ES2276401T3 - Proteinas de fusion g-csf tpo. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN POLIPEPTIDO DE FUSION, QUE COMPRENDE UN POLIPEPTIDO CON ACTIVIDAD G-CSF; A UN POLIPEPTIDO CON ACTIVIDAD TPO; A UN ADN QUE CODIFICA PARA DICHO POLIPEPTIDO DE FUSION. SE DESCRIBE ASIMISMO UN POLIPEPTIDO DE FUSION, EN EL QUE SE FUSIONAN EL POLIPEPTIDO CON ACTIVIDAD G-CSF, Y EL POLIPEPTIDO CON ACTIVIDAD TPO, A TRAVES DE UN PEPTIDO ESPACIADOR. TAMBIEN SE DESCRIBE UN POLIPEPTIDO DE FUSION, QUIMICAMENTE MODIFICADO MEDIANTE UN DERIVADO DE POLIALQUILEN GLICOL. ASIMISMO, SE HACE REFERENCIA A UNA COMPOSICION PARA EL TRATAMIENTO DE LA ANEMIA, QUE CONTIENE DICHO POLIPEPTIDO DE FUSION COMO INGREDIENTE ACTIVO.

Description

Proteínas de fusión G-CSF TPO.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido que presenta una actividad del factor estimulante de colonias de granulocitos (al que se hace referencia en adelante como "G-CSF") y un polipéptido que presenta una actividad del factor de crecimiento de plaquetas (trombopoyetina, al que se hace referencia en adelante como "TPO") y al ADN que codifica el polipéptido de fusión. Dado que el polipéptido de fusión de la presente invención puede formar y aumentar las plaquetas y neutrófilos simultáneamente, es útil para el tratamiento de la anemia y similares.

Técnica anterior

La sangre comprende células hematopoyéticas tales como eritrocitos, leucocitos, plaquetas y similares. Estas células hematopoyéticas maduran a partir de solamente una clase de célula madre sanguínea pluripotencial a través de varias etapas de diferenciación. Estas etapas experimentan regulación compleja por un grupo de factores proteicos que generalmente se denominan citocinas. Un determinado tipo de citocina participa en la diferenciación y multiplicación de varias células hematopoyéticas. Por otra parte, un determinado tipo de célula hematopoyética experimenta la regulación de su diferenciación y multiplicación por varios tipos de citocinas. Esto se denomina solapamiento de las acciones de citocina. Entre estos miembros de citocina, se considera que TPO y G-CSF presentan pequeñas acciones de solapamiento.

TPO participa principalmente en la formación de plaquetas. Las plaquetas se forman por fragmentación de megacariocitos, célula hematopoyética que tiene un núcleo grande y está presente principalmente en la médula ósea. Las plaquetas son esenciales para la formación de los coágulos sanguíneos y de las partes dañadas de los vasos sanguíneos. Las plaquetas desempeñan asimismo importantes funciones no solamente en la coagulación de la sangre sino además en la cicatrización de heridas, liberando las proteínas que tienen otras funciones en las partes dañadas. Una disminución significativa en el número de plaquetas puede ser fatal, porque el cuerpo puede desangrarse fácilmente.

G-CSF es una citocina que acelera la activación de los neutrófilos, un miembro de los leucocitos, y la diferenciación de neutrófilos de sus células precursoras. Los neutrófilos ejercen la primera acción de defensa cuando son invadidos por enemigos extraños tales como bacterias, virus y similares. Cuando el número de neutrófilos disminuye, el cuerpo se vuelve indefenso contra la infección, y esto también es con frecuencia mortal.

El tratamiento médico actual de los cánceres con frecuencia produce efectos secundarios en los que las células madre pluripotenciales de la sangre se dañan por la administración de fármacos quimioterapéuticos, irradiación de rayos X o trasplante de médula ósea para el tratamiento de la leucemia, disminuyendo de este modo el número de células hematopoyéticas. Aparentemente, es notablemente beneficioso para los pacientes de la trombopenia y la leucopenia ampliar el número de estas células mediante la administración de citocina, para suprimir la tendencia a la hemorragia y evitar enfermedades infecciosas.

No se ha encontrado una citocina que pueda ampliar plaquetas y neutrófilos simultáneamente, ni existe medicina que posea dicho efecto.

Los factores de inhibición de la leucemia, los factores de las células madre, los factores estimulantes de colonias de macrófagos, los factores estimulantes de colonias de granulocitos/macrófagos, la eritropoyetina, interleucinas (IL)-3, IL-6, IL-11, los factores estimulantes de colonias de megacariocitos y similares son conocidos como sustancias que amplían las plaquetas o aumentan la diferenciación y multiplicación de megacariocitos [Metcalf et al., Blood, 80, 50-56 (1990); Hunt et al., Blood, 80, 904-911 (1992); publicación de patente japonesa examinada nº 6-11705; Hoffman et al., Blood Cells, 13, 75-85 (1987); Mazur et al., Exp. Hematol., 15, 1123-1133 (1987); McNiece et al., Exp. Hematol., 16, 8807-810 (1988); Lu et al., Brit. J. Hematol., 70, 149-156 (1988); Ishibashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5953-5957 (1989); documento WO 95/21919; documento WO 95/18858]. Se entiende que muchos de estos miembros de citocina amplían las plaquetas solapando acciones. Recientemente, se ha puesto de manifiesto que un ligando receptor denominado c-mpI es una citocina que presenta la máxima actividad frente a los factores de ampliación de plaquetas y actúa directamente [de Sauvage et al., Nature, 369, 533 (1994)].

Como sustancias que multiplican los granulocitos, se conocen las IL-3, los factores estimulantes de colonias de macrófagos, los factores estimulantes de colonias de granulocitos/macrófagos mencionados anteriormente y similares, pero G-CSF posee la máxima actividad desde el punto de vista de multiplicar selectivamente los neutrófilos [Nicola et al., J. Biol. Chem., 258, 9017 (1983)]. Con respecto a un polipéptido en el que se fusionan dos clases diferentes de citocina, existen publicaciones en la solicitud de patente internacional publicada no examinada nº 500116/94, la patente U.S. nº 5.359.035, Exp. Hematol., 21, 647-655 (1993) e Ibid, 18, 615 (1990) y similares.

Sin embargo, nada se sabe acerca de un polipéptido de fusión en el que se utiliza TPO como una de las citocinas fusionadas.

Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un polipéptido de fusión que pueda producir y ampliar plaquetas y neutrófilos simultáneamente. Este polipéptido de fusión permite la formación de colonias de megacariocitos y colonias de neutrófilos y puede controlarse la diferenciación o maduración del precursor de megacariocitos y del precursor de neutrófilos.

Exposición de la invención

La presente invención se refiere a un polipéptido de fusión, que comprende un polipéptido que presenta actividad de G-CSF y un polipéptido que presenta actividad de TPO y a ADN que codifica el polipéptido de fusión tal como se define en las reivindicaciones. También se exponen las proteínas de fusión en las que un polipéptido con actividad de G-CSF y un polipéptido con actividad de TPO se fusionan mediante un péptido espaciador y ADN que codifica el polipéptido de fusión; y un polipéptido en el que el polipéptido de fusión que comprende un polipéptido con actividad de G-CSF y un polipéptido con actividad de TPO se modifica químicamente con un derivado de polietilenglicol. También se proporcionan composiciones para el tratamiento de la anemia que contienen el polipéptido de fusión como ingrediente activo.

Como polipéptido con actividad de G-CSF para su utilización en la presente invención, puede utilizarse cualquier proteína con la condición de que posea el requisito de actividad de G-CSF, tal como un polipéptido con la secuencia de aminoácidos presentada en la Tabla 1 [Nature, 319, 415 (1986)].

Es útil asimismo una proteína que tenga una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos presentada en la Tabla 1 por sustitución, deleción o adición de uno o más aminoácidos, y ejemplos de los mismos incluyen los derivados de hG-CSF presentados en la Tabla 2 y descritos en la solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 267299/88, la solicitud de patente japonesa no examinada no publicada nº 299/88 y la solicitud de patente internacional no examinada publicada nº 500636/88.

TABLA 1

1

TABLA 2

2

Como polipéptido con actividad de TPO para su utilización en la presente invención, puede utilizarse cualquier proteína con la condición de que posea el requisito de actividad de TPO, tal como el ligando c-mpl que es un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 3 [Nature, 369, 533 (1994)], así como los factores de inhibición de la leucemia, los factores de las células madre, los factores estimulantes de colonias de macrófagos, los factores estimulantes de colonias de granulocitos/macrófagos, eritropoyetina, interleucina (IL)-3, IL-6, IL-11, factores estimulantes de colonias de megacariocitos y similares.

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TABLA 3

3

4

El polipéptido con actividad de G-CSF y el otro polipéptido con actividad de TPO, que constituyen el polipéptido fusionado de la presente invención, no están especialmente limitados, con la condición de que contengan las fracciones respectivas que producen actividad. Por ejemplo, cuando se utiliza el ligando c-mp1 como polipéptido con actividad de TPO, puede contener una secuencia de aminoácidos de las posiciones 153º y 154º del aminoácido N-terminal.

También está incluido en el polipéptido de la presente invención un polipéptido en el que un polipéptido con actividad de G-CSF y un polipéptido con actividad de TPO se fusionan mediante un péptido espaciador. Como péptido espaciador, puede utilizarse cualquier secuencia con la condición de que no deteriore la actividad de G-CSF y la actividad de TPO. Por ejemplo, puede utilizarse como péptido espaciador el péptido mostrado en la Tabla 4.

TABLA 4

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Enlazador\cr  (GlyGlyGlySer) _{3} Arg\cr 
(SerGlyGlyGly) _{4} Arg\cr  SerGlyGlyGlyArg\cr 
(SerGlyGlyGly) _{4} \cr  SerGlyGlyGly\cr 
(GlyGlyGlySer) _{3} \cr 
(GlyGlyGlySer) _{2} \cr}

Ejemplos del polipéptido de fusión de la presente invención incluyen un polipéptido con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia ID. nº: 1, 2 ó 3 y un polipéptido derivado de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión por adición, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos comprendidos dentro de un intervalo de modo que la actividad de G-CSF y la actividad de TPO no se deterioren, que tiene una homología del 40% o más con la secuencia de aminoácidos del polipéptido. La homología es preferentemente del 60% o más, y más preferentemente del 80% o más.

La sustitución, deleción o adición de aminoácidos puede realizarse según los procedimientos conocidos descritos por ejemplo en Nucleic Acid Research, 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662 (1984); Science, 224, 1431 (1984); PCT WO 85/00817; Nature, 316, 601 (1985); Gene, 34, 315 (1985); Nucleic Acid Research, 13, 4431 (1985); y "Current Protocols in Molecular Biology", cap. 8, Mutagenesis of Cloned DNA, John Wiley and Sons, Inc. (1989).

\newpage

También se incluye en el polipéptido de fusión de la presente invención un péptido que presenta una secuencia de aminoácidos en la que se añade un péptido señal de secreción al aminoácido N-terminal del polipéptido mencionado anteriormente; los ejemplos incluyen un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia ID. nº 4, 5 ó 6.

Además, en el polipéptido de fusión de la presente invención se incluye también un polipéptido de fusión con actividad de G-CSF y actividad de TPO, en el que por lo menos un grupo amino del polipéptido mencionado anteriormente está modificado químicamente con un derivado de polietilenglicol.

Ejemplos de derivado de polialquileno incluyen un derivado de polietilenglicol, un derivado de polipropilenglicol, un derivado copolímero de polioxietileno y polioxipropileno y similares. Se prefiere el propionato de polietilenglicol-succinimidilo.

El polipéptido de fusión modificado químicamente con un derivado de polietilenglicol puede prepararse según el procedimiento descrito en la publicación de la patente japonesa no examinada nº 96558/95.

El ADN que codifica el polipéptido de fusión (al que se hace referencia en adelante como "TPO-CSF") de la presente invención puede obtenerse mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) y similares basada en las secuencias nucleotídicas conocidas de un polipéptido con actividad de TPO y un polipéptido con actividad de G-CSF. Puede obtenerse asimismo por síntesis química.

Ejemplos de ADN que codifica TPO-CSF incluyen un ADN que contienen una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia ID. nº 1, 2 ó 3 o un derivado de polipéptido de la secuencia de aminoácidos del polipéptido por sustitución, deleción o adición de uno o más aminoácidos pero que posee actividad de G-CSF y actividad de TPO, tal como un ADN que contiene la secuencia nucleotídica mostrada en la Secuencia ID. nº 4, 5 ó 6.

Otros ejemplos son los ADN en los que la mutación tal como la mutación por sustitución, mutación por deleción, mutación por inserción y similares se introduce en el ADN mencionado anteriormente con un intervalo tal que la actividad de G-CSF y la actividad de TPO no se deterioren, que puede obtenerse, por ejemplo, mediante hibridación de colonias o hibridación en placa utilizando un ADN que contiene la secuencia nucleotídica mostrada en la Secuencia ID. nº 4, 5 ó 6 como sonda.

Un ejemplo es un ADN que se identifica realizando la hibridación de un filtro de membrana en el que el ADN originado por colonias o en placa se fija, a 65ºC en presencia de cloruro de sodio 0,7 a 1,0 M utilizando un ADN que contiene la secuencia nucleotídica mostrada en la Secuencia ID. nº 4, 5 ó 6 como sonda, y lavando posteriormente el filtro resultante a 65ºC en una solución SSC 0,1 a 2 veces (SSC una vez contiene cloruro de sodio 150 mM y citrato de sodio 15 mM).

Las técnicas de hibridación están descritas en "Molecular Cloning, A laboratory manual", segunda edición (editada por Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Todos los polipéptidos codificados por el ADN definidos anteriormente están incluidos en el TPO-CSF.

Ejemplos de plásmidos que contienen el ADN que codifica TPO-CSF incluyen pBS-T153LND28, pBS-T154ND28 y pBS-T153ND28LN1. TLN-1 de Escherichia coli como bacilo del colon que contiene pBS-T153ND28 y TN-1 de Escherichia coli como bacilo del colon que contiene pBS-T154ND28 se han depositado el 16 de febrero de 1995 en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón (código postal: 305), y se han asignado las designaciones FERM BP-5001 y FERM BP-5002, respectivamente.

A fin de expresar el gen que codifica TPO-CSF obtenido de este modo (denominado en adelante "gen TPO-CSF") en un hospedador, se escinde en primer lugar un fragmento de ADN que contiene el gen TPO-CSF en un ADN que contiene el gen TPO-CSF de una longitud apropiada con enzimas de restricción o enzimas hidrolizantes del ADN y se inserta en el punto corriente abajo de un gen activador en un vector de expresión y a continuación el vector de expresión insertado con ADN de este modo se introduce en un hospedador adecuado para el vector de
expresión.

Como hospedador, puede utilizarse cualquier hospedador capaz de expresar el gen deseado. Ejemplos del mismo incluyen las cepas microbianas que pertenecen a los géneros Escherichia, Serratia, Corynebacterium, Brevibacterium, Pseudomonas, Bacillus y similares, así como las cepas de levadura, las células hospedadoras animales y similares.

Un vector útil como vector de expresión es el que puede replicarse en el hospedador mencionado anteriormente o puede insertarse en su cromosoma y tiene un activador en el punto donde puede realizarse la transcripción del gen TPO-CSF.

Cuando un microorganismo tal como Escherichia coli o similares se utiliza como hospedador, es deseable que el vector de expresión de TPO-CSF pueda replicarse en el microorganismo y comprende un activador, un ribosoma que se une a la secuencia, el gen TPO-CSF y la secuencia de terminación de la transcripción. Puede contener asimismo un gen regulador.

Ejemplos del vector del expresión incluyen pBTrp2, pBTacl y pBTac2 (disponibles todos en Boehringer-Mannheim Co.), pKYP10 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 110600/83), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript (disponible en STRATAGENE Co.), pTrs30 [preparado a partir de JM109/pTrs30 de Escherichia coli (FERM BP-5407)], pTrs32 [preparado a partir de JM109/pTrs32 de Escherichia coli (FERM BP-5408)], pAGE107 [solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 22979/91; Miyaki et al., Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 227075/90) y pAMoERC3Sc CDM8 [Brian Seed et al., Nature, 329, 840 (1987)].

Como activador, puede utilizarse cualquiera capaz de ejercer la expresión en un hospedador tal como Escherichia coli o similar. Ejemplos del mismo incluyen los activadores originados a partir de Escherichia coli, fagos y similares, tal como el activador trp (Ptrp), el activador lac (Plac), el activador P_{L}, el activador P_{R} y similares. Son también útiles los activadores diseñados y modificados artificialmente tal como un activador preparado conectando dos activadores Ptrp en serie (Ptrpx 2), el activador tac y similares.

Como secuencia de unión de ribosomas, puede utilizarse cualquier secuencia capaz de ejercer la expresión en un hospedador tal como Escherichia coli o similar, pero es deseable utilizar un plásmido en el que la secuencia de unión del ribosoma y el codón de iniciación estén situados a una distancia apropiada (por ejemplo, 6 a 18 bases).

Cualquier gen que codifique TPO-CSF puede utilizarse como el gen TPO-CSF, pero es deseable utilizar el gen sustituyendo sus bases de tal manera que la secuencia de ADN del gen tenga codones más adecuados para su expresión en los microorganismos del hospedador.

Aunque la secuencia de terminación de la transcripción no siempre es necesaria para la expresión del gen, es deseable situar la secuencia de terminación de la transcripción preferentemente inmediatamente corriente abajo del gen estructural.

Ejemplos de hospedador incluyen XL1-Blue de Escherichia coli, XL2-Blue de Escherichia coli, DH1 de Escherichia coli, DH5 \alpha de Escherichia coli, MC1000 de Escherichia coli, KY3276 de Escherichia coli, W1485 de Escherichia coli, JM109 de Escherichia coli, HB101 de Escherichia coli, Escherichia coli nº 49, W3110 de Escherichia coli, NY49 de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacience, ATCC 14068 de Brevibacterium immariophilum, ATCC 14066 de Brevibacterium saccharolyticum, ATCC 14067 de Brevibacterium flavum, ATCC 13869 de Brevibacterium lactofermentum, ATCC 13032 de Corynebacterium glutaminicum, ATCC 13870 de Corynebacterium acetoacidophilum, ATCC 15354 de Microbacterium ammoniaphilum y similares.

Cuando se utilice una cepa de levadura como hospedador, puede utilizarse YEp13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419) o similares como vector de expresión.

Puede utilizarse cualquier tipo de activador, con la condición de que pueda ejercer la expresión en hospedadores de cepa de levadura. Ejemplos de los mismos incluyen activadores de genes de hexosa cinasa y las enzimas de la serie de reacciones glucolíticas similares, activador de gal 1, activador de gal 10, activador de la proteína de choque térmico, activador de MF \alpha1, activador de CUP 1 y similares.

Ejemplos de hospedador incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius y similares.

Cuando se utilizan células de animal como hospedadoras, los ejemplos de los vectores de expresión útiles comprenden pcADN, I/Amp, pcADN I, pcDM8 (disponibles todos en Funakoshi Co., Ltd.), pcADN 3 (disponible en Invitrogen Co.), pAGE248, pAGE210 y similares.

Puede utilizarse cualquier activador capaz de ejercer la expresión en los hospedadores de células animales. Por ejemplo, puede utilizarse el activador del gen IE de CMV humano (precoz inmediato). También, puede utilizarse el potenciador del gen IE de CMV humano junto con el activador.

Puede utilizarse cualquier gen que codifique a TPO-CSF como el gen TPO-CSF.

En general, solamente se segrega una parte del TPO-CSF expresado en el gen dentro de la porción extracelular, de modo que, para efectuar la secreción extracelular positiva del TPO-CSF del hospedador, es deseable preparar y utilizar un gen que posea una secuencia en la que una secuencia nucleotídica que codifica un péptido señal se añade al gen, según el método de Paulson et al. [C. Paulson et al., J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)] y el procedimiento de Lowe et al. [John. B. Lowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989); John. B. Lowe et al., Genes Develop., 4, 1288 (1990)].

Como hospedador, pueden utilizarse células namalwa, HBT5637 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 299/88), células COS, células CHO y similares.

La introducción del ADN que contiene el gen TPO-CSF en células animales puede efectuarse por cualquier procedimiento, con la condición de que pueda introducirse ADN en las células animales. Por ejemplo, puede utilizarse un procedimiento de electroporación [Miyaji et al., Cytotechnology, 3, 133 (1990)], un procedimiento de fosfato cálcico (solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 227075/90), un procedimiento de lipofección [Phillip L. Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] y similares. El aislamiento y cultivo de un transformante puede efectuarse según el procedimiento descrito en la solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 227075/90 o en la solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 257891/90.

Puede producirse TPO-CSF cultivando el transformante obtenido de este modo según el procedimiento de cultivo utilizado habitualmente.

Cuando se cultiva un transformante obtenido utilizando Escherichia coli, levadura o el microorganismo similar como hospedador, el medio puede ser un medio natural o un medio sintético, con tal que contenga fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas y similares que pueden ser asimiladas por el microorganismo y el cultivo del transformante puede realizarse de manera eficaz.

Como fuentes de carbono, se utilizan las que pueden ser asimiladas por los microorganismos respectivos, que incluyen carbohidratos tales como glucosa, fructosa, sacarosa, las molasas que los contienen, almidón, hidrolizados de almidón y similares, ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico y similares y alcoholes tales como etanol, propanol y similares.

Ejemplos de fuentes de nitrógeno útiles incluyen el amoniaco, sales de amoniaco de varios ácidos inorgánicos y orgánicos, tales como cloruro de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio, fosfato de amonio y similares, y otros compuestos que contienen nitrógeno, así como peptona, extracto de carne, extracto de levadura, maíz empapada en solución, hidrolizado de caseína, torta de soja e hidrolizado de torta de soja, varias células microbianas fermentadas y los digestos de las mismas.

Ejemplos de materiales inorgánicos útiles incluyen el fosfato dibásico de potasio, el fosfato monobásico dipotásico, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre, carbonato de calcio y similares.

El cultivo se realiza en condiciones aeróbicas agitando, removiendo, agitando con aire sumergido o similares. La temperatura del cultivo está comprendida preferentemente entre 15 y 40ºC y el periodo de cultivo es generalmente de 16 a 96 horas. El pH del medio se controla entre 3,0 y 9,0 durante el cultivo. El ajuste de pH se realiza utilizando un ácido inorgánico u orgánico, una solución alcalina, urea, carbonato de calcio, amoniaco y similares.

Según sea necesario, pueden añadirse antibióticos tales como ampicilina, tetraciclina y similares al medio durante el cultivo.

Cuando se cultiva un microorganismo transformado con un vector de expresión preparado que utiliza un activador inducible, puede añadirse un inductor al medio si es necesario. Por ejemplo, puede añadirse isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) o similares al medio cuando se cultiva un microorganismo transformado con un vector de expresión preparado utilizando el activador lac, o ácido indolacético (IAA) o similares cuando se cultiva un microorganismo transformado con un vector de expresión preparado utilizando el activador trp.

Cuando se cultiva un transformante obtenido utilizando células animales como hospedador, puede utilizarse medio RPMI 1640 utilizado generalmente (fabricado por Eagle Co. o GibcoBRL Co.), medio D-MEM (fabricado por GibcoBRL Co.) o uno cualquiera de estos medios enriquecidos más con suero bovino fetal y similares.

El cultivo se realiza, por ejemplo, en presencia de CO_{2} al 5%. La temperatura para el cultivo está comprendida preferentemente entre 35 y 37ºC, y el periodo de cultivo es generalmente de 3 a 7 días.

Según sea necesario, pueden añadirse al medio antibióticos tales como kanamicina, penicilina y similares durante el cultivo.

La productividad puede aumentarse utilizando un sistema para la ampliación del gen en el que se utilizan el gen de dihidrofolato reductasa y similares, según el procedimiento descrito en la solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 227075/90.

El TPO-CSF de la presente invención obtenido de esta manera puede purificarse por técnicas de purificación de proteínas utilizadas normalmente.

Por ejemplo, cuando el TPO-CSF no está segregado en la porción externa de las células hospedadoras, un caldo de cultivo del transformante se somete a centrifugación a las células recogidas en el caldo de cultivo, y las células recogidas de este modo se lavan y a continuación se destruyen utilizando un generador de ultrasonidos, prensa francesa, homogeneizador Manton Gaulin, Dynomil o similares, obteniéndose de este modo un extracto exento de células. A continuación, el extracto exento de células se somete a centrifugación, y el TPO-CSF se purifica en el fluido sobrenadante resultante haciendo uso de varias técnicas que incluyen el salado con sulfato de amonio o una sal similar, la cromatografía de intercambio aniónico en dietilaminoetil (DEAE)-Sefarosa o similares, la cromatografía hidrófoba en Butilsefarosa, Fenilsefarosa o similares, la filtración en gel con ayuda de tamices moleculares y varios tipos de electroforesis tales como el enfocado isoeléctrico y similares.

Cuando se segrega el TPO-CSF, puede obtenerse TPO-CSF purificado a partir de un filtrado del cultivo del transformante de la misma manera que en el caso del tratamiento mencionado anteriormente del sobrenadante del extracto exento de células.

Cuando se produce en células de Escherichia coli, puede purificarse eficazmente mediante la combinación del procedimiento mencionado anteriormente con el procedimiento descrito en la solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 267292/88.

También, es posible producir el TPO-CSF de la presente invención en forma de su proteína de fusión con otra proteína y purificar el producto por cromatografía de afinidad utilizando una sustancia que tenga afinidad para la proteína fusionada. Por ejemplo, es posible producir el TPO-CSF de la presente invención como su proteína de fusión con la proteína y purificarla por cromatografía de afinidad con ayuda de la inmunoglobulina G, según el procedimiento de Lowe et al. [John. B. Lowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989); John. B. Lowe et al., Genes Develop., 4, 1288 (1990)].

Además, puede purificarse también mediante cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos específicos para un polipéptido que presenta actividad de G-CSF, tales como los anticuerpos específicos para G-CSF.

El TPO-CSF de la presente invención puede utilizarse tal como es o como composiciones farmacéuticas en varias formas galénicas.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se producen mezclando una cantidad eficaz de TPO-CSF como ingrediente activo uniformemente con vehículos farmacológicamente aceptables.

Preferentemente, estas composiciones farmacéuticas pueden prepararse en forma de envases en dosis unitarias solubles para inyectables.

Los inyectables para su utilización en la administración por inyección pueden prepararse utilizando un vehículo tal como agua destilada, una solución salina de cloruro sódico o de una mezcla de cloruro sódico con otras sales inorgánicas, una solución azucarada de manitol, lactosa, dextrano, glucosa o similares, una solución de aminoácidos de glicina, arginina o similares, una solución de ácido orgánico, una solución de base orgánica o una solución mezcla que comprende una solución salina y una solución de azúcar. En este caso, la composición puede prepararse en soluciones, suspensiones o dispersiones de la manera habitual utilizando auxiliares que incluyen un agente activo de superficie no iónico osmótico. Estas soluciones pueden prepararse en preparaciones sólidas por preparación en polvo, liofilización y métodos similares, que se disuelven otra vez antes de su utilización.

Las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente que contienen el TPO-CSF de la presente invención como ingrediente activo son útiles para el tratamiento de la anemia o de pacientes que se vuelven anémicos como resultado de tratamiento de enfermedades.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una ilustración que presenta la construcción de un plásmido que contiene ADN que codifica a TPO-ND28 (1).

La Fig. 2 es una ilustración que presenta la construcción de un plásmido que contiene ADN que codifica a TPO-ND28 (2).

La Fig. 3 es una ilustración que presenta la construcción de un plásmido que contiene ADN que codifica a TPO-ND28 (3).

Mejor modo de poner en práctica la invención

Ejemplo 1

Preparación de ADN que codifica TPO-CSF

Se preparó de la siguiente manera un ADN que codifica TPO-CSF, utilizando un ADN que codifica un polipéptido ND28 en el que el resto del aminoácido en 1ª posición de la secuencia de aminoácidos del G-CSF humano fue sustituido por alanina (Ala) y el aminoácido en 3ª posición por treonina (Thr), el aminoácido en 4ª posición por tirosina (Tyr), el aminoácido en 5ª posición por arginina (Arg) y el aminoácido en 17ª posición por serina (Ser) (aplicación de patente japonesa publicada no examinada nº 267292/88) como ADN que codifica un polipéptido que presenta actividad de G-CSF, y un ADN que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la Tabla 3 (de Sauvage et al., Nature, 369, 533 (1994); en adelante denominada "TPO") como un ADN que codifica un polipéptido que presenta actividad de TPO. El polipéptido de fusión de TPO y ND28 se abrevia como TPO-ND28 en
adelante.

1. Preparación del gen TPO

Un gen que codifica a TPO (denominado en adelante "gen TPO") para su utilización en la preparación de TPO-ND28 se obtuvo por PCR de la siguiente manera basándose en la secuencia nucleotídica descrita por de Sauvage et al. [Nature, 369, 533 (1994)].

Un ADN mostrado en la Secuencia ID. nº: 7 que contiene la secuencia nucleotídica con extremo 5'' del gen TPO (denominado en adelante "cebador 1") y un ADN mostrado en la Secuencia ID. nº: 8 que contiene la secuencia nucleotídica con extremo 3'' del gen TPO (denominado en adelante "cebador 2") se sintetizaron utilizando un sintetizador de ADN 380A de Applied Biosystems, Inc. para facilitar la clonación, una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción se añadió al terminal de cada cebador.

La ampliación y la clonación de la secuencia de la zona de traducción del gen TPO se realizaron por PCR con transcripción inversa utilizando los cebadores 1 y 2, poli A^{+} ARNm de hígado humano (preparado por Clontech Co., producto nº CL 6510-1) a ARNm y sistema de preampliación SuperScript para el kit de síntesis de la primera cadena de ADNc (preparado por GibcoBRL Co.).

Una parte de 0,013 ml de solución acuosa que contiene 1.000 ng de poli A^{+} ARNm de hígado humano y 500 ng de oligo (dt) 12-18 (incluido en el kit) se trató a 70ºC durante 10 minutos y a continuación se dejó en reposo en hielo durante 1 minuto.

La solución resultante se mezcló con 0,002 ml de tampón de síntesis concentrado diez veces, 0,001 ml de mezcla NTPd de 10 mM, 0,002 ml de DTT 0,1 M y 0,001 ml de SuperScript II RT (200 kU/ml) (incluidos todos en el kit), y se dejó reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos y a continuación se incubó a 42ºC durante 50 minutos. Una vez terminada la incubación, se calentó la mezcla a 90ºC durante 5 minutos para terminar la reacción de transcripción inversa.

La solución de reacción se mezcló con 0,001 ml de RNasa H de E. coli (2.000 U/ml; incluida en el kit) y se incubó a 37ºC durante 20 minutos.

Una parte de 0,1 ml de una solución de reacción que contiene 0,005 ml de la solución de reacción anterior, cebador 1 400 nM, cebador 2 400 nM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,2), cloruro potásico 10 mM, 0,01 mg/ml de albúmina de suero bovino (denominada en adelante "BSA"), cloruro de magnesio 2 mM, sulfato amónico 6 mM, triton X-100 0,1%, sulfóxido de dimetilo al 10% (denominado en adelante "DMSO"), trifosfato de desoxiadenosina 0,05 mM (denominado en adelante "dATP"), trifosfato de desoxicitidina 0,05 mM (denominado en adelante "dCTP"), trifosfato de desoxiguanosina 0,05 mM (denominado en adelante "dGTP") y trifosfato de desoxitimidina 0,05 mM (denominado en adelante "dTTP") se mezcló con 2,5 unidades de Pfu polimerasa (fabricada por Stratagene Co.) para realizar la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN PERKIN ELMER CETUS (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) mediante repetición de 35 veces de una incubación en tres etapas a 94ºC durante 45 segundos, a 50ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 2 minutos.

La solución de reacción resultante se sometió a extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol, y el precipitado obtenido de este modo se disolvió en 0,015 ml de tampón TE [Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y ácido etilendiamintetraacético 1 mM (denominado en adelante "EDTA")].

La solución preparada de este modo se mezcló con enzimas de restricción HindIII y KpnI para escindir el ADN ampliado por PCR.

La solución resultante se sometió a electroforesis en gel de agarosa y un ADN tratado con HindIII-KpnI de aproximadamente 1,1 kb se aisló del gel de agarosa.

Utilizando el kit de ligadura de ADN ver. 1 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), el ADN aislado de este modo (50 ng) se ligó con un fragmento de 2,9 kb (30 ng) escindido por HindIII-KpnI de un vector plásmido pBlueScript II SK(-) que tiene un punto de multiclonación (preparado por Stratagene Co.) (volumen de la solución de reacción: 0,018 ml).

Utilizando esta solución de reacción, se transformó de la manera habitual una cepa DH5\alpha de Escherichia coli (Célula competente DH5\alpha con eficacia de banco, fabricada por GibcoBRL Co.) y el transformante resultante se sembró en medio agar-agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y se cultivó durante la noche a 37ºC.

Se aislaron plásmidos de varias cepas transformantes cultivados en el medio según un procedimiento conocido [Bimboim et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979)].

Se determinó la secuencia nucleotídica del fragmento de inserción en cada plásmido utilizando el kit Taq DyeDeoxy Terminador Cycle Sequencing (fabricado por Applied Biosystems Japan Inc., producto nº 401113) y el secuenciador de ADN ABI373A (fabricado por Applied Biosystems Japan Inc.). Al determinar la secuencia nucleotídica, seis ADN que presentan las secuencias nucleotídicas de las Secuencias ID nº 9 a nº 13 ó 14 y dos cebadores que presentan la secuencia nucleotídica mostrada en la Secuencia ID. nº 15 o nº 16 que contiene una secuencia nucleotídica en el vector se sintetizaron basándose en la secuencia nucleoítica del gen TPO [de Sauvage et al., Nature, 369, 533 (1994)] y se utilizaron como cebadores para la determinación de la secuencia nucleotídica.

La determinación de la secuencia nucleotídica se realizó según las instrucciones adjuntas al kit y al aparato.

De los plásmidos mencionados anteriormente, un plásmido PBS-TP0332 que coincidía con la secuencia nucleotídica descrita del fragmento de inserción del gen TPO se utilizó en los procedimientos posteriores.

2. Construcción y expresión del ADN que codifica a TPO-ND28

Utilizando el ADN que codifica a TPO obtenido en el Ejemplo 1-1 y el ADN que codifica a ND28 obtenido por el procedimiento descrito en la solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 267292/88, se preparó de la siguiente manera un polipéptido de fusión de TPO y ND28 (TPO en la cadena terminal en N y ND28 en la cadena terminal C), TPO-ND28.

1) Construcción de ADN (Secuencia ID. nº 5) que codifica a TPO-ND28 (1) [Secuencia ID. nº 2; tipo construido mediante un enlazador (Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg: secuencia ID. nº 17)]

Aunque el TPO de tipo maduro comprende 332 aminoácidos, se informa de que es una proteína acortada constituida por 153 aminoácidos de la cadena terminal N que presentan la misma actividad del TPO completo [de Sauvage et al., Nature, 369, 533 (1994)], de manera que un ADN que codifica a TPO-ND28 (1) en el que los 153 aminoácidos del terminal N de TPO, utilizados como su cadena terminal N, se fusionó con el ND28 completo (174 aminoácidos) como lateral terminal C mediante un enlazador (Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg) se preparó de la siguiente manera (compárese con la Fig. 1).

(i) Preparación del ADN que codifica la porción TPO de TPO-ND28 (1)

Para preparar un ADN que codifica la porción TPO de TPO-ND28 (1) por medio de PCR, un cebador de ADN que presenta una secuencia nucleotídica (Secuencia ID. nº 18) que corresponde con el enlazador se sintetizó como cebador del extremo 3'' (denominado en adelante "cebador 3").

Utilizando el cebador 3 sintetizado de este modo y el cebador 1 y pBS-TP0332, se realizó la PCR de la manera siguiente.

Una parte de 0,1 ml de una solución de reacción que contiene 10 ng de pBS-TP0332, cebador 3 400 nM, cebador 1 400 nM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,2), cloruro potásico 10 mM, 0,01 mg/ml de BSA, cloruro de magnesio 2 mM, sulfato amónico 6 mM, Triton X-100 0,1%, DMSO al 10%, dATP 0,05 mM, dCTP 0,05 mM, dGTP 0,05 mM y dTTP 0,05 mM se mezcló con 2,5 unidades de Pfu polimerasa para realizar la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN PERKIN ELMER CETUS (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) mediante repetición de 18 veces de una incubación en tres etapas a 94ºC durante 45 segundos, a 50ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto.

La solución de reacción resultante se sometió a extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol, el precipitado obtenido de esta manera se disolvió en 0,015 ml de tampón TE.

La solución preparada de este modo se mezcló con las enzimas de restricción HindIII y XbaI para escindir el ADN ampliado por PCR.

La solución resultante se sometió a electroforesis en gel de agarosa, y un fragmento de ADN tratado con HindIII-XbaI de aproximadamente 0,6 kb se aisló del gel de agarosa.

Utilizando el kit de ligadura de ADN ver. 1 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), el fragmento de ADN (100 ng) aislado de este modo se ligó con un fragmento de 2,9 kb (50 ng) escindido por HindIII-XbaI de pBlueScript II SK(-) (volumen de la solución de reacción: 0,018 ml).

Utilizando esta solución de reacción, se transformó de la manera habitual una cepa DH5\alpha de Escherichia coli y el transformante resultante se sembró en medio agar-agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y se cultivó durante la noche a 37ºC.

Se aislaron los plásmidos de varias cepas transformantes cultivadas en el medio según un procedimiento conocido.

Se determinó la secuencia nucleotídica del fragmento de inserción en cada plásmido utilizando el Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit y el secuenciador de ADN ABI373A (fabricado por Applied Biosystems Japan Inc.). Al determinar la secuencia nucleotídica, los cebadores que presentan la secuencia nucleotídica mostrada en la Secuencia ID. nº 9 a 12, nº 15 y nº 16 se utilizaron como cebadores para la determinación de la secuencia nucleotídica.

La determinación de la secuencia nucleotídica se realizó según las instrucciones adjuntas al kit y al aparato.

De los plásmidos mencionados anteriormente, un plásmido pBS-T153LND que coincidía con la secuencia nucleotídica descrita del fragmento de inserción del gen TPO se utilizó en los procedimientos posteriores.

(ii) Preparación de ADN que codifica la porción ND28 de TPO-ND28 (1)

Para preparar un ADN que codifica la porción ND28 de TPO-ND28 (1) mediante PCR, un cebador que presenta una secuencia nucleotídica (Secuencia ID. nº 19) que corresponde al enlazador y a la secuencia de aminoácidos de ND28 se sintetizó como cebador del extremo 5'' (denominado en adelante "cebador 4"), y un cebador que presenta una secuencia nucleotídica (Secuencia ID. nº 20) que corresponde a la secuencia de aminoácidos del lateral terminal C de ND28 se sintetizó como cebador del extremo 3'' (denominado en adelante "cebador 5").

Utilizando los cebadores sintetizados de este modo y el plásmido pCfBD28 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 267292/88), se realizó la PCR de la siguiente manera.

Una parte de 0,1 ml de una solución de reacción que contiene 10 ng de pCfBD28, cebador 4 400 nM, cebador 5 400 nM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,2), cloruro potásico 10 mM, 0,01 mg/ml de BSA, cloruro de magnesio 2 mM, sulfato amónico 6 mM, Triton X-100 0,1%, DMSO al 10%, dATP 0,05 mM, dCTP 0,05 mM, dGTP 0,05 mM y dTTP 0,05 mM se mezcló con 2,5 unidades de Pfu polimerasa para realizar la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN PERKIN ELMER CETUS (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) mediante repetición de 18 veces de una incubación en tres etapas a 94ºC durante 45 segundos, a 50ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto.

La solución de reacción resultante se sometió a extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol, el precipitado obtenido de este modo se disolvió en 0,015 ml de tampón TE.

La solución preparada de este modo se mezcló con las enzimas de restricción SacIII y XbaI para escindir el ADN ampliado por PCR.

La solución resultante se sometió a electroforesis en gel de agarosa, y un fragmento de ADN escindido por HindIII-XbaI de aproximadamente 0,5 kb se aisló del gel de agarosa.

Utilizando el kit de ligadura de ADN ver. 1 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), el fragmento de ADN (100 ng) aislado de este modo se ligó con un fragmento de 2,9 kb (50 ng) escindido por SacIII-XbaI de pBlueScript II SK(-) (volumen de la solución de reacción: 0,018 ml).

Utilizando esta solución de reacción, se transformó de la manera habitual una cepa DH5\alpha de Escherichia coli y el transformante resultante se sembró en medio agar-agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y se cultivó durante la noche a 37ºC.

Se aislaron los plásmidos de varias cepas transformantes cultivadas en el medio según un procedimiento cono-
cido.

Se determinó la secuencia nucleotídica del fragmento de inserción en cada plásmido utilizando el Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit y el secuenciador de ADN ABI373A. Al determinar la secuencia nucleotídica, dos ADN que presentan la secuencia nucleotídica de la Secuencia ID. nº 21 o nº 22 que contienen una secuencia nucleotídica del ADN que codifica a ND28 y dos ADN que presentan la secuencia nucleotídica de la Secuencia ID.nº 15 o nº 16 que contienen una secuencia presente en el vector se utilizaron como cebadores para la determinación de la secuencia nucleotídica.

La determinación de la secuencia nucleotídica se realizó según las instrucciones adjuntas al kit y al aparato.

De los plásmidos mencionados anteriormente, el plásmido pBS-LND28 en el que la secuencia nucleotídica del fragmento de la inserción coincidía con las secuencias nucleotídicas del gen ND28 y los cebadores se utilizó en los procedimientos posteriores.

(iii) Preparación de ADN que codifica a TPO-ND28 (1)

Los ADN respectivamente que codifican la porción TPO y la porción ND28 preparadas en el Ejemplo 1-2-1)-(i) y (ii) se fusionaron de la siguiente manera.

Una parte de 2.000 ng de pBS-T153LND se escindió con las enzimas de restricción SacII y XbaI y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para aislar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,5 kb.

Asimismo, una parte de 500 ng de pBS-LND28 se escindió con las enzimas de restricción SacII y XbaI y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para aislar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,5 kb.

\newpage

Utilizando el kit de ligadura de ADN Ver. 1 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), el fragmento de ADN de aproximadamente 3,5 kb (100 ng) se ligó con un fragmento de aproximadamente 0,5 kb (100 ng) (volumen de la solución de reacción: 0,018 ml).

Utilizando esta solución de reacción, se transformó de la manera habitual una cepa DH5\alpha de Escherichia coli y el transformante resultante se sembró en medio agar-agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y se cultivó durante la noche a 37ºC.

Se aislaron los plásmidos de varias cepas transformantes cultivadas en el medio según un procedimiento conocido.

Se examinaron las estructuras de estos plásmidos utilizando las enzimas de restricción SacII y XbaI, y el plásmido pBS-T153LND28 que presenta una estructura en la que ambos fragmentos de ADN están ligados entre sí se utilizó en los procedimientos posteriores.

2) Construcción de ADN (Secuencia ID. nº 4) que codifica a TPO-ND28 (2) [Secuencia ID. nº 1; tipo construido sin enlazador]

Un ADN que codifica a TPO-ND28 (2) en el que los 154 aminoácidos de TPO de su terminal N se fusionaron con la terminal N de D28 (174 aminoácidos) se preparó de la siguiente manera (compárese con Fig. 2).

(i) Preparación de ADN que codifica la fracción TPO de TPO-ND28 (2)

Para preparar un ADN que codifica la porción TPO de TPO-ND28 (2) mediante PCR, un cebador que presenta una secuencia nucleotídica mostrada en la Secuencia ID. nº 23 que tiene una secuencia nucleotídica que corresponde a las secuencias de aminoácidos de TPO y ND28 se sintetizó como cebador del lado 3'' (denominado en adelante "cebador 6").

Utilizando el cebador 6 sintetizado de este modo y el cebador 1 y pBS-TP0332, se realizó la PCR de la siguiente manera.

Una parte de 0,1 ml de una solución de reacción que contiene 10 ng de pBS-TP0332, cebador 6 400 nM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,2), cloruro potásico 10 mM, 0,01 mg/ml de BSA, cloruro de magnesio 2 mM, sulfato amónico 6 mM, Triton X-100 0,1%, DMSO al 10%, dATP 0,05 mM, dCTP 0,05 mM, dGTP 0,05 mM y dTTP 0,05 mM se mezcló con 2,5 unidades de Pfu polimerasa para realizar la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN PERKIN ELMER CETUS mediante repetición de 18 veces de una incubación en tres etapas a 94ºC durante 45 segundos, a 50ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto.

La solución de reacción resultante se sometió a extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol, y el precipitado obtenido de este modo se disolvió en 0,015 ml de tampón TE.

La solución preparada de este modo se mezcló con las enzimas de restricción HindIII y XhoI para escindir el ADN ampliado por PCR.

La solución resultante se sometió a electroforesis en gel de agarosa, y un fragmento de ADN escindido por HindIII-XhoI de aproximadamente 0,5 kb se aisló del gel de agarosa.

Utilizando el kit de ligadura de ADN ver. 1 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), el fragmento de ADN (100 ng) aislado de este modo se ligó con un fragmento de 2,9 kb (50 ng) escindido por HindIII-XhoI de pBlueScript II SK(-) (volumen de la solución de reacción: 0,018 ml).

Utilizando esta solución de reacción, se transformó de la manera habitual una cepa DH5\alpha de Escherichia coli y el transformante resultante se sembró en medio agar-agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y se cultivó durante la noche a 37ºC.

Se aislaron los plásmidos de varias cepas transformantes cultivadas en el medio según un procedimiento conocido.

Se determinó la secuencia nucleotídica del fragmento de inserción en cada plásmido utilizando el Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit y el secuenciador de ADN ABI373A (fabricado por Applied Biosystems Japan Inc.). Al determinar la secuencia nucleotídica, los cebadores que presentan las secuencias nucleotídicas de la Secuencia ID. nº 9 a nº 12, nº 15 y nº 16 se utilizaron como cebadores para la determinación de la secuencia nucleotídica.

La determinación de la secuencia nucleotídica se realizó según las instrucciones adjuntas al kit y al aparato.

De los plásmidos mencionados anteriormente, el plásmido pBS-T154ND en el que la secuencia nucleotídica del fragmento de la inserción coincidía con las secuencias nucleotídicas del gen TPO y de los cebadores se utilizó en los procedimientos posteriores.

(ii) Preparación de ADN que codifica a TPO-ND28 (2)

El ADN que codifica la porción TPO preparada en el Ejemplo 1-2-2)-(i) y el ADN que codifica la porción ND28 preparada en el Ejemplo 1-2-1)-(ii) se fusionaron de la siguiente manera.

Una parte de 200 ng de pBS-T154ND se escindió con las enzimas de restricción KpnI y XhoI y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para aislar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,5 kb.

Asimismo, una parte de 500 ng de pBS-LND28 se escindió con las enzimas de restricción KpnI y XhoI y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para aislar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,5 kb.

Utilizando el kit de ligadura de ADN Ver. 1 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), el fragmento de ADN de aproximadamente 3,5 kb (100 ng) se ligó con un fragmento de aproximadamente 0,5 kb (100 ng) (volumen de la solución de reacción: 0,018 ml).

Utilizando esta solución de reacción, se transformó de la manera habitual una cepa DH5\alpha de Escherichia coli y el transformante resultante se sembró en medio agar-agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y se cultivó durante la noche a 37ºC.

Se aislaron los plásmidos de varias cepas transformantes cultivadas en el medio según un procedimiento conocido.

Se examinaron las estructuras de estos plásmidos utilizando las enzimas de restricción KpnI y XhoI, y el plásmido pBS-T154ND28 que presenta una estructura en la que ambos fragmentos de ADN están ligados entre sí se utilizó en los procedimientos posteriores.

3) Construcción de ADN (Secuencia ID. nº 6) que codifica TPO-ND28 (3) [Secuencia ID. nº 3; tipo construido mediante un enlazador (Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg; secuencia ID. nº 24)]

Un ADN que codifica a TPO-ND28 (3) en el que los 153 aminoácidos del terminal N de TPO, utilizado como su lado terminal N, se fusionó con el ND28 completo (174 aminoácidos) como lado terminal C mediante un enlazador (Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg) se preparó de la siguiente manera (compárese con la Fig. 3).

Para ligar el ADN que codifica la porción TPO preparada en el Ejemplo 1-2-2)-(1) con el ADN que codifica la porción ND28 preparada en el Ejemplo 1-2-1)-(ii) mediante un enlazador (Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg), se sintetizaron dos ADN mostrados en la Secuencia ID. nº 25 y nº 26 que tienen secuencias nucleotídicas que forman los terminales complementarios SolI-BbeI en ambos lados correspondientes a las secuencias de aminoácidos de los enlazadores.

Una fracción de 0,02 ml de una solución que contiene ADN 0,01 mM mostrado en la Secuencia ID. nº 25, ATP 5 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), cloruro de magnesio 10 mM y ditiotreitol 5 mM se mezcló con 10 unidades de T4 polinucleótido cinasa (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) y la mezcla se dejó en reposo a 37ºC durante 30 minutos y a continuación se calentó a 70ºC durante 3 minutos para obtener la solución de tratamiento (1).

El ADN mostrado en la secuencia ID. nº 26 se trató también de la misma manera para obtener la solución de tratamiento (2).

La solución de tratamiento (1) se mezcló con la solución de tratamiento (2), y la mezcla se incubó a 90ºC durante 5 minutos y a continuación se enfrió gradualmente a 22ºC empleando 3 horas para preparar ADN de doble cadena.

El ADN de doble cadena preparado de este modo se insertó en el punto de conexión del gen que codifica a TPO y el gen que codifica a ND28 de PBS-T154ND28 obtenido en el Ejemplo 1-2-2)-(ii) de la siguiente manera.

Una parte de 2.000 ng de pBS-T154ND se escindió con las enzimas de restricción BbeI y SplI y se sometió a electroforesis en gel de agarosa para aislar un fragmento de ADN de aproximadamente 4,0 kb.

Utilizando el kit de ligadura de ADN Ver. 1 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), el fragmento de ADN de aproximadamente 4,0 kb (100 ng) se ligó con el ADN de doble cadena mencionado anteriormente (12,5 pmoles) (volumen de la solución de reacción: 0,018 ml).

Utilizando esta solución de reacción, se transformó de la manera habitual la cepa DH5\alpha de Escherichia coli y el transformante resultante se sembró en medio agar-agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y se cultivó durante la noche a 37ºC.

Se aislaron los plásmidos de varias cepas transformantes cultivadas en el medio según un procedimiento conocido.

Se determinó la secuencia nucleotídica del fragmento de inserción en cada plásmido utilizando el Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit y el secuenciador de ADN ABI373A. Al determinar la secuencia nucleotídica, dos ADN mostrados en la Secuencia ID. nº 12 y nº 22 se utilizaron como cebadores. La determinación de la secuencia nucleotídica se realizó según las instrucciones adjuntas al kit y al aparato.

De estos plásmidos, el plásmido denominado pBS-T153ND28LN1 en el que la secuencia nucleotídica del fragmento de la inserción coincidía con las secuencias nucleotídicas del ADN del enlazador se utilizó en los procedimientos posteriores.

Ejemplo 2

Producción de TPO-CSF

El TPO-CSF se produjo efectuando la expresión del ADN que codifica el TPO-CSF en células animales de la manera siguiente.

1) Producción de TPO-ND28 (1) y TPO-ND28 (2)

El plásmido pcDNA3 (preparado por Invitrogen Co.) se escindió con EcoRI y NotI y se sometió a electroforesis en gel de agarosa para aislar un fragmento de ADN (lado del vector) de aproximadamente 5,4 kb.

Además, pBS-TI53LND28 y pBS-T154ND28 obtenidos en el Ejemplo 1-2-1)-(iii) y en el Ejemplo 1-2-2)-(ii) se escindieron por separado con EcoRI y NotI y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para aislar un fragmento de ADN (lado de la inserción) de aproximadamente 1,1 kb de cada plásmido.

Utilizando el kit de ligadura de ADN Ver. 1, el fragmento de ADN del lado del vector de aproximadamente 5,4 kb (100 ng) se ligó con cada uno de los fragmentos del ADN del lado de la inserción (100 ng) (volumen de la solución de reacción: 0,018 ml).

Utilizando esta solución de reacción, se transformó de la manera habitual la cepa DH5\alpha de Escherichia coli y el transformante resultante se sembró en medio agar-agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y se cultivó durante la noche a 37ºC.

Se aislaron los plásmidos de varias cepas transformantes cultivadas en el medio según un procedimiento conocido.

Se examinó las estructura de cada plásmido utilizando las enzimas de restricción EcoRI y NotI para seleccionar los plásmidos que contenían las inserciones respectivas con una estructura en la que los fragmentos de ADN del lado vector y del lado inserción están ligados entre sí, y el plásmido pCD-153LND28 que contiene un gen que codifica a TPO-ND28 (1) y el plásmido pCD-154ND28 que contiene un gen que codifica a TPO-ND28 (2) se utilizaron en el procedimiento posterior.

El plásmido pCD-153LND28 o pCD-154ND28 se introdujo en células de animales por electroporación [Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7161 (1984)] y su expresión se efectuó de la siguiente manera.

Se cultivaron células COS 7 en medio D-MEM (preparado por GibcoBRL Co., producto nº 11885-50) que se enriqueció además con suero bovino fetal al 10%.

Las células COS 7 obtenidas por cultivo se pusieron en suspensión en tampón K-PBS (cloruro potásico 137 mM, cloruro sódico 2,7 mM, fosfato disódico 8,1 mM, fosfato monosódico 1,5 mM, cloruro de magnesio 4 mM) para preparar una suspensión celular de 8 \times 10^{8} células/ml.

Una parte de 0,2 ml de la suspensión celular se inyectó en un Pulser Cuvette (fabricado por BIO RAD LABORATORIES) con una anchura de rendija de 0,2 cm.

Una parte de 4 \mug de pCD-153LND28 o pCD-154ND28 se añadió a la cubeta, se mezcló intensamente con la suspensión y se sometió a la aplicación de pulsaciones utilizando un aparato de electroporación (Gene Pulser, fabricado por BIO RAD LABORATORIES) en las condiciones de 200 \Omega, 0,3 kv/cm y 0,125 mF.

La solución tratada con pulsaciones se dejó en reposo en hielo durante 5 minutos, se puso en suspensión en 10 ml de medio D-MEM enriquecido con suero bovino fetal al 10% y a continuación se cultivó a 37ºC durante 72 horas en un incubador de CO_{2}.

El caldo de cultivo se sometió a centrifugación, y el sobrenadante de cultivo resultante se filtró a través de un filtro de 220 nm de tamaño de poro para obtener una solución de TPO-ND28 (1) o TPO-ND28 (2).

2) Producción de TPO-ND28 (3)

Se utilizó un plásmido pAGE210 como vector para su utilización en la expresión de TPO-ND28 (3). El vector pAGE210 es un derivado de pAGE248 [Sasaki et al., J. Biol. Chem., 269, 14730, (1994)], en el que se ha sustituido el activador del virus de leucemia murina de Moloney (fragmento XhoI-HindIII) por el activador precoz SV40 (fragmento XhoI-HindIII) de pAGE103 [Mizukami et al., J. Biochem., 101, 1307 (1987)].

Se escindió el plásmido pAGE210 con KpnI y HindIII y se sometió a una electroforesis en gel de agarosa para aislar un fragmento de ADN (lado del vector) de aproximadamente 9,0 kb.

Independientemente de éste, pBS-TPO322 obtenido en el Ejemplo 1-1 se escindió con KpnI y HindIII, y pBS-153ND28LN1 obtenido en el Ejemplo 1-1-3) se escindió con KpnI y a continuación parcialmente con HindIII, y cada uno de los fragmentos resultantes escindidos se sometió a electroforesis en gel de agarosa para aislar el fragmento de ADN (lado de la inserción) de aproximadamente 1,1 kb de cada plásmido.

Utilizando el kit de ligadura de ADN ver. 1, el fragmento de ADN del lado vector de aproximadamente 9,0 kb (100 ng) se ligó con cada uno de los fragmentos del ADN del lado de la inserción de aproximadamente 1,1 kb (100 ng) (volumen de la solución de reacción: 0,012 ml).

Utilizando esta solución de reacción, se transformó de la manera habitual la cepa DH5\alpha de Escherichia coli y el transformante resultante se sembró en medio agar-agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y se cultivó durante la noche a 37ºC.

Se aislaron los plásmidos de varias cepas transformantes cultivadas en el medio según un procedimiento conocido.

Se examinó las estructura de cada plásmido utilizando las enzimas de restricción KnnI para seleccionar los plásmidos que contenían las inserciones respectivas con una estructura en la que los fragmentos de ADN del lado vector y del lado inserción están ligados entre sí, y el plásmido pAGE210-T332 que contiene un gen que codifica a TPO-ND28 (1) y el plásmido pCD-154ND28 que contiene el gen que codifica a TPO y el plásmido pAGE210-LN1 que contiene el gen que codifica a TPO-ND28 (3) se utilizaron en el procedimiento posterior.

El plásmido pAGE210-T332 o el pAGE210-LN1 se introdujo en células de animal por electroporación.

Las células CHO se cultivaron en medio MEM (1) (preparado por GibcoBRL Co., producto nº 19000-024) que se enriqueció además con suero bovino fetal al 10%.

Las células CHO obtenidas por cultivo se pusieron en suspensión en tampón K-PBS para preparar una suspensión celular de 8 \times 10^{6} células/ml.

Una fracción de 0,2 ml de la suspensión celular se inyectó en una Pulser Cuvette con una anchura de rendija de 0,2 cm.

Una fracción de 4 \mug de pAGE210-T332 o pAGE210-LN1 se añadió a la cubeta, se mezcló intensamente con la suspensión y se a continuación se sometió a la aplicación de pulsaciones utilizando un aparato de electroporación, Gene Pulser, en las condiciones de 0,35 kv/cm y 0,25 mF.

La solución tratada con pulsaciones se dejó reposar en hielo durante 5 minutos, se puso en suspensión en 10 ml de medio D-MEM enriquecido con suero bovino fetal al 10% y a continuación se cultivó a 37ºC durante 24 horas en un incubador de CO_{2}.

Las células cultivadas de esta manera se cultivaron de nuevo durante 2 semanas en medio MEM (1) enriquecido con suero bovino fetal al 10% y 0,3 mg/ml de higromicina.

Las células resultantes se siguieron cultivando durante 2 semanas en medio MEM (2) (preparado por GibcoBRL Co., código nº 12000-022) enriquecido con suero bovino fetal al 10% y metotrexato 50 mM (denominado en adelante MTX).

El cultivo se repitió de la misma manera sucesivamente aumentando la concentración de MTX a 100 nM, 500 nM y 1.000 nM en este orden, obteniendo de este modo cepas resistentes a TMX 1.000 nM.

Cada una de las cepas resistentes a MTX 1.000 nM se cultivó en medio MEM (2) enriquecido con suero bovino fetal al 10%, se cambió el medio por un medio exento en suero para su utilización con células CHO, CHO-S-SFMII (preparado por GibcoBRL Co., código nº 12052-015) y a continuación se cultivó la cepa de nuevo durante 96 a 144 horas.

Sometiendo el caldo de cultivo a centrifugación, se obtuvo un cultivo sobrenadante que contenía TPO o TPO-ND28 (3).

\newpage

Ejemplo 3

Purificación de TPO-ND28 (3) y TPO

Una parte de 1.000 ml de TPO-ND28 (3) o TPO obtenida en el Ejemplo 2-2) se concentró hasta 50 ml utilizando Centriprep (fabricado por Amicon Co.) para preparar una solución concentrada.

Una parte de 50 ml de cada una de las soluciones concentradas se aplicó a una columna XK50 (fabricada por Pharmacia K.K.) que había sido rellenada con 1.000 ml de resina Sephacryl S-200 (fabricada por Pharmacia K.K.) y rellena con tampón de fosfato (fosfato sódico 9,4 mM (pH 7,2), NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM).

La elución de TPO-ND28 (3) o TPO se efectuó pasando el tampón fosfato a través de la columna a un caudal de 3 ml/minuto.

Los eluídos se mezclaron cada 12,5 minutos, y se comprobaron sus actividades de TPO y G-CSF en las fracciones resultantes mediante un método de análisis MTT que se describirá a continuación, obteniéndose de este modo TPO-ND28 (3) o TPO purificados.

Ejemplo 4

Modificación de TPO-ND28 (3) con polietilenglicol

A agua enfriada con hielo se añadió PEG 20 kd-propionato de succinimidilo (preparado por Shearwater Polymers Co.) hasta una concentración final de 400 mg/ml.

Una fracción de 50 \mul de la solución acuosa preparada de este modo se mezcló con 200 \mul de la solución TPO-ND28 (3) obtenida en el Ejemplo 3 y 150 \mul de agua destilada. Se dejó reposar la mezcla durante 12 horas a 4ºC, efectuándose de este modo la modificación de TPO-ND28 (3) por polietilenglicol.

El TPO-ND28 (3) modificado de este modo con polietilenglicol (denominado en adelante PEG-TPO-ND28 (3)) se aplicó a una columna de Super Rose 610/30 (fabricada por Pharmacia K.K.) que se había rellenado de antemano con un tampón de fosfato (fosfato sódico 9,4 mM (pH 7,2), NaCl 137 mM, RCl 2,7 mM).

La elución se efectuó pasando el tampón fosfato a través de la columna a un caudal de 0,5 ml/minuto.

Se combinaron los eluídos cada 1 minuto, y en las fracciones resultantes se comprobaron sus actividades de G-CSF y TPO por el método de análisis MTT que se describirá a continuación.

Los resultados se presentan en la Tabla 5.

Las actividades de G-CSF y TPO originadas a partir de TPO-ND28 (3) no modificado se detectaron 34 a 40 minutos después del comienzo de la elución, y las actividades de G-CSF y TPO originadas a partir de PEG-TPO-ND28 (3) se detectaron después de 16 a 28 minutos de la elución.

Estos resultados confirmaron que puede obtenerse TPO-CSF modificado con polietilenglicol con actividades tanto de G-CSF como de TPO.

TABLA 5

5

Ejemplo de la prueba 1

Medición del peso molecular de TPO-ND28

Utilizando la solución de TPO-ND28 (1) obtenida en el Ejemplo 2-1), se midió su peso molecular mediante una cromatografía de filtración en gel de la manera siguiente.

Una fracción de 0,2 ml de la solución TPO-ND28 (1) se aplicó a una columna Super Rose 610_30 (fabricada por Pharmacia K.K.) que se había equilibrado de antemano con tampón fosfato (fosfato sódico 9,4 mM (pH 7,2), NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM), y se efectuó la elución de TPO-ND28 (1) pasando el tampón fosfato a través de la columna a un caudal de 0,5 ml/minuto.

Los eluídos se mezclaron cada 0,5 minutos, y se comprobaron las actividades de TPO y G-CSF en las fracciones resultantes mediante un método de análisis MTT que se describirá a continuación.

La Tabla 6 presenta el tiempo de elución en Super Rose y los valores medidos de las actividades de TPO y G-CSF.

Las actividades de TPO y G-CSF alcanzaron el máximo tras 33,5 minutos de elución.

Independientemente de esto, se utilizaron tiroglobulina (peso molecular: 670.000), aldolasa (peso molecular: 160.000), albúmina de suero bovino (peso molecular: 69.000) y G-CSF (peso molecular: 20.000) como proteínas de peso molecular estándar y se pasaron a través de Super Rose para obtener la relación entre el tiempo de elución y el peso molecular.

El peso molecular de TPO-ND28 (1) deducido a partir de 33,5 minutos del tiempo de elución fue aproximadamente de 40.000.

TABLA 6

6

Ejemplo 2 de prueba

Actividad biológica de TPO-CSF

La construcción básica para la medición de la actividad estimulante del crecimiento celular de una solución que ha de analizarse (solución TPO-ND28) sobre las células que deben analizarse es la siguiente.

Cada solución que ha de analizarse (solución TPO-ND28), la solución patrón TPO y la solución patrón ND28 se prepara en diluciones de 10 veces en serie, y una parte de 0,01 ml de cada una de las diluciones se añade a cada pocillo de una placa de microvaloración.

Las células que crecen activamente que han de analizarse se recogen de un caldo de cultivo por centrifugación, se lavan y a continuación se vuelven a poner en suspensión en un medio para probar la utilización a una densidad celular más adecuada para cada análisis.

La suspensión celular preparada de este modo se distribuye en fracciones de 0,9 ml en los pocillos de la placa de microvaloración mencionada anteriormente que ha sido preparada distribuyendo las diluciones de la solución que debe analizarse, solución patrón TPO o solución patrón ND28 en fracciones de 0,01 ml.

La placa de microvaloración se incuba a 37ºC en un incubador con CO_{2} al 5% completamente húmedo y a continuación se utiliza en el análisis siguiente.

Una fracción de 0,01 ml de 0,5 mg/ml de solución de MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil tetrazolio] se añade a cada pocillo, se incuba durante 4 horas, se mezcla con 0,15 ml de solución de ácido clorhídrico 0,1 N/alcohol isopropílico y a continuación se agita con extracto de pigmento de las células, interpretando posteriormente el crecimiento de las células por medición de la cantidad de pigmento mediante su absorbancia a 540 nm.

Este procedimiento para la medición de la actividad estimulante del crecimiento celular se denomina en adelante ensayo MTT.

(1) Medición de la actividad estimulante del crecimiento celular en células Ba/F3

Las células Ba/F3 que crecen dependiendo de la presencia de IL-3 de ratón se cultivaron en medio de Dulbecco modificado por Iscove (denominado en adelante "IMDM") que se había enriquecido con suero de ternero fetal inactivado térmicamente al 10% (denominado en adelante "FCS") e IL-3 de ratón (sobrenadante del cultivo de WEHI-3B).

Utilizando las células Ba/F3 cultivadas de este modo, se midió la actividad estimulante de crecimiento celular mediante el ensayo MTT utilizando el medio recién descrito anteriormente pero en ausencia de IL-3 de ratón.

Se realizó el ensayo MTT con una densidad de inoculación de 10.000 células por pocillo e incubando la placa en CO_{2} al 5% durante 48 horas.

Los resultados del ensayo MTT demostraron que cada TPO, ND28 y TPO-ND28 (1), (2) y (3) no presentaba actividad estimulante de crecimiento de células Ba/F3.

(2) Medición de la actividad estimulante del crecimiento celular en Ba/F3-cmp1

Las células Ba/F3-cmp1 que crecen dependiendo de la presencia de IL-3 o TPO de ratón se cultivaron en IMDM que se había enriquecido con FCS inactivado térmicamente al 10%, 0,5 mg/ml de G-418 e IL-3 de ratón (sobrenadante del cultivo de WEHI-3B).

Utilizando las células Ba/F3-cmp1 cultivadas de este modo, se midió la actividad estimulante de crecimiento celular mediante el ensayo MTT utilizando el medio recién descrito pero en ausencia de IL-3 de ratón.

Se realizó el ensayo MTT con una densidad de inoculación de 10.000 células por pocillo e incubando la placa en CO_{2} al 5% durante 48 horas.

Los resultados del ensayo MTT demostraron que cada TPO y TPO-ND28 (1), (2) y (3) no presentaba actividad estimulante de crecimiento de Ba/F3-cmp.

(3) Medición de la actividad estimulante del crecimiento celular en células NFS-60

Las células NFS-60 que crecen dependiendo de la presencia de G-CSF humano o de IL-3 de ratón se cultivaron en medio RPMI que había sido enriquecido con CSF inactivado térmicamente al 10%, glutamina 2 mM, P/S (100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina) y 1,0 ng/ml de G-CSF humano de tipo recombinante.

Utilizando las células NFS-60 cultivadas de este modo, se midió la actividad estimulante de crecimiento celular mediante el ensayo MTT utilizando el medio recién descrito pero en ausencia de G-CSF.

Se realizó el ensayo MTT con una densidad de inoculación de 10.000 células por pocillo e incubando la placa en CO_{2} al 5% durante 48 horas.

Los resultados del ensayo MTT demostraron que cada ND28 y TPO-ND28 (1), (2) y (3) presentaba actividad estimulante de crecimiento de células NFS-60.

Ejemplo 3 de prueba

Efecto de TPO-ND28 sobre las células mieloides de ratón

Se sacrificaron ratones BALB/c de 8 semanas para escindir el sistema de fémur y tibia cuyos extremos fueron cortados posteriormente con tijeras. Se insertó la aguja de una jeringuilla rellena con solución RPMI que contenía FCS al 10% en la sección del fémur y de la tibia para extirpar las células mieloides en un tubo de ensayo pequeño y las células se dejaron en reposo durante 5 minutos.

Utilizando una pipeta Pasteur, se tomó el fluido sobrenadante en el tubo de ensayo teniendo cuidado de no contaminarlo con el precipitado, y el fluido sobrenadante se cubrió en Nycoprep 1.077 Animal (preparado por NYCOMED Co., producto nº 1002380) y se sometió a 15 minutos de centrifugación a 600 g para aislar las células mononucleares de ratón (denominadas en adelante "MNC").

Se prepararon MNC en una suspensión de 5 \times 10^{5} células/ml con una solución que contiene una solución que debe analizarse, FCS al 10%, BSA al 1% y 0,6 mg/ml de transferrina (preparada por Boehringer Manheim Co.) y se cultivaron durante 5 días en un incubador de CO_{2} (BNA-120D, fabricado por TABAI Co.) en las condiciones de 37ºC, 5% de CO_{2} y 95% o más de humedad.

Como solución que debe analizarse, se utilizó una solución de TPO, ND28 o TPO-ND28 que tiene una concentración final de 1,0, 10 ó 100 ng/ml o una solución en la que el mismo volumen de soluciones de TPO y ND-28 que tienen la concentración mencionada anteriormente se mezclaron (TPO/ND28). Se utilizaron el TPO y ND28 obtenidos en el Ejemplo 3.

Una vez terminado el cultivo, se examinaron las condiciones de la diferenciación de MNC midiendo la cantidad de CD61 expresada que es un índice de diferenciación en el sistema de megacariocitos [J. Med., 311, 1084 (1984)] y la cantidad de Gr-1 expresada que es un índice de diferenciación en el sistema de granulocitos [J. Immunol., 144, 22 (1991)].

Tras la tinción con anticuerpo monoclonal CD61-FITC antirratón (preparado por PHARMINGEN Co., producto nº 01864D) y el anticuerpo monoclonal Gr-1-PE antirratón (fabricado por PHARMINGEN Co., producto nº 01215A), se midieron las cantidades expresadas de CD61 y Gr-1 utilizando un citómetro de flujo ELITE (fabricado por Coulter Co.).

Los resultados se presentan en la Tabla 7.

TABLA 7

7

Cuando se añadió la solución que ha de analizarse preparada mezclando la misma cantidad de TPO y ND28 (TPO/ND28), se generaron células expresadas por Gr-1 en un nivel similar al caso de la adición a la solución que debe analizarse que contiene ND28 solo, demostrando así la diferenciación de MNC en el sistema de granulocitos, pero la frecuencia de la generación de las células expresadas por CD61 fue menor que en el caso de la adición de la solución que debe analizarse que contiene TPO solo, demostrando así una diferenciación disminuida en el sistema de megacariocitos. Estos resultados sugieren que, cuando están presentes la misma cantidad de TPO y ND28, MNC reacciona mayoritariamente con ND28 y se diferencia en el sistema de granulocitos.

Sin embargo, cuando el polipéptido de fusión de TPO y ND28, es decir TPO-ND28, se añadió como solución que debe analizarse, la frecuencia de la generación de las células expresadas por CD61 era similar o mayor que en el caso de la adición de la solución que debe analizarse que contiene TPO solo y dos veces o más superior al del caso de la adición de TPO/ND28. Más aún, la frecuencia de la generación de las células expresadas por Gr-1 fue también similar al caso de la adición de la solución que debe analizarse que contiene ND28 solo.

Ejemplo 4 de prueba

Función potenciadora de la producción de plaquetas y leucocitos en ratones

Se administraron 10 \mug/ml de solución de TPO o 10 \mug/ml de solución de TPO-ND28 (3) obtenidas en el Ejemplo 3 por inyección subcutánea a ratones BALB/c (machos, de 7 semanas) con una dosis de 0,2 ml por cada 20 g de peso corporal de cada ratón, una vez al día continuamente durante 4 días a partir del primer día de la prueba (grupos tratados, 4 animales por grupo). Se extrajo una muestra de sangre de la vena oftálmica de cada animal el quinto día de la prueba para hacer el recuento del número de plaquetas y leucocitos con contador de microcélulas (Sysmex F800, fabricado por Toa Iyo Denshi Co.).

Después de introducir el plásmido pAGE210 utilizado para la expresión del gen TPO o TPO-ND28 (3) en las células CHO según el método descrito en el Ejemplo 2-2), se cultivaron las células, el sobrenadante del cultivo resultante se trató por el mismo procedimiento de purificación de TPO-ND28 (3) descrito en el Ejemplo 3, y una fracción de elución correspondiente a la fracción de elución de TPO-ND28 (3) se utilizó como solución blanco para hacer el recuento del número de plaquetas y leucocitos por el procedimiento mencionado anteriormente.

Para comparar y examinar los efectos de TPO y TPO-ND28 (3), se calculó la relación creciente (%) del número de plaquetas y leucocitos en el grupo al que se administraron cada una de estas sustancias al grupo administrado con solución blanco basándose en la fórmula siguiente:

[recuentos de plaquetas o leucocitos en ratones del grupo administrado con TPO- o TPO-ND28 (3)]/[recuento de plaquetas o leucocitos en ratones del grupo administrado con solución blanco] \times 100

Los resultados se presentan en la Tabla 8.

TABLA 8

8

Aplicación industrial

La presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido que presenta actividad de G-CSF y un polipéptido que presenta actividad de TPO. El polipéptido de fusión de la presente invención puede formar plaquetas y leucocitos simultáneamente y puede controlar la formación de colonias de megalocitos y colonias de neutrófilos y la diferenciación o maduración de precursores de megalocitos y de precursores de neutrófilos.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas de fusión G-CSF TPO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 26

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

REMITENTE: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 6-1, Ohtemachi 1-chome, Chiyoda-ku

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Tokio

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Japón

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(v)

MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 96 912 262.1

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 26.04.1996

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

DATOS DE ABOGADO/ AGENTE DE INFORMACIÓN

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Kinzebach, Werner, Durante.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO: M/37549

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE CONTACTO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (089) 998397-0

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (089) 987304

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 328 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: humano (Homo sapiens)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..154

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 154..328

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 348 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: humano (Homo sapiens)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..153

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 167..340

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 344 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: humano (Homo sapiens)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..153

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 171..344

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1047 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: dos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: humano (Homo sapiens)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: péptido sig

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..63

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 64..1047

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:

15

16

\hskip0.5cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1083 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: dos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: humano (Homo sapiens)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: péptido sig

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..63

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 64..1083

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:

18

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1095 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: dos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: humano (Homo sapiens)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: péptido sig

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..63

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 64..1095

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:

21

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: péptido sig

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 27..44

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTCCAAGC TTGAATTCCG GCCAGAATGG AGCTGACTGA ATTG

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: cds

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 23..47

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGAGGTAC CGCGGCCGCT TACCCTTCCT GAGACAGATT CTGGGAG

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..24

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAACCTCTG GGCACTGGCT CAGT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..24

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGCCTGCT GTGGACTTTA GCTT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..24

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTTGGAAGC TCAGGAAGAT GGCA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..24

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGATGCTT GTAGGAGGGT CCAC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..24

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAAGAGTTC GTGTATCCTG TTCA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..24

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATGGAACT CGTGGACTCT TTCC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAAACGAC GGCCAGT

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGAAACAG CTATGAC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 66 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..3

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 43..66

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 22..45

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTTCCGGAG GCGGTTCTAG AGCACCAACA TATCGCGCCT CGAGT

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 48 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 22..48

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTCCGCGG GGTACCGCGG CCGCTCAGGG CTGGGCAAGG TGGCGTAG

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..24

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCTGCTTGA GCCAACTCCA TAGC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..24

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCCAACTC GGGGGAGATC CCTT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 57 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..27

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 28..57

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: mutación

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 25

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: mutación

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 33..34

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGACTCGAG GCGCGATATG TTGGCGCCCG CCGTACGCAG AGGGTGGACC CTCCTAC

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 61 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS de TPO

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..6

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: péptido enlazador

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 7..57

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS de ND28

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 58..61

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: SpII

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..5

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: Mrol

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 7..12

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: Mrol

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 43..48

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: Bbel

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 58..61

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: mutación

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 4..5

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS de TPO

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 52..53

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: péptido enlazador

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..51

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: sPII

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 53

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: mROI

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 10..15

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: Mrol

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 46..51

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGACCGCCT CCGGAGCCGC CACCAGAACC ACCGCCAGAG CCACCTCCGG ACC

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (8)

1. Polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC. ID. nº: 1, 2 y 3.

2. Polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC. ID. nº: 1, 2 y 3, que contiene además en su parte de factor estimulante de colonias de granulocitos un modelo de sustitución de aminoácidos a), b), c), d), e), f), g), h), i), j) o l) como se define en la tabla siguiente

26

o en el que la parte de factor estimulante de colonias de granulocitos se sustituye por una de las secuencias de aminoácidos siguientes

27

3. Polipéptido de fusión según la reivindicación 1 ó 2, en el que el polipéptido es un polipéptido en el que por lo menos un grupo amino del polipéptido está químicamente modificado con un derivado de polialquilenglicol.

4. Polipéptido de fusión según la reivindicación 3, en el que el derivado de polialquilenglicol es un derivado de polietilenglicol, un derivado de polipropilenglicol o un derivado del copolímero polioxietileno-polioxipropileno.

5. ADN que codifica el polipéptido de fusión según la reivindicación 1 ó 2.

6. ADN según la reivindicación 5, en el que el ADN es un ADN que contiene una secuencia seleccionada de entre las secuencias de ADN mostrada en las SEC. ID. nº: 4, 5 y 6.

7. Composición farmacéutica, preferentemente para tratar la anemia, que comprende el polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 como ingrediente activo.

8. Utilización del polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la anemia.