に医薬分野で有用である。 【００１６】 【発明の実施の形態】以下、本発明遺伝子につき詳述す
る。 【００１７】本発明遺伝子は、例えばＭ−ＣＳＦ産生能
を有するヒト細胞、より具体的且つ有利には前記ＡＧＲ
−ＯＮより分離されたｍＲＮＡから調製される。以下、
この調製の詳細をＡＧＲ−ＯＮを用いて説明するが、他
の細胞でも同様である。起源細胞として利用されるＡＧ
Ｒ−ＯＮは、特開昭５９−１６９４８９号公報に記載さ
れた特性を有するヒト白血病Ｔ細胞由来のヒト培養株化
細胞であり、これはアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ＡＴＣＣ）に「ＡＴＣＣ受託Ｎo.ＣＲＬ
−８１９９」として受託されている。 【００１８】上記ＡＧＲ−ＯＮからのｍＲＮＡの分離
は、基本的には通常の抽出操作に従い実施される。より
詳しくは、上記ＡＧＲ−ＯＮを、まず例えばＣＥＭ培
地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、ＤＭ−１６０培地、イー
グルの最小必須培地（Eagle's MEM ）、フイッシャーの
培地（Fisher's Medium ）、Ｆ−１０培地、Ｆ−１２培
地、Ｌ−１５培地、ＮＣＴＣ−１０９培地、ＲＰＭＩ−
１６４０培地等又は必要に応じて牛胎児血清（ＦＣＳ）
等の血清やアルブミン等の血清成分を添加した上記培地
で、約１×１０4 〜１×１０7 個／ｍｌの濃度範囲で、
通常の培養法例えば炭酸ガス培養法等に従い、約３０〜
４０℃程度、好ましくは約３７℃前後で１〜５日間を要
して培養する。次いで培養上清中にＡＧＲ−ＯＮ・ＣＳ
Ｆが生産蓄積される時期に、上記培養細胞を、適当な界
面活性剤、例えばＳＤＳ、ＮＰ−４０、トリトンＸ１０
０、デオキシコール酸等を用いて、或いはホモゲナイザ
ーを用いる方法や凍結融解等の物理的方法によって、部
分的又は完全に破壊、可溶化した後、染色体ＤＮＡを、
ポリトロン等のミキサーもしくは注射筒を用い、ある程
度せん断し、その後、蛋白質と核酸分画とを分別して全
ＲＮＡの抽出を行なう。この操作には、特にフエノール
・クロロホルム抽出もしくは超遠心を用いるＣｓＣｌ重
層法〔チルグウィンら（Chirgwin,J.M., et al.), バイ
オケミストリー(Biochemistry), 18, 5294 (1979) 〕等
が一般に用いられる。 【００１９】また上記各方法においては、ＲＮaseによ
るＲＮＡの分解を防ぐために、ＲＮaseインヒビター、
例えばヘパリン、ポリビニル硫酸、ジエチルピロカーボ
ネート、バナジウム複合体、ベントナイト、マカロイド
等を添加使用することもできる。 【００２０】上記抽出操作に従い得られるＲＮＡからの
ｍＲＮＡの分離、精製は、例えばオリゴｄＴ−セルロー
ス〔コラボレィティブ リサーチ社（Collaborative Re
search Inc.〕、ポリＵ−セフアロース〔フアルマシア
(Pharmacia）社〕、セフアロース２Ｂ〔フアルマシア
社〕等を用いて吸着カラム法又はバツチ法により実施で
きる。 【００２１】かくして得られるｍＲＮＡからの、目的の
Ｍ−ＣＳＦに対するｍＲＮＡの精製濃縮及び同定は、例
えば得られたｍＲＮＡを蔗糖密度勾配遠心等によつて分
画し、その分画につき、蛋白質の翻訳系、例えばアフリ
カツメガエルの卵母細胞への注入やウサギ網状赤血球ラ
イゼート又は小麦胚芽等の無細胞系で蛋白質に翻訳さ
せ、その蛋白質のＭ−ＣＳＦ活性を調べることにより実
施でき、かくして目的とするｍＲＮＡの存在を確認でき
る。更に目的とするｍＲＮＡの確認は、上記Ｍ−ＣＳＦ
の活性測定に代えて、Ｍ−ＣＳＦに対する抗体を用いる
免疫法によつても行ない得る。 【００２２】上記により得られる精製ｍＲＮＡは、通常
不安定であるため、これを安定なｃＤＮＡに変換し、目
的遺伝子の増幅を可能とするために微生物由来のレプリ
コンに接続する。インビトロでの、上記ｍＲＮＡのｃＤ
ＮＡへの変換、即ち本発明遺伝子の合成は、一般に次の
ようにして行なうことができる。 【００２３】即ち、まずオリゴｄＴをプライマーとし
（このプライマーは遊離のオリゴｄＴもしくは既にベク
タープライマーに付加されたオリゴｄＴのいずれでもよ
い）、ｍＲＮＡを鋳型としてｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰ又はｄＴＴＰ）の存在下で、逆転写酵素
を用いてｍＲＮＡからこれに相補的な一本鎖ｃＤＮＡを
合成する。次のステツプは、上記において遊離のオリゴ
ｄＴを用いたか、ベクタープライマーに付加されたオリ
ゴｄＴを用いたかにより、各々以下の如く異なる。 【００２４】前者の場合、鋳型としたｍＲＮＡをアルカ
リ処理等により分解して除去し、その後一本鎖ＤＮＡを
鋳型として逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼを用いて
二本鎖ＤＮＡを作成する。次に得られる二本鎖ＤＮＡの
両端をエキソヌクレアーゼで処理し、そのそれぞれに適
当なリンカーＤＮＡ又はアニーリング可能な組合せの塩
基を複数付加し、これを適当なベクター、例えばＥＫ系
プラスミドベクターやλgt系ファージベクター等に組込
む。 【００２５】また、後者の場合、鋳型としたｍＲＮＡを
残存させたまま、上記と同様のリンカーを付与した開環
状プラスミドと、リンカーＤＮＡ（しばしば動物細胞で
自立複製できる領域とｍＲＮＡの転写プロモーター領域
を含むＤＮＡ断片が用いられる）とを、アニーリングさ
せて閉環状とした後、ｄＴＮＰ存在下で、ＲＮase とＤ
ＮＡポリメラーゼとを共存させて、ｍＲＮＡをＤＮＡ鎖
に置換し、完全なプラスミドＤＮＡを作成できる。 【００２６】上記のごとくして得られるＤＮＡは、これ
をベクターの宿主、例えばエシェリヒア コリ（Esheri
chia coli）、バチルス ズブチリス（Bacillus subtil
is）、サッカロミセス セレビシアエ（Saccharomyces
cerevisiae）等の適当な宿主内に導入して、これを形質
転換することができる。このＤＮＡの宿主への導入及び
これによる形質転換の方法としては、一般に用いられて
いる方法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集
め、ＣａＣｌ2 処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい
状態にして、プラスミドを取り込ませる方法等を採用で
きる。上記方法においては、通常知られているように形
質転換の効率を一層向上させるためにＭｇＣｌ2 やＲｂ
Ｃｌを更に共存させることもできる。また、宿主細胞を
スフェロプラスト又はプロトプラスト化してから形質転
換させる方法も採用することができる。 【００２７】上記により得られる形質転換株から、目的
のＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡを有する株を選出する方法とし
ては、例えば以下に示す各種方法を採用できる。 【００２８】（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを
用いるスクリーニング法 目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明されて
いる（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、
目的蛋白のどの領域のものでもよい）場合、該アミノ酸
に対応するオリゴヌクレオチドを合成し（この場合、コ
ドン使用頻度を用いて導いた塩基配列又は考えられる塩
基配列の組合せの複数個のどちらでもよく、また後者の
場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこともでき
る）、これをプローブ（32Ｐ又は35Ｓでラベルする）と
して、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロ
ースフィルターとハイブリダイゼーションし、得られた
ポジティブ株を検索して、これを選出する。 【００２９】（２）動物細胞でＭ−ＣＳＦを産生させて
スクリーニングする方法 形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフェクトし（この場合、自己複製可
能でｍＲＮＡ転写プロモーター領域を含むプラスミドも
しくは動物細胞染色体にインテグレートするようなプラ
スミドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋白
質を産生させ、その培養上清もしくは細胞抽出物のＭ−
ＣＳＦ活性を測定するか、又はＭ−ＣＳＦに対する抗体
を用いてＭ−ＣＳＦを検出することにより、元の形質転
換株より目的のＭ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを有す
る株を選出する。 【００３０】（３）Ｍ−ＣＳＦに対する抗体を用いて選
出する方法 予め、ｃＤＮＡを形質転換株内で蛋白質を発現し得るベ
クターに組込み、形質転換株内で蛋白質を産生させ、Ｍ
−ＣＳＦに対する抗体及び該抗体に対する第二抗体を用
いて、Ｍ−ＣＳＦ産生株を検出し、目的株を得る。 【００３１】（４）セレクティブ・ハイブリダィゼーシ
ョン・トランスレーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロース
フィルター等にブロットし、Ｍ−ＣＳＦ産生細胞からの
ｍＲＮＡをハイブリダイゼーションさせた後、ｃＤＮＡ
に対応するｍＲＮＡを回収する。回収されたｍＲＮＡを
蛋白翻訳系、例えばアフリカツメガエルの卵母細胞への
注入や、ウサギ網状赤血球ライゼートや小麦胚芽等の無
細胞系で蛋白質に翻訳させ、その蛋白質のＭ−ＣＳＦ活
性を調べるか、又はＭ−ＣＳＦに対する抗体を用いて検
出して、目的の株を得る。 【００３２】得られた目的の形質転換株よりＭ−ＣＳＦ
をコードするＤＮＡを採取する方法は、公知の方法に従
い実施できる。例えば細胞よりプラスミドＤＮＡに相当
する画分を分離し、該プラスミドＤＮＡよりｃＤＮＡ領
域を切り出すことにより行ない得る。 【００３３】かくして得られるＤＮＡは、本発明遺伝子
の一具体例であり、第３図に示される３７２のアミノ酸
配列又は第５図に示される５５４のアミノ酸配列、で特
定されるヒトＭ−ＣＳＦ前駆体をコードしている。 【００３４】しかして、本発明遺伝子を利用して遺伝子
工学的手法により得られる物質が、ヒトＭ−ＣＳＦの生
物活性を発現するためには、該遺伝子は必ずしも上記Ｄ
ＮＡ、即ちヒトＭ−ＣＳＦ前駆体のアミノ酸配列のすべ
てをコードするＤＮＡ配列を有するものである必要はな
く、例えばその部分配列であって、それがヒトＭ−ＣＳ
Ｆの生物活性発現を可能とする限り、それらのＤＮＡも
また本発明遺伝子に包含される。 【００３５】ヒトＭ−ＣＳＦの生物活性発現に、必ずし
も前記式（１）に示す全アミノ酸配列を必要としない事
実は、例えば上記前駆体の一方が、その３７２番目のア
ミノ酸（Ｐro）をＣ端アミノ酸としていること、又は前
記ＡＧＲ−ＯＮ・ＣＳＦが、その３５番目のアミノ酸
（Ｖal）を、Ｎ端アミノ酸としていること、ＡＧＲ−Ｏ
Ｎ・ＣＳＦ製造の際に副産物（マイナー成分）として、
同３３番目のアミノ酸（Ｇlu）又は同３７番目のアミノ
酸（Ｇlu）をそれぞれＮ端アミノ酸とする生物活性のＭ
−ＣＳＦが得られること等からも明白である。更に他の
ヘモポエチン間の一次構造上の類似性の知見から、同２
７番目のアミノ酸（Ａla）をＮ端アミノ酸とするＭ−Ｃ
ＳＦも天然に存在すると考えられる〔J.W.Schrader, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, Vol.83, pp.2458-
2462 (1986) 〕。 【００３６】また、後述する実施例に示す通り、前記式
（１）に示すアミノ酸配列における１７８番目のアミノ
酸（Ｃys）以降のＣ末端側のアミノ酸配列は、ヒトＭ−
ＣＳＦの生物活性発現には必ずしも必要でないことも確
認されている。 【００３７】従って、本発明遺伝子は、式（１）に示さ
れるアミノ酸配列情報に基づいた、生物活性のヒトＭ−
ＣＳＦ分子をコードする新規なＤＮＡ配列を有すること
により特徴づけられる。これには、より具体的には、式
（１）に示す全アミノ酸配列をコードするＤＮＡのほ
か、そのＮ末端側アミノ酸配列の一部、例えばアミノ酸
番号１〜２６、１〜３２、１〜３４及び１〜３６の配列
のいずれか、及び／又はそのＣ末端側アミノ酸配列の一
部、例えばアミノ酸番号１７８以降の配列の全て又は一
部、を欠失する各々のアミノ酸配列をコードする各ＤＮ
Ａ及び之等と実質的に均等なＤＮＡが包含される。 【００３８】かかる本発明遺伝子は、上記情報に基づい
て、例えばホスファイト トリエステル法〔Nature, 31
0, 105 (1984) 〕等の常法に従い、核酸の化学合成によ
り製造することもでき、また第３図に示される３７２
の、又は第５図に示される５５４の、アミノ酸配列から
なるポリペプチドをコードするＤＮＡを原料として、通
常の方法に従い製造することもでき、特に後者の方法は
簡便であり好適である。 【００３９】この３７２又は５５４のアミノ酸配列から
なるポリペプチドをコードするＤＮＡを原料とする方法
において、一部ＤＮＡの化学合成やＤＮＡ鎖の切断、削
除、付加乃至は結合を目的とする酵素処理やＤＮＡの単
離、精製乃至複製、選別等の各種操作乃至手段は、いず
れも常法に従うことができ、本発明遺伝子以外の遺伝子
もしくはＤＮＡ鎖について当該分野でよく知られている
各種方法をいずれも採用することができる。例えば上記
ＤＮＡの単離精製は、アガロースゲル電気泳動法等に従
うことができ、核酸配列のコドンの一部の改変は、サイ
ト−スペシフィック ミュータジェネシス(Site-Specif
ic Mutagenesis) 〔Proc. Natl. Acad.Sci., 81, 5662-
5666 (1984)〕等に従うことができる。尚、上記におい
て所望のアミノ酸に対応する遺伝暗号の選択は、特に限
定されるものではなく、利用する宿主細胞のコドン使用
頻度等を考慮して常法に従い決定できる。 【００４０】また、上記方法に従い得られる本発明遺伝
子のＤＮＡ配列の決定及び確認は、例えばマキサム−ギ
ルバートの化学修飾法〔Maxam-Gilbert, Meth. Enzym.,
65,499-560 (1980) 〕やＭ１３ファージを用いるジデ
オキシヌクレオチド鎖終結法〔Messing, J. and V ieir
a,J., Gene, 19, 269-276 (1982)〕等により行なうこと
ができる。 【００４１】かくして得られる本発明遺伝子の利用によ
れば、遺伝子組換え技術により、ヒトＭ−ＣＳＦを容易
に且つ大量に製造、収得することができる。 【００４２】このヒトＭ−ＣＳＦの製造方法は、上記特
定の本発明遺伝子（ＤＮＡ）を利用することを除いて、
従来公知の一般的な遺伝子組換え技術に従うことができ
る〔Science, 224, 1431 (1984) ；Biochem. Biophys.
Res. Comm., 130, 692 (1985) ；Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA, 80, 5990 (1983) ；ＥＰ特許公開第１８７９
９１号公報、Molecular Cloning, by T.Maniatis et a
l., Cold Spring Harbor Laboratory (1982) 等参
照〕。 【００４３】より詳細には、本発明遺伝子が宿主細胞中
で発現できるような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主
細胞に導入して形質転換し、該形質転換株を培養すれば
よい。 【００４４】ここで宿主細胞としては、真核生物及び原
核生物のいずれをも用いることができる。該真核生物の
細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物
細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Y.
Gluzman, Cell, 23, 175-182(1981)〕やチヤイニーズ・
ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株
〔G.Urlaub and L.A.Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA, 77, 4216-4220 (1980)〕等がよく用いられている
が、之等に限定される訳ではない。脊椎動物細胞の発現
ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流
に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポ
リアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを
使用でき、これは更に必要により複製起点を保有してい
てもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初
期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr〔S.Sabramani,
R.Mulligan and P.Berg, Mol. Cell. Biol., 1, 854-7
64〕等を例示できるが、これに限定されない。 【００４５】また真核微生物としては酵母が一般によく
用いられており、その中でもサッカロミセス属酵母が有
利に利用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクター
としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプ
ロモーターを持つｐＡＭ８２〔A.Miyanohara et al, Pr
oc. Natl. Acad. Sci.,USA., 80, 1-5 (1983)〕等を好
ましく利用できる。 【００４６】原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌
が一般によく用いられている。本発明では例えば該宿主
菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベク
ター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上
流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガ
ーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付
与した発現プラスミドが使用できる。上記宿主菌として
の大腸菌としては、エシエリヒア・コリ（Escherichia
coli）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一
般にｐＢＲ３２２がよく用いられるが、これらに限定さ
れず、公知の各種の菌株及びベクターがいずれも利用で
きる。プロモーターとしては、例えばトリプトフアン・
プロモーター、ＰL プロモーター、lac プロモーター、
lpp プロモーター等を使用することができ、いずれの場
合にも本発明遺伝子を発現させることができる。 【００４７】宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合
を例にあげると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製
起点を保有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であ
り、更に転写プロモーター、転写終結シグナル及びＲＮ
Ａスプライス部位等を備えたものを用いることができ、
例えば後記実施例に示すプラスミドｐｃＤＥを用いる場
合、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター下流に位置する制
限酵素ＥcoＲＩ部位に、本発明遺伝子を連結することに
より、目的とする発現プラスミドを得ることができる。 【００４８】かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿
主細胞への導入及びこれによる形質転換の方法として
は、一般に用いられている方法が採用でき、例えば上記
プラスミドｐｃＤＥに目的遺伝子が挿入された発現プラ
スミドは、ＤＥＡＥ−デキストラン法やリン酸カルシウ
ム−ＤＮＡ共沈澱法等により、ＣＯＳ細胞に取込ませる
ことができ、かくして所望の形質転換細胞を容易に得る
ことができる。 【００４９】かくして得られる所望の形質転換体は、常
法に従い培養することができ、該培養により生物活性の
ヒトＭ−ＣＳＦが生産、蓄積される。該培養に用いられ
る培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される
各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＣＯＳ細胞であ
れば、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ダルベッコの修正イー
グル最小必須培地（Dulbecco's modified Eagle's MEM
）等の培地に必要に応じ牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血
清成分を添加したものを使用できる。 【００５０】上記により、形質転換体の細胞内又は細胞
外に生産されるＭ−ＣＳＦは、該Ｍ−ＣＳＦの物理的性
質、化学的性質等を利用した各種の分離操作（「生化学
データーブックII」、１１７５〜１２５９頁、第１版第
１刷、１９８０年６月２３日、株式会社東京化学同人発
行参照）により、それらより分離、精製することができ
る。該方法としては、具体的には例えば通常の蛋白沈澱
剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィ
ー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種
液体クロマトグラフィー、透析法、之等の組合せ等を例
示できる。 【００５１】特に好ましい分離方法においては、まず培
養上清より予め目的とする物質を部分精製する。この部
分精製は、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、
リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理及び／又は透
析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外濾過処理等に
より行なわれる。之等の各処理の操作及び条件は、通常
のこの種方法のそれらと同様のものとすればよい。 【００５２】次いで上記で得られた粗精製物を、吸着ク
ロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、
ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマ
トグラフィー等に付すことにより、又は之等各操作の組
合せにより、目的物質の活性が認められる画分を収得
し、かくして目的物質を均質な物質として単離すること
ができる。 【００５３】上記吸着クロマトグラフィーは、例えばフ
エニル−セファロース、オクチル−セファロース等を担
体として実施できる。 【００５４】アフィニティクロマトグラフィーは、場合
により例えばＣonＡ−セファロース、レンチルレクチン
−セファロース（フアルマシア社製）等の担体を利用し
たクロマトグラフィーにより実施することもできる。 【００５５】ゲル濾過は、例えばデキストランゲル、ポ
リアクリルアミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリル
アミド−アガロースゲル、セルロース等を素材としたゲ
ル等を用いて実施できる。上記ゲル濾過剤の具体例とし
ては、セフアデックスＧタイプ、セフアロースタイプ、
セフアクリルタイプ（以上、フアルマシア社製）、セル
ロファイン（チッソ社製）、バイオゲルＰタイプ、同Ａ
タイプ（バイオラド社製）、ウルトロゲルＡｃＡ（ＬＫ
Ｂ社製）、ＴＳＫゲルＳＷタイプ（東洋曹達社製）等の
市販品を例示できる。 【００５６】イオン交換クロマトグラフィーは、例えば
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等を交換基とする陰
イオン交換体を利用したクロマトグラフィーにより実施
できる。 【００５７】逆相クロマトグラフィーは、例えばＣ1 、
Ｃ3 、Ｃ4 等のアルキル基、シアノプロピル基、フエニ
ル基等の官能基がシリカゲル等の基体に結合された担体
を用いて実施できる。より具体的には例えばＣ4 ハイポ
アー逆相ＨＰＬＣカラム（ＲＰ−３０４、バイオラド社
製）を用いて、移動相としてアセトニトリル、トリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）、水等及び之等の混合溶媒を用いて
実施できる。 【００５８】上記方法により、容易に高収率、高純度で
所望の本発明ヒトＭ−ＣＳＦを工業的規模で製造でき
る。 【００５９】上記で得られるＭ−ＣＳＦは、これを医薬
として用いるに当り、その有効量を、薬理的に許容され
る通常の無毒性担体と共に含有する薬理組成物の形態に
調製され該形態に応じた各種投与経路で投与される。そ
の製剤形態としては、液状形態例えば溶液、懸濁液、乳
濁液等が通常採用され、之等は一般に経口、静脈内、皮
下、皮内、筋肉内投与されるが、特に之等の形態及び投
与経路に限定されず、上記Ｍ−ＣＳＦは、他の通常採用
される経口、非経口投与等に適した各種の製剤形態に調
製することもでき、また使用前に適当な担体の添加によ
り液状となし得る乾燥品とすることもできる。各種形態
の製剤の投与量は、所望の薬理効果、疾病の種類、患者
の年齢、性別、疾患の程度等に応じて適宜決定され、特
に限定はないが、通常有効成分とするＭ−ＣＳＦを蛋白
量として約０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ／日となる量で１
日に１回乃至数回に分けて投与すればよい。 【００６０】 【実施例】以下、本発明遺伝子の製造及びその利用によ
る本発明ヒトＭ−ＣＳＦの製造、その特徴等を、実施例
として挙げて、更に詳述する。 【００６１】尚、各例で得られる試料のＣＳＦ活性は以
下の方法により測定されるものとする。 【００６２】〈ＣＳＦの活性測定法〉牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）２０ｍｌ、α−培地３０ｍｌ及び２倍濃度α−培地
２０ｍｌを混和して得られる溶液を３７℃にて保温し、
その２３．３ｍｌを予め５０℃に保温した１％寒天（デ
ィフコ社製）溶液１０ｍｌと混合して３７℃に保温す
る。 【００６３】一方ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス大腿骨より採取
した骨髄細胞（ＢＭＣ）を、ハンクス液で２回洗浄後、
α−培地にて細胞濃度が１０7 個／ｍｌとなるように調
製し、その１ｍｌを上記３７℃に保温してある寒天培地
に加え、よく混和した後、３７℃に保温し、次いでその
０．５ｍｌを、予め５０μｌの供試試料を入れたウェル
（ティッシュカルチャークラスター１２、コスター社
製）に加えて手早く混和して室温に放置する。各ウェル
の寒天が固化するのを待って炭酸ガスインキュベーター
に移し、更に３７℃で７日間培養する。 【００６４】かくして生じたコロニー数を実体顕微鏡を
用いて計測し、ＣＳＦ活性の指標とする。尚上記で生じ
るコロニーは、形態学的及び酵素化学的観察の結果、い
ずれもマクロファージコロニーであつた。 【００６５】 【実施例１】本発明遺伝子の製造 イ） ＡＧＲ−ＯＮ細胞の培養 ヒトＴ細胞培養株化細胞ＡＧＲ−ＯＮ（ＡＴＣＣ受託Ｎ
o.ＣＲＬ−８１９９）を、１０％新生子牛血清（ＮＣ
Ｓ）、２０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン
−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１００
μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００単位／ｍｌペニ
シリンＧ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、５×１０-5
Ｍ ２−メルカプトエタノール及び１ｍＭグルタミンを
含むＲＰＭＩ−１６４０培地〔フローラボラトリー社
製〕にて、約１０5 細胞／ｍｌの細胞濃度に調製した。
その１ｌを、２００ｍｌ容ティッシュ−カルチャ−フラ
スコ〔コーニング社製〕５本にて、３７℃で７２時間培
養した。 【００６６】ロ） ｍＲＮＡの抽出 上記イ）で得たＡＧＲ−ＯＮ細胞約５×１０8 細胞を、
４Ｍ−グアニジンチオシアネート溶液〔４Ｍ−グアニジ
ンイソチオシアネート、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ザルコシル（Ｓar
kosyl ）、１４０ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕５
０ｍｌに溶解後、６０℃に加温しながら、Ｇ１８Ｇ注射
針をつけた５０ｍｌ注射筒を用いてＤＮＡをせん断し
た。 【００６７】この溶液に６０℃に加温した等量のフェノ
ール、１／２容量の１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．２）−１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）−１
ｍＭＥＤＴＡ溶液及び等量のクロロホルム−イソアミル
アルコール（２４：１）混合液を加え、６０℃の水浴中
で１０分間振盪した後、４℃にて３０００rpm で１５分
間遠心分離した。水層を取り、フェノール−クロロホル
ム抽出を２回、更にクロロホルム抽出を２回行なった
後、２容の冷エタノールを加えて、−２０℃で６０分間
保持した。４℃にて３０００rpm で２０分間遠心し、沈
澱したＲＮＡペレットを、１００ｍＭトリス・ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）−５０ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ−０．２％ＳＤＳ溶液５０ｍｌに溶解後、プロティ
ナーゼＫ〔proteinaseＫ、メルク社製〕を２００μｇ／
ｍｌの濃度で加え、３７℃にて６０分間反応させた。６
０℃にて、フェノール−クロロホルム抽出を２回、更に
クロロホルム抽出を２回行なった後、１／１０容の３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２容の冷エタノール
を加えて、−７０℃にて６０分間放置した。４℃にて３
０００rpm で２０分間遠心し、沈澱したＲＮＡペレット
を冷７０％エタノールで洗浄後、ＴＥ溶液〔１０ｍＭト
リス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ〕に
溶解させた。 【００６８】かくしてＡＧＲ−ＯＮ細胞５×１０8 細胞
から全ＲＮＡ約５ｍｇを得た。 【００６９】次いで、上記で得られた全ＲＮＡからｍＲ
ＮＡを取得するために、オリゴ（ｄＴ）−セルロース
〔コラボレイティブリサーチ社製〕を用いて、カラムク
ロマトグラフィーを行なった。ｍＲＮＡの吸着は、１０
ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
−０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いて行ない、カラムを同
溶液及び１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ−０．１ＭＮａＣｌ溶液にて洗浄後、１０
ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍＭＥＤＴＡを
用いてＲＮＡを溶出させた。 【００７０】上記により、ｍＲＮＡ約１１０μｇを得
た。 【００７１】ハ） ｃＤＮＡライブラリーの作製 上記ロ）で得たｍＲＮＡ５μｇから、ｃＤＮＡを、ｃＤ
ＮＡ合成システム〔アマシャム社製〕を利用して合成し
た。 【００７２】得られたｃＤＮＡ約０．６μｇを、減圧乾
燥した後、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１
０ｍＭ ＥＤＴＡ−５０ｍＭ ＤＴＴ−４０μＭ Ｓ−
アデノシル−Ｌ−メチオニン溶液２０μｌに溶解し、Ｅ
coＲＩメチラーゼ〔ニューイングランドバイオラブ社
製〕１６単位を加え、３７℃にて１５分間反応させた。 【００７３】この反応液を７０℃で１０分間加熱し、反
応を停止させた後、フェノール−クロロホルム抽出を行
ない、抽出液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．２）及び２．５容のエタノールを加え、−７０℃に
て１５分間放置した。４℃にて１５０００rpm で１５分
間遠心し、沈澱させたＤＮＡペレットを、５０ｍＭトリ
ス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 −１
０ｍＭ ＤＴＴ−１ｍＭ ＡＴＰ−１００μｇ／ｍｌＥ
coＲＩリンカー〔宝酒造社製、５′−ＧＧＡＡＴＴＣＣ
−３′〕溶液１０μｌに溶解後、これにＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ〔宝酒造社製〕３５０単位を加え、１４℃にて１６
時間反応させた。 【００７４】得られた反応液を７０℃で１０分間加熱し
て反応を停止させた後、１００ｍＭＮａＣｌ−５０ｍＭ
トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−７ｍＭ ＭｇＣｌ2 −
１０ｍＭ ＤＴＴ溶液１６μｌと、制限酵素ＥcoＲＩ
〔宝酒造社製〕４０単位とを加え、３７℃にて３時間消
化させた。 【００７５】反応液に０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）０．８μｌを加え、反応を停止させた後、バイオゲ
ルＡ５０ｍ〔バイオ−ラド社製〕カラムクロマトグラフ
ィーにて、余剰のＥcoＲＩリンカーを除去した。ｃＤＮ
Ａ画分に、制限酵素ＥcoＲＩで消化後、アルカリフォス
ファターゼにて、５′−リン酸基を除去したλｇｔ１１
ＤＮＡ〔プロトクローンＧＴ（Ｐrotoclone ＧＴ）、プ
ロメガバイオテク社製〕１μｇ、１／１０容積の３Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２．５容積のエタノー
ルを加え、−７０℃にて３０分間放置した。４℃にて１
５０００rpm で１５分間遠心し、沈澱させたＤＮＡペレ
ットを７０％エタノールで洗浄後、減圧乾燥し、水７μ
ｌに溶解させた。 【００７６】次に、５００ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）−１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 溶液２μｌを加え、
４２℃にて１５分間保温した後、室温に戻し、１００ｍ
Ｍ ＤＴＴ１μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ１μｌ及びＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１７５単位を加え、１４℃で１６時間保温
した。 【００７７】次に、この反応液１０μｌにλファージパ
ッケージングエクストラクト〔Packagene system 、プ
ロメガバイオテク社製〕を加え、２２℃にて２時間保温
することにより、インビトロでリコンビナントファージ
ＤＮＡのパッケージングを行なった。この溶液にファー
ジ希釈緩衝液〔１００ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭトリス
・ＨＣｌ（ｐＨ７．９）−１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ〕０．５ｍｌ及びクロロホルム２５μｌを加え４℃
で保存した。 【００７８】ニ） ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ング ニ）-1. 合成プローブの作製 ＡＧＲ−ＯＮ培養上清から抽出単離されたＡＧＲ−ＯＮ
・ＣＳＦのアミノ酸配列（Ｎ末端より２７残基）の情報
に基づいて、合成プローブとして、下記塩基配列を用い
た。 【００７９】 Ｖal −Ｓer −Ｇlu −Ｔyr −Ｃys − Ｓer− Ｈis 5′ＧＴＧ ＴＣＧ ＧＡＧ ＴＡＣ ＴＧＴ ＡＧＣ ＣＡＣ 3′ 3′ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＴＣ ＡＴＧ ＡＣＡ ＴＣＧ ＧＴＧ 5′ 上記式に示した塩基配列に対する相補的な塩基配列（最
下段に示す）を、Ｍ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを有
するリコンビナントファージの選出のためのプローブと
して利用するため、以下の方法により合成した。 【００８０】即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルメチルホスホロ
アミダイド誘導体を、縮合ユニツトとして用いた固相ホ
スフアイトトリエステル法〔ネーチヤー(Nature), 310,
105(1984) 〕にて、自動合成機〔３８０Ａ ＤＮＡシ
ンセサイザー，アプライドバイオシステムズ社製〕を用
いて、目的とする完全保護ＤＮＡを合成した。続いて該
完全保護ＤＮＡを２８％アンモニア水で５５℃で１０時
間処理することにより５′末端のＯＨ基に結合している
保護基としてのＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）基以外
の保護基（Ａ、Ｇ、Ｃのアミノ基のアシル基をさす）を
脱保護させ、部分保護ＤＮＡ（ＤＭＴｒ体とよぶ）を得
た。次いでこのＤＭＴｒ体をＯＤＳ（山村化学研究所社
製）を担体とする逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）により精製後、８０％酢酸を用いて室温で２０
分間処理して、粗オリゴヌクレオチドを得た。これをＯ
ＤＳを担体とする逆相ＨＰＬＣにより更に精製して、目
的とするオリゴヌクレオチドを得た。 【００８１】上記で得たＤＮＡ０．８μｇを、１００μ
ｌの反応液〔５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、２００μＣｉ〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰ）中で、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ〔宝酒造〕１８単位と、３
７℃にて１時間反応させ、ＤＮＡの５′末端を32Ｐで標
識した。標識されたＤＮＡと未反応の〔γ−32Ｐ〕ＡＴ
Ｐを分別するために、バイオゲルＰ−３０〔バイオ−ラ
ド社製〕によるゲル濾過を行なつた。標識ＤＮＡ画分を
プールし−２０℃で保存した。 【００８２】得られたプローブの比放射活性は、１０8
cpm ／μｇＤＮＡ以上であった。 【００８３】ニ）-2. プラークハイブリダイゼーション エシェリヒア・コリＹ１０９０株を、５０μｇ／ｍｌア
ンピシリン及び０．２％マルトースを含むＬＢ培地〔バ
クトトリプトン１０ｇ、バクトイースト抽出物５ｇ及び
ＮａＣｌ５ｇ／ｌ〕４０ｍｌに植菌し、３００ｍｌフラ
スコにて３７℃で一夜振盪培養した。４℃にて３０００
rpm で１５分間遠心して菌体を回収し、菌体のペレット
を２０ｍｌのＳＭ培地〔１００ｍＭ ＮａＣｌ−５０ｍ
Ｍトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１０ｍＭ ＭｇＳＯ
4 ・７Ｈ2 Ｏ−０．０１％ゼラチン〕に懸濁させ、４℃
で保存した。 【００８４】次に、上記菌液０．３ｍｌに、前記ハ）で
得られたリコンビナントファージ粒子液をＳＭ培地にて
３．５×１０5 pfu （プラークフォーミングユニット）
／ｍｌに希釈したもの０．１ｍｌを加え、３７℃にて１
５分間保温した。続いて、予め４７℃に保温しておいた
ＬＢ軟寒天培地〔バクトトリプトン１０ｇ、バクトイー
スト抽出物５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、アガロース７ｇ／ｌ〕
７．５ｍｌを加えて混和した後、直径１５ｃｍのシャー
レに作ったＬＢ寒天プレート〔バクトトリプトン１０
ｇ、バクトイースト抽出物５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、バクト
寒天１５ｇ／ｌ〕に重層し、４２℃にて一夜培養した。
尚、同様の操作を合計２０枚のシャーレで実施した。 【００８５】プラークの出現した寒天プレート上に、直
径１３２ｍｍのナイロンフィルター〔ＢＮＲＧ１３２、
ポール社製〕を載せることによって、レプリカフィルタ
ーを作製した。寒天プレートはこれをマスタープレート
として４℃に保存した。 【００８６】フィルターを、０．５Ｍ ＮａＯＨ−１．
５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）−１．５Ｍ ＮａＣｌ及び０．３Ｍ ＮａＣｌ−
０．０２Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 （ｐＨ７．４）−０．００
２Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）にて順次処理し、風乾
後、真空下に８０℃で１時間ベーキングを行なった。 【００８７】ベーキング済みのフィルターを、０．７５
Ｍ ＮａＣｌ−０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム−１ｍ
ｇ／ｍｌフィコール−１ｍｇ／ｍｌポリビニルピロリド
ン−１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ−１０ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ６．５）−０．２％ＳＤＳ−０．１ｍｇ／ｍｌサ
ーモンスパーム（Ｓalmon Ｓperm）ＤＮＡ溶液５０ｍｌ
中で軽く振盪しながら、４２℃にて６時間保温した。次
にフィルターを１０6 cpm ／ｍｌの濃度にプローブを加
えた同液に移し、４２℃にて２０時間軽く振盪しなが
ら、ハイブリダイゼーシヨンを行なった。 【００８８】ハイブリダイゼーシヨンの終わったフィル
ターを取り出し、０．９Ｍ ＮａＣｌ−０．０９Ｍクエ
ン酸ナトリウムにて室温で３回洗浄し、その後、５６℃
で同溶液にて５分間洗浄した。 【００８９】フィルターを風乾後、増感紙を用いてＸ線
フイルム〔ＸＲ５、コダック社製〕に、−７０℃にて２
日間オートラジオグラフィーを行なった。 【００９０】フイルムを現像後、シグナル領域に符合す
るプラークをマスタープレートよりかき取り、上記の方
法を繰返してポジティブシグナルを有するプラークの純
化を行ない、最終的に、代表的なポジティブクローンλ
ｃＭ５及びλｃＭ１１を単離した。 【００９１】ホ） クローンの構造解析 λｃＭ５のｃＤＮＡの制限酵素地図を作製した。その結
果を第１図に示す。 【００９２】第１図より、ｃＤＮＡは全長約２．５キロ
ベース（kb）であり、その中にはＢstＥＩＩ〔ニューイ
ングランドバイオラブ社〕、ＮcoＩ〔宝酒造社〕、Ｓma
Ｉ〔宝酒造社〕、ＫpnＩ〔宝酒造社〕、ＥcoＲＩ〔宝酒
造社〕及びＮdeＩ〔ニューイングランドバイオラブ社〕
により切断される個所がそれぞれ１個所、またＳcaＩ
〔宝酒造社〕、ＳtuＩ〔宝酒造社〕及びＢamＨＩ〔宝酒
造社〕により切断される個所がそれぞれ２個所ずつ存在
することが確認された。 【００９３】次に、上記ｃＤＮＡの塩基配列をマキサム
−ギルバートの化学修飾法及びＭ１３フアージを用いる
ジデオキシヌクレオチド鎖終結法にて決定した。その結
果を、第２図（第２図−１〜第２図−４）に示す。 【００９４】第２図より、合成プローブと相補的な領域
が、５′末端より２２７番目〜２４７番目に存在（図に
下線を付して示す）した。 【００９５】また、λｃＭ５のｃＤＮＡ中の最長のリー
デイングフレーム（reading frame）を検索したとこ
ろ、これは５′末端より１２５番目から１２４０番目の
領域にあり、そのコドンのフレームによる２２７番目〜
３０７番目の塩基配列に対応するアミノ酸配列は、ＡＧ
Ｒ−ＯＮ・ＣＳＦのＮ末端２７アミノ酸と完全に同一で
あった。このことは、λｃＭ５のｃＤＮＡがＭ−ＣＳＦ
前駆体蛋白質をコードするｃＤＮＡであることを示して
いる。 【００９６】以上の結果より、決定されたλｃＭ５のコ
ードするＭ−ＣＳＦ前駆体蛋白質の蛋白一次構造を第３
図（第３図−１〜第３図−２）に示す。 【００９７】また上記と同様にして決定されたλｃＭ１
１ｃＤＮＡの塩基配列を第４図（第４図−１〜第４図−
４）に、そのコードするＭ−ＣＳＦ前駆体蛋白質の蛋白
一次構造を第５図（第５図−１〜第５図−３）にそれぞ
れ示す。 【００９８】 【実施例２】 ＣＯＳ細胞における組換えＭ−ＣＳＦ（ｒ−ＭＣＳＦ）
の製造 この例に利用したＣＯＳ−１細胞とは、増殖開始点（Ｏ
ri）欠損のＳＶ４０ＤＮＡで、サルの腎細胞ＣＶ１をト
ランスフォームさせることによって、ＳＶ４０初期遺伝
子を発現し、Ｔ抗原陽性となった細胞である〔セル(Cel
l), 23, 175-182 (1981)参照〕。 【００９９】イ） ＣＯＳ細胞発現ベクターｐｃＤＥの
作製 まず、プラスミドｐｃＤＶ１〔オカヤマら(H.Okayama,
P.Berg, Mol.Cell.Biol., 3, 280-289 (1983) 〕を、制
限酵素ＫｐｎＩで切断し、次いで５′末端及び３′末端
の突出部分をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ〔ＢＲＬ社〕で削
り平滑末端とした。 【０１００】一方、ＥcoＲＩリンカー（５′−ＧＧＡＡ
ＴＴＣＣ−３′）〔宝酒造社〕の５′末端を、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、これを先の平
滑末端としたＤＮＡ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結した。連結物を制限酵素ＥcoＲＩで切断し、更に
制限酵素Ｈind ＩＩＩで切断し、得られた反応物をアガ
ロースゲル電気泳動に付して、２５９０ベースペアー
（bp）のＥcoＲＩ−Ｈind ＩＩＩＤＮＡ断片を単離精製
した。 【０１０１】また他方、プラスミドｐＬ１〔オカヤマら
(H.Okayama, P.Berg, Mol.Cell.Biol., 3, 280-289 (19
83) 〕を、制限酵素ＰstＩ〔宝酒造社〕で切断後、５′
末端及び３′末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平
滑末端とし、このＤＮＡ断片に、上記と同様にしてＥco
ＲＩリンカーを連結させ、得られるＤＮＡ断片を制限酵
素Ｈind ＩＩＩにて切断し、反応物をアガロースゲル電
気泳動に付して、５８０bpのＥcoＲＩ−Ｈind ＩＩＩＤ
ＮＡ断片を単離精製した。 【０１０２】得られたＤＮＡ断片と先に調製したＥcoＲ
Ｉ−Ｈind ＩＩＩＤＮＡ断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結させて、所望のプラスミドｐｃＤＥを得
た。 【０１０３】以上の概略を第６図に示す。 【０１０４】ロ） Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ
・ＣＳＦの作製 λｃＭ５ＤＮＡを、制限酵素ＥcoＲＩで部分消化させ、
得られる反応物をアガロースゲル電気泳動に付し、ｃＤ
ＮＡ部分（約２．５kb）をＥcoＲＩ部分消化断片として
単離精製した。 【０１０５】上記イ）で得られたＣＯＳ細胞発現ベクタ
ーｐｃＤＥを制限酵素ＥcoＲＩで切断し、これを上記で
調製したｃＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結させて、所望のプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦを得た。 【０１０６】かくして得られたプラスミドを、エシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１株にトランスフォームさせて、目
的のトランスフォーマントを、アルカリ溶菌法〔マニア
ティスら（T.Maniatis et al. Molecular Cloning, pp9
0, Cold Spring Harvor Laboratory (1982) 〕によっ
て、得られるプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選
択した。 【０１０７】以上の概略を第７図に示す。 【０１０８】ハ） ｒ−ＭＣＳＦの製造 上記ロ）で得たｐｃＤＭ・ＣＳＦを、ＣＯＳ−１細胞
に、ＤＥＡＥ−デキストラン法〔Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, Vol.81, p1070 (1984)〕にてトランスフェクト
し、該細胞におけるｒ−ＭＣＳＦの生産を以下の通り試
験した。 【０１０９】即ち、まずＣＯＳ−１細胞を、１０％牛胎
児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で、約
２．５×１０5 細胞／ｍｌの細胞濃度に調製し、これを
ティッシュカルチャークラスター６〔コースター社製〕
に、１ウェル当り２ｍｌとなる量で入れて、３７℃で一
夜、炭酸ガスインキュベーターにて培養した。 【０１１０】次いで培地を除去し、ＲＰＭＩ−１６４０
にて細胞を２回洗浄後、上記ロ）で調製したｐｃＤＭ・
ＣＳＦ１０μｇを含むＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌ
〔５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）及び４００μ
ｇ／ｍｌＤＥＡＥ・デキストラン（ファルマシァ社製）
を含む〕を加え、炭酸ガスインキュベーター内に４時間
放置した。更に培地を除去した後、ＲＰＭＩ−１６４０
にて細胞を２回洗浄し、これに１５０μＭクロロキン
〔シグマ社製〕を含むＲＰＭＩ−１６４０培地３ｍｌを
加え、３時間培養した。次に培地を除去し、細胞をＲＰ
ＭＩ−１６４０にて洗浄後、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地にて、３７℃で７２時間、炭酸ガスイ
ンキュベーター内で培養した。 【０１１１】かくして得られた細胞培養物より培養上清
及びその抽出物を回収して、之等につき、それぞれの希
釈倍率でのＣＳＦ活性を測定した。 【０１１２】得られた結果を下記表１に示す。尚、表１
には、コントロールとしてｐｃＤＭ・ＣＳＦに代えて、
ｐｃＤＥを用いて上記と同一操作を行なった結果を併記
する。また各活性測定試験は、同一試料につき各２回行
なった。 【０１１３】 【表１】 【０１１４】尚、表１における数値は、プレート当りの
コロニー数（平均値）を示す。以降のＣＳＦ活性を示す
表においても同様とする。 【０１１５】ニ） Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ
・ＣＳＦ−１８５の作製 上記ロ）で得たプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦを利用し
て、サイト−スペシフィック ミュータジェネシス（Si
te-Specific Mutagenesis ）〔Proc. Natl. Acad. Sc
i., 81, 5662-5666 (1984)〕の方法に従って、第３図に
おけるアミノ酸番号１８６のアミノ酸（Ｌys）をコード
するコドン（ＡＡＧ）を、終止コドン（ＴＡＧ）に置換
して、第３図におけるアミノ酸番号１８５のアミノ酸
（Ｔhr）をＣ端アミノ酸とする所望のＭ−ＣＳＦ発現プ
ラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ−１８５を得た。 【０１１６】その詳細は次の通りである。 【０１１７】即ち、まずプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦよ
りＥcoＲＩ−ＥcoＲＩＤＮＡ断片（大きさ１．８kb）を
切り出し、これをＭ１３ｍｐ１１ファージ（ＲＦ）のＥ
coＲＩとＥcoＲＩの制限酵素サイトにクローニングし、
これから一本鎖（ss）ＤＮＡ（Ｍ１３−ＣＳＦ）を得、
これをミュータジェネシスの鋳型とした。 【０１１８】一方、合成オリゴヌクレオチド〔５′−Ｇ
ＴＧＧＴＧＡＣＣＴＡＧＣＣＴＧＡＴＴ−３′（プライ
マー）〕を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化
した後、上記ssＤＮＡ（Ｍ１３−ＣＳＦ）とハイブリダ
イズし、アニーリング後、ｄＮＴＰｓの存在下に、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）及びＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで各々処理して、１５℃で１８時間インキュベート
した。 【０１１９】得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント
細胞にトランスフォームし、生じたコロニーの内５０コ
ロニーを、寒天プレート上に植菌し、３７℃で１８時間
培養した。生育したコロニーを含むフィルターを通常の
方法によりアルカリ変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベ
ーキング処理した。このフィルターをプレハイブリダイ
ズした後、このものと、上記プライマーの５′末端を32
Ｐ−ｒ−ＡＴＰでラベルした32Ｐ−プローベとを、室温
でハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたフィル
ターを、６×ssc (saline sodium citrate）で、室温で
１０分間、次いで５６℃で４分間各々洗浄し、乾燥させ
た後、−７０℃で１８時間オートラジオグラフィーを行
なった。 【０１２０】変異したクローンの内から、Ｍ１３−ＣＳ
Ｆ−１８５を選び、これをＪＭ１０５に感染させて培養
して、ssＤＮＡ及びＲＦ ＤＮＡを調製した。 【０１２１】上記で得られたssＤＮＡのＭ１３ジデオキ
シヌクレオチド鎖終結法により、目的とする遺伝子の変
異を確認した。 【０１２２】また上記ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ Ｄ
ＮＡよりＥcoＲＩ−ＥcoＲＩ断片を調製し、これを上記
ロ）と同様にして発現プラスミドに組込んで、所望のプ
ラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ−１８５を得た。 【０１２３】このプラスミドを用いて、上記ハ）と同様
にして、ＣＯＳ−１細胞でｒ−ＭＣＳＦを発現させた。
その結果を下記表２に示す。 【０１２４】 【表２】 【０１２５】ホ） Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ
・ＣＳＦ−１７７の作製 プライマーとして５′−ＧＣＴＧＡＡＴＧＡＴＣＣＡＧ
ＣＣＡＡ−３′を用いて、上記ニ）と同様にして、第３
図におけるアミノ酸番号１７８のアミノ酸（Ｃys）をコ
ードするコドン（ＴＧＣ）を終止コドン（ＴＧＡ）に置
換して、第３図におけるアミノ酸番号１７７のアミノ酸
（Ｇlu）をＣ端アミノ酸とする所望のＭ−ＣＳＦ発現プ
ラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ−１７７を得た。 【０１２６】このプラスミドを用いて、上記ハ）と同様
にして、ＣＯＳ−１細胞でｒ−ＭＣＳＦを発現させた結
果を同様にして下記表３に示す。 【０１２７】 【表３】 【０１２８】上記表２及び表３に示す結果より、本発明
遺伝子を保有するプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ−１８５
及び同ｐｃＤＭ・ＣＳＦ−１７７の利用によれば、それ
ぞれＭ−ＣＳＦの生物活性を示す所望のｒ−ＭＣＳＦを
発現できることが判る。 【０１２９】このことから、少なくとも第３図に示すア
ミノ酸配列におけるアミノ酸番号１７８以降のＣ端側の
アミノ酸配列は、目的とする生物活性を有するＭ−ＣＳ
Ｆ分子の発現には、実質的に影響を及ぼさないことが明
らかである。 【０１３０】ヘ） 上記ロ）において、λｃＭ５ｃＤＮ
Ａの代わりにλｃＭ１１ｃＤＮＡを用いて、プラスミド
ｐｃＤＭ・ＣＳＦ１１を得た。該プラスミドを用いて、
上記ハ）に従ってｒ−ＭＣＳＦを製造し、略同様の結果
を得た。 【０１３１】即ち、λｃＭ１１ＤＮＡを、制限酵素Ｅco
ＲＩで部分消化させ、得られる反応物をアガロースゲル
電気泳動に付し、ｃＤＮＡ部分（約２．５kb) をＥcoＲ
Ｉ部分消化断片として単離精製した。 【０１３２】前記イ）で得られたＣＯＳ細胞発現ベクタ
ーｐｃＤＥを制限酵素ＥcoＲＩで切断し、これを上記で
調製したｃＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結させて、所望のプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ１１を得
た。 【０１３３】かくして得られたプラスミドを、エシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１株にトランスフォームさせて、目
的のトランスフォーマントを、アルカリ溶菌法〔マニア
ティスら（T.Maniatis et al. Molecular Cloning, pp9
0, Cold Spring Harvor Laboratory (1982) 〕によっ
て、得られるプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選
択した。 【０１３４】また、上記λｃＭ１１ＤＮＡのｃＤＮＡ
（ＥcoＲＩ部分消化断片）を、クローニングベクターｐ
ＵＣ１９ＤＮＡ（宝酒造）のＥcoＲＩクローニング部位
に挿入して、プラスミドｐＵＣＭＣＳＦ・１１を得た。
該プラスミドをエシェリヒア・コリＨＢ１０１株にトラ
ンスフォームさせた形質転換体は、Ｅscherichia coli
ＨＢ１０１／ｐＵＣＭＣＳＦ・１１なる名称で、１９８
７年７月１６日に工業技術院微生物工業研究所に微工研
条寄第１４０９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４０９）として
寄託されている。 【０１３５】ト） プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ１１を
制限酵素ＥcoＲＩ及びＢstＥＩＩで消化し、約６７０bp
のＥcoＲＩ−ＢstＥＩＩＤＮＡ断片を単離精製した。 【０１３６】このＤＮＡ断片のＢstＥＩＩ切断側に、
５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにてリン酸化
した下記合成ＤＮＡリンカー； を連結して得られたＤＮＡ断片と、前記したプラスミド
ｐｃＤＥのＥcoＲＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼによ
り連結して、所望のプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ１１−
１８５を得た。該プラスミドは、上記合成リンカー部位
に翻訳終止コドンＴＧＡＴＡＡをもち、従ってプラスミ
ドｐｃＤＭ・ＣＳＦ１１がコードする第５図に示される
ポリペプチドにおいて、その１８５番目のアミノ酸（Ｔ
hr）をＣ端アミノ酸とするＭ−ＣＳＦをコードする。 【０１３７】以上の概略を第８図に示す。 【０１３８】該プラスミドを用いて、上記ハ）と同様に
して発現させた結果を下記表４に示す。 【０１３９】 【表４】 【０１４０】チ） 上記ト）で得たプラスミドｐｃＤＭ
・ＣＳＦ１１−１８５を用い、上記ホ）に従って第５図
におけるアミノ酸番号１７８のアミノ酸（Ｃys）をコー
ドするコドン（ＴＧＣ）を終止コドン（ＴＧＡ）に置換
して、第５図における１７７番目のアミノ酸（Ｇlu）を
Ｃ端アミノ酸とする所望のＭ−ＣＳＦ発現プラスミドｐ
ｃＤＭ・ＣＳＦ１１−１７７を得た。該プラスミドを用
いて上記ハ）と同様にして発現させた結果を下記表５に
示す。 【０１４１】 【表５】 【０１４２】リ） プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ１１−
１８５ ＤＮＡを、ＥcoＲＩ及びＢamＨＩで消化してＥ
coＲＩ−ＢamＨＩ ＤＮＡ断片（約６８０bp）を単離精
製し、これを分泌型発現ベクターｐＩＮ−ＩＩＩ−Ｏｍ
ｐＡ３〔EMBO J., 3, 2437〜2442 (1984)〕のＥcoＲ
Ｉ、ＢamＨＩクローニングサイトに挿入して、プラスミ
ドｐＩＮ−ＩＩＩ−ＯｍｐＡ３−ＭＣＳＦ１１−１８５
を得た。 【０１４３】該プラスミドＤＮＡをＸbaＩ及びＢamＨＩ
で消化してＸbaＩ−ＢamＨＩ ＤＮＡ断片（約７７０b
p）を単離精製し、これを一本鎖ＤＮＡ調製用のクロー
ニングベクターｐＵＣ１１８ＤＮＡ〔宝酒造〕のＸba
Ｉ、ＢamＨＩクローニングサイトに挿入して、プラスミ
ドｐＵＣ１１８−ＯｍｐＡ３−ＭＣＳＦ１１−１８５を
得た。 【０１４４】該プラスミドを用い、前記サイト スペシ
フィック ミュータジェネシスの方法に従い、ＯｍｐＡ
シグナルペプチドのＣ末端アミノ酸（Ａla）をコードす
るコドン（ＧＣＣ）に、第５図に示すポリペプチドの３
５番目のアミノ酸（Ｖal）をコードするコドン（ＧＴ
Ｇ）が連結して位置するように改変して、プラスミドｐ
ＵＣ１１８−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５１を得
た。 【０１４５】即ち、プラスミドｐＵＣ１１８−ＯｍｐＡ
３−ＭＣＳＦ１１−１８５ ＤＮＡにてトランスフォー
ムした大腸菌ＪＭ１０５に、ヘルパーファージＫ０７
〔宝酒造〕を感染させ、３７℃で１４時間振盪培養し、
一本鎖（ss）ｐＵＣ１１８−ＯｍｐＡ３−ＭＣＳＦ１１
−１８５ＤＮＡを得、これをミュータジェネシスの鋳型
として用い、またプライマーとして５′−ＴＡＣＣＧＴ
ＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＧＴＧＴＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴ
ＡＧＣ−３′を用いて、上記ニ）と同様にして所望のプ
ラスミドｐＵＣ１１８−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ
１５１を得た。 【０１４６】該プラスミドＤＮＡをＸbaＩ及びＢamＨＩ
で消化してＸbaＩ−ＢamＨＩ ＤＮＡ断片（約５４０b
p）を単離精製し、これを発現ベクターｐＩＮ−ＩＩＩ
（lppp −５）−Ａ３のＸbaＩ−ＢamＨＩサイトに挿入
して、第５図における３５番目のアミノ酸（Ｖal）から
１８５番目のアミノ酸（Ｔhr）までからなるポリペプチ
ド発現用の、所望の分泌型発現プラスミドｐＩＮ−ＩＩ
Ｉ（lpp p −５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５
１を得た。 【０１４７】以上の概略を第９図−１、２及び３に示
す。 【０１４８】また、上記分泌型発現プラスミドにコード
されるアミノ酸配列を第１０図に示す。第１０図中、下
線を付した配列はＯｍｐＡシグナルペプチドを、▼はプ
ロセッシング部位をそれぞれ示す。 【０１４９】ヌ） 上記リ）で得たｐＩＮ−ＩＩＩ（lp
p p −５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５１を大
腸菌ＨＢ１０１及びＪＭ１０９にトランスフォームして
分泌生産を行ない、ペリプラズム画分としてＣＳＦ活性
を示す上清を回収した。 【０１５０】即ち、上記のＭ−ＣＳＦ分泌型発現ベクタ
ーを保有する菌株を２ｌ容フラスコにて、５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地５００ｍｌにて３７
℃で１４時間振盪培養した後、遠心（５０００rpm 、５
分間、室温）して菌体をペレットとした。 【０１５１】この菌体ペレットを、５０ｍＭトリス・Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）−２５％シュークロース溶液５０ｍ
ｌに再浮遊させ、更に２５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）を１．２５ｍｌ加えた後、ゆっくりと振盪しながら
室温に３０分間置いた。同様に遠心して得られた菌体ペ
レットを、氷冷した蒸留水２５ｍｌに再浮遊させ、ゆっ
くりと振盪しながら、３０分間氷冷し、４℃にて、１０
０００rpm 、５分間遠心して、ペリプラズム画分として
上清を回収した。 【０１５２】ル） 上記リ）において、ｐｃＤＭ・ＣＳ
Ｆ１１−１８５の代りにｐｃＤＭ−ＣＳＦ１１−１７７
を用いることにより、第５図における３５番目のアミノ
酸（Ｖal）から同１７７番目のアミノ酸（Ｇlu）までか
らなるポリペプチド発現用の所望のＭ−ＣＳＦ分泌型発
現プラスミド、ｐＩＮ−ＩＩＩ（lpp p −５）−Ｏｍｐ
Ａ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１４３を得た。 【０１５３】該プラスミドにコードされるアミノ酸配列
を第１１図に示す。第１１図中、下線を付した配列はＯ
ｍｐＡシグナルペプチドを、▼はプロセッシング部位を
それぞれ示す。該プラスミドを上記ヌ）と同様にして大
腸菌にトランスフォームさせて、該大腸菌よりペリプラ
ズム画分としてＣＳＦ活性を示す上清を得た。 【０１５４】ヲ） 上記ヘ），ト）、チ）及びヌ）で得
た各上清を、下記条件のＨＰＬＣに付した。 【０１５５】カラム：ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（６０
ｃｍ×７．５ｍｍ直径、東洋曹達工業） 溶離液：０．００５％ポリエチレングリコール及び０．
１５Ｍ ＮａＣｌ含有ＰＢＳ 流速：０．８ｍｌ／分 フラクション容積：０．８ｍｌ／チューブ／分 分子量マーカー（グルタミン酸脱水素酵素：２９万、乳
酸脱水素酵素：１４．２万、エノラーゼ：６．７万、ア
デニル酸キナーゼ：３．２万、チトクロムＣ：１．２４
万）を基準として、各サンプルにつき、以下の結果を得
た。 【０１５６】・サンプル：前記ヘ）で得た培養上清の４
ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）にて約１５
０μｌに濃縮したもの。 【０１５７】分子量３２〜７０万（平均４８万）に相当
する範囲の溶出画分に、ＣＳＦ活性を認めた。 【０１５８】・サンプル：前記ト）で得た培養上清４ｍ
ｌを上記と同様に処理したもの。 【０１５９】分子量６．６万から８．６万（平均７．６
万）に相当する範囲の溶出画分に、ＣＳＦ活性を認め
た。 【０１６０】・サンプル：前記チ）で得た培養上清４ｍ
ｌを上記と同様に処理したもの。 【０１６１】分子量５．２万から８．６万（平均６．７
万）に相当する範囲の溶出画分に、ＣＳＦ活性を認め
た。 【０１６２】・サンプル：前記ヌ）で得たペリプラズム
画分の上清２ｍｌを上記と同様にして約１１０μｌに濃
縮したもの。 【０１６３】分子量３〜４万（平均３．５万）に相当す
る位置に、ＣＳＦ活性を認めた。 【０１６４】ワ） 前記ヘ），ト）又はチ）で得た培養
上清の１０ｍｌを、１ｍｌのＣonＡ−セファロースを充
填したカラムに供した後、ＰＢＳ−（５ｍｌ）にて洗浄
後、０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシド含有ＰＢＳ−
（１０ｍｌ）にて溶出した。得られた溶出液の４ｍｌを
セントリコン−１０にて濃縮し、これを下記ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ用サンプルとした。 【０１６５】また、前記ヌ）で得たペリプラズム画分の
上清は、これをそのまま、同サンプルとした。 【０１６６】Ｍ−ＣＳＦの検出は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後
のゲルをウエスタンブロッティングに供し、常法に従っ
て製造したＭ−ＣＳＦに対する家兎抗血清を使用するこ
とにより行なった。 【０１６７】即ち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥはレムリの方法
〔Laemmli, U.K., Nature, 277, 680(1970)〕に従い、
ミニスラブ（ゲル濃度１５％）を用い、またウエスタン
ブロッティングは、バイオラッド社のトランスブロット
セルを用いて行なった。トランスファーされたニトロセ
ルロース膜を１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳ−にてブ
ロッキング後、Ｍ−ＣＳＦに対する上記家兎抗血清と反
応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体
（バイオラッド社製）を作用させた。Ｍ−ＣＳＦバンド
の検出は、かくして得られたニトロセルロース膜と発色
基質である４−クロロ−１−ナフトール液を反応させる
ことにより行なった。 【０１６８】結果を下記表６に示す。 【０１６９】 【表６】【０１７０】カ） プラスミドｐＳＶ２−dhfr〔Mol. C
ell. Biol., 1, 854 (1981) 〕を、制限酵素Ｈind ＩＩ
ＩとＢamＨＩにより２つの断片に切断して、ジヒドロ葉
酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む断片を単離精製し
た。 【０１７１】次に、プラスミドｐＲＳＶ−ＣＡＴ〔Pro
c. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6777 (1981) 〕を、同
じくＨinｄＩＩＩとＢamＨＩとで切断してラウス肉腫ウ
イルス（ＲＳＶ）のＬＴＲ（long terminal repeat）部
分を含む断片を単離精製した。 【０１７２】上記で精製された２種の断片を、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを反応させることにより連結させた。 【０１７３】この反応物を大腸菌ＨＢ１０１コンピテン
トセル（宝酒造）にトランスフォームし、得られたアン
ピシリン耐性を示すコロニーからプラスミドＤＮＡを調
製し、制限酵素地図を作成して、目的のプラスミドｐＲ
ＳＶ−dhfrを得た。 【０１７４】該プラスミドはＲＳＶのＬＴＲ部分、ＤＨ
ＦＲ遺伝子、ＳＶ４０由来の介在配列とpolyＡ付加シグ
ナル、更に大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開
始点とアンピシリン耐性遺伝子を含有し、上記ＬＴＲ部
分に含有されるプロモーターのコントロール下にＤＨＦ
Ｒを発現するものである。 【０１７５】このプラスミドｐＲＳＶ−dhfrをＮdeＩと
ＢamＨＩとで２つの断片に切断して、ＤＨＦＲ遺伝子を
含む断片を単離精製した。得られたＤＮＡ断片を、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（クレノウ フラグメント）で処理し
て両末端を平滑末端とした。 【０１７６】一方、前記ヘ）で得たプラスミドｐｃＤＭ
・ＣＳＦ１１を、ＳalＩで切断後、この切断部位を同様
にＤＮＡポリメラーゼＩで処理して平滑末端とした。 【０１７７】以上により得られた両断片を、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結させ、この反応物を大腸菌ＪＭ１
０９コンピテントセルにトランスフォームした。得られ
たアンピシリン耐性を示すコロニーからプラスミドＤＮ
Ａを調製し、制限酵素地図を作成して、目的のＭ−ＣＳ
ＦとＤＨＦＲの両遺伝子の発現プラスミドｐｃＤＭ・Ｃ
ＳＦ１１−dhfrを得た。 【０１７８】該プラスミドは、Ｍ−ＣＳＦ発現に係わる
ＳＶ４０由来の初期プロモーター部分、介在配列、Ｍ−
ＣＳＦ遺伝子、polyＡ付加シグナル、ＤＨＦＲ発現に係
わるＲＳＶのＬＴＲ部分、ＤＨＦＲ遺伝子、ＳＶ４０由
来の介在配列、polyＡ付加シグナルを含有し、更に大腸
菌プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点及びアンピ
シリン耐性遺伝子を含有する。 【０１７９】以上の概略を第１２図−１及び−２に示
す。 【０１８０】ヨ） 上記で得たプラスミドｐｃＤＭ・Ｃ
ＳＦ１１−dhfrを用いて、前記ハ）に従って、ｒ−ＭＣ
ＳＦを製造した。 【０１８１】その結果、培養上清のＣＳＦ活性は、プレ
ート当たりのコロニー数（平均値）として６８（プラス
ミドｐｃＤＥを用いた対照は０）であった。 【０１８２】タ） ７５ｃｍ2 培養フラスコ（コスター
社製）で培養されたチャイニーズハムスター卵巣dhfr欠
損細胞〔ＣＨＯ−Ｄｕｋdhfr−細胞：Proc. Natl. Aca
d. Sci., USA., 77, 4216 (1980) 〕を、常法に従って
トリプシン（フローラボラトリー社製）処理し、１０％
透析牛胎児血清（GIBCO 社製）を含むダルベッコ改良最
小必須培地（ＤＭＥＭ培地、GIBCO 社製）に懸濁させ、
同培地にて細胞を洗浄した後、培地を除いた。 【０１８３】この細胞を、ＤＮＡ注入溶液（０．２５Ｍ
マンニトール−０．１ｍＭ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ−
０．１ｍＭ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ−０．２ｍＭトリス
ＨＣｌ、ｐＨ７．２、和光純薬工業社製）に懸濁させ
た。 【０１８４】前記カ）で得たＭ−ＣＳＦ発現プラスミド
ｐｃＤＭ・ＣＳＦ１１−dhfrを、ＣlaＩにより切断し、
線状化した後、ＤＮＡ注入溶液に溶解させた。 【０１８５】上記の細胞懸濁液２００μｌ（２×１０6
細胞）とＤＮＡ溶液２００μｌ（３０μｇＤＮＡ）を混
合し、融合チャンバーＣＨ−２（島津製作所社製）に入
れ、電気融合装置ＳＳＨ−１（島津製作所社製）に接続
して、４．２ＫＶ／ｃｍ2 パルスを１秒間隔で２回繰返
し、電気的に、細胞内にＤＮＡを導入した。 【０１８６】ＤＮＡを導入した細胞を１０％透析牛胎児
血清−１％非必須アミノ酸溶液（フローラボラトリーズ
社製）−２％ＨＴ溶液（同上社製）−ＤＭＥＭ培地に懸
濁させ、２４穴プレート（コスター社製）にて培養し
た。 【０１８７】４８時間培養後、培地を選択培地（１０％
透析牛胎児血清及び１％非必須アミノ酸溶液を含むＤＭ
ＥＭ培地）に交換し、その後、３〜４日毎に培地を新鮮
なものと交換した。 【０１８８】１０〜１４日間培養して得られた約２００
クローンの形質転換細胞より５０クローンを選んで、常
法通りトリプシン処理後、新しい２４穴プレートに移し
た。 【０１８９】ＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、高濃度のメトト
レキセート（ＭＴＸ）に対する耐性を与え〔J. B. C.,
253, 1357 (1978)〕、同時に形質転換された近接の遺伝
子はＭＴＸにより増幅を示す。 【０１９０】上記５０クローンの形質転換細胞を、２０
ｎＭ ＭＴＸを含む選択培地で培養し続け、増殖のみら
れた耐性クローンをトリプシン処理後、５０ｎＭ ＭＴ
Ｘを含む選択培地に懸濁させて培養を行なった。同様に
増殖のみられた耐性クローンを、１００ｎＭ ＭＴＸを
含む選択培地で培養し続け、最終的に４００ｎＭ ＭＴ
Ｘに耐性を示すクローンを得た。 【０１９１】これらの耐性クローンの培養上清のＣＳＦ
活性を下記表７に示す。 【０１９２】 【表７】 【０１９３】上記で得たＣＨＯ細胞培養上清を、そのま
ま、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルとして、前記ワ）と同
様にして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の検討を行な
った。 【０１９４】その結果、非還元条件下で９万、還元条件
下で４．４万に相当する位置にＭ−ＣＳＦのバンドが検
出された。
【図面の簡単な説明】
【図１】λｃＭ５のｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。
【図２】マキサム−ギルバートの化学修飾法及びＭ１３
フアージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法にて
決定された上記ｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図３】マキサム−ギルバートの化学修飾法及びＭ１３
フアージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法にて
決定された上記ｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図４】マキサム−ギルバートの化学修飾法及びＭ１３
フアージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法にて
決定された上記ｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図５】マキサム−ギルバートの化学修飾法及びＭ１３
フアージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法にて
決定された上記ｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図６】上記ｃＤＮＡによりコードされているＭ−ＣＳ
Ｆ前駆体蛋白質の蛋白一次構造を示す。 【図７】上記ｃＤＮＡによりコードされているＭ−ＣＳ
Ｆ前駆体蛋白質の蛋白一次構造を示す。 【図８】λｃＭ１１のｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図９】λｃＭ１１のｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図１０】λｃＭ１１のｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図１１】λｃＭ１１のｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図１２】λｃＭ１１ｃＤＮＡによりコードされている
Ｍ−ＣＳＦ前駆体蛋白質の蛋白一次構造を示す。 【図１３】λｃＭ１１ｃＤＮＡによりコードされている
Ｍ−ＣＳＦ前駆体蛋白質の蛋白一次構造を示す。 【図１４】λｃＭ１１ｃＤＮＡによりコードされている
Ｍ−ＣＳＦ前駆体蛋白質の蛋白一次構造を示す。 【図１５】ＣＯＳ細胞発現ベクターｐｃＤＥの作製の概
略図を示す。 【図１６】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ
の作製の概略図を示す。 【図１７】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ
１１−１８５の作製の概略図を示す。 【図１８】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ
（lpp p −５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５１
の作製の概略図を示す。 【図１９】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ
（lpp p −５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５１
の作製の概略図を示す。 【図２０】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ
（lpp p −５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５１
の作製の概略図を示す。 【図２１】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ
（lpp p −５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５１
によりコードされるアミノ酸配列を示す。 【図２２】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ
（lpp p −５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１４３
によりコードされるアミノ酸配列を示す。 【図２３】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ
１１−dhfrの作製の概略図を示す。 【図２４】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ
１１−dhfrの作製の概略図を示す。
フアージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法にて
決定された上記ｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図３】マキサム−ギルバートの化学修飾法及びＭ１３
フアージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法にて
決定された上記ｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図４】マキサム−ギルバートの化学修飾法及びＭ１３
フアージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法にて
決定された上記ｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図５】マキサム−ギルバートの化学修飾法及びＭ１３
フアージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法にて
決定された上記ｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図６】上記ｃＤＮＡによりコードされているＭ−ＣＳ
Ｆ前駆体蛋白質の蛋白一次構造を示す。 【図７】上記ｃＤＮＡによりコードされているＭ−ＣＳ
Ｆ前駆体蛋白質の蛋白一次構造を示す。 【図８】λｃＭ１１のｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図９】λｃＭ１１のｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図１０】λｃＭ１１のｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図１１】λｃＭ１１のｃＤＮＡの塩基配列を示す。 【図１２】λｃＭ１１ｃＤＮＡによりコードされている
Ｍ−ＣＳＦ前駆体蛋白質の蛋白一次構造を示す。 【図１３】λｃＭ１１ｃＤＮＡによりコードされている
Ｍ−ＣＳＦ前駆体蛋白質の蛋白一次構造を示す。 【図１４】λｃＭ１１ｃＤＮＡによりコードされている
Ｍ−ＣＳＦ前駆体蛋白質の蛋白一次構造を示す。 【図１５】ＣＯＳ細胞発現ベクターｐｃＤＥの作製の概
略図を示す。 【図１６】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ
の作製の概略図を示す。 【図１７】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ
１１−１８５の作製の概略図を示す。 【図１８】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ
（lpp p −５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５１
の作製の概略図を示す。 【図１９】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ
（lpp p −５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５１
の作製の概略図を示す。 【図２０】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ
（lpp p −５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５１
の作製の概略図を示す。 【図２１】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ
（lpp p −５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５１
によりコードされるアミノ酸配列を示す。 【図２２】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ
（lpp p −５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１４３
によりコードされるアミノ酸配列を示す。 【図２３】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ
１１−dhfrの作製の概略図を示す。 【図２４】Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ
１１−dhfrの作製の概略図を示す。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 河野 尚美
徳島県徳島市佐古八番町８−17 八番町
リバーハイツ404号
(72)発明者 平井 嘉勝
徳島県板野郡北島町新喜来字江古川５−
49
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．下式（１）に示すアミノ酸配列の３３位Ｇｌｕから
３７位ＧｌｕのいずれかをＮ端アミノ酸とし、同１８５
位ＴｈｒをＣ端アミノ酸とする部分アミノ酸配列をコー
ドする核酸配列を有するヒトＭ−ＣＳＦ遺伝子を含有す
る組換えベクターで形質転換された宿主を培養し、得ら
れるヒトＭ−ＣＳＦを採取することを特徴とするヒトＭ
−ＣＳＦの製造方法。 式（１）：Met-Thr-Ala-Pro-Gly-Ala-Ala-Gly-Arg-Cys-
Pro-Pro-Thr-Thr-Trp-Leu-Gly-Ser-Leu-Leu-Leu-Leu-Va
l-Cys-Leu-Leu-Ala-Ser-Arg-Ser-Ile-Thr-Glu-Glu-Val-
Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Ser-Gly-His-Le
u-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-Gln-Met-Glu-
Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Val-Asp-Gln-Gl
u-Gln-Leu-Lys-Asp-Pro-Val-Cys-Tyr-Leu-Lys-Lys-Ala-
Phe-Leu-Leu-Val-Gln-X -Ile-Met-Glu-Asp-Thr-Met-Arg
-Phe-Arg-Asp-Asn-Thr-Pro-Asn-Ala-Ile-Ala-Ile-Val-G
ln-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-Lys-Ser-Cys-Phe
-Thr-Lys-Asp-Tyr-Glu-Glu-His-Asp-Lys-Ala-Cys-Val-A
rg-Thr-Phe-Tyr-Glu-Thr-Pro-Leu-Gln-Leu-Leu-Glu-Lys
-Val-Lys-Asn-Val-Phe-Asn-Glu-Thr-Lys-Asn-Leu-Leu-A
sp-Lys-Asp-Trp-Asn-Ile-Phe-Ser-Lys-Asn-Cys-Asn-Asn
-Ser-Phe-Ala-Glu-Cys-Ser-Ser-Gln-Asp-Val-Val-Thr-L
ys-Pro-Asp-Cys-Asn-Cys-Leu-Tyr-Pro-Lys-Ala-Ile-Pro
-Ser-Ser-Asp-Pro-Ala-Ser-Val-Ser-Pro-His-Gln-Pro-L
eu-Ala-Pro-Ser-Met-Ala-Pro-Val-Ala-Gly-Leu-Thr-Trp
-Glu-Asp-Ser-Glu-Gly-Thr-Glu-Gly-Ser-Ser-Leu-Leu-P
ro-Gly-Glu-Gln-Pro-Leu-His-Thr-Val-Asp-Pro-Gly-Ser
-Ala-Lys-Gln-Arg-Pro-Pro-Arg-Ser-Thr-Cys-Gln-Ser-P
he-Glu-Pro-Pro-Glu-Thr-Pro-Val-Val-Lys-Asp-Ser-Thr
-Ile-Gly-Gly-Ser-Pro-Gln-Pro-Arg-Pro-Ser-Val-Gly-A
la-Phe-Asn-Pro-Gly-Met-Glu-Asp-Ile-Leu-Asp-Ser-Ala
-Met-Gly-Thr-Asn-Trp-Val-Pro-Glu-Glu-Ala-Ser-Gly-G
lu-Ala-Ser-Glu-Ile-Pro-Val-Pro-Gln-Gly-Thr-Glu-Leu
-Ser-Pro-Ser-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser-Met-Gln-Thr-G
lu-Pro-Ala-Arg-Pro-Ser-Asn-Phe-Leu-Ser-Ala-Ser-Ser
-Pro-Leu-Pro-Ala-Ser-Ala-Lys-Gly-Gln-Gln-Pro-Ala-A
sp-Val-Thr-Gly-Thr-Ala-Leu-Pro-Arg-Val-Gly-Pro-Val
-Arg-Pro-Thr-Gly-Gln-Asp-Trp-Asn-His-Thr-Pro-Gln-L
ys-Thr-Asp-His-Pro-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Asp-Pro-Pro
-Glu-Pro-Gly-Ser-Pro-Arg-Ile-Ser-Ser-Pro-Arg-Pro-G
ln-Gly-Leu-Ser-Asn-Pro-Ser-Thr-Leu-Ser-Ala-Gln-Pro
-Gln-Leu-Ser-Arg-Ser-His-Ser-Ser-Gly-Ser-Val-Leu-P
ro-Leu-Gly-Glu-Leu-Glu-Gly-Arg-Arg-Ser-Thr-Arg-Asp
-Arg-Arg-Ser-Pro-Ala-Glu-Pro-Glu-Gly-Gly-Pro-Ala-S
er-Glu-Gly-Ala-Ala-Arg-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Asn-Ser
-Val-Pro-Leu-Thr-Asp-Thr-Gly-His-Glu-Arg-Gln-Ser-G
lu-Gly-Ser-Ser-Ser-Pro-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Val-Phe
-His-Leu-Leu-Val-Pro-Ser-Val-Ile-Leu-Val-Leu-Leu-A
la-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Phe-Tyr-Arg-Trp-Arg-Arg-Arg
-Ser-His-Gln-Glu-Pro-Gln-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro-Leu-G
lu-Gln-Pro-Glu-Gly-Ser-Pro-Leu-Thr-Gln-Asp-Asp-Arg
-Gln-Val-Glu-Leu-Pro-Val 〔式中、ＸはＴｙｒ又はＡｓｐを示す。〕
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8133284A JP2660332B2 (ja) | 1986-09-17 | 1996-05-28 | ヒトｍ−ｃｓｆの製造方法 |
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22075086 | 1986-09-17 | ||
| JP1102587 | 1987-01-19 | ||
| JP16638887 | 1987-07-02 | ||
| JP61-220750 | 1987-07-02 | ||
| JP62-11025 | 1987-07-02 | ||
| JP62-166388 | 1987-07-02 | ||
| JP8133284A JP2660332B2 (ja) | 1986-09-17 | 1996-05-28 | ヒトｍ−ｃｓｆの製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62222696A Division JP2583770B2 (ja) | 1986-09-17 | 1987-09-04 | 遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09107963A JPH09107963A (ja) | 1997-04-28 |
| JP2660332B2 true JP2660332B2 (ja) | 1997-10-08 |
Family
ID=27455513
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8133284A Expired - Lifetime JP2660332B2 (ja) | 1986-09-17 | 1996-05-28 | ヒトｍ−ｃｓｆの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2660332B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200008258A (ko) * | 2018-07-16 | 2020-01-28 | 충북대학교 산학협력단 | 대식세포 콜로니 자극인자의 분리 및 정제 방법 |
-
1996
- 1996-05-28 JP JP8133284A patent/JP2660332B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200008258A (ko) * | 2018-07-16 | 2020-01-28 | 충북대학교 산학협력단 | 대식세포 콜로니 자극인자의 분리 및 정제 방법 |
| KR102075256B1 (ko) | 2018-07-16 | 2020-02-07 | 충북대학교 산학협력단 | 대식세포 콜로니 자극인자의 분리 및 정제 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09107963A (ja) | 1997-04-28 |
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