DE69026440T2 - Für M-CSF kodierendes Gen und dazu gehörende rekombinante Systeme - Google Patents
Für M-CSF kodierendes Gen und dazu gehörende rekombinante SystemeInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das für ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität eines Monocyten Makrophagenkolonie stimulierenden Faktors (im folgenden mit M-CSF bezeichnet) aufweist, sowie ein dazu komplementäres Gen. Die Erfindung betrifft auch die Clonierung und die Expression dieses Gens.
- Darüber hinaus betrifft die Erfindung einen Vektor zum Exprimieren des M-CSF, der eine ein im Harn ausgeschiedenes human M-CSF-Protein codierende DNS-Sequenz und eine in einem Wirt, vorzugsweise einer tierischen Zelle funktionierenden Promotor und eine Enhancersequenz enthält, und ein Verfahren zur Erzeugung dieses im Harn ausgeschiedenen human M-CSF-Proteins unter Verwendung eines Transformanten, der den Expressionsvektor für den M-CSF trägt.
- Weiterhin betrifft die Erfindung ein Polypeptid mit M-CSF-Aktivität und einer Teilaminosäuresequenz des C-terminalen Endes des natürlich vorkommenden harngängigen human M-CSFs und dessen Herstellung unter Einsatz der Verfahren der Gentechnologie. Insbesondere betrifft die Erfindung die effiziente Herstellung eines M-CSFs natürlicher Art unter Verwendung eines E.Coli-Expressionssystems.
- Es steht zu erwarten, daß M-CSF als medizinische Anwendung bei der Behandlung von durch die Verabreichung von Krebsmitteln verursachten Leukopänien und von Nebenwirkungen der Strahlentherapie, verschiedenen Infektionskrankheiten, Tumoren, der Hypercholesterinämie, der Arteriosklerose und ähnlichen medizinischen Anwendungen, indem es die Leukozyten nach einer Knochenmarkstransplantation erhöht, sowie auch bei der Diagnose der Leukopänie, der hyperplastischen Anämie und dergleichen nützlich sein könnte (K. Motoyoshi et al., Jap.J.Med. 21, 187 (1982)).
- Es wird behauptet, daß CSFs natürliche Materialien darstellen, die myeloleukozytotische Vorläufer mittels Differenzierung zu Granulozyten oder Makrophagen reifen lassen.
- CSF ist außerdem ein wesentlicher Faktor für die Differenzierung und Reifung von myeloleukozytotischen Vorläufern, damit diese bei in vitro-Kultivierungen von Knochenmark Kolonien bilden (D.H. Pluznik & H. Sachs, J.Cell Physiol. 66, 319 (1965) und T.R. Bradley & D. Metcalf, Aust.J.Exp.Biol.Med. 44, 287 (1966)).
- Die CSF stellen eine Gruppe von Glycoproteinen dar, die von verschiedensten tierischen Zellen und Geweben erzeugt und nach ihren in-vitro-Funktionen und der Form ihrer Kolonien in vier Subklassen eingeteilt werden, wobei die Kolonien aus myeloleukozytotischen Vorläufern in einem halbfesten Kulturmedium ausdifferenziert und reifen gelassen werden: der Granulozytenkolonie stimulierende Faktor (G-CSF), der Monozyten Makrophagenkolonie stimulierende Faktor (M-CSF), der Granulozyten Makrophagenkolonie stimulierende Faktor (GM-CSF) der Granulozytenkolonien, Makrophagenkolonien oder gemischte Kolonien hervorbringt, und die multi-CSF (I1-3), der auf embryonale myeloleukozytotische Vorläufer einwirkt.
- Berichten zufolge sind menschlicher Urin (S.K. Das & E.R. Stanley, J.Biol.Chem. 257, 13679 (1982), ein mit der Bauchspeicheldrüsentumorzellinie MIA-PaCa-2 konditioniertes Medium (J.H. Shien et al., Archives Biochem.Biophys. 253, 205 (1987)) usw. Quellen für dem Monozyten Makrophagen stimulierenden Faktor des Menschen.
- An clonierten Genen für den vom Menschen stammenden Monozyten Makrophagen stimulierenden Faktor sind eine etwa 1,6 kB cDNA, die aus MIA-PaCa-Zellen stammt, (E.S. Kawasaki et al, Science 230, 291 (1985)) eine cDNA von etwa 4,0 kB die aus einer mit SV-40 transformierten Trophoblastenzellinie stammt, (G.G. Wong et al., Science 235, 1504 (1987) und WO 87/06 954) und eine cDNA, die eine 438 Aminosäuren entsprechende Translationsregion aufweist, jedoch ohne Offenbarung eines 3'- nichttranslatierten Bereichs, beschrieben worden.
- Außerdem offenbart die japanische Offenlegungsschrift Nr.1-104176 eine aus der human T-Zellinie AGR-ON (ATCC CRL 8199) abgeleitete cDNA von 2,5 kBp. Ein für human M-CSF codierende cDNA wird auch in der japanischen Offenlegungsschrift Nr.1-501283 offenbart.
- Auf einige Nachteile wie Unsicherheit bezüglich der C-terminalen Aminosäuresequenz des rekombinanten M-CSF sowie Aminosäuredeletionen derselben wurde jedoch bereits in der japanischen OS 62-501607, der WO 87/06 954, der japanischen OS 63- 68095, von Kobayashi, in: Jisedai Symposium Biotechnology Yokoushu (6th), S.79 (1988) und von Takahashi et al., Proc.Jp.Soc.Immunol., Bd. 17, S.251 (1987)) hingewiesen.
- Bei der Herstellung von M-CSF aus Urin und einem mit Hilfe von Zellen konditionierten Medium gibt es aufgrund des extrem niedrigen Gehalts an M-CSF, sowie wegen der erforderlichen großen Mengen an Rohmaterial und dergleichen Probleme.
- Es ist außerordentlich schwierig große Mengen Urin zu erhalten.
- Es ist aufgrund des niedrigen Gehalts außerdem teuer und schwierig, M-CSF aus Urin zu isolieren und aufzureinigen.
- Im Fall von Zellkulturen ist die Produktion außerordentlich klein; im Kulturmedium werden kostspielige Nährstoffquellen (z.B. fetales Kalbsserum) benötigt. Auch ist es schwierig, die Kultur sowie die Produktivität der gewünschten Produkte in den kultivierten Zellen optimal zu halten.
- Deshalb kann keine der beiden Methoden eine dauerhafte Lösung (z.B. in bezug auf Reinheit und Wirtschaftlichkeit der M-CSF-Herstellung) sein.
- De facto ist berichtet worden, daß harngängiges human M-CSF nach der Aufreinigung aus Urin und der Aminosäuresequenzierung eines von zwei Glycoproteinen darstellt, die 214 bzw 238 Aminosäure aufweisen (die japanischen OS 64-22899 und 64- 34998 sowie Y.Hirai, BIO medica 3, 1023 (1988)); homogene M-CSF-Produkte sind bislang jedoch noch nicht erhalten worden.
- Eine weitere Methode zum Erhalt einer großen Menge an M-CSF ist die Technik der Genmanipulation.
- Ein für M-CSF codierendes Gen ist bereits in einen Vektor insertiert und der Vektor in Bakterienzellen, Pilzzellen, Hefen oder tierischen Zellen repliziert, transcribiert und translatiert worden. Kawasaki et al. (wie oben) beschrieben die clonierte 1,6 kB cDNA, offenbarten jedoch keine Proliferationsdaten für menschliche Knochenmarkszellen.
- Darüber hinaus wurde von Cerretti et al. (Advances in Leukemia & Lymphoma, S.238 (1987), Alan R. Liss Inc.) beschrieben, daß von mit der 1,6 kB cDNA aus MIA- PaCa-2-Zellen transformierten Hefen oder Nierenzellen von Affen erzeugtes M-CSF auf Knochenmarkszellen von Affen, nicht jedoch auf Zellen von Menschen wirkt. Cerretti et al. (Mol.Immunol. 25, 761 (1988)) offenbaren sogar, daß drei in Nierenzellen von Affen exprimierte M-CSFs (diejenigen, die von cDNAs abgeleitet wurden, die jeweils für 256, 438 bzw 554 Aminosäuren codieren) bei proliferierenden human Knochenmarkszellen inaktiv sind.
- Andererseits offenbaren Wong et al. (Science 235, 1504 (1987)), daß ein M-CSF, das mit Hilfe der Expression einer 4,0 kB cDNA in Nierenzellen vom Affen erzeugt wurde, auf menschliche Knochenmarkszellen wirkt. Es besteht daher ein Widerspruch zwischen den Brichten von Wong und Cerretti.
- Um Tests auf die Wirkung von M-CSF auf menschliche Knochenmarkszellen einzuleiten und durchzuführen, gefolgt von Tierversuchen und klinischen Tests als Voraussetzungen der medizinischen Verwendung, ist es daher immer noch wichtig, die Hilfsmittel und Verfahren für dessen Aufreinigung bis zur Homogenität in signifikanten Mengen zur Verfügung zu stellen.
- Es ist weiterhin erforderlich einen neues M-CSF-Gen zu erhalten.
- Außerdem wird angenommen, daß in der Natur vorkommendes harngängiges human M-CSF für praktische Anwendungen wünschenswert wäre.
- Auch sollte es wertvoll und nützlich sein, unter Einsatz von E.Coli-Expressionssystemen, recombinantes M-CSF, insbesondere vom im Urin ausgeschiedenen Typ, zu erzeugen.
- Es wurde nun gefunden, daß es ein neues M-CSF codierendes Gen gibt. Im Ergebnis wurde die Erfindung mit Hilfe intensiver Forschungen erzielt.
- Erfindungsgemäß wurde auch gefunden, daß sich die effiziente Produktion eines Glycoproteins, das den harngängigen human M-CSF entsprechende biologische Aktivitäten und eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen mit derjenigen des harngängigen human M-CSF identisch ist, aufweist, durch die Verwendung dieses Gens in gentechnologischen Verfahren erzielen läßt.
- Erfindungsgemäß wurde weiterhin gefunden, daß das Expressionssystem dieses Gens oder von dessen Derivat in Escherichia Coli bei der Erzeugung des M-CSF-Proteins von Vorteil ist.
- Dementsprechend wird erfindungsgemäß eine DNS, die ausschließlich ein Polypeptid mit M-CSF-Aktivität aus den Aminosäure 1 - 522 der Fig.3 codiert, sowie eine dazu komplemetäre DNS derselben Länge zur Verfügung gestellt.
- Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung weist die das Polypeptid codierende DNS die Basensequenz der in Fig.2 gezeigten Formel auf.
- Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung hat die das Polypeptid codierende DNS die in Fig.2 gezeigte Basensequenz.
- Nach einer weiteren Ausführungsform enthält die das Polypeptid codierende DNS eine Basensequenz der in Fig. 1 gezeigten Formel oder einen Teil derselben.
- Erfindungsgemäß wird außerdem ein Verfahren zur Herstellung des Gens bereitgestellt, bei dem man mRNS aus einer ausgewählten monozytotischen human Zellinie isoliert und das für ein Polypeptid mit M-CSF-Aktivität codierende Gen aus der mRNS herstellt.
- Erfindungsgemäß wird auch ein Transformant zur Verfügung gestellt, der das Gen und ein das Gen tragendes aktives Plasmid (oder einen Vektor) enthält.
- Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Expressionsvektor für human M-CSF zur Verfügung gestellt, der eine DNSsequenz, die eine der Aminosäuresequenzen der Fig.10 codiert, eine einen in einer tierischen Zelle aktiven Promotor enthaltende DNSsequenz und eine Enhancersequenz enthält. Außerdem wird ein Verfahren zur Herstellung von harngängigem human M-CSF zur Verfügung gestellt, bei dem man die tierische Zelle mit dem Exprtessionsvektor transformiert und den Transformanten zur Gewinnung von M-CSF aus der Kultur kultiviert. Darüber hinaus wird noch ein Polypeptid mit M-CSF- Aktivität zur Verfügung gestellt, das aus einer der Aminosäuresequenzen der Fig.10 besteht, in dem X Ser bedeutet.
- Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Polypeptid mit M-CSF-Aktivität, das aus einer der Aminosäuresequenzen der Fig.20 oder 21 besteht, eine für diese Peptide codierende DNSsequenz, ein replizierbarer Clonierungsvektor, der jene DNSsequenz und ein in einem Mikroorganismus, insbesondere E. Coli, funktionierendes Replikon enthält, ein Expressionssystem, in dem die DNSsequenz funktional mit einer geeigneten Kontrollsequenz verknüpft ist, und ein Mikroorganismus als Transformant bereitgestellt, der mit dem Expressionssystem transformiert worden ist.
- Erfindungsgemäß wird außerdem ein Verfahren zur Herstellung von human M-CSF bereitgestellt, bei dem man einen ein Plasmid tragenden Transformanten (Mikroorganismus) kultiviert, wobei das Plasmid ein human M-CSF-Monomerprotein exprimieren kann, das Monomerprotein aus der Kultur gewinnt und das Monomer neu zu einem biologisch aktiven human M-CSF-Homodimerprotein faltet.
- Fig.1 zeigt die Basensequenz der erfindungsgemäßen cDNS.
- Fig.2 zeigt eine Basensequenz im translatierbaren Bereich des erfindungsgemäßen cDNS-Fragments.
- Fig.3 zeigt eine Aminosäuresequenz des Polypeptids, das das erfindungsgemäße cDNS-Fragment codiert.
- Fig.4 zeigt eine schematische Darstellung zur Konstruktion des Plasmids pBSIICSF, welches das eine Aminosäuresequenz eine Peptids mit M-CSF-Aktivität codierende Gen trägt, wie in Beispiel 5 beschrieben. MCS: Multicloning Site (= Mehrfachclonierungsstelle).
- Fig.5 zeigt eine schematische Darstellung zur Rekonstruktion von pBSS und pBSL aus pBSII CSF.
- Fig.6 zeigt ein ausgestelltes Diagramm einer wie in Beispiel 6 erhaltenen Restriktionskarte.
- Fig.7 zeigt schematisch eine Markierung der Restriktionsorte des Expressionsvektors pSVL-CSF, der das Gen trägt, welches wie in Beispiel 7 beschrieben die Aminosäuresequenz des Polypeptids mit M-CSF-Aktivität codiert.
- Fig.8 enthält eine schematische Darstellung des Expressionsvektors pSVL CSF, der das Gen trägt, das wie in Beispiel 7 beschrieben eine Aminosäuresequenz des Polypeptids mit M-CSF-Aktivität codiert.
- Der Pfeil gibt die Transcriptionsrichtung des Promotors an.
- Fig.9 enthält eine schematische Darstellung zur Konstruktion des Expressionsvektors pSV2*-hCSF1-mdhfr, der das Gen trägt, das eine Aminosäuresequenz des Polypeptids mit M-CSF-Aktivität wie in Beispiel 8 beschrieben trägt.
- Der Pfeil gibt die Transcriptionsrichtung des Promoters an.
- Fig.10 zeigt eine Aminosäuresequenz eines harngängigen human M-CSF.
- Fig.11 stellt eine schematische Zeichnung zur Konstruktion der Plasmide pSVL CSF214 bzw. pSVL CSF 238 dar.
- Fig.12 enthält eine schematische Darstellung zur Konstruktion des Plasmids pBSSER.
- Fig.13 stellt eine schematische Zeichnung zur Konstruktion der Plasmide pSVL CSF 214s bzw. pSVL CSF 238s dar.
- Fig.14 stellt eine schematische Zeichnung zur Konstruktion der Plasmide pSV2d CSF 214 bzw. pSV2d CSF 238 dar.
- Fig.15 enthält eine schematische Darstellung zur Konstruktion des Expressionsvektors pUC-CSF 214.
- Fig.16 enthält eine schematische Darstellung zur Konstruktion von pUC-CSF 214.
- Fig.17a enthält eine schematische Darstellung zur Konstruktion des Expressionsvektors pPLN CSF 214 für mutiertes M-CSF.
- Fig.17b enthält eine schematische Darstellung zur Konstruktion des Expressionsvektors pPLN CSF 214Δ3 für mutiertes M-CSF.
- Fig.18 zeigt eine schematische Darstellung zur Konstruktion von pUC-CSF238.
- Fig. 19a enthält eine schematische Darstellung zur Konstruktion des Expressionsvektors pPLN CSF 238 für mutiertes M-CSF.
- Fig. 19b enthält eine schematische Darstellung zur Konstruktion des Expressionsvektors pPLN CSF 238Δ3 für mutiertes M-CSF.
- Die Fig.20 und 21 zeigen je eine aus E.Coli erhaltene M-CSF-Aminosäuresequenz.
- Die Erfindung betrifft neue Gene, die Polypeptide mit M-CSF-Aktivität codieren, sowie deren Herstellung. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Gen, das durch Isolierung von Boten-RNS (mRNS) aus menschlichen monozytotischen Zellen, die mit Zellstimulanzien angeregt wurden, und Herstellung des Gens aus der mRNS mittels Methoden und Verfahren der Gentechnologie erhalten wird.
- Erfindungsgemäß wird die Herstellung neuer Proteine mit M-CSF-Activität, die Transformation verschiedener Wirtszellen sowie Maßnahmen zum Testen auf damit verbundene Gene, physiologisch aktive Produkte und dergleichen unter Verwendung dieses Gens ermöglicht. Das erfindungsgemäße Gen wird vorzugsweise über die folgenden Schritte hergestellt:
- (1) humane monozytotische Zellen werden propagiert und mit Stimulanzien angeregt.
- (2) aus den stimulierten Zellen wird die mRNS isoliert und unter Verwendung dieser mRNS als Template die komplementäre cDNS erzeugt.
- (3) unter Verwendung spezifischer Sonden werden cDNS-Banken durchgetestet, um cDNS's zu selektieren, die Produkte mit M-CSF-Aktivität codieren.
- (4) die Basensequenz der selektierten cDNS wird bestimmt.
- (5) die das Produkt mit M-CSF-Aktivität codierende cDNS wird verwendet, um sie zur Bereitstellung von rekombinanten Vektoren in geeignete Vektoren zu insertieren.
- (6) zum Erhalt von Transformanten werden Wirtszellen mit dem Vektor transformiert, die unter geeigneten Bedingungen behandelt werden, um biologisch und physiologisch aktive M-CSF-Produkte bereitzustellen.
- Das erfindungsgemäße Gen wird aus mRNS hergestellt, die aus menschlichen monozytotischen Zellen isoliert wurde; ist das Gen jedoch einmal auf diese Weise erhalten und seine Sequenz bestimmt worden, kann es unabhängig von der ursprünglichen Quelle aus beliebigen Zellen erhalten werden.
- Die erfindungsgemäß als mRNS-Quellen verwendeten monozytotischen Zellen umfassen Monozyten, die mittels verschiedener Verfahren aus menschlichem Blut isoliert werden, Monozyten, die mit Hilfe eines geeigneten Induktors aus einer Knochenmarksvorläuferzelle abgeleitet wurden, eine menschliche subakute lymphomatiode histozytische Zelle, sowie eine akut promyelotische menschliche Leukämiezelle oder eine akut myelomonozytotische Leukämiezelle. Bei den Leukämiezellen handelt es sich vorzugsweise um etablierte Zellinien und noch stärker bevorzugt um diejenigen davon, die sich ausgezeichnet propagieren lassen, beispielsweise U937, HL-60, RC2a usw..
- U937, die eine menschliche monozytotische Zellinie darstellt, ist besonders bevorzugt.
- Die zur Differenzierung der Knochenmarksvorläufer zu Monozyten verwendeten Induktoren können verschiedene Kolonie stimulierenden Faktoren wie GM-CSF und M- CSF sowie das von stimulierten Lymphozyten abgeleitete IL3 und dergleichen darstellen.
- Bei der Isolierung der erfindungsgemäß verwendeten mRNS aus menschlichen monozytotischen Zellen ist die Vorbehandlung der Zellen mit verschiedenen Modulatoren der Immunantwort (Stimulanzien) bevorzugt. Derartige Modulatoren der Immunantwort (Stimulanzien) können sein: Mitogene, somatische Komponenten von Bakterien und physiologisch aktive Substanzen wie Lipopolysaccharide (LPS), BCG (Bacillus Calmette-Guerin), aufgereinigte Proteinderivate des Tuberkulins (PPD), Phorbol-12-myristat- 13-acetat (PMA), Concavalin A (Con A), Phytohämagglutinin (PHA), das Mitogen der Kermesbeere (Pokeweed Mitogen, PWM), Corynebacterium parvum (CP), Corynebacterium granulosum, Levamisol, Lentinan, Interferon, Lymphokine, Hormone der Thymusdrüse, ein hämolytischer Streptococcus z.B. Picibanil (OK 432) usw.. Darüber hinaus können diese Modulatoren der Immunantwort Cycloheximid und dergleichen einschließen. Die Modulatoren der Immunantwort können allein oder wahlweise in Kombination eingesetzt werden. Stärker bevorzugt handelt es sich bei den Modulatoren der Immunantwort um Mitogene wie Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA), Concavalin A (ConA) und dergleichen und/oder Cycloheximid usw.. Die Stimulation von menschlichen monocytotischen Zellen durch diese Modulatoren der Immunantwort kann entweder vor der Isolierung der mRNS oder während des Propagierens menschlicher monozytotischer Zellen, insbesondere einer menschlichen monozytotischen Zellinie erfolgen.
- Erfindungsgemäß erfolgt die Kultivierung einer menschlichen monozytotischen Zelle vor dem Ernten der mRNS vorzugsweise 0 - 30 Std. unter Einsatz von 0 - 200 ng/ml PMA, gefolgt von 0 - 20 Std. vorzugsweise unter 0 - 200 µg/ml Cycloheximid.
- Stärker bevorzugt erfolgt das Kultivieren der menschlichen monozytotischen Zellinie U 937 vor dem Ernten der mRNS in einem Basismedium wie Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (D-MEM), RPMI-1640, ASF 103, BME Hanks, BME Earle, Dico T Medium und dergleichen, ggf. ergänzt mit Serum, beispielsweise fetalem Kalbsserum, Serum von neugeborenen Rindern, menschlichem Serum, Kalbsserum und ähnlichem, Wachstumsfaktoren z.B. human Interleukin 2, γ-Interferon, Somatomedin C, human EGF und ähnlichem sowie verschiedenen Faktoren beispielsweise Transferrin, Interleukin I, CSF, Albumin, GM-CSF und ähnlichem, solange bis die Zelllkonzentration von 1 x 10³ bis 1 x 10&sup7; Zellen/ml, vorzugsweise 1 x 10&sup5; bis 1 x 10&sup7; Zellen/ml erreicht, gefolgt von 0,10 bis 30 Stunden, vorzugsweise 0,25 bis 20 Stunden in Anwesenheit eines Mitogens wie PMA in einer Bndkonzentration von 0 - 200 mg/ml und anschließend weiteren 0,10 bis 24 Stunden, vorzugsweise 0,25 bis 12 Stunden in Anwesenheit von Cycloheximid in einer Endkonzentration von 0 - 100 µg/ml.
- Die auf diese Weise erhaltenen Zellen werden mittels Zentrifugation aus dem von den Zellen konditionierten Medium gewonnen. Die so erhaltenen Zellen können weiterhin durch wiederholtes Suspendieren derselben in einer gepufferten Kochsalzlösung u.ä. und anschließende Zentrifugation 2 bis 10 mal gewaschen werden.
- Die obigen Kulturbedingungen lassen sich nach einem der beiden folgenden Verfahren bestimmen, nachdem die Zellen unter verschiedenen Bedingungen kultiviert wurden:
- (1) Die gewonnenen Zellen werden lysiert und der Punkthybridisierung unterworfen (B.A.White & F.C. Bancroft, J.Biol.Chem. 257, 8569 (1982)).
- (2) Aus den Zellen erhaltene mRNS-Fraktionen werden in Proteinsynthesesystemen wie Oozyten von Xenopus Laevis, einem Reticulozytenlysat oder zellfreien Weizenkeim-Rattenleber-Systemen translatiert (cf. Akira Kaji et al., Seigaku Jitsuken Kouza (herausgegeben von Nippon Sikagakukai, Bd.7, Tanpakushitu No Seigousei (I), Kap.1, Tokyo Kagaku Doujin (1975)); das erhaltene Protein wird direkt auf seine biologische Aktivität hin untersucht oder in einem Immunoassay nachgeweisen oder ähnliches.
- Erfindungsgemäß werden vorzugsweise U937-Zellen eingesetzt und in RPMI-1640 (als Basismedium), das fetales Kalbsserum (fetal calf serum = FCS) in einer Endkonzentration von 10 % enthält, in einem 10 l-Glasfermenter solange kultiviert, bis die Dichte an U937-Zellen 1 x 10&sup6; Zellen/ml erreicht; danach wird die Kultivierung über 6 Stunden, nach Zugabe von PMA bis zur Endkonzentration von 50 ng/ml, und dann nach Zugabe von Cycloheximid bis zur Endkonzentration von 20 µg/ml fortgesetzt und die Zellen durch Zentrifugation aus der Brühe erhalten.
- Das erfindungsgemäß verwendbare Basismedium kann geeigneterweise aus der Gruppe ausgewählt werden, die Basismedien, die eine oder mehrere Komponenten enthalten, die aus der aus Zuckern, Aminosäuren, Vitaminen, Hormonen, Proteinen, Antibiotika, Wachstumsfaktoren, Nukleinsäuren und deren Vorläufern, anorganischen Salzen, Schwermetallen und Säuren und dergleichen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, sowie mit Tierseren und dergleichen supplementierte Basismedien umfaßt. Diese Basismedien schließen wie oben erwähnt die im Handel erhältlichen Medien RPMI-1640, MEM, Dulbecco's modifiziertes Medium und ähnliche ein.
- Die Tierseren umfassen wie bereits erwähnt fetales Kalbsserum, Serum von neugeborenen Rindern, Rinder-, Pferde-, Ziegen-, Schweine-, Kaninchen- und Hühnerserum sowie menschliches Serum und ähnliches. Solche Seren können bei geeigneter Zugabe zum Medium vorzugsweise in einer Endkonzentration von bis zu 20 % eingesetzt werden.
- Geeignete Basismedien, Seren und deren Konzentrationen, Zelldichten, Kultivierungsdauern, geeignete Modulatoren der Immunantwort (Stimulanzien) und deren Konzentrationen sowie auch geeignete Kultivierungsapparate und dergleichen können eingesetzt werden, indem man sie je nach Zweck aus den üblicherweise eingesetzten auswählt, ohne auf diese beschränkt zu sein.
- Die auf diese Weise isolierten monozytotischen Zellen werden im Verlauf einer Periode steigender Produktion eines M-CSF-aktiven Produkts teilweise oder vollständig aufgebrochen, um ihr Cytoplasma zu solubilisieren; die Extraktion der gesamten RNS erfolgt durch Fraktionierung des Cytoplasmas.
- Die Verfahren zum Aufbrechen und Solubilisieren von Zellen schließen chemische und physikalische Behandlungen ein, z.B. geeignete oberflächenaktive Mittel, Homogenisatoren oder Frier-Tau-Zyklen nutzende Verfahren und dergleichen.
- Die Fraktionierung des Cytoplasmas umfaßt eine Extraktion mit Phenol, Chloroform u.ä., ein Fällmittel wie Ammoniumsulfdat einsetzende Verfahren, die Dichtegradientenzentrifugation mit Saccharose oder CsCl und dergleichen.
- Während der Behandlungen kann zum Inhibieren der RNase ein RNase-Inhibitor zugesetzt werden.
- Stärker bevorzugt sind folgende Verfahren:
- Die monozytotischen Zellen werden nach dem Guanidin-Thiocyanat-Verfahren aufgebrochen, beispielsweise dem von J.M. Chirgwin et al. in Biochemistry 18, 5294 (1979) beschriebenen Verfahren, anschließend mit einer CsCl-Dichtegradientenzentrifugation zum Erhalt einer Gesamt-RNS-Fraktion behandelt, die unter Verwendung einer Oligo- (dT)-Cellulosesäule, einer Poly-(U)-Sepharosesäule u.ä. der Affinitätschromatographie unterworfen wird, um Poly-(A)&spplus;-RNS-Frakionen zu erhalten.
- Die so erhaltene RNS kann mittels Saccharosedichtegradientenzentrifugation zur Aufkonzentrierung weiter fraktioniert werden, beispielswese gemäß dem von Y. Ishii et al. in Immunol.Invest. 14, 95 (1985), beschriebenen Verfahren.
- Die Indentifikation einer ein Polypeptid mit M-CSF-Aktivität codierenden mRNS in der erhaltenen Gesamt-mRNS erfolgt über eine erste Fraktionierung der Gesamt-mRNS über Saccharosedichtegradientenzentrifugation, Gelelektrophorese und dergleichen, wobei die erhaltenen Fraktionen in Oozyten von Xenopus Laevis mikroinjiziert oder zellfreie Proteintranslationssysteme wie Kaninchen Retikulozytenlysat oder Weizenkeimsysteme u.ä. eingebracht werden und das produzierte Protein entweder einem Immunoassay oder einer Aktivitätsbestimmung unterworfen wird.
- Alternativ dazu läßt sich die Identifizierung dadurch erreichen, daß man DNS- Sonden chemisch synthetisiert, die einem Teil der aus in der Natur vorkommendem M- CSF, insbesondere harngängigem human M-CSF erhaltenen Peptidsequenz entspricht, und eine von denjenigen auswählt, die mit mehreren Fragmenten der Sonden hybridisieren.
- Die bei der Selektion der gewünschten mRNS verwendeten Sonden werden wünschenswerter Weise hergestellt, indem man bekannte Sequenzen, speziell mit den Wirkungen verbundene und/oder nicht benachbarte Sequenzen wählt.
- Die Sonden können mit Hilfe chemischer Fest- oder Flüssigphasennukleotidsyntheseverfahren hergestellt werden, beispielsweise mit Hilfe des Phosphittriesterverfahrens, des Phosphoamiditverfahrens und dergleichen.
- Eine Markierung der so erhaltenen DNS-Sonde läßt sich durch Verwendung von Polynukleotidkinasen, z.B. der aus mit T4-Phagen infizierten E.Coli-Zellen gewonnenen T4-Polynukleotidkinase u.ä. zum Übertragen markierter Phosphate, z.B. ³²P an das 5'-Ende der DNS-Sonde erreichen.
- Eine Northernhybridisierung der mRNS mit der markierten Sonde wird durchgeführt, indem man zunächst die mRNS einer Elektrophorese unterwirft, beispielsweise der Elektrophorese auf Agarose-Formaldehyd-Gelen in Anwesenheit von denaturierenden Mitteln (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, S.202 (1980), Cold Spring Harbor Laboratory), anschließend die mRNS vom Gel auf ein Nitrocellulosefilter überführt und schließlich den Filter mit der markierten Sonde hybridisiert.
- Die auf diese Weise erhaltene erfindungsgemäße mRNS (die für ein Polypeptid mit M-CSF-Aktivität codiert) ist durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet:
- (1) Sie wurde aus human monozytotischen Zellen, genauer der monozytotischen Humanzellinie U937 gewonnen.
- (2) Sie weist S-Werte (Sedimentationskoeffizienten) von 24,7 bis 27,0 S, insbesondere von 26,2 bis 26,6 S auf.
- (3) Sie besitzt eine polyadenylierte Struktur am 3'-Ende.
- (4) Sie codiert ein Polypeptid mit M-CSF-Aktivität.
- Unter Verwendung der so erhaltenen mRNS als Template wird eine doppelsträngige cDNS hergestellt.
- Die Synthese kann nach jeder der zahlreichen bekannten Methoden erfolgen.
- Vorzugsweise besteht das DNS-Syntheseverfahren aus folgenden Schritten:
- Man synthetisiert Oligonukleotide, die einem Teil der Aminosäuresequenz des in der Natur auftretenden Proteins mit M-CSF-Ativität entsprechen, oder Oligo-(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; chemisch; anschließend wird unter Verwendung des Oligonukleotids als Primer und der erfindungsgemäßen mRNS als Template mit Hilfe von reversen Transcriptasen, z.B. der AMV-reversen Transcriptase u.ä., in Anwesenheit von dATP, dGTP, dCTP und dTTP eine komplementäre, einzelsträngige cDNS hergestellt.
- Als nächstes wird die als Template verwendete mRNS durch Behandlung mit Alkali abgedaut; danach wird die Doppelstrang-DNS unter Verwendung der einzelsträngigen DNS als Template mit Hilfe von reversen Transcriptasen oder DNA-Polymerasen beispielsweise der E.Coli DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) hergestellt.
- Alternativ bevorzugte Verfahren sind folgende:
- Unter Verwendung von mit einem Vektor ligierten Oligo-(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Primer und der gleichen mRNS als Template wird ein komplementärer einzelsträngiger Vektor mit eingefügter cDNS hergestellt und anschließend ein geöffnetes circuläres Plasmid mit angefügtem Linker mit der Linker-DNS annealt. Schließlich wird in Anwesenheit von dATP, dGTP, dCTP und dTTP mit Hilfe von RNase und DNA-Polymerase ein vollständiges Plasmid erzeugt.
- Eine besonders bevorzugte DNS-Synthese besteht aus der Verwendung des Oligo- (dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Primer, der mRNS als Template und im Handel erhältlicher cDNS-Synthesekits, beispielsweise dem cDNS-Synthesekit von Pharmacia, wobei man zur Erzeugung der Doppelstrang-DNS zunächst das Gemisch im Reaktionsgemisch für den ersten Strang, gefolgt vom Reaktionsgemisch für den zweiten Strang zur Umsetzung bringt und anschließend mit DNA-Polymerase, beispielsweise der E.Coli DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) zum Erhalt der doppelsträngigen DNS umsetzt.
- Die so erhaltene Doppelstrang-DNS wird im nächsten Schritt durch Verbindung mit einem geeigneten Vektor eingesetzt.
- Um die Doppelstrang-DNS mit einem Vektor zu ligieren, wird wünschenswerter Weise ein zur Bindung fähiges Ende (Linker) an das Ende der cDNS angesetzt.
- Ein solches Ansetzen eines Linkers kann unter Einsatz eines geeigneten chemisch synthetisierten DNS-Fragments erfolgen.
- Die cDNS mit angefügtem Linker kann zum Erhalt einer rekombinanten DNS mit der T4-Phagen-DNA-Ligase in Anwesenheit von dATP usw. zusammen mit der Vektor- DNS behandelt werden, die zuvor an der gewünschten Stelle mit einem Restriktionsenzym geschnitten wurde.
- Alternativ kann die DNS für die Rekombination erhalten werden, indem man dC- und dG-Ketten bzw. dA- und dT-Ketten zur doppelsträngigen cDNS bzw der zuvor an der gewünschten Stelle mit einem Restriktionsenzym geschnittenen Vektor-DNS zugibt und anschließend deren Enden aneinander ligiert.
- Die so erhaltene Doppelstrang-cDNS kann zum Aufbau von cDNS-Banken eingesetzt werden, indem man sie in geeignete Vektoren insertiert wie EK-Plasmidvektoren, z.B. pBR327, pBR322, pDF41, Col E1, pMB9, pACYC1, pMIS4, pMIH17, pMIH18, pM10, pMF10, pMCR735 und ähnliche, Hefevektoren, beispielsweise der Typen YIp, YEp, YRp, YVCp und dergleichen sowie pLS102, pLS103, pUB110, pE194, pTP4, pTP5, pTA1302, pTA1321, pSCP, pSLP, pIJ, pMS, von Phagen abgeleitete Vektoren z.B. λgt, λc, λgt10, λgtWES und dergleichen und anschließend Escherichia Coli (E. Coli), Bacillus, Hefe, Pseudomonas, Actinomycetes und andere transformiert.
- Stärker bevorzugt werden E. Coli z.B. die Stämme X1776, HB101, DH1, MM294, JM109, K12MC100 λ Lysogen, C600, Bacillus z.B. Bacillus subtilis RM125, MT120 u.ä. Hefen, beispielsweise Saccharomyces cervisiae (SHY-Stamm, AH22, AH22 pho80 u.a.) und dergleichen als Wirtszellen verwendet.
- Bei den hier verwendeten Vetoren handelt es sich vorzugsweise um diejenigen, die verschiedene an den Wirt anzupassende Replikationsursprünge (origin of replication), Shine-Dalgarno-Sequenzen (SD-Sequenzen) und Steuerungssequenzen enthalten.
- Die in den Vektoren verwendeten Promotoren können die β-Lactamase (z.B. Penicillinase), den Colicin E1-Promoter, die Lactose-(lac)-Promotersysteme, Tryptophan-(trp)- Promotersysteme, den Elongationsfaktor des EF-TU-Gens (tuf B) der Proteinbiosynthese, das Gen des Lipoproteins der Außenmembran (lpp), den recA-Genpromoter, den tac-Promoter und die vom Phagen λ abgeleiteten PL-Promotersysteme umfassen.
- Andere spezieller für Hefen geeignete Promoter schließen das 3-Phosphoglyceratkinase-Promotersystem sowie die mit anderen glycolytischen Enzymen wie Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, Alkoholdehydrogenase 2, Cytochrom C und der sauren Phosphatase verbundenen Systeme ein.
- Darüber hinaus kann die Resistenz gegen Antibiotika wie Ampicillin, Tetracyclin und Chloramphenicol als Marker für Vektoren verwendet werden. Promoter für Bacillus können die SPO2-Promoter, das Chloramphenicolresistenzgen (Cmr), das Erythromycinresistenzgen (Emr) sowie die Sekretionsvektoren beispielsweise das Amylasegen, das Penicillinasegen und dergleichen sein.
- Erfindungsgemäß kann eine für die Transformation besonders bevorzugte DNS erhalten werden, indem man an beide Ende der wie oben erhaltenen Doppelstrang-cDNS Eco RI-Linker anfügt und anschließend die erhaltene DNS am Eco RI-Ort von λgt10 insertiert.
- Der so erhaltene Rekombinant kann nach dem Verpacken in E. Coli-Wirtszellen wie C600Hfl eingebracht werden, wodurch rekombinante Phagendatenbanken erzeugt werden können. Auf diese Weise können cDNS-Datenbanken erhalten werden.
- Erfindungsgemäß werden die auf diese Weise erhaltenen cDNS-Datenbanken mit Hilfe des Kolonie- oder Plaquehybridisierungstests unter Verwendung von synthetischen DNS-Sonden durchgetestet (beispielsweise S.L.C. Woo, Methods in Enzymology 68, 398 (1979); J. Szostak et al., ibid 68, 419 (1979)). So lassen sich die gewünschten Kolonien oder Plaques selektieren.
- Alternativ dazu können die gewünschten Produkte mit Hilfe des Plus/Minus-Verfahrens, des Hybridisierungs-/Translationstests und anderer Tests identifiziert werden.
- Aus den so selektierten Kolonien und Plaques wird eine rekombinante Phagen-DNS hergestellt.
- Die rekombinante Phagen-DNS wird mit Restriktionsenzymen zum Erhalt von DNS- Stücken ausgeschnitten, die die gewünschten Inserts enthalten. Die DNS-Stücke werden in geeignete Plasmidvektoren insertiert und cloniert. Derartige Prozesse können je nach Bedarf mehrfach wiederholt werden.
- Das schließlich so erhaltene clonierte DNS-Fragment wird untersucht und seine Basensequenz bestimmt. Zunächst wird das clonierte DNS-Fragment wird mit Hilfe von Restriktionsenzymen abgedaut und dadurch eine Restriktionskarte erstellt. Als nächstes wird das clonierte DNS-Fragment im Phagen M13, vorzugsweise M13 mp18 und mp19 subcloniert und dann dessen Basensequenz mittels der Didesoxysequenzierung bestimmt, beispielsweise nach dem Verfahren von Sanger et al. (Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74, 5463 (1977)); J.Mol.Biol. 162, 729 (1982) usw.).
- Eine solche Sequenzierung kann auch nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert erfolgen.
- Die die gewünschten Basensequenzteile tragende cDNS wird unter Verwendung der erhaltenen Restriktionskarte der analysierten und zuvor entdeckten Basensequenz, die der Aminosäureteilsequenz des Proteins mit M-CSF-Aktivität entspricht, selektiert und somit die clonierte, eine die Sequenz, die die Aminosäuresequenz des Polypeptids mit M-CSF-Aktivität codiert, tragende cDNS ermittelt.
- Stärker bevorzugte Verfahren zum Erhalt der für das gewünschte Polypeptid mit M- CSF-Aktivität codierenden clonierten DNS umfassen die folgenden Schritte:
- Zunächst werden cDNS-Datenbanken mit Hilfe des Plaquehybridisierungstests unter Verwendung der mit ³²P markierten synthetischen DNS-Sonden, wie sie zur Selektion der obigen mRNS verwendet wurden, durchgetestet, beispielsweise nach Maniatis et al. in Molecular Cloning, S.326 (1982), Cold Springs Harbor Laboratory; anschließend wird aus jeder der selektierten Plaques eine rekombinante Phagen-DNS konstruiert bespielsweise nach Perbals Verfahren, in: A practical guide to molecular cloning, S.171 (1985), John Wiley & Sons Inc.).
- Danach wird eine Southernhybridisierung durchgeführt, der so selektierte Phage zum Erhalt des gewünschten DNS-Fragments ausgeschnitten, das wiederum mit einem geeigneten Plasmid ligiert wird, beispielsweise pBlueskript II SK (Stratagene) und in E. Coli- Zellen, z.B. E. Coli JM109, transfiziert.
- Der erhaltene Rekombinant wird zum Erhalt von Plasmiden behandelt, die dann nach dem alkalischen SDS-Verfahren, das z.B. von H.C. Birnbaum & J. Doly in Nucleic acids Res. 7, 1513 (1979) beschrieben wurde, behandelt und der Elektrophorese unterworfen.
- Der erwünschte Clon wird danach ausgewählt, daß die obige Elektrophorese die gewünschte Bande des Basenfragments aufweist. Aus diesem Clon werden das gewünschte Fragment tragende Plasmide erhalten; diese behandelt man auf geeignete Art und Weise mit Restriktionsenzym zum Erhalt von Fragmenten, die wiederum mit Plasmiden wie beispielsweise passenden Fragmenten von pBS&spplus; (Stratagene) ligiert und zum Erhalt von Clonen in E. Coli-Zellen wie z.B. E. Coli JM109 transfiziert werden. Auf diese Weise erhält man die das gewünschte Fragment tragende clonierte DNS in großen Mengen.
- Das so in großen Mengen erhaltene DNS-Fragment kann in M13 mp18 oder mp19 subcloniert, mit Primern annealt, gefolgt von der Synthese der komplementären Kette unter Verwendung von Sequenase (United States Biochemical Corporation) nach dem Didesoxykettenabbruchverfahren (Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA 74, 5463 (1977), J.Mol.Biol. 162, 729 (1982)), und anschließend der Gelelektrophorese und der Autoradiographie unterzogen werden. Auf Basis der so erhaltenen Ergebnisse wurde die Basensequenz des Gens, das die für ein Polypeptid mit M-CSF-Aktivität codierende DNS-Sequenz trägt, bestimmt.
- Fig.1 zeigt die Basensequenz des erfindungsgemäßen Gens.
- Die Basensequenz des translatierten Bereichs ist in Fig.2 dargestellt; sie codiert für das Polypeptid der Fig.3.
- Die so erfindungsgemäß erhaltene DNS kann mit Hilfe bekannter automatischer Nukleotidsyntheseapparate und dergleichen unter Verwendung der Information bezüglich der erhaltenen Basensequenz chemisch synthetisiert werden. Darüber hinaus läßt sich die erfindungsgemäße DNS auch über die enzymatische Bindung solcher teilweise synthetischen Fragmente herstellen.
- Da angenommen wird, daß das ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit M-CSF-Aktivität codierende Gen dem in der Natur auftretenden sehr ähnlich ist, weil es sich um ein Derivat der einer natürlichen Zelle relativ ähnlichen monozytotischen Zelle handelt, steht zu erwarten, daß das vom selben Gen erzeugte Peptid Vorteile im medizinischen Bereich bietet.
- Das erfindungsgemäße Gen ist im Vergleich zu denjenigen des Standes der Technik ziemlich lang. Dementsprechend erforderte die Gewinnung dieses Gen eine erfinderische Tätigkeit.
- Da anzunehmen ist, daß sich in der Sequenz multifunktionale Bereiche finden, ist zu erwarten, daß sich bei Herstellung eines rekombinanten Plasmids unter Verwendung desselben rekombinante Zellen effektiv herstellen lassen.
- Insbesondere können unter Verwendung des erfindungsgemäßen Gens rekombinante Plasmide mit ausgezeichneter Affinität für höhere eukaryotische Organismen erhalten werden. Noch spezieller ergibt das erfindungsgemäße Gen rekombinante Plasmide, die für die effiziente Transformation von von Tieren stammenden Zellen geeignet sind.
- Die Basensequenz des erfindungsgemäßen Gens ist für die Expression des Proteins mit M-CSF-Aktivität in Wirtszellen besser geeignet. Wird es deshalb mit Hilfe gentechnologischer Verfahren in solche Wirtszellen eingebracht, wird es die effiziente Produktion der interessierenden Polypeptide bewirken.
- Außerdem sollte die Deletion des Gens nur in sehr geringem Umfang erfolgen.
- Weiterhin weist das erfindungsgemäße Gen eine spezifische Basensequenz auf und ist im Vergleich mit denjenigen des Standes der Technik sehr lang; dementsprechend lassen sich, wenn es zur Herstellung von Transformanten eingesetzt und in diesen exprimiert wird, insbesondere unter glycosylierenden Bedingungen ausgezeichnete Ergebnisse erzielen, die so im Stand der Technik nie erzielt wurden. Eine geeignete Glycosylierung steht zu erwarten, so daß Aktivtät und Stabilität des erzeugten Proteins erhöht werden.
- Aufgrund der Annahme, daß das vorliegende Gen dem natürlichen sehr ähnlich ist, ist anzunehmen, daß eine Transformation unter Verwendung dieses Gens effizient ausgeführt werden kann. Darüber hinaus läßt sich die Expression des rekombinanten Gens leicht kontrollieren. Außerdem wird noch erwartet, daß die Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids konstant ist und aufgrund der für tierische Wirtszellen geeigneten Struktur ausgezeichnet im industriellen Maßstab abläuft.
- Da angenommen wird, daß das erfindungsgemäße Polypeptidprodukt dem natürlichen sehr ähnlich ist, sollte es für medizinische Anwendungen geeignet sein.
- Es steht auch zu erwarten, daß seine Antigenizität geringer, sein Metabolismus nach dem Verabreichen vorteilhaft und seine Handhabbarkeit in Formulierungen ausgezeichnet ist.
- Es wird vermutet, daß das erfindungsgemäße Gen nicht nur im Hinblick auf die Eigenschaften der Basensequenz, sondern auch auf die stereochemische Annordnung und die genetische Orientierung der Kontrollbereiche Vorteile bietet.
- Vorzugsweise wird das DNS-Fragment, das das Polypeptid mit M-CSF-Aktivität codierende Gen trägt, wiederum in eine geeignete Vektor-DNS insertiert und das Produkt für die Transformation geeigneter Wirte verwendet. Bei der Insertion des DNS-Fragments in eine geeignete Vektor-DNS, können durch Zugabe geeigneter Promoter und Sequenzen zur Induktion der Genexpression rekombinante Vektoren konstruiert werden.
- Als Wirte für die erfindungsgemäße Transformation können prokaryotische und eukaryotische Zellen und dergleichen verwendet werden.
- Beispiele für derartige Zellen sind Mikroorganismen wie E. Coli, z.B. K12, Bacillus, Actinomyceten, Hefe und ähnliche, Insektenzellen, tierische Zellen wie COS-7-Zellen und CHO-Zellen, die Mäusemyelomzellen N51, VERO, Hela-Zellen, Affen CV1, Affen AGMK, Mäuse L-Zellen, FM3A, NIH3T3, C127, Friends human Leukämie 293, Affen W162, Hamster BHK, human 143 und dergleichen.
- Zur Transformation von E. Coli und dergleichen verwendete Vektoren schließen pBR322, pKK223-3, vom Phagen Lambda abgeleitete Vektoren wie SV40 und die als Shuttle-Vektoren bekannten ein. Andere Vektoren, die oft zur Transformation von eukaryotischen Mikroorganismen wie Hefen verwendet werden, umfassen pAM82 und ähnliche.
- Die zur Konstruktion der oben erwähnten cDNS-Datenbank eingesetzten Wirtszellen und Vektoren können gleichermaßen zur Transformation des Wirts verwendet werden.
- Die zur Transformation der oben erwähnten tierischen Zellen verwendbaren Vektoren schließen solche, die frühe und späte Promoter des SV40-Vektors tragen, vom Vaccinia-Virus abgeleitete Vektoren, vom Adenovirus abgeleitete Vektoren, vom Rinder- Papillomavirus abgeleitete Vektoren, aber auch solche Vektoren, denen geeigneterweise ein Metallothioningen-Promoter von Mäusen insertiert wurde, von (tierischen) Retroviren abgeleitete Vektoren, den vom human Cytomegalovirus stammenden unmittelbaren-frühen Promoter, beispielsweise einem von Vogel Retroviren abgeleiteten Promoter, Immunglobulinpromoter oder Heatshock-Promoter ein.
- Beispiele für diese Vektoren sind pNE05, pL2BVL, pMSV gpt, pSV2-gpt, SV40 ori, pSV2 neo, pSV2 cat, pMDSG, BPV69TDNA, pSV2 dhfr, pLTR dhfr26, pCVSVE, pMg4, ΔEld/d1309, pZIP-neoSV, pMOV&supmin; und dergleichen.
- Vektoren, die zur Transformation der oben erwähnten Insektenzellen verwendet werden können, schließen vom Polyhedrosevirus abgeleitete Vektoren ein.
- In den obigen Vektoren verwendete Selektionsmarker umfassen das Thymidinkinasegen (TK), das Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferasegen (HPRT), das Dihydrofolsäuredehydrogenasegen (DHFR), das Adeninphosphoribosyltransferasegen (APRT) und dergleichen.
- Es werden bevorzugt Vektoren verwendet, in denen Promoter, Enhancerbereiche, RNS-Splicingstellen und dergleichen oberhalb (upstream) des das erfindungsgemäße Polypeptid mit M-CSF-Aktivität codierenden Gens eingefügt wurden, die am Ende des Gens Sequenzen zur Termination der Transcription enthalten oder in die Replikationsursprünge und Selektionsmarker insertiert wurden.
- Die vorzugsweise erfindungsgemäß verwendeten Transformationsoperons können beispielsweise die Operons für Tryptophan, die β-Galactosidase, die alkalische Phosphatase, die β-Lactamase u.ä. einschließen.
- Die Transformation der Wirtszellen mit den so erhaltenen Expressionsvektoren kann mit Hilfe der folgenden Verfahren ausgeführt werden:
- Im Falle von prokaryotischen Zellen und Zellen mit Zellwand wird eine Calciumchloridbehandlung eingesetzt. Besonders E. Coli wird vorzugsweise in Anwesenheit von Calcium-, Magnesium- oder Rubidiumchlorid behandelt.
- In bestimmten Fällen kann die Transformation ein direktes Einschleusen in Protoplasten mittels Polyethylenglykol oder Polyornithin, über ein Liposomenverfahren, die Co-Kultivierung, ein Spheroplastenverfahren und dergleichen einschließen. Die Transformation von Säugerzellen kann die Virusinfektion, das DEAE-Dextranverfahren, die Calciumphosphatfällung, die Mikroinjektion, die Liposomenfusion, die Protoplastenfusion, die Zellfusion mit Hilfe des Sedai-Virus, die Mikronukleolusfusion, die Chromosomentransinjektion und ähnliches umfassen.
- Vorzugsweise wird das Plasmid, das das für das Polypeptid mit M-CSF-Aktivität codierende Gen trägt, mit einer DNA-Polymerase, beispielsweise der E. Coli DNA- Polymerase I (Klenow-Fragment) zum Erhalt von glatten Enden ("blunt ends") behandelt und Fragmenten des Vektors pSVL ligiert. Das erhaltene Produkt wird zum Erhalt eines rekombinanten Clons in E. Coli, beispielsweise HB101 transfektiert, aus dem die DNS erhalten wird. Die DNS wird über die Restriktionskartierung auf ihre Insertionsrichtung hin untersucht. Vorzugsweise selektiert man zwei Vektoren, von denen einer dieselbe Richtung wie der Promoter der andere die umgekehrte Richtung hat.
- Anschließend transformiert man tierische Zellen zur Expression gemäß dem Calciumphosphatverfahren mit den obigen Vektoren (z.B. Okayama et al., Mol.Cell.Biol. 7, 2745 (1987)) und anderen.
- Die erfindungsgemäßen rekombinanten M-CSF-aktiven Produkte werden isoliert und nach einem der verschiedenen herkömmlichen Verfahren aufgereinigt.
- Die rekombinanten Produkte können innerhalb oder außerhalb der Transformanten vorliegen.
- Die erfindungsgemäße Reinigung und/oder Isolierung kann Säurebehandlungen, Hitzebehandlungen, die Proteinfällung, eine Elektrophorese, die Gelfiltration, die Molekularsiebchromatographie, die Ultrafiltration, die Umkehrphasenchromatographie, HPLC, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Absorbtionschromatographie usw. umfassen. Diese Behandlungen können je nach Bedarf allein oder in Kombination miteinander angewandt werden.
- Bei der Proteinfällung werden vorzugsweise Aussalzungsmittel wie Ammoniumphosphat, Natriumphosphat verwendet. Träger für die Auftrennung in der Gelfiltration schließen beispielsweise Polyacrylamidgele, Agarosegele, Dextrangele und dergleichen ein.
- Die Umkehrphasenchromatographien können solche umfassen, die Materialien einsetzen, in denen C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl, Cyanopropyl, Phenyl und dergleichen an eine Silicagelbasis gebunden sind. Die Ionenaustauschchromatographie umfaßt solche, die mit Dimethylaminoethyl oder Diethylaminoethyl modifizierte Anionenaustauscher und mit Carboxymethyl modifizierte Kationenaustauscher verwenden. Die Affinitätschromatographie umfaßt solche unter Verwendung Con-A-Sepharose, Lectin-Sepharose, an Sepharose gebundene Antikörper und ähnliches, vorzugsweise an Sepharose gebundene monoklonale Antikörper. Phenylsepharose, Octylsepharose und dergleichen können für die Absorptionschromatographie verwendet werden.
- Erfindungsgemäß lassen sich die rekombinanten Produkte mit M-CSF-Aktivität leicht in großen Mengen und hoher Reinheit erhalten, indem man die oben genannten Isolier- und Reinigungsverfahren allein oder in Kombination anwendet.
- Für die medizinische Anwendung kann das so erhaltene Produkt gemäß einem herkömmlichen, für proteinhaltige Zubereitungen üblichen Verfahren verabreicht werden. Demnach kann das Produkt beispielsweise intravenös, intramuskulär, intranasal, subkutan oder intradermal und sogar oral verabreicht werden. Für die parenterale Verabreichung umfassen die Zubereitungen sterile Lösungen oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Diese können auch lyophilisierte Zubereitungen umfassen, die in sterilem Wasser oder einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst sind oder unmittelbar vor Gebrauch in einem sterilen injizierbaren Medium gelöst werden.
- Die erfindungsgemäßen Produkte sind für die Behandlung verschiedener Infektionen, Tumoren, der Hypercholesterinämie, der Arteriosklerose und der Leukopenie sowie zur Verhinderung der durch Gabe von Antikrebsmitteln und Bestrahlung verursachten Nebenwirkungen usw. geeignet.
- Die erfindungsgemäßen Produkte sind auch für die Diagnose der hypoplastischen Anämie und dergleichen geeignet.
- Die vorliegenden therapeutischen Produkte lassen sich vorteilhaft in Kombination mit Interleukin 2, TNF, Interferon, Adriamycin, Mitomycin, 5-FU und dergleichen einsetzen.
- Insbesondere eignet sich die die vorliegenden Produkte enthaltende pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung eines Patienten mit einem bösartigen Tumor, der aufgrund der Verabreichung von Bestrahlung und Antikrebsmitteln wegen des funtkionalen Defekts des Knochenmarkgewebes seinen Immunschutz verloren hat, und zur Behandlung eines ernsthaft infizierten Patienten, wenn die Behandlung mit Antibiotika schwierig ist.
- Bei Verwendung für die oben genannten Zwecke, läßt sich die Dosierung unter Berücksichtigung des Zustands des Patienten und dergleichen ermitteln.
- Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor zur Expression des harngängigen human M-CSF, der eine die Aminosäuresequenz aus Fig. 10 codierende DNS-Sequenz und eine einen in einer tierischen Zelle funktionierenden Promoter aufweisende DNS-Sequenz sowie eine Enhancersequenz enthält.
- Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von harngängigem human M-CSF, das die Aminosäuresequenz der Fig. 10 aufweist.
- Die die Aminosäuresequenz der Fig. 10 codierenden M-CSF-Gene lassen sich mittels Verwendung einer human M-CSF-cDNS, der chemischen Synthese eines DNS-Teilstücks, der Spaltung mit Restriktionsenzymen sowie über Deletionen, Additionen und Ligationen mit modifizierenden Enzymen herstellen.
- Sie können auch chemisch synthetisiert werden.
- Weiterhin werden sie üblicherweise aus dem oben genannten Gen, beispielsweise dem Plasmid pBS II CSF hergestellt. Die Expressionsvektoren, die die für 522 Aminosäure (ohne Signalpeptid) codierende cDNS tragen, werden mit geeigneten Restriktionsenzymen angedaut, gefolgt von Trennung und Reinigung der DNS-Fragmente.
- Die DNS wird zum Erhalt von 214 bzw. 238 Aminosäuren chemisch synthetisiert. Die chemische DNS-Synthese erfolgt beispielsweise mittels des β-Cyanoethylamidit- und des H-Phosphonatverfahrens. Der obige Vektor und die synthetische DNS werden mit T4-Ligase ligiert, gefolgt von Transfektion in E. Coli zur Bereitstellung der interessierenden Rekombinanten.
- Wie oben bereits angesprochen, entsprechen die allgemeinen gentechnologischen Methoden, die zur Konstruktion des Expressionsvektors für das harngängige human M- CSF aus Fig.10 verwendet werden, dem von Maniatis et al, in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), offenbarten Verfahren.
- Gemäß der punktspezifischen Mutagenese (T.A. Kunkel et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82 488 (1985)) wird eine teilweise Veränderung der Aminosäuren durchgeführt. Die Verifizierung der so erhaltenen Gensequenz erfolgt wie oben gesagt gemäß dem Didesoxyverfahren sowie dem Verfahren von Maxam und Gilbert.
- Um das Gen des harngängigen human M-CSF in tierischen Zellen zu exprimieren, weist der Expressionsvektor für tierische Zellen vorzugsweise einen Promoter oberhalb (upstream) des Gens, einen Splicingbereich unterhalb (downstream) davon, ein Poly(A)- Signal und einen Poly(A)-Bereich auf.
- Darüber hinaus kann die Einführung von Enhancerbereichen auf den Vektoren die Produktivität des Genprodukts steigern helfen.
- Die hier verwendeten Promoter schließen üblicherweise von Viren abgeleitete Promoter, beispielsweise frühe und späte SV 40-Promoter, die wesentlichen späten Promoter von humanen Adenoviren, die unmittelbaren frühen Promoter des human Cytomegalovirus und dergleichen ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
- Die hier verwendeten tierischen Wirtszellen umfassen beispielsweise Affen Nieren- COS-Zellen (Y. Gluzman, Cell 23, 175 (1981)) und Ovarienzellen des chinesischen Hamsters CHO dhfr&supmin;-Zellen (G. Urlaub & L.A. Chasin, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77, 4216 (1980) und dergleichen; vorzugsweise handelt es sich um CHO dhfr&supmin;-Zellen. Bei den COS-Zellen ist bevorzugt, daß die Expressionsvektoren die oben angesprochene Expressionseinheit auf Plasmiden tragen, die SV40-Replikationsursprünge aufweisen, jedoch über keine die Replikation von SV40 inhibierenden Sequenzen, die sogenannten toxischen Sequenzen verfügen.
- Für CHO dhfr&supmin; wird vorzugsweise der Vektor pSV2-dhfr verwendet, der als dominanten Marker die dhfr-Gene der Maus trägt (S. Sabramani et al., Mol.Cell.Biol. 1, 854 (1981)).
- Liegt das dhfr-Gen vor, läßt sich die Genmultiplikation mit Hilfe von Methotrexat erreichen; auf diese Weise lassen sich hochproduktive Stämme vorteilhaft erzielen (J.R. Kaufman et al., Mol.Cell.Biol. 5, 1750 (1985)).
- Um mit Hilfe eines dominanten Markers das CSF-Gen in Chromosomen zu transferieren, kann man sowohl die Co-Transfektion, bei der das CSF-Gen vor der Transfektion nicht mit dem dominanten Marker ligiert ist, als auch ein Verfahren verwenden, bei dem das CSF-Gen ligiert und anschließend transfektiert wird. Erfindungsgemäß wird letzteres Verfahren vorzugsweise angewandt.
- Darüber hinaus kann die Expression gemäß dem Polycistronverfahren eine hohe Translationseffizienz errreichen (R.J. Kaufman et al., EMBO J. 6, 187 (1987)).
- Erfindungsgemäß läßt sich die Transformation leicht nach den üblichen Verfahren beispielsweise dem DEAE-Dextranverfahren (N. Arai et al., Exp.Med. 5, 1019 (1987)) und dem Calciumphosphatverfahren (H. Okayama et al., Mol.Cell.Biol. 7, 2724 (1987)) durchführen.
- Der erhaltene Transformant wird nach einem herkömmlichen Verfahren kultiviert und das im Harn ausgeschiedene human M-CSF im Kulturmedium akkumuliert.
- Die erfindungsgemäß für die COS-Zellen verwendeten Medien sind z.B. Dulbeccos modifiziertes MEM Medium (D-MEM), das je nach Bedarf mit fetalem Kalbsserum (FCS) und dergleichen ergänzt wird. Die Kultivierung erfolgt für 2 - 5 Tage bei 35 - 37 ºC unter 0 - 10 % CO&sub2;. Für CHO dhfr&supmin;-Zellen verwendet man vorzugsweise ein Nukleinsäure-freies MEM-α(-)-Medium, das je nach Bedarf mit Seren wie dialysiertem fetalen Kalbsserum ergänzt wird. Die Kultivierung erfolgt für 2 bis 5 Tage bei 35 bis 37 ºC unter 0 - 10 % CO&sub2;.
- Der Gehalt an M-CSF beträgt in dem nach dem obigen Verfahren konditionierten Medium 1 - 10 mg pro Liter.
- Dies ist, verglichen mit dem Gehalt in menschlichem Urin, fast die 10.000fache Menge.
- Entsprechend einigen Ausführungsformen erfolgt die Aufreinigung des M-CSF wie folgt:
- Zunächst wird das so erhaltene konditionierte Medium mittels Ultrazentrifugation aufkonzentriert, mit Phosphorsäure u.ä. auf pH 4,0 - 5,0 eingestellt und der Niederschlag entfernt.
- Das Konzentrat wird auf einen Anionenaustauscher gegeben, beispielsweise DEAE- Cellulose, um M-CSF-Aktivität aufweisende Fraktionen zu sammeln. Die aktive Fraktion wird zum Sammeln von aktiven Fraktionen einer hydrophoben Chromatographie unterworfen, z.B. auf Phenyl-Sepharose. Diese Fraktion wird wiederum der Molekularsiebchromatographie unterworfen, z.B. auf einer mit Superose 12 gepackten Säule, und fraktioniert. Die Fraktion wird entsalzt und konzentriert.
- Erfindungsgemäß wird das im Harn ausgeschiedene human M-CSF mit hoher Ausbeute und in hoher Reinheit erhalten.
- Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von harngängigem human M-CSF unter Verwendung eines E. Coli-Expressionssystems.
- In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der Fig.20, den betreffenden Vektor und den Transformanten.
- Die M-CSF-Gene, die die Aminosäuresequenz der Fig.20 codieren, lassen sich mittels der oben angeführten Verfahren herstellen.
- Sie können auch chemisch synthetisiert werden.
- Außerdem werden sie bequemerweise aus den oben genannten Genen, beispielsweise den Plasmiden pBS II CSF, pSVL-CSF 214 und pSVL-CSF 238 hergestellt.
- Die Plasmide pSVL-CSF 214 und pSVL-CSF 238 werden zur Konstruktion eines Expressionsvektors für E. Coli verwendet.
- Jedes der obigen Plasmide trägt die Basensequenz, die einem Signalpeptid mit 32 Aminosäuren und einem Peptid mit 214 bzw. 238 Aminosäuren entspricht.
- Üblicherweise werden die Plasmide mit Restriktionsenzymen zum Erhalt von Fragmenten zerschnitten, die in Vektoren mit Mehrfachclonierungsstellen subcloniert werden, und mit geeigneten Restriktionsenzymen angedaut, die diese an der dem N-Terminus des im Harn ausgeschiedenen human M-CSF benachbarten Aminosäure und im den Bereich des Signalpeptids ausschließenden Bereich schneiden. Das für die M-CSF- Aminosäuresequenz codierende DNS-Fragment wird isoliert.
- Um die durch die obige Behandlung deletierte Sequenz wieder zu vervollständigen, werden DNS-Stücke chemisch synthetisiert, die fMet (dem Startcodon der Translation) und der fehlenden N-terminalen Aminosäure entsprechen.
- Die chemische DNS-Synthese erfolgt beispielsweise mittels des β-Cyanamidit- und des H-Phosphonatverfahrens.
- Die Vektoren, die in E. Coli exprimiert werden können, konstruiert man wie folgt:
- Der Expressionsvektor wird mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten (die Enzyme sollten seine überstehenden Enden ("sticky ends") sowohl zur Ligation mit der gewonnenen DNS als auch mit der synthetischen DNS befähigen).
- Die gewonnene DNS, die synthetische DNS und der geschnittene Expressionsvektor werden mit der T4-DNA-Ligase ligiert und zum Erhalt des gewünschten Transformanten in E. Coli transfektiert.
- Wie oben angesprochen, werden die allgemeinen gentechnologischen Manipulationen entsprechend den von T. Maniatis et al., in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) offenbarten Methoden ausgeführt.
- Ein teilweiser Austausch der Aminosäuren erfolgt gemäß der punktspezifischen Mutagenese (Kunkel, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82, 488 (1985)). Darüber hinaus läßt sich ein teilweiser Austausch von Aminosäuren durch Insertion einer teils synthetischen DNS in die Schnittstelle eines Restriktionsenzyms herbeiführen. Die Verifikation der auf diese Weise erhaltenen Gensequenz erfolgt ebenfalls wie oben beschrieben.
- Der erhaltene E. Coli-Tranformant wird zur Bereitstellung des Monomeren des harngängigen human M-CSF kultiviert.
- Die Expressionsvektoren für E. Coli sind Vektoren, die Promoter-Operator-Systeme, SD-(Shine-Dalgarno)-Sequenzen sowie Initationscodons für die Proteinsynthese (z.B. ATG) und einen downstream davon gelegenen Terminator enthalten.
- Die Promoter-Operator-Systeme umfassen lac-Promoter-Operator-Systeme, die trp- Promoter-Operator-Systeme, die PL-Promoter-Operator-Systeme des Phagen Lambda, die tac-Promoter-Operator-Systeme und dergleichen, ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
- Die Konstruktion von ein Repressorgen tragenden Plasmiden und der Einsatz von ein Repressorgen auf dem Chromosom tragenden E. Coli-Zellen sind für die Steuerung der Expression von Nutzen.
- Beispiele für den Repressor sind die Lactoserepressoren (lac I) für die lac- und die tac-Promoter-Operator-Systeme, die cI-Repressoren und deren Mutanten, die cI-857- Repressoren für die PL-Promoter-Operator-Systeme des Phagen Lambda und trp R für die trp-Promoter-Operator-Systeme.
- Solange wie die Repressoren den Promoter-Operator-Systemen entsprechen, sind die verwendbaren Kombinationen von Promoter-Operator-Systemen und Repressoren nicht auf diese beschränkt. Dementsprechend können die bekannten herkömmlichen Systeme verwendet werden. Die phänotypische Expression der E. Coli-Zellen, die durch die Repressoren gesteuert wird, kann unter verschiedenen Bedingungen induziert werden.
- Die Induktion der Expression läßt sich bei Verwendung des Lactoserepressors durch Lactose oder IPTG (Isopropylthiogalactosid), bei Verwendung des cI-Repressors durch einen Inhibitor der DNA-Synthese, bei Verwendung des cI 857-Repressors durch hohe Temperatur, 42 ºC, und bei Verwendung des trp R durch entweder Indolyl-3-acrylsäure, Indolyl-3-propionsäure oder einen Tryptophanmangel erzielen.
- Solange die Induktion der phänotypischen Expression dem verwendten Repressor entspricht, ist sie nicht auf die oben angeführten Beispiele beschränkt.
- Eine leichte Selektion der Rekombinanten läßt sich auch durch zuvorige Insertion eines Resistenzgens gegen Wirkstoffe und dergleichen in die verwendeten Expressions- und Clonierungsvektoren erzielen.
- Derartige Markergene schließen Antibiotikaresistenzgene gegen Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Kanamycin und dergleichen, sowie die lac Z Gene (hierbei zeigt die Erzeugung eines blauen Farbstoffs durch den Abbau von X-gal auf Basis der α-Komplemetarität des Lactoseoperons an, ob die interessierende DNS insertiert ist) ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
- Die Transformation von E. Coli mit dem erhaltenen Expressionsvektor wird gemäß den üblichen Verfahren durchgeführt. Die Transformation läßt sich auf einfache Weise z.B. durch Behandlung des Wirts E. Coli mit Calciumchlorid oder eine Behandlung in Anwesenheit von Calcium-, Magnesium- oder Rubidiumchlorid, gefolgt von Mischen mit Plasmid-DNS erzielen (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)).
- Die so erhaltenen Transformanten lassen sich gemäß konventionellen Methoden kultivieren.
- Anschließend führt man eine geeignete Induktion der Expression in E. Coli aus; dadurch wird das im Harn ausgeschiedene human M-CSF erzeugt und in der Zelle akkumuliert.
- Bei den für diese Kultivierung verwendeten Medien handelt es sich um für die Kultivierung von E. Coli übliche Medien wie das LB-Medium, das E-Medium, das M9-Medium, das M63-Medium; diese können wie allgemein bekannt je nach Bedarf mit verschiedenen Arten von Stickstoffquellen, Kohlenstoffquellen, anorganischen Salzen, Vitaminen und anderem ergänzt werden. Die Kultivierung von E. Coli erfolgt bei pH 5 - 9, vorzugsweise pH 7 oder in der Nähe von pH 7, bei 20 - 45 ºC, vorzugsweise 28 - 42 ºC.
- Die kultivierten E. Coli-Zellen werden geerntet und das harngängige human M-CSF- Protein aus den Zellen gewonnen.
- Erfindungsgemäß läßt sich die effiziente M-CSF-Produktion auch durch Expression von M-CSF gemäß dem 2-Cistronverfahren erreichen.
- Dieses Verfahren schließt 2 kontinuierliche Cistrone enthaltende Genexpressionssysteme ein. Diese Gensysteme führen zu einer stabilen effizienten Produktion von M- CSF im Wirt E. Coli in großen Mengen.
- Erfindungsgemäß sollen detailliertere Ausführungsformen für diese Expressionssysteme näher veranschaulicht werden.
- Expressionsplasmide werden konstruiert, die als erstes Cistron ein für ein geeignetes Polypeptid oder einen Teil desselben codierendes Gen und als zweites Cistron das M- CSF-Gen tragen.
- Es ist entscheidend den Promoter und die SD-Sequenz für die Expression des interessierenden Gens oberhalb (upstream) des ersten Cistrons sowie die SD-Sequenz für die Expression des zweiten Cistrons und ein Initiationscodon zwischen dem Terminationscodon für das erste Cistron und das zweite Cistron zu plazieren.
- Solange sich das als das erste der obigen Cistrone verwendete Gen in den Wirtszellen exprimieren läßt, unterliegt es keinen Beschränkungen. Da jedoch das von dem Gen, das als erstes Cistron verwendet wird, codierte Polypeptid im selben System wie das interessierende M-CSF produziert wird, wird ein leicht vom interessierenden M-CSF abtrennbares Protein bevorzugt.
- Darüber hinaus ist ein Gen bevorzugt, das direkt der Kontrolle der verwendeten Promoter-Systeme untersteht. In weiteren Ausführungsformen werden der PL-Promoter und der vom PL-Promoter kontrollierte Bereich des N-Proteins dargestellt. Der Bereich des N-Proteins wird mit einem Restriktionsenzym geschnitten, so daß von dem behandelten Bereich ein maximal 100 Aminosäuren codierender Bereich verbleibt; dieser wird durch Einführung der synthetischen DNS modifiziert, nachdem die überflüssige Sequenz entfernt wurde. Die obige synthetische DNS wird so hergestellt, daß sie das Terminationscodon für das modifizierte N-Protein, die SD-Sequenz für die Expression des zweiten Cistrons und das Initiationscodon für das M-CSF enthält.
- Um ein Überlesen von oben aus zu verhindern, ist die Einführung des Terminationscodons in jeden der drei Leserahmen erwünscht. Als Terminations- und Initiationscodon in der synthetischen DNS kann jedes der in der Natur vorkommenden Codons verwendet werden.
- Stärker bevorzugt konstruiert man einen Expressionsvektor, der den PL-Promoter und den vom PL-Promoter gesteuerten Bereich des N-Proteins trägt, schneidet diesen mit einem Restriktionsenzym, isoliert und reinigt ihn nach dem Verwerfen der überflüssigen DNS-Sequenz auf.
- Der das M-CSF-Gen tragende clonierte Vektor wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym angedaut und das M-CSF-Genfragment gewonnen.
- Sowohl die gewonnenen Fragmente als auch die synthetische DNS zum Ergänzen der fehlenden DNS-Bereiche derselben (das Terminationscodon des N-Proteins, die SD- Sequenz und das Initiationscodon für die Expression des zweiten Cistrons und das aufgrund der Behandlung mit dem Restriktionsenzym fehlende Codon) werden mit T4- Ligase und dergleichen ligiert, um den gewünschten Expressionsvektor zu erhalten.
- Der daraus resultierende Expressionsvektor weist als erstes Cistron einen Bereich eines N-Proteinteils und wie oben erwähnt einen M-CSF-Bereich als zweites Cistron auf. Die neuartige Expression von M-CSF wird durch Verwendung des auf diese Weise erhaltenen Expressionsvektors erzielt. Dieses Expressionsverfahren ist für die Herstellung von M-CSF in großen Mengen sehr geeignet, insbesondere des M-CSF der Fig.20 (x = 0), obwohl Berichten zufolge die Expression von M-CSF sehr gering war (R. Halenbeck et al., Bio/Technology 7, 711 (1989)).
- Die E. Coli-Wirte, die den cI 857 Repressor tragen (z.B. N4830-1, K12 delta H1), werden gemäß dem zwei Cistronverfahren zum Erhalt des gewünschten Transformanten transformiert.
- Der so erhaltene Transformant kann gemäß den üblichen Verfahren kultiviert werden.
- Der Transformant wird unter Rühren oder Schütteln in einem LB-Medium bei 26 ºC bis 37 ºC, stärker bevorzugt 28 ºC bis 32 ºC kultiviert, anschließend an einen geeigneten Punkt der exponentiellen Phase von 37 ºC auf 42 ºC Kulturtemperatur erwärmt und für eine konstante Zeitspanne, beispielsweise 2 bis 24 Stunden bei 37 bis 42 ºC, rekultiviert. Entsprechend einer solchen Kultivierung läßt sich beobachten, daß in der Zelle des Wirts E. Coli Proteinkörperchen aus dem erzeugten M-CSF gebildet werden. Die Zellen werden mittels Zentrifugation geerntet und die erhaltenen Zellen zum Erhalt des M-CSF als unlösliche Fraktion aufgebrochen.
- Der Aufbruch der Mikroorganismen kann mittels Ultraschall oder gemäß dem Verfahren von Nagai et al. erfolgen (K. Nagai et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA 82, 7252 (1985)). Die so erhaltenen Proteinkörperchen aus M-CSF werden in einem 2 bis 8 M Harnstoff, 4 bis 7 M Guanidinhydrochlorid oder mehr als 0,1 % (Gew./Vol.) SDS (Natriumdodecylsulfat) enthaltenden Puffers unter Verwendung eines Homogenisators und dergleichen solubilisiert.
- Das so erhaltene M-CSF-Monomerprotein wird nach verschiedenen Verfahren unter solubilisierenden Bedingungen aufgereinigt. Die Aufreinigung schließt die Umkehrphasenchromatographie, die Ionenaustauschchromatographie, die HPLC, Absorptionschromatographie, die Gelfiltration und dergleichen ein.
- Das M-CSF-Monomer kann mittels dieser Verfahren gereinigt und zum Erhalt des Dimeren neu gefaltet werde. Die Neufaltung kann durch schnelle oder langsame Entfernung des Solubilisierungsmittels erreicht werden. Die Bildung von Disulfidbrücken wird entweder durch Autoxidation oder durch Zugabe eines geeigneten Oxidationsmittels unter Bedingungen der Neufaltung bewirkt.
- Die für diese Behandlung verwendeten Reagenzien schließen oxidiertes Gluthation (GS-SG), reduziertes Glutathion (GSH), DTT und ähnliches ein.
- Die Neufaltung kann auch durch Enzyme wie Thioredoxin bewirkt werden.
- In der Beschreibung und den Zeichnungen der Erfindung werden die von der IUPAC-IUB-Komission für die biochemische Nomenklatur oder die üblicherweise im Stand der Technik verwendeten Abkürzungen verwendet. Beispiele hierfür sind im folgenden angeführt.
- Ala: Alanin
- Asn: Asparagin
- Cys: Cystein
- Gln: Glutamin
- His: Histidin
- Leu: Leucin
- Met: Methionin
- Pro: Prolin
- Thr: Threonin
- Tyr: Tyrosin
- Arg: Arginin
- Asp: Asparaginsäure
- Glu: Glutaminsäure
- Gly: Glycin
- Ile: Lsoleucin
- Lys: Lysin
- Phe: Phenylalanin
- Ser: Serin
- Trp: Tryptophan
- Val: Valin
- B...BamH1 E...Eco RI K... Kpn I p...Pst I
- S...Sma I Sa...Sac I Sal...Sal I Sc...Sca I
- DNS: Desoxyribonukleinsäure
- cDNS: komplementäre Desoxyribonukleinsäure
- A: Adenin
- G: Guanin
- T: Thymin
- C: Cytosin
- RNS: Ribonukleinsäure
- dATP: Desoxyadenosintriphosphat
- dTTP: Desoxythymidintriphosphat
- dGTP: Desoxyguanosintriphosphat
- dCTP: Desoxycytosintriphosphat
- ATP: Adenosintriphosphat
- Tdr: Thymidin
- EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
- SDS: Natriumdodecylsulfat
- CSF: CSF-Gen
- Ampr oder Apr: Ampicillinresistenzmarker
- Tcr: Tetracyclinresistenzmarker
- N: N-Proteingen des Phagen Lambda
- N': ein den N-terminalen 33 Aminosäure entsprechendes N-Proteingen des Phagen Lambda
- Ptac: tac-Promoter
- PL: PL-Promoter
- T4Pol: T4-DNA-Polymerase
- Lac Z: Lac-Promoter-Operator-Bereich einschließlich der ersten 145 Aminosäurereste der β-Galactosidase
- Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher veranschaulicht. Diese sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken.
- U937-Zellen (American Type Culture Collection (ATCC) CRL 1593) wurden unter einer Atmosphäre von 5 % CO&sub2; in Luft zum Erhalt von 1 x 10&sup6; Zellen/ml in 20 ml RPMI-1640 propagiert, das 10 % FCS enthielt (etwa 72 Stunden). PMA wurde in Konzentrationen von 0, 10, 50, 100 und 200 ng/ml zugegeben, gefolgt von Inkubation für 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 12 bzw. 20 Stunden. Anschließend wurde Cycloheximid in Endkonzentrationen von 0, 20, 40, 60, 80 bzw. 100 µg/ml zugegeben, gefolgt von Inkubation über weitere 0,25, 1, 2, 4, 6 und 12 Stunden. Das Medium wurde 5 Minuten mit 800 g zentrifugiert. Die Zellen wurden geerntet und in 10 ml PBS-Puffer (5 mM Phosphatpuffer mit 0,15 M NaCl, pH 7,2) resuspendiert. Die Suspension wurde nochmals 5 Minuten mit 800 g zentrifugiert und der Überstand zum Erhalt der Zellen verworfen.
- Die im obigen Verfahren (1) erhaltenen Zellen wurden in 45 µl 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) mit 1 mM EDTA nach dem von White und Baneroft beschriebenen Verfahren suspendiert (J.Biol.Chem. 257, 8569 (1982), gefolgt von Zugabe von 5 µl einer 5 %igen NP-40-Lösung und Zentrifugation bei 15000 UpM nach deren Auflösung. Zu den 50 µl mittels Zentrifugation erhaltenem Überstand gab man 30 µl 20faches SCC (1 x SCC = 0,01 M Trinatriumcitrat mit 0,15 M NaCl) und 20 µl 37 %iges (Gew./Vol.) Formaldehyd hinzu, gefolgt von einer Hitzebehandlung für 15 min bei 60 ºC. Die erhaltene Lösung wurde vierfach verdünnt, auf Nitrocellulosefilter geblottet und 20 Stunden lang bei 54 ºC mit einer Hybridisierlösung hybridisiert, die chemisch gemäß dem Verfahren aus Beispiel 3 synthetisierte mit ³²P-markierte DNS-Sonden in einer Konzentration von 2 x 10&sup6; cpm/ml enthielt.
- Die Autoradiographie zeigt, daß die Kulturbedingungen mit 50 ng/ml PMA für 6 Stunden, gefolgt von 20 µg/ml Cycloheximid für 4 Stunden optimal sind, da der Überstand bis hinauf zur höchsten Verdünnung aktiv ist.
- Gemäß dem in Beispiel 1-(2) erzielten Ergebnissen wurden die U937-Zellen in 10 % FCS enthaltendem RPMI 1640 unter einer 5 % CO&sub2; in Luft enthaltenden Atmosphäre zum Erhalt einer Zelldichte von 1 x 10&sup6; Zellen/ml (für etwa 72 Stunden) kultiviert. PMA wurde in einer Endkonzentration von 50 ng/ml zugegeben und danach für 6 Stunden inkubiert. Cycloheximid wurde in einer Endkonzentration von 20 µg/ml zugefügt, gefolgt von Inkubation über weitere 4 Stunden. Die auf diese Weise erhaltenen Zellen wurden mittels Zentrifugation bei 800 g geerntet (International Equipment Co.), in 500 ml PBS (5 mM Phosphatpuffer mit 0,15 M NaCl, pH 7,2) suspendiert und durch 5 minütige Zentrifugation bei 800 g und Verwerfen des Überstands gewaschen. Nach zweimaliger Wiederholung des Waschvorgangs auf gleiche Weise wurden die erhaltenen Zellen (etwa 7,6 g) bis zur Verwendung bei -80 ºC aufbewahrt.
- Die Extraktion der Gesamt-RNS erfolgte nach Verfahren wie dem bekannten Guanidinthiocyanat-Verfahren (J.M. Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)). Als Ausgangsmaterial wurden 7,6 g der Zellen in 60 ml einer Lösung suspendiert, die 6 M Guanidinthiocyanat, 5 mM Natriumcitrat, 0,5 % N-Laurylsarcosinnatriumsalz und 0,1 M 2-Mercaptoethanol enthält, und homogenisiert. Jeweils 10 ml des erhaltenen Homogenats wurden auf ein 5 ml einer Lösung aus 5,7 M Caesiumchlorid, 0,2 M EDTA enthaltendes 16 ml-Zentrifugationsröhrchen gegeben und bei 27000 UpM 24 Stunden lang zum Erhalt von 6,8 mg einer Gesamt-RNS-Fraktion zentrifugiert (Rotor: SRP 28 SA1; Hitachi Japan). Etwa 6,8 mg der so erhaltenen Gesamt-RNS-Fraktion wurde in 30 ml 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) gelöst, enthaltend 500 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,1 % N-Laurylsarcosinnatriumsalz, der Chromatographie auf einer Oligo-(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8;-Cellulosesäule (1,0 x 2,0 cm; Pharmacia Typ 7) unterworfen, die zuvor mit dem obigen Puffer äquilibriert wurde, mit 100 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,1 % N-Laurylsarcosinnatriumsalz enthaltendem 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) gewaschen und anschließend mit einer Lösung aus 1 mM EDTA, 0,1 % N-Laurylsarcosinnatriumsalz zum Erhalt einer Poly- (A)&spplus;-RNS-Fraktion (etwa 290 µg) eluiert. 150 µg der so erhaltenen mRNS wurde auf einen Saccharosegradienten von 5 bis 30 % (13 ml) gegeben und bei 15 ºC 18 Stunden mit 24000 UpM unter Verwendung eines SRP28SA1-Rotors (Hitachi Japan) zentrifugiert. Der erhaltene Gradient wurde in 30 Fraktionen (je 450 µl) zerlegt. Zu jeder Fraktion wurden die Hälfte ihre Volumens an 7,5 M Ammoniumacetat zugegeben und gemischt; dazu wurden 2 Äquivalente (Mengenanteile) Ethanol gegeben und bei -20 ºC über Nacht zum Ausfällen der mRNS stehengelassen.
- Als Standardmarker zur Bestimmung der Sedimentationskoeffizienten wurde ribosomale 16S, 18S, 23S und 28S RNS verwendet.
- Um zu Untersuchen, welche der in Beispiel 2-(2) erhaltenen mRNS-Größenfraktionen die das M-CSF-Gen codierende mRNS enthält, wurde unter Verwendung von mit ³²P markierten synthetischen DNS-Sonden eine Northernhybridisierung durchgeführt.
- Unter Anwendung der Information bezüglich der Aminosäuresequenz des M-CSF (44 Reste von N-Terminus), das aus in der japanischen Offenlegungsschrift Nr.34998/1989 aus menschlichem Urin aufgereinigt wurde, wurden die folgenden Sequenzen als synthetische Sonden verwendet:
- Zur ersten, oben angeführten Basensequenz (jeweils entsprechend der zweiten Basensequenz) komplementären Sequenzen wurden als Sonden chemisch synthetisiert. Ein Biosearch 8600 DNA-Synthesegerät (Millipore) wurde zur Herstellung dieser Sequenzen eingesetzt. Die Synthesereaktion wurde für 2 bis 3,5 Stunden ausgeführt. Die erhaltenen Polynukleotide wurden unter Verwendung einer Patrone zur Aufreinigung von Oligonukleotiden gereinigt (Applied Bio-Systems Japan, Japan). Die jeweils auf diese Weise synthetisierten komplementären Basensequenzen (2 Nanomol/ml) wurden 30 Minuten bei 37 ºC mit 200 Einheiten/ml Polynukleotidkinase (T4-Polynukleotidkinase, abgeleitet aus mit T4-Phagen infizierten E. Coli-Zellen) in einer Pufferlösung aus 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,01 M MgCl&sub2;, 5 mM Dithiotreitol, 0,1 mM Spermidin und 0,1 M EDTA behandelt.
- Zwei mit ³²P markierte Sonden wurden durch Übertragung von Phosphatresten von (γ-³²P)-ATP auf die Hydroxylreste am 5'-Ende der Basensequenz hergestellt.
- Die spezifische Aktivität beträgt jeweils 6 x 10&sup6; cpm/pmol. Die in Beispiel 2-(2) erhaltene Gesamt-Poly(A)&spplus;-RNS (je 2 µg) wurde einer Elektrophorese (6 Std., 60 V) auf MOPS (20 mM) und Formaldehyd (2,2 M) enthaltendem Agarose unterworfen. (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, S.202 (1980), Cold Spring Harbor Laboratory), auf einen Nitrocellulosefilter in 20fachem SCC (einfach: 15 mM Natriumcitrat und 0,15 M NaCl) übertragen, durch 5 stündige Hitzebehandlung bei 80 ºC fixiert und über Nacht bei 54 ºC in 20 ml Vorhybridisierlösung (0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM Dinatrium-EDTA, 0,5 % Natrium-N-Laurylsarcosin und 0,4 mg/ml denaturierte Lachsspermien Träger-DNS) behandelt. Der Filter wurde 20 bis 40 Stunden bei 54 ºC in 3 ml Hybridisierungspuffer hybridisiert, der 6 x 10&sup6; cpm der obigen mit ³²P markierten synthetischen DNS-Sonde enthielt. Der hybridisierte Filter wurde mit 500 ml 0,5 % N-Laurylsarcosinlösung zweimal bei Raumtemperatur und zweimal bei 54 ºC gewaschen und an Luft getrocknet.
- Unter Verwendung eines Kodak XAR-5-Films wurde eine Autoradiographie durchgeführt (-80 ºC, Exposition über Nacht). Ribosomale 16S, 18S, 23S und 28S RNS wurde als Marker eingesetzt. Im Ergebnis wurde bei 26,2S bis 26,6S (bei 4,45 - 4,7 kBp) eine Bande entdeckt, die mit beiden Sonden reagierte.
- Die Herstellung der cDNS erfolgte unter Verwendung der in Beispiel 2-(2) erhaltenen mRNS-Fraktionen 22 und 23 (24,7S bis 27,1S) als Template. 5 µg der in Beispiel 2-(2) erhaltenen mRNS-Fraktion wurden in 20 µl RNase-freiem Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wurde als Template für die cDNS-Synthese eingesetzt. Die von einem Oligo-(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Primer gestartete cDNS-Synthese wurde bei 37 ºC 60 Minuten in einem Reaktionsgemisch für den ersten Strang (First-strand reaction mix, cDNA Synthesis Kit, Pharmacia) durchgeführt. Die erhaltene Lösung (32 µl) wurde 60 Minuten bei 12 ºC in einem Reaktionsgemisch für den zweiten Strang (Second-strand reaction mix, cDNA Synthesis Kit, Pharmacia), gefolgt von 60 Minuten bei 22 ºC umgesetzt. Zu dieser Lösung wurde 1 µl DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) hinzugefügt und 30 Minuten bei 37 ºC zum Erhalt der Doppelstrang-DNS inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zugabe einer äquivalenten Menge eines Gemisches aus Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol (50 : 50 : 1) gestoppt. Die resultierende Lösung wurde 5 Minuten mit 15000 UpM zentrifugiert und zum Erhalt des Überstands abgetrennt.
- Zum Überstand wurde ein halbes Volumen 7,5 M Ammoniumacetat und danach 2,5 Äquivalente Ethanol zugegeben. Die Ethanolfällung erfolgte für 30 Minuten bei -80 ºC. Die Lösung wurde 30 Minuten lang mit 15000 UpM zentrifugiert, um die Doppelstrang-DNS (etwa 1,5 µg) als Niederschlag (Sediment) zu gewinnen. Die Doppelstrang- cDNS (1 µg) wurde mit einem Eco RI-Linker (5 µl) in einem Ligationskit (Takara Shuzou) ligiert: 30 µl Lösung A und 7,5 µl Lösung B bei 12 ºC über Nacht, gefolgt von Ethanolfällung zum Erhalt der DNS. Die DNS wurde auf ein 0,8 %iges Agarosegel geladen. Die Elektrophorese erfolgte für 2 Stunden mit 100 V unter Verwendung von Hind III-Fragmenten des Phagen Lambda als Marker.
- Ein Gel mit Anteilen von 3 bis 5 kBp wurde ausgeschnitten, um die Doppelstrang- cDNS zu erhalten. Die erhaltene cDNS wurde unter Verwendung des obigen Ligationskit mit dem Eco RI-Ort von λgt 10 (1 µg) über Nacht bei 16 ºC ligiert, mit Ethanol gefällt und in 5 µl 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 1 mM EDTA, gelöst. 5 µl dieser Lösung wurden unter Kühlung mit Eis zu einem Frier-Tau-Extrakt (Freeze/Thaw Extract) Gaigapack Gold (Stratagene) zugegeben, gefolgt von Zugabe von 15 µl Ultraschallextrakt und einer 2 stündigen Inkubation bei 22 ºC zum Verpacken. Die Lösung des rekombinanten Phagen wurde in 0,5 ml pro Liter 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO&sub4;, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5) und 5 ml 2 %ige Gelatine enthaltendes SM-Medium eingegeben, nach der Zugabe von 20 µl Chloroform 30 Sekunden mit 15000 UpM zentrifugiert und zum Erhalt eines Überstands entnommen, der bei 4 ºC aufbewahrt wurde.
- E. Coli C600 Hfl-Zellen (eine einzelne Kolonie) wurde in 50 ml einer TB-Brühe (5 g NaCl und 10 g Bactotrypton pro Liter) inokuliert, die 10 mM MgSO&sub4; und 0,2 % Maltose enthielt, und anschließend bei 30 ºC über Nacht inkubiert. Die Mikroorganismen wurden mittels 10 minütiger Zentrifugation bei 2000 UpM geerntet und in 10 mM MgSO&sub4; zum Erzielen einer optischen Dichte von 0,5 bei 600 nm suspendiert. Zu dieser E. Coli-Suspension wurde die obige, zwischengelagerte Lösung des rekombinanten Phagen zugegeben, die eine Konzentration von 5 x 10&sup4; pfu/ml (pfu = Plaque bildende Einheiten) in SM-Medium aufwies. Die daraus resultierende Lösung wurde 15 min bei 37 ºC inkubiert, zu 3 ml auf 48 ºC vorgewärmtem NZY-Weichagarmedium (5 g NaCl, 2 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 5 g Hefeextrakt, 10 g NZ-Amin und 7 g Bactoagar pro Liter) zugegeben und eingemischt.
- Die Mischung wurde auf NZY-Agarplatten (5 g NaCl, 2 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 5 g Hefeextrakt, 10 g NZ-Amin und 15 g Bactoagar pro Liter) aufgebracht, die in Petrischalen von 10 cm Durchmesser angelegt waren, und über Nacht bei 37 ºC inkubiert. Dieselbe Behandlung wurde bei insgesamt 10 Schalen wiederholt. Die cDNS-Datenbank wurde erstellt. Insgesamt wurden etwa 50.000 Plaques erhalten.
- Eine Plaquehybridisierung wurde unter Verwendung von mit ³²P markierten synthetischen DNS-Sonden durchgeführt, um Phagenplaques aus den obigen cDNS-Datenbanken herauszufinden, die eine Polypeptide mit M-CSF-Aktivität codierende cDNS enthalten.
- Die Plaquehybridisierung erfolgte gemäß dem von Maniatis et al., in Molecular Cloning, S.326 (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, beschriebenen Verfahren.
- Zum Transferieren der Phagen wurden Nitrocellulosefilter auf die Oberfläche der die Plaques enthaltenden Platten gelegt, die oben in Schritt (2) erhalten wurden. Die Filter wurden danach auf mit 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl imprägniertes Filterpapier gelegt und 5 Minuten behandelt. Die Filter wurden 5 Minuten lang mit 1,5 M NaCl enthaltendem 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5) neutralisiert und anschließend mit 500 ml doppeltem SCC für 5 Minuten behandelt, gefolgt von 2 Stunden bei 80 ºC, um die DNS der rekombinanten Phagen auf den Filtern zu fixieren. Die Filter wurden dann über Nacht bei 54 ºC mit 100 ml Vorhybridisiermischung vorhybridisiert, gefolgt von 40 Stunden bei 54 ºC Vorhybridisieren mit 20 ml 4 x 10&sup7; cpm der Sonden enthaltender Vorhybridisiermischung.
- Das Waschen der Filter sowie die Autoradiographgie erfolgten nach dem Verfahren aus Beispiel 3. Nach dem Verfahren aus Beispiel 3 synthetisierte Sonden wurden als mit ³²P markierte synthetische DNS-Sonde eingesetzt. Aus den etwa 50.000 Plaques wurden zehn Plaques erhalten, die mit beiden Sonden reagierten.
- Nach dem von Pherbal et al. in "A practical guide to molecular cloning", S.171 (1985), John Wiley & Sons Inc., beschriebenen Verfahren wurde aus jedem Plaque eine rekombinante Phagen-DNS hergestellt, teilweise mit Eco RI angedaut und der Elektrophorese auf einem 0,8 %igen Agarosegel unterworfen. Die erhaltenen Gele wurden zweimal für je 15 Minuten mit 500 ml 0,25 M HCl behandelt und zweimal 5 Minuten mit destilliertem Wasser gewaschen.
- Die Gele wurden dann zweimal für 5 Minuten mit 0,5 M NaOH/1 M NaCl (pH 7,5) alkalibehandelt und zweimal 15 Minuten lang mit 500 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 3 M NaCl, neutralisiert, gefolgt vom Transfer auf Nitrocellulosefilter in 20fachem SCC. Die Filter wurden 2 Stunden bei 80 ºC behandelt, um die DNS zu fixieren. Die Southernhybridisierung erfolgte unter denselben Bedingungen wie die obige Plaquehybridisierung.
- Der λ-Phagenclon mit dem längsten insertierten Anteil, CSF1-1, wurde selektiert.
- Die in Beispiel 4 erhaltene DNS des rekombinanten λ-Phagen CSF1-1 (50 µg) wurde 5 Minuten lang bei 37 ºC mit Eco RI (2 Einheiten) geschnitten und zum Erhalt von 2,5 µg eines DNS-Fragments von etwa 4,0 kBp der Elektrophorese auf einem 0,8 %igen Agarosegel (100 V, 2 Std.) unterworfen.
- Dieses Fragment wurde unter Anwendung des Ligationskits (Takara Shuzou, Japan) bei 16 ºC über Nacht mit dem Eco RI-Ort des Plasmids pBluescript II SK + (Stratagene) ligiert.
- E. Coli JM109-Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte von 0,5 bei 600 nm in 200 ml LB-Medium (5 g NaCl, 10 g Bactotrypton und 5 g Hefeextrakt pro Liter) kultiviert und 10 Minuten mit 4000 UpM zum Erhalt der E. Coli-Sedimente zentrifugiert, die in 100 ml 50 mM CaCl&sub2; suspendiert, eisgekühlt stehengelassen, wiederum für 10 Minuten bei 4000 UpM zentrifugiert, geerntet und in 20 ml 14 % Glycerol enthaltendem 0,1 M CaCl&sub2; resuspendiert wurden. Die Suspension wurde in 1 ml-Aliquots aufgeteilt und bei -80 ºC aufbewahrt.
- Die erhaltenen kompetenten E. Coli JM109-Zellen (0,2 ml) wurden mit dem oben hergestellten rekombinanten Vektor transformiert und in Anwesenheit von 5mM IPTG und 40 µg/ml X-gal auf ein 100 µg/ml Ampicillin enthaltendes LB-Agarmedium ausplatiert, gefolgt von Inkubation über Nacht bei 37 ºC.
- Die Transformanten wurden in Form weißer Kolonien erhalten.
- Fünf Transformanten wurden aus den oben erhaltenen Kolonien zufällig ausgewählt und bei 37 ºC über Nacht in 10 ml LB-Medium inkubiert.
- Aus den Mikroorganismen wurden die Plasmide über das alkalische SDS-Verfahren (H.C. Birnboim & J. Doly, Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)) hergestellt. Die Mikroorganismen wurden mittels 30 Sekunden Zentrifugation mit 15000 UpM gesammelt und in 600 µl Lysozympuffer (50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 10 mM EDTA) suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 400 µl Lysozym (10 mg/ml) und 10 µl RNase A (10 mg/ml) zugegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, gefolgt von Zugabe von 2000 µl einer 1 % SDS enthaltenden 0,2 N NaOH. Danach ließ man die Suspension 5 Minuten im Eisbad stehen und gab anschließend 1500 µl 5 M Kaliumacetat hinzu. Die Suspension wurde wiederum für 5 Minuten im Eisbad stehengelassen und anschließend zum Erhalt des Überstands 10 Minuten mit 15000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde mit Phenol-Chloroform behandelt; anschließend wurde zum Erhalt der Plasmide mit Ethanol gefällt. In jedem Fall wurden etwa 10 µg Plasmid erhalten. Die erhaltenen Plasmide (1 µg) wurden 5 Minuten lang bei 37 ºC teilweise mit 0,01 Einheiten Eco RI angedaut oder 120 Minuten bei 37 ºC mit je 10 Einheiten Xba I und Hind III geschnitten. Das erhaltene Gemisch wurde zum Erhalt der gewünschten Fragmente (etwa 4,0 kBp) einer 0,8 %igen Agarosegelelektrophorese unterworfen (100 V, 2 Std.). Das das Fragment von etwa 4,0 kBp tragende Plasmid wurde mit pBS II CSF bezeichnet (Fig.4).
- Der dieses Plasmid pBS II CSF tragende E. Coli JM 109-Stamm wurde am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology; Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRI) unter dem Budapester Vertrag hinterlegt.
- (Hinterlegungsnummer: FERM BP-2526; Hinterlegungsdatum: 25. Juli 1990; Transformant: Escherichia Coli JM109/pBS II CSF)
- Fünf µg des in Schritt (2) oben erhaltenen pBS II CSF wurden 120 Minuten bei 37 ºC mit 10 Einheiten Eco RI angedaut und zum Erhalt zweier Fragmente von etwa 1,85 bzw. 2,1 kBp der 0,8 %igen Agarosegelelektrophorese unterworfen (100 V, 2 Std.).
- Ein µg jedes Fragments wurde gemäß dem in Beispiel 5-(1) beschriebenen Verfahren mit 0,1 µg eines vom Plasmid pBS(+) mittels Andauen mit Eco RI abgeleiteten Fragments ligiert, gefolgt von Transfer in kompetente E. Coli JM109-Zellen und einer Behandlung gemäß dem in Beispiel 5-(1) beschriebenen Vorgehen, um Transformanten zu erhalten, die als weiße Kolonien detektiert wurden.
- Jeweils 4 Transformanten wurden nach dem Zufallsprinzip aus den auf diese Weise erhaltenen Kolonien ausgewählt und anschließend die Plasmide gemäß dem oben unter (2) beschrieben Protokoll hergestellt. Die erhaltene Plasmid-DNS (1 µg) wurde 120 Minuten bei 37 ºC mit 10 Einheiten Eco RI angedaut und der 0,8 %igen Agarosegelelektrophorese (100 V, 2 Std.) unterworfen, gefolgt von Selektion der die gewünschten Produkte enthaltenden Clone (1,85 bzw 2,1 kBp). Das das 1,85 kBp-Fragment enthaltende Plasmid wurde mit pBSS und das das 2,1 kBp-Fragment enthaltende Plasmid mit pBSL bezeichnet (Fig.5).
- Die pBS II CSF, pBSS und pBSL enthaltenden Transformanten (erhalten in Beispiel 5-(2) bzw (3)) wurden über Nacht bei 37 ºC in 11 eines 100 µg/ml Ampicillin enthaltenden LB-Mediums kultiviert und 10 Minuten bei 6000 UpM zum Erhalt der jeweiligen Zellen zentrifugiert.
- Aus diesen Zellen wurden die Plasmide pBS II CSF, pBSS und pBSL in großen Mengen gewonnen (K. Matsubara et al., J.Virol. 16, 479 (1975); Kenichi Matsubara, Protein Nucleic Acid and Enzyme, Kakusan Jitsukenhou (Sonderausgabe II), S.9, Hrsg.: Kyoritsu (1973)). Die gesammelten Zellen wurden zunächst in 30 ml TES-Puffer (30 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA) suspendiert und 10 Minuten mit 6000 UpM zentrifugiert. Die wiedergewonnenen Zellen wurden in 30 ml 25 % Saccharose enthaltendem TES-Puffer suspendiert, gefolgt von Zugabe von 5 ml 250 mM EDTA und 10 ml Lysozym (5 mg/ml) und 40 minütiger Inkubation bei 37 ºC. Zu dem Gemisch wurden 5 mg/ml Pronase zugegeben und 30 Minuten bei 37 ºC inkubiert. Anschließend wurden zu dieser Lösung 5 ml 10 % SDS und 6 ml 5 M NaCl zugegeben und das Gemisch über Nacht bei 4 ºC gelagert. Die daraus resultierende Lösung wurde 2 Stunden mit 50000 UpM zum Erhalt eines Überstands zentrifugiert, der durch Zugabe von 2,5 Äquivalenten Ethanol gefällt und 5 Minuten mit 10000 UpM zentrifugiert wurde, um die Sedimente zu gewinnen. Die Sedimente wurden in 20 ml 0,4 % N-Laurylsarcosinnatriumsalz enthaltendem TES-Puffer bei 37 ºC gelöst. Zu der erhaltenen Lösung (20 ml) wurden 20 g CsCl und 1 ml Ethidiumbromid (10 mg/ml) zugefügt, diese auf zwei 12 PA versiegelte Röhrchen aufgeteilt und anschließend 20 Stunden mit 45000 UpM zum Erhalt der Plasmide zentrifugiert. Jedes Plasmid (2 mg, 2,4 mg bzw. 2,2 mg) wurde so erhalten. Die Plasmide wurden mit Restriktionsenzymen zur Insertion in M13 mp 18 oder M13 mp19 wie unten unter (2) beschrieben angedaut und zur Restriktionskartierung der Agarosegelelektrophorese unterworfen (Fig.6).
- Für jedes Restriktionsenzym wurden 2 µg jedes Plasmids in 100 µl Puffer gelöst, wozu jeweils 10 Einheiten des respektiven Restriktionsenzyms zugegeben wurden; dieses wurde 120 Minuten inkubiert und zur Analyse der Fragmente einer Agarosegelelektrophorese unterworfen (100 V, 2 Std.).
- Für jedes Restriktionsenzym wurden 5 µg Plasmid in 100 µl Puffer gelöst, mit jeweils 10 Einheiten des betrachteten Restriktionsenzyms geschnitten und der Gelelektrophorese auf 0,7 %, 1,0 %, 1,2 %, 1,5 % oder 1,8 % Agarose unterworfen (100 V, 2 Std.). Ein Anteil der gewünschten Produkte wurde aus den Gelen ausgeschnitten.
- Das Gel wurde in einer NaI-Lösung aufgelöst, gefolgt von Adsorption der DNS auf Glasmilch entsprechend Geneclean (Bio101). Die Glasmilch wurde in 1 ml Waschlösung suspendiert und mittels Zentrifugation bei 15000 UpM für einige Sekunden und Verwerfen des Überstands gewaschen. Nach zweimaliger Wiederholung desselben Waschvorgangs wurde die Glasmilch 2 Minuten bei 50 ºC mit Wasser behandelt, um das DNS-Fragment zu eluieren. Das so erhaltene DNS-Fragment wurde mit Plasmiden ligiert, die durch Schneiden mit dem jeweiligen Restriktionsenzym erzeugte Derivate von M13 mp 18 RF oder M13 mp19 RF darstellten, um die Insertion des jeweiligen Fragments entsprechend dem oben angeführten Ligationskit in die Mehrfachclonierungsstellen der Plasmide zu ermöglichen, gefolgt von Transfektion in die (zuvor beschriebenen) kompetenten E. Coli JM109-Zellen. Die erhaltenen Transformanten wurden in Brühe-Weichagar-Medium auf Petrischalen mit Brühe-Agar ausplatiert, der mit E. Coli JM109-Zellen als Indikatorzellen gemischt war. Die Mikroorganismen wurden bei 37 ºC über Nacht kultiviert.
- Aus den auf diese Weise erhaltenen Plaques rekombinanter Phagen wurde ein einzelsträngiger rekombinanter Phage hergestellt.
- Die clonierte Basensequenz wurde durch das Annealen von Primern gemäß dem von Sanger et al. beschriebenen Didesoxykettenabbruchverfahren bestimmt (Proc.Natl.Acad. Sci. USA 74 5463 (1977); J.Mol.Biol. 162, 729 (1982)), nachdem die cDNS-Fragmente gemäß dem Verfahren von Messig et al. (Gene 19, 269 (1982)) in M13 mp18 oder mp19 subcloniert wurden, sowie mittels Synthese von komplementären Ketten (unter Verwendung der Sequenase (United States Biochemical Corporation) mit [α-³&sup5;S] dCTP (1500 Ci/mmol) markiert), gefolgt von Gelelektrophorese und Autoradiographie.
- Fig.7 zeigt die Restriktionsstellen nach der Basensequenzanalyse der M-CSF codierenden DNS sowie die Richtungen und Bereiche der verwendeten Fragmente (mit Pfeilen gekennzeichnet).
- Der offene Bereich der Abbildung stellt die codierende Sequenz des M-CSF-Translationsbereichs dar. Die M-CSF codierende Basensequenz ist in Fig.1 gezeigt.
- Von den Nukleotiden Nr.186 bis Nr.1847 wird angenommen, daß sie eine für einen M-CSF-Vorläufer codierende Sequenz darstellen.
- Von den mit dem Nukleotid Nr.282 beginnenden Bereich wird angenommen, daß er das fertige M-CSF codiert, bei dem die Aminosäure Nr.376 Pro (CCG) ist, während sie in den von Wong et al., Science 235, 1504 (1987), offenbarten Proteinen Leu (CTG) ist.
- Das TAG-Stopcodon folgt dem Codon für die Aminosäure Nr.522 (Val). Obwohl aufgrund der Degeneration des genetischen Codes keine Unterschiede in bezug auf die Aminosäuren im das Peptrid codierenden Bereich vorzukommen scheinen, handelt es sich bei den Nukleotiden Nr.1280 und 1718 der vorliegenden M-CSF-DNS jeweils um C, während Nukleotid Nr.1280 der M-CSF-DNS von Wong A und Nukleotid Nr.1718 T darstellt. Der Bereich der Nukleotide Nr.1 - 40 ist in der M-CSF-DNS von Wong nicht vorhanden.
- Im Bereich außerhalb der das Peptid codierenden Region ist das Nukleotid Nr.2296 der vorliegenden DNS G, Nr.3091 T und Nr.3346 G, während die Nukleotide Nr. 2296, 3091 bzw. 3346 der Wong'schen M-CSF-DNS C, C bzw. T darstellen. Aufgrund solcher Unterschiede erscheinen in der erfindungsgemäßen M-CSF-DNS neue Restriktionsorte.
- Zwei µg des in Beispiel 5-(3) erhaltenen Plasmids pBSS wurden 120 Minuten mit 10 Einheiten Eco RI angedaut und zum Erhalt eines die M-CSF-DNS tragenden Fragments (etwa 1,85 kBp, 200 ng) der 0,8 %igen Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das Fragment (200 ng) wurde 5 Minuten bei 37 ºC mit T4-DNA-Polymerase unter Verwendung eines "Blunting Kits" (Takara Shuzou, Japan) mit glatten Enden versehen ("Blunt ends"), gefolgt von Phenolextraktion und anschließender Ethanolfällung zum Erhalt eines Fragments mit glatten Enden.
- Zwei µg pSVL-Vektor (Pharmacia) zur Expressions in Säugerzellen wurden 120 Minuten bei 30 ºC mit 10 Einheiten Sma I angedaut und mit dem obigen M-CSF-cDNS- Fragment nach dem in Beispiel 5-(1) beschriebenen Verfahren ligiert. Die ligierten Produkte wurden in 0,3 ml kompetente E. Coli HB 101-Zellen transfektiert, diese auf 100 µg/ml Ampicillin enthaltenden LB-Agarplatten ausgebracht und zum Erhalt von Clonen über Nacht bei 37 ºC inkubiert. Mit Hilfe des oben angeführten alkalischen SDS-Verfahrens wurde die Plasmid-DNS (etwa 20 µg) aus dem obigen Clon aufgereinigt und die Insertionsrichtung mit Hilfe der Restriktionskartierung bestimmt.
- Das Ergebnis zeigt, daß der pSVL-CSF-Vektor eine cDNSsequenz aufweist, in der das M-CSF-cDNS-Fragment in derselben Richtung wie der Promoter insertiert ist, während der pSVL-CSF(-)-Vektor eine Sequenz hat, in der das Fragment in umgekehrter Richtung insertiert war (Fig.8).
- COS-7-Zellen (ATCC CRL1651) wurden mit 20 µg DNS (pSVL-CSF, pSVL-CSF(-) und pSVL) mit Hilfe des Calciumphosphatverfahrens transformiert (H. Okayama et al., Mol.Cell.Biol. 7, 2745, (1987)).
- Die COS-7-Zellinien (1 x 10&sup6; Zellen) wurden auf 100 mm Petrischalen in 10 ml eines 10 % FCS enthaltenden D-MEM-Mediums ausplatiert und über Nacht bei 37 ºC unter 5 % CO&sub2; in Luft inkubiert. Am folgenden Tag wurden 20 µg DNS in 1 ml CaCl&sub2;-BBS-Puffer (0,125 M Calciumchlorid, 25 mM BES (pH 6,95), 140 mM NaCl, 0,75 mM Na&sub2;HPO&sub4;) suspendiert und zur Bildung eines Co-Präzipitats 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dieses Co-Präzipitat wurde zu den COS-7-Zellen zugefügt und weiter für etwa 10 Stunden bei 37 ºC unter 3 % CO&sub2; in Luft inkubiert.
- Die transformierten Zellen wurden mit 4 % FCS enthaltendem D-MEM-Medium gewaschen, gefolgt won Zugabe von 5 ml 4 % FCS enthaltendem D-MEM-Medium und anschließender Inkubation für 3 Tage unter 5 % CO&sub2; bei 37 ºC.
- Der aus der Kultur gewonnene Überstand wurde auf seine M-CSF-Aktivität sowie auf die Morphologie der induzierten Kolonien hin untersucht (Tabelle 1). Tabelle 1 Kolonieverhältnisse (%) Vektor Aktivität U/ml Mix
- Der Test erfolgt gemäß dem von Pluznik, Sachs (J.Cell.Physiol 66, 319 (1965)), Bradley, Metcalf (Aust.J.Exp.Biol.Med. 44, 287 (1966)) und Tsuneoka, Shikita (FEBS Letters 77, 243 (1977)) offenbarten Verfahren.
- Pferdeserum (0,2 ml; Endkonzentration = 20 %), 1,6 % Agar (0,2 ml; Endkonzentration = 0,32 %), McCoy's 5A-Medium in doppelt isotonischer Konzentration (0,2 ml) und 0,1 ml einer 1 x 10&sup6; Knochenmarkszellen von Mäusen pro ml enthaltenden Dispersion wurden zum Erhalt eines Weichagarmediums gemischt, von dem jeweils 0,7 ml in Plastikpetrischalen mit einem Durchmesser von 35 mm gegeben wurden, die 0,3 ml einer M-CSF-Standardlösung (100 Einheiten) oder einer Verdünnungsreihe der Probenlösung enthielten.
- Nach der Verfestigung des Agars wurden die Schälchen 7 Tage bei 37 ºC in einem Inkubator mit 5 % CO&sub2; inkubiert. Sieben Tage später wurden Gruppen von mehr als 50 Zellen unter einem Inversionsmikroskop als Kolonien gezählt.
- Eine Einheit CSF-Aktivität entspricht einer CSF-Menge, durch die unter den obigen Kulturbedingungen eine Kolonie induziert werden kann.
- Die Identifikation der Kolonien erfolgt gemäß einem der folgenden zwei Verfahren:
- (I) Hämatoxylin-Färbung (M.C. Wu & A.A, Yunis, J.Clin.Invest. 65, 77 (1980)) Die eine Woche lang kultivierten und mit einem Weichagarmedium gemischten Zellen werden mit 30 %iger Essigsäure in Ethanol fixiert. Nach der Fixierung wird der Agar sukzessive mit 100 %, 70 % und 50 % Ethanol gewaschen, auf eine Glasplatte überführt und bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet. Nach dem Färben mit Hämatoxylin-Lösung (Mutou, Japan), erfolgt die Einordnung von Monozyten, Makrophagen und Granulozyten durch Untersuchung der Zellgröße und der Karyomorphie unter dem Mikroskop.
- (II) Esterase-Doppelfärbung (L.T. Yam et al., Am.J.Clin.Pathol. 55, 283 (1979), Jikken Doubutsu No Ketsuekigaku, Softscience, Co. (1981)). Die Zellen werden fixiert, indem man die Weichagarplatte 30 Sekunden mit einer kalten, phosphatgepufferten Formalin-Aceton-Lösung (pH 6,6) tränkt. Die Zellen werden mit Wasser gewaschen, an Luft getrocknet und mit einer unspezifischen Esterasefärbung unter Verwendung von 1-Naphtylbutylat als Substrat und mit einer Chloracetat-Esterasefärbung unter Verwendung von 2- Naphthol AS-D-Chloracetat als Substrat behandelt. Die Kolonieeigenschaften werden aus der Farbtönung der Färbung unter dem Mikroskop ermittelt.
- Das Ergebnis zeigt, daß die Kolonien, die durch Behandlung mit dem gewonnenen Kulturüberstand induziert wurden, zu über 98 % aus Monozyten Makrophagen bestanden.
- Das in Beispiel 7-(1) erhaltene Plasmid pSVL-CSF (2 µg) wurde 120 Minuten bei 37 ºC mit 10 Einheiten Xho I und 10 Einheiten Sac I angedaut und zur Elektrophorese auf ein 0,8 %iges Agarosegel aufgebracht (100 V, 2 Std.).
- Zum Erhalt eines M-CSF-Fragments von etwa 1,9 kBp wurde das Gel ausgeschnitten. Das erhaltene DNS-Fragment (300 ng) wurde unter Verwendung des zuvor erwähnten Blunting Kits (Takara Shuzou), Japan) mit glatten Enden versehen.
- Modifizierte Vektoren (2 µg) für die Expression in Säugern als Wirten, pSV*2 dhfr (bezeichnet als pSV2 dhfr; S.J. Scahill et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80, 4654 (1983)), wurden 120 Minuten lang bei 37 ºC mit 10 Einheiten Hind III angedaut und unter Verwendung des Blunting Kits mit glatten Enden versehen.
- Das oben angeführte DNS-Fragment wurde mit dem Vektor ligiert, gefolgt von Transfektion in kompetente E. Coli HB101-Zellen und Inkubation zum Erhalt von Clonen. Die DNS wurde aus den Clonen aufgereinigt und mittels Restriktionskartierung auf die Insertionsrichtung des M-CSF-cDNS-Fragments hin untersucht. Das Ergebnis zeigte, daß ein Vektor, pSV2*-hCSF1-mdhfr, erhalten wurde, in dem das M-CSF- cDNS-Fragment in derselben Richtung insertiert war wie der Promoter (Fig.9).
- CHO-dhfr-Mangelzellen (G. Urlanb & L.A.Chasin, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77, 4216 (1980)) wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 7-(2) beschrieben, d.h. nach dem Calciumphosphatverfahren (Okayama et al, siehe oben) mit pSV2*-hCSF1-mdhfr transfektiert und nach dem Verfahren von Kaufman et al. kultiviert (R.J. Kaufman et al., Mol.Cell.Biol. 5, 1750 (1985)).
- Ungefähr zwei Wochen später begannen Kolonien zu erscheinen und wurden in Mischform gewonnen. Die gemischten Kolonien wurden für drei bis fünf Tage zum Erhalt eines Kulturüberstandes kultiviert.
- Anschließend wurde Methotrexat (MTX) in einer Konzentration von 0,02 µM zum die Transformanten enthaltenden Kulturmedium zugegeben. Aus dem Kulturmedium für die Kolonien wurde der Überstand nach etwa zwei Wochen gewonnen.
- Der erhaltenen Überstände wurden wie in Beispiel 7-(2) beschrieben auf ihre CSF- Aktivität hin untersucht (Tabelle 2). Tabelle 2 Aktivität (U/ml)
- Es wird erwartet, daß sich die Produktivität der Polypeptide mit M-CSF-Aktivität durch Zugabe einer höheren MTX-Konzentration steigern läßt. CHO-Zellinien, die effizient Produkte mit M-CSF-Aktivität hervorbringen können, lassen sich durch Clonen der erhaltenen Kolonie unter Einsatz des Grenzverdünnungsverfahrens erzielen.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung werden sehr vorteilhafte Reaktionen auf MTX erreicht, indem man das M-CSF-Gen verwendet; dadurch lassen sich Polypeptide mit M-CSF-Aktivität auf einfache Art und Weise sowie zeitsparend erhalten.
- Da aus der Kultur Überstände mit hoher spezifischer Aktivität erhalten werden, können darüber hinaus Produkte in hoher Reinheit und großer Menge durch relativ einfache Verfahrensschritte erhalten werden. Dementsprechend ist die Erfindung für die Herstellung pharmazeutischer Produkte geeignet.
- Der Expressionsvektor pSVL-CSF (5 µg) wurde 2 Stunden lang bei 37 ºC mit 10 Einheiten BamH I (Takara Shuzou, Japan) angedaut und zum Erhalt eines 5,8 kB-Fragments der Elektrophorese auf einem 1 %igen Agarosegel unterworfen.
- Oligonukleotide, die einer zwei Aminosäuresequenzen codierenden Basensequenz entsprechen, die gemäß der Nummerierung aus Fig.10 die Aminosäuren der Nummern 213-214 bzw. 213-238 abdecken, wurden wie folgt unter Verwendung eines Biosearch 8600 DNS-Synthesegeräts (Millipore) chemisch synthetisiert:
- Die Aufreinigung der synthetischen Oligonukleotide erfolgte unter Verwendung einer Patrone zum Aufreinigen von Oligonukleotiden (Applied Biosystems Japan, Japan) oder gemäß dem Verfahren von Khorana et al. (H.G. Khorana et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81, 2285 (1984)).
- Jedes aufgereinigte Oligonukleotid wurde 1 Stunde bei 37 ºC mit 10 Einheiten T4- Polynukleotidkinase (Takara Shuzou, Japan) behandelt, um die 5'-Enden zu phosphorylieren, und anschließend annealt.
- Das [213-238]-Oligonukleotid wurde außerdem der Gelelektrophorese auf einem 7,5 %igen Polyacrylamidgel unterworfen. Die 88 Bp entsprechende Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten, elektroeluiert und gereinigt.
- Das obige Fragment von 5,8 kB wurde mit den synthetischen DNS's, [213-214] bzw. [213-238], durch 2 stündige Behandlung mit T4 DNA-Ligase (2 Einheiten; Takara Shuzou, Japan) bei 16 ºC ligiert und zum Erhalt von Transformanten in E. Coli HB101- Zellen transfektiert. Mit Hilfe der Restriktionskartierung und des Didesoxykettenabbruchverfahrens wurden die Plasmide pSVL-CSF 214 (M-CSF mit 214 Aminosäuren) und pSVL-CSF 238 (M-CSF mit 238 Aminosäuren) erhalten, in denen die synthetischen DNS-Teile richtig cloniert waren (Fig.11).
- Die Mutagenese erfolgt gemäß Mutan -K (ein System zur punktspezifischen Mutagenese, Takara Shuzou, Japan).
- Das Plasmid pBSS (5,071 Bp, 10 µg) wurde mit 20 Einheiten Eco RI und Sph I (beide Takara Shuzou, Japan) verdaut, um ein 1,195 Bp-Fragment mittels 1 %iger Agarosegelelektrophorese zu erhalten. Das Fragment wurde in die Eco RI/Sph I-Orte von M13 mp18 ligiert und in E. Coli BW313-Zellen (dut&supmin;, Ung&supmin;) transfektiert. Gemäß dem üblichen Vorgehen wurde eine einzelsträngige Phagen-DNS aus den Transformanten gewonnen. Diese einzelsträngige DNS wurde mit dem mutagenen Primer
- 5'-ATTACATTTGAGTCTGACCAGGAACAG-3'
- annealt und zur Herstellung einer vollständigen Doppelstrang-DNS mittels Synthese des komplementären Stranges mit E. Coli-Ligase und T4 DNA-Polymerase behandelt, gefolgt von Transfektion in E. Coli BMH71-18 mut S.
- Zur Erzeugung einzelsträngiger und doppelsträngiger DNS wurde der erhaltene Plaque in E. Coli JM109 rücktransferriert unter Verwendung von E. Coli MV1184 als Indikatormikroorganismus.
- In bezug auf den Clon, dessen Doppelstrang-DNS mit Hind III (BRL) verdaut werden konnte, ließ sich der gewünschte Clon mit der Mutation außerdem nach dem Didesoxykettenabbruchverfahren erhalten. Zum Erhalt eines 839 Bp-Fragments wurde die DNS aus dem Clon mit der Mutation mit Eco RI und Nco I (Takara Shzou, Japan) verdaut.
- Das Plasmid pBSS wurde vollständig mit Nco I und teilweise mit Eco RI verdaut, um ein Fragment von 4,178 Bp zu erhalten. Beide Fragmente wurden ligiert und in E. Coli JM109 zum Erhalt eines Transformanten transfektiert. Der gewünschte Transformant pBSSER wurde mittels Restriktionskartierung der Transformanten selektiert (Fig.12).
- Das Plasmid pBSSER (10 µg) wurde mit 20 Einheiten Sma I (Takara Shuzou, Japan) und 20 Einheiten BamH I zum Erhalt eines 898 Bp-Fragments verdaut. Anschließend wurden pSVL-CSF 214 und pSVL-CSF 238 zum Erhalt von 4927 Bp bzw. 4999 Bp- Fragmenten mit Sma I und BamH I angedaut, wobei diese Fragmente mit den 898 Bp- Fragment ligiert wurden, gefolgt von Transfektion in E. Coli HB101. Mittels Restriktionskartierung der erhaltenen Transformanten wurden die gewünschten Transformanten pSVL-CSF 214s bzw. pSVL-CSF 238s selektiert.
- COS-7-Zellen wurden nach dem DEAE-Dextranverfahren (Arai et al., siehe oben) mit den Plasmiden pSVL-CSF, pSVL-CSF 214, pSVL-CSF 238, pSVL-CSF214s bzw. pSVL-CSF 238s transformiert.
- Die COS 7-Zellen (1 x 10&sup6; Zellen) wurden auf Petrischalen mit 10 cm Durchmesser ausplatiert, die mit 10 % FCS ergänztes D-MEM-Medium enthielten, und über Nacht bei 37 ºC unter 5 % CO&sub2; in Luft inkubiert. Anschließend wurde das Medium entfernt und die Zellen zweimal mit FCS freiem D-MEM gewaschen. Zu den Zellen gab man 4 ml D-MEM hinzu, das jeweils 20 µg der obigen Plasmide (enthaltend 50 mM Tris- HCl (pH 7,4) und 400 µg DEAE-Dextran) enthielt, gefolgt von 4 stündiger Inkubation bei 37 ºC unter 5 % CO&sub2; in Luft. Die Zellen wurden zweimal mit D-MEM gewaschen, gefolgt von Zugabe von 7 ml 2 % FCS enthaltendem D-MEM (enthaltend 100 µM Chloroquin) und 3 stündiger Inkubation. Die Zellen wurden wiederum zweimal mit D- MEM gewaschen, gefolgt von Zugabe von 4 % FCS enthaltendem D-MEM, und anschließend 3 Tage inkubiert.
- Aus den Kulturen wurden die Überstände gewonnen und auf ihre CSF-Aktivität und die Morphologie der induzierten Kolonien hin untersucht (Tabelle 3). Tabelle 3 Kolonieverhältnis (%) Vektor Aktivität (U/ml) Monozyten-makrophagen Granulozyten Mischung
- Die Ergebnisse belegen, daß die durch Behandlung mit dem Kulturüberstand induzierten Kolonien zu über 98 % Monozyten Makrophagen aufwiesen.
- Der Expressionsvektor pSV2*-dhfr (2 µg) wurde 2 Stunden lang bei 37 ºC mit 4 Einheiten Hind III (Takara Shuzou, Japan) verdaut und 30 Minuten bei 37 ºC mit 2 Einheiten T4-Polymerase (Takara Shuzou, Japan) mit glatten Enden versehen.
- Die Vektoren pSVL-CSF 214 (10 µg) bzw. pSVL-CSF 238 (10 µg) wurden mit 20 Einheiten Xho I (Takara Shuzou, Japan) angedaut, um das CSF-Gen tragende Fragmente zu gewinnen (0,95kB bzw. 1,03 kB), die 30 Minuten lang bei 37 ºC mit 2 Einheiten T4-Polymerase mit glatten Enden versehen wurden. Das aus dem Vektor pSV2*- dhfr oben erhaltene Fragment wurde mit den das CSF-Gen tragenden Fragmenten von 0,95 bzw. 1,03 kB ligiert und anschließend in zum Erhalt der jeweiligen Transformanten in E. Coli HB101-Zellen transfektiert.
- Daraus wurden die Vektoren pSV2d-CSF 214 bzw. pSV2d-CSF 238 erhalten, in die das CSF-Gen in derselben Transcriptionsrichtung wie der Promoter cloniert war (Fig.14).
- CHO-dhfr&supmin;-Zellinien wurden über das Calciumphosphatverfahren (Okayama et al., siehe oben) mit den Plasmiden pSSV2d-CSF 214 bzw. pSV2d-CSF 238 transformiert.
- Die Selektion der Transformanten und die Genamplifikation erfolgten nach dem Verfahren von Kaufman et al. (Kaufman et al., siehe oben).
- Die CHO-dhfr&supmin;-Zellen (5 x 10&sup5; Zellen) wurden auf 10 cm-Petrischalen ausplatiert, die mit 10 % FCS ergänztes F-12-Medium enthielten, und bei 37 ºC über Nacht unter 5 % CO&sub2; in Luft inkubiert.
- Die die Plasmide pSV2d-CSF 214 und pSV2d-CSF 238 (je 25 µg) enthaltenden Calciumphosphat-Co-Präzipitate (25 mM BES (pH 6,95), 140 mM NaCl, 0,75 mM Na&sub2;HPO&sub4; und 125 mM CaCl&sub2; wurden in die CHO-Zellen transfektiert und diese bei 35 ºC unter 3 % CO&sub2; in Luft kultiviert.
- Die Zellen wurden zweimal mit F-12-Medium gewaschen, dann 10 ml des Mediums zugegeben und anschließend bei 37 ºC über Nacht unter 5 % CO&sub2; in Luft inkubiert. Die Zellen wurden mit 0,25 % Trypsin (GIBCO) enthaltendem Versene von der Grundlage gelöst, in einer Konzentration von jeweils 5 x 10&sup5; Zellen auf frischen 10 cm- Petrischalen ausplatiert, die mit 10 % FCS ergänztes F-12-Medium enthielten, und bei 37 ºC über Nacht unter 5 % CO&sub2; in Luft inkubiert. Danach wurden die Zellen zweimal mit 10 % dialysiertes FCS enthaltendem MEMα(-)-Medium gewaschen, dasselbe Medium aufgefüllt (10 ml) und dann etwa 2 Wochen bei 37 ºC unter 5 % CO&sub2; in Luft inkubiert.
- Im Verlauf der Inkubation wurde das Medium 2 oder 3 mal pro Woche ausgetauscht.
- Ungefähr zwei Wochen später wurden erzeugte Kolonien cloniert. Vier Clone, die in der Lage waren, effizient M-CSF zu produzieren, wurden selektiert und mit Hilfe von MTX amplifiziert.
- Die vier Clone wurden in einem 0,02 µM MTX (und 10 % dialysiertes FCS) enthaltenden MEMα(-)-Medium kultiviert, um resistente Clone zu erhalten, die wiederum im selben Medium, das jedoch 0,1 µM MTX enthielt, inkubiert wurden.
- Die Ergebnisse in bezug aufg die M-CSF-Aktivität in den von den resistenten Clonen konditionierten Medien sind in Tabelle 4 (pSV2d-CSF 214) bzw. Tabelle 5 (pSV2d- CSF 238) dargestellt. Tabelle 4 MTX-Resistenz CHO-Zelle Clon-Nr. Tabelle 5 MTX-Resistenz CHO-Zelle Clon-Nr. Aktivität jeweils in U/ml
- Um die Zahl der Expressionskopien des Vektors pKK223-3 (Pharmacia) zu erhöhen und eine hohe Sicherheit gegen das biologischen Austausch mit der Umwelt zu erzielen, wurden zunächst die Replikatoren tragenden Bereiche gegen pAT153 (Amasham) ausgetauscht.
- Das pKK223-3 (5 µg) wurde 2 Stunden lang bei 37 ºC vollständig mit je 10 Einheiten von Eco T14 I (Takara Shuzou; Japan) und AlwN I (NEB) abgedaut und der Elektrophorese (100 V, 2 Std.) auf einem 1,0 %igen Agarosegel unterworfen, um mittels GENECLEAN (Bio 101) ein Fragment von etwa 3 kBp zu gewinnen.
- Das pAT153 (5 µg) wurde mit denselben Restriktionsenzymen verdaut, um über dieselbe Elektrophorese und Aufreinigung einen Bereich von etwa 800 Bp zu gewinnen, der einen Replikator trägt.
- Beide isolierten Fragmente wurde mit Hilfe des zuvor erwähnten DNS-Ligationsverfahrens in Form eines Kits (Takara Shuzou, Japan) ligiert und in kompetente E. Coli HB101-Zellen transfektiert.
- Die E. Coli-Zellen wurden auf einem Ampicillin (100 µg/ml) enthaltenden LB-Agarmedium ausplatiert und über Nacht bei 37 ºC inkubiert. Aus den erhaltenen Kolonien wurden 12 zufällig selektiert und über Nacht bei 37 ºC in einem LB-Medium inkubiert. Aus der daraus resultierenden Kultur wurde unter Einsatz des bereits erwähnten alkalischen SDS-Verfahrens Plasmide hergestellt, die 2 Stunden bei 37 ºC vollständig mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms Pvu II (Takara Shuzou, Japan) abgedaut und der 1,0 %igen Agarosegelelektrophorese unterworfen wurden, um den gewünschten Clon mit einem Fragment von etwa 3,88 kBp (mit pAT223-3 bezeichnet) zu selektieren (Fig.15).
- Im nächsten Schritt wurden die einen PL-Promoter tragenden Bereich in dem durch Hitze induzierbaren Expressionsvektor pKC30 (mit PL-Promoter; CLONTECH Lab.) gegen den den tac-Promoter tragenden Bereich (der von pK223-3 stammt) in pAT223-3 ausgetauscht.
- Dazu wurde pAT223-3 (5 µg) 2 Stunden lang bei 37 ºC vollständig mit je 10 Einheiten von BamH I und Nru I (Takara Shuzou; Japan) abgedaut und der Elektrophorese (100 V, 2 Std.) auf einem 1,0 %igen Agaraosegel unterworfen, um mittels GENECLEAN ein Fragment von etwa 3 kBp zu gewinnen.
- pKC30 (5 µg) wurde ebenfalls vollständig 2 Stunden bei 37 ºC mit 10 Einheiten Pvu I (Takara Shuzou, Japan) abgedaut und mit Hilfe der T4 DNA-Polymerase (Blunting Kit) bei 37 ºC 5 Minuten lang mit glatten Enden versehen, um mittels Phenolextraktion und Ethanolfällung Fragmente zu gewinnen. Dieses Fragment wurde bei 37 ºC 2 Stunden vollständig mit 10 Einheiten BamH I verdaut und einer 1,0 %igen Agarosegelelektrophorese unterworfen (100 V, 2Std.), um unter Verwendung von GENECLEAN ein Fragment von etwa 1,3 kBp zu gewinnen. Beide isolierten Fragmente wurden nach dem im DNS-Ligationskit beschriebenen Verfahren ligiert und in kompetente E. Coli N99cI&spplus;-Zellen transfektiert. Die E. Coli-Zellen wurden über Nacht bei 37 ºC in einem Ampicillin enthaltenden (100 µg/ml) Lb-Agarmedium ausplatiert.
- Nach dem Zufallsprinzip wurden aus den erhaltenen Kolonien 12 Kolonien selektiert und in einem Ampicillin (50 µg/ml) enthaltenden LB-Medium inkubiert. Aus der Kultur wurden mit Hilfe des alkalischen SDS-Verfahrens Plasmide hergestellt, 2 Stunden bei 37 ºC mit 10 Einheiten Hpa I vollständig abgedaut und einer 1,0 %igen Agarosegelelektrophorese unterworfen, um den gewünschten Clon mit einem Fragment von etwa 4,3 kBp (bezeichnet mit pPLN) zu selektieren (Fig.15).
- Der M-CSF-DNS-Bereich des Expressionsvektors pSVL-CSF 214 wurde in die Mehrfachclonierungsstelle von pUC19 (Nippon Gene, Japan) insertiert.
- Dazu wurde pSVL-CSF 214 (5 µg) 2 Stunden lang bei 37 ºC vollständig mit je 10 Einheiten von Xba I und Xho I (Takara Shuzou; Japan) abgedaut und der Elektrophorese (100 V, 2 Std.) auf einem 1,0 %igen Agarosegel unterworfen, um mittels GENECLEAN ein Fragment von etwa 950 Bp zu gewinnen.
- pUC19 (5 µg) wurde ebenfalls vollständig 2 Stunden bei 37 ºC mit je 10 Einheiten Xba I und Sal I (Takara Shuzou, Japan) abgedaut und der Elektrophorese (100 V, 2 Std.) auf einem 1,0 %igen Agaraosegel unterworfen, um unter Verwendung von GENECLEAN ein Fragment von etwa 2,7 kBp zu gewinnen.
- Beide isolierten Fragmente wurden nach dem im DNS-Ligationskit beschriebenen Verfahren ligiert und in kompetente E. Coli JM109-Zellen transfektiert. Die E. Coli- Zellen wurden über Nacht bei 37 ºC in einem Ampicillin (100 µg/ml), X-gal (40 µg/ml) und IPTG (5 mM) enthaltenden LB-Agarmedium ausplatiert.
- Die Transformanten wurden als weiße Kolonien erhalten. Nach dem Zufallsprinzip wurden aus den erhaltenen Kolonien 12 Kolonien selektiert und in einem Ampicillin (50 µg/ml) enthaltenden LB-Medium über Nacht bei 37 ºC inkubiert.
- Aus der Kultur wurden mit Hilfe des alkalischen SDS-Verfahrens Plasmide hergestellt.
- Die Plasmide wurden 2 Stunden bei 37 ºC mit Xba I und Xho I (je 10 Einheiten) umgesetzt und der 1,0 %igen Agarosegelelektrophorese unterworfen. Es wurde ein Clon selektiert, der nicht von Xho I und nur an einer Stelle von Xba I zum ausschließlichen Erhalt des Fragments von etwa 3,6 kBp geschnitten wurde. Dieser Clon wurde mit pUC-CSF 214 bezeichnet (Fig.16).
- Zur Verwendung von Oligonukleotiden als Linker werden die folgenden mit Hilfe des Biosearch 8600 DNS-Synthesegeräts (Millipore) chemisch synthetisiert:
- Die Aufreinigung der synthetischen Oligonukleotide erfolgt unter Verwendung einer Patrone zum Aufreinigen von Oligonukleotiden (Applied Biosystems Japan, Japan) oder gemäß dem Verfahren von Khorana et al. (H.G. Khorana et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA 81, 2285 (1984)).
- Jedes gereinigte Oligonukleotid wurde mit T4-Polynukleotidkinase (Takara Shuzou, Japan) am 5'-Ende phosphoryliert. Anschließend wurde das Oligonukleotid (1) an (2) und das Oligonukleotid (3) an (4) annealt. Man erhielt zwei doppelsträngige DNS- Linker (wobei der erste als N-terminaler Linker und letzterer als N-terminaler Δ3-Linker bezeichnet wurde).
- Der Expressionsvektor pPLN (5 µg) wurde 2 Stunden lang bei 37 ºC vollstandig mit je 10 Einheiten von Hpa I und Hind III abgedaut und der Elektrophorese (100 V, 2 Std.) auf einem 1,0 %igen Agarosegel unterworfen, um mittels GENECLEAN ein Fragment von etwa 3,5 kBp zu gewinnen.
- Danach wurde pUC-CSF 214 (5 µg) wurde 2 Stunden bei 37 ºC mit 10 Einheiten Hind III und anschließend 2 Stunden bei 55 ºC mit 10 Einheiten Bst XI (NEB) abgedaut und der Elektrophorese (100 V, 2 Std.) auf einem 1,0 %igen Agarosegel unterworfen, um unter Verwendung von GENECLEAN ein Fragment von etwa 640 Bp zu gewinnen.
- Die beiden isolierten Fragmente wurden gemäß dem im Ligationskit beschriebenen Verfahren mit den N-terminalen Linker oder dem N-terminalen Δ3-Linker ligiert und in kompetente E. Coli N4830-1-Zellen transfektiert. Die E. Coli-Zellen wurden über Nacht bei 32 ºC auf einem Ampicillin (100 µg/ml) enthaltenden LB-Medium ausplatiert. Aus den erhaltenen Kolonien wurden zwölf Kolonien zufällig selektiert und bei 32 ºC über Nacht in einem ampicillinhaltigen (50 µg/ml) LB-Medium inkubiert.
- Aus der Kultur wurden Plasmide hergestellt, mit Nde I (BRL) oder Bst XI verdaut und der 1,0 %igen Agarosegelelektrophorese unterworfen, um drei Clone zu selektieren, die ein Fragment von etwa 4,2 kBp ergaben.
- Die Plasmide wurden aus den Clonen unter Einsatz des alkalischen SDS-Verfahrens hergestellt. Die erhaltenen Plasmide (je 5 µg) wurden bei 37 ºC 2 Stunden lang mit je 10 Einheiten Pst I und Bgl II (Takara Shuzou, Japan) angedaut und zum Erhalt eines Fragments von etwa 500 Bp der Elektrophorese (100 V, 2 Std.) auf einem 1,0 %igen Agarosegel unterworfen.
- M13 mp18RF (Takara Shuzou, Japan) wurde bei 37 ºC 2 Stunden mit je 10 Einheiten Pst I und BamH I verdaut und der 1,0 %igen Agarosegelelektrophorese (100 V, 2 Std.) unterworfen, um unter Verwendung von GENECLEAN ein etwa 7,2 kBp-Fragment zu erhalten.
- Die beiden isolierten Fragmente wurden gemäß dem im Ligationskit beschriebenen Verfahren ligiert und in kompetente E. Coli LM109-Zellen transfektiert. Die E. Coli- Zellen wurden in einem X-gal und IPTG enthaltenden B-Brüheagarmedium ausgebracht und über Nacht bei 37 ºC unter Verwendung von E. Coli JM109 als Indikatormikroorganismus inkubiert. Die Tranformanten wurden als weiße Plaques erhalten. Je vier Plaques wurden aus den erhaltenen Transformanten zufällig selektiert, um gemäß herkömmlicher Verfahren einzeisträngige rekombinante Phagen herzustellen.
- Die Sequenzanalyse erfolgte mit Hilfe des Didesoxykettenabbruchs. Die gewünschten Transformanten wurden untersucht und selektiert.
- Unter den auf diese weise erhaltenen Transformanten wurden zwei Clone, die die richtigen Expressionsvektoren aufwiesen, als pPNL-CSF 214 (Fig.17(a)) bzw. pPNL- CSF 214Δ3 (Fig.17(b)) bezeichnet.
- Der M-CSF-DNS-Bereich des Expressionsvektors pSVL-CSF 238 wurde auf dieselbe Art und Weise wie in Beispiel 12-(2) in eine Mehrfachclonierungsstelle von pUC19 insertiert.
- Dazu wurde pSVL-CSF 238 (5 µg) vollständig über 2 Stunden bei 37 ºC mit je 10 Einheiten Xba I und Xho I abgedaut und der 1,0 %igen Agarosegelelektrophorese (100 V, 2 Std.) unterworfen, um unter Verwendung von GENECLEAN ein etwa 1 kBp- Fragment zu erhalten.
- pUC19 (5 µg) wurde vollständig über 2 Stunden bei 37 ºC mit je 10 Einheiten Xba I und Sal I abgedaut und der 1,0 %igen Agarosegelelektrophorese (100 V, 2 Std.) unterworfen, um unter Verwendung von GENECLEAN ein etwa 2,7 kBp-Fragment zu erhalten.
- Die beiden isolierten Fragmente wurden gemäß dem im DNA-Ligationskit beschriebenen Verfahren ligiert und in kompetente E. Coli JM109-Zellen transfektiert. Die E. Coli-Zellen wurden über Nacht bei 37 ºC in einem Ampicillin (100 µg/ml), X-gal (40 µg/ml) und IPTG (5 mM) enthaltenden LB-Agarmedium ausplatiert.
- Die Transformanten wurden in Form einer weißen Kolonie erhalten.
- Zwölf Kolonien wurden aus den erhaltenen Kolonien zufällig ausgewählt und bei 37 ºC in einem ampicillinhaltigen (50 µg/ml) LB-Agarmedium über Nacht kultiviert.
- Die Plasmide wurden unter Anwendung des alkalischen SDS-Verfahrens aus der Kultur hergestellt.
- Die Plasmide wurden anschließend für 2 Stunden bei 37 ºC mit Xba I und Xho I (je 10 Einheiten) umgesetzt und einer 1,0%igen Agarosegelelektrophorese unterworfen. Man selektiert den Clon, der nicht von Xho I und zum Erhalt des gewünschten Fragments von 3,7 kBp nur an einer Stelle von Xba I geschnitten wurde.
- Dieser wurde pUC-CSF 238 genannt (Fig.18).
- Die Rekombination erfolgte wie in Beispiel 12-(4) beschrieben.
- Der Expressionsvektor pPLN (5 µg) wurde 2 Stunden bei 37 ºC mit je 10 Einheiten Hpa I und Hind III vollständig abgedaut und der 1,0 %igen Agarosegelelektrophorese (100 V, 2 Std.) unterworfen, um unter Verwendung von GENECLEAN ein etwa 3,5 kBp-Fragment zu erhalten.
- Anschließend wurde pUC-CSF 238 (5 µg) vollständig über 2 Stunden mit 10 Einheiten Hind III bei 37 ºC und danach 2 Stunden mit 10 Einheiten Bst XI bei 55 ºC abgedaut und der 1,0 %igen Agarosegelelektrophorese (100 V, 2 Std.) unterworfen, um unter Verwendung von GENECLEAN ein etwa 710 Bp-Fragment zu erhalten.
- Die beiden isolierten Fragmente wurden gemäß dem im DNA-Ligationskit beschriebenen Verfahren mit dem N-terminalen Linker oder dem N-terminalen Δ3-Linker ligiert und in kompetente E. Coli N4830-1-Zellen transfektiert. Die E. Coli-Zellen wurden über Nacht bei 32 ºC in einem Ampicillin (100 µg/ml) enthaltenden LB-Agarmedium ausplatiert. Zwölf Kolonien wurden aus den erhaltenen Kolonien zufällig ausgewählt und bei 32 ºC in einem ampicillinhaltigen (50 µg/ml) LB-Agarmedium über Nacht kultiviert. Die Plasmide wurden aus der Kultur hergestellt, mit Nde I (BRL) oder Bst I angedaut und zur Selektion des gewünschten Clons der 1,0%igen Agarosegelelektrophorese unterworfen, wobei der Clon ein Fragment von etwa 4,3 kBp ergab.
- Das Basensequenzfragment von etwa 500 Bp, das man durch die Spaltung jedes geclonten Plasmids mit Pst I und Bgl II erhielt, wurde auf dieselbe Art und Weise wie in Beispiel 12-(5) beschrieben untersucht.
- Unter den so erhaltenen Transformanten wurden zwei Clone, die die richtigen Expressionsvektoren aufweisen, mit pPLN-CSF 238 (Fig.19(a)) und pPLN-CSF 238 Δ3 (Fig.19(b)) bezeichnet.
- Die Expression der M-CSF-cDNS vom Typ 214 erfolgte unter Verwendung von E. Coli N4830-1-Zellen, die mit dem in Beispiel 12(4) konstruierten Expressionsvektor pPLN-CSF 214 transformiert wurden. Die mit pPLN-CSF 214 transformierten E. Coli- Zellen wurden mit PLN 214 bezeichnet.
- Der obige Transformant wurde bei 37 ºC über Nacht in 50 ml eines Ampicillin enthaltenden (50 µg/ml) LB-Mediums kultiviert. Das erhaltene Vorkulturmedium wurde zu einem Liter Ampicillin (50 µg/ml) enthaltendem LB-Medium zugegeben, bei 32 ºC kultiviert, bis die optische Dichte bei 550 nm 0,5 erreichte, und im Wasserbad bei 65 ºC erwärmt, bis das Medium eine Temperatur von 42 ºC erreichte. Ein Teil des Mediums wurde an dieser Stelle entnommen und unter dem Phasenkontrastmikroskop betrachtet.
- Im Kulturmedium ließen sich Proteinkörperchen beobachten, während sie in nicht- transformierten E. Coli N4830-1-Zellen nicht zu sehen waren.
- Das die Proteinkörperchen enthaltende Kulturmedium wurde 10 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert, diese wurden gesammelt und in 100 ml Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert. Die Suspension wurde 10 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert und gesammelt.
- Die Sedimente aus Mikroorganismen wurde mit Hilfe der Ultraschallbestrahlung aufgebrochen, einer SDS-PAAGE unter reduzierenden Bedingungen unterworfen und mit einem Chromatoscanner (Shimazu, Japan) untersucht. Die Menge des produzierten M-CSF-Monomeren vom Typ 214 betrug über 10% der Gesamtproteinmenge des Mikroorganismus.
- Die Proteinkörperchen wurden aus den im obigen Schritt (1) gesammelten Mikroorganismen gemäß dem Verfahren von Nagai et al. gewonnen (K. Nagai et al., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 82, 7252 (1985)).
- Das feuchte Mikroorganismensediment (10 g) wurde in 8 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (enthaltend 25 % (Gew./Gew.) Saccharose und 1 mM EDTA, pH 8,0) suspendiert. Zu der Suspension wurde Lysozym (20 mg pro 10 g feuchtes Sediment) zugefügt und 30 Minuten auf Eis stehengelassen. MgCl&sub2; und MnCl&sub2; wurden bis zu Endkonzentrationen von 10 mM bzw. 1 mM zugegeben. Außerdem wurde DNase I in einer Endkonzentration von 10 µg/ml zugefügt und wiederum bei 4 ºC auf Eis etwa 30 Minuten stehengelassen. Zu der erhaltenen Suspension wurde ein 20 mM Tris-HCl-Puffer (enthaltend 0,2 M NaCl, 2 mM EDTA, 1,6 % NP-40 und 1 % Desoxycholsäure, pH 7,5; 20 ml auf je 10 g feuchtes Sediment), etwa 30 Minuten bei 4 ºC stehengelassen und anschließend 10 Minuten mit 5000 g zum Erhalt eines Sediments zentrifugiert. Das Sediment wurde in einem 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) suspendiert, der 50 mM NaCl, 10 mM EDTA und 0,5 % Triton X-100 (das zehnfache der Gewichtsmenge des Feuchtgewichts des Sediments) enthielt, 5 Minuten bei 4 ºC stehengelassen und zum Erhalt eines Niederschlags bei 5000 g 10 Minuten zentrifugiert. Diese Behandlung mit dem Triton X-100 enthaltenden Tris-Puffer wurde dreimal wiederholt.
- Man erhielt einen Niederschlag aus Proteinkörperchen.
- Zu den im obigen Schritt (2) erhaltenen Proteinkörperchen wurden (auf je 10 g Gewicht der feuchten Proteinkörperchen) 90 ml eines 50 mM Tris-HCl-Puffers (pH 8,0) zugegeben, der 8 M Harnstoff, 1 mM EDTA und 10 mM DTT enthielt, und mit Hilfe eines Polytron Homogenisators (Kinematic) solubilisiert.
- Zu der Lösung wurde Trifluoresssigsäure in einer Endkonzentration von 10 % zugefügt und dieses auf eine YMC SH-843-15-30 Säule (S-15 300 Å C4 (YMC Co. Japan; 20 x 250 mm) aufgegeben, die mit 0,1 % Trifluoressigsäure äquilibriert war.
- Die Säule wurde mit einem 0,1 % Trifluoressigsäure enthaltenden linearen Gradienten von 40 bis 70 % Acetonitril eluiert, wobei die Fraktionen mit 62 bis 68 % Acetonitril gewonnen wurden. Das Eluat wurde gegen 0,05 % PEG enthaltenes PBS dialysiert und 10 Minuten mit 15000 UpM zum Erhalt von neugebildeten Proteinkörperchen des M-CSF-Monomeren vom Typ 214 als Niederschlag zentrifugiert. In diesem Stadium liegt die Reinheit des so erhaltenen M-CSF-Monomeren oberhalb von 90 %. Das Molekulargewicht des so erhaltenen Typ 214 M-CSF-Monomeren beträgt gemäß SDS-PAAGE unter reduzierenden Bedingungen etwa 28.000.
- Die im obigen Schritt (3) erhaltenen neugebildeten Proteinkörperchen aus M-CSF- Monomer von Typ 214 wurden in einer minimalen Menge an 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) erneut solubilisiert, der 8 M Harnstoff, 1 mM EDTA und 10 mM DTT enthielt, mit einem Rekonstitutionspuffer (pH 8,5), der 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 2 mM GSH (reduziertes Glutathion), 1 mM GSSG (oxidiertes Glutathion) enthielt, auf eine optische Dichte von 0,15 bei 280 nm verdünnt und 3 Tage lang bei 4 ºC gerührt.
- Nach der Umsetzung wurde die Lösung gegen 0,05 % PEG enthaltendes PBS dialysiert und direkt auf CSF-Aktivität hin untersucht.
- Das Ergebnis zeigt, daß die Lösung über 10&sup7; Einheiten/ml Aktivität aufweist. Bei der Untersuchung der Morphologie der gebildeten Kolonien mittels der Esterase- Doppelfärbung ließ sich bestätigen, daß es sich bei dem Produkt um M-CSF handelte, da alle gebildeten Kolonien Monozyten Makrophagen waren. Das Molekulargewicht des gebildeten Typ 214 M-CSF-Dimeren betrug gemäß SDS-PAAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen etwa 60.000.
- Die Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz erfolgte durch Eingabe eines Teils der Typ 214 M-CSF-Monomer-Fraktion in ein 477A-Protein Sequenziergerät (ABI), welches nach dem Edman-Abbau die erhaltene PTH-Aminosäure (Phenylhydantoin- Aminosäure) bestimmt.
- Nach 20 Analysezyklen wurde ermittelt, daß die N-terminale Aminosäuresequenz des von PLN 214 erzeugten M-CSF von Typ 214 wie folgt aussah:
- Met-Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-X-Ser-His-Met-Ile-Gly-Ser- Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu.
- Durch Anwendung der Carboxymethylierung des Typ 214 M-CSF-Monomeren gemäß dem von Crestfield et al. beschriebenen Verfahren (A.M. Crestfield et al., J.Biol.Chem. 238, 622 (1963)) und anschließende Proteinsequenzierung ließ sich bestätigen, daß es sich bei der nicht identifizierten Aminosäure im achten Zyklus um Cystein handelt.
- Die Expression der M-CSF-cDNS vom Typ 214 Δ3 erfolgte unter Verwendung von E. Coli N4830-1-Zellen, die mit dem in Beispiel 12(4) konstruierten Expressionsvektor pPLN-CSF 214 Δ3 transformiert wurden. Die mit pPLN-CSF 214 Δ3 transformierten E. Coli-Zellen wurden mit PLN 214Δ3 bezeichnet.
- Der obige Transformant PLN 214 Δ3 wurde gemäß dem in Beispiel 14-(1) beschriebenen Verfahren kultiviert.
- Nach der Hitzebehandlung wurde ein Teil der Brühe aus der Kultur, die 6 Stunden bei 42 ºC inkubiert worden war, unter dem Phasenkontrastmikroskop betrachtet.
- In der Kulturbrühe ließen sich den bei PLN 214 vergleichbare Proteinkörperchen beobachten.
- Die die Proteinkörperchen enthaltenden Zellen wurden nach dem in Beispiel 14-(1) beschriebenen Verfahren gesammelt. Die Zellen wurden mittels Ultraschallbestrahlung aufgebrochen, einer SDS-PAAGE unter reduzierenden Bedingungen unterworfen und mit einem Chromatoscanner untersucht.
- Die Menge des produzierten M-CSF-Monomeren vom Typ 214 Δ3 betrug mehr als 10 % der Gesamtproteinmenge des Mikroorganismus, was der Menge an M-CSF- Monomer vom Typ 214 vergleichbar war.
- Die Gewinnung der Proteinkörperchen aus den im obigen Schritt (1) gesammelten Zellen erfolgte wie in Beispiel 14-(1) beschrieben.
- Die im obigen Schritt (2) erhaltenen Proteinkörperchen wurden gemäß dem unter Beispiel 14-(3) beschriebenen Verfahren solubilisiert. Die Lösung wurde zum Erhalt der 62 bis 68 % Acetonitril-Fraktionen der Umkehrphasenchromatographie unterzogen. Die Fraktion wurde gegen 0,05 % PEG enthaltenes PBS zum Erhalt von neugebildeten Proteinkörperchen des M-CSF-Monomeren vom Typ 214 Δ3 als Niederschlag dialysiert.
- In diesem Stadium liegt die Reinheit des so erhaltenen M-CSF-Monomeren vom Typ 214 Δ3 ebenfalls oberhalb von 90 %. Das Molekulargewicht des so erhaltenen Typ 214 Δ3 M-CSF-Monomeren beträgt gemäß SDS-PAAGE unter reduzierenden Bedingungen etwa 28.000.
- Die Rekonstruktion des im obigen Schritt (3) erhaltenen M-CSF-Monomeren von Typ 214 Δ3 erfolgte gemäß dem unter Beispiel 14-(3) beschriebenen Verfahren. Nach der Umsetzung wurde die Lösung gegen 0,05 % PEG enthaltendes PBS dialysiert und direkt auf CSF-Aktivität hin untersucht.
- Das Ergebnis zeigt, daß die Lösung über 10&sup7; Einheiten/ml Aktivität aufweist. Anhand der Untersuchung der Morphologie der gebildeten Kolonien mittels der Esterase-Doppelfärbung wie in Beispiel 14-(4) ließ sich bestätigen, daß es sich bei dem Produkt um M-CSF handelte, da alle gebildeten Kolonien Monozyten Makrophagen waren. Das Molekulargewicht des gebildeten Typ 214 Δ3 M-CSF-Dimeren betrug gemäß SDS-PAAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen etwa 60.000.
- Die Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz erfolgte unter Verwendung eines Teils der Typ 214 Δ3 M-CSF-Monomer-Fraktion gemäß dem unter Beispiel 14-(5) beschriebenen Verfahren.
- Nach 20 Analysezyklen wurde ermittelt, daß die N-terminale Aminosäuresequenz des von PLN 214 Δ3 erzeugten M-CSF von Typ 214 Δ3 wie folgt aussah:
- Ser-Glu-Tyr-X-Ser-His-Met-Ile-Gly-Ser-Gly-His-Leu-Gln- Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile
- Mittels Carboxymethylierung des Typ 214 Δ3 M-CSF-Monomeren gemäß dem in Beispiel 14-(5) beschriebenen Verfahren ließ sich bestätigen, daß es sich bei der nicht identifizierten Aminosäure im vierten Zyklus um Cystein handelt.
- Die Expression der M-CSF-cDNS vom Typ 238 erfolgte unter Verwendung von E. Coli N4830-1-Zellen, die mit dem in Beispiel 13-(2) konstruierten Expressionsvektor pPLN-CSF 238 transformiert wurden.
- Die mit pPLN-CSF 238 transformierten E. Coli-Zellen wurden mit PLN 238 bezeichnet.
- Der obige Transformant PLN 238 wurde gemäß dem in Beispiel 14-(1) beschriebenen Verfahren kultiviert. Nach der Hitzebehandlung wurde ein Teil der Brühe aus der Kultur, die 6 Stunden bei 42 ºC inkubiert worden war, unter dem Phasenkontrastmikroskop betrachtet.
- In der Kulturbrühe ließen sich den bei PLN 214 zu sehenden vergleichbare Proteinkörperchen beobachten.
- Die die Proteinkörperchen enthaltenden Zellen wurden nach dem in Beispiel 14-(1) beschriebenen Verfahren gesammelt. Die Zellen wurden mittels Ultraschallbestrahlung aufgebrochen, einer SDS-PAAGE unter reduzierenden Bedingungen unterworfen und mit einem Chromatoscanner untersucht.
- Die Menge des produzierten M-CSF-Monomeren vom Typ 238 betrug mehr als 10% der Gesamtproteinmenge des Mikroorganismus, was der Menge an M-CSF-Monomer vom Typ 214 vergleichbar war.
- Die Gewinnung der Proteinkörperchen aus den im obigen Schritt (1) gesammelten Zellen erfolgte wie in Beispiel 14-(1) beschrieben.
- Die im obigen Schritt (2) erhaltenen Proteinkörperchen wurden gemäß dem unter Beispiel 14-(3) beschriebenen Verfahren solubilisiert. Ebenso wurde die Lösung zum Erhalt der 62 bis 68 % Acetonitril-Fraktionen der Umkehrphasenchromatographie unterzogen. Die Fraktion wurde gegen 0,05 % PEG enthaltenes PBS zum Erhalt von neugebildeten Proteinkörperchen des M-CSF-Monomeren vom Typ 238 als Niederschlag dialysiert. In diesem Stadium liegt die Reinheit des so erhaltenen M-CSF-Monomeren vom Typ 238 ebenfalls oberhalb von 90 %. Das Molekulargewicht des so erhaltenen Typ 238 M-CSF-Monomeren beträgt gemäß SDS-PAAGE unter reduzierenden Bedingungen etwa 32.000.
- Die Rekonstruktion des im obigen Schritt (3) erhaltenen M-CSF-Monomeren von Typ 238 erfolgte gemäß dem unter Beispiel 14-(3) beschriebenen Verfahren. Nach der Umsetzung wurde die Lösung gegen 0,05 % PEG enthaltendes PBS dialysiert und direkt auf CSF-Aktivität hin untersucht.
- Das Ergebnis zeigt, daß die Lösung über 10&sup7; Einheiten/ml Aktivität aufweist. Anhand der Untersuchung der Morphologie der gebildeten Kolonien mittels der Esterase-Doppelfärbung wie in Beispiel 14-(4) ließ sich bestätigen, daß es sich bei dem Produkt um M-CSF handelte, da alle gebildeten Kolonien Monozyten Makrophagen waren. Das Molekulargewicht des gebildeten Typ 238 M-CSF-Dimeren betrug gemäß SDS-PAAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen etwa 64.000.
- Die Analyse der N-terminalen Äminosäuresequenz erfolgte unter Verwendung eines Teils der oben in Schritt (3) erhaltenen Typ 238 M-CSF-Monomer-Fraktion gemäß dem unter Beispiel 14-(5) beschriebenen Verfahren.
- Nach 20 Analysezyklen wurde ermittelt, daß die N-terminale Aminosäuresequenz des von PLN 238 erzeugten M-CSF von Typ 238 wie folgt aussah:
- Met-Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-X-Ser-His-Met-Ile-Gly-Ser- Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu
- Mittels Carboxymethylierung des Typ 238 M-CSF-Monomeren gemäß dem in Beispiel 14-(5) beschriebenen Verfahren ließ sich bestätigen, daß es sich bei der nicht identifizierten Aminosäure im achten Zyklus um Cystein handelt.
- Die Expression der M-CSF-cDNS vom Typ 238 Δ3 erfolgte unter Verwendung von E. Coli N4830-1-Zellen, die mit dem in Beispiel 13-(2) konstruierten Expressionsvektor pPLN-CSF 238 Δ3 transformiert wurden.
- Die mit pPLN-CSF 238 Δ3 transformierten E. Coli-Zellen wurden mit PLN 238Δ3 bezeichnet.
- Der obige Transformant PLN 238 Δ3 wurde gemäß dem in Beispiel 14-(1) beschriebenen Verfahren kultiviert. Nach der Hitzebehandlung wurde ein Teil der Brühe aus der Kultur, die 6 Stunden bei 42 ºC inkubiert worden war, unter dem Phasenkontrastmikroskop betrachtet.
- In der Kulturbrühe ließen sich den bei PLN 214 beobachtbaren vergleichbare Proteinkörperchen beobachten.
- Die die Proteinkörperchen enthaltenden Zellen wurden nach dem in Beispiel 14-(1) beschriebenen Verfahren gesammelt. Die Zellen wurden mittels Ultraschallbestrahlung aufgebrochen, einer SDS-PAAGE unter reduzierenden Bedingungen unterworfen und mit einem Chromatoscanner untersucht.
- Die Menge des produzierten M-CSF-Monomeren vom Typ 238 Δ3 betrug mehr als 10 % der Gesamtproteinmenge des Mikroorganismus, was der Menge an M-CSF- Monomer vom Typ 214 vergleichbar war.
- Die Gewinnung der Proteinkörperchen aus den im obigen Schritt (1) gesammelten Zellen erfolgte wie in Beispiel 14-(1) beschrieben.
- Die im obigen Schritt (2) erhaltenen Proteinkörperchen wurden gemäß dem unter Beispiel 14-(3) beschriebenen Verfahren solubilisiert. Ebenso wurde die Lösung zum Erhalt der 62 bis 68 % Acetonitril-Fraktionen der Umkehrphasenchromatographie unterzogen. Die Fraktion wurde gegen 0,05 % PEG enthaltenes PBS zum Erhalt von neugebildeten Proteinkörperchen des M-CSF-Monomeren vom Typ 238 Δ3 als Niederschlag dialysiert. In diesem Stadium liegt die Reinheit des so erhaltenen M-CSF-Monomeren vom Typ 238 Δ3 ebenfalls oberhalb von 90 %.
- Das Molekulargewicht des Typ 238 Δ3 M-CSF-Monomeren beträgt gemäß SDS- PAAGE unter reduzierenden Bedingungen etwa 32.000.
- Die Rekonstruktion des im obigen Schritt (3) erhaltenen M-CSF-Monomeren von Typ 238 Δ3 erfolgte gemäß dem unter Beispiel 14-(3) beschriebenen Verfahren. Nach der Umsetzung wurde die Lösung gegen 0,05 % PEG enthaltendes PBS dialysiert und direkt auf CSF-Aktivität hin untersucht.
- Das Ergebnis zeigt, daß die Lösung über 10&sup7; Einheiten/ml Aktivität aufweist. Anhand der Untersuchung der Morphologie der gebildeten Kolonien mittels der Esterase-Doppelfärbung wie in Beispiel 14-(4) beschrieben ließ sich bestätigen, daß es sich bei dem Produkt um M-CSF handelte, da alle gebildeten Kolonien Monozyten Makrophagen waren. Das Molekulargewicht des gebildeten Typ 238 Δ3 M-CSF-Dimeren betrug gemäß SDS-PAAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen etwa 64.000.
- Die Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz erfolgte unter Verwendung eines Teils der im vorherigen Schritt (3) erhaltenen Typ 238 Δ3 M-CSF-Monomer-Fraktion gemäß dem unter Beispiel 14-(5) beschriebenen Verfahren.
- Nach 20 Analysezyklen wurde ermittelt, daß die N-terminale Aminosäuresequenz des von PLN 238 Δ3 erzeugten M-CSF von Typ 238 Δ3 wie folgt aussah:
- Ser-Glu-Tyr-X-Ser-His-Met-Ile-Gly-Ser-Gly-His-Leu-Gln- Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile
- Mittels der wie in Beispiel 14-(5) beschriebenen Carboxymethylierung des Typ 238 Δ3 M-CSF-Monomeren ließ sich bestätigen, daß es sich bei der nicht identifizierten Aminosäure im vierten Zyklus um Cystein handelt.
Claims (41)
1. DNS, die ausschließlich ein Polypeptid mit M-CSF-Aktivität und folgender
Aminosäuresequenz codiert:
sowie eine dazu komplementäre DNS derselben Länge.
2. DNS gemäß Anspruch 1, wobei die das Polypeptid codierende DNS folgende
Basensequenz aufweist:
3. DNS gemäß Anspruch 1,
wobei die das Polypeptid codierende DNS folgende
Basensequenz oder einen Teil derselben aufweist:
4. DNS gemäß einem der Ansprüche 1 - 3, die über eine mRNS hergestellt wird, die
aus der M-CSF erzeugenden human Monocytenzellinie U937 (hinterlegt als ATCC
CRL-1593) erhalten wird.
5. DNS gemäß einem der Ansprüche 1 - 4, die über eine mRNS hergestellt wird, die
mittels Zentrifugation in einem Saccharose-Dichtegradienten als 24,7 S- bis 27,0 S-
Fraktion aus der M-CSF erzeugenden human Monocytenzellinie U937 (hinterlegt als
ATCC CRL-1593) erhalten wird.
6. Verfahren zur Herstellung der DNS gemäß den Ansprüchen 1 - 5, bei dem man eine
mRNS aus einer human Monocytenzellinie isoliert, die aus einem von einer
Knochenmarksvorläuferzelle abgeleitenen Monocyten, einem menschlichen subakuten
lymphomatoiden Histiozyten sowie einer akuten myelomonocytischen Leukämiezelle
ausgewählt ist, und die DNS aus der mRNS herstellt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem die M-CSF erzeugende human
Monocytenzellinie U937 (hinterlegt als ATCC CRL-1953) in einem mit Phorbolmyristatacetat
und Cycloheximid ergänzten Medium kultiviert wird.
8. Transformant, der die DNS nach den Ansprüchen 1 - 5 enthält.
9. DNS gemäß einem der Ansprüche 1 - 5, die mit einem nachweisbaren Marker
verbunden ist.
10. Biologisch aktives(r) Plasmid oder Vektor, das(der) eine DNS gemäß den
Ansprüchen 1 - 5 enthält.
11. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit M-CSF-Aktivität, bei dem man
eine tierische Zelle mit einem von der DNS gemäß einem der Ansprüche 1 - 5
abgeleiteten Expressionsvektor transformiert.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, bei dem die tierische Zelle aus CHO- und COS-
Zellen ausgewählt wird.
13. Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 12, bei dem der Expressionsvektor von der
folgenden Gruppe abgeleitet wird: dem Phagen λ CSF1-1 (gemäß der Definition in
Beispiel 4(2)) und den Plasmiden pBS-II-CSF (hinterlegt als FERM BP-2526), pBSS
(gemäß der Definition in Beispiel 5(3)), pSVL-CSF (gemäß der Definition in
Beispiel 7(1)) und pSV2*-hCSF1-mdhfr (gemäß der Definition in Beispiel 8(1)).
14. Verfahren nach den Ansprüchen 11 - 13, in denen das Polypeptid die
kontinuierliche Aminosäuresequenz hat, die zwischen den Positionen 1 und 22 der Fig.3a und
3b liegt.
15. Vektor für die Expression des im Harn ausgeschiedenen human M-CSF, der die für
eine der Aminosäureseqzuenzen der Fig.10 codierende DNS, eine aus einem in einer
tierischen Zelle wirkenden Promoter bestehende DNA und eine Enhancer-Sequenz
aufweist.
16. Verfahren zur Herstehung des im Harn ausgeschiedenen human M-CSF, bei dem
man eine Säugerzelle mit dem Expressionsvektor gemäß Anspruch 15 transformiert
und den Transformanten kultiviert, um den M-CSF aus der Kultur zu gewinnen.
17. Polypeptid mit M-CSF-Aktivität, das aus einer der Aminosäuresequenzen der
Fig.10 besteht, wobei X Ser bedeutet.
18. Polypeptid gemäß Anspruch 17, bei dem n = 0 ist.
19. Polypeptid gemäß Anspruch 17, bei dem n = 1 ist.
20. Polypeptid mit M-CSF-Aktivität, das aus einer der Aminosäuresequenzen der
Fig.20 besteht.
21. Polypeptid gemäß Anspruch 20, bei dem n = 0 ist.
22. Polypeptid gemäß Anspruch 20, bei dem n = 1 ist.
23. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 20 - 22, bei dem Y die Bedeutung:
-Gly-Ser-Ala-Lys-Gln-Arg-Pro-Pro-Arg-Ser-Thr-Cys-Gln-Aer-Phe-Glu-Pro-Pro-Glu-
Thr-Pro-Val-Val-Lys hat.
24. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 20 - 22, bei dem Y keine Aminosäure
darstellt.
25. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 20 - 24, bei dem X keine Aminosäure
darstellt.
26. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 20 - 24, bei dem X Glu-Glu-Val bedeutet.
27. Polypeptid mit M-CSF-Aktivität, das aus einer der Aminosäuresequenzen der
Fig.21 besteht.
28. Polypeptid gemäß Anspruch 27, bei dem Y -Gly-Ser-Ala-Lys-Gln-Arg-Pro-Pro-
Arg-Ser-Thr-Cys-Gln-Aer-Phe-Glu-Pro-Pro-Glu-Thr-Pro-Val-Val-Lys bedeutet.
29. Polypeptid gemäß Anspruch 27, bei dem Y keine Aminosäure darstellt.
30. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 27 - 29, bei dem X Met-Glu-Glu-Val
bedeutet.
31. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 27 - 29, bei dem X Met bedeutet.
32. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 17 - 19 mit M-CSF-Aktivität und der
Aminosäuresequenz der Fig.10 in Form eines Homodimeren.
33. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 20 - 26 mit M-CSF-Aktivität und der
Aminosäuresequenz der Fig.20 in Form eines Homodimeren.
34. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 27 - 31 mit M-CSF-Aktivität und der
Aminosäuresequenz der Fig.21 in Form eines Homodimeren.
35. DNS-Sequenz, die ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 17 - 31 codiert.
36. Replizierbarer Clonierungsvektor, der die DNS-Sequenz gemäß Anspruch 35 sowie
ein in einem Mikroorganismus funktionierendes Replikon enthält.
37. Expressionssystem, in dem die DNS-Sequenz gemäß Anspruch 35 mit einer
geeigneten Kontrollsequenz funktional verknüpft ist.
38. Expressionssystem gemäß Anspruch 37, das in einem Vektor vorliegt, der sich in
einer geigneten Wirtszelle replizieren kann.
39. Expressionssystem gemäß Anspruch 35, bei dem die Expression des human M-
CSF-Monomerproteins mittels zwei-Cistronen-Verfahren durchgeführt wird.
40. Mikroorganismus als Transformant, der mit Hilfe eines Expressionssystems gemäß
Anspruch 38 oder 39 transformiert worden ist.
41. Verfahren zur Herstellung von human M-CSF, bei dem man einen ein Plasmid
tragenden Transformanten, wobei das Plasmid ein human M-CSF-Monomerprotein
exprimieren kann und der Transformant zur Erzeugung des Proteins die DNS gemäß
Anspruch 35 aufweist, kultiviert, das Protein aus der Kultur gewinnt und das human
M-CSF-Monomerprotein neu in ein biologisch aktives human
M-CSF-Homodimerprotein faltet.
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