JPS61246197A - Ｄｎａ - Google Patents
ＤｎａInfo
- Publication number
- JPS61246197A JPS61246197A JP60086284A JP8628485A JPS61246197A JP S61246197 A JPS61246197 A JP S61246197A JP 60086284 A JP60086284 A JP 60086284A JP 8628485 A JP8628485 A JP 8628485A JP S61246197 A JPS61246197 A JP S61246197A
- Authority
- JP
- Japan
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- dna
- bcdf
- cells
- mrna
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5412—IL-6
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、ＤＮＡに関し、詳しくはＢ細胞分化因子の
（以下「ＢＣＤＦ Ｊと記す）蛋白の部分アミノ酸配列
をコードするＤＮＡをそのＤＮＡ ｑ中に有するＤＮＡ
である。
（以下「ＢＣＤＦ Ｊと記す）蛋白の部分アミノ酸配列
をコードするＤＮＡをそのＤＮＡ ｑ中に有するＤＮＡ
である。
Ｃ従来の技術〕
ＢＣＤＦは、’ｌ’ ＩＪンパ球代替因子、ＴＲＩ’と
して、マウスのリンパ球混合物培養後の培養上清または
抗原やマイトゲンにより刺激を受けたマウスのリンパ球
上清中に、マウスのＴ細胞を除去されたリンノ母球細胞
集団やヌードマウス由来のり７７４球のヒツジ赤血球に
対する一次免疫応答を増幅させる物質として見出された
（ Ｄ、Ｗ、Ｄｕｔｔｏｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ。
して、マウスのリンパ球混合物培養後の培養上清または
抗原やマイトゲンにより刺激を受けたマウスのリンパ球
上清中に、マウスのＴ細胞を除去されたリンノ母球細胞
集団やヌードマウス由来のり７７４球のヒツジ赤血球に
対する一次免疫応答を増幅させる物質として見出された
（ Ｄ、Ｗ、Ｄｕｔｔｏｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ。
Ｒｅｖ、、 ２３ 、６６ 、 （１９７５） 、Ａ、
Ｓｃｈｉｍｐｌ、 Ｅ壷Ｗｅａｋｅｒ ら、Ｎａｔ
ｕｒｅＮ、Ｂｌｏｔ、、２３７，１５ （１９７２）
）。
Ｓｃｈｉｍｐｌ、 Ｅ壷Ｗｅａｋｅｒ ら、Ｎａｔ
ｕｒｅＮ、Ｂｌｏｔ、、２３７，１５ （１９７２）
）。
それ以来ＴＲＦは、抗厚非特異的に主要組織適合遺伝子
複合体（以下、ＭＨＣと略称する。）の一致を必要とし
かい様式でＢ細胞に作用し、Ｂ細胞の分裂増殖を誘導せ
ず、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を誘導する液性因子
であると定義されている。
複合体（以下、ＭＨＣと略称する。）の一致を必要とし
かい様式でＢ細胞に作用し、Ｂ細胞の分裂増殖を誘導せ
ず、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を誘導する液性因子
であると定義されている。
その後、このよう−５Ｂ細胞分化因子の存在を示す証拠
が蓄積されており、人においてもマウス同様の分化因子
の存在が示唆されている。現在では上述のように定義さ
れたＢ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因子をＢＣＤＦ
と総称するようになった。
が蓄積されており、人においてもマウス同様の分化因子
の存在が示唆されている。現在では上述のように定義さ
れたＢ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因子をＢＣＤＦ
と総称するようになった。
このようにＢＣＤＦは大の体内でＢ細胞の抗体産生機能
に重要な働きをしてｂる。ＢＣＤＦの臨床への応用は大
別して３つ考えられる。第１はＢＣＤＦ’によりＢＣＤ
Ｆ抗体を作シ、ＢＣＤＦと抗ＢＣＤＦ抗体によるＢＣＤ
Ｆのイムノアッセイ系を用いて免疫学的な病態の解析に
用いることが出来る。第２の応用は各種疾患の治療への
応用である。例えば、Ｔ細胞のヘルパー機能低下にと本
なうＢ細胞抗体産生能低下による免疫不全症患者にＢＣ
ＤＦ単独または他のリンホカインと共に投与することに
より抗体産生機能を正常に戻すことが考えられる。更に
ＢＣＤＦの応用として次のことが考えられる。Ｂ細胞増
殖因子（ＢＣＧＦ）（Ｋ、 Ｙｏｓｈｌｚａｋｉら、Ｊ
、 ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １３０．１２４１（１
９８３））、その他のリンホカインを含むで細胞因子を
培地に加えることによプ正常Ｂ細胞を長期培養できるこ
とが報告されている（ Ｂ、 ５ｒｅｄｎｉら、Ｊ−Ｅ
ｘｐ−Ｍ＠ｄ、、１５４ｙ １５００（１９８１）参照
）。これらの培養正常Ｂ細胞あるいはＥＢウィルスで形
質転換し九Ｂ細胞に対し、適当な時期にＢＣＤＦを作用
させることにより生体外で抗体を産生させることが出来
る。特定の抗体、例えば、病厚細菌、病厚ウィルス、病
原原虫、癌細胞などの表面にある特定抗厚を認識する抗
体を産生ずるＢ細胞をモノクローン化し、クローン化正
常Ｂ細胞またはＥＢクイルスで形質転換した細胞をＢＣ
ＤＦとその他のリンホカインを組合せて培養し、有用な
モノクローナル抗体を産生させることが出来る。これら
抗体は感染症や癌の治療および診断に利用できる。
に重要な働きをしてｂる。ＢＣＤＦの臨床への応用は大
別して３つ考えられる。第１はＢＣＤＦ’によりＢＣＤ
Ｆ抗体を作シ、ＢＣＤＦと抗ＢＣＤＦ抗体によるＢＣＤ
Ｆのイムノアッセイ系を用いて免疫学的な病態の解析に
用いることが出来る。第２の応用は各種疾患の治療への
応用である。例えば、Ｔ細胞のヘルパー機能低下にと本
なうＢ細胞抗体産生能低下による免疫不全症患者にＢＣ
ＤＦ単独または他のリンホカインと共に投与することに
より抗体産生機能を正常に戻すことが考えられる。更に
ＢＣＤＦの応用として次のことが考えられる。Ｂ細胞増
殖因子（ＢＣＧＦ）（Ｋ、 Ｙｏｓｈｌｚａｋｉら、Ｊ
、 ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １３０．１２４１（１
９８３））、その他のリンホカインを含むで細胞因子を
培地に加えることによプ正常Ｂ細胞を長期培養できるこ
とが報告されている（ Ｂ、 ５ｒｅｄｎｉら、Ｊ−Ｅ
ｘｐ−Ｍ＠ｄ、、１５４ｙ １５００（１９８１）参照
）。これらの培養正常Ｂ細胞あるいはＥＢウィルスで形
質転換し九Ｂ細胞に対し、適当な時期にＢＣＤＦを作用
させることにより生体外で抗体を産生させることが出来
る。特定の抗体、例えば、病厚細菌、病厚ウィルス、病
原原虫、癌細胞などの表面にある特定抗厚を認識する抗
体を産生ずるＢ細胞をモノクローン化し、クローン化正
常Ｂ細胞またはＥＢクイルスで形質転換した細胞をＢＣ
ＤＦとその他のリンホカインを組合せて培養し、有用な
モノクローナル抗体を産生させることが出来る。これら
抗体は感染症や癌の治療および診断に利用できる。
従来ＢＣＤＦを得るには、人末梢血などより分離した正
常人で細胞をマイトゲン刺激することによりＢＣＤＦを
産生させる方法が採られてきた。この方法では、Ｔ細胞
を十分得ることが困難である点、マイトゲンを用いたた
め、ＢＣＤＦに有害なマイに１”ンが混入し、これを除
去するのが困難である点、またで細胞培養にはウシ胎児
血清彦ど血清成分を培地に添加する必要があり、これら
添加タンｚ４り質とＢＣＤＦを十分分離することが出来
ず、ＢＣＤＦを医療に用いるには、純化ＢＣＤＦが得ら
れぬことが障害となっている点など問題が多く、工業的
にＢＣＤＦを産生することは出来なかった。また六Ｔ細
胞を人癌細胞と細胞融合して人Ｔ融合細胞を得、これに
よりＢＣＤＦを産生せしめる方法も報告されている（Ｏ
ｋａｄａら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍａｄ、、１５７，５８３（
１９８３））。しかし・人融合細胞は継代中、リンホカ
イン産生能が低下してゆくことが多く、実用的ＢＣＤＦ
産生人融合細胞は未だない。
常人で細胞をマイトゲン刺激することによりＢＣＤＦを
産生させる方法が採られてきた。この方法では、Ｔ細胞
を十分得ることが困難である点、マイトゲンを用いたた
め、ＢＣＤＦに有害なマイに１”ンが混入し、これを除
去するのが困難である点、またで細胞培養にはウシ胎児
血清彦ど血清成分を培地に添加する必要があり、これら
添加タンｚ４り質とＢＣＤＦを十分分離することが出来
ず、ＢＣＤＦを医療に用いるには、純化ＢＣＤＦが得ら
れぬことが障害となっている点など問題が多く、工業的
にＢＣＤＦを産生することは出来なかった。また六Ｔ細
胞を人癌細胞と細胞融合して人Ｔ融合細胞を得、これに
よりＢＣＤＦを産生せしめる方法も報告されている（Ｏ
ｋａｄａら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍａｄ、、１５７，５８３（
１９８３））。しかし・人融合細胞は継代中、リンホカ
イン産生能が低下してゆくことが多く、実用的ＢＣＤＦ
産生人融合細胞は未だない。
一方、ＢＣＤＦをコードするＤＮＡを、Ｂ、ｃｏｌｉ等
の微生物細胞内で発現せしめる方法も考えられるが、こ
のようなりＮＡは未だ得られてはいなかりた〇〔発明が
解決しようとする問題点〕 この発明の目的は、従って、ＢＣＤＦをコードするＤＮ
Ａを得る際のグローブとなる、あるいはＢＣＤＦをコー
ドするＤＮＡを提供することにある。
の微生物細胞内で発現せしめる方法も考えられるが、こ
のようなりＮＡは未だ得られてはいなかりた〇〔発明が
解決しようとする問題点〕 この発明の目的は、従って、ＢＣＤＦをコードするＤＮ
Ａを得る際のグローブとなる、あるいはＢＣＤＦをコー
ドするＤＮＡを提供することにある。
本発明者らは、ヒ）Ｔ細胞白血病ウィルスにより形質転
換されたヒト細胞が生産するＢＣＤＦの部分アミノ酸配
列であるＬｙ ｓ −Ａｓ ｐ−Ｖａｌ−ＡＬａをコー
ドするＤＮＡを分子中に有し、ＢＣＤＦＣＤ症を有する
ヒト細胞により生産されるメツセンジャーＲＮＡに二重
鎖の一方のＤＮＡ鎖が相補性を有するＤＮＡが上記の目
的とするＤＮＡであることを見い出した。即ち、本発明
（Ｄ ＤＮＡは、塩基配列ＡＡＸ ＧＡＹ ＧＴＺ Ｇ
ＣＺ （ＸはＡ又はＧであり、ＹはＴ又はＣであシ、２
はＴ又はＡ又はＧ又はＣである）、又はこのＤＮＡを分
子中に有するものでおる。Ｌｙｓ−Ａｓｐ−’Ｉ／ａｔ
−Ａｌａ ｔ−コードするＤＮＡは、Ｍ、Ｄ、Ｍａｔｔ
ｅｖａａｉ 、ら、Ｊ、 Ａｍ、 Ｃｈｅｍ。
換されたヒト細胞が生産するＢＣＤＦの部分アミノ酸配
列であるＬｙ ｓ −Ａｓ ｐ−Ｖａｌ−ＡＬａをコー
ドするＤＮＡを分子中に有し、ＢＣＤＦＣＤ症を有する
ヒト細胞により生産されるメツセンジャーＲＮＡに二重
鎖の一方のＤＮＡ鎖が相補性を有するＤＮＡが上記の目
的とするＤＮＡであることを見い出した。即ち、本発明
（Ｄ ＤＮＡは、塩基配列ＡＡＸ ＧＡＹ ＧＴＺ Ｇ
ＣＺ （ＸはＡ又はＧであり、ＹはＴ又はＣであシ、２
はＴ又はＡ又はＧ又はＣである）、又はこのＤＮＡを分
子中に有するものでおる。Ｌｙｓ−Ａｓｐ−’Ｉ／ａｔ
−Ａｌａ ｔ−コードするＤＮＡは、Ｍ、Ｄ、Ｍａｔｔ
ｅｖａａｉ 、ら、Ｊ、 Ａｍ、 Ｃｈｅｍ。
Ｓｏｃ、１０３，３１８５（１９８１）に記載された方
法により化学的に合成してもよいし、化学的に合成され
たＤＮＡをグローブとして、ＢＣＤＦＣＤ症を有するヒ
ト細胞が産生じたメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ ）
の逆転写物であるＤＮＡより選別してもよい。後者の方
法による場合には、選別した単鎖ＤＮＡに相補性を有す
るＤＮＡを作成すればＢＣＤＦをコードするＤＮＡが得
られる。
法により化学的に合成してもよいし、化学的に合成され
たＤＮＡをグローブとして、ＢＣＤＦＣＤ症を有するヒ
ト細胞が産生じたメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ ）
の逆転写物であるＤＮＡより選別してもよい。後者の方
法による場合には、選別した単鎖ＤＮＡに相補性を有す
るＤＮＡを作成すればＢＣＤＦをコードするＤＮＡが得
られる。
このように、本発明のＤＮＡは、Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ｖａ
Ｌ−Ａｌａをコードする１）ＮＡ 、これに相補性を有
するＤＮＡ 、これらの二重鎖ＤＮＡ及びこれらのＤＮ
ＡをそのＤＮＡ鎖中に有するＤＮＡを含むものである。
Ｌ−Ａｌａをコードする１）ＮＡ 、これに相補性を有
するＤＮＡ 、これらの二重鎖ＤＮＡ及びこれらのＤＮ
ＡをそのＤＮＡ鎖中に有するＤＮＡを含むものである。
ＢＣＩ）Ｆ産生能を有するヒト細胞株は、例えば以下の
ように、得ることができる。人の末梢血・扁桃・膀帯血
などよりフィルコールバックなどを用いた密度勾配遠心
法等でリンパ球を分離し、 Ｎ、 Ｙａｍａｍｏｔｏ−
ｓｃｉｅｎｃｅ ２１７ 、７３７（１９８２）の方法
に準じてＨＴＬＶ （ヒ）Ｔ細胞白血病ウィルス）を用
いて人Ｔ細胞を形質転換（トランスフォーメーション）
する。たとえば下記の方法を用いることができる〇ウィ
ルス産生細胞株ＭＴ−２をＸ線照射（１２０００〜１４
０００ラド）で不活化した細胞１ｘｌＯ／−と、上述の
ようにして得た人リンパ球ｌＸｌ０／７１Ｅ／を２０％
ＦＣ８，１００μ９／ゴカナマイシン、２μ９／Ｉｌｌ
ＮａＨＣＯｓ、２５ ｍＭ Ｎ −２−ｈｙｄｒｏｘ
ｙａｔｈｙｌ −ｐｌｐｅｒａｚｉｎｓ −Ｎ’−２−
５ｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｅｉｄ （田ＥＳ ）ｔ
ｌ＋含むＲＰＭＩ １６４０培地を入れたグラスチック
シャーレ（７アル：ンナ３００８）に接種し５％ＣＯ２
存在下３７℃で培養する。１週間に２回、半分の培地を
新鮮な培地と交換しつつ２〜３力月培養した後、リミテ
ィングダイリューション法により株化する。株化した細
胞の培養上清のＢＣＤＦ活性を測定し、ＢＣＤＦ活性を
有する株を得る。
ように、得ることができる。人の末梢血・扁桃・膀帯血
などよりフィルコールバックなどを用いた密度勾配遠心
法等でリンパ球を分離し、 Ｎ、 Ｙａｍａｍｏｔｏ−
ｓｃｉｅｎｃｅ ２１７ 、７３７（１９８２）の方法
に準じてＨＴＬＶ （ヒ）Ｔ細胞白血病ウィルス）を用
いて人Ｔ細胞を形質転換（トランスフォーメーション）
する。たとえば下記の方法を用いることができる〇ウィ
ルス産生細胞株ＭＴ−２をＸ線照射（１２０００〜１４
０００ラド）で不活化した細胞１ｘｌＯ／−と、上述の
ようにして得た人リンパ球ｌＸｌ０／７１Ｅ／を２０％
ＦＣ８，１００μ９／ゴカナマイシン、２μ９／Ｉｌｌ
ＮａＨＣＯｓ、２５ ｍＭ Ｎ −２−ｈｙｄｒｏｘ
ｙａｔｈｙｌ −ｐｌｐｅｒａｚｉｎｓ −Ｎ’−２−
５ｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｅｉｄ （田ＥＳ ）ｔ
ｌ＋含むＲＰＭＩ １６４０培地を入れたグラスチック
シャーレ（７アル：ンナ３００８）に接種し５％ＣＯ２
存在下３７℃で培養する。１週間に２回、半分の培地を
新鮮な培地と交換しつつ２〜３力月培養した後、リミテ
ィングダイリューション法により株化する。株化した細
胞の培養上清のＢＣＤＦ活性を測定し、ＢＣＤＦ活性を
有する株を得る。
この方法により株化した細胞としてたとえばＶＴ−１と
名付けられたヒトで細胞株が得られたＱｍ ＲＮＡを得
る九めに、このようｆｉ ＢＣＤＦ産性能全性能るヒ）
Ｔ細胞を培養する培地は、動物細胞を培養する通常の培
地のいずれもが用いられる。具体的には、ローズウェル
６パークＴメモリア／１１０インステイテユード１６４
０培地（ＲｏｓｅｗｅＬｌｉ ＰａｒｋＭｓｍｏｒｉａ
ｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ １６４０ 、以下略してＲＰ
ＭＩ−１６４０）が好適であるが、他にダルベツコ変法
イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃ６ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ ） 、イーグル基礎培地
（Ｅａｇｌｅｓ Ｍｉｎｌｍｕｍ Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ
Ｍｅｄｕｉｍ ）、クリック培地（Ｃ１１ｃｋ Ｍｓ
ｄｉｕｍ ）なども用いられる。
名付けられたヒトで細胞株が得られたＱｍ ＲＮＡを得
る九めに、このようｆｉ ＢＣＤＦ産性能全性能るヒ）
Ｔ細胞を培養する培地は、動物細胞を培養する通常の培
地のいずれもが用いられる。具体的には、ローズウェル
６パークＴメモリア／１１０インステイテユード１６４
０培地（ＲｏｓｅｗｅＬｌｉ ＰａｒｋＭｓｍｏｒｉａ
ｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ １６４０ 、以下略してＲＰ
ＭＩ−１６４０）が好適であるが、他にダルベツコ変法
イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃ６ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ ） 、イーグル基礎培地
（Ｅａｇｌｅｓ Ｍｉｎｌｍｕｍ Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ
Ｍｅｄｕｉｍ ）、クリック培地（Ｃ１１ｃｋ Ｍｓ
ｄｉｕｍ ）なども用いられる。
これらの培地には、胎児ウシ血清（以下ＦＢＳと略す・
）や新生児ウシ血清、ウシ血清を添加して用いるのが望
ましい。
）や新生児ウシ血清、ウシ血清を添加して用いるのが望
ましい。
これらの培地に対する添加物として１）１１当シ約２０
〜２５０単位、理想的には１ゴ当り約１００単位のペニ
シリン、１ｉ）１ゴ当９１μｇ〜１００μ９、理想的に
は１ゴ当９１０μＩのｒンタマイシン、＋＋＋）１ ｙ
当り２０〜２５０μ１１理想的には１００μＪのストレ
プトマイシン、１ｖ）１−当り約１００〜１０００μＩ
、理想的には１ゴ当シ約３００μＩＯ新鮮Ｌ−グルタミ
ン、Ｖ）１０〜６０７、理想的には２５−のへペス緩衝
液、■１）８〜２０ｍ１へ理想的には１６ｍＭのＮａＨ
ＣＯ３、Ｖｆｉ） ５ ｘ １０−’ 〜５ ｘ １０
−’ ｙｌ 、理想的には５Ｘ１０−５Ｍの２−メルカ
プトエタノールなどを必要に応じて用いることが出来る
。細胞数を増やすのに最適な培地として、たとえば上述
の培地にさらに１〜３０チ、好ましくは２０チのＦｅ２
を添加した培地を用いる。
〜２５０単位、理想的には１ゴ当り約１００単位のペニ
シリン、１ｉ）１ゴ当９１μｇ〜１００μ９、理想的に
は１ゴ当９１０μＩのｒンタマイシン、＋＋＋）１ ｙ
当り２０〜２５０μ１１理想的には１００μＪのストレ
プトマイシン、１ｖ）１−当り約１００〜１０００μＩ
、理想的には１ゴ当シ約３００μＩＯ新鮮Ｌ−グルタミ
ン、Ｖ）１０〜６０７、理想的には２５−のへペス緩衝
液、■１）８〜２０ｍ１へ理想的には１６ｍＭのＮａＨ
ＣＯ３、Ｖｆｉ） ５ ｘ １０−’ 〜５ ｘ １０
−’ ｙｌ 、理想的には５Ｘ１０−５Ｍの２−メルカ
プトエタノールなどを必要に応じて用いることが出来る
。細胞数を増やすのに最適な培地として、たとえば上述
の培地にさらに１〜３０チ、好ましくは２０チのＦｅ２
を添加した培地を用いる。
ＢＣＤＦ産生能を有するヒト細胞の培養は、３５〜３８
℃、Ｐ［（は７．４〜７．０で行う。ヒト細胞の培養時
間は、ｍ１ＩＡが最も多く産生される時間であシ、この
時間は、ＢＣＤＦが産生され始めた時１ｊに相当し、通
常１２〜９６時間である。徒らに培養時間を延ばすと。
℃、Ｐ［（は７．４〜７．０で行う。ヒト細胞の培養時
間は、ｍ１ＩＡが最も多く産生される時間であシ、この
時間は、ＢＣＤＦが産生され始めた時１ｊに相当し、通
常１２〜９６時間である。徒らに培養時間を延ばすと。
生成したｍｌ（ト）人が分解されてしまう。
このようにして得られた細胞よｊ５ＢｃＤＦに対応する
ｍＲＮＡを抽出するには、細胞の楓類を問わず常法によ
って行なえばよい。たとえば、ＮＰ−４０，ＳＤＳ。
ｍＲＮＡを抽出するには、細胞の楓類を問わず常法によ
って行なえばよい。たとえば、ＮＰ−４０，ＳＤＳ。
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００デオキシコール酸などの界面
活性剤を使用するか、ホモブナイブ−や凍結融解などの
物理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完全に破壊
、可溶化する方法を行なう。抽出の際にＲＮａｓａによ
るＲＮＡの分解を防ぐために、抽出液中にＲＮａｓのイ
ンヒビター、たとえばヘノザリン、ポリビニル硫酸、ベ
ントナイト、マカロイド、ジエチルピロカーゴネイト、
バナジウム複合体などを添加しておくのが好ましい。ま
た、場合に応じては、ＢＣＤＦに対応する抗体を用いて
ＢＣＤＦ合成途上のポリゾームを沈降せしめ、これによ
ｐｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出する方法も行なうこ
とができる。
活性剤を使用するか、ホモブナイブ−や凍結融解などの
物理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完全に破壊
、可溶化する方法を行なう。抽出の際にＲＮａｓａによ
るＲＮＡの分解を防ぐために、抽出液中にＲＮａｓのイ
ンヒビター、たとえばヘノザリン、ポリビニル硫酸、ベ
ントナイト、マカロイド、ジエチルピロカーゴネイト、
バナジウム複合体などを添加しておくのが好ましい。ま
た、場合に応じては、ＢＣＤＦに対応する抗体を用いて
ＢＣＤＦ合成途上のポリゾームを沈降せしめ、これによ
ｐｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出する方法も行なうこ
とができる。
また、本発明のｍＲＮＡの精製についてはオリゴｄＴ−
セルロース、ポＩＪ Ｕ−セファロース、セファロース
２Ｂなどの吸着カラムあるいはパッチ法による精製法、
ＳＤＧ遠心法による分画等によって行なうことができ
る。
セルロース、ポＩＪ Ｕ−セファロース、セファロース
２Ｂなどの吸着カラムあるいはパッチ法による精製法、
ＳＤＧ遠心法による分画等によって行なうことができ
る。
上記の如くして得られたｍＲＮＡが目的とするＢＣＤＦ
に対応するものであることを確認するためには、ｍＲＮ
Ａ ｆ’Ｈｅに翻訳させその生理活性を調べるか、抗体
等を用いてその蛋白を同定する等の方法を行なえばよい
０たとえばｍＲＮＡ ｆ蛋白に翻訳するのによく用いら
れる系であるアフリカツメが１ル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌ
ａｓｖｉｇ ）の卵母細胞にｍＲＮＡ ｔ”注入して翻
訳させる、あるいはＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔａ −１ｙ
ｚｍｔｅ （網状赤血球ライザー） ） Ｗｈｅａｔ
ｇｅｒｍなどの無細胞系で蛋白に翻訳させることが行な
われている。
に対応するものであることを確認するためには、ｍＲＮ
Ａ ｆ’Ｈｅに翻訳させその生理活性を調べるか、抗体
等を用いてその蛋白を同定する等の方法を行なえばよい
０たとえばｍＲＮＡ ｆ蛋白に翻訳するのによく用いら
れる系であるアフリカツメが１ル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌ
ａｓｖｉｇ ）の卵母細胞にｍＲＮＡ ｔ”注入して翻
訳させる、あるいはＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔａ −１ｙ
ｚｍｔｅ （網状赤血球ライザー） ） Ｗｈｅａｔ
ｇｅｒｍなどの無細胞系で蛋白に翻訳させることが行な
われている。
得られたｍＲＮＡより１．このｍＲＮＡの逆転写の産物
としてのＤＮＡ、即ち、ｍＲＮＡに相補性を有するＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ ） ｆ、例えば、以下のようにして得る
。
としてのＤＮＡ、即ち、ｍＲＮＡに相補性を有するＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ ） ｆ、例えば、以下のようにして得る
。
ｍＲＮＡ ｔ−鋳型とし、オリがｄＴｔ−グライマート
シてｄＡＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴＰ 、 ｄＴ
ＴＰの、存在下で逆転写酵素によｊ７ ｍＲＮＡと相補
的な単鎖ｃＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮ
Ａ ｆ分解、除去した後、今度に単鎖ｃＤＮＡ ’ｉ鋳
型にして、差転写酵素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用
いて二重鎖ｃＤＮＡを合成する。
シてｄＡＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴＰ 、 ｄＴ
ＴＰの、存在下で逆転写酵素によｊ７ ｍＲＮＡと相補
的な単鎖ｃＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮ
Ａ ｆ分解、除去した後、今度に単鎖ｃＤＮＡ ’ｉ鋳
型にして、差転写酵素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用
いて二重鎖ｃＤＮＡを合成する。
得られたｃＤＮＡのうちよシ、二重鎖の一方のＤＮＡ鎖
がＬ）ｒ ａ −ＡＩｉ ｐ −Ｖａ ｔ−Ａｌａをコ
ードするＤＮＡとハイブリダイズするものが、本発明の
ＤＮＡである。
がＬ）ｒ ａ −ＡＩｉ ｐ −Ｖａ ｔ−Ａｌａをコ
ードするＤＮＡとハイブリダイズするものが、本発明の
ＤＮＡである。
Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ４−ＡｌａをコードするＤＮＡと
しては虚ＧＡＹ ＧＴＺ ＧＣＺ （ＸはＡ又はＧであ
り、ＹはＴ又はＣであシ、２はＴ又はＡ又はＧ又はＣで
ある）の塩基配列を有するものである。
しては虚ＧＡＹ ＧＴＺ ＧＣＺ （ＸはＡ又はＧであ
り、ＹはＴ又はＣであシ、２はＴ又はＡ又はＧ又はＣで
ある）の塩基配列を有するものである。
このようにして得られたＤＮＡは、ＢＣＤＦ’ｉコード
するＤＮＡを得るためのグローブとして使用することも
できるし、ＢＣＤＦをコードするものであるときは、微
生物細胞内でその遺伝子を発現させてＢＣＤＦを生産す
ることができる。
するＤＮＡを得るためのグローブとして使用することも
できるし、ＢＣＤＦをコードするものであるときは、微
生物細胞内でその遺伝子を発現させてＢＣＤＦを生産す
ることができる。
本発明のＤＮＡを大量に調製する方法を以下に説明する
。
。
単鎖ｅＤＮＡを逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼを用
いて二重鎖ｃＤＮＡとし、次いで得られた二重鎖ＤＮＡ
両端を必要によりエキソヌクレエースで処理し、それぞ
れに適当なりＮＡを接続し、あるいはア＝ ＋７ング
可能な組合せの塩基を複数個重合せしめる。しかる後、
これを微生物ベクターに組込む。組込む方法は、ベクタ
ーを適当な制限酵素で切断し・必要により適轟なリンカ
−またはアニーリング可能な組合せの塩基を複数個重合
せしめる。
いて二重鎖ｃＤＮＡとし、次いで得られた二重鎖ＤＮＡ
両端を必要によりエキソヌクレエースで処理し、それぞ
れに適当なりＮＡを接続し、あるいはア＝ ＋７ング
可能な組合せの塩基を複数個重合せしめる。しかる後、
これを微生物ベクターに組込む。組込む方法は、ベクタ
ーを適当な制限酵素で切断し・必要により適轟なリンカ
−またはアニーリング可能な組合せの塩基を複数個重合
せしめる。
このように加工した二重鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡを混
合し、リガーゼを用いて接続せしめる。
合し、リガーゼを用いて接続せしめる。
得られ六組換えＤＮＡはベクターの宿主微生物に導入す
る。宿主微生物としてはエシェリヒア・コリ等のエシェ
リヒア属の微生物、バチルス・ズブチリス等のバチルス
属の微生物、サツカロミセスやセレビシェ等のサツカロ
ミセス属の微生物などが好適である・ また得られたＤＮＡを発現ベクターの適当な位置に挿入
すれば、ＢＣＤＦを生産することができる。
る。宿主微生物としてはエシェリヒア・コリ等のエシェ
リヒア属の微生物、バチルス・ズブチリス等のバチルス
属の微生物、サツカロミセスやセレビシェ等のサツカロ
ミセス属の微生物などが好適である・ また得られたＤＮＡを発現ベクターの適当な位置に挿入
すれば、ＢＣＤＦを生産することができる。
ＢＣＤＦの活性は以下のようにして測定できる。
人ＢＣＤＦに反応してＩｇＧを産生する人Ｂ細胞株ＣＥ
ＳＳ（Ｋｍ Ｙｏｓｈｉｚａｋｉら、Ｊ、 ｏｆ ｒｒ
ｍ＋ｕｎｏｌｏｇｙ、 １３２ 、２９４８（１９８４
））を用いてＢＣＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性を
測定する検液と６ Ｘ １ ’０３個のＣＥＳＳを２０
０μｔの１０％ＦＣ８を含むＲＰＭ１１６４０培地（１
ゴ当りペニシリン１００単位、ストレプトマイシン１０
０μｙ、ゲンタマイシン１０μＩおよびＮａＨＣＯｓ
１６ ｒｎＭｉを含む）に入れる。この混合物を９６穴
マイクロプレート中で３日間、５ｅｓＣＯ２存在下、３
７℃で培養し、培養上清のＩｇＧ量全酵素免疫測定法に
より、測定する。この条件において最大のＩｇＧ生産量
（最高のＣＥＳＳの反応）の５０％を示すＢＣＤＦの活
性をＩＵ／ｍＪとした。
ＳＳ（Ｋｍ Ｙｏｓｈｉｚａｋｉら、Ｊ、 ｏｆ ｒｒ
ｍ＋ｕｎｏｌｏｇｙ、 １３２ 、２９４８（１９８４
））を用いてＢＣＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性を
測定する検液と６ Ｘ １ ’０３個のＣＥＳＳを２０
０μｔの１０％ＦＣ８を含むＲＰＭ１１６４０培地（１
ゴ当りペニシリン１００単位、ストレプトマイシン１０
０μｙ、ゲンタマイシン１０μＩおよびＮａＨＣＯｓ
１６ ｒｎＭｉを含む）に入れる。この混合物を９６穴
マイクロプレート中で３日間、５ｅｓＣＯ２存在下、３
７℃で培養し、培養上清のＩｇＧ量全酵素免疫測定法に
より、測定する。この条件において最大のＩｇＧ生産量
（最高のＣＥＳＳの反応）の５０％を示すＢＣＤＦの活
性をＩＵ／ｍＪとした。
実施例】
オリゴヌクレオチドの合成はアプライドバイオシステム
社１ＤＮＡシンセサイザー・モデル３８０人を用い、シ
リカゲルを固相担体とし、亜すン酸トリエステル法金用
いてヌクレオチド結合反応全行ったＯ 常法により保護基金除去した後、Ｃ４８逆相カラム高速
液体クロマトグラフィーにてアセトニトリル・グラツエ
ン）Ｔｈ用いて、目的のオリゴヌクレオチドを精製した
。
社１ＤＮＡシンセサイザー・モデル３８０人を用い、シ
リカゲルを固相担体とし、亜すン酸トリエステル法金用
いてヌクレオチド結合反応全行ったＯ 常法により保護基金除去した後、Ｃ４８逆相カラム高速
液体クロマトグラフィーにてアセトニトリル・グラツエ
ン）Ｔｈ用いて、目的のオリゴヌクレオチドを精製した
。
以上のようにして、以下の（ＡＡＸ ＧＡＹ ＧＴＺ
ＧＣＺＧＣＩで示される６４種のＤＮＡ混合物を得た。
ＧＣＺＧＣＩで示される６４種のＤＮＡ混合物を得た。
実施例２
２）容プラスチックローラー培養器（ファルコ＝ｙ＋
３０２７）（以下ローラーと称する）中の１ノの２０％
ＦＣ８含有ＲＰＭ１１６４０培地（２ｍＭグルタミン、
５Ｘ１０−５Ｍ ２ＭＫ、 １００単位／ ｍｌ ヘ＝
シリン、１００μｍ１７ゴストレプトマイシン、２０
μ９／ゴダンタマイシン、１６ ｍＭ ＮａＨＣＯ３’
に含有） Ｋ ２Ｘ１０”／ゴ細胞数にｖ’ｒ−１を接
種し、 ８ ｒｐｍで回転させつつ３日間、３７℃で培
養した。
３０２７）（以下ローラーと称する）中の１ノの２０％
ＦＣ８含有ＲＰＭ１１６４０培地（２ｍＭグルタミン、
５Ｘ１０−５Ｍ ２ＭＫ、 １００単位／ ｍｌ ヘ＝
シリン、１００μｍ１７ゴストレプトマイシン、２０
μ９／ゴダンタマイシン、１６ ｍＭ ＮａＨＣＯ３’
に含有） Ｋ ２Ｘ１０”／ゴ細胞数にｖ’ｒ−１を接
種し、 ８ ｒｐｍで回転させつつ３日間、３７℃で培
養した。
こうして集めたＶＴ−１細胞６Ｘ１０’個より、平野俊
夫免疫実験操作法、Ｐ、３６５５（１９８２）の方法に
従いＲＮＡ ２９■を抽出、これよシオリゴ（ｄＴ）セ
ルロースカラムを用いｍＲＮＡ ５５６μｉを得た。こ
のｍ ＲＮ Ａを蔗糖密度勾配遠心法で分画し、各分画
を鋳型に逆転写酵素を用い単鎖ｃ ＤＮＡを得た。
夫免疫実験操作法、Ｐ、３６５５（１９８２）の方法に
従いＲＮＡ ２９■を抽出、これよシオリゴ（ｄＴ）セ
ルロースカラムを用いｍＲＮＡ ５５６μｉを得た。こ
のｍ ＲＮ Ａを蔗糖密度勾配遠心法で分画し、各分画
を鋳型に逆転写酵素を用い単鎖ｃ ＤＮＡを得た。
一方、実施例１に示した合成りＮＡ混合物５０ ｐｍｏ
ｌｓａをγ−３２Ｐ−ＡＴＰ １００ μ（！ｌとＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ６単位を用いてリン酸化した
・これをプローブに各単鎖ｃ ＤＮＡのサデンハイプリ
ダイゼーシ、ンを５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、、Ｊ、Ｍ
ｏｌ、Ｂｉｏｌ、１９８ 、５０３（１９７５）の方法
で行ったところ、７ｓから２８ｓ。
ｌｓａをγ−３２Ｐ−ＡＴＰ １００ μ（！ｌとＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ６単位を用いてリン酸化した
・これをプローブに各単鎖ｃ ＤＮＡのサデンハイプリ
ダイゼーシ、ンを５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、、Ｊ、Ｍ
ｏｌ、Ｂｉｏｌ、１９８ 、５０３（１９７５）の方法
で行ったところ、７ｓから２８ｓ。
特に１３８付近のｍＲＮＡ分画よシ得た単鎖ｅ ＤＮＡ
が合成りＮＡ混合物とハイブリダイズした。この１３８
付近のハイブリダイズした分画のｍＲＮＡ １０μＩを
もとにＬａｎｄ、Ｈ，、Ｎｕｅｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｓｓ、、 ９ ｒ２２５１（１９８１）の方法に従い
、二重鎖ＤＮＡ ２μＩを得た。この二重鎖ＤＮＡを、
両３′端にポリＣ鎖を付加した後、ｐｓｔ Ｉサイトに
ポリＧを付加したプラスミドｐＢＲ３２２に７ニーリン
グし、Ｅ、ｃｏｌｉ、Ｍ０１０６１株に導入した。得ら
れた形質転換株約６０００株に対し、合成りＮＡ混合物
をグローブにＧｒｕｎａｔｅｉｎ。
が合成りＮＡ混合物とハイブリダイズした。この１３８
付近のハイブリダイズした分画のｍＲＮＡ １０μＩを
もとにＬａｎｄ、Ｈ，、Ｎｕｅｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｓｓ、、 ９ ｒ２２５１（１９８１）の方法に従い
、二重鎖ＤＮＡ ２μＩを得た。この二重鎖ＤＮＡを、
両３′端にポリＣ鎖を付加した後、ｐｓｔ Ｉサイトに
ポリＧを付加したプラスミドｐＢＲ３２２に７ニーリン
グし、Ｅ、ｃｏｌｉ、Ｍ０１０６１株に導入した。得ら
れた形質転換株約６０００株に対し、合成りＮＡ混合物
をグローブにＧｒｕｎａｔｅｉｎ。
Ｍ、ら、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ）ｒｍｏｌｏ
ｇｙ、 ６８．３７９（１９７９）の方法でコロニーハ
イブリダイゼーションを行ったところ、合成りＮＡ混合
物とノーイプリダイズする株が認められた。
ｇｙ、 ６８．３７９（１９７９）の方法でコロニーハ
イブリダイゼーションを行ったところ、合成りＮＡ混合
物とノーイプリダイズする株が認められた。
同株のプラスミドを抽出し、制限酵素Ｐａｔ １で切断
後ｃＤＮＡインサートを７ガロース電気泳動にてｐＢＲ
３２２と分離した。このｅ ＤＮＡのサデンハイプリダ
イゼーシ、ンを行ったところ、合成りＮＡ混合物とハイ
ブリダイズした。
後ｃＤＮＡインサートを７ガロース電気泳動にてｐＢＲ
３２２と分離した。このｅ ＤＮＡのサデンハイプリダ
イゼーシ、ンを行ったところ、合成りＮＡ混合物とハイ
ブリダイズした。
Claims (2)
- （１）Ｂ細胞分化因子産生能を有するヒト細胞により生
産されるメッセンジャーＲＮＡに二重鎖の一方のＤＮＡ
鎖が相補性を有し且つ上記ヒト細胞が生産するＢ細胞分
化因子蛋白の部分アミノ酸配列であるＬｙｓ−Ａｓｐ−
Ｖａｌ−ＡｌａをコードするＤＮＡを分子中に有するＤ
ＮＡ。 - （２）塩基配列ＡＡＸＧＡＹＧＴＺＧＣＺを分子中に有
する特許請求の範囲第（１）項記載のＤＮＡ。 但しＸはＡ又はＧであり、ＹはＴ又はＣであり、ＺはＴ
又はＣ又はＧ又はＡである。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60086284A JPS61246197A (ja) | 1985-04-24 | 1985-04-24 | Ｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60086284A JPS61246197A (ja) | 1985-04-24 | 1985-04-24 | Ｄｎａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61246197A true JPS61246197A (ja) | 1986-11-01 |
Family
ID=13882529
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60086284A Pending JPS61246197A (ja) | 1985-04-24 | 1985-04-24 | Ｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61246197A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0645452A1 (en) * | 1985-10-14 | 1995-03-29 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Human interferon-beta 2A and interfeon-beta 2B, vectors containing genes coding for said interferons, cell lines producing same and use of said interferons as pharmaceuticals |
| US5670373A (en) * | 1988-01-22 | 1997-09-23 | Kishimoto; Tadamitsu | Antibody to human interleukin-6 receptor |
| US6284237B1 (en) | 1986-07-08 | 2001-09-04 | Steven C. Clark | Methods of treatment using IL-6 |
-
1985
- 1985-04-24 JP JP60086284A patent/JPS61246197A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NUCLEIC ACIDS RES.=1984 * |
| PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A=1983 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0645452A1 (en) * | 1985-10-14 | 1995-03-29 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Human interferon-beta 2A and interfeon-beta 2B, vectors containing genes coding for said interferons, cell lines producing same and use of said interferons as pharmaceuticals |
| US6284237B1 (en) | 1986-07-08 | 2001-09-04 | Steven C. Clark | Methods of treatment using IL-6 |
| US5670373A (en) * | 1988-01-22 | 1997-09-23 | Kishimoto; Tadamitsu | Antibody to human interleukin-6 receptor |
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