DE69636714T2

DE69636714T2 - G-CSF TPO Fusionsproteine

Info

Publication number: DE69636714T2
Application number: DE69636714T
Authority: DE
Inventors: Haruhiko Yokoi; Yukimasa Shiotsu; Noboru Konishi; Hideharu Anazawa; Tatsuya Tamaoki; Motoo Yamasaki; Yoko Terasaki; Kazuhisa Uchida; Kinya Yamashita
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1995-04-26
Filing date: 1996-04-26
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2016-04-27
Also published as: WO1996034016A1; AU705064B2; ES2276401T3; CA2194070A1; EP0783003B1; DE69636714D1; EP0783003A4; EP0783003A1; AU5514796A; JP3763846B2; ATE346096T1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fusionspolypeptid, welches ein Polypeptid mit Aktivität des Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktors (nachfolgend als „G-CSF" bezeichnet) und ein Polypeptid mit Thrombozytenwachstumsfaktoraktivität (Thrombopoietin, nachfolgend als „TPO" bezeichnet) umfasst, und die DNA, die das Fusionspolypeptid codiert. Da das erfindungsgemäße Fusionspolypeptid gleichzeitig Thrombozyten und Neutrophile bilden und vermehren kann, ist es zur Verwendung von Anämie und dergleichen verwendbar.
Stand der Technik
Das Blut umfasst hämatopoietische Zellen wie z. B. Erythrozyten, Leukozyten, Thrombozyten und dergleichen. Diese hämatopoietischen Zellen reifen über verschiedene Differenzierungsstufen aus einer einzigen Art von pluripotenter Blutstammzelle heran. Diese Schritte unterliegen einer komplexen Regulation durch eine Gruppe proteinöser Faktoren, die allgemein als Cytokine bezeichnet werden. Eine bestimmte Art von Cytokinen nimmt an der Differenzierung und Vermehrung verschiedener hämatopoietischer Zellen teil. Andererseits unterliegt ein bestimmter Typ hämatopoietischer Zellen der Regulation seiner Differenzierung und Vermehrung durch verschiedene Typen von Cytokinen. Dies wird als Überlappung von Cytokinwirkungen bezeichnet. Unter diesen Cytokinen wird von TPO und G-CSF angenommen, dass sie wenig überlappende Wirkungen haben.
TPO nimmt hauptsächlich an der Bildung von Thrombozyten teil. Thrombozyten werden durch die Fragmentierung von Megakaryozyten, hämatopoietischen Zellen mit großem Kern, die hauptsächlich im Knochenmark zu finden sind, gebildet. Thrombozyten sind essentiell für die Bildung von Blutgerinnseln an Schadstellen in Blutgefäßen. Die Thrombozyten spielen nicht nur bei der Blutgerinnung, sondern auch bei der Heilung von Verletzungen eine wichtige Rolle, indem sie Proteine mit anderen Funktionen an den Schadstellen freisetzen. Eine starke Abnahme in der Thrombozytenanzahl kann tödlich sein, da der Körper leicht Blut verlieren kann.
G-CSF ist ein Cytokin, das die Aktivierung von Neutrophilen, einem Mitglied der Leukozytengruppe, und die Differenzierung von Neutrophilen aus ihren Vorläuferzellen beschleunigt. Die Neutrophilen unternehmen die ersten Verteidigungsaktionen im Falle eines Eindringens von Fremdorganismen wie Bakterien, Viren und dergleichen. Wenn die Anzahl der Neutrophilen sinkt, wird der Körper wehrlos gegen Infektionen, und auch diese ist oftmals tödlich.
Die gegenwärtige medizinische Behandlung von Krebsformen verursacht oftmals Nebenwirkungen, bei denen pluripotente Blutstammzellen durch die Verabreichung eines Chemotherapeutikums, durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder durch Knochenmarkstransplantationen zur Behandlung von Leukämie geschädigt werden, wodurch die Anzahl aller hämatopoietischen Zellen gesenkt wird. Offenkundig ist es von erheblichem Vorteil für Thrombopenie- und Leukopenie-Patienten, die Anzahl dieser Zellen durch die Verabreichung von Cytokinen zu steigern, um Blutungsneigungen zu unterdrücken und infektiöse Krankheiten zu verhindern.
Ein Cytokin, das Thrombozyten und Neutrophile gleichzeitig vermehren kann, ist nicht gefunden worden, und es gibt kein Medikament mit einer solchen Wirkung.
Leukämieinhibierende Faktoren, Stammzellfaktoren, Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren, Granulozyten-/Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren, Erythropoietin, Interleukin (IL)-3, IL-6, IL-11, Megakaryozyten-Kolonie-stimulierende Faktoren und dergleichen sind als Substanzen bekannt, die Thrombozyten vermehren oder die Differenzierung und Vermehrung von Megakaryozyten fordern. [Metcalf et al., Blood, 80, 50–56 (1990); Hunt et al., Blood, 80, 904–911 (1992); Examined Japanese Patent Publication No. 6-11705; Hoffman et al., Blood Cells, 13, 75–86 (1987), Mazur et al., Exp. Hematol., 15, 1123–1133 (1987); McNiece et al., Exp. Hematol., 16, 807–810 (1988); Lu et al., Brit. J. Hematol., 70, 149–156 (1988); Ishibashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5953–5957 (1989); WO 95/21919; WO 95/18858]. Diese zahlreichen Mitglieder der Cytokinfamilie führen zur Vermehrung von Thrombozyten durch überlappende Wirkungen. Vor Kurzem wurde gezeigt, dass ein Rezeptorligand namens c-mpl ein Cytokin ist, das die höchste Aktivität unter thrombozytenvermehrenden Faktoren hat und direkt wirkt [de Sauvage et al., Nature, 369, 533 (1994)].
Als Substanzen, die Granulozyten vermehren, sind das oben erwähnte IL-3, Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren, Granulozyten-/Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren und dergleichen bekannt, aber G-CSF hat die höchste Aktivität, was die selektive Vermehrung von Neutrophilen betrifft [Nicola et al., J. Biol. Chem., 258, 9017 (1983)]. Im Hinblick auf ein Polypeptid, in dem die beiden verschiedenen Arten von Cytokin fusioniert sind, gibt es Berichte in der ungeprüften veröffentlichten internationalen japanischen Patentanmeldung Nr. 500116/94, US Patent 5,359,035, Exp. Hematol., 21, 647–655 (1993) und ibid., 18, 615 (1990) und dergleichen.
Es ist jedoch nichts über ein Fusionspolypeptid bekannt, in dem TPO als eines der fusionierten Cytokine verwendet wird.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Fusionspolypeptid bereitzustellen, das Thrombozyten und Neutrophile gleichzeitig bilden und vermehren kann. Dieses Fusionspolypeptid erlaubt die Bildung von Megakaryozytenkolonien und Neutrophilenkolonien und die Differenzierung oder Reifung von Megakaryozyten-Vorläufern und Neutrophilen-Vorläufern kann kontrolliert werden.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fusionspolypeptid, das ein Polypeptid mit G-CSF-Aktivität und ein Polypeptid mit TPO-Aktivität umfasst, und DNA, die dieses Fusionspolypeptid codiert, wie in den Ansprüchen definiert. Weiterhin werden Fusionspolypeptide offenbart, in denen ein Polypeptid mit G-CSF-Aktivität und ein Polypeptid mit TPO-Aktivität über ein Spacer-Peptid fusioniert sind, und DNA, die das Fusionspolypeptid codiert; und ein Polypeptid, in dem das Fusionspolypeptid, das ein Polypeptid mit G-CSF-Aktivität und ein Polypeptid mit TPO-Aktivität umfasst, mit einem Polyethylenglycolderivat chemisch modifiziert ist. Außerdem werden Mittel zur Behandlung von Anämie bereitgestellt, die das Fusionspolypeptid als aktiven Bestandteil enthalten.
Als Polypeptid mit G-CSF-Aktivität zur erfindungsgemäßen Verwendung kann jedes beliebige Protein verwendet werden, sofern es die erforderliche G-CSF-Aktivität hat, wie z. B. ein Polypeptid mit der in Tabelle 1 dargestellten Aminosäurensequenz [Nature, 319, 415 (1986)].
Gleichfalls verwendbar ist ein Protein mit einer Aminosäurensequenz durch Substitution, Deletion oder Addition von ein oder mehreren Aminosäuren von der in Tabelle 1 dargestellten Aminosäurensequenz abgeleitet, und zu Beispielen davon gehören die in Tabelle 2 gezeigten und in den ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldungen Nr. 267299/88, Nr. 299/88 und in der ungeprüften veröffentlichten internationalen Patentanmeldung Nr. 500636/88 beschriebenen hG-CSF-Derivate.
Tabelle 1
Tabelle 2

*: unsubstituierte Aminosäure

Als Polypeptid mit TPO-Aktivität zur erfindungsgemäßen Verwendung kann jedes beliebige Protein verwendet werden, sofern es die erforderliche TPO-Aktivität besitzt, wie z. B. der c- mpl-Ligand, der ein Polypeptid mit der in Tabelle 3 dargestellten Aminosäurensequenz ist [Nature, 369, 533 (1994)], ebenso auch leukämieinhibierende Faktoren, Stammzellfaktoren, Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren, Granulozyten-/Magrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren, Erythropoietin, Interleukin (IL)-3, IL-6, IL-11, Megakaryozyten-Kolonie-stimulierende Faktoren und dergleichen.
Tabelle 3
Das Polypeptid mit G-CSF-Aktivitäten und das andere Polypeptid mit TPO-Aktivität, die das erfindungsgemäße Fusionspolypeptid bilden, sind nicht besonders limitiert, sofern sie entsprechende aktivitätsbildende Teile enthalten. Zum Beispiel kann, wenn der c-mpl-Ligand als Polypeptid mit TPO-Aktivität verwendet wird, der eine Aminosäurensequenz von der 153- und 154-zigsten Position an, gezählt von der N-terminalen Aminosäure, enthalten.
Gleichfalls umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid ein Polypeptid, in dem ein Polypeptid mit G-CSF-Aktivität und ein Polypeptid mit TPO-Aktivität über ein Spacer-Peptid fusioniert sind. Als Spacer-Peptid kann jede beliebige Sequenz verwendet werden, sofern sie nicht die G-CSF-Aktivität und die TPO-Aktivität zerstört. Zum Beispiel kann das in Tabelle 4 dargestellte Peptid als Spacer-Peptid verwendet werden. Tabelle 4
Zu Beispielen des erfindungsgemäßen Fusionspolypeptides gehören ein Polypeptid mit der Aminosäurensequenz, die in Sequenz ID Nr. 1, 2 oder 3 dargestellt ist, und ein Polypeptid, das durch Addition, Deletion oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren innerhalb eines solchen Bereiches, dass die G-CSF-Aktivität und die TPO-Aktivität nicht zerstört werden, von der Aminosäurensequenz des Fusionspolypeptids abgeleitet ist, mit einer Homologie von 40 % oder mehr mit der Aminosäurensequenz des Polypeptides. Die Homologie beträgt vorzugsweise 60 % oder mehr, und bevorzugter 80 % oder mehr.
Die Substitution, Deletion oder Addition von Aminosäuren kann gemäß bekannten Verfahren erfolgen, z. B. beschrieben in Nucleic Acid Research, 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 5662 (1984); Science, 224, 1431 (1984); PCT WO 85/00817; Nature, 316, 601 (1985); Gene, 34, 315 (1985); Nucleic Acid Research, 13, 4431 (1985); und "Current Protocols in Molecular Biology", Kapitel 8, Mutagenesis of Cloned DNA, John Wiley & Sons, Inc. (1989).
Gleichfalls in das erfindungsgemäße Fusionspolypeptid inbegriffen ist ein Peptid mit einer Aminosäurensequenz, in der ein Sekretions-Signalpeptid der N-terminalen Aminosäure des oben genannten Polypeptids hinzugefügt ist, Beispiele umfassen Polypeptide mit Aminosäurensequenzen, die in SEQ. ID Nr. 4, 5 oder 6 dargestellt sind.
Weiterhin ist auch ein Fusionspolypeptid mit G-CSF-Aktivität und TPO-Aktivität, in dem mindestens eine Aminogruppe des oben genannten Polypeptids durch ein Polyalkylenglykolderivat chemisch modifiziert ist, in das erfindungsgemäße Fusionspolypeptid inbegriffen.
Zu Beispielen des Polyalkylenderivats gehören ein Polyethylenglycolderivat, ein Polypropylenglycolderivat, ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymer-Derivat und dergleichen. Polyethylenglycol-Succinimidylpropionat ist bevorzugt.
Das mit einem Polyethylenglycolderivat chemisch modifizierte Fusionspolypeptid kann gemäß dem in der geprüften japanischen Patentanmeldung Nr. 96558/95 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Die DNA, die das erfindungsgemäße Fusionspolypeptid (nachfolgend als „TPO-CSF" bezeichnet) codiert, kann durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten und der gleichen auf der Basis der bekannten Nukleotidsequenz eines Polypeptids mit TPO-Aktivität und eines Polypeptids mit G-CSF-Aktivität erhalten werden. Sie kann auch durch chemische Synthese erhalten werden.
Zu Beispielen der DNA, die TPO-CSF codiert, gehören eine DNA, die eine Nukleotidsequenz enthält, wie ein Polypeptid mit einer Aminosäurensequenz, die in SEQ. ID Nr. 1, 2 oder 3 dargestellt ist, codiert oder ein durch Substitution, Deletion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren von der Aminosäurensequenz des Polypeptids abgeleitetes, aber die G-CSF-Aktivität und die TPO-Aktivität besitzendes Polypeptid, wie z. B. eine DNA, die die in der Sequenz ID Nr. 4, 5 oder 6 dargestellte Nukleotidsequenz enthält.
Zu anderen Beispielen gehören DNAs, in denen eine Mutation der Substitutionsmutation, eine Deletionsmutation, eine Insertionsmutation oder dergleichen, in die oben genannte DNA eingeführt ist, so dass die G-CSF-Aktivität und die TPO-Aktivität nicht zerstört werden, welche DNA z. B. durch Koloniehybridisierung oder Plaquehybridisierung erhalten werden kann unter Verwendung einer DNA, die die in Sequenz ID Nr. 4, 5 oder 6 dargestellte Nukleotidsequenz als Sonde enthält.
Ein Beispiel ist eine DNA, die dadurch identifiziert wird, dass man eine Hybridisierung eines Membranfilters durchführt, auf den aus Kolonien oder Plaque stammende DNA fixiert ist, bei 65°C in Gegenwart von 0,7 bis 1,0 M Natriumchlorid unter Verwendung einer der in der Sequenz ID Nr. 4, 5 oder 6 gezeigten Sequenz als Sonde enthaltenden DNA, gefolgt vom Waschen des so erhaltenen Filters bei 65°C in 0,1- bis 2-facher SSC-Lösung (1-fach SSC enthält 150 mM Natriumchlorid und 15 mM Natriumcitrat).
Die Hybridisierungstechniken sind in „Molecular Cloning", A laboratory manual", zweite Auflage (herausgegeben von Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), beschrieben.
Alle von der in der obigen Beschreibung definierten DNA codierten Polypeptide sind in TPO-CSF inbegriffen.
Zu Beispielen von Plasmiden, die die TPO-CSF-codierende DNA enthalten, gehören pBS-T153LND28, pBS-T154ND28 und pBS-T153ND28LN1. Escherichia coli TLN-1 als pBS-T153LND28 enthaltendes Darmbakterium Escherichia coli TN-1 als pBS154ND28 enthaltendes Darmbakterium wurden am 16. Februar 1995 beim Nationalen Institut für Biowissenschaften und Humantechnologie, Agentur für industrielle Wissenschaft und Technologie, Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan (Postleitzahl: 305), hinterlegt, und sie erhielten die Bezeichnung FERM BP-5001 beziehungsweise FERM BP-5002.
Um das so erhaltende TPO-CSF-codierende Gen (nachfolgend als „TPO-CSF-Gen" bezeichnet) in einem Wirt zu exprimieren, wird an das TPO-CSF-Gen enthaltendes DNA-Fragment zuerst in Restriktionsenzyme oder DNA-hydrolysierende Enzyme in eine das TPO-CSF-Gen-enthaltende DNA von geeigneter Länge geschnitten und in eine stromabwärts von einem Promotorgen auf einem Expressionsvektor gelegene Stelle eingefügt, und dann wird der Expressionsvektor mit der eingefügten DNA in einen für den Expressionsvektor geeigneten Wirt eingefügt.
Als Wirt kann jeder Wirt verwendet werden, der imstande ist, das gewünschte Gen zu exprimieren. Zu Beispielen gehören Mikrobenstämme aus den Gattungen Escherichia, Serratia, Cornyebacterium, Brevibacteriuim, Pseudomonas, Bacillus und dergleichen, ebenso Hefestämme, Tierzellen und dergleichen.
Als Expression verwendbar ist ein Vektor, der sich in dem oben genannten Wirt selbständig replizieren kann, oder der in dessen Chromosom integriert werden kann, und der ein Promotor an einer Stelle hat, an der Transkription des TPO-CSF-Gens erfolgen kann.
Wenn ein Mikroorganismus wie Escherichia coli oder dergleichen als Wirt verwendet wird, ist es wünschenswert, dass der TPO-CSF-Expressionsvektor sich selbständig in den Mikroorganismus vermehren kann und ein Promotor, eine Ribsomenbindungsstelle, das TPO-CSF-Gen und eine Transkriptionsterminationssequenz umfasst. Er kann auch ein regulatorisches Gen umfassen.
Zu Beispielen des Expressionsvektors gehören pBTrp2, pBTac1 und pBTac2 (alle von Boehringer-Mannheim Co. erhältlich), pKYP10 (japanische unveröffentlichte Patentanmeldung Nr. 110600/83), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript (erhältlich von STRATAGENE Co.), pTrs30 [hergestellt aus Escherichia coli JM109/pTrs30 (FERM BP-5407)], pTrs32 [hergestellt aus Escherichia coli JM109/pTrs32 (FERM BP-5408)], pAGE107 [japanische unveröffentlichte Patentanmeldung Nr. 22979/91; Miyaji et al., Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (japanische unveröffentlichte Patentanmeldung Nr. 227075190) und pAMoERC3Sc CDM8 [Brian Seed et al., Nature, 329, 840 (1987)].
Als Promotor kann jeder verwendet werden, der imstande ist, Expression in einem Wirt wie Escherichia coli oder dergleichen zu bewirken. Zu Beispielen davon gehören Promotoren, die aus Escherichia coli, Phagen und dergleichen stammen, wie z. B. der trp-Promotor (Ptrp), der lac-Promotor (Plac) der P_L-Promotor, der P_R-Promotor und dergleichen. Auch künstlich entworfene und modifizierte Promotoren sind verwendbar, wie z. B. ein Promotor, der dadurch hergestellt wird, dass man zwei Ptrp-Promotoren hintereinander (Ptrpx 2), den tac-Promotor und dergleichen verbindet.
Als Ribosomenbindungssequenz kann jede beliebige Sequenz verwendet werden, die imstande ist, die Expressionen im Wirt wie Escherichia coli oder dergleichen zu bewirken, aber es ist wünschenswert, ein Plasmid zu verwenden, indem die Ribosomenbindungssequenz und das Startcodon in einem passenden Abstand angeordnet sind (z. B. 6 bis 18 Basen).
Jedes beliebige Gen, das TPO-CSF codiert, kann als TPO-CSF-Gen verwendet werden, aber es ist wünschenswert, ein solches Gen zu verwenden, dessen Basen auf eine solche Weise substituiert sind, dass die DNA-Sequenz des Gens diejenigen Codons besitzt, die für seine Expression in den Wirtsmikroorganismen am geeignetsten sind.
Obwohl die Transkriptionsterminationssequenz nicht immer zur Expression des Gens notwendig ist, ist es wünschenswert, die Transkriptionsterminationsequenz vorzugsweise unmittelbar stromabwärts des Strukturgens anzuordnen.
Zu Beispielen für Wirte gehören Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli DH5 α, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacience, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Cornynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 und dergleichen.
Wenn ein Hefestamm als Wirt verwendet wird, können YEp13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419) oder dergleichen als Expressionsvektor verwendet werden.
Jede Art von Promotor kann verwendet werden, sofern er Expression in einen Hefestamm als Wirt bewirken kann. Zu Beispielen davon gehören Promotoren der Hexokinasegene und ähnlicher Enzyme des glykolytischen Stoffwechselweges, in Gal-1-Promotor, der Gal-10-Promotor, ein Hitzeschockproteinpromotor, der MF α1-Promotor, der CUP-1-Promotor und dergleichen.
Zu Beispielen für Wirte gehören Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyes pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius und dergleichen.
Wenn Tierzellen als Wirt verwendet werden, sind Beispiele verwendbarer Expressionsvektoren pcDNA I/Amp, pcDNA I, pcDM8 (alle von Funakoshi Co., Ltd. erhältlich), pcDNA 3 (erhältlich von Invitrogen Co.), pAGE 248, pAGE210 und dergleichen.
Jeder Promotor, der imstande ist, Expressionen in den tierischen Wirtszellen zu bewirken, kann verwendet werden. Zum Beispiel kann der menschliche CMV-IE („immediate early")-Gen-Promotor verwendet werden. Auch der Enhancer des menschlichen CMV-IE-Gens kann zusammen mit dem Promotor verwendet werden.
Jedes Gen, das TPO-CSF codiert, kann als TPO-CSF-Gen verwendet werden.
Im Allgemeinen wird nur ein Teil des von dem Gen exprimierten TPO-CSF in das extrazelluläre Medium sezerniert, so dass es, um positive extrazelluläre Sekretionen des TPO-CSF aus dem Wirt zu bewirken, wünschenswert ist, ein Gen herzustellen und zu verwenden; das eine Sequenz besitzt, in der eine ein Signalpeptid codierende Nukleotidsequenz dem Gen gemäß dem Verfahren von Paulson et al. [C. Paulson et al., J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)] und dem Verfahren von Lowe et al. [John. B. Lowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989); John. B. Lowe et al., Genes Develop., 4, 1288 (1990)] hinzugefügt wird.
Als Wirt können Namalwa-Zellen, HBT5637 (japanische unveröffentlichte Patentanmeldung Nr. 299188), COS-Zellen, CHO-Zellen und dergleichen verwendet werden.
Die Einführung von DNA, die das TPO-CSF-Gen enthält, in Tierzellen kann durch beliebige Verfahren bewirkt werden, sofern dieses Verfahren die DNA in Tierzellen einführen kann. Zum Beispiel können ein Elektroporationsverfahren [Miyaji et al., Cytotechnology, 3, 133 (1990)], ein Calciumphosphatverfahren (japanische unveröffentlichte Patentanmeldung Nr. 227075/90) ein Lipofektionsverfahren [Philip L. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)] und dergleichen verwendet werden. Die Isolation und Kultivierung eines Transformanten können gemäß dem in der ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 227075190 oder ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 257891/90 beschriebenen Verfahren bewirkt werden.
TOP-CSF kann dadurch hergestellt werden, dass man die so erhaltenen Transformanten gemäß den üblicherweise verwendeten Kultivierungsverfahren kultiviert.
Wenn ein unter Verwendung von Escherichia coli, Hefe oder ähnlichen Mikroorganismen als Wirt erhaltener Transformant kultiviert wird, kann das Medium entweder ein natürliches oder ein synthetisches Medium sein, sofern es Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und dergleichen enthält, die von dem Mikroorganismus assimiliert werden können, und eine effiziente Kultur des Mikroorganismus möglich ist.
Als Kohlenstoffquellen werden diejenigen verwendet, die von dem jeweiligen Mikroorganismus assimiliert werden können, wozu Kohlenhydrate wie Glukose, Fruktose, Saccharose, sie enthaltene Melassen, Stärke, Stärkehydrolysate und dergleichen, organische Säuren wie Essigsäure, Propionsäure und dergleichen und Alkohole wie Ethanol, Propanol und dergleichen gehören.
Zu Beispielen verwendbarer Stickstoffquellen gehören Ammoniak, Ammoniumsalze verschiedener anorganischer und organischer Säuren, wie z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumazetat, Ammoniumphosphat und dergleichen, und andere stickstoffhaltige Verbindungen, ebenso wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Getreideextrakt, Caseinhydrolysat, Sojabohnenkuchen und Sojabohnenhydrolysat, verschiedene fermentierte Mikrobenzellen und Verdauungsprodukte davon.
Zu Beispielen verwendbarer anorganischer Materialien gehören Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Kaziumcarbonat und dergleichen.
Die Kultur erfolgt unter aeroben Bedingungen durch Rühren, submerses Rühren unter Belüftung oder dergleichen. Die Temperatur für die Kultur beträgt vorzugsweise 15 bis 40°C, und die Dauer für die Kultur beträgt im Allgemeinen 16 bis 96 Stunden. Der durchschnittliche pH-Wert wird während der Kultivierung kontrolliert bei einem Wert von 3,0 bis 9,0 gehalten. Die Einstellung des pH-Werts erfolgt unter Verwendung einer anorganischen oder organischen Säure, einer basischen Lösung, Harnstoff, Calciumcarbonat, Ammoniak und dergleichen.
Gewünschtenfalls können Antibiotika wie z. B. Ampicillin, Tetracyclin und dergleichen dem Medium während der Kultivierung zugesetzt werden.
Wenn ein Mikroorganismus, der mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der unter Verwendung eines induzierbaren Promotors hergestellt worden ist, kultiviert wird, kann ein Induktor dem Medium gewünschtenfalls zugesetzt werden. Zum Beispiel können Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) oder dergleichen dem Medium zugesetzt werden, wenn ein mit einem unter Verwendung eines lac-Promotors hergestellten Expressionsvektor transformierten Mikroorganismus kultiviert wird, oder in Indolessigsäure (IAA) oder dergleichen, wenn ein mit einem unter Verwendung des trp-Promotors hergestellten Expressionsvektors transformierter Mikroorganismus kultiviert wird.
Wenn ein unter Verwendung von Tierzellen als Wirt hergestellter Transformant kultiviert wird, können grundsätzlich konditioniertes RPMI 1640-Medium, MEM-Medium (hergestellt von Eagle Co. oder GibcoBRL Co.), D-MEM-Medium (von GibcoBRL Co. hergestellt) oder ein beliebiges dieser Medien, zusätzlich mit fötalem Rinderserum und dergleichen ergänzt, verwendet werden.
Die Kultivierung erfolgt z. B. in Gegenwart von 5 % CO₂. Die Kulturtemperatur beträgt vorzugsweise 35 bis 37°C und die Dauer der Kultivierung grundsätzlich 3 bis 7 Tage.
Gewünschtenfalls können Antibiotika wie z. B. Kanamycin, Penicillin und dergleichen während der Kultivierung dem Gen zugesetzt werden.
Die Produktivität kann erhöht werden, indem man ein Genamplifikationssystem verwendet, in dem gemäß dem in der ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 227075/90 beschriebenen Verfahren das Dihydrofolatreduktasegen und dergleichen verwendet werden.
Das auf diese Weise erhaltene erfindungsgemäße TPO-CSF kann durch allgemein verwendete Proteinreinigungstechniken aufgereinigt werden.
Zum Beispiel wird, wenn das TPO-CSF nicht in das Medium außerhalb der Wirtszellen sezerniert wird, die Kulturbrühe des Transformanten der Zentrifugation unterzogen, um die Zellen aus der Kulturbrühe zu gewinnen, und die so gewonnenen Zellen werden gewaschen und dann unter Verwendung eines Ultraschallgerätes, einer hydraulischen Hochdruckpresse, eines Manton Gaulin-Homogenisators, von Dynomil oder dergleichen aufgebrochen, wodurch ein zellfreier Extrakt erhalten wird. Danach wird der zellfreie Extrakt der Zentrifugation unterzogen, und das TPO-CSF wird unter Verwendung verschiedener Techniken aus dem resultierenden flüssigen Überstand aufgereinigt, wie durch Aussalzung mit Ammoniumsulfat oder dergleichen, Anionenaustauschchromatographie auf Diethylaminoethyl (DEAE)-Sepharose oder dergleichen, hydrophobe Chromatographie auf Butylsepharose, Phenylsepharose oder dergleichen, Molekularsieb-Gelfiltration und verschiedene Arten der Elektrophorese wie z. B. isoelektrische Fokussierung und dergleichen.
Wenn das TPO-CSF sezerniert wird, kann gereinigtes TPO-CSF aus einem Kulturfiltrat des Transformanten auf die gleiche Weise wie im Fall der oben beschriebenen Behandlung des zellfreien Extraktüberstandes erhalten werden.
Wenn es in Escherichia coli-Zellen hergestellt wird, kann es auf wirksame Weise durch Kombination des oben beschriebenen Verfahrens mit dem in der japanischen unveröffentlichten Patentanmeldung Nr. 267292/88 gereinigt werden.
Es ist auch möglich, das erfindungsgemäße TPO-CSF in Form eines Fusionsproteins mit einem anderen Protein herzustellen und das Produkt durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Substanz mit Affinität für das fusionierte Protein zu reinigen. Es ist z. B. möglich, das erfindungsgemäße TPO-CSF als Fusionsprotein mit Protein A herzustellen und es durch Immunglobulin-G-Affinitätschromatographie gemäß dem Verfahren von Lowe et al. [John. B. Lowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989); John. B. Lowe et al., Genes Develop., 4, 1288 (1990)] über eine Immunglobin-G-Affinitätschromatographie zu reinigen.
Des Weiteren kann es auch durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern gereinigt werden, die spezifisch für ein Polypeptid mit G-CSF-Aktivität sind, wie z. B. für G-CSF spezifische Antikörper.
Das erfindungsgemäße TPO-CSF kann als solches oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen in verschiedenen Dosierungsformen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden dadurch hergestellt, dass man eine wirksame Menge TPO-CSF als aktiven Bestandteil einheitlich mit pharmakologisch akzeptablen Trägern mischt.
Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form von zur Injektion geeigneten Einzeldosisformen hergestellt werden. Injektionen zur injektiven Verabreichung können dadurch hergestellt werden, dass man einen Träger wie destilliertes Wasser, eine Salzlösung von Natriumchlorid oder ein Gemisch von Natriumchlorid mit anderen anorganischen Salzen, eine Zuckerlösung von Mannitol, Laktose, Dextran, Glukose der dergleichen, einer Aminosäurenlösung von Glycin, Arginin oder dergleichen, eine organische Säurelösung, eine organische Basenlösung oder eine gemischte Lösung, umfassend eine Salzlösung und eine Zuckerlösung, verwendet. In diesem Fall kann die Zusammensetzung auf die übliche Weise in Form von Lösungen, Suspensionen oder Dispersionen gebracht werden, indem man Hilfsstoffe verwendet, zu denen ein den osmotischen Druck einstellendes Mittel, ein Pflanzenöl wie Sesamöl oder Sojabohnenöl und ein oberflächenaktives Mittel wie Lecithin oder ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel gehören. Diese Lösungen können zu festen Präparaten verarbeitet werden, durch Pulverisierung, Gefriertrocknung und ähnlichen Mitteln, die wiederum vor ihrer Verwendung aufgelöst werden.
Die oben erwähnten pharmazeutischen Zusammensetzungen, die das erfindungsgemäße TPO-CSF als aktiven Bestandteil enthalten, sind verwendbar zur Behandlung von Anämie oder von Patienten, die infolge der Behandlung von Erkrankungen anämisch werden.
Kurze Erklärung der Zeichnungen
1 ist eine Illustration, die die Konstruktion eines Plasmids zeigt, das TPO-ND28 (1) codiert.
2 ist eine Illustration, die die Konstruktion eines Plasmids zeigt, das TPO-ND28 (2) codiert.
3 ist eine Illustration, die die Konstruktion eines Plasmids zeigt, das TPO-ND28 (3) codiert.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Beispiel 1 Herstellung einer DNA, die TPO-CSF codiert
Eine TPO-CSF codierende DNA wurde auf die folgende Weise hergestellt, wobei eine DNA verwendet wurde, die ein Polypeptid ND28 codiert, indem der an erster Stelle stehende Aminosäurenrest der Aminosäurensequenz des menschlichen Gens G-CSF durch Alanin (Ala) substituiert war, die Aminosäure einer dritten Position durch Threonin (Thr), die Aminosäure an vierter Position durch Tyrosin (Tyr), die Aminosäure an fünfter Position durch Arginin (Arg) und die Aminosäure an siebzehnter Position durch Serin (Ser) (japanische unveröffentlichte Patentanmeldung Nr. 267292188) als DNA, die ein Polypeptid mit G-CSF-Aktivität codiert, und eine DNA, die ein Polypeptid mit der Aminosäurensequenz der Tabelle 3 (de Sauvage et al., Nature, 369, 533 (1994); als DNA, die ein Polypeptid mit TPO-Aktivität codiert, verwendet. Als Fusionspolypeptid aus TPO und ND28 wird nachfolgend als TPO-ND28 abgekürzt.
1. Herstellung des TPO-Gens
Ein TPO-codierendes Gen (nachfolgend als „TPO-Gen" bezeichnet) zur Verwendung bei der Herstellung von TPO-ND28 wurde auf die folgende Weise durch PCR auf der Basis der von de Sauvage et al. [Nature, 369, 533 (1994)] berichteten Nukleotidsequenz erhalten.
Eine in SEQ. ID Nr. 7 dargestellte DNA, enthalten die 5'-Endnukleotidsequenz des TPO-Gens (nachfolgend als „Primer 1" bezeichnet), und eine in SEQ. ID Nr. 8 dargestellte DNA, enthaltend die 3'-Endnukleotidsequenz des TPO-Gens (nachfolgend als „Primer 2" bezeichnet) wurden aus einem 380A-DNA-Synthesizer von Applied Biosystems, Inc., synthetisiert. Zur Erleichterung der Codierung wurde dem Terminus jedes der beiden Primer eine Restriktionsenzymerkennungssequenz hinzugefügt.
Amplifikation und Klonierung der Sequenz der Translationsregion des TPO-Gens erfolgten durch reverse Transkriptionen und PCR unter Verwendung der Primer 1 und 2, Poly-A⁺-mRNA aus der menschlichen Leber (hergestellt von Clontech Co., Produkt Nr. CL 6510-1) und des Superscript Preamplification System für First Strand cDNA Synthesis Kit (hergestellt von GibcoBRL Co.).
0,013 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend 1000 ng polyadenylierter mRNA aus der menschlichen Leber und 500 ng Oligo(dt)_12-18 (in dem Kit enthalten) wurden 10 Minuten lang bei 70°C behandelt und dann 1 Minute lang auf Eis stehengelassen.
Die so erhaltene Lösung wurde mit 0,002 ml an zehnfach konzentrierten Synthesepuffer, 0,001 ml 10 mM dNTP gemischt, 0,002 ml an 0,1 M DTT und 0,001 ml an Superscript II RT (200 kU/ml) (alle im Kit enthalten) vermischt, und das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen und dann 50 Minuten lang bei 42°C inkubiert. Nach Abschluß der Inkubation wurde das Gemisch 5 Minuten lang auf 90°C erhitzt, um die Reverstranskriptionsreaktion zu beenden.
Die Reaktionslösung wurde mit 0,001 ml an E. coli RNase H (2000 U/ml; in dem Kit enthalten) vermischt und 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert.
0,1 ml der Reaktionslösung, enthaltend 0,005 ml der oben genannten Reaktionslösung, 400 nM des Primers 1, 400 nM des Primers 2, 20 mM Tris-HCl (pH 8,2), 10 mM Kaliumchlorid, 0,01 mg/ml Rinderserumalbumin (nachfolgend als „BSA" bezeichnet), 2 mM Magnesiumchlorid, 6 mM Ammoniumsulfat, 0,1 % Triton X-100, 10 % Dimethylsulfoxid (nachfolgend als „DMSO" bezeichnet), 0,05 mM Desoxyadenosintriphosphat (nachfolgend als „dATP" bezeichnet), 0,05 mM Desoxycytidintriphosphat (nachfolgend als „dCTP" bezeichnet), 0,05 mM Desoxyguanosintriphosphat (nachfolgend als „dGTP" bezeichnet) und 0,05 mM Desoxythymidintriphosphat (nachfolgend als „dTTP" bezeichnet), wurde mit 2,5 Einheiten Pfu-Polymerase (von Stratagene Co. hergestellt) gemischt, um unter Verwendung eines PERKIN ELMER CETUS DNA-Thermal Cycler (von Takara Shuzo Co. Ltd. hergestellt), eine PCR durch 35-fache Wiederholung einer dreischrittigen Inkubation (45 Sekunden bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und 2 Minuten bei 72°C) durchzuführen.
Die so erhaltene Reaktionslösung wurde einer Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung unterzogen, und das so erhaltene Präzipitat wurde in 0,015 ml TE-Puffer aufgelöst [10 mM Tris-HCl (ph 8,0) und 1 mM Ethylendiaminotetraessigsäure (nachfolgend als „EDTA" bezeichnet)].
Die so hergestellte Lösung wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und KpnI gemischt, um die durch die PCR amplifizierte DNA zu schneiden.
Die erhaltene Lösung wurde einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, und eine HindIII-KpnI behandelte DNA von 1,1 Kilobasenpaar (kb) wurde aus dem Agarosegel isoliert.
Unter Verwendung des DNA Ligation Kit Version 1 (von Takara Shuzo Co. Ltd. hergestellt), wurde die so isolierte DNA (50 ng) mit einem HindIII-KpnI-geschnittenen 2,9 Kilobasenpaar (kb)-Fragment (30 ng) eines Plasmidvektors pBlueScript II SK(-) mit einem Polylinker (von Stratagene Co. hergestellt) ligiert (Volumen der Reaktionslösung : 0,018 ml).
Unter Verwendung dieser Reaktionslösung wurde ein Escherichia coli-Stamm DH5α (Library Efficiency DH5α Competent Cell, von GibcoBRL Co. hergestellt) auf die übliche Weise transformiert, und die resultierenden Transformanten wurden auf 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB-Agarmedium ausgebracht und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Plasmide wurden aus mehreren in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren auf dem Medium kultivierten Transformantenstämmen isoliert [Birnboim et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979)].
Die Nukleotidsequenz des in jedes Plasmid eingefügten Fragmentes wurde unter Verwendung eines Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (hergestellt von Applied Biosystems Japan Inc., Produkt Nr. 401113) und eines ABI373A-DNA-Sequenzierungsgerätes (von Applied Biosystems Japan Inc. hergestellt) bestimmt. Zur Bestimmung der Nukleotidsequenz wurden sechs DNAs mit der Nukleotidsequenz der SEQ. ID Nrn. 9 bis 13 oder 14 und zwei Primern mit der in SEQ. ID Nr. 15 oder 16 dargestellten Nukleotidsequenz, enthaltend eine Nukleotidsequenz in dem Vektor, auf der Basis der Nukleotidsequenz des TPO-Gens hergestellt [de Sauvage et al., Nature, 369, 533 (1994) ] und als Primer zur Nukleotidsequenzbestimmung verwendet.
Die Bestimmung der Nukleotidsequenz erfolgte gemäß den dem Kit und dem Gerät beigelegten Instruktionen.
Unter den oben genannten Plasmiden wurde ein Plasmid pBS-TPO332, das mit der beschriebenen Nukleotidsequenz des Insertionsfragments des TPO-Gens zusammenfiel, in den nachfolgenden Prozeduren verwendet.
2. Konstruktion und Expression einer DNA, die TPO-ND28 codiert
Unter Verwendung der in Beispiel 1-1 erhaltenen TPO-codierenden DNA und der nach dem in der ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 267292/88 beschriebenen Verfahren erhaltenen in ND28 codierenden DNA wurde auf die folgende Weise ein Fusionspolypeptid von TPO und ND28 (TPO auf der N-terminalen und ND28 auf der C-terminalen Seite), TPO-ND-28, hergestellt.
1) Konstruktion der DNA (SEQ ID. Nr. 5). die TPO-ND28 (1) codiert [SEQ ID Nr. 2: ein durch einen Platzhalter konstruierter Typ (Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg; SEQ ID. Nr. 17)]
Obwohl das TPO vom reifen Typ 332 Aminosäuren umfasst, ist berichtet worden, dass ein verkürztes Protein davon, das aus seinen N-terminalen 153 Aminosäuren besteht, die gleiche Aktivität wie das TPO mit voller Länge zeigen kann [de Sauvage et al., Nature, 369, 533 (1994)], weswegen eine DNA, die TPO-ND28 (1) codiert, in dem die 153 Aminosäuren von N-Terminus von TPO, als seine N-terminale Seite verwendet, über einen Platzhalter (Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg) mit ND28 mit voller Länge (174 Aminosäuren) als C-terminaler Seite fusioniert waren, auf die folgende Weise hergestellt wurde (siehe 1).
(i) Herstellung der DNA, die den TPO-Teil von TPO-ND28 (1) codiert
Um durch PCR eine DNA herzustellen, die für den TPO-Teil von TPO-ND28 (1) codiert, wurde ein DNA-Primer mit einer Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 18), die dem Platzhalter entspricht, als 3'-terminaler Primer hergestellt (nachfolgend als „Primer 3" bezeichnet).
Unter Verwendung des so hergestellten Primers 3, des Primers 1 und von pBS-TPO332 wurde auf die folgende Weise eine PCR durchgeführt.
0,1 ml der Reaktionslösung, enthaltend 10 ng pBS-TPO332, 400 nM des Primers 3, 400 nM des Primers 1, 20 mM Tris-HCl (pH 8,2), 10 mM Kaliumchlorid, 0,01 mg/ml BSA, 2 mM Magnesiumchlorid, 6 mM Ammoniumsulfat, 0,1 % Triton X-100, 10 % DMSO, 0,05 mM dATP, 0,05 mM dCTP, 0,05 mM dGTP und 0,05 mM dTTP, wurde mit 2,5 Einheiten Pfu-Polymerase (von Stratagene Co. hergestellt) gemischt, um unter Verwendung eines PERKIN ELMER CETUS DNA-Thermal Cycler (von Takara Shuzo Co. Ltd. hergestellt), eine PCR durch 18-fache Wiederholung einer dreischrittigen Inkubation (45 Sekunden bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und 2 Minuten bei 72°C) durchzuführen.
Die so erhaltene Reaktionslösung wurde einer Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung unterzogen, und das so erhaltene Präzipitat wurde in 0,015 ml TE-Puffer aufgelöst.
Die so hergestellte Lösung wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI gemischt, um die durch die PCR amplifizierte DNA zu schneiden.
Die erhaltene Lösung wurde einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, und eine HindIII-XbaI behandelte DNA von 0,6 Kilobasenpaar (kb) wurde aus dem Agarosegel isoliert.
Unter Verwendung des DNA Ligation Kit Version 1 (von Takara Shuzo Co. Ltd. hergestellt), wurde das so isolierte DNA-Fragment (100 ng) mit einem HindIII-XbaI-geschnittenen 2,9 Kilobasenpaar (kb)-Fragment (50 ng) eines Plasmidvektors pBlueScript II SK(-) mit einem Polylinker (von Stratagene Co. hergestellt) ligiert (Volumen der Reaktionslösung: 0,018 ml).
Unter Verwendung dieser Reaktionslösung wurde der Escherichia coli-Stamm DH5α auf die übliche Weise transformiert, und die resultierenden Transformanten wurden auf 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB-Agarmedium ausgebracht und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Plasmide wurden aus mehreren auf dem Medium in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren kultivierten Transformantenstämmen isoliert.
Die Nukleotidsequenz des in jedes Plasmid eingefügten Fragmentes wurde unter Verwendung eines Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit und eines ABI373A-DNA-Sequenzierungsgerätes (von Applied Biosystems Japan Inc. hergestellt) bestimmt. Zur Bestimmung der Nukleotidsequenz wurden Primer mit den Nukleotidsequenzen der SEQ ID Nrn. 9 bis 12, 15 und 16 als Primer zur Nukleotidsequenzbestimmung verwendet.
Die Bestimmung zur Nukleotidsequenz erfolgte gemäß den dem Kit und dem Gerät beigelegten Instruktionen.
Unter den oben genannten Plasmiden wurde ein Plasmid pBS-T153LND, das mit der beschriebenen Nukleotidsequenz des Insertionsfragments des TPO-Gens zusammenfiel, in den nachfolgenden Prozeduren verwendet.
(ii) Herstellung der DNA. die den ND28-Teil von TPO-ND28 (1) codiert
Um durch PCR eine DNA herzustellen, die für den ND28-Teil von TPO-ND28 (1) codiert, wurde ein Primer mit einer Nukleotidsequenz (SEQ. ID Nr. 19), die dem Platzhalter und der Aminosäurensequenz von ND28 entspricht, als 5'-endiger Primer (nachfolgend als „Primer 4" bezeichnet) und ein Primer mit einer Nukleotidsequenz (SEQ. ID Nr. 20), die der C-terminalen Aminosäurensequenz von ND28 entspricht, als 3'-endiger Primer (nachfolgend als „Primer 5" bezeichnet), hergestellt.
Unter Verwendung der so hergestellten Primers und des Plasmids pCfBD28 (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 267292/88) wurde auf die folgende Weise eine PCR durchgeführt.
0,1 ml der Reaktionslösung, enthaltend 10 ng pCfBD28, 400 nM des Primers 4, 400 nM des Primers 5, 20 mM Tris-HCl (pH 8,2), 10 mM Kaliumchlorid, 0,01 mg/ml BSA, 2 mM Magnesiumchlorid, 6 mM Ammoniumsulfat, 0,1 % Triton X-100, 10 % DMSO, 0,05 mM dATP, 0,05 mM dCTP, 0,05 mM dGTP und 0,05 mM dTTP, wurde mit 2,5 Einheiten Pfu-Polymerase (von Stratagene Co. hergestellt) gemischt, und unter Verwendung eines PERKIN ELMER CETUS DNA-Thermal Cycler (von Takara Shuzo Co. Ltd. hergestellt), eine PCR durch 18-fache Wiederholung einer dreischrittigen Inkubation (45 Sekunden bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und 2 Minuten bei 72°C) durchzuführen.
Die so erhaltene Reaktionslösung wurde einer Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung unterzogen, und das so erhaltene Präzipitat wurde in 0,015 ml TE-Puffer aufgelöst.
Die so hergestellte Lösung wurde mit den Restriktionsenzymen SacII und XbaI gemischt, um die durch die PCR amplifizierte DNA zu schneiden.
Die erhaltene Lösung wurde einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, und eine SacII-XbaI behandelte DNA von 0,5 Kilobasenpaar (kb) wurde aus dem Agarosegel isoliert.
Unter Verwendung des DNA Ligation Kit Version 1 (von Takara Shuzo Co. Ltd. hergestellt), wurde das so isolierte DNA-Fragment (100 ng) mit einem SacII-XbaI-geschnittenen 2,9 Kilobasenpaar (kb)-Fragment (50 ng) eines Plasmidvektors pBlueScript II SK(-) mit einem Polylinker (von Stratagene Co. hergestellt) ligiert (Volumen der Reaktionslösung: 0,018 ml).
Unter Verwendung dieser Reaktionslösung wurde der Escherichia coli-Stamm DH5α auf die übliche Weise transformiert, und die resultierenden Transformanten wurden auf 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB-Agarmedium ausgebracht und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Plasmide wurden aus mehreren auf dem Medium in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren kultivierten Transformantenstämmen isoliert.
Die Nukleotidsequenz des in jedes Plasmid eingefügten Fragmentes wurde unter Verwendung eines Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit und eines ABI373A-DNA-Sequenzierungsgerätes (von Applied Biosystems Japan Inc. hergestellt) bestimmt. Zur Bestimmung der Nukleotidsequenz wurden zwei DNAs mit den Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO:21 oder 22, enthaltend eine Nukleotidsequenz der ND28-codierenden DNA, und zwei DNAs mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:15 oder 16, enthaltend eine in dem Vektor vorliegende Nukleotidsequenz, als Primer zur Nukleotidsequenzbestimmung verwendet.
Die Bestimmung zur Nukleotidsequenz erfolgte gemäß den dem Kit und dem Gerät beigelegten Instruktionen.
Unter den oben genannten Plasmiden wurde ein Plasmid pBS-LND28, das mit der beschriebenen Nukleotidsequenz des Insertionsfragments des ND28-Gens und den Primern zusammenfiel, in den nachfolgenden Prozeduren verwendet.
(iii) Herstellung der DNA, die TPO-ND28 (1) codiert
Die in Beispiel 1-2-1)-(i) und (ii) hergestellten DNAs, die den TPO-Teil beziehungsweise den ND28-Teil codieren, wurden auf die folgende Weise fusioniert.
2000 ng pBS-T153LND wurden mit den Restriktionsenzymen SacII und XbaI gespalten und einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment von ungefähr 3,5 Kilobasen (kb) zu isolieren.
Ebenso wurden 500 ng pBS-LND28 mit den Restriktionsenzymen SacII und XbaI geschnitten und der Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment von ungefähr 0,5 Kilobasen (kb) zu isolieren.
Unter Verwendung des DNA Ligation Kit Version 1 (von Takara Shuzo Co. Ltd. hergestellt), wurde das DNA-Fragment von etwa 3,5 kb (100 ng) mit DNA-Fragment von etwa 0,5 kbp (100 ng) ligiert (Volumen der Reaktionslösung: 0,018 ml).
Unter Verwendung dieser Reaktionslösung wurde der Escherichia coli-Stamm DH5α auf die übliche Weise transformiert, und die resultierenden Transformanten wurden auf 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB-Agarmedium ausgebracht und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Plasmide wurden aus mehreren auf dem Medium in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren kultivierten Transformantenstämmen isoliert.
Die Strukturen dieser Plasmide wurden unter Verwendung der Restriktionsenzyme SacII und XbaI untersucht, und das Plasmid pBS-T53LND28 mit einer Struktur, in der beide der DNA-Fragmente miteinander ligiert sind, wurde in den nachfolgenden Prozeduren verwendet.
2) Konstruktion der DNA (SEQ ID. Nr. 4) die TPO-ND28 (2) codiert [SEQ ID Nr 1 ein ohne Platzhalter konstruierter Typ]
Eine DNA, die TPO-ND28 codiert, in dem die 154 Aminosäuren vom N-Terminus des TPO mit dem N-Terminus des D28 (174 Aminosäuren) fusioniert waren, wurde auf die folgende Weise hergestellt (vergl. 2).
(i) Herstellung der DNA, die den TPO-Teil von TPO-ND28 (2) codiert
Um durch PCR eine DNA herzustellen, die für den TPO-Teil von TPO-ND28 (1) codiert, wurde ein DNA-Primer mit einer in SEQ ID Nr. 23 dargestellten Nukleotidsequenz, die den AMinosäureequenzen von TPO und ND28 entspricht, als 3'-endiger Primer hergestellt (nachfolgend als „Primer 6" bezeichnet).
Unter Verwendung des so hergestellten Primers 6, des Primers 1 und pBS-TPO332, wurde auf die folgende Weise eine PCR durchgeführt.
0,1 ml der Reaktionslösung, enthaltend 10 ng pBS-TPO332, 400 nM des Primers 6, 400 nM des Primers 1, 20 mM Tris-HCl (pH 8,2), 10 mM Kaliumchlorid, 0,01 mg/ml BSA, 2 mM Magnesiumchlorid, 6 mM Ammoniumsulfat, 0,1 % Triton X-100, 10 % DMSO, 0,05 mM dATP, 0,05 mM dCTP, 0,05 mM dGTP und 0,05 mM dTTP, wurde mit 2,5 Einheiten Pfu-Polymerase gemischt, um unter Verwendung eines PERKIN ELMER CETUS DNA-Thermal Cycler eine PCR durch 18-fache Wiederholung einer dreischrittigen Inkubation (45 Sekunden bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und 2 Minuten bei 72°C) durchzuführen.
Die so erhaltene Reaktionslösung wurde einer Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung unterzogen, und das so erhaltene Präzipitat wurde in 0,015 ml TE-Puffer aufgelöst.
Die so hergestellte Lösung wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und XhoI gemischt, um die durch die PCR amplifizierte DNA zu schneiden.
Die erhaltene Lösung wurde einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, und eine HindIII-XhoI behandelte DNA von ungefähr 0,5 Kilobasenpaar (kb) wurde aus dem Agarosegel isoliert.
Unter Verwendung des DNA Ligation Kit Version 1 (von Takara Shuzo Co. Ltd. hergestellt), wurde das so isolierte DNA-Fragment (100 ng) mit einem HindIII-XhoI-geschnittenen 2,9 Kilobasenpaar (kb)-Fragment (50 ng) eines Plasmidvektors pBlueScript II SK(-) ligiert (Volumen der Reaktionslösung: 0,018 ml).
Unter Verwendung dieser Reaktionslösung wurde der Escherichia coli-Stamm DH5α auf die übliche Weise transformiert, und die resultierenden Transformanten wurden auf 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB-Agarmedium ausgebracht und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Plasmide wurden aus mehreren auf dem Medium in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren kultivierten Transformantenstämmen isoliert.
Die Nukleotidsequenz des in jedes Plasmid eingefügten Fragmentes wurde unter Verwendung eines Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit und eines ABI373A-DNA-Sequenzierungsgerätes (von Applied Biosystems Japan Inc. hergestellt) bestimmt. Zur Bestimmung der Nukleotidsequenz wurden Primer mit den Nukleotidsequenzen der SEQ ID Nrn. 9 bis 12, 15 und 16 als Primer zur Nukleotidsequenzbestimmung verwendet.
Die Bestimmung zur Nukleotidsequenz erfolgte gemäß den dem Kit und dem Gerät beigelegten Instruktionen.
Unter den oben genannten Plasmiden wurde ein Plasmid pBS-T154ND, das mit der beschriebenen Nukleotidsequenz des Insertionsfragments des TPO-Gens zusammenfiel, in den nachfolgenden Prozeduren verwendet.
(ii) Herstellung der DNA, die TPO-ND28 (2) codiert
Die in Beispiel 1-2-2)-(i) hergestellte DNA, die den TPO-Teil codiert, und die in Beispiel 1-2-1)-(ii) hergestellte DNA, die den ND28-Teil codiert, wurden auf die folgende Weise fusioniert.
200 ng pBS-T154ND wurden mit den Restriktionsenzymen KpnI und XhoI gespalten und einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment von ungefähr 3,5 Kilobasen (kb) zu isolieren.
Ebenso wurden 500 ng pBS-LND28 mit den Restriktionsenzymen KpnI und XhoI geschnitten und der Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment von ungefähr 0,5 Kilobasen (kb) zu isolieren.
Unter Verwendung des DNA Ligation Kit Version 1 (von Takara Shuzo Co. Ltd. hergestellt), wurde das so isolierte DNA-Fragment von etwa 3,5 kb (100 ng) mit dem DNA-Fragment von etwa 0,5 kb (100 ng) ligiert (Volumen der Reaktionslösung: 0,018 ml).
Unter Verwendung dieser Reaktionslösung wurde der Escherichia coli-Stamm DH5α auf die übliche Weise transformiert, und die resultierenden Transformanten wurden auf 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB-Agarmedium ausgebracht und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Plasmide wurden aus mehreren auf dem Medium in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren kultivierten Transformantenstämmen isoliert.
Die Strukturen dieser Plasmide wurden unter Verwendung der Restriktionsenzyme KpnI und XhoI untersucht, und das Plasmid pBS-T154ND28 mit einer Struktur, in der beide der DNA-Fragmente miteinander ligiert sind, wurde in den nachfolgenden Prozeduren verwendet.
3) Konstruktion der DNA (SEQ ID Nr. 6), die TPO-ND28 (3) codiert [SEQ ID Nr. 3; ein durch einen Platzhalter konstruierter Typ (Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg; SEQ ID Nr. 24)]
Eine DNA, die TPO-ND28 (3) codiert, in dem die 153 Aminosäuren von dem N-Terminus von TPO, als seine N-Terminalseite verwendet, über einen Platzhalter (Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg) mit ND28 von voller Länge (174 Aminosäuren) als C-terminale Seite über einen Platzhalter verbunden waren, wurde auf die folgende Weise hergestellt (siehe 3).
Um die DNA, die die in Beispiel 1-2-2)-(i) hergestellte TPO-Hälfte codiert, mit der DNA, die die in Beispiel 1-2-1)-(ii) hergestellte ND28-Hälfte codiert, über einen Linker zu ligieren (Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg), wurden zwei in SEQ ID Nrn. 25 und 26 dargestellte DNAs mit Nukleotidsequenzen, die Spl1-Bbe1 komplementäre Enden auf beiden Seiten bilden, die den Aminosäurensequenzen der Linker entsprechen, hergestellt.
0,02 ml einer Lösung, enthaltend 0,01 mM der in SEQ ID Nr. 25 dargestellten DNA, 5 mM ATP, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM Magnesiumchlorid und 5 mM Dithiothreitol, wurden mit 10 Einheiten T4-Polynukleotidkinase vermischt (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), und das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 37°C stehen gelassen und dann 3 Minuten lang auf 70°C erhitzt, um die Behandlungslösung (1) zu erhalten.
Die in SEQ ID Nr. 26 dargestellte DNA wurde auf gleiche Weise behandelt, um die Behandlungslösung (2) zu erhalten.
Die Behandlungslösung (1) wurde mit der Behandlungslösung (2) gemischt, und das Gemisch wurde 5 Minuten lang bei 90°C inkubiert und dann schrittweise im Verlauf von 3 Stunden auf 22°C abgekühlt, um doppelsträngige DNA herzustellen.
Die so hergestellte doppelsträngige DNA wurde in die Verbindungsstelle des TPO-codierenden Gens und des ND28-codierenden Gens von pBS-T154ND28, die im Beispiel 1-2-2-)-(ii), auf die folgende Weise eingefügt.
2000 ng pBS-T154ND28 wurden mit den Restriktionsenzymen BbeI und SplI gespalten und einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment von ungefähr 4,0 kb zu isolieren.
Unter Verwendung des DNA Ligation Kit Version 1 (von Takara Shuzo Co. Ltd. hergestellt), wurde das so erhaltene DNA-Fragment von etwa 4,0 kbp (100 ng) mit der oben genannten doppelsträngigen DNA (12,5 pmol) ligiert (Volumen der Reaktionslösung: 0,018 ml).
Unter Verwendung dieser Reaktionslösung wurde der Escherichia coli-Stamm DH5α auf die übliche Weise transformiert, und die resultierenden Transformanten wurden auf 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB-Agarmedium ausgebracht und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Plasmide wurden aus mehreren auf dem Medium in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren kultivierten Transformantenstämmen isoliert.
Die Nukleotidsequenz des in jedes Plasmid eingefügten Fragmentes wurde unter Verwendung eines Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit und eines ABI373A-DNA-Sequenzierungsgerätes (von Applied Biosystems Japan Inc. hergestellt) bestimmt. Zur Bestimmung der Nukleotidsequenz wurden Primer mit den Nukleotidsequenzen der SEQ ID Nrn. 12 und 22 als Primer zur Nukleotidsequenzbestimmung verwendet. Die Bestimmung zur Nukleotidsequenz erfolgte gemäß den dem Kit und dem Gerät beigelegten Instruktionen.
Unter diesen Plasmiden wurde ein Plasmid namens pBS-T153LND28LN1, in dem die Nukleotidsequenz des Insertionsfragmentes mit der Nukleotidsequenz der Spacer-DNA zusammenfiel, in den nachfolgenden Prozeduren verwendet.
Beispiel 2 Herstellung von TPO-CSF
TPO-CSF wurde hergestellt, indem man die Expression der DNA, die das TPO-CSF codiert, in Tierzellen auf die folgende Weise bewirkte.
1) Herstellung von TPO-ND28 (1) und TPO-ND28 (2)
Das Plasmid pcDNA3 (von Invitrogen Co. hergestellt) wurde mit EcoRI und NotI gespalten und einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment (Vektorseite) von ungefähr 5,4 Kilobasenpaar (kb) zu isolieren.
Weiterhin wurden pBS-T153LND28 und pBS-T154ND28 im Beispiel 1-2-1)-(iii) und Beispiel 1-2-2)-(ii) erhalten, separat mit EcoRI und NotI gespalten und einer Agarosegel-Elektro phorese unterzogen, um ein DNA-Fragment (Insertseite) von ungefähr 1,1 Kilobasenpaar (kb) aus jedem Plasmid zu erhalten.
Unter Verwendung des DNA Ligation Kit Version 1 (von Takara Shuzo Co. Ltd. hergestellt), wurde das so erhaltene DNA-Fragment von etwa 5,4 kbp (100 ng) mit jeder der insertseitigen DNAs (100 ng) ligiert (Volumen der Reaktionslösung: 0,018 ml).
Unter Verwendung dieser Reaktionslösung wurde der Escherichia coli-Stamm DH5α auf die übliche Weise transformiert, und die resultierenden Transformanten wurden auf 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB-Agarmedium ausgebracht und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Plasmide wurden aus mehreren auf dem Medium in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren kultivierten Transformantenstämmen isoliert.
Die Strukturen dieser Plasmide wurden unter Verwendung der Restriktionsenzyme EcoRI und NotI untersucht, um Plasmide zu selektieren, die jeweils Inserts mit einer Struktur enthielten, in der das vektor-seitige und das insert-seitig DNA-Fragmente miteinander ligiert sind, und das Plasmid pCD-153LND28, enthaltend ein TPO-ND28 (1)-codierendes Gen, und das Plasmid pCD-154LND28, enthaltend ein TPO-ND28 (2)-codierendes Gen, wurden in den nachfolgenden Prozeduren verwendet.
Das Plasmid pCD-153LND28 oder pCD-154ND28 wurde durch Elektroporation in Tierzellen eingeführt [Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 7161 (1984)], und seine Expression wurde auf die folgende Weise bewirkt.
COS-7-Zellen wurden in D-MEM-Medium (von GibcoBRL Co., hergestellt, Produkt Nr. 11885-50), das weiterhin mit 10 % fötalem Rinderserum ergänzt war, kultiviert.
Die durch die Kultivierung erhaltenen COS-7-Zellen wurden in K-PBS-Puffer suspendiert (137 mM Kaliumchlorid, 2,7 mM Natriumchlorid, 8,1 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 1,5 mM Natriumdihydrogenphosphat, 4 mM Magnesiumchlorid), um eine Zellsuspension von 8 × 10⁸ Zellen/ml herzustellen.
0,2 ml der Zellsuspension wurden in eine Pulser-Küvette (von BIO RAD LABORATORIES hergestellt) mit einer Spaltbreite von 0,2 cm eingefüllt.
4 μg an pCD-153LND28 oder pCD-154-ND28 wurden der Küvette zugesetzt, mit der Suspension gründlich gemischt und dann unter Verwendung eines Elektroporationsapparats (Gene Pulser, von BIO RAD LABORATORIES hergestellt) unter Bedingungen von 200 Ω, 0,3 kv/cm und 0,125 mF einem Puls ausgesetzt.
Die pulsbehandelte Lösung wurde 5 Minuten lang auf Eis stehen gelassen, in 10 ml D-MEM Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, suspendiert und dann 72 Stunden lang in einem CO₂-Inkubator bei 37°C kultiviert.
Die Kulturflüssigkeit wurde einer Zentrifugation unterzogen, und der resultierende Kulturüberstand wurde durch einen Filter mit 220 nm Porenweite filtriert, um eine Lösung von TPO-ND28 (1) oder TPO-ND28 (2) zu erhalten.
Herstellung von TPO-ND28 (3)
Ein Plasmid PAGE210 wurde als Vektor zur Verwendung bei der Expression von TPO-ND28 (3) verwendet. Der Vektor pAGE210 ist ein Derivat von pAGE248 [Sasaki et al., J. Biol. Chem., 269, 14730, (1994)], in dem der Promotor des Moloney-Mäuseleukämievirus XhoI-HindIII-Fragment) durch den frühen Promotor von SV40 (XhoI-HindIII-Fragment) aus pAGE103 [Mizukami et al., J. Biochem., 101, 1307 (1987)] ersetzt worden ist.
Das Plasmid pAGE210 wurde mit KpnI und HindIII geschnitten und einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment (Vektorseite) von ungefähr 9,0 Kilobasenpaare (kb) zu isolieren.
Getrennt hiervon wurde das in Beispiel 1-1 erhaltene pBS-TPO322 mit KpnI und HindIII geschnitten und das in dem Beispiel 1-2-3) erhaltene pBS-153ND28LN1 wurde mit KpnI und dann teilweise mit HindIII geschnitten, und jedes der resultierenden geschnittenen Fragmente wurde einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment (Insert-Seite) von ungefähr 1,1 Kilobasenpaar (kb) aus jedem Plasmid zu isolieren.
Unter Verwendung des DNA Ligation Kit Version 1 (von Takara Shuzo Co. Ltd. hergestellt), wurde das so erhaltene DNA-Fragment von etwa 9,0 kb (100 ng) mit jedem der insertseitigen DNA-Fragmente von etwa 1,1 kb (100 ng) ligiert (Volumen der Reaktionslösung: 0,018 ml).
Unter Verwendung dieser Reaktionslösung wurde der Escherichia coli-Stamm DH5α auf die übliche Weise transformiert, und die resultierenden Transformanten wurden auf 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB-Agarmedium ausgebracht und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Plasmide wurden aus mehreren auf dem Medium in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren kultivierten Transformantenstämmen isoliert.
Die Strukturen dieser Plasmide wurden unter Verwendung des Restriktionsenzyms KpnI untersucht, um Plasmide zu selektieren, die jeweils Inserts mit einer Struktur enthielten, in der das vektor-seitige und das insert-seitig DNA-Fragmente miteinander ligiert sind, und das Plasmid pAGE210-T332, enthaltend ein TPO-codierendes Gen, und das Plasmid pAGE210-LN1, enthaltend ein TPO-ND28 (3)-codierendes Gen, wurden in den nachfolgenden Prozeduren verwendet.
Das Plasmid pAGE210-T332 oder pAGE210-LN1 wurde durch Elektroporation in Tierzellen eingeführt.
CHO-Zellen wurden in MEM-Medium (1) (von GibcoBRL Co., hergestellt, Produkt Nr. 19000-024), das weiterhin mit 10 % fötalem Rinderserum ergänzt war, kultiviert.
Die durch die Kultivierung erhaltenen CHO-Zellen wurden in K-PBS-Puffer suspendiert, um eine Zellsuspension von 8 × 10⁸ Zellen/ml herzustellen.
0,2 ml der Zellsuspension wurden in eine Pulser-Küvette (von BIO RAD LABORATORIES hergestellt) mit einer Spaltbreite von 0,2 cm eingefüllt.
4 μg an pAGE210-T332 oder pAGE210-LN1 wurden der Küvette zugesetzt, mit der Suspension gründlich gemischt und dann unter Verwendung eines Elektroporationsapparats (Gene Pulser, von BIO RAD LABORATORIES hergestellt) unter Bedingungen von 0,35 kv/cm und 0,25 mF einem Puls ausgesetzt.
Die pulsbehandelte Lösung wurde 5 Minuten lang auf Eis stehen gelassen, in 10 ml MEM Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, suspendiert und dann 24 Stunden lang in einem CO₂-Inkubator bei 37°C kultiviert.
Die auf diese Weise kultivierten Zellen wurden nochmals zwei Wochen lang in MEM-Medium (1), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 0,3 mg/ml Hygromycin, kultiviert.
Die erhaltenen Zellen wurden weitere 2 Wochen lang in MEM-Medium (2) (von GibcoBRL Co., hergestellt, Code Nr. 12000-022), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 50 nM Methotrexat (nachfolgend als MTX bezeichnet).
Die Kultivierung wurde auf die gleiche Weise wiederholt, indem sukzessiv die MTX-Konzentration auf 100 nM, 500 nM und 1000 nM in dieser Reihenfolge erhöht wurde, wodurch Stämme erhalten wurden, die gegen 1000 nM (MTX?) TMX resistent waren.
Jeder der in 1000 nM MTX resistenten Stämme wurde in MEM-Medium (2), mit 10 % fötalem Rinderserum ergänzt, kultiviert, das Medium wurde durch ein serumfreies Medium zur Verwendung mit CHO-Zellen, CHO-S-SFMII (hergestellt von GibcoBRL Co., Code Nr. 12052-015) ersetzt, und dann wurde der Stamm erneut 96 bis 144 Stunden lang kultiviert.
Indem die Kulturflüssigkeit einer Zentrifugation unterzogen wurde, wurde ein TPO oder TPO-ND28 (3) enthaltender Kulturüberstand erhalten.
Beispiel 3 Reinigung von TPO-ND28 (3) und TPO
1000 ml TPO-ND28 (3) oder TPO, in Beispiel 2-2) erhalten, wurden unter Verwendung von Centriprep (von Amicon Co. hergestellt), auf 50 ml eingeengt, um eine konzentrierte Lösung herzustellen.
50 ml jeder der konzentrierten Lösungen wurden auf XK50-Säulen (von Pharmacia K.K. hergestellt) aufgetragen, die mit 1000 ml Sephacryl S-200-Harz (von Pharmacia K.K. hergestellt) bepackt und mit einem Phosphatpuffer (9,4 mM Natriumphosphat (pH 7,2), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl) gefüllt waren.
Die Elution von TPO-ND28 (3) oder TPO wird dadurch bewirkt, dass man den Phosphatpuffer mit einer Flussrate von 3 ml/Minute durch die Säule leitete.
Die Eluate wurden für jeweils 12,5 Minuten vereinigt, und die so erhaltenen Fraktionen wurden durch ein weiter unten beschriebenes MTT-Assay auf ihre TPO und G-CSF-Aktivitäten überprüft, wodurch gereinigtes TPO-ND28 (3) oder TPO erhalten wurde.
Beispiel 4 Modifikation von TPO-ND28 (3) mit Polyethylenglykol
Eisgekühltem Wasser wurde 20 kDa-PEG-Succinimidylpropionat (von Shearwater Polymers Co. hergestellt) zu einer Endkonzentration von 400 mg/ml zugesetzt.
50 μl der so hergestellten wässrigen Lösung wurden mit 200 μl der in Beispiel 3 erhaltenen TPO-ND28 (3)-Lösung und 150 μl an destilliertem Wasser vermischt. Das Gemisch wurde 12 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen, wodurch Modifikationen von TPO-ND28 (3) durch Polyethylenglykol bewirkt wurden.
Das so mit Polyethylenglykol modifizierte TPO-ND28 (3) (nachfolgend als PEG-TPO-ND28 (3)) bezeichnet, wurde auf eine Super Rose 610/30-Säule (von Pharmacia K.K. hergestellt) aufgetragen, die zuvor mit einem Phosphatpuffer (9,4 mM Natriumsulfat (pH 7,2), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl) gefüllt worden waren.
Die Elution wurde bewirkt, indem man den Phosphatpuffer mit einer Flussrate von 0,5 ml/Minute durch die Säule leitete.
Die Eluate wurden für jeweils 1 Minute vereinigt, und die so erhaltenen Fraktionen wurden durch das weiter unten beschriebene MTT-Assay auf ihre TPO- und G-CSF-Aktivitäten überprüft.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
Die von unmodifizierten TPO-ND28 (3) ausgehenden G-CSF- und TPO-Aktivitäten wurden 34 bis 40 Minuten nach Beginn der Elution detektiert, und die von PEG-TPO-ND28 (3) ausgehenden G-CSF und TPO-Aktivitäten wurden nach 16 bis 28 Minuten der Elution detektiert.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass mit Polyethylenglykol modifiziertes TPO-CSF, das sowohl G-CSF- als auch TPO-Aktivität hat, erhalten werden kann. Tabelle 5

–: keine Aktivität; +: Aktivität

Testbeispiel 1 Messung des Molekulargewichts von TPO-ND28
Unter Verwendung der im Beispiel 2-1) erhaltenen TPO-ND28 (1)-Lösung durch eine Gelfiltrationschromatographie auf die folgende Weise seinem Molekulargewicht entsteht.
0,2 ml der TpO-ND28 (1)-Lösung wurden auf Super Rose 610/30-Säulen (von Pharmacia K.K. hergestellt) aufgetragen, die zuvor mit einem Phosphatpuffer (9,4 mM Natriumphosphat (pH 7,2), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl) äquilibriert worden waren, und die Elution von TPO-ND28 (1) wurde dadurch bewirkt, dass man den Phosphatpuffer mit einer Flussrate von 0,5 ml/Minute durch die Säule leitete.
Die Eluate wurden für jeweils 0,5 Minuten vereinigt, und die so erhaltenen Fraktionen wurden durch das weiter unten beschriebene MTT-Assay auf ihre TPO und G-CSF-Aktivitäten überprüft.
Tabelle 6 zeigt die Elutionszeit aus der Super Rose und die gemessenen Werte der TPO- und G-CSF-Aktivitäten.
Die TPO- und G-CSF-Aktivitäten erreichten nach 33,5 Minuten der Elution das Maximum.
Getrennt hiervon wurden Thyroglobulin (Molekulargewicht 670.000), Aldolase (Molekulargewicht 160.000), Rinderserumalbumin (Molekulargewicht 69.000) und G-CSF (Molekulargewicht 20.000) als Molekulargewicht-Proteinstandards verwendet und durch Super Rose geleitet, um den Bezug zwischen der Elutionszeit und dem Molekulargewicht herzustellen.
Das aus dem 33,5 Minuten Elutionszeit hergeleitete Molekulargewicht von TPO-ND28 (1) war ungefähr 40.000. Tabelle 6
Testbeispiel 2 Biologische Aktivität von TPO-CSF
Das Prinzip der Messung der zellwachstumsstimulierenden Aktivität einer zu testenden Lösung (TPO-ND28-Lösung) auf zu testende Zellen ist wie folgt.
Jede zu testende Lösung (TPO-ND28-Lösung), TPO-Standardlösung und ND28-Standardlösung wird zu 10-fachen Verdünnungsreihen verdünnt, und 0,01 ml jeder dieser Verdünnungen wird jedem Napf einer Mikrotiterplatte zugesetzt.
Aktiv wachsende Zellen, die getestet werden sollen, werden durch Zentrifugation aus einer Kulturflüssigkeit gewonnen, gewaschen und dann in einem Medium zur Verwendung bei dem Test in der für jeden Test geeignetsten Zellendichte resuspendiert.
Die so hergestellte Zellsuspension wird in Aliquots von jeweils 0,09 ml den Näpfen der oben genannten Mikrotiterplatte zugesetzt, die hergestellt wurde, indem man Verdünnungen der zu testenden Lösungen, TPO-Standardlösungen und ND28-Standardlösung in Aliquots von 0,01 ml zusetzte.
Die Mikrotiterplatte wird bei 37°C in einem vollständig feuchten 5 % CO₂-Inkubator inkubiert und dann in der folgenden Messung verwendet.
0,01 ml einer 0,5 mg/ml-Lösung von MTT [3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-tetrazolium-bromid] wird jedem Napf zugesetzt, 4 Stunden inkubiert, mit 0,15 ml einer Lösung von 0,1 N Salzsäure/Isopropylalkohol gemischt und dann gerührt, um das Pigment aus den Zellen zu extrahieren, gefolgt von Beurteilung des Zellwachstums durch Messung der Pigmentmenge bei seinem Absorptionsmaximum von 540 nm.
Dieses Verfahren zur Messung der das Zellwachstum stimulierenden Aktivität wird nachfolgend als das MTT-Assay bezeichnet.
(1) Messung der zellwachstumsstimulierenden Aktivität gegenüber Ba/F3 Zellen
Die Ba/F3-Zellen, die in Abhängigkeit der murinen IL-3 wachsen, wurden in Iscoves modifiziertem Dulbeccomedium (nachfolgend als „IMDM" bezeichnet), ergänzt mit 10 % hitzeinak tiviertem fötalem Kälberserum (nachfolgend als „FCS" bezeichnet) und murinem IL-3 (Kulturüberstand von WEHI-3B), kultiviert.
Unter Verwendung der so kultivierten Ba/F3-Zellen wurde die zellwachtumsstimulierende Aktivität durch das MTT-Assay unter Verwendung des soeben beschriebenen Mediums aber in Abwesenheit von murinem IL-3 gemessen.
Das MTT-Assay wurde mit einer Inokulationsdichte von 10.000 Zellen pro Napf und durch Inkubation der Platte unter der 5 % CO₂ über 48 Stunden hinweg durchgeführt.
Die Ergebnisse des MTT-Assays zeigen, dass keines von TPO, ND28 und TPO-ND28 (1), (2) und (3) eine wachstumsstimulierende Aktivität gegenüber Ba/F3-Zellen hatte.
(2) Messung der zellwachstumsstimulierenden Aktivität gegenüber Ba/F3-cmpl
Die Ba/F3-cmpl-Zellen, die in Abhängigkeit von der Gegenwart von murinen IL-3 oder TPO wachsen, wurden in IMDM kultiviert, das mit 10 % hitzeinaktiviertem FCS, 0,5 mg/ml G418 und murinem IL-3 (Kulturüberstand von WEHI-3B) ergänzt worden war, kultiviert.
Unter Verwendung der so kultivierten Ba/F3-cmpl-Zellen wurde die zellwachtumsstimulierende Aktivität durch das MTT-Assay unter Verwendung des soeben beschriebenen Mediums aber in Abwesenheit von murinem IL-3 gemessen.
Das MTT-Assay wurde mit einer Inokulationsdichte von 10.000 Zellen pro Napf und durch Inkubation der Platte unter der 5 % CO₂ über 48 Stunden hinweg durchgeführt.
Die Ergebnisse des MTT-Assays zeigen, dass jedes von TPO und TPO-ND28 (1), (2) und (3) eine wachstumsstimulierende Aktivität gegenüber Ba/F3-cmpl-Zellen hatte.
Die Ergebnisse des MTT-Assays zeigten, dass jedes von TPO, TPO-ND28 (1), (2) und (3) eine zellwachstumsstimulierende Aktivität gegenüber Ba/F3-cmpl-Zellen hatte.
(3) Messung der zellwachstumsstimulierenden Aktivität gegenüber NFS-609-Zellen
Die NFS60-Zellen, die in Abhängigkeit von der Gegenwart von murinen IL-3 oder menschlichem G-CSF wachsen, wurden in RPMI-Medium kultiviert, das mit 10 % hitzeinaktiviertem FCS, 2 mM Glutamin, P/S (100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin) und 1.0 ng/ml an menschlichem G-CSf vom rekombinanten Typ ergänzt worden war, kultiviert.
Unter Verwendung der so kultivierten NFS60-Zellen wurde die zellwachtumsstimulierende Aktivität durch das MTT-Assay unter Verwendung des soeben beschriebenen Mediums aber in Abwesenheit von G-CSF gemessen.
Das MTT-Assay wurde mit einer Inokulationsdichte von 10.000 Zellen pro Napf und durch Inkubation der Platte unter der 5 % CO₂ über 48 Stunden hinweg durchgeführt.
Die Ergebnisse des MTT-Assays zeigen, dass jedes von TPO und TPO-ND28 (1), (2) und (3) eine wachstumsstimulierende Aktivität gegenüber NFS60-Zellen hatte.
Die Ergebnisse des MTT-Assays zeigten, dass jedes von TPO-ND28 (1), (2) und (3) eine zellwachstumsstimulierende Aktivität gegenüber NFS60-Zellen hatte.
Testbeispiel 3 Wirkung von TPO-ND28 auf myeloide Mäusezellen
Eine acht Wochen alte BALB/c-Maus wurde getötet, um das Femur- und Tibia-System zu entnehmen, dessen beide Enden anschließend mit Scheren abgeschnitten wurden. Die Nadel einer mit 10 % FCS enthaltendem RPMI-Lösung gefüllten Spritze wurde in die Schnittfläche von Femur und Tibia eingeführt, um myeloide Zellen in ein kleines Reagenzglas auszuschwemmen, und die Zellen wurden 5 Minuten lang stehen gelassen.
Unter Verwendung einer Pasteur-Pipette wurde die Überstandsflüssigkeit in dem Reagenzglas aufgenommen, wobei darauf geachtet wurde, es nicht mit dem Präzipitat zu kontaminieren, und der Überstand wurde Nycoprep 1,077 Animal (hergestellt von NYCOMED Co., Produkt Nr. 1002380) überschichtet und einer 15-minütigen Zentrifugation bei 600 g unterzogen, um mononukleäre Mäusezellen (nachfolgend als „MNC" bezeichnet) zu isolieren.
Aus dem MNC wurden mit einer Lösung, enthaltend eine zu testende Lösung, 10 % FCS, 1 % BSA und 0,6 mg/ml Transferrin (von Boehringer Mannheim Co. hergestellt), einer Suspension von 5 × 10⁵ Zellen/ml hergestellt, und sie wurden 5 Tage lang in einem CO₂-Inkubator (BNA-120D, von TABAI Co. hergestellt) unter Bedingungen von 37°C, 5 % CO₂ und 95 % oder mehr Feuchtigkeit kultiviert.
Als zu testende Lösung wurde eine Lösung von TPO, ND28 oder TPO-ND28 mit einer Endkonzentration von 1,0, 10 oder 100 ng/ml oder eine Lösung, der die gleichen Volumina von TPO und ND-28-Lösungen mit den oben genannten Konzentrationen vermischt worden waren (TPO/ND28), verwendet. Die in Beispiel 3 erhaltene TPO und ND-28 wurden verwendet. Nach Abschluss der Kultivierung wurden die MNC-Differenzierungsbedingungen untersucht, indem man die exprimierte Menge an CD61 maß, das ein Index der Differenzierung ins Megakaryozytensystem ist [J. Med., 311. 1084 (1984)], und der exprimierten Gr-1-Menge, die ein Maß der Differenzierungsgranulozytensystem ist [J. Immunol., 144. 22 (1991)].
Nach Färbung mit FITC-gekoppelten monoklonalen Antikörper gegen murines CD61 (von PHARMINGEN Co. hergestellt, Produkt Nr. 01864D) und PE-konjugierten monoklonalen Antikörper gegen murines Gr-1-PE (von PHARMINGEN Co., Produkt Nr. 01215A), wurden die exprimierten Mengen an CD61 und Gr-1 unter Verwendung eines ELITE-Durchflusszytometers (von Coulter Co. hergestellt) gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7
Wenn die durch Mischung der gleichen Mengen an TPO und ND28 (TPO/ND28) hergestellte zu testende Lösung zugesetzt wurde, wurden Gr-1-exprimierende Zellen in einem Ausmaß gebildet, das den Fall der Zugabe der nur ND28 enthaltenden zu testende Lösung ähnelte, was die Differenzierung der MNCs ins Granulozytensystem zeigte, aber die Häufigkeit der Bildung von CD61-exprimierenden Zellen war geringer als im Fall der Zugabe der nur TPO enthaltenden zu testenden Lösung, was eine verringerte Differenzierung ins Megakaryozytensystem zeigte. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass, wenn die gleichen Mengen von TPO und ND28 vorliegen, MNCs hauptsächlich mit ND28 reagieren und sich zum Granulozytensystem differenzieren.
Wenn jedoch das Fusionspolypeptid aus TPO und ND28, nämlich TPO-ND28, als zu testende Lösung zugesetzt wurde, war die Häufigkeit der Bildung CD61-exprimierende Zellen ähnlich wie oder höher als im Fall der Zugabe der nur TPO-enthaltenden zu testenden Lösung oder zweimal oder mehr höher als im Fall der Zugabe von TPO/ND28. Mehr noch, die Häufigkeit der Bildung Gr-1-exprimierende Zellen war ebenfalls ähnlich wie im Fall der Zugabe der nur ND28 enthaltenden zu testenden Lösung.
Testbeispiel 4 Thrombozyten- und Leukozytenbildungs-fördernde Funktionen bei Mäusen
Eine 10 μg/ml-Lösung von TPO oder ein 10 μg/ml-Lösung von TPO-ND28 (3), wie im Beispiel 3 enthalten, wurde BALC/c-Mäusen (männlich, 7 Wochen alt) durch subkutane Injektion mit einer Dosierung von 0,2 ml auf 20 g Körpergewicht pro Maus einmal am Tag kontinuierlich über einen Zeitraum von 4 Tagen, beginnend am ersten Tag des Tests (behandelte Gruppen, 4 Tiere pro Gruppe) verabreicht. Eine Blutprobe wurde aus der Augenvene jedes Tieres am fünften Tage des Tests abgenommen, um die Anzahl der Thrombozyten und Leukozyten durch einen Mikrozellzähler (Sysmex F800, durch Toa Iyo Denshi Co. hergestellt) zu zählen.
Nach der Einführung des zur Expression von TPO oder TPO-ND28 (3)-Gens verwendeten Plasmids pAGE210 in CHO-Zellen gemäß der in Beispiel 2-2) beschriebenen Verfahren wurden die Zellen kultiviert, der erhaltene Kulturüberstand wurde mit dem gleichen TPO-ND28 (3)-Reinigungsverfahren wie in Beispiel 3 beschrieben behandelt, und eine der Eluti onsfraktion von TPO-ND28 (3) korrespondierende Elutionsfraktion wurde als Leerprobe verwendet, um die Anzahl der Thrombozyten und Leukozyten durch das oben genannte Verfahren zu bestimmen.
Um die Wirkungen von TPO und TPO-ND28 (3) zu vergleichen und zu bestimmen, wurde das ansteigende Verhältnis (%) der Anzahl der Thrombozyten und Leukozyten in der Gruppe, in der jedwede Substanzen verabreicht wurden, gegenüber der in der Gruppe, der die Leerprobe verabreicht wurde, gemäß der folgenden Formel berechnet: [Thrombozyten- oder Leukozytenzahl in den Mäusen der TPO- oder TPO-ND28 (3)-behandelten Gruppe]/[Thrombozyten- oder Leukozytenzahl in Mäusen der mit der Leerprobe behandelten Gruppe] × 100
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8
Gewerbliche Anwendbarkeit
Von der vorliegenden Erfindung wird ein Fusionspolypeptid bereitgestellt, das sowohl ein Polypeptid mit G-CSF-Aktivität als auch ein Polypeptid mit TPO-Aktivität umfasst. Das erfindungsgemäße Fusionspolypeptid kann Thrombozyten und Leukozyten gleichzeitig bilden und vermehren, und es kann die Bildung von Megakaryozytenkolonien und neutrophilen Kolonien und die Differenzierung oder Reifung von Megakaryozytenvorläufern und neutrophilen Vorläufern kontrollieren.

Claims

Fusionspolypeptid welches eine Aminosäuresequenz ausgewählt unter den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO:1, 2 und 3 umfasst.
Fusionspolypeptid welches eine Aminosäuresequenz ausgewählt unter den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO:1, 2 und 3 umfasst und zusätzlich in seinem Granulocyten-Kolonie-stimulierender Faktor-Abschnitt ein Aminosäuresubstitutionsmuster a), b), c), d), e), f), g), h), i), j), k) oder 1) gemäß der Definition in folgender Tabelle aufweist
*: unsubstltuierte Aminosäure oder wobei der Granulocyten-Kolonie-stimulierende Faktor-Abschnitt ersetzt ist durch eine der folgenden Aminosäuresequenzen
Fusionspolypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid ein Polypeptid ist, in welchem wenigstens eine Aminogruppe des Polypeptides mit einem Polyalkylenglycolderivat chemisch modifiziert ist.
Fusionspolypeptid nach Anspruch 3, wobei das Polyalkylenglycolderivat ein Polyethylenglycolderivat, ein Polypropylenglycolderivat oder ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylencopolymer-Derivat ist.
DNA, welche für das Fusionspolypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert.
DNA nach Anspruch 5, wobei die DNA eine DNA ist, welche eine Sequenz, ausgewählt unter DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NO:4, 5 und 6 enthält.
Pharmazeutisches Mittel, vorzugsweise zur Behandlung von Anämie, umfassend ein Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als aktiven Bestandteil.
Verwendung des Fusionspolypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Anämie.