JPH02500328A - ヒトインターロイキン‐３とそのミューテイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトインターロイキン−３とそのミューティン本発明は概ね造血組織発達の媒介 蛋白質と、それをコードする核酸に関する。より具体的には、本発明はヒトイン ターロイキン−３の変異体、即ちミューティンに、そしてそれをコードする核酸 に関する。

循環する血球は絶え間無く新たに発達した細胞で置き換えられている。血球の置 き換えは、造血と呼ばれる過程で行われ、それは少なくとも８種類の成熟血球系 統、即ち、赤血球、マクロファージ（単球）、好酸球、巨核球（血小板）、中性 法、好塩基球（マストセル）、１９２８球およびＢリンパ球の産生が関与する（ バーゲスおよびニコラ（Ｂｕｒｇｅｓｓ　ａｎｄ　Ｎ１ｃｏｌａ）、「成長因子 と幹細胞（Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｃｒｓａｎｄ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅ１ｌ）Ｊ、ア カデミツク・プレス、ニューヨーク、１９８３を参照）。血球生成制御の多くは コロニー刺激因子（ＣＳ　Ｆ）と呼ばれる、相互に作用しあう一群の糖蛋白質に よって媒介されている。

これらの糖蛋白質は、その存在を検出するために用られるｉｎ　ｖｉｖｏおよび ｉｎ　ｖｉｔｒｏのアッセイに因んでそのように刺激因子と命名されている。半 固形培地における造血細胞のクローン培養の技術は、インビトロ・アッセイの発 達において特に重要であった。そのよものの、未だ増殖可能な細胞）は、成熟し た子孫のコロニーを形成するために、インビボでの同様な過程と全く同じように 増殖できると信じられている。造血におけるＣＳＦの役割は、最近の多くの論文 の主題である。例えば、メトカルフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）、ｒ造血コロニー刺激因 子（Ｔｈｅ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｏ１ｏｎｙ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ 　Ｆａｃｔｏｒｓ）Ｊ、エルシーバー（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、　ニューヨーク、 １９８４）；メトカルフ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２９．１６−２２　（１９８５） ；ニコラら、「今日の免疫学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ）Ｊ、５．７ ６−８０　（１９８４）；およびウエットン（Ｗｈｅｔｔｏｎ）ら、ＴｌＢ５， １１，２０７−１１１　（１９８６）を参照。

これらの因子の検出、分離および精製は、極度に困難である。というのは、この ような因子が典型的に含有されている上清（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）の性質、 その液中の種々の構成成分の活性の交錯や多様性、そのような因子の特性を確認 するために用いるアッセイの感度（徴のひんばんな類似性、そして天然状態にお ける因子の非常に低い濃度、などによってしばしば複雑化されているからである 。

主として分子クローニングによって、より置くのＣ８Ｆが入手されるようになる につれ、それらの医療面での応用を見出すことに興味が集まっている。ホルモン との生理学的類似性（例えば、可溶性因子、成長介在因子、細胞のりセプターを 介しての活性）のために、Ｃ８Ｆの可能な用途は、現在ホルモンが用られる用途 になぞらえられている（例えば、デキスタ−（Ｄｅｘｔｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ、 ３２１，１９８　（１９８６）を参照。それらの用途には、血球生成の刺激が望 まれるようないくつかの医療の状況が示唆されており、例えば腫瘍の化学療法や 放射療法後のリハビリ療法、骨髄発育不全（ｍｙｅｌｏｉｄ　ｈｙｐｏｐｌａｓ ｉａｓ）の治療、好中球欠乏症（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ）の治療、骨髄移植に続く血液生成（機能）の再生を高めるための治療、そして 診断の確立した感染に対して宿主の抵抗を増加させるための治療、などがある。

例えば上記デキスターおよび上記メトカルフ（Ｓｃｉｅｎｃｅ）を参照。

過去数年にわたって、ネズミＣ８Ｆ活性（マルチＣ８Ｆあるいはインターロイキ ン−３と呼ばれいてる）が、同定、精製、およびクローン化された；ヨコタ（Ｙ ｏｋｏｔａ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

、８１．１０７０−１０７４　（１９８４）；７ｙング（Ｆｕｎｇ）　ら、Ｎａ ｔｕｒｅ、３０７，２３３−２３７（１９８４）；ヘイペル（Ｈａｐｅｌ）ら、 Ｂｌｏｏｄ、６５．１４５３−１４５９　（１９８５）；イール（Ｉｈ　ｌ　ｅ ）　ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．．１２９．２４３１−２３４６　（１９８２） ；イール（Ｉ　ｈ　１　ｅ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．．１３１．　２８２− ２８７　（１９８３）　；およびイスコツ（Ｉｓｃｏｖｅ）ら、３９７−４２５ 頁、［リンホカインの細胞・分子生物学（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　。

ｆ　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ）Ｊ、アカデミツク・プレス、ニューヨーク、１９ ８５．を参照。ネズミＩＬ−３は、Ｃ８Ｆ活性の幅広いスペクトルを示し、確認 されている全ての骨髄系統の原細胞の増殖と発達を刺激することができる。例え ば、デキスター、Ｎａｔｕｒｅ、３０９．７４６−７４７　（１９８４）；イー ルら、リンホカインズ（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ）、９，１５３−２００（１９ ８４）を参照。この因子の幅広い刺激効果のために、他の哺乳動物、特にヒトに おいて類似の因子を分離することに多くの関心が払われている。

最近、マウスＩ　Ｌ−３のラット、ギボン（テナガザル）、そしてヒトの類縁体 がコーエン（Ｃｏｈｅｎ）　ら＋Ｎｕｃ１．Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、１４．３６４ １−３６５８　（１９８６）；およびヤング（Ｙ　ａ　ｎ　ｇ）ら、Ｃｅ１１． ４７．３−１０　（１９８６）によって報告されている。報告された分子のアミ ノ酸配列は、マウスＩＬ−３に比較的低度のホモロジーを持つ：ラットで５４％ 、ギボンで２９％、そしてヒトで２９％である。さらに、ヒト類縁体がマウスの 対応因子（ＩＬ−３）と同範囲の生物学的活性を所有しているかどうかは、未だ 不明である。

前述の視点では、確認された生物学的活性を持つ、マウスＩ　Ｌ−３のヒト類縁 体の変異体の入手可能性は、可能な医療的使用に、特に血球生成の刺激が骨髄形 成不全性疾患を補ったり、癌治療の有害な副作用を一変させたり、骨髄移植の効 果を高めたりすることのできるような状況で、非常に有益である。

本発明はヒトインターロイキン−３（ＩＬ−３）および遺伝的に操作されたヒト Ｉ　Ｌ−３のミューティンに関する。それらは、下記式Ｉに定義されたセットか ら選択されるアミノ酸配列を持つポリペプチドを包含し、標準アッセイ法で、定 義されたコロニー刺激因子（ＣＳ　Ｆ）活性を有する。本発明はまた、式Ｉで定 義されるポリペプチドをコードする核酸、該核酸の使用によってそのようなポリ ペプチドを製造する方法、およびこのポリペプチドを単独または他のＣ８Ｆと共 に用いて、骨髄形成不全に関わる障害の治療、また骨髄移植後やある種の癌療法 後の造血システム再生を高める方法も含んでいる。

本発明の好ましい態様は、グリコジル化された、またはされていない、ポリペプ チドのセットであり、それらは下記の式で定義される配列のセットから選択され るアミノ酸配列を有する。

ここで用語Ｗ（Ｘａａ）およびＸ（Ｘａａ）は、ホツブーウツズ（Ｈｏ　ｐ　ｐ −Ｗｏ　ｏ　ｄ　ｓ）分析で決定された、それぞれ蛋白質の親水性または疎水性 領域に位置するアミノ酸Ｘａａに同義のアミノ酸のグループを表す。グループ内 の同義のアミノ酸は、同じグループのメンバー間での置換の際に、分子の生物学 的機能を保つために充分類似の物理化学的性質を持つニゲランサム（Ｇ　ｒ　ａ 　ｎｔｈａｍ）、５ｃｉｅｎｃｅ、１８５，８６２−８６４（１９７４）；デイ ホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）ら、「蛋白質における進化的変化のモデル、蛋白質配列 と構造の図解（Ａ　Ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＣｈａｎｇｅ 　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎ ｃｅ　ａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）Ｊ、５．８９−９９　（１９７２）を参照。

アミノ酸の挿入と欠失もまた生物学的機能を変化させることなしに、上で定義さ れた配列に行なうことができることは明らかであり、特にその挿入または欠失が ほんの数アミノ酸、例えば１０以下のアミノ酸に関わるもので、そして機能的コ ンホメーションに重要なアミノ酸、例えばシスチン残基を削除したり置換したり し　・なければそうである：アンフィンゼン（Ａｎｆｉｎｓｅｎ）、「蛋白鎖タ タミコミを支配する原則（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　Ｔｈａｔ　Ｇｏｖｅｒｎ　Ｔ ｈｅ　Ｆｏｌｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈａｉｎｓ）Ｊ。

５ｃｉｅｎｃｅ、１８１，２２３−２３０　（１９７３）を参照。このような欠 失および／または挿入で作られる蛋白質およびミューティンは、本発明の範囲に 含まれる。式Ｉの蛋白質のアミノ酸残基が本明細書で数字で特定されるときは、 常にそのような数字は蛋白質のＮ−末端からの番号である。

式Ｉ′で、また本明細書で後に与えられる式■で実際のアミノ酸Ｘａａで表され るヒトＩ　Ｌ−３ポリペプチドは、以前ヤング（Ｙ　ａ　ｎ　ｇ）らによって、 Ｃｅ１ｌ、４７．３−１０　（１９８６）に報告されたヒトＩＬ−３の配列に照 らして、７位のセリンがプロリンに変化する非保存的（ｎｏｎ−ｃｏｎｓｅｒｖ ａｔ　１ｖｅ）アミノ酸置換を有することを言及する。

好ましくは、同義のアミノ酸グループは、表１および■に定義されたものである 。より好ましくは、同義のアミノ酸グループは表Ｉおよび■で、各行の２番目の スラッシュの前に挙げたものである；そして最も好ましくは、同義のアミノ酸の グループは、表Ｉおよび■で各行の最初のスラッシュの前に挙げたものである（ それぞれの最も好ましいＷ（Ｘａａ）グループは、ただＸａａだけからなる。

表１．同義アミノ酸Ｘ（Ｘａａ）の好ましい、より好ましい、そして最も好まし いグループＸａ　ａ　−Ｘ　（Ｘａ　ａ） Ｓｅｒ　Ｓｅｒ、／／Ｔｈｒ、　Ｇｌｙ、　Ａｓｎ、　ＣｙｓＡｒｇ　Ａｒｇ、 ／Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、／Ｇｉｎ、ＧｌｕＬｅｕ　Ｌｅｕ、　ｌｉｅ、　Ｍｅｔ、／ Ｐｈｅ／Ｖａｌ、　ＴｙｒＰｒｏ　Ｐｒｏ、／Ａｌａ、／Ｇｌｙ、ＴｈｒＴｈｒ 　Ｔｈｒ、／／Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＧｉｎＡｌａ　Ａｌ ａ、／Ｐｒｏ、／Ｇｌｙ’、ＴｈｒＶａｌ　Ｖａｌ、／Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、／Ｌｅ ｕ、Ｔｙｒ、ＰｈｅＧｌｙ　Ｇｌｙ、／／Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、５ｅｔ１１ ｅ　Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、／Ｐｈｅ、Ｖａｌ、／ＴｙｒＰｈｅ　Ｐｈｅ、／ Ｍｅｔ、　Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、　Ｌｅｕ、／Ｖａｌ、　ＴｒｐＴｙｒ　Ｔｙｒ、／ Ｐｈｅ、／Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕＨｉｓ　Ｈｉｓ、／Ｇｉｎ 、　Ａｒｇ、／Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＴｈｒＧｉｎ　Ｇｉｎ、／Ｇｌｕ、　Ｈｉｓ、 ／Ｔｈｒ、　Ａｒｇ、　Ｌｙｓ、　ＡｓｎＡｓｎ　Ａｓｎ、／Ａｓｐ、／Ｓｅｒ 、ＧｉｎＬｙｓ　Ｌｙｓ、／Ａｒｇ、／Ｇｌｕ、Ｇｉｎ、ＨｉｓＡｓｐ　Ａｓｐ 、／Ａｓｎ、／Ｇｌｕ Ｇｌｕ　Ｇｌｕ、／Ｇｉｎ、／Ｈｉｓ、　Ａｒｇ、　Ａｓｐ、　Ｌｙｓ、　Ａｓ ｎＭｅｔ　Ｍｅｔ、ｌｉｅ、Ｌｅｕ、／Ｐｈｅ、Ｖａｌ／Ｃｙｓ　Ｃｙｓ／／ 表■、同義アミノ酸Ｗ（Ｘａａ）の好ましい、より好ましい、そして最も好まし いグループＸａａ　Ｗ（Ｘａａ） Ｓｅｒ　Ｓｅｒ、／／Ｃｙｓ Ａｒｇ　Ａｒｇ、／／Ｈｉｓ、Ｌｙｓ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ、／ｌｉｅ、Ｍｅｔ、／ＰｈｅＰｒｏ　Ｐｒｏ、／／Ａｌａ Ｔｈｒ　Ｔｈｒ／／ Ａｌａ　Ａｌａ、／／Ｐｒ。

Ｖａｌ　Ｖａｌ、／／Ｍｅｔ、ｌ１ｅ Ｇｌ）ｊ　Ｇｌｙ／／ ｌｉｅ　Ｉｌｅ、／Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、／Ｐｈｅ、ＶａｌＰｈｅ　Ｐｈｅ、／／Ｍ ｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、ＬｅｕＴｙｒ　Ｔｙｒ、／／Ｐｈｅ Ｈｉｓ　Ｈｉｓ、／／Ｇ１ｎ、Ａｒｇ Ｇｉｎ　Ｇｉｎ、／／Ｇｌｕ、Ｈｉｓ Ａｓｎ　Ａｓｎ、／／Ａｓｐ Ｌｙｓ　Ｌｙｓ、／／Ａｒｇ Ａｓｐ　Ａｓｐ、／／Ａｓｎ Ｇｌｕ　Ｇｌｕ、／／Ｇｉｎ Ｍｅｔ　Ｍｅｔ、／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、／Ｐｈｅ、ＶａｌＣｙｓ　Ｃｙｓ／／ 本発明は、一箇所あるいは数カ所でのアミノ酸の置換（式■の推定される本来の 配列で定義されるポリペプチドのアミノ酸と同義アミノ酸との間の置換）を伴う 、式Ｉのポリペプチドを含む。「Ｎ−箇所置換」という用語は、同義アミノ酸が 本来の配列のＯ−Ｎアミノ酸に置換した式Ｉで定義されたポリペプチドのサブセ ットを意味する。したがって、例えば１箇所置換された式Ｉのポリペプチドのグ ループは、同義アミノ酸の好ましいグループからなる３８１ポリペプチド、同義 アミノ酸のより好ましいグループからなる２４５ポリペプチド、そして同義アミ ノ酸の最も好ましいグループからなる３８ポリペプチドで構成される。こられの 数字は次の２つの合計がら得られる＝（ｉ）本来の配列の疎水性領域の各種アミ ノ酸数の合計と、そのアミノ酸に同義なアミノ酸のグループ（Ｘグループ）のサ イズとの積、および（ｉｉ）本来の配列の親水性領域の各種アミノ酸数の合計と そのアミノ酸に同義なアミノ酸のグループ（Ｗグループ）のサイズとの積。

好ましくは、ヒトＩ　Ｌ−３ポリペプチドのグループは、１０箇所置換されたも のであり、１０−３２．４７−６０．７１−８６、そし９５−１１３の残基で定 義される領域ではアミノ酸は３箇所より多くは置換されないような式■のポリペ プチドで構成される。これらの領域のアミノ酸配列は、マウス、ラット、ギボン のＩ　Ｌ−３と比較したとき、分子の他の部分に比べてはるかに保存されている 。

より好ましくは、ヒトＩ　Ｌ−３ポリペプチドのグループは５箇所置換されたも のであり、しがも１０−３２．４７−６０，７１−８６．９５−１１３の残基で 定義される領域ではアミノ酸は１箇所より多くは置換されてぃないような式１の ポリペプチドで構成される。さらにより好ましくは、ヒトＩ　Ｌ−３ポリペプチ ドのグループは２箇所置換されたものであり、しかも１０−３２．４７−６０， ７１−８６、そして９５−１１３は置換を受けていない、式Ｉのポリペプチドで 構成される。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは以下の式で定義される本 来のアミノ酸配列を有する： Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−（式■） 同様に、式Ｉのポリペプチドに関して、用語「Ｎ−箇所挿入」とは、式Ｉで定義 された配列に１〜Ｎ個までのアミノ酸が挿入された一部のポリペプチドを意味す るために使用される。好ましくは、挿入されるアミノ酸は、その挿入を両側から はさむアミノ酸の同義アミノ酸の好ましいグループから選択される。より好まし くは、その挿入を両側からはさむアミノ酸の同義アミノ酸のより好ましいグルー プから、そして最も好ましくは、その挿入を両側からはさむアミノ酸の同義アミ ノ酸の最も好ましいグループから選択される（表工および■を参照）。したがっ て、例えば、１箇所挿入されたポリペプチドのグループの１つのサブグループは 、Ｎ末端のＸ（Ｐｒｏ）とその隣のＸ（Ｍｅｔ）の間に挿入されたアミノ酸１個 を含む。このサブグループのメンバーを定義する挿入アミノ酸は、好ましくはＰ ｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｍｅ　ｔ、Ｐｈｅ、Ｉ　Ｉｅ、Ｖａ　１．Ｌｅ ｕがら選択され、より好ましくは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、 Ｉ　ｌｅ、Ｖａｌから選択され、そして最も好ましくはＰｒｏ、Ｍｅｔ、Ｉ　ｌ ｅ、Ｌｅｕから選択される。挿入は式１のどの隣接アミノ酸の間にも、あるいは アミノ酸配列のはじめと終わりにも行うことができる。

１３３ケ所の挿入可能部位が有り、また同じ部位に複数の挿入を行う事ができる ので、式１の２箇所挿入ペプチドは、１７，６８９種のペプチドサブグループを 与え、その各々のサブグループのサイズは、挿入の両側をはさむアミノ酸と同義 のアミノ酸グループのサイズに依存する。

式Ｉのポリペプチドに関して、用語「Ｎ−箇所欠失」とは、式Ｉで定義された配 列からアミノ酸が１〜Ｎ個欠失した一部のペプチドを表すのに用いられる。例え ば、式Ｉの１箇所欠失したポリペプチドのセットは、それぞれが長さ１３１のア ミノ酸残基（１３１量体）のポリペプチドの１３２サブグループからなる。各サ ブグループは、置換可能な数に依存して、好ましい、より好ましい、そして最も 好ましい同義のアミノ酸グループによって定義される１３１量体の集合からなる 。

式Ｉの配列に関する欠失と式Ｉの配列に関する挿入の両方によって、ポリペプチ ドのセットが定義されるときは必ず、まず挿入によって定義されるポリペプチド のセットが作られ、そしてそれからそのセットの各メンバーに対し欠失で定義さ れるポリペプチドのセットが作られる。後のセットの全メンバーの合計が、挿入 と欠失の両者で定義されるポリペプチドのセットを形成する。

本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドのＮ−末端に結合した不可的ペ プチドを包含する、より長いポリペプチドの一部であってもよい。この付加され たペプチドは、宿主の組織からの蛋白質分泌を司令するシグナル配列、例えば酵 母のＭＦａｌｆａｌシグナル配列（カージャン（Ｋｕ　ｒ　ｊ　ａｎ）ら、Ｃｅ １ｌ、３０，９３３−９４３　（１９８２））であってもよい。あるいはこの付 加されたペプチドは、所望ポリペプチドの精製を容易にするために使用されるも のであってもよい：サッセンフエルド（Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ）ら、「組換え蛋 白質の精製のためにデザインされたポリペプチドの融合（Ａ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔ ｉｄｅ　Ｆｕｓｉｏｎ　Ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｕｒｉｆｉｃａ ｔｉｏｎｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ、７６−８１　（１９８４年１月号）を参照。後者の場合は、付 加されたペプチドは、後に生物学的活性の見地から不用なアミノ酸配列を、酵素 または化学的手段によって切除するために、所望ポリペプチドのＮ−末端に隣接 して選択的切断箇所を有する。

本発明の上記の好ましい態様には、更に式Ｉのポリペプチドを、同義アミノ酸の 好ましい、より好ましい、そ　゛して最も好ましいグループのためにコードする ことのできるヌクレオチド配列も包含される。特に、本発明は、第２図に示され いてるクローン、ｐｃＤ−ｈｕＩＬ３−２２−１のｃＤＮＡ挿入片の配列を持つ 核酸も包含する。ｐｃＤ−ｈｕＩＬ３−２２−１は、アメリカン・タイプ・カル チャー・コレクション（米国、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に受託 番号６７３１８として寄託されている。

アミノ酸、ヌクレオチド、制限エンドヌクレアーゼ、その他を記載するに際して は、本明細書中では一貫して標準的略称を用いる。コーエン（Ｃｏｈｅｎ）、ｒ α−アミノ酸の命名と記号（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｙｍｂｏｌ ｉｓｍ　ｏｆ　ａ−Ａｍｉｎｏ　Ａａｉｄ）Ｊ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ ｙｍｏｌ。

ｇ）ｒ、１０６．３−１７　（１９８４）；ウッド（Ｗｏ。

ｄ）ら、「生化学二問題の解決（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ　Ｐｒｏｂｌｅ ｍｓ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）Ｊ。

第２版、ベンジャミン、メンロパーク、（１９８１）；およびロバーツ（Ｒｏｂ ｅｒｔｓ）、、ｒ制限エンドヌクレアーゼの目録（Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ　ｏｆ　 Ｒｅ５ｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）Ｊ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８．２７−４０　（１９７９）を参照。

本発明は、医学上のおよび／または獣医学上の病変を治療するための免疫抑制剤 の使用に伴う問題の解消も目的とする。特に、本発明は血球の再生を刺激する化 合物を提供して、癌の治療、ある種の血液疾患の治療、持続感染症の治療に有効 である。

本発明をより充分に理解するため、好ましい実施態様を図面を参照して説明する 。

第１図はｐｃＤ発現およびクローニングベクターの組み立てに使われる、プラス ミドｐｃＤＶ１の制限部位と主要なコード領域を示す。

第２図は、ｐｃＤ発現およびクローニングベクターの組み立てに使われるプラス ミドｐＬ１の制限部位と主要なコード領域を示す。

第３図は、本発明のヒトＩＬ−３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列とそれから推定さ れるアミノ酸配列を示す。

第４図は、改変したｐｃＤベクター、ｐＳＰ６を示し、このベクターは、卵母細 胞内に注入するためのｍＲＮＡを産生ずるために使われる。

本発明は、ヒトＩ　Ｌ−３活性を示すグリコジル化された、あるいはされていな いポリペプチドを含み、それらは、標準的なタンパク工学技術を用いて、ここに 開示されたＩ　Ｌ−３ポリペプチドから誘導可能である。本発明はまた、本発明 のポリペプチドをコードし得る配列をもつ核酸も包含する。最後に本発明は、こ こに開示されたヌクレオチド配列を用いて、本発明のグリコジル化されたまたは 非グリコジル化されたポリペプチドを製造する方法列びにこのポリペプチドを使 用する方法も包含する。

本発明のポリペプチドおよび核酸を製造し、使用し、そして確認するための技術 は下記において、一般技術として説明されている。そしてその後にいくっがの実 施例があたえられており、そこではこの一般技術が特定の細胞型、ベクター、試 薬その他を使用して応用されている。

■、天然源からのヒトＩＬ−３ｃＤＮＡの調製本発明のｃＤＮＡは第２図で明ら かにされているｃＤＮＡ配列から、ｃＤＮＡプローブを組み立てることによって 得られる。このプローブは次にｃＤＮＡライブラリー中から相補的ｃＤＮＡクロ ーンを探索するために使用される。好ましくは、そのｃＤＮＡライブラリーは、 有糸分裂促進物質で誘発されたＴ−細胞クローンまたは末梢血リンパ球（Ｐ　Ｂ 　Ｌ）の集団から作成される。増殖するようにおよび／またはある種の細胞産物 を合成するように誘発された細胞からのｃＤＮＡライブラリーの作成は、分子生 物学ではよく知られた技術である：ドウハーティ　（Ｄｏｈｅｒｔｙ）、ｒｃＤ ＮＡのクローニングと発現（Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏ ｆ　ｃＤＮＡ）Ｊ、第１０章、ガテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ）編集１分子細 胞遺伝学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ジョン・ウィ リー＆サンズ、ニューヨーク、１９８５．およびブランディス（Ｂｒａｎｄｉｓ ）ら、ｒｃＤＮＡライブラリーの作製と特定遺伝子配列の探索（Ｐｒｅｐａｒａ ｔ　１ｏｎｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｄｅｔｅｃ ｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｇｅｎｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）Ｊ、セッ トロウ（Ｓｅｔｌｏｗ）ら編集、遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅ ｒｉｎｇ）、１８，２９９−３１６．ブレナム・プレス、ニューヨーク、１９８ ６、が最近の総括記事として挙げられる。

全ｍＲＮＡの抽出、抽出されたｍＲＮＡから２本鎖ＣＤＮＡへの変換、このｃＤ ＮＡのクローニングおよび適当な宿主への形質転換は、ＷＯ３７１０２９９０と して国際公開されたＰＣＴ出願／ＵＳ８６１０２４６４の３０〜３１頁に跨る章 に概説されているようにして行われる。

所望のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの好ましい供給源は、本発明のポリペ プチドに伴う活性をその上澄に含む細胞である。一般に適切なＴ細胞は、ヒトひ 臓、へん桃、末梢血などのようなさまざまな供給源から得られる。Ｔ−細胞クロ ーン、例えば末梢血Ｔリンパ球がら分離されたものもまた使用できる（免疫学の 研究論文（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ　ｉｎ　１ｍｍｕｎｏ　ｌ ｏｇｙ）ｒ　フォノ・デユーｖ−（ｖｏｎＤｏ　ｅ　ｈｍｅ　ｒ）、Ｈ，および ハーフ（Ｈａａｆ）、Ｖ。

編集；セクションＤ＝ヒトＴ細胞クローン（ＨｕｍａｎＴ−Ｃｅｌｌ　Ｃ１ｏｎ ｅｓ）、第８巻、２４３−３３３；エルシーバー・サイエンス・パブリシャーズ （ＥＩｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｎｅｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ　’ｓ）、ニューヨ ーク（１９８５）を参照）。

ｃＤＮＡライブラリーのためのプローブは、標準的技術を用いて組み立てられる １例えば、本発明の最大限またはほぼ最大限の長さのｃＤＮＡクローンのニック ・トランスレーションによって、あるいは標識された合成オリゴヌクレオチドに よって組み立てられる。上記マニアチスらは、ニック・トランスレーションの技 法の詳細な解説をのせており、いかなる望みの塩基配列の標識された合成オリゴ ヌクレオチドも、市販品として入手可能なりＮＡ合成装置を用いて得ることがが できる。そのような合成装置としては、例えばアプライド・バイオシステムズ（ Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、−フォスター・シティ−（Ｆｏｓｔ ｅｒ　Ｃ１ｔｙ）、カルフォルニア）のモデル３８１Ａがある。

ｃＤＮＡライブラリーは、その後標準的技術を用いてプローブによって選択され る、例えばベルブ（Ｂｅｌｔ２）ら、　「フィルター・ハイブリダイゼーション 法による複合遺伝子ファミリーの分離とホモロジーの決定（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ 　ｏｆ　Ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ　Ｆａｍｉｌｉｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａ ｔｉｏｎ　。

ｆ　Ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ　ｂｙ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ 　Ｍｅｔｈｏｄｓ）Ｊ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１００ ，２６６−２８５　（１９８３）；キャラハン（Ｃａｌｌａｈａｎ）ら、「マウ ス乳癌ウィルスゲノムに関連したヒトＤＮＡ配列の検索とクローニング（Ｄｅｔ ｅｃｔｉｏｎａｎｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　ＤＮＡ５ｅｑｕｅｎ ｃｅｓ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅＭｏｕｓｅ　Ｍａｍｍａｒｙ　Ｔｕｍｏ ｒ　ＶｉｒｕｓＧｅｎｏｍｅ）Ｊ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、７９．５５０３−５５０７　（１９８２）；グルンシュテイン（Ｇｒ ｕｎｓｔｅｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７２．３９６１−３９６５　（１９７５）； またはベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、１９６，１８０−１８３ 　（１９７７）を参照。

■、タンパク工学によるヒトＩ　Ｌ−３ミユーテインの調製 ＤＮＡ変異とミューティン産生の一般的技術は上記ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２４６ ４の３３頁、下から４行〜３頁１１行に記載されている。これらはまた本発明で も適用できる。

天然のポリペプチドのミューティンはさまざまな状況下で望まれうる。特に、副 作用が望ましい活性の部位と異なる部位に起因する場合は、例えば、ある種のミ ューティンによってその望ましからぬ副作用が緩和される可能性がある。さらに 、いくつかの発現系では、本来のポリペプチドはプロテアーゼによる分解を受け やすいことがありうる；もしそうならアミノ酸の選択された置換および／または 欠失で分解を受けやすい配列を変更して、収量を著しく高めることが可能である ：例えば英国特許出願２１７３−８０４−Ａでは、ヒト組織プラスミノーゲン活 性化因子の２７５位のＡｒｇがＧｌｙまたはＧＩＵに置換されている。ミューテ ィンはまた精製工程での収量を高め、および／または酸化、アシル化、アルキル 化または他の化学的変化を受けやすいアミノ酸を排除して蛋白質の保存寿命を延 長する可能性もある。例えば、メチオニンは酸化してスルホキシドを形成しやす く、多くの蛋白質において生物学的活性の失活の原因となる：例えば、プロット （Ｂｒｏｔ）およびワイズバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｐ　ｈ　ｙ　ｓ、　、２２３．　２７１　（１９８３）を 参照。メチオニンはしばしば生物学的活性の失活が殆どまたは全くない、より不 活性なアミノ酸に置換することができる：例えば、オーストラリア特許出願ＡＵ −Ａ−５２４５１／８６を参照。細菌の発現系において、コンホメーションに必 須でないシスティン残基を、削除または置換すると、収量が増加することがとき どき見られる：例えば、マーク（Ｍａｒｋ）らの米国特許４，５１８，５８４を 参照。

本明細書の以下の記載においては、上記エステル（Ｅｓ　ｔ　ｅ　１１）らによ ってミューティンを表示するために使われた表示法が使用されている。例えば［ ヒトＩＬ−３ミューティンＬｅｕ”Ｊ（あるいは、文脈上本来の蛋白質を指して いるときは単にＬｅｕ１３と記載されている）とは、Ｎ−末端を基準として１３ 位以外は本来の蛋白質と同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。

この位置でＶａｌ′ｂ＜Ｌｅｕに置換されている。１以上の置換についても同様 に表示される：例えば、１３位にＶａｌの代わりにＬｅｕおよび１８位にＭｅｔ の代わりにＰｈｅを持つミューティンは、ヒトＩ　Ｌ−３ミユーテイン（Ｌ　ｅ 　ｕ１３．　Ｐ　ｈ　ｅ１８）と記載される。欠失は「Δ」で表示される。例え ば、４位のＧｉｎを欠失するミューティンはヒトＩ　Ｌ−３ミユーテインΔ４と 記載される。

挿入は「ＩＮ　（Ｘａａ）Ｊと表示される。例えば、４位のＧｉｎ後にＬｅｕが 挿入されたミューティンは、ヒトＩＬ−３ミューティンＩＮ’　（Ｌｅｕ）と記 載される。

こうして、ヒトＩ　Ｌ−３ミユーテイン（Ｓｅｔ”、　Δ４゜ＩＮ’　（Ｇｌｙ ））は、本来のヒトＤＮＡ配列が１０位にＴｈｒの代わりにＳｅｒを有し、４位 のＧｌｎが削除され、６位のＴｈｒのすぐ後にＧｌｙが挿入されて改変されたミ ューティンを表す。同じ場所での複数アミノ酸の挿入は、ＩＮ’　（Ｘａａ、− Ｘａａ２−Ｘａａ３−・・・）と表示され、Ｘａａ、−Ｘａａｚ　−Ｘａａｓ　 −・・・は位置ｉの後に挿入された配列である。Ｎ−末端への追加は肩文字「０ 」で、例えばＩＮｏ　（Ｘａａ）と表示され、そしてアミノ酸６−１０の欠失配 列は、例えばΔ６−１０または（Δ６．Δ７．Δ８．Δ９．Δ１０）のいずれか で表示される。

最も好ましくは、ヒトＩ　Ｌ−３ミユーテインを作製するためには、カセットミ ュータジエネシス法が用いられる。後に詳細に説明するように、合成ヒトＩ　Ｌ −３遺伝子は、いくつかのユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位をその遺伝子 に沿ってほぼ均一な間隔で持つような配列に作り上げられる。この制限部位のユ ニーク性は、この遺伝子が適当なベクターへ挿入される際に保持されねばならず 、それによって、遺伝子のセグメントが都合良く切り出されて所望の変異をコー ドする合成オリゴヌクレオチド（即ち、カセット）で置換されることが可能にな る。

ユニークな制限部位の数と分布の決定には、いくつかいられるベクター内にすで に存在している制限部位、（２）種あるいは屑物異的コドンの使用が好ましいが 否か、（３）ベクターを切断することなく使用できる種々の制限エンドヌクレア ーゼの種類（および合成遺伝子内のそれらの複数性）、ユニークな制限部位の間 のセグメントを合成したりおよび／または配列決定する際の容易性と信頼性等が 含まれる。

式Ｉは、推定上の本来的ヒトＩ　Ｌ−３配列に対して、保存的なアミノ酸の置換 、挿入、および／または欠失を有するポリペプチドの一部を一般に定義する。本 明細書で使用される「保存的」の用語は、（ｉ）変異ができるかぎりコンホメー ションに対する影響が小さく　（中立であり）、即ち、本来のヒトＩ　Ｌ−３に 比較して、変異ポリペプチドの三次元構造における変化が最少になるよう設計さ れていて、そして（ｉｉ）変異は抗原性に対してもできる限り影響が小さく　（ 中立であり）、即ち、本来のヒトＩ　Ｌ−３に比較して、変異ポリペプチドの抗 原決定部における最小限の変化しか生じないように設計されていることを意味す る。コンホメーションの中立性は、生物学的活性を保持するために好ましく、抗 原の中立性は、本発明の化合物で治療される患者または動物における免疫反応の 引金がひかれる危険を避けるために望ましい。どの変異がコンホメーション的に そして抗原的に中立であるかを絶対的確実性をもって選択することは困難である が、コンホメーション的にそして抗原的に中立である可能性が大きい変異を実現 するために、当業者を導く法則は存在する。例えば上記アンフィンセンおよびバ ーシフスキー（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ）、５ｃｉｅｎｃｅ、２２９．９３２−９４ ０　（１９８５）を参照。重要な法則のうち、いくつかを挙げれば、（１）疎水 性残基同士を置換しても、それらの残基は蛋白質の内部に位置することが多いの で、抗原性の変化をおこす可能性は比較的小さい、例えば上記バーシフスキーを 参照；（２）物理化学的に同様な、即ち同義な残基同士の置換は、あらたに加わ ったアミノ酸が削除されたアミノ酸と同じ構造上の役割を果たすことができるの で、コンホメーション的変化をおこす可能性が小さい；（３）進化的に保存され ている配列の変換は、進化的保存は、配列が機能的に重要であろうことを示唆し ているので、有害なコンホメーション上の影響を生じる可能性がある。

ミューティン配列を選ぶためのこのような基本的法則に加えて、遺伝子工学的処 理を受けた分子の生物学的活性とコンホメーションを確認するためのアッセイが 用意されている。本発明のポリペプチド用の生物学的アッセイは、後により詳細 に説明される。コンホメーションの変化は、少なくとも二つの良く知られている アッセイ法で調べることができる：その一つは、例えばワラセルマン（Ｗａ　ｓ 　ｓ　ｅ　ｒｍａｎ）　ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

８７．２９０−２９５　（１９６１）　、またはレバイン（Ｌｅｖｉｎｅ）　ら 、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ　ｌｏｇｙ、１１，９２８−９３６　（ １９６７）に記載されている、マイクロコンブリメント・フィクセーション法で あり、蛋白質の三次元構造の進化的研究に広く使用されている；そして二つ目の 方法は、コンホメーション特異的モノクローナル抗体群に対する親和性を利用す る方法である、例えば、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　 ｒｙ、２２，９４８−９５４　（１９８３）を参照。

ｍ、ｃｓＦ活性アッセイ Ｃ８Ｆ活性を決定するのに、造血細胞、例えば骨髄細胞や、胎児さい帯面細胞等 を分散浮遊液（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ　５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）にする。次い で、個々の細胞を栄養成分としばしばウシ胎児血清を含む半固体カンテン培地ま たは粘稠性メチルセルロース培地中に不動化する。適切な刺激因子が存在すると 、各細胞は増殖および分化する。細胞は最初に不動化されているので、細胞が増 殖して成熟するにつれてコロニーが形成される。これらのコロニーは７−１４日 後に数えられるようになる。Ｃ３Ｆアツセイの詳細な説明は、バーゲス（’　Ｂ ｕｒｇｅｓｓ）、Ａ、ｒ成長因子と幹細胞（Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａ ｎｄ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅ１ｌｓ）Ｊ、５２−５５頁（アカデミツク・プレス、ニュ ーヨーク、１９８４）及びメトカルフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）。

「造血コロニー刺激因子（Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｏ１ｏｎｙ　Ｓｔｉｍｕ ｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒｓ）Ｊ、１０３−１２５頁（エルシーバー、ニュー ヨーク、１９８４）に記載されている。必要であれば、各コロニーを抽出し、顕 微鏡スライドにのせて、固定してライト／ギムザ染色することができる（トッド −サンフォード（Ｔｏｄｄ−３ａｎｆｏｒｄ）、ｒ実験室の手法による医療診断 （Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓｂｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｔ ｈｏｄｓ）Ｊ、１５版、デイビドソン及びヘンリー（Ｄａｖｉｄｓｏｎａｎｄ　 Ｈｅｎｒｙ）編、１９７４を参照）。こうして単独コロニーあたり存在する細胞 型の形態学的解析をすることができる。

非血液性疾患の患者から集めた骨髄細胞を、フィコール（タイプ４００．シグマ 社、セントルイス、モントリオール）上に重ねて遠心しく６００　Ｘ　ｇ、２０ 分）、界面の細胞を集める。これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ） 含む、イズコフの改変ダルベツコ培地中で２回洗浄し、接着性の細胞をプラスチ ックペトリ皿への接着によって除去する（接着性細胞はしばしばＧＭ−Ｃ８Ｆ産 生細胞である；上記メトカフル参照）。非接着性細胞は、２０％ＦＣ３，５０μ Ｍ２−メルカプトエタノール、０．９％メチルセルロース、そしてさまざまな濃 度のコロニー刺激因子を含む液またはテスト用上澄のいずれかを含むイズコフ培 地（Ｉｓｃｏｖｅ’　ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）に、１０’細胞／ＭＪｌの割で添加す る。その１−を３５ｍｍのベトリ皿上に置き、空気中に６％のＣＯ２を含み完全 に湿潤な大気中で３７℃で培養する。培養の開始から３日後に各プレートに１単 位のエリスロポエチンを加える。顆粒球−マクロファージコロニーと、赤芽球バ ースト（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ　ｂｕｒｓｔ）を１０−１４日目に顕微鏡を用いて 数える。

ヘパリン中に集められたさい帯面細胞は、６００Ｘｇで６分間遠心する。血漿と 赤血球ピークの中間の層にある白血球を、０．１７Ｎ塩化アンモニウムと６％Ｆ ＣＳを含む試験官に移す。氷上に５分装置いてから、その浮遊液を４艷のＦｅ２ とともに６００Ｘｇで６分間遠心する。細胞ペレットはダルベツコの燐酸緩衝化 塩水で洗浄し、上で骨髄細胞について説明したようにして、フィコールとプラス チック接着工程を行う。低比重の非接着性細胞を集め、上で述べたように半固体 培養液中に、培養当たり１０５細胞となるように加える。

アッセイの最後に、個々のコロニーをガラススライドにのせて、ライトーギムザ で染色して細胞構成を決定する。好酸球はルキソール・ファースト・ブルー（Ｌ ｕｘｏＩ　Ｆａｓｔ　Ｂｌｕｅ）で染めて決定される、例えば、ジョンソンおよ びメトカルフ（Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｇ、＆　Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｄ、）、Ｅｘｐ、Ｈ ｅｍａｔ。

１、．８，５４９−５６１　（１９８０）を参照。

■、精製と薬理学的組成物 本発明のポリペプチドを精製するための、そしてそれを実験室でまたは薬理学的 組成物の活性成分として使用するための一般的手法は、ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２ ４６４のセクション■、特に４３頁２０行から４４頁１５行までと、４４頁２７ 行から４５頁２７行までに開示されている。効力および適応状況に応じ、本発明 による１投与量単位の活性ポリペプチドの量は１μｇから１００ｍｇまで可能で ある。

さらにまた、−人の人間の造血細胞の集団を維持し、および／またはエクス・ビ ボ（ｅｘ　ｖｉｖｏ）で増殖または分化させて、最終的に同一または他の人間に 再度導入して、好ましい効果を得ることができるであろう。

このような組成物は、免疫系のさまざまな要素を選択的に、単独であるいはこの 分野の熟練音速によくしられている他の薬剤と共に刺激することができる。特に 、この組成物は他の免疫反応剤、例えば、リンホカイン（ＩＬ−１、Ｉ　Ｌ−２ 、Ｉ　ｎ、−４、ＧＭ−Ｃ８Ｆ等）を含むことができる。

■９発現系 任意の適当な発現系が使用できる；適当なものである限り、発現系の特徴は本発 明にとって決定的要因ではない。適当な発現系は、ＰＣＴ／ＵＳ８６−０２４６ ４の４５−５０頁のセクション■「発現システム」で検討さ次の実施例で本発明 をさらに説明する。ｃＤＮＡライブラリー、ベクターおよび宿主の選択は、試薬 の濃度、温度および他の変数と同様、本発明の応用を単に例示するもので、発明 の限界を示すためのものではない。

フリカッメガエル　Ｘｅｎｏ　ｕｓ　リ母上ＩＦ（７）ノし四。

Ｂｉｏｌ、、２，１６１−１７０　（１９８２）および同誌、３，２８０−２８ ９　（１９８３）に開示された技術を用い、コンカナバリンＡ（ｃｏｎ　Ａ）に 暴露して（２−１ｏμｇ　／ｄ、　４−１２時間）ｍＲＮＡを誘発させたヒトＴ 細胞クローン（６Ｄ１１）から分離されたｍＲＮＡから作製した。他の誘発化合 物、例えば、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）　、ブタ草有糸分裂誘発因子（ｐｏｋ ｅ　ｗｅｅｄ　ｍｉｔｏｇｅｎ）、カルシウムφイオノフオア、抗Ｔ３抗原、そ の他も、ある条件下において、ある種の型の細胞にとってより効果的である可能 性もある。ｐｃＤ前駆プラスミドのｐｃＤＶｌおよびｐＬｌは、ファルマシア（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ、）（ビス力夕つエイ、ニューシャーシー）から市 販されている。

オカヤマおよびパークのｐｃＤｃＤＮＡライブラリーの構築は、ＰＣＴ／１Ｊｓ ８６１０２４６４の３１〜３２頁にわたる章に、簡単に説明されている。

第１図に概略的に図示されているオカヤマ／バニグブラスミドベクター内のｃＤ ＮＡライブラリーが得られたら、ｃＤＮＡクローンを集め、無作為のプールにつ いて、望むｃＤＮＡの存在を標準的方法、例えばハイブリッド選択、発現産物の 抗原決定基の検出および／または機能のアッセイなどによってチェックする。

Ａ、ｍＲＮＡの分離 チャーゲイン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ、１８ ．５２９４−５２９９　（１９７９）のグアニジン・イソチオシアネートを用い て、６Ｄ１１細胞から全部の細胞ＲＮＡを分離した。この工程は既述のマニアチ スらによっても記載されている。洗浄してペレット化したｃｏｎＡ−刺激６Ｄ１ １細胞を、グアニジン・イソチオシアネート溶解液中に浮遊させた。この溶解液 は、５０ｇのグアニジン・インチオシアネート法を０．５ｇナトリウム　Ｎ−ラ ウロイルザルコシン（最終濃度０．５％）と、２．５艷の１Ｍクエン酸ナトリウ ム、ｐＨ７，Ｏ（２５ｍＭ）、０．７−の２−メルカプトエタノール（０，１Ｍ ）、および０．３３−のジグｖ（ｓｉｇｍａ）３０５アンチフオームＡ（消泡剤 ）（０，１％）；脱イオン水を室温で１００艷の量まで加え、最終量の液を濃過 して、ＩＮ　ＮａＯＨでｐＨ７に調節して調製した。この溶解液は、１．５Ｘ１ ０’細胞に対して２゜−が使用された。

結果として生じたペレットは、ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２４６４のセクションＢ、 ５５頁２２行〜５６頁２４行）工程にしたがって処理した。

Ｂ、ｐｃＤライブラリーの構築 オカヤマ・ベルブの方法（Ｍｏ１．＆　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ　１．．２，１６１− １７０　（１９８２）を僅かに修正して用いた。ｐｃＤＶｌおよびｐＬ１プラス ミドは、オカヤマおよびベルブによって、Ｍｏ１．＆　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．．３ ，３８０−３８９　（１９８３）に記載されており、ファルマシア（ピスカタウ エー、二ニーシアージー）から入手可能である。特に改変されたｐ’　ｃ　Ｄｖ １プラスミドが使われ、このプラスミドはＫｐｎＩであった場所にＮ５ｉＩを含 む；そして改変されたｐＬｌが使われ、これはＸｈｏＩの位置にＨＴＬＶ　（Ｉ ）レトロウィルスのロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）の一部からなる挿 入物を含んでいた。ＬＴＲセグメントの存在は、一般に哺乳動物細胞において発 現を２０−５０倍向上させることが知られている。改変された構築物は第１図お よび第２図に示されている。

レトロウィルスのＬＴＲは、いくつかの系で発現を高めることが示されている。

チェノ（Ｃｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８２．７ ２８５−７２８８　（１９８５）；ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７９．６７７７−６７８１　（１９８２）；チ ミン（Ｔｅｍｉｎ）、Ｃｅ１ｌ、２７．ｌ−３（１９８１）ニルシュ（Ｌｕｃｉ ｗ）　ら、Ｃｅ　１１，３３，７０５−７１６　（１９８３）を参照。ｐＬｌの Ｘｈｏ１部位に挿入されたＨＴＬｖ（Ｉ）のＬＴＲ部分は、Ｒ領域全体と、Ｒ／ Ｕ５境界から最初の下流ＴａｑＩ部位（全部で３９塩基）に及ぶＵ５領域の一部 （第２図でＵ５°で示されている）を含む２６７塩基セグメントからなる。ＨＴ ＬＶ　（Ｉ）ＬＴＲの配列は、ヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ）らによって明らかにさ れている（カレント・トピッシス・イン・マイクロパイロオシ−・アンド・イム ノロジー（Ｃｕｒｒｅｎ、ｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１１５，１５７−１７５　（１９８５））。

ＨＴＬＶ　（１）ＬＴＲセグメントは、実施例Ｈに記載されている工程を用いて ４段階でｐＬｌへ挿入される。

まず、ｐＬｌをＢｇｌＩとＸｈｏＩで消化し、大きな断片を分離する。その大き な断片を次に合成片ＩＡ／Ｂおよび２Ａ／Ｂ　（下に定義される）と標準ライゲ ーション混合液中で混和する。合成片ＩＡ／Ｂおよび２Ａ／Ｂは共に、配列５° →３°内に、小さなりｇｌＩ／ＸｈｏＩ断片の配列、ＬＴＲＲ領域の５°部分２ ６塩基、および順にＳｍａＩ、５ａｃＴ、ＮａｅＩ、ＸｈｏＩ部位からなるポリ リンカーから構成される。

合成片Ｉ　Ａ／Ｂ ライゲーション（連結）の後、第１段階で得られたプラスミドを増幅し、分離し て、ＳｍａＩおよび５ａｃＩで消化し、大きな断片を分離する。次いでこの大ぎ な断片を合成片３Ａ／Ｂおよび４Ａ／Ｂ　（下に定義される）と共に標準ライゲ ーション混合液中で混和する。

合成片３Ａ／Ｂ ライゲーションの後、第２段階でできたプラスミドを増幅し、分離して、５ａｃ ＩおよびＮａｅＩで消化して、大きな断片を分離する。この大きな断片を続いて 合成片５Ａ／Ｂ（下に定義される）と標準ライゲーション混合液中で混和する。

ライゲーションの後、第３段階でできたプラスミドを増幅、分離してＮａｅＩお よびＸｈｏＩで消化し、大きな断片を分離する。この大きな断片を次に、合成片 ６Ａ／Ｂおよび７Ａ／Ｂ　（下に定義される）と共に標準的ライゲーション混合 液内で混和して、ｐＬｌｏと呼ばれる変形ｐＬ１プラスミドを形成する。

合成６Ａ／Ｂ ｐｃＤＩＤＮＡの８０Ｍｇサンプルを３０℃で２０単位のＫｐｎＩエンドヌクレ アーゼを用いて６ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、６ｍＭＭｇＣｌｚ　、６ｍＭ ＮａＣ１，６ｍＭ２−ＭＥ、−あたり０．１■のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） を含む反応液４５０μｍ中で消化した。１６時間後にこの消化を４０μｍの０． ２５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８゜Ｏ）および２０μｍの１０％ドデシル硫酸ナトリウ ム（ＳＤＳ）を加えて終了させた；　ＤＮＡは、水で飽和した１：１のフェノー ル−クロロホルムでの抽出とエタノール沈澱の後回収した。一端あたり平均６０ １しかし８０以上ではない、デオキシチミジン（ｄＴ）残基のホモポリマーチイ ルを、Ｎ５ｉＩエンドヌクレアーゼで生じた末端に、仔牛胸腺ターミナルトラン スフェラーゼを用いて以下のようにして付加した：反応混合液（３８μｌ）は、 カコジル酸ナトリウム３０ｍＭを含むトリス塩酸（ｐＨ６，８）をバッファーと して、ｌｍＭＣｏ　Ｃ１２，０，１ｍＭジチオスレイトール、０．２５ｍＭｄＴ ＴＰ、Ｎｓ　ｉ　Ｉエンドヌクレアーゼで消化されたＤＮＡ、ターミナル・デオ キシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ６８単位（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ、 ミルオーキー、ライスコンシン）を含むものを用いた。３７℃３０分の後、反応 は２０μｌの０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）および１０μｍの１０％Ｓ ＤＳで停止し、フェノール−ＣＨＣｌ３で数回抽出後、エタノール沈澱によって ＤＮＡを回収した。次いでＤＮＡを１５単位のＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼで 、１０ｍＭ）−リス塩酸ｐＨ７，４，１０ｍＭＭｇＣ１２，１ｍＭジチオスレイ トール、−あたり０．１■のＢＳＡを含む５０μｍ中で、３７℃５時間消化した 。大きい断片はＳＶ４０のポリアデニル化部位と、ｐＢＲ３２２の複製オリジン とアンピシリン耐性遺伝子を含み、アガロース（１％）ゲル電気泳動で純化し、 ガラスパウダー法（フォーゲルシュティン（Ｖｏｇｌｓｔｅｉｎ）。

Ｂ、およびギレスピ−（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）、Ｄ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７６．６１５−６１９　（１９７ ９））の変法によってゲルがら回収した。ｄＴ−ティル化ＤＮＡをさらに以下の ようにオリした：　ＤＮＡを１ｍＭ　ＥＤＴＡとＩＭＮａＣｌを含む１０ｍＭト リス塩酸ｐＨ７，３バツフア一１社中に溶解し、ＯｏＣに冷却し、同じバッファ ーで平衡化したオリゴ（ｄＡ）−セルロースカラム（０，６Ｘ２，５ｃｍ）に０ ℃で導入し、室温で水により溶出させた。溶出されたＤＮＡはエタノールで沈澱 させ、１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７，３゜１ｍＭ　ＥＤＴＡ中に溶解した。

オリゴ（ｄＧ）のテールが結合したＤＮＡは、７５ＭｇのｐＬｌｏ　ＤＮＡを、 ２０単位のＰｓｔＩエンドヌクレアーゼで４５０μｍの６ｍＭ）−リス塩酸ｐＨ ７，４，６ｍＭＭｇＣ１２，６ｍＭ２−？ｖｉＥ、５０ｍＭＮａＣＩ、Ｊ当たり ０．０１■ＢＳＡ中で消化して調製した。３０℃１６時間の後、反応混合液を、 フェノール−ＣＨＣ１，で抽出し、抽出されたＤＮＡをアルコールで沈澱させた 。１０ないし１５デオキシグアニル化（ｄＧ）残基のテールを、４６単位のター ミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼによって、０．１ｍＭｄ ＧＴＰをｄＴＴＰに置き換えた以外は上記と同じ反応混合液（３８μｍ）中で各 末端に付加した。３７℃２０分の後、この混合液をフェノール−ＣＨＣ１３で抽 出し、抽出されたＤＮＡをエタノールで沈澱させてから、３５単位のＨｉｎｄ■ エンドヌクレアーゼによって、５０μｍの２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７，４，７ ｍＭＭｇＣＩ２．６０ｍＭＮａＣ１，０，１ｍｇのＢＳＡ中で、３７°０４時間 消化した。この小さいオリゴ（ｄＧ）テールを付したリンカ−ＤＮＡを、アガロ ースゲル（１，８％）電気泳動で精製し、上記のようにして回収した。

ライブラリーのキ築： これはＰＣＴ／ＵＳ８６１０２４６４の４８頁下９行〜６１頁１０行の、ｃＤＮ Ａライブラリー製作、セクションＣ２）に従って行った。その後、サンプルカル チャーを保存のためＤＭＳＯ中に凍結した。それとは別に、ＤＭＳＯを加える前 に２０枚の１５ｃｍ培養プレートに各約３０００クローンずつ植え込んだ。

上記のコロニー用の放射性標識されたプローブは、下記のようにして作成した： （１）ヤング（’１’　ａ　ｎ　ｇ　）ら、Ｃｅ　１１，４７．３−１０　（１ ９８６）に記載されたヒトＩＬ−３配列データを使って、報告されているヒトＩ Ｌ−３配列のコードストランドの最初の５５ヌクレオチド（ＡＴＧで始まる）を 含む合成オリゴヌクレオチドを合成した；（２）同じ配列のデータを使って、報 告されている配列の４５−１００塩基を含む、重複するアンチセンス−ストラン ド・オリゴヌクレオチドを合成した；（３）これら二つの合成ストランドをアニ ールさせ、ＡＴＰ、ＧＴＰＸＴＴＰ、および放射性標識されたＣＴＰの存在下で ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片のプライマーとして使用した；（４）最後に 反応は最大限のストラン“ド伸長を確実にするよう、非標識前駆体で「コールド チェイス」した。コールドチェイスとは、放射性活性をもつ前駆体ＣＴＰをその 非放射性のもので置換することをいう。

上記で作った２０枚のプレートは、合成プローブを用いて、標準的コロニー・ハ イブリダイゼーションのプロトコール、例えば前記マニアチスらの方法によって クローンのスクリーニングを行った。二つの陽性コロニーが検出された。ｐｃＤ −ｈｕＩＬ３−２２−１と命名された一方のクローンを選択し、増幅して、グイ デオキシ・チェーン・ターミネーション法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）　 ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７４．５３６３−５３６７　（ １９７７）による配列決定のため、プラスミドＭ１３に再クローン化した。ＣＤ ＮＡ配列は第３図に、最も大きいオープンリーディングフレームの推定されるア ミノ酸配列と共に示されている。バールマン（Ｐｅ　ｒ　１ｍａｎ）ら、Ｊ、Ｍ ｏ　１．Ｂｉｏ　１．．１６７．３９１−４０９　（１９８３）によって発表さ れた経験法則に従うＮ末端アミノ酸の分析によると、このオーブンリーディング フレームの最初から３番目のプロリンが、成熟蛋白質のＮ末端である可能性が最 も大きいと思われる。しかしながら、この法則にもかかわらず、マウスＩ　Ｌ− ３のＮ末端がＡｌａであることが見出されている観点から、Ｐｒｏの隣りのＡｌ ａが本来の蛋白質の正しいＮ末端である可能性もある。いずれにせよ、シグナル 配列は活性分子の重要部分ではなく、分泌や活性に有害な効果なしに、配列の広 い多様性を包含するのかもしれない、例えばカイザー（Ｋａｉｓｅｒ）ら、５ｃ ｉｅｎｃｅ、、２３５，３１２−３１７　（１９８７）参照。Ｎ−グリコジル化 の可能性部位は、第３図で四角く囲まれている。

驚ろくべきことに、分離されたヒトＩＬ−３ｃＤＮＡは、ヤングら（上記）によ って報告された配列とくらべて、重要なアミノ酸の相違を有することが発見され た：分離されたｃＤＮＡは、ヤングらによって報告されたセリンの代わりにプロ リンを７位に（式■のＮ末端から数えて）コードしている。プロリンとセリンの 非類似性を考えると、このような変化は、この２種のポリペプチド並行して、同 じクローンを別に増幅させた；ｐｃＤクローニングベクターは、標準的技術を用 いて分離した、例えば上記マニアチスらを参照；そしてｃＤＮＡを２つの別々の 系、即ちＣ０８７サル細胞およびアフリカッメガエル卵母細胞で発現させた。ｐ ｃＤベクターはＣ０８７細胞を以下のようにトランスフェクトするために用いら れた。トランスフェクションの１日前に、約１０６個のＣ０８７サル細胞を、１ ０％０％ウシ胎清と２ｍＭグルタミンを含む、ダルベツコの変形イーグル培地（ ＤＭＥ）の入った１　００　ｍｍプレートの各々に植え込んだ。トランスフェク ションを行うため、それぞれのプレートから培地を吸引して除去し、５０［１１ Ｍ）リス塩酸ｐＨ７，４，４００μｍ／ｄＤＥＡＥ−デキストランと５０Ｍｇの 試験すべきプラスミドＤＮＡを含んだ４ｄのＤＭＥで置き換えた。プレートを３ ７℃で４時間インキュベートし、その無血清ＤＭＥで２回洗浄した。１５０ＭＭ クロロキンを含むＤＭＥをプレートに加え返し、３７℃で３時間さらにインキュ ベートした。プレートをＤＭＥで１回洗浄し、次いで４％ウシ胎児血清、２ｍＭ グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤＭＥを加えた。

細胞をその後３７℃で７２時間インキュベートした。増殖用培地を集め、上記の 胎児さい帯面アッセイを使用してＣＳＦ活性を調べた。多様なコロニーが観察さ れた。

ｐｃ、Ｄ−ｈｕＩＬ３−２２−１のｃＤＮＡ挿入物から発現したＲＮＡを注入し たアフリカッメガエル卵母細胞の上清の生物学的活性に関してアッセイした。そ の方法は、メルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ、１２．７０３５−７０５６（１９８４）およびフレイブ（Ｋｒｅｉ ｇ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１２．７０５７−７ ０７０　（１９８４）によって開示されたものと全く同じ方法を用いた。先ず、 ｐ　ｃＤ−ｈｕ　Ｉ　Ｌ３−２２−１のｃＤＮＡ挿入物を、改変ｐｃＤベクター 、ｐＳＰ６に再クローン化した。ｐＳＰ６は、第４図に示す゛　とおり、ｐＣＤ の中のＳＶ４０複製オリジンをＳＰ６プロモーターで置き換えて作成された。こ の変形ｐｃＤベクターは、更にアンピシリン耐性遺伝子内に不能化したＰｓｔＩ 部位（第４図でΔＰｓｔＩで示されている）およびｐｃＤのポリＡ領域のＸｈｏ １部位に挿入されたポリリンカー領域をも含んでいる。ポリリンカー領域は、Ｅ ｃｏＲＩ、５ａｃＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩＳＸｂａＩ、Ｓａ　ｌ　Ｉ、Ｓｓ　 ｔ　Ｉ、ＨｉｎｄｌＩＩ部位を含む。不能化したＰｓｔＩ部位は、ＳＶ４０のオ リ（ｏ　ｒ　ｉ）領域挿入に先立って）切り出されることを可能にする。適当な ＳＰ６プロモーター挿入部位（長さ約６０塩基）は、前記メルトン（Ｍｅｌｔｏ ｎ）らによって明らかにされた配列から、標準的技法を使用して合成することが できる。ＳＰ６プロモーターの挿入後、生じたプラスミドを増幅、分離して、Ｘ ｈｏＩで消化した。標準的技法を用いて合成したポリリンカーをＸｈｏＸ部位へ 挿入した。

別法として、ＳＰ６プロモーターとポリリンカー領域を含む市販のプラスミドを 使用することも可能である；例えばＮＥＮリサーチ・プロダクツ（Ｒｅｓｅａｒ ｃ、ｈＰｒｏｄｕｃｔｓ）（ボストン、マサチューセッツ）から入手できるｐｓ Ｐ６２−ＰＬ、あるいはＢＲＬライフチクノロシーズ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｉｅｓ）（ガイザースバーグ、メリーランド）から入手できるｐｓＰ１８ またはｐｓＰ１９が使用できる。

ヒトＩＬ−３ｃＤＮＡを、ＰｓｔＩとＢａｍＨＩでの消化によってｐ　ｃＤ−ｈ ｕ　Ｉ　Ｌ３−２２−１から切り出し、分離してｐＳＰ６−ｈｕＩＬ３を形成す るため、ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＳＰ６に連結した。ｐＳＰ６’−ｈ ｕＩＬ３を大腸菌ＭＣ１０６１中で増幅し、分離して、ＸｂａＩで線状化した。

卵母細胞注入用のＲＮＡは、線状化されたｐＳＰ６−ｈｕ　Ｉ　Ｌ３を５Ｐ６Ｒ ＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬライフチクノロシーズから入手可能）で転写して作成 したが、その方法は上記フレイブらの方法および上記メルトンらの方法に従った 。５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ５ｅ（例えば、ＲＮＡ５ｉｎおよびＲＮ Ａ５　ｅを含まないＤＮＡ５ｅをそれぞれ１単位／マイクロリットルおよび２０ マイクログラム／−）で処理し、アフリカッメガエル卵母細胞の細胞質内に注入 し、その培養液の上清をＣ８Ｆ活性に関してアッセイした。多様なコロニー型が 観察された。

実施例■　ｃＤにおけるカセットミュータジエネシスのための合゛ヒトＩ　Ｌ− ３遺云　の　築とＣＯ３７サル細胞での この実施例の合成遺伝子を造成し発現する技術は、分子生物学の技術において標 準的なものである。例えば特にスブロートおよびゲイト（Ｓｐｒｏａｔ　ａｎｄ 　Ｇａ１ｔ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１３．２９５ ９−２９７７　（１９８５）　、およびフエレッティ　（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ）ら 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８３，５９９−６０３　（１９ ８６）、そして更にミューレンバッハ（Ｍｕ　１１　ｅ　ｎｂａｃｈ）　ら、Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６１，７１９−７２２　（１９８６）；ウェルズ（ Ｗｅｌｌｓ）ら、Ｇｅｎｅ、３４，３１５−３２３　（１９８５）；そしてエス テル（Ｅｓｔｅｌｌ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３３．６５９−６６３　（１９８ ６）を参照。簡単に説明すれば、合成ヒトＩＬ−３遺伝子は、複数の化学的に合 成された二本鎖ＤＮＡ断片から組み立てられる。合成遺伝子の塩基配列は組み立 てられた合成遺伝子が、その遺伝子を運搬するベクターとの関係において、一連 のユニークな制限部位を含むように選ばれる。一連のユニークな制限部位は、切 り出され、異なる塩基配列を持つセグメントに置換されることが容易にできる一 連のセグメントを規定する。合成断片は直接または他の断片との連結の後に、適 当なベクター、例えばｐｃＤプラスミドやその他へ挿入される。上で述べたセグ メントは、上記ウェルズらの「カセット」に相当する。合成断片は、標準的技術 を用いて合成される；例えばゲイト（Ｇａｉｔ）、オリゴヌクレオチドシンセシ ス（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ。

ｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）ニア・プラクティカルアプローチ（Ａ　Ｐｒａ ｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）（ＩＲＬプレス、オッシスフォード、英国、 １９８４）を参照。好ましくは自動合成装置、例えばアプライド・バイオシステ ムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｉｎｃ、（フォスターシティ −、カリホルニア）のモデル３８０Ａのような装置が使用される。ｐｃＤプラス ミドおよび他の適当なベクターは市販されており、例えばファルマシアから入手 可能である。ｐｃＤについては、クローニングは大腸菌ＭＣ１０６１またはＨＢ ＩＯＩで行うことができ、発現はＣＯＳサル細胞ま本実施例においてはｐｃＤプ ラスミドへの挿入のために、合成ヒトＩ　Ｌ−３遺伝子を組み立てる。簡単に説 明すると、ｐＣＤベクターは最初に下記の４つの断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで一 緒に連結して組み立てられる：ｐＢＲ３２２オリ（ｏｒｉ）とＡｍｐｒを含むｐ ｃＤＶｌから大きなＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ　／　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ断片、ＳＶ４０の 早期領域プロモーターと後記領域イントロンを含むｐＬｌからのＨｉｎｄＩＩ［ ／ＰｓｔＩ断片、そして下で説明される合成片１１Ａ／Ｂおよ４）”１２Ａ／Ｂ である。

次に、増幅、純化そして挿入の三工程のさらなる繰り返しによって、残りの合成 片１３Ａ／Ｂから１８Ａ／Ｂ迄が、ｐｃＤベクター中に完成した合成Ｉ　Ｌ−３ 遺伝子が生じるまで、付加される。

制限エンドヌクレアーゼ消化および連結反応は標準的方法を用いて行われ、例え ば「モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ　（ コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、＝！−ヨーク、１８９２）を参照。

アルカリ法（上記マニアチス）が小規模のプラスミド調製に使用される。大規模 の調製にはアルカリ法の変法が用いられ、その場合は等量のイソプロパツールが 溶解液上清から核酸を沈澱するために使用される。２．５Ｍの冷酢酸アンモニウ ムでの沈澱が、塩化セシウム密度勾配遠心分離とエチジウム・プロミドでの検出 に先立ってＲＮＡを除去するために使用されている。

クローン化する合成りＮＡの相補ストランド（各約４００ｎｇ）を混合し、５０ μｌの反応量中で、ポリヌクレオチド・キナーゼでリン酸化する。このＤＮＡを 適当な制限酵素で消化したベクターＤＮＡ１μｇと連結し、連結反応は、５０μ ｌ量中、室温で４〜１２時間である。

リン酸化、制限酵素消化、ポリメラーゼ反応、連結反応および細菌トランスフェ クションの条件は、上記マニアチスらにより説明されている。

第１段階では、ｐｃＤＶｌを増幅し、分離して、ＨｉｎｄｍおよびＢａｍＨＩで 消化する。ｐＢＲ３２２のＯｒｉとＡｍｐ’領域を含む断片を標準的技術、例え ば上記マニアチスらの方法を用いてゲル電気泳動によっ−て分離する。ｐＬｌを 増幅し、分離して、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化する。ＳＶ４０早期領域プ ロモーターを含む断片を電気泳動で分離する。この２つの分離されたｐｃＤＶＩ とｐＬｌ（７）断片を合成１１Ａ／Ｂおよび１２Ａ／Ｂ（下に示されている）と 、標準的Ｔ４ＤＮＡリガーゼ溶液中で混合する。合成１１Ａ／Ｂと１２Ａ／Ｂは アニ−ルして、新たに作成されるｐｃＤベクターへの挿入部を形成し、これは大 腸菌内で増幅されて、その後分離される。

第２段階では、第１段階で分離したｐｃＤベクターをＳｐｅ　Ｉおよび５ａｕＩ で消化する。大きい断片を分離し、標準的Ｔ４ＤＮＡリガーゼ溶液中で、第２段 階のｐｃＤベクターを形成するため、合成片１３Ａ／Ｂおよび１４Ａ／Ｂと混合 し、これを大腸菌ＭＣ１０６１内で増幅して分離する。　。

第３段階では、第２段階で分離したｐｃＤベクターをＭｌｕｌと５ａｕＩで消化 する。大きな断片を分離し、標準的Ｔ４ＤＮＡリガーゼ溶液中で第３段階のｐｃ Ｄベクターを形成するため、合成片１５Ａ／Ｂおよび１６Ａ／Ｂと混合し、これ を大腸菌ＭＣ１０６１内で増幅して分離する。

第４段階では、第３段階で分離したｐｃＤベクターをＥｃｏＲＩと５ａｕＩで分 解する。大きい断片を分離して、標準的Ｔ４リガーゼ溶液中でｐｃＤ内に完成し た合成Ｉ　Ｌ−３遺伝子を形成するため、合成片１７Ａ／Ｂおよび１８Ａ／Ｂと 混合する。第４段階のｐｃＤベクターは、大腸菌ＭＣ１０６１内で増幅し、分離 して、実施例Ｉで述べられているように、Ｃ０８７細胞へトランスフェクション させる。培養液上清を回収し、上記のようにＣ８Ｆ活性についてアッセイする。

合成片１１Ａ／Ｂから１８Ａ／Ｂ迄の配列を下に示す。

（Ｐｓｔｌ）Ｂｅｌｌ ＧＴＧＡＴＣＡＡＴＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＣ−ＡＣＧＴ ＣＡＣＴＡＧＴＴＡＣＴＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＣＡＧＧＡＣＧＡＧ−ＣＴＧＣ ＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴ 合成片１１　Ａ／Ｂ ＮａｒＩ ＣＧＣＣＣＣＧＧＡＣＴＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＴＧＡＣＣ−ＧＡＧＧＡＣＣＡ ＧＧＣＧＧＧＧＣＣＴＧＡＧＧＴＣＣＧＣＧＧＧＴＡＣＴＧＧ−Ｓｐｅｌ　５ａ ｕｌ　（ＢａｍＨ］） ＣＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＴＧＡＡＧＡＣＴＡＧＴＣＣＴＴＡＧＧＧＧＴＣＴ ＧＴＴＧＣＧＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧ合成片１ ２Ａ／Ｂ Ｓｐｅ　Ｉ ＣＴＡＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＣＴＧＣＴＣＴＡＡＣＡＴＧＡＴＣＧＡＴＣＡＡ− ＡＡＣＣＣＡＡＴＴＧＡＣＧＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＡＧＣＴＡＣＴＴ−ｂａｌ ＡＴＴＡＴＡＡＣＡＣＡＣＴＴＡＡＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＴＧＣＣＴＣＴＴ −ＴＡＡＴＡＴＴＧＴＧＴＧＡＡＴＴＴＣＧＴＣＧＧＴＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＡ Ａ−ＣＴＡＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＴＧＡＴＣＴＧＡＡＧＴＴＧ 合成片１３Ａ／Ｂ ＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＧＡＣＡＴＴＣＴＧＡＴＧＧＡＡ−ＴＴＧＧＡＧＴＴ ＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＴＡＡＧＡＣＴＡＣＣＴＴ−Ｘｍａ　Ｉ　Ｉ 　Ｉ ＡＡＴＡＡＣＣＴＴＣＧＡＣＧＧＣＣＧＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＣＡＴＴＣＡＡＣ −ＴＴＡＴＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＴＧＧＡＣＣＴＣＣＧＴＡＡＧＴＴ Ｇ−ＴＣＣＣＧＡＣＡＧＴＴＣＴＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＣＧＣＡＧＧＡＡＴ合 成片１４Ａ／Ｂ １ｕｌ ＣＧＣＧＴＣＡＧＣＡＡＴＴＧＡＧＡＧＣＡＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴＣＴＣ−Ａ ＧＴＣＧＴＴＡＡＣＴＣＴＣＧＴＡＡＧＡＡＴＴＴＴＴＡＧＡＧ−ＣＴＧＣＣＡ ＴＧＴＣＴＧＣＣＣ ＡＣＧＧＴ 合成片１５Ａ／Ｂ ａｃＩＩ ＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＧＧＣＡＣＣＣＡＣＧＣＧＡＣＡＴ−ＡＣＡＧＡＣＧＧ ＧＧＡＣＣＧＧＴＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＣＧＣＴＧＴＡ−ＣＣＡＡＴＣＣ ＡＴＡＴＣＡＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＡＴＴ−ＧＧＴＴＡＧＧＴＡＴＡＧ ＴＴＣＣＴＧＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＡＡ−ＥｃｏＲＩ　（Ｓａｕｌ） ＧＡＡＴＴＣＣＣ ＣＴＴＡＡＧＧＧＡＡＴ 合成片１６Ａ／Ｂ ＥｃｏＲＩ ＴＴＣＣＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＣＧＴＴＣＴＡＴＣＴＧ−ＡＡＧＧＣＣＴＣ ＣＴＴＴＧＡＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＧＡＣ−ＡＡＡＡＣＣＣＴＴＧＡＧＡＡＴ ＴＴＴＧＧ 合成片１７Ａ／Ｂ ＧＣＧＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡｑＡＣＧＡＣＴ−ＧＡＡＣＴＣＴＴＡＣＧＣＧＴ ＣＣＧＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡ−ＮｈｅＩ　（Ｓａｕｌ） ＴＴＧＴＣＧＣＴＡＧＣＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＣＣＡＡＣＡＧＣＧＡＴＣＧＣＴ ＡＧＡＡＡＡＴＣＧＧＡＴＴ合成片１８Ａ／Ｂ 実施例■　ヒトＩ　Ｌ−３ミユーテインＬｅｕ１３１の構築と発現 １３１位のＩｌｅを、ヒトＩ　Ｌ−３ミユーテインＬｅｕ１３１を形成するため 、Ｌｅｕに変更する。実施例■の全ヒトＩ　Ｌ−３遺伝子を含むｐｃＤプラスミ ドをＳ−ａ　ｕ工とＮｈｅＩで消化する。大きい断片を分離して、標準的Ｔ４リ ガーゼ溶液中で下の合成片と結合する：得られたｐｃＤベクターを大腸菌ＭＣ１ ０６１内で増幅し、分離して、上記の方法に従って、ｃｏｓ７サル細胞へトラン スフェクションさせる。３〜４日のインキュベーションののち、Ｃ０８７培養上 清を回収して、ｃｓＦ活性についてアッセイする。

実施例■　ヒトＩ　Ｌ−３ミユーテインＩｌｅ”のｉ築と発現 ２位のＭｅｔを、ヒトＩ　Ｌ−３ミユーテインｌ１ｅ２を形成するためＩｌｅに 変更する。実施例Ｈの全ヒトＩＬ−３遺伝子を含むｐｃＤプラスミドをＮａｒＩ と５ｐｅＩで消化する。大きい断片を分離して、標準的Ｔ４リガーゼ溶液中で下 の合成片と結合する：生じたｐｃＤベクターは大腸菌ＭＣ１０６１内で増幅させ 、分離して、上記手順に従ってＣＯ３７サル細胞へトランスフェクションさせる 。３〜４日のインキュベーションの後、Ｃ０８７培養上清を回収して、Ｃ８Ｆ活 性に関してアッセイする。

本発明の上記態様の記載は、説明と例示のみを目的としている。これらの記載が 全てを網羅しているわけではなく、本発明は記載された形態のみに限定されるも のではない。

出願人は、ｐ　ｃＤ−ｈｕ　Ｉ　Ｌ３−２２−１をアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクション（ロックビル。

メリーランド）（ＡＴＣＣ）に受託番号６７３１８として寄託した。

浄書（内容に変更なし） 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１００４０２ ２、発明の名称 ヒトインターロイキン−３のとそのミューティン３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国カリフォルニア用９４３０４．バロ・アルド。

カリフォルニア・アベニ、−９０１ 名　称　シエリング・バイオチック・コーポレーション４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正書の提出日 （英文３ａ頁の翻訳） （翻訳文第５頁第６行と第７行の間に挿入）ケミカルアブストラクト（Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ）、１０４巻、２５　（１９８６）、５０７頁、 ２２３６２６ａおよび２２３６２７ｂには、ある型のヒトＩＬ−３が開示されて いる。しかしながら、このヒトＩ　Ｌ−３は十分に特性が決定されておらず、そ してこのヒトＩ　Ｌ−３が前記Ｃｅｌ　１，４７．３−１６　（１９８６）に開 示されているヒト！Ｌ−３と如何なる点においても異なると仮定する根拠は存在 しない０本発明のヒトＩ　Ｌ−３は、７位でセリンの代わりにプロリンが非保存 的にアミノ酸置換していることにおいて、前記Ｃｅ１１誌のヒトＩ　Ｌ−３と異 なる。

特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１００４０２ ２、発明の名称 ３、補正をする者 名　称　シエリング・バイオチック・コーポレーション４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　平成　１年１０月　３日　［有］送日）国際調査報告

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．次式： 【配列があります】 （式中、 Ｘ（Ｓｅｒ）は、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＡｓｎを表し、 Ｘ（Ａｒｇ）は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＧｌｕを表し、 Ｘ（Ｌｅｕ）は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＭｅｔまたはＶａｌを表し 、 Ｘ（Ｐｒｏ）は、ＰｒｏまたはＡｌａを表し、Ｘ（Ｔｈｒ）は、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ 、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＨｉｓまたはＧｌｎを表し、 Ｘ（Ａｌａ）は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＴｈｒまたはＰｒｏを表し、 Ｘ（Ｖａｌ）は、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、ＩｌｅまたはＬｅｕを表し 、 Ｘ（Ｇｌｙ）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＳｅｒを表し、 Ｘ（Ｉｌｅ）は、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、ＶａｌまたはＬｅｕを表し 、 Ｘ（Ｐｈｅ）は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＬｅ ｕを表し、 Ｘ（Ｔｙｒ）は、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＬ ｅｕを表し、Ｘ（Ｈｉｓ）は、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒまたは Ａｒｇを表し、 Ｘ（Ｇｌｎ）は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、ＴｈｒまたはＡｒ ｇを表し、 Ｘ（Ａｓｎ）は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＳｅｒを表し、 Ｘ（Ｌｙｓ）は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＡｒｇを表し、 Ｘ（Ａｓｐ）は、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｓｎを表し、Ｘ（Ｇｌｕ）は、Ｇｌｕ 、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＡｒｇを表し、Ｘ（Ｍｅｔ ）は、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＴｙｒを表し、 Ｘ（Ｔｒｐ）は、Ｔｒｐを表し、 Ｗ（Ｓｅｒ）は、Ｓｅｒを表し、 Ｗ（Ａｒｇ）は、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓを表し、Ｗ（Ｌｅｕ）は、Ｌｅｕ 、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＭｅｔを表し、 Ｗ（Ｐｒｏ）は、ＰｒｏまたはＡｌａを表し、Ｗ（Ｔｈｒ）は、Ｔｈｒを表し、 Ｗ（Ａｌａ）は、ＡｌａまたはＰｒｏを表し、Ｗ（Ｖａｌ）は、Ｖａｌ、Ｍｅｔ またはＩｌｅを表し、Ｗ（Ｇｌｙ）はＧｌｙを表し、 Ｗ（Ｉｌｅ）は、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＶａｌまたはＬｅｕを表し、 Ｗ（Ｐｈｅ）は、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、ＩｌｅまたはＬｅｕを表し、 Ｗ（Ｔｙｒ）は、ＴｙｒまたはＰｈｅを表し、Ｗ（Ｈｉｓ）は、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ またはＡｒｇを表し、Ｗ（Ｇｌｎ）は、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＨｉｓを表し、Ｗ （Ａｓｎ）は、ＡｓｎまたはＡｓｐを表し、Ｗ（Ｌｙｓ）は、ＬｙｓまたはＡｒ ｇを表し、Ｗ（Ａｓｐ）は、ＡｓｐまたはＡｓｎを表し、Ｗ（ＧＩｕ）は、Ｇｌ ｕまたはＧｌｎを表し、Ｗ（Ｍｅｔ）は、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌまた はＬｅｕを表し、そして Ｗ（Ｔｒｐ）は、Ｔｒｐを表す。） で表される、１０箇所まで置換されていてよいが、アミノ酸１０〜３２（両端を 含む）、４７〜６０（両端を含む）、７１〜８６（両端を含む）および９５〜１ １３（両端を含む）で規定される領域では全部で３箇所より多くは置換されてい ない、グリコシル化された又はグリコシル化されていないポリペプチドからなる 、コロニー刺激因子活性を有する蛋白質。
2. ２．アミノ酸１０〜３２（両端を含む）、４７〜６０（両端を含む）、７１〜８ ６（両端を含む）および９５〜１１３（両端を含む）で規定される領域では全部 で１箇所より多くは置換されていないことを条件に、該ポリペプチドが５箇所ま で置換されていてよい、請求項１記載の蛋白質。
3. ３．アミノ酸１０〜３２（両端を含む）、４７〜６０（両端を含む）、７１〜８ ６（両端を含む）および９５〜１１３（両端を含む）で規定される領域では置換 されていないことを条件に、該ポリペプチドが２箇所まで置換されていてよい、 請求項２記載の蛋白質。
4. ４．前記式中、 Ｘ（Ｓｅｒ）は、Ｓｅｒを表し、 Ｘ（Ａｒｇ）は、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓを表し、Ｘ（Ｌｅｕ）は、Ｌｅｕ 、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＭｅｔを表し、 Ｘ（Ｐｒｏ）は、ＰｒｏまたはＡｌａを表し、Ｘ（Ｔｈｒ）は、Ｔｈｒを表し、 Ｘ（Ａｌａ）は、ＡｌａまたはＰｒｏを表し、Ｘ（Ｖａｌ）は、Ｖａｌ、Ｍｅｔ またはＩｌｅを表し、Ｘ（Ｇｌｙ）は、Ｇｌｙを表し、 Ｘ（Ｉｌｅ）は、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＶａｌまたはＬｅｕを表し、 Ｘ（Ｐｈｅ）は、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、ＩｌｅまたはＬｅｕを表し、 Ｘ（Ｔｙｒ）は、ＴｙｒまたはＰｈｅを表し、Ｘ（Ｈｉｓ）は、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ またはＡｒｇを表し、Ｘ（Ｇｌｎ）は、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＨｉｓを表し、Ｘ （Ａｓｎ）は、ＡｓｎまたはＡｓｐを表し、Ｘ（Ｌｙｓ）は、ＬｙｓまたはＡｒ ｇを表し、Ｘ（Ａｓｐ）は、ＡｓｐまたはＡｓｎを表し、Ｘ（Ｇｌｕ）は、Ｇｌ ｕまたはＧｌｎを表し、Ｘ（Ｍｅｔ）は、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌまた はＬｅｕを表し、 Ｗ（Ａｒｇ）は、Ａｒｇを表し、 Ｗ（Ｌｅｕ）は、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔを表し、Ｗ（Ｐｒｏ）は、Ｐｒｏ を表し、 Ｗ（Ａｌａ）は、Ａｌａを表し、 Ｗ（Ｖａｌ）は、Ｖａｌを表し、 Ｗ（Ｉｌｅ）は、Ｉｌｅ、ＭｅｔまたはＬｅｕを表し、Ｗ（Ｐｈｅ）は、Ｐｈｅ を表し、 Ｗ（Ｔｙｒ）は、Ｔｙｒを表し、 Ｗ（Ｈｉｓ）は、Ｈｉｓを表し、 Ｗ（Ｇｌｎ）は、Ｇｌｎを表し、 Ｗ（Ａｓｎ）は、Ａｓｎを表し、 Ｗ（Ｌｙｓ）は、Ｌｙｓを表し、 Ｗ（Ａｓｐ）は、Ａｓｐを表し、 Ｗ（Ｇｌｕ）は、Ｇｌｕを表し、そしてＷ（Ｍｅｔ）は、Ｍｅｔ、Ｉｌｅまたは Ｌｅｕを表す、請求項１記載の蛋白質。
5. ５．アミノ酸１０〜３２（両端を含む）、４７〜６０（両端を含む）、７１〜８ ６（両端を含む）および９５〜１１３（両端を含む）で規定される領域では全部 で１箇所より多くは置換されていないことを条件に、該ポリペプチドが５箇所ま で置換されていてよい、請求項４記載の蛋白質。
6. ６．アミノ酸１０〜３２（両端を含む）、４７〜６０（両端を含む）、７１〜８ ６（両端を含む）および９５〜１１３（両端を含む）で規定される領域では置換 されていないことを条件に、該ポリペプチドが２箇所まで置換されていてよい、 請求項５記載の蛋白質。
7. ７．前記式中、 Ｘ（Ａｒｇ）は、Ａｒｇを表し、 Ｘ（Ｌｅｕ）は、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔを表し、Ｘ（Ｐｒｏ）は、Ｐｒｏ を表し、 Ｘ（Ａｌａ）は、Ａｌａを表し、 Ｘ（Ｖａｌ）は、Ｖａ１を表し、 Ｘ（Ｉｌｅ）は、Ｉｌｅ、ＭｅｔまたはＬｅｕを表し、Ｘ（Ｐｈｅ）は、Ｐｈｅ を表し、 Ｘ（Ｔｙｒ）は、Ｔｙｒを表し、 Ｘ（Ｈｉｓ）は、Ｈｉｓを表し、 Ｘ（Ｇｌｎ）は、Ｇｌｎを表し、 Ｘ（Ａｓｎ）は、Ａｓｎを表し、 Ｘ（Ｌｙｓ）は、Ｌｙｓを表し、 Ｘ（Ａｓｐ）は、Ａｓｐを表し、 Ｘ（Ｇｌｕ）は、Ｇｌｕを表し、 Ｘ（Ｍｅｔ）は、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕを表し、Ｗ（Ｌｅｕ）は、Ｌｅｕ を表し、 Ｗ（Ｉｌｅ）は、Ｉｌｅを表し、そしてＷ（Ｍｅｔ）は、Ｍｅｔを表す、 請求項４記載の蛋白質。
8. ８．アミノ酸１０〜３２（両端を含む）、４７〜６０（両端を含む）、７１〜８ ６（両端を含む）および９５〜１１３（両端を含む）で規定される領域では全部 で１箇所より多くは置換されていないことを条件に、該ポリペプチドが５箇所ま で置換されていてよい、請求項７記載の蛋白質。
9. ９．アミノ酸１０〜３２（両端を含む）、４７〜６０（両端を含む）、７１〜８ ６（両端を含む）および９５〜１１３（両端を含む）で規定される領域では置換 されていないことを条件に、該グリコシル化された又はグリコシル化されていな いポリペプチドが２箇所まで置換されていてよい、請求項８記載の蛋白質。
10. １０．前記グリコシル化された又はグリコシル化されていないポリペプチドが、 次式： 【配列があります】 で表されるアミノ酸配列を有する、請求項９記載の蛋白質。
11. １１．請求項１において与えられた式で規定されるアミノ酸配列を有し、５箇所 まで挿入、５箇所まで削除および５箇所まで置換されていてよいが、アミノ酸１ ０〜３２（両端を含む）、４７〜６０（両端を含む）、７１〜８６（両端を含む ）および９５〜１１３（両端を含む）で規定される領域では３箇所より多くは置 換されていない、グリコシル化された又はグリコシル化されていないポリペプチ ドからなる、コロニー刺激因子活性を有する蛋白質。
12. １２．アミノ酸１０〜３２（両端を含む）、４７〜６０（両端を含む）、７１〜 ８６（両端を含む）および９５〜１１３（両端を含む）で規定される領域では置 換も削除も挿入も受けていないことを条件に、前記ポリペプチドが２箇所までの 挿入、２箇所までの削除および２箇所までの置換を受けていてよい、請求項１１ 記載の蛋白質。
13. １３．ポリペプチドが、次式： 【配列があります】 で表される、請求項１２記載の蛋白質。
14. １４．請求項１における式で表される、１０箇所まで置換されていてよいが、ア ミノ酸１０〜３２（両端を含む）、４７〜６０（両端を含む）、７１〜８６（両 端を含む）および９５〜１１３（両端を含む）で規定される領域では全部で３箇 所より多くは置換されていないポリペプチドをコードすることができるヌクレオ チド配列から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸。
15. １５．ヌクレオチド配列が、請求項１０で与えられた式で表されるポリペプチド をコードすることができるヌクレオチド配列から選択される、請求項１４記載の 核酸。
16. １６．（ａ）請求項１における式で表される１０箇所まで置換されていてよいが 、アミノ酸１０〜３２（両端を含む）、４７〜６０（両端を含む）、７１〜８６ （両端を含む）および９５〜１１３（両端を含む）で規定される領域では全部で ３箇所より多くは置換されていないポリペプチドをコードすることができ、且つ 下記ベクターを含む宿主によって発現されうるヌクレオチド配列から選択される ヌクレオチド配列を含むベクターを組み立て、（ｂ）上記ベクターを宿主内に導 入し、そして（ｃ）上記宿主を、上記ヌクレオチド配列がポリペプチドへ発現さ れるために適する条件下で培養培地内に維持する、 工程からなる、コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドの製造方法。
17. １７．ヌクレオチド配列が、請求項１０で与えられた式で表されるポリペプチド をコードすることができるヌクレオチド配列から選択される、請求項１６記載の 方法。
18. １８．ポリペプチドを培養培地および宿主から分離する工程を更に含む、請求項 １７記載の方法。
19. １９．治療学的に許容される担体および有効量の請求項１で定義された蛋白質を 含有してなる、血球の増殖および発達を生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）または生体 内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で刺激するための薬剤組成物。
20. ２０．前記蛋白質が、請求項１０における式またはその先頭にＡｌａがついた式 で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１９記載の薬剤組成物。