JPH03505730A - ヒトにヒト好中球走化因子を投与することによる免疫不全状態に起因する疾患の治療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトにヒト好中球走化因子を投与することによる免疫不全状態に起因する疾患の 治療法 本発明は、ヒトにヒト好中球走化因子を投与することにより、先天的又は後天的 免疫不全状態に起因する疾患を治療する方法に関する。

ヒト好中球走化因子（以下、ＮＣＦと記す）は、リポポリサッカライドで刺激さ れたヒト単核白血球から産生される生理活性ポリペプチドである。ＮＣＦは、好 中球を動員する活性を有しており、炎症反応の初期段階に関与する調節因子のひ とつであると考えられている［ヨシムラ、　Ｔ、（Ｙｏｓｈｌｍｕｒａ、Ｔ、） ら、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３９巻、７８８頁、　１９８７年コ。

に、マッシ？　（Ｋ、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）らはヒトＮＣＦをコ・−ドするＣ ＤＮＡの単離及び組換えＣ１ＮＡ法によるヒトＮＣＦポリペプチドの効率的な生 産に成功している。１９８８年５月２日に本製法に関する特許出願をしている。

そのクローン化ヒトＮＣＦ　ｃＤＮＡの蛋白翻訳領域の塩基配列は、シュミット （Ｓｃｈｍｉｄ）とワイズマン（Ｗｅｌｓｓｍａｎｎ）により報告された塩基配 列と同一であった（ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３９巻、２５０頁。

１９８７年）。遺伝子の解析及びヒト単核白血球法に由来するＮＣＦのＮ末端ア ミノ酸配列の解析［ヨシムラ、　Ｔ、（Ｙｏｓｈｌｍｕｒａ。

Ｔ、）ら、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．、υＳＡ、　８ ４巻、　９２３３頁。

１９８７年コにより確立された全−次構造に基づき、ヒトＮＣＦポリペプチドは 分子量９．４ｋＤの低分子量ポリペプチドであることが明らかになった。

ＮＣＦポリペプチドの生物活性に関して、ＮＣＦは好中球を動員する能力及び活 性化する能力［ウォルッ（ＷａＴＺ）ら。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１４９巻 、７５５頁、　１９８７年］を持っていることが知られている。

本発明者らは大腸菌で生産した組換えヒトＮＣＦポリペプチドの特性をさらに調 べた。その結果、驚くべきことにヒトＮＣＦは好中球を動員することに加え、１ ９２８球を動員し、活性化することが明らかになった。これらの知見は、ＮＣＦ が１９２８球の胸腺やリンパ腺への移動等の成長及び恒常性維持機構及び免疫応 答の調節において重要な役割を果たしていることを示すものである。

本発明の目的は、ヒト好中球走化因子をヒトに投与することにより、悪性腫瘍及 び免疫不全状態の患者に対する免疫療法剤による治療法を提供することにある。

本発明の他の目的は、免疫療法のためのヒトＮＣＦを含有する組成物の用途を提 供することにある。

ヒトＮＣＦは第１表の式［１］で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの みならず、いわゆる文献記載のヒトＮＣＦも意味する。

第１表の式［１］で表されるアミノ酸配列からなる典型的なヒトＮＣＦポリペプ チドは、組換えＤＮＡ法を応用して生産することができる。

ヒト組換えＮＣＦポリペプチドの生産方法を以下に説明する。

式［１］で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡの塩 基配列は、第２表の式［Ａ］として示される。

ヒトＮＣＦポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば参考例１に記載の方法及 び前記シュミット（Ｓｃｈｍｉｄ）とワイズマン（ＷｅＩＳＳｍａｎｎ）により 報告された方法に従って単離することができる。また、常法により該ＤＮＡを化 学的に全合成することも可能である。得られたＤＮＡの余分な領域又は欠損して いる領域については、例えば適当な制限酵素による切断及び／又はＤＮＡリガー ゼによる化学合成オリゴデオキリボシヌクレオチドの結合による修復等の方法に より目的とするＤＮＡを製造することができる。

このＤＮＡの５′末端に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を付加し、開始コドンを付加 したＯＮへの３°末端には終止コドンを有するＤＮＡ断片を結合させ、得られた ＤＮＡを適当なプロモーター（例えばｔｒｐｌｌａｃ、　ｐｈｏＳＳＰＬ、　Ｓ Ｖ４０初期プロモーター）及びＳＯ配列に接続し、更にこの適当なプロモーター 及びＳＤ配列を有するＤＮＡを適当なベクター（例えばプラスミドｐ８Ｒ３２２ ）に組み込むことにより、ヒトＮＣＦポリペプチド生産用の発現ベクターを構築 することができる。

好ましいＳＯ配列から翻訳開始コドンまでの塩基配列としては、下記式［Ｂ］で 示される塩基配列が挙げられる。

５°−ＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＧ−３゜「Ｂ］ ヒトＮＣＦを生産する形質転換体は、上記のように構築した発現ベクターを適当 な宿主、例えば大腸菌にコーエン（Ｃｏｈｅｎ）らの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．、　ＵＳＡ、　６９巻、　２１１０頁、　１９７２年） に準じて導入することにより得ることができる。

ヒトＮＣＦポリペプチドは、上記で得られた形質転換体を適当な培養条件下で培 養することにより製造することができる。

この培養物を、例えばリゾチーム消化と凍結融解、超音波破砕、フレンチプレス （Ｆｒｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓ）等により破壊したのち、遠心分離又は濾過するこ とによりヒトＮＣＦポリペプチド含存抽出液を得ることができる。

この抽出液から除核酸処理、塩析、陰イオン交換及び／又は陽イオン交換クロマ トグラフィー、限外濾過、ゲル濾過、透析、電気泳動、特異抗体を用いるアフィ ニティー　りロマトグラフィー等の方法を組み合せることによりヒトＮＣＦポリ ペプチドを精製することができる。

式［１］で表されるヒトＮＣＦリペブチドは、市販されているペプチド合成装置 で化学合成することもできる。

以下に、参考例２に記載した方法で得られたヒトＮＣＦポリペプチドの化学的、 物理化学的、及び生物学的特性について組換えヒトＮＣＦの分子量を、５Ｏ５− ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した。分子量の既知蛋白質として 以下の蛋白質からなる標準蛋白質キット　［ファルマシア・ファインケミカルズ 社、スウェーデン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍ１ｃａ＋ｓ。

Ｓｗｅｄｅｎ）］を用いた。リゾチーム（１４，４ｋＯ）　、大豆トリプシンイ ンヒビター　（２ｏ、１ｋＯ）　、炭ａ脱水酵素（３０ｋＤ）　、オボアルブミ ン（４３ｋＯ）　、牛血清アルブミン（６７ｋＤ）及びホスホリレースｂ　（９ ４ｋＯ）。

その結果、組換えヒｌ−ＮＣＦの分子量は、約８〜１０ｋＤと求められた。尚、 分子間ジスルフィド結合形成による組換えヒトＮＣＦの重合体は検出されなかっ た。

（２）　アミノ酸配列 組換えヒトＮＣＦのアミノ酸配列を自動エドマン分解法により決定した。

組換えヒトＮＣＦを、７　ルア　−（Ｆｕｌｌｍａｒ）の方法（Ａｎａｌ。

Ｂｌｏｃｈｅｍ、、　１４２巻、３３６頁、　１９８４年）に従って、２−メル カプトエタノールにてジスルフィド結合を還元的に開裂させ、システィン（Ｃｙ ｓ）残基を４−ビニルピリジンにて、Ｓ−β−４−ピリジルエチル化した。得ら れた生成物をピリジルエチル化ＮＣＦと呼ぶ。

別途、組換えヒトＮＣＦの数種のペプチド断片を以下の方法に従って調製し単離 した。組換えヒトＮＣＦを、シンプレツガ−（Ｓｏｎｄｅｒｅｇｇｅｒ）らの方 法（Ａｎａｌ、　８１ｏｃｈｅｍ、、　　１２２巻、２９８頁。

１９８２年）に従って、７０χギ酸処理を行うことにより、Ａｓｐ−Ｐｒｏのペ プチド結合を特異的に開裂させた。得られた二種類のペプチド断片から、シンク ロパック（ＳｙｎＣｈｒｏｐａｋ）　ＲＰ−Ｐカラム　［ジンクローム社、米国 （ＳｙｎＣｈｒｏｍ、　Ｉｎｃ、、　ＵＳＡ）］を用い、０．１χトリフルオロ 酢酸中、０〜５０％のアセトニトリルの直線的濃度勾配での溶出条件による高速 液体クロマトグラフィーにて、そのＣ末端側断片（ＦＡ−１断片と呼ぶ）を単離 した。ピリジルエチル化ヒトＮＣＦをメタロエンドペプチダーゼ（ｍｅｔａＴｌ ｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）　（ＥＣ３，４，２４，生化学工業１日本）に て消化し、得られたペプチド断片を０．１％Ｉ−リフルオロ酢酸中、０〜３０％ のアセトニトリルの直線的ａ度勾配での溶出条件による高速液体クロマトグラフ ィーにて単離した。このようにして得られた二種類の断片をそれぞれに−１及び に−２断片と呼ぶ。

このピリジルエチル化ＮＣＦ及び各ペプチド断片のＮ末端側アミノ酸配列をプロ ティン・シークエンサー４７０Ａ型（Ｐｒｏｔｅｌｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ、　 Ｍｏｄｅｌ　４７０Ａ）　［アプライド・バイオシステムズ社、米国（Ａｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　（ＪＳＡ）］及び５Ｐ８４４０ＵＶ／ＶＩＳ 検出装Ｒ［スベクトラーフィジクス社、米国（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｌｃｓ 、　ＵＳＡ）］を用いて解析した。これらのペプチドの決定したアミノ酸配列を 第３表に示す。

結論として、組換えヒトＮＣＦポリペプチドのアミノ酸配列が天然型ヒトＮＣＦ をコードする塩基配列がら演鐸される配列と完全に一致することを確認した。そ のＮ末端は、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）に由来するメチオニン残基は検出されな かった。

（３）　吸光係数 組換えヒトＮＣＦポリペプチドを添加物を入れずに凍結乾燥した。この凍結乾燥 品中の水分含量及び灰分含量は、それぞれ６．０１％及び０．５２χであった。

組換えヒトＮＣＦの吸光係数は、１ｘ水溶液及び１　ｃｍ光路長の条件下におい て、波長２８０　ｎｍで８．２５であると求められた。

（４）　Ｔリンパ球走化活性 リンパ球の動員は、リンパ球走化活性測定のためのマルチウエルケモタキシスチ ャンバー法［バーバス、　Ｌ、（Ｈａｒｖａｔｈ。

Ｌ、）ら（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、　３７巻、３９頁、　１９８ ０年）］を改良した方法にて測定した。１％ウシ胎児血清を含むダルベツコ改変 イーグル培地［Ｄｕ］ｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｌｆｌｅｄ　　Ｅａｇｌｅ’ｓ　 Ｍｅｄｌｕｍ（０８５Ｍ）］で希釈した相換えＮＣＦを４８穴マイクロケモタキ シスチヤンバー（４８ｗｅＮ　ｍ１ｃｒｏ　ｃｈｅｍｏｔａｘｌｓ　ｃｈａｍｂ ｅｒ）　［、：、　ユーロ・プローブ社、米国、メリーランド州（Ｎｅｕｒｏ　 Ｐｒｏｂｅ、　Ｉｎｃ、。

ＩＪＳＡ、　ＭＯ）］の下段に注入した。１９２８球は健常人から採集したパフ ィーコ−１−（Ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔ）　Ｃ国立衛生研究所、血液銀行、米国（ Ｎａｔｌｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｌｏｏｄ　 Ｂａｎｋ。

ＵＳＡ）］をナイロンウールカラム法で精製して得た。１９２８球の純度は自動 免疫蛍光分析法にて検査し、９５％以上であった。１９２８球は５Ｘ１０’細胞 ／ｍｌの濃度で上段の５０μｍ容槽に注入した。上段と下段の槽は孔径５μｍの ポリビニルピロリドン不含ポリカーボネート膜［ヌクレポール社、米国（Ｎｕｃ ］ｅｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　ＵＳＡ）］で隔てた。使用前に膜の下面をタイプ ＩＶコラーゲン［ベセスダリサーチ　ラボラトリーズ、米国（Ｂｅｔｈｅｓｄａ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ、　ＵＳＡ）］で被覆し、動員 された細胞が結合しやすいようにした。チャンバーを湿気流中、３７°Ｃで２時 間培養し、膜を取りはずした。上表面をぬぐって非動員細胞を取り除いたのち、 膜を７０χメタノールで固定し、ギムサ液で染色した。リンパ球の動員は膜の下 表面に結合した細胞数で評価した。結果として、０．０１　ｎｇ／ｍ１ｌ１度の 組換えＮＣＦで有意な１９２８球の走化的動員が認められた。

１　ｎｇ／ｍｌ濃度の組換えＮＣＦでは最大の動員と動員された１９２８球のポ リカーボネート膜のコラーゲン被覆した下表面への付着を認めた。動員された細 胞がリンパ球であることは染色された細胞の顕微鏡観察により形態学的に同定し た。

（５）好中球走化活性 好中球走化活性は、バーバス、　Ｌ４Ｈａｒｖａｔｈ、Ｌ、）ら（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、　３７巻、３９頁、　１９８０年）により報 告されているマルチウエルケモタ牛シス・ボイデンチャン、（−（ｍｕｌｔｊｗ ｅｔｌ　ｃｈｅｍｏｔａｘｌｓ　Ｂｏｙｄｅｎ　ｃｈａｍｂｅｒ）　　［＝　、 　−ｏ−プローブ社、米国（Ｎｅｕｒｏ　Ｐｒｏｂｅ、　Ｉｎｃ、、ＵＳＡ）］ を用いる方法で測定した。

組換えＮＣＦは、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したダルベツコ改変イ ーグル培地［Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｌｆｌａｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓＭｅ＋ ｊｉｕｍ（ＤＭＥＭ）］で連続的に希釈した。正常ヒト好中球は、健常人から集 めたパフィーコー）　（Ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔ）　［国立衛生研究所、血液銀行 、米国（Ｎａｔｌｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ。

Ｂｌｏｏｄ　Ｂａｎｋ、　ＵＳＡ）］からフィコールＨハイバーク（Ｆｌｌｃｏ ｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　）での分離及びＡＣに一うイジング緩衝ｆｉ（ＡＣに一 １ｙｓｌｎｇｂｕｆｆｅｒ）による赤血球の溶血操作にて精製した。好中球の純 度は、ギムサ液（Ｇｉｅｍｓａ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）で染色した細胞の形態学的 検査で９５χ以上であった。そ、の生存率はトリバンブルー染料排出法（ｔｒｙ ｐａｎ　ｂｌｕｅ　ｄｙｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｔｅｓｔ）で９５％以上であ った。好中球細胞を、１％ＢＳＡを含むＯＭＥＮ培地中、巨万細胞／ｍｌの細胞 密度で３７℃で４０分間培養した。動員されて膜（３μｍ：ヌクレボール社、米 国（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　ＵＳＡ）］上に付着した好中球をメタ ノールで固定し、ギムサ液で染色した。

顕微鏡検査の結果、０．１　ｎｇ／ｍｌの濃度で明らかな好中球の動員を認めた 。１０　ｎｇ／ｍｌで最大の動員反応を認めた。動員された細胞が好中球である ことを形態学的に同定した。

（６）　マウスにおけるｉｎ　ｖｉｖｏ走化活性Ｃ３Ｈ／Ｈｅ雌性マウス（６〜 ７週令）に、１μ９１マウスの用量で組換えヒトＮＣＦを腹腔内に投与した。対 照群のマウスには同条件でリン酸塩緩衝化生理食塩液（ｐＨ７，２）を投与した 。

一定時間毎に各マウスから末梢血を採取し、屠殺後、リン酸で緩衝化したヘパリ ン含有リン酸塩緩衝化生理食塩液（４ｍｌ）で腹腔内を洗浄することにより、腹 腔浸出細胞（ＰＥＣ）を集めた。末梢血中及びＰＥＣ中の全白血球（ＷａＣ）　 、好中球、リンパ球、単核球、好酸球及びその他の血球の数を常法により計測し た。

その結果、組換えヒトＮＣＦを注射したマウスの末梢血中の全ＷａＣの数は、Ｎ ＣＦ投与後１時間目の対照群の数と比較して約１．７倍増加した。分別血球数分 析から、全ＷａＣ数の増加は、主に好中球及びリンパ球の増加によるもと考えら れた。好中球とリンパ球の増加の割合は、対照群に比してそれぞれ２．８倍及び １．２倍であった。

一方、組換えヒトＮＣＦを注射したマウスのＰＥＣ中の全Ｗ８Ｃ数は、投与３時 間目で対照群の数と比較して約２．０倍増加した。この増加は、対照群と比較し て好中球及びリンパ球がそれぞれ６３倍及び１．９倍に増加したことによるもの であろう。

ヒトＮＣＦポリペプチドは、免疫不全状態、悪性腫瘍等の患者のための免疫療法 剤として使用できる。

ヒトＮＣＦの製剤としては、溶液状態又は凍結乾煽品として用いられ不。長期安 定化の見地からは〜凍結乾燥状態が好ましい。賦形剤又は安定化剤としてアルブ ミン、グロブリン、ゼラチン、プロタミン、プロタミン塩、グルコース、ガラク トース、キシロース、マニトール、グルクロン酸、トレハロース、デキストラン 、ヒドロキシエチルデンプン、及び非イオン界面活性剤（ポリオキシエチレン脂 肪酸エステル、ポリオキシエチレン　アキルエステル、ポリオキシエチレン　ア ルキル　フェニルエステル、ポリオキシエチレン　ソルビタン脂肪酸エステル、 ポリオキシエチレン　カスター油、ポリオキシエチレン　ポリオキシプロピレン 　アルキルエステル、ポリオキシエチレン　ポリオキシプロピレン　ブロック共 重合体、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル及びグリセリン脂肪 酸エステル）を添加することが望ましい。

免疫療法としては、該製剤を局所投与又は非経口的に投与することが好ましい。

例えば、局所腫瘍組織の治療には、腫瘍部への局所投与が好ましい。例えば、免 疫不全状態の患者の治療の場合の如く、免疫応答の活性化を目的とする場合には 、静脈内投与及び筋肉的投与経路等の非経口的な投与が採用される。

用量は患者及び投与経路の状態により異なる。通常、Ｉ　ｎ９７ｋｇ体重から１ 　ｍｇ／ｋｇ体重で、好ましくは、１０　ｎｇ／ｋｇ体重から０．０１　ｍｇ／ ｋｇ体重である。

尚、本明細書及び請求の範囲には記載の簡略化のために以下の略号を使用する。

ｄＡＴＰ　　　　　デオキシアデノシン三リン酸ｄＣＴＰ　　　　　デオキシシ チジン三リン酸ｄＧＴＰ　　　　　デオキシグアノシン三リン酸ｄＴＴＰ　　　 　　デオキシチミジン三リン酸ＡＴＰ　　　　　　アデノシン酸三リン酸ＤＮＡ 　　　　　　デオキシリボ核酸 ｃ　ＤＮＡ　　　　　相補ＤＮＡ ｋｂｐ　　　　　　キロ塩基対 ＳＤ配列　　　　シャイン・ダルガーノ配列ｋＤ　　　　　　　キロダルトン ＳＤＳ　　　　　　ラウリル硫酸ナトリウム本明細書及び請求の範囲において、 単鎖で示した塩基配列は翻訳（センス）鎖の塩基配列であり、その左端は５′末 端で、右端は３°末端である。アミノ酸配列の左端はＮ末端で、右端はＣ末端で ある。

以下に参考例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

尚、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

以下に示す参考例をさらに分かりやすくするために、本明細書に図表１から図表 ３を添付する。

図表１は発現プラスミドｐＨＮ１０１の構築法を示す（参考例２）。

図表２は発現ベクターｐＥＰ２０５の構築法を示す（参考例３）。

図表３は発現プラスミドｐＨＩＰ８３８３ａの構築法を示す（参考ｃＤＮＡライ ブラリーは、１０μｇ／ｍ＋のりボポリサッヵライド（１１ρｏｐｏｌｙｓａｃ ｃｈａｒｉｄｅ）で６時間刺激した単球から得られた正常ヒト単球由来ポリアデ ニル化ｍＲＮＡを用いて合成したｃＤＮＡをファージベクターλ９ｔ１０のＥｃ ｏＲＩ切断位置に挿入することにより構築した。５０万個のプラーク（ｐｌａｑ ｕｅ）について、［３２ｐ］で標識した次式［Ｃ］と［Ｄ］に示す２種類の化学 合成オリゴヌクレオチドプローブとの結合を指標として、スクリーニングした。

ＡＩＴＡＡＩＴ ｓｌ−ＡＡ　ＧＧ　ＴＴ　ＣＴ　ＴＡ　ＧＴ　ＴＴＩＡＴ−３’　　　　　［Ｃ ３ＧＣＣＧＧＣＣ 及び 一次スクリーニングで、１３個の陽性と思われるクローンを得た。これらの陽性 クローンから、１個のクローン（ｒ〜ＭＯＮＣＦ２−１と称す）をもう一方のプ ローブを用いた二次スクリーニングで選択した。ｒ−ＭＤＮＣＦ２−１中のファ ージＤＮＡをｐＵｃ１９プラスミドに挿入した。

得られた組換えプラスミドをｐＬＩｃ１９−１．７−５と命名した。組換えプラ スミドｐＵｃ１９−１．７−５中のクローン化ｃＤＮＡは、第４表に示すヒトＮ ＣＦをコードする塩基配列を含んでいる。

第１表の式［１］で示されるアミノ酸配列を有するヒトＮＣＦポリペプチドを以 下の方法で製造した。

（１）発現プラスミドｐＨＮＰｌｏ１の構築参考例１に記載のヒトＮＣＦ　ｃＤ ＮＡが組み込まれた組換えプラスミドｐＵｃ１９−１．７−５から制限酵素Ｐｓ ＠ＩとＥｃｏＲＩによる消化にて、ヒトＮＣＦ前駆体ポリペプチドの第１８〜９ ７番目のアミノ酸に相当するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片（第４表の塩 基番号第５２〜２９１番目の塩基配列に相当）を単離した。このＤＮＡ断片をフ ァージベクターＭ１３ｍｐ１８　　（宝酒造１日本）のポリリンカー配列中の制 限酵素ＰＳｔＩとＥｃｏＲＩの切断部位の間の領域に挿入した。この組換えファ ージＤＮＡを用い、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ　）らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１５４巻、３６７頁。

１９８７年）に準じた部位特異的変異誘導法により、ヒトＮＣＦ前駆体ポリペプ チドのＮ末端から第２７番目のＡｒｇをコードするコドンと第２８番目のＳｅｒ をコードするコドンの間に５’−ＴＴＴＡＡＡＴ丁ＡＴＧ−３’の配列を有する 塩基配列を挿入した。部位特異的変異誘導には、ＭＵＴＡ−ＧＥＮＥインビトロ 　ムタジエネシス　キット（Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ　ｆｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａ ｇｅｎｅｓｌｓ　ｋｉｔ）　（バイオラッド社、米国（Ｂｌｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ ｓ、、ＵＳＡ）］を用い、操作手順書に従って行つた。組換えファージＤＮＡを 大腸菌ＪＭ１０５株に感染させ、これを培養して組換えファージを採取した。次 いで、上記の組換えファージを大腸菌ＣＪ２３６株に感染させ、ウリジン（１μ ｇ／ｍｌ）とクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ　）を添加した２Ｘ　ＴＹ 培地［組成：１．６Ｘ　ｈリブトン、１％酵母エキス、０．５ｚ塩化ナトリウム ］中、３７℃で５時間培養した。その培養液からウラシルを含む単鎖ファージＤ ＮＡを単離した。

別途、下記式［Ｅ］で示される３３塩基の変異誘導プライマーを化学合成した。

５　’−ＧＴＴＴＴＧＣＣＡＡＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＧＡＧＴＧＣ工ＡＡＡ Ｇ−３’［Ｅ］ この変異誘導プライマーの５′末端に予めリン酸基を付加した。このリン酸化プ ライマーを先に調製したウラシルを含む単鎖７７−ジＤＮＡとアニール緩衝液（ ａｎｎｅｌｌｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）　　［組成：　２　ｍＭ塩化マグネシウム及 び５０　ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０　ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７−４ ）］中、７０℃で１０分間反応させ、次いで１分間に１℃の割合で３０℃まで冷 却することにより結合させた。次いで、合成緩衝液［各０．４　＋ｎＭのデオキ シヌクレオシド三リン酸（ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ）　 、０．７５　ｍＭＡＴＰ　１３．７５　ｍＭ塩化マグネシウム及び１．５　ｍＭ ジチオスレイトール（ｄｌｔｈｉｏｔｈｒｅｌｔｏｌ　）を含む１０ｍＭ１−リ ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）］中、水中に５分間、２５℃で５分間及び３７℃で ９０分間の連続反応で、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を合成し、そ の末端をＴ４　ＤＮＡリガーゼにて結合させた。反応を一２０℃での凍結にて停 止させた。環状二重鎖ＤＮＡ［ヘテロ二重鎖（ｈｅｔｒｏｄｕｐｌｅｘ）］を大 腸菌ＪＭ１０５株に導入したのち培養し、変異二重鎖複製型ＤＮＡ（ｔｉｅ　ｍ ｕｔａｔｅ（ｌ　ｄｏｕｔ）ｌｅ−５ｔｒａｎ（ｌｅｄｒｅｐＴｉｃａｔｉｖｅ 　ｆｏｒｍ　ＤＮＡ）を単離した。その変異ＤＮＡの塩基配列は、培養液から単 離した単鎖ＤＮＡを用いて決定して確認した。

得られた変異二重鎖ＤＮＡを制限酵素ＤｒａＩとＥｃｏＲＩにて消化し、ヒ１− ＮＣＦポリペプチドをコードする領域の大部分を含むＤＮＡ断片を単離した。こ の単離したＤＮＡ断片を、ＮＣＦ（ＤｒａＩ−ＥｃｏＲＩ）断片と記す。

こ（７）　ＮＣＦ（ＤｒａＩ−ＥｃｏＲＩ）断片に、下記の式［Ｆ］で示される 化学合成オリゴヌクレオチドアダプターをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合さ せた。

ここで得られたＤＮＡ断片を、ＮＣＦ（Ｏｒａｌ−Ｘｈｏｌ）断片という。

別途、参考例３に記載の発現プラスミドｐＥＰ２０５を制限酵素ＤｒａＩとＸｈ ｏＩにて消化し、アンピシリン耐性遺伝子及び複製開始点を含む大きなりＮＡ断 片（Ｅρ２０５ベクターＤＮＡ断片と記す）を単離し、このＥＰ２０５ベクター ＤＮＡ断片を上記のＮＣＦ（ＤｒａＩ−ＸｈｏＩ）断片とＴ４　ＤＮＡリガーゼ を用いて結合させることにより、ヒトＮＣＦ生産用発現プラスミドｐＨＮＰ１０ １を構築した（図表１参照）。

（２）大腸菌の形質転換 上記の発現プラスミドｐＨＮＰ１０Ｌを、下記の方法で大腸菌８８１０１株に導 入した。

大腸菌８８１０１株をり、Ｂ培地［組成：１％トリプトン、０．５ｚ酵母エキス 、１％塩化ナトリウム（ｐＨ７，５）］に接種し、３０℃で一夜培養した。得ら れた培養液の１　ｍｌを１００　ｗ＋１のＬＨ培地に接種し、波長６００　ｎｍ の濁度が約０．６に達するまで、３０℃で更に培養した。氷水中で３０分間静置 したのち、遠心分離にて菌体を採取した。この菌体を５０ｍ］の５０　ｍＭ塩化 カルシウム液中に再懸濁させ、氷水中で６０分間静置した。次いで、遠心分離に て菌体を採取し、２０％グリセリンを含む５０　ｍＭ塩化カルシウム液の１０ｍ １に再懸濁させた。

この菌体懸濁液に発現プラスミドｐＨＮＰｌｏ１を添加し、氷水中で２０分間、 次いで室温で６０分間処理した。この菌体懸濁液にＬＢ培地を添加して３７℃で ６０分間振盪培養した。この得られた菌体懸濁液の一定量を、２５μｇｌ＋ｎ１ ４度のアンピシリンを含むＬＢ寒天平板（寒天１．５％）に播いた。３７℃で一 夜培養したのち、アンピシリン耐性クローンを選択することにより形質転換体を 得た。この形質転換体のひとつを大腸菌ＨＢＩＯＩ／ｐＨＮＰ１０１と名付け、 ヒトＮＣＦポリペプチドの生産に使用した。

（３）ヒトＮＣＦポリペプチドの製造 上記（２）項で得た大腸菌ＨＢＩＯＩ／ｐＨＮＰ１０１を、ＬＢ培地にて３７℃ で一夜培養した。その培養液を１００倍容量の栄養培地［組成：１．５％リン酸 二ナトリウム・１２水塩、０．３駕リン酸−力ｌＪ’７ム、Ｏ，１％塩化アンモ ニウム、２　ｍｇ／ｌビ９　ミ＞ＢＩ、　０．５％カザミノ酸（ｃａｓａｍ（ｎ ｏ　ａｃｉｄ）　、２　ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１１１１Ｍ塩化カルシウム 、１％トリプトン、Ｏ，ＳＸ酵母エキス、１χ塩化ナトリウム及び０．４χグリ セロールコに接種したのち、３−インドールアクリル酸（３−１ｎｄｏｌｅａｃ ｒｙＮｃ　ａｃｉｄ）を最終濃度２０μｇ／ｍｌになるように添加した。培養は ３５℃で２８時間行った。

菌体を遠心分離により採取し、０．１％リゾチーム及び３０　ｍＭ塩化ナトリウ ムを含む５０ｎ＋Ｍｌ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁させた。この懸濁 液を氷水中で３０分間静置した。更に、ドライアイス／エタノール浴での凍結と ３７℃での融解を繰り返して菌体を破壊した。これに１７５０容量の１ｏχポリ エチレンイミンを加えたのち遠心分離にて澄明な菌体抽出液を得た。この菌体抽 出液に硫酸アンモニウムを７０％飽和になるように添加し、析出した沈澱を遠心 分離により採取した。この沈澱を蒸留水に溶解させ、５　ｍＭリン酸塩緩衝化生 理食塩液（ｐＨ６，５）［以下、ＰＢＳと記す］に対して透析した。この透析液 をセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ＋）　Ｓ−２００カラム［ファルマシア社、 スウェーデン（Ｐｈａｒｍａｃｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）］に負荷し、分子量約６ 〜１ｏｋＤのポリペプチドを含む両分を集めてプールした。各溶出液中のポリペ プチドの分子量は５Ｏ５−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した。上記のプー ルした画分を２０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）　［以下、Ｐａと記すコに 対して透析した。この透析液を、ｐａｔ：で予め平衡化したＣＭ−ｋｙ　７７　 ロー　ス（ＣＭ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−６８カラム（ファルマシア社）に 負荷した。カラムをρＢにて洗浄し、ＰＢ中０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムの直 線的濃度勾配にて溶出した。このヒトＮＣＦポリペプチドを含む両分を集め、プ ールし、限外濾過にて濃縮した。更に、この濃縮液をトーラーバール（Ｔｏｙｏ ｐｅａｒｌ）　ＭＷ−５５カラム（東ソー、日本）を用いるゲル濾過に付し、高 度精製ヒトＮＣＦポリペプチドを得た。

この高度精製ヒトＮＣＦポリペプチド中には、５Ｄｓ−ポリアクリルアミドゲル 電気泳動分析にて不純物を認めなかった。

ここで得たヒ）　ＮＣＦ調製品を、前記の化学的、物理化学的及び生物学的分析 に用いた。

プラスミドｐＢＲ３２２を、制限酵素ヅエとＰｖｕＴＩにて消化し、得られた大 きな断片（約３．７ｋｂｐ）を単離した。このＤＮＡ断片の両粘着末端（ｃｏｈ ｅｓ１ｖ＠ｅｎｄ）を、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの存在下 で、Ｅ、　ｃｏＮ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　［クレノー断片（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆ ｒａｇｍｅｎｔ）］を用イテ平滑末端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）としたのち、その 両端をＴ４　ＤＮＡリガーゼにて結合させることにより、プラスミドｐＢＲ３２ ２の複製開始点近傍のコピー数制御領域を欠失させた新規プラスミドベクター（ ｐＢＲｓ６という）を作製した。

このプラスミドベクターｐＢＲＳ６を、制限酵素ＥｃｏＲＩと４Ｉにて消化し、 アンピシリン耐性遺伝子の上流領域を含む小さなりＮＡ断片（約０．７５ｋｂｐ ）を単離した。このＤＮＡ断片をＡｍｐ（ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ　）断片と記す 。

このＡｍｐ（ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ　）断片を、参考例２に記載した方法に従っ てファージベクターＭ１３ｍｐ１８に挿入した。得られた組換えファージＤＮＡ を用い、参考例２に記載の方法による部位特異的変異誘導法（ｔｈｅ　５１ｔｅ 　ｄｌｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｌｓ）　ｉ：、より、Ａｍｐ（Ｐｓｔ Ｉ−ＥｃｏＲＩ　）断片中の一塩基（Ｔ）を他の塩基（Ｃ）に変換することによ り、制限酵素Ｄｒａｌが認識する特異な塩基配列（ＡＡＡＴＴＴ）を消去した。

ウラシルを含む単鎖ファージＤＮＡを、上記のＩｆｌ換えファージＤＮ＾を感染 させた大腸菌ＣＪ２３６株の培養液から単離した。

変異誘導プライマーとして、下記式［Ｇ］で示されるオリゴデオキシリボヌクレ オチドを化学合成した。

５°−ＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＣ−３′　　　［Ｇ］リン酸化し た該プライマーを、ウラシルを含む鋳型ＤＮＡと結合させた。参考例２に記載の 方法に従って、目的とする変異二重鎖ＤＮＡ　（ｔｈｅ　ｍｕｔａｔｅｄ　ｄｏ ｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ）を単離した。

得られた変異二重鎖ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔｌとＥｃｏＲＩにより消化し、上記 のＡｍｐ（ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ　）断片に対応し、かつ制限酵素０ｒａｌの切 断認識配列が消去されたＤＮＡ断片［以下、変異Ａｍｐ（Ｐｓｔｒ−ＥｃｏＲＩ 　）断片と記す］を単離した。この変異Ａｍｐ（ρ５ｔｌ−ＥｃｏＲＩ　）断片 を、ベクターｐＢＲＳ６から制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔｌによる消化にて単離 した大きなりＮＡ断片と結合させることにより、プラスミドベクターｐＢＲｓ６ 中のアンピシリン耐性遺伝子領域内の制限酵素叶ａｌの切断認識配列が消去され たプラスミドベクターを作製した。この新規ベクターをρＢＲＳ６０１と名付け る。

更に、この新規ベクターｐＢＲ５６０１を、制限酵素ＤｒａＩにより消化し、得 られる大きなりＮＡ断片を単離した。この大きなりＮＡ断片をＳｍａＩ　リンカ −（宝酒造９日本）とＴ４　ＤＮＡリガーゼにて結合させることにより、新規プ ラスミドベクターを作製した。この得られた新規プラスミドベクターは、プラス ミドｐＢＲ５６の誘導体であり、制限酵素（ｌｒａｌの切断認識塩基配列を含ん でいない。この新規プラスミドベクターをｐＢＲｓ６０２と名付ける。

ＳｍａＩ　リンカ−の塩基配列は下記のとおりである。

５’　−ＣＣＣＧＧＧ−３’ 更に、この新規ベクターｐＢＲｓ６０２を、制限酵素ＡδｔＨと５ａｌｌにて消 化し、得られる大きなりＮＡ断片を単離した［以下、ｐ８Ｒ３６０２（Ａａｔｌ Ｉ−５ａｌｌ）断片ト記す］。

別途に、参考例４に記載したヒト　インターロイキンｌα生産用発現プラスミド ｐＨＩＰ８３８３８を制限酵素ＡａｔＩＩと５ａｌｌにより消化し、大腸菌トリ プトファンプロモーター配列及びヒト　インターロイキンｌαをコードする領域 を含むＤＮＡ断片を単離した。この得られたＤＮＡ断片をｔｒｐ　ｐｒｏｍｏｔ ｅｒ／ＩＬＩ　ａ　−ＤＮＡ断片と記す。

コ（７）　ｔｒｐ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＩＬｌα−ＤＮＡ断片を、ｐ８Ｒ５５０ ２（ＡａｔＩＩ−ＳａｌＩ）断片と７４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させるこ とにより、新規の発現プラスミドを構築した（図表２参照）。

この新規発現プラスミドをρＥＰ２０５と名付ける。

ヒト　インターロイキン１α前駆体ポリペプチドをコードするクローン化ｃＯＮ ＾は、ヨーロッパ公開特許第０１８８９２０号に記載の方法に従って単離した。

ヒト　インターロイキンｌα前駆体をコードするｃＤＮＡが組み込まれた組換え ブラスミドｐＨＬ４　［フルタニ，　Ｙ．（Ｆｕｒｕｔａｎ１，ｙ．）　　ら， 　Ｎｕｃｌｅ｛ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ．，　１３巻，　５８６９頁，　１９８ ５年］から、制限酵素ＰｓｔＩによる消化にて、ｃＤＮＡ領域を単離し、更に制 限酵素Ｅｃｏｌ２ＩとＢｓｔＮＩにて消化し、成熟型ヒト　インター口，イキン ｌαをコードする領域の中央部のＤＮＡ断片（　４１０１ρ）を単離した。この 単離したＤＮＡ断片は、ヨーロッパ公開特許第０１８８９２０号の第５表に記載 の塩基番号第３９８〜８０８番目の塩基配列に相当する。

このＤＮＡ断片に、下記の式［Ｈ］及び［Ｊ］で示される二種類の化学合成オリ ゴヌクレオチドアダプターをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて順次結合させた。こ こで得られたＤＮＡ断片を、ＳＯ−ＩＬＩ断片と記す。

化学合成オリゴデオキシヌクレオチドアダプター［Ｈ］は、下記式［ａ］〜［ｅ ］で示される５種類のＤＮＡ断片を、順次結合させて作製した。

及び 式［Ｊ］の塩基配列は、次の通りである。

５“一ＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＧＡ　　　　　　　　　　　　　　［　Ｊ 　］３　’　−ＣＣＧＣＡＣＴＡＣＴＧＡＧＣＴＣＴＡＧ別途に、発現ベクター ｐερ３０２〔フルタニ，　Ｙ．（Ｆｕｒｕｔａｎ１，Ｙ．）　　ら，　Ｎｕｃ Ｔｅ１ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ．，　１３巻，　５８６９頁，　１９８５年］を 、制限酵素ＨｐａＩとＢａｍＨＩにて消化し、大腸菌トリブトファンプロモータ ー配列及びアンピシリン耐性遺伝子を含む大きなＤＮＡ断片（以下、ＥＰ３０２ ベクターＤＮＡ断片と記す）を単離した。

このε２３０２ベクターＤＮＡ断片を上記のＳＤ｛Ｌｌ断片と、Ｔ４　ＤＮＡリ ガーゼを用いて結合させることにより、成熟型ヒト　インターロイキンＩαポリ ペプチド生産用の発現ブラスミドｐＨＩＰＨ３８３ａを構築した（図表３参照） 。

第１表 ＳｅｒＡ１ａＬｙｓＧ１ｕＬｅｕＡｒｇＣｙｓＧ１ｎＣｙｓＩ１ｅＬｙｓＴｈｒ ＴｙｒＳｅｒＬｙｓＰｒｏＰｈｅＨ１ｓＰｒｏＬｙｓＰｈｅｌ　＋ｅＬｙｓＧＴ ｕＬｅｕＡｒｇＶａｌＩｌｅＧ１ｕＳｅｒＧｌｙＰｒｏＨｉｓＣｙｓＡ１ａＡｓ ｎＴｈｒＧ１ｕＩ１ｅＩ１ｅＶａｌＬｙｓＬｅｕＳｅｒＡｓｐＧ１ｙＡｒｇＧ１ ｕＬｅｕＣｙｓＬｅｕＡｓｐＰｒｏＬｙｓＧ＋ｕＡｓｎＴｒｐＶａｌＧ１ｎＡｒ ｇＶａｌＶａｌＧ１ｕＬｙｓＰｈｅＬｅｕＬｙｓＡｒｇＡ１ａＧ１ｕＡｓｎＳｅ ｒ式［１］ 第２表 ５　’　−ＡＧＴＧＣＴＡＡＡＧＡＡＣＴＴＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＧＣＡＴＡＡ ＡＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＡＡＡＣＣＴＴＴＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＴＴＴＡＴＣＡ ＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＴＴＧＡＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＣＴＧＣＧ ＣＣＡＡＣＡＣＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＧＴＡＡＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＴＧＧＡＡ ＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣ ＡＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡ ＡＴＴＣＡ−３　’式［Ａ］ 第３表 組換えヒトＮＣＦポリペプチドの決定されたアミノ酸配列第４表 ヒトＮＣＦ前駆体をコードするｃＤＮＡの塩基配列及び演鐸されるアミノ酸配列 Ｇ１ｕＧ１ｙＡ１ａＶａ１Ｌｅｕ　　ＰｒｏＡｒｇＳｅｒＡ１ａしｙｓ　　　３ ０ＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＴＴＧ　ＣＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＴＡＡＡ　　９０ Ｇ１ｕＬｅｕＡｒｇＣｙｓＧ１ｎ　ＣｙｓＩ１ｅＬｙｓＴｈｒＴｙｒ　　４０Ｇ ＡＡＣＴＴＡＧＡＴＧＴＣＡＧ　ＴＧＣＡＴＡＡＡＧＡＣＡＴＡＣ　１２０Ｓｅ ｒＬｙｓＰｒｏＰｈｅＨ１ｓ　ＰｒｏＬｙｓＰｈｅＩ１ｅＬｙｓ　　５０ＴＣＣ ＡＡＡＣＣＴＴＴＣＣＡＣ　ＣＣＣＡＡＡＴＴＴＡＴＣＡＡＡ　１５０ＣｙｓＡ １ａＡｓｎＴｈｒＧ１ｕ　ｒｌｅＩ１ｅＶａｌＬｙｓＬｅｕ　　７０ＴＧＣＧＣ ＣＡＡＣＡＣＡＧＡＡ　ＡＴＴＡＴＴＧＴＡＡＡＧＣＴＴ　２１０ＳｅｒＡｓｐ Ｇ１ｙＡｒｇＧ１ｕ　ＬｅｕＣｙｓＬｅｕＡｓｐＰｒｏ　　８０ＴＣＴＧＡＴＧ ＧＡＡＧＡＧＡＧ　　ＣＴＣＴＧＴＣ丁ＧＧＡＣＣＣＣ　　２１１１０ＬｙｓＧ １ｕＡｓｎＴｒｐＶａｌ．ＧｌｎＡｒｇＶａｌＶａｌＧ１ｕ　　９０ＡＡＧＧＡ ＡＡＡＣ丁ＧＧＧＴＧ　　ＣＡＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＧＡＧ　　２７０図表１ 発現プラスミドｐＨＮＰ１０１の構築 ヒトＮＣＦ　ｃＤＮＡクローン：　ｐＵｃ１９−１．７−５ＰｓｔニーＥｃｏＲ ニーＤＮＡ断片 組換えプアージ ウラシル含有鋳型ＤＮＡ ＧＴＴＴＴＧＣＣＭＧＧ　ＡＧＴＧＣＴＡＡＡＧウラシル含有鋳型ＤＮＡ へテロ二重鎖 変異二重鎖ＤＮＡ ＮＣＦ（ＤｒａニーＥｃｏＲ工）断片 −続く− 図表２ 図表１　（続き） ＥｃｏＲ工 ＡＡＡＴＴＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＡＡＧ　ｌ−ＧＣＴＧＡＧ　　　　　　　　Ａ ＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＡＡＴＡＣＴＣＡＣＧＡＴＴＴＣ・・・ＣＧＡ ＣＴＣＴＴＡＡ　　　　　　　　ＧＴＡＣＴＡＣＴＧＡＧＣＴ図表２（続き） 発現ベクターｐＥＰ２０ｓの構築 プラスミドｐＢＲ３２２ ＤＮＡ（３，７ｋｂｐ）大断片 プラスミドベクターｐＢＲ５６ 組換えファージ ウラシル含有鋳型ＤＮＡ ヘテロ二重鎖 −続く− ヘテロ二重鎖 変異二重鎖ＤＮＡ 変異Ａｍｐ（ＰｓｔニーＥｃｏＲＸ　）断片プラスミドベクターｐＢＲ９６０１ プラスミドベクターｐＢＲ５６０２ ｐＢＲ５６０２（ＡａｔエニーＳａｌ工）断片図表３ 発現プラスミドｐＨ工ＰＨ３８３ａの構築ヒ　トエＬ−１α　ｃＤＮＡ：　　ｐ ＨＬ４ｃＤＮＡ領域 ＳＤ−工し１断片　　　　　　　　　ｐＥＰ３０２ｍｌ＠＋ＡＡｌ＋Ｉａａｌ＾ 帥ｈｔＭｍＭ、、、−、、、ｃ　、、、、、、、＾。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト好中球走化因子をヒトに投与することにより免疫不全状態で引き起こさ れる疾患を治療する方法。
2. ２．ヒト好中球走化因子が、下記式で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチ ドである請求の範囲第１項に記載の方法。 【配列があります】
3. ３．ヒト好中球走化因子が、組換えＤＮＡ法により微生物中で生産されるポリペ プチドである請求の範囲第２項に記載の方法。
4. ４．下記式で示されるアミノ酸配列からなるヒト好中球走化因子ポリペプチドの 有効量をヒトに投与することにより免疫不全状態あるいは悪性腫瘍を治療する方 法。 【配列があります】
5. ５．ヒト好中球走化因子をヒトに投与することによりＴリンパ球を活性化する方 法。
6. ６．ヒト好中球走化因子ポリペプチドからなるＴリンパ球活性化剤。