JPH01502157A - ヒトｉｌ―３の分子クローン化および発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒ）ＩＬ−３の分子クローン化および発現発明の分野 本発明はヒトインターロイキン３　（ｈｌＬ−３）をエンコードするｃＤＮＡ並 びに、中でも微生物、殊に酵母、細菌および真菌、組織培養細胞並びに形質転換 した動物および植物を含む種々の生物体中のクローン化および発現におけるその 使用に関する。

発明の背景 造血には、すべての型の成熟血液細胞および若干の特定組繊細胞中への多分化能 性前駆細胞の能動的な増殖および分化過程が包含される０機能血液細胞の生産は 特殊タンパク質、造血増殖因子ｔＱ（ＨＧＦｓ）により調節される。ＨＧＦｓの 若干は特定成熟系の成熟を制御するが、他は前駆物質の増殖および分化を多くの 経路を通して刺激する。造血分化過程の我々の知識の多くは精製増殖因子を用い る試験管内および生体内のマウスの研究から得られた。マウス増殖因子インター ロイキン３（ｍｌＬ−３）は、またＭｕｌｔｉ　ＣＳ　Ｆ、マスト細胞増殖因子 、幹細胞活性化因子または他の若干の名称をつけられ、ＲＥＫコロニー検定によ り検出されるように発注的に初期の多分化能性細胞（ＣＦＵ−３）の増殖を刺激 し、赤芽球、巨核球、顆粒球／マクロファージ、骨芽細胞および若干の他の系を 通して前駆細胞の生産を生ずる。さらに、ｍ１Ｌ−３は多分化能性幹細胞の複製 に、おそらく他のＨＧＦとの相互作用に関連づけられた。

近年、若干のグループがｍ１Ｌ−３ｃＤＮＡのクローン化に成功した。ｍ１Ｌ− ３ＤＮＡをプローブとして用いるヒトＤＮＡ中の相同配列を確認した結果は全く 報告されていない、おそらく、ヒト遺伝子はｍＩＬ−３遺伝子から広範に分岐し たがまたは霊長動物の進化の間にその機能を失なった。しがし、ヒト白血球はマ ウスＣＦＵ−５の増殖の支持においてｍＩＬ−３を置換できるＨＧＦ（ｉ）を生 産することが認められた。従って、ｍ１Ｌ−３と生物学的性質を共有し、従って ヒト同族体であることができるヒトＨＧＦの存在が仮定された。ヤン（Ｙａｎｇ 、　Ｙ　Ｃ）　ホカ、セル（Ｃｅｌｌ）、（１９８６）４７：３〜１０．１０月 １０日付、はテナガザルＴ細胞のＩＬ−３ＰＪ活性を有するタンパク質をエンコ ードするＣＤＮＡ、およびヒト同等物をエンコードするゲノムＤＮＡのレトリー バルを開示している。ヒトＩＬ−３をエンコードするｃＤＮＡの配列はヤン（Ｙ ａｎｇ　）ほかにより発表されたヒト遺伝子配列から演鐸することができる。し かし、前記論文はヒトＩＬ−３をエンコードするＣＤＮＡを分離する方法を開示 または教示せず、またｈｌＬ−３の生産が達成されなかった０本発明はヒトＩＬ −３に対する全コーディング配列を含むｃＤＮＡの分離を初めて開示する。

ヒトＩＬ−３タンパク質はいまだかつて精製形態で調製されず、また一定の試験 管内増殖検定におけるその活性および演鐸−次構造以外のその特性が開示されな かった０本発明は精製ヒ）ＩＬ−３の回収、およびｃＤＮＡクローンからの組換 生産によるその特性の確認を可能にする。

発明の概要 前記のように、本発明はさし当りヒトＩＬ−３に対する全コーディング配列を含 むｃＤＮＡの分離を記載する。マウスおよびヒ）ＩＬ−３をコードするＤＮＡ配 列間の低度の相同性はｍ１Ｌ−３コーディング配列とのハイブリッド形成による ｈ　Ｉ　Ｌ−３に対するｃＤＮＡのレトリーバルを可能にしない、意外にも、ｈ ｌＬ−３ｃＤＮＡクローンを、ｃＤＮＡの３′非コーディング部におけるむしろ 高度の相同性を利用することにより分離することができた。ｃＤＮＡクローンの 利用性は広範囲の宿主生物体によるｈｌＬ−３の生産を可能にする。大規模生産 の後、タンパク質を精製し、治療に用いることができる。

本発明はヒトＩＬ−３タンパク質をエンコードするｃＤＮＡ配列の転写および翻 訳により広範囲の宿主細胞中の組換ヒ）ＩＬ−３タンパク質の生産を可能にする 。タンパク質の生産は以下にＥ。

コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）、　ＣＯＳ細胞、Ｃ１２７細胞、Ｂ、サチリス（Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓ　）およびＢ、リシエニフオルミス（Ｂ、　１ｊｃｈｅｎｉｆ ｏｒｓｉｓ）。

Ｓ、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）およびに、ラクチス（Ｌｌａ ｃｔｉｓ　）を含む若干の宿主中で例示される。適当な発現系を用いる他の宿主 中の生産もまたイントロンのないｃＤＮＡを準備することにより可能にされる。

より一般的には、組換タンパク質の満足な生産を示すコロニーの確認を可能にす る抗ヒ）ＩＬ−３抗体の利用性が任意の組換系からのヒ）　Ｉ　Ｌ−３の生産を 援助する。

従って、−観点において本発明はヒ）ＩＬ−３タンパク質をエンコードする組換 体の、イントロンのないＤＮＡを指向する。

他の観点において本発明は、ｈｌＬ−３をエンコードする前記ＤＮＡ配列の発現 を適当な宿主中で行なうことができる発現系を指向する。

他の観点において本発明は、グリコジル化または非グリコジル化形態の組換ヒ） 　Ｉ　Ｌ−３タンパク質、前記タンパク質に通常伴なわれる物質のないヒトＩＬ −３、およびこれらの組換体または精製タンパク質と特異的反応性の抗体を指向 する。

図面の簡単な説明 第１図はヒトｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　ＦおよびマウスＩＬ−３のＤＮＡおよびタン パク質配列の比較を示す、　ｈｍｕｌｔｉ　ＣＳ　Ｆタンパク質およびＤＮＡ配 列（クローンＤ１１、上列）がｍｌＬ　８ｃＤＮＡ（１１，３５）およびタンパ ク質配列（３ｏ）とともに配列された０等しいヌクレオチドが垂直線により示さ れ、等しいアミノ酸がボックス中に示される。黒点はポリアデニル化シグナル配 列を示し、水平バーはＡＴＴＴＡ反復単位を示す。

第２図はヒトＩＬ−３ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＬＢ４の構築を示す、Ｅ−Ｅ ｃｏＲＬ　Ｓｍ＝Ｓｍａｌ　Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｓ−３ｓｔｌ、に−Ｋｐｎｌ。

第３図はヒト骨髄前駆物質に対するＣＯ３／ｐＬＢ４の生物活性を示す、赤芽球 （ＢＦＵ−Ｅ）　、Ｈ粒球−マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）　、顆粒球（ＣＦ Ｕ−Ｇ）　、好酸球（ＣＦＬＩ　−Ｅ、）、マクＣ１ファージ（ＣＦＵ−Ｍ）お よび混合（ＣＦＵ−ＭＩＸ）、ｍ口二一の平均数（±ＳＤ）は変量のＣＯ３／ｐ 　ＬＢ　４　ＣＭで刺激した重複培養に対して示されている。

第４図はコロニー培養検定（パネルＡ）およびＤＮＡ合成（”［１−ＴｄＲ取込 み）検定（パネルＢ）において評価したＡＭＬ増殖第５図はＥ、コリ（Ｅ、　ｃ ｏｌｉ　）発現ベクターｐＧＢ／ＩＬ−３０１、ｐＧＢ／ＩＬ−３０２、ｐＧＢ ／ＩＬ−３０３、ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０４、ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０５およびｐＧ Ｂ／ＩＬ−３０６の構築線図を示す、この図においてＸはＸｈｏｌ、ＥはＥｃ。

Ｒ１，ＢはＢａｍＨｌおよびＡはＡｖａ１部位を表わす。

第６図はｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）製）およびその 誘導体ｐＴｌ中のマルチクローン化部位の配列を示す。

第７図はｈｓ＋ｕｌｔｉ　ＣＳ　Ｆ発現クローンの略図を示す、真核生物発現プ ラスミドｐＬＢ４およびｐＬＨｌに対して隼にｈｍｕｌｔｉ−Ｃ３Ｆ　ｃＤＮＡ 挿入断片のみが示される。リーダーペプチド（口２０）および成熟ｈａｕｌｔｉ 　ＣＳ　Ｆタンパク質（−■■）コーディング領域がボックス中に示される＊　 ｂｓ＋ｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆの細菌発現クローン（ｐＬＨｌから誘導）はＩａｃ 　Ｚおよびマルチリンカ−タンパク質コーディング領域（こココ）、ｈｓｕｌｔ ｉ　−ＣＳ　Ｆの５′末端非コーデイング領域（口ココ）およびｈｍｕｌｔｉ　 ＣＳ　Ｆコーディング領域を含む、矢印は個々のベクター中に使用されるＡＴＧ 出発コドンを示す。

第８図は種々の細菌発現ベクターに対するｌａｃ　Ｚ　／　ｈｍｕｌｔｉ　−Ｃ ３Ｆ　ＤＮＡの融合領域の配列を示す、クローンの配列はｐＵＣ８またはｐＴＺ １８Ｒ（下段文字）中のｌａｃ　Ｚタンパク質の出発点からおよびｈｍｕｌｔｉ −ＣＳＦ　ＤＮＡ配列の位置１５８におけるＣｌａｌ部位まで示される。　ｈｍ ｕｌｔｉ　Ｃ５Ｆ　ＤＮＡ配列中の変異は下線が付され、Ｌｒｐ′３−ａｒｇ１ ３（ｐ　ＧＢ／　Ｉ　Ｌ　−３０２）　；ｌｅｕ”−＊ｐｒｏ”およびｔｒｐ” 　→ａｒｇ”　（ｐ　ＧＢ／　Ｉ　Ｌ　−３０３）　；ｍｅｔ”−ｅｔｈｒ”お よびサイレント変化（ｐＧＢ／ＩＬ−３０４）を生ずる。肩付数字は成熟タンパ ク質のアミノ酸残基番号を示す。

第９図はｐＧＢ／ＩＬ−３０１およびｐＧＢ／ＩＬ−３０２を含む細菌から生産 された細菌のｈｍｕｌｔｉ　ＣＳ　Ｆのポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す 。

第１θ図はＡＭＬ芽球細胞のｈｍｕｌｔｉ　ＣＳ　Ｆ融合タンパク質の力価測定 を示す。

第１１図はｐＧＢ／ＩＬ−３０１で形質転換ＬりＥ、　：２　＋）　（Ｅ。

ｃｏｌｉ　）の溶解物から分離された２１ｋｄタンパク質に対して生じたウサギ 抗血清のＩＬ−３特異性反応を示すウェスタンプロットを示す。

第１２図はＩＬ−３活性に対する第１１図の抗血清の効果を示す。

第１３図はプラスミドｐＧＢ／ＩＬ−３０７の略図を示す。

ボックス（αココ）はヒトＩＬ−３コーディング配列を示す。融合タンパク質の Ｎ末端アミノ酸は図の下部に示される。

第１４図はプラスミドｐＧＢ／ＩＬ−３０８の略図を示す。プロモーター領域の ヌクレオチド配列が図の下部に示される。

第１５図はプラスミドｐＧＢ／ＩＬ−３０９の構築を示す。

初めのボックス（ココ）はヒトＩＬ−３配列の一部、すなわち成熟タンパク質の シグナル配列プラス２０アミノ酸を示す。他のボックス（巨ミョ）はＩＬ−３ｃ ＤＮＡ配列の３′非コーデイング領域の部分を示す。

第１６図はプラスミドｐＧＢ／ＩＬ−３１０の略図である。

第１７図はプラスミドｐＢＨＡ１のヌクレオチド配列を示す。

第１８図はプラスミドｐＧＢ／ＩＬ−３１１およびｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３１２の構 築を示す。ボックス（ｃｚｚｚコ）は前駆物質ヒトＩＬ−３コーディング領域を 示す。

第１９図はプラスミドｐＧＢ／ｌ　Ｌ−３１３の構築を示す。

ＩＬ／３配列の５′側における配列が図の下部に示される。

第２０図はプラスミドｐＧＢ／Ｔ　Ｌ−３１７の略図を示す。

第２１図はプラスミドｐＧＢ／ＩＬ−３１６の略図を示す。

第２２図はラクターゼプロモーター中の特有５ａｃＩＩａＥ位とターミネータ− の後方の旧ｎｄｎ［部位との間のプラスミドｐＧＢ／ＩＬ−３１６のヌクレオチ ド配列（残基４４５７〜？２０４）を示す。

第２３図はラクターゼプロモーター中の特有Ｓａｃ■部位とターミネータ−後方 のＨｉｎｄｍ部位との間のプラスミドｐＧＢ／ＩＬ−３１８のヌクレオチド配列 （残基４４５７〜７１９０）を示す。

第２４図はプラスミドｐＧＢ／ＴＥＦａｃｔ上に存在するＥＦ−１αプロモータ ー、５ａｌｌ　−ＢｇｌＩＩ−Ｘｈｏｌリンカ−およびアク手ン々−臂÷−カー 小マカ１ノ千二ｖＱη曹え千す発明の詳細な説明 −Ｃ３ＦＪおよびｒｈｍｕｌｔｉ−Ｃ３ＦＪは同義に使用され、次の活性を示す タンパク質調製物を示す： １、　タンパク質が、形成されるコロニーが赤芽球、顆粒球、顆粒球マクロファ ージおよび混合を含む、ヒト造血前駆細胞によるコロニー形成を刺激する。

２、　タンパク質が、例えば標識チミジン取込みにより立証されるように、ヒト 急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）芽球によるＤＮＡ合成を刺激する。

ｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆの定義を適合させると、前記検出における活性は、こ れらの抗体もまた下記例示ｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆによるこれらの活性を阻止 しなければ、ＧＭ−ＣＳＦに応答して生じたそれに対し免疫特異性の抗体により 実質的に阻止されてはならない。

ｈｍｕｌｔｉ　ＣＳ　Ｆの１例示形態は第１図に１９個のアミノ酸シグナル配列 を有する１３３個のアミノ酸成熟タンパク質として示される。第１図のアミノ酸 配列は、ヤン（Ｙａｎｇ　）タンパク質のＳｅｔがこ＼にＰｒｏにより置換され ている成熟タンパク質の位置８を除いてヤン（Ｙａｎｇ、　Ｙ−Ｃ，）ほか、セ ル（Ｃｅｌｌ）（１９８６）４７：３〜１０（前掲）により開示されたものに一 致する。こ−に示されるように、このアミノ酸配列はその非グリコジル化形態に おいて有効である。しかし、それは２つのグリコジル化部位を含み、グリコジル 化形態もまた本発明の範囲内に包含される。タンパク質は酸付加塩形態、塩基塩 形態で存在することができ、あるいはその周囲のｐａにより中性であることがで きることもまた認められる。リン酸化、アセチル化などによる、活性が破壊され ない程度の誘導体化もまた本発明の範囲内に包含されるタンパク質を生ずる。

全配列が活性に対し必要でないかもしれないこともまた認められる。アミノ酸配 列の一部を、生物活性を保持して欠失または置換することができる。こ−に例示 するように、融合ペプチド配列の残基の配列により置換されれば、初めの１４ア ミノ酸残基程度の数であることができるので、位Ｗ１におけるアラニンが欠失ま たは置換されることができる。さらにマウス形態のタンパク質は活性に対し車に 初めの７９残基を必要とすると思われ；これはヒト同等物の初めの８３残基にほ り相当する。従って、タンパク質の初めの８３アミノ酸残基のみを含むフラグメ ント、およびそのＮ末端置換形態もまた本発明の範囲内に包含される。さらに、 成熟ｈｌＬ−３のＮ末端が残基ａｌａ　−ｐｒｏ　−ｓｅｔなどにより形成され ることもまた考慮すべきである（第１図参照）、タンパク質が酵母宿主により分 泌されたとき、若干の場合にジペプチジルアミノペプチダーゼとの相互作用のた めに２つのアミノｆｌｌ　（ａｌａ−ｐｒｏ）だけ短縮されることができること が知られる（７２）、Ｎ末端アラニンおよびプロリンのないｈ　Ｔ　Ｌ−３はな おその生物活性を保持する。Ｘ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ遺伝 子のヌル変異をもつ酵母株は完全ｈｌＬ−３（アミノ酸１〜１３３）を生ずる。

従って、本発明のｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆ　ｓにはＸプロリルジペプチジルアミ ノペプチダーゼ変異体および野生型宿主によりそれぞれ生産されたＮ末端アラニ ンおよびプロリンを含むものおよび含まないものが包含される。

原核宿主中に成熟タンパク質として生産されたとき、成熟タンパク質に対するコ ーディング配列はＡＴＧ出発コドンにより先行される。生ずるＮ末端メチオニン は、次いで細菌宿主内のプロセシングにより次のアミノ酸配列の性質により除去 または部分的に除去されることができる。再び、両形態のｈｌＬ−３が生物活性 である。従って、本発明のｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆ　ｓにはＮ末端メチオニン を含むものおよび含まないものが含まれる。

前記から、生物学的機能に影響を与えないでアミノ酸変換をヒ）ＩＬ−３タンパ ク質中へ導入できることが明らかである。エンコードされた残基の化学修飾、種 々の残基の置換、あるいは１個またはそれ以上の、しかし好ましくは１個の残基 の欠失または付加によるアミノ酸配列中の小変換が、活性を保持するタンパク質 を生ずることが認められる。従って、非破壊変異、殊に天然存在対立遺伝子変異 および活性に対して非致死である他の変異もまた本発明に包含される。

一方、ヒトＩＬ−３タンパク質中のアミノ酸変換がタンパク質の治療使用に有益 であることができることを考慮すべきである。

こ−に認められるように、成熟タンパク質は残基１５〜３６．５４〜６１．７４ 〜９１および１０７〜１１８における４保存ドメインを有する。非保存領域１〜 １４（これらはとにかく宿主由来融合タンパク質の配列により置換できる）、３ ７〜５３．６２〜７３．９２〜１０６および１１９〜１３３内に１つおよび多重 のアミノ酸変換を含むタンパク質が可能である。しかし、位置１６および８４に おけるシスティン残基は、それらが種間に保存されるのでジスルフィド架橋形成 に必要であると思われる。上記保存ドメインの変換がタンパク質の生物学的性質 、例えば受容体結合およびシグナル導入に影響を与えることができる。改変性質 を有するｈＴＬ−３を治療に使用することがもくろまれる。公知タンパク質工学 手法により作ることができるｈ　Ｉ　Ｌ−３の誘導体は本発明の範囲内にあると 理解すべきである。

タンパク質調製物はｈｓｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆペプチドをモノマー形態または、 凝集体が前記活性を保持すれば凝集形態で含むことができる。

こ〜に用いた「発現系」という語は、発現を望むコーディング配列および適当な 制御配列の両方を、中に発現系が配置された宿主に制御配列が適合するときに発 現を可能にする作動可能な連鎖内に含むＤＮＡ配列を示す、一般に理解されるよ うに、「制御配列」という語はコーディング配列と作動可能に連結され、その発 現に必要であるかまたはそれをｔ）ｉＪ節するＤＮＡセグメントを示す。

すべての宿主に対する制御配列はその環境の調節により制御できるかまたは制御 できないかもしれないプロモーターを含む、原核生物に適する典型的なプロモー ターには、例えばｔｒｐプロモーター（トリプトファン欠如により誘発される） 　、ｌａｃプロモーター（ガラクトース類位体Ｉ　ＰＴＧにより誘発される）、 β−ラクタマーゼプロモーター、およびファージ由来ＰＬプロモーター（温度変 化により誘発される）が含まれる。さらに、殊にバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ）中の発現に対し、有用なプロモーターにはα−アミラーゼ、プロテアーゼ、Ｓ ｐｏ　２に対するものおよび合成プロモーター配列が包含される。酵母中の発現 に対するプロモーターには３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターおよび 他の解糖酵素に対するもの、並びにアルコールデヒドロゲナーゼおよび酵母ホス ファターゼに対するプロモーター領域が包含される。転写延長因子（ＴＥＦ）お よびラクターゼプロモーターもまたを用である。哺乳動物の発現は一般にウィル ス由来プロモーター例えばアデノウィルスプロモーターおよびＳＶ４０プロモー ター系を用いるが、しかしそれらにはまた調節可能なプロモーター例えば重金属 またはグルココルチコイド濃度により制御されるメタロチオネインプロモーター が包含される。現在利用できるウィルス基昆虫細胞発現系、並びに植物細胞プロ モーター例えばツバリンシンテターゼプロモーターに基く発現系もまた存在する 。

ＲＮＡポリメラーゼによる遺伝子の転写に必要であるプロモーターＤＮＡ配列に 加えて、終結（例えば真核系中にポリアデニル化配列を生ずる）を調節するもの を含む種々の制御配列もまた発現の制御に有用である。若干の系はまた、望まし いがしかし発現を行なうのに必らずしも必要でないエンハンサ−要素を含む。

翻訳制御は原核系中でリポソーム結合部位（ＲＢＳ）を含むが、真核系において 翻訳はＡＵＧコドン付近のヌクレオチド配列により制御されることができる。

前記に含まれるように、組換タンパク質生産は細菌〔主にＥ。

コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）およびストレプト マイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　））を含む種々の宿主中、酵母および真 菌〔例えばサツカロミセス（ＳＢｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）　、タルイベロミ セス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　）およびアスペルギルス並びに哺乳動物お よび他の細胞培養例えばＣＯＳ細胞、Ｃ１２７細胞、チャイニーズハムスター卵 巣細胞、スポドプテラ・フルギベルダ（　Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐ ｅｒｄａ　）　（Ｓ　ｆ　９）細胞など中で行なうことができる．該タンパク質 は細胞内成熟または融合タンパク質として生産されることができ、あるいは適当 な適合性シグナルをエンコードするＤＮＡが遺伝子内に含まれるときに分泌され ることができる。

本発明は初めに、組換ヒトＩＬ−３の大規模生産を可能にし、このタンパク質を 次に、精製形態で、治療剤として使用できる。

こ−に記載の方法は、実質的に純粋なヒトＩＬ−３に精製できるグリコジル化並 びに非グリコジル化形態のタンパク質を生産する方法を提供する。「精製」ヒ） ＩＬ−３という語は通常それに伴なわれる他のタンパク質を含まない前記のヒト ＩＬ−３を示す。

Ｂ、ヒトＩＬ−３をエンコード　るｃＤＮＡのレトリーバルヒトＩＬ−３は次の 方策により分離された：１、　ヒト白血球による造血増殖因子類（ＨＧＦｓ）の 再生産性生産を可能にする操作を開発した。

２、ｍＲＮＡをそのような生産性細胞から調製し、二本鎖ｃＤＮＡ中へ転写した 。

３、　該ｃＤＮＡを、コーディングおよび非翻訳３′下流部の両方を含む完全ｍ １Ｌ−３ｃＤＮＡでスクリーニングしてＤｌｌを得た。

４、ハイブリッド形成ｃＤＮＡクローンＤｌｌを発現ベクターｐＬｏ中へ挿入し てｐＬＢ４を得、それをＣＯ８細胞中に発現させてヒトＩＬ−３をエンコードす る配列の存在を確認した。

これらの細胞のならし培地はｈｌＬ−３の予期生物活性を示した。

ヒトｃ　ＤＮＡは、マウスコーディング配列との相同性を著しくかいたにもか− わらず、意外な程度な程度の相同性が３′非翻訳領域中に存在したので、この操 作を用いてレトリーバルすることができた。出願人は代替種遺伝子に対するレト リーバルに３′非翻訳配列を使用する先行の開示を知らない。

より詳しくは、１２−〇−テトラデカノイルホルボルー１３アセター）　（ＴＰ Ａ）およびコンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ）の存在下に培養したリンパ球のな らし培地は、懸濁培養中のマウスＣＦＵ−３の刺激を用いる培地の検定、ｍ１Ｌ −３依存ＤＡ−１細胞の増殖、試験管内のコロニー形成によるヒト造血前駆物質 検定、および急性白血病芽球の試験管内刺激により測定してヒ）ＨＧＦｓに適す る原料である。ヒトリンパ球のｃＤＮＡライブラリーは２ｇｔ−１０フアージ（ ２０）中で構築し、ｍ１Ｌ−３関連配列の発生に対してｍ１Ｌ−３ｃＤＮＡの旧 ｎｄｌ［［−Ｘｂａｌフラグメントを用いてスクリーニングした。ハイブリッド 形成りローンが確認されなかった。

しかし、完全マウスＩＬ−３ｃＤＮＡをプローブとして用いたときに４クローン が確認された。最大クローン（Ｄｌｌ）の制限酵素分析は内部ＥｃｏＲ１部位（ 位置４１１、第１図）を含む９１０ｂｐ挿入断片を示した。

（このＥｃｏＲ１部位が２つの独立ｃＤＮＡフラグメントの連結により生じたか または天然存在部位であるかを調べた。プローブとしてクローンＤｌｌの標識し た５′および３　’　ＥｃｏＲＩフラグメントを用いた制限酵素消化ヒ）ＤＮＡ のサザン分析はＢｉｎｄｌ［［（１５ｋｂ）およびＢａ５ＨＩ　（４，６ｋｂ） による消化後に等しいＤＮＡフラグメントを示した。さらに、ＥｃｏＲ１部位の 付近のＤＮＡ配列はファージＤＮＡ中へのｃＤＮＡの挿入に用いたリンカ−配列 （ｐＣＣＧＡＡＴＴＣＧＳ）に相当せず、これらのＥｃｏＲＩフラグメントが単 −ｍＲＮＡ由来であることを示す、）ハイブリッド形成および配列決定試験から 、小クローン（■、■および■）がクローンＤｌｌの３′ヌクレオチド配列に等 しく、同−ｍＲＮＡ種由来であると結論された。

ＤｌｌｃＤＮＡおよびｍ１Ｌ−３ｃＤＮＡのコンピューター援用配列（第１図） は５′末端ＩＱＯｂｐ中、ヌクレオチド２３６〜２６９間、および３′末端領域 中のヌクレオチド５９８〜８０３間の配列相同性を示した（それぞれ６８％、７ １％および７３％）。

殊にヌクレオチド７０６〜７６３０間の領域が高度に保存され（９３％相同）、 反復ＡＴ富配列を含む、ヒトｃＤＮＡの５′末端６００ｂｐ中の低相同性（５２ ％）はｍ１Ｌ−３のＨｉｎｄＩ［［−Ｘｂａｌフラグメントとのハイブリッド形 成による検出を排除する。

エンコードされたタンパク質に対するヒトｃ　ＤＮＡクローンの分析は位置４９ ５〜４９７における終止コドンＴＧＡまでの開読み枠を示す（第１図）、初めの ＡＴＧ）リブレットはおそらくエンコードポリペプチドの実際の開始コドンであ ろう、推定エンコードタンパク質は１９個のアミノ酸の疎水性リーダータンパク 質からなり、それはおそらくグリシンおよびアラニン残基間で切断される（２２ ．２３）。

ヒトおよびマウスＩＬ−３の予期アミノ酸残基の配列（第１図）はリーダーペプ チド（残基−２６〜＋１）に対し５０％、成熟タンパク質（残基１〜１３３）に 対し２８％の相同性を示す、リーダーペプチド内に２つの４アミノ酸の保存領域 （残基−１３〜−１０および−３〜＋１）があり、その第２の領域がプロセシン グ部位を含む、成熟タンパク質は１３３個のアミノ酸の長さであり、１５ｋｄの 分子量を有する。成熟タンパク質は４つの保存ドメイン（残基１５〜３６．５４ 〜６１．７４〜９１および１０７〜１１８）を有し、２つの潜在グリコジル化部 位（残基１５〜１７および７０〜７２）を含む、ヒトタンパク質中に存在する両 システィン残基（位置１６および８４）が保存され、ジスルフィド架橋形成によ るタンパク質ひだ形成に重要な役割を演することができる。

このヒ）ｃＤＮＡがｍ１Ｌ−３に類似する機能性タンパク質をエンコードするこ とを立証するため、ＤｌｌｃＤＮＡを真核発現ベクター（ｐＬｏ、ＳＶ４０転写 単位を含む）中に挿入して発現ベクターｐＬＢ４を得、Ｃ０３Ｉ細胞に移入させ た。ＣＯ３／ｐＬＢ４ならし培地（ＣＭ）をその（１）ヒト骨髄細胞によるコロ ニー形成を刺激する能力、（２）ヒト急性骨髄性白血病（Ａ？ＩＬ）芽球を刺激 する能力について試験した。

骨髄卓球（Ｖｉａ　２陽性）およびＴリンパ球（Ｔ−３陽性）補助細胞を消耗し たヒト造血前駆物質の試験管内コロニー増殖はＣＯ５／ｐＬＢ４ＣＭにより有効 に刺激された。データはＣＯＳ／ｐＬＢ４ＣＭによる若干の造血分化系の前駆物 質の、およびＢＦＬ）−Ｈの亜集団の刺激を示す。

別の試験において骨髄を密度遠心分離、Ｔリンパ球を除＜Ｅ−ロゼツト沈降およ び単核食細胞を除く付着により前駆細胞を濃縮し、ウシ胎仔血清を含む濃厚培地 中で培養した。これらの条件のもとでＣＯ３／ｐＬＢ４ＣＭで刺激して得たコロ ニーの大部分が２つまたはそれ以上の造血分化系を含み：すべでマクロファージ であり、約１／２の未成熟芽球および（または）未熟芽球および（または）未熟 赤芽球細胞並びに（または）好中球顆粒球、さらに、少数の好塩基球または好酸 球顆粒球を含む、これらの結果はヒトｃＤＮＡクローンＤｌｌによりエンコード されたタンパク質の多基刺激性および発生的に早い多分化能性造血細胞に対する その作用を示す。

ＡＭＬ刺激に関して、５ｆｉ者のＡＭＬ芽球を、ＣＯ３／ｐＬＢ４ＣＭで刺激し 、応答について”Ｈ−ＴｄＲ取込みおよびコロニーの形成の測定により検定した 。５白血病細胞試料中の３つは再検定でＣＯ３／ｐＬＢ４ＣＭに応答し；異なる 愚者のＡＭＬ芽球のコロニー形成およびＤＮＡ合成に対する特有用量応答関係が 得られた。ＧＭ−Ｃ５Ｆに対する応答はさらにＣＯ３／ｐＬＢ４Ｃガに応答する 白血病間に表現型の差異を示した。

これらのデータはＤ１１ｃＤＮＡクローンが形質転換ＣＯ８細胞中で、培地中へ 輸送される生物活性タンパク質に対する完全な遺伝情報を含むことを示す、ヒト タンパク質とｍ１Ｌ−３との間のタンパク質配列に関する相同性の明らかな不足 （単に３０％）にもか−わらず、それらのタンパク質はそれらの生物機能に関し て匹敵する６両タンパク質は種々の系の発生初期造血前駆物質に対してそれらの 影響を及ぼす、アミノ酸水準におけ為低い相同性はまたコーディングヌクレオチ ド配列中の低い相同性により表わされる。しかし、非常に意外にも、より高度の 、ヒトｃＤＮＡクローンのレトリーバルに十分な、相同性が３′非翻訳領域中に 生じた。

ヒトＤＮＡのサザン分析は単一ハイブリッド形成遺伝子を示してこのｃＤＮＡが 密接に関連する遺伝子の群に属しないことを示す。

前記結果から我々はＤｌｌ中のヒ）ｅＤＮＡ挿入断片がｍ１Ｌ−３のヒト同族体 をエンコードすると結論する。我々はｃ　ＤＮＡクローンＤｌｌによりエンコー ドされたタンパク質に対する使用用語ｈ■ｕｌｔｉ−Ｃ３Ｆを、その主生物学的 効果および検定にてらして使用することを決定した。

ｍ１Ｌ−３ｃＤＮＡの３′末端領域とのハイブリッド形成によるｈｓｕｌｔｉ− Ｃ３Ｆ　ｃＤＮＡクローンの確認は予想されなかった。

相同ＤＮＡ配列はコーディング領域中に一般に主に認められるが、ｈｍｕｌｔｉ 　−ＣＳ　Ｆ配列は遺伝子のこの部分中に広く分散した（４５％相同）、３′末 端非コーデイング領域中の高保存ドメインの分析はすべてｍ１Ｌ−３ｃＤＮＡ中 に保存される５つのＡＴＴＴＡ反復単位の発生を示した。

ｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　ＦおよびｍＩＬ−３は他のマウスおよびヒトの増殖因子 またはリンホカイン、例えばＧＭ−Ｃ３Ｆ　（２５）　、インターロイキン２（ ２５）、インターロイキン１（２６）およびインターフェロン（２７〜２９）、 より著しく少いタンパク質相同性を示す、成熟ｍ１Ｌ−３の生物活性は、位置１ ７におけるシスティン残基に対する絶対要件（３０）を含めて初めの７９個のア ミノ酸中に含まれると思われる。このシスティン残基はｈｍｕｌｔｉ−Ｃ３Ｆ中 に保存され（第１図、位置１６）、タンパク質ひだ形成における実質的役割を演 することができる。このシスティン残基付近の潜在グリコジル化部位の発生がジ スルフィド架橋形成を妨害することができる。

Ｃ，ｈｓｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆの　および記入出願人はヒトＩＬ−３タンパク質 を種々の形態で、融合タンパク質として、成熟細胞内タンパク質として、および 分泌されたタンパク質として生産できる発現系の代表的種類を提供した。出願人 の知る限り、組換体形態のヒトＩＬ−３または、実際にこの所望タンパク質に通 常伴なわれるタンパク質を含まない調製物中のヒトＩＬ−３が技術的にどこにも 利用可能でない、従って、本発明は初めてヒ）ＩＬ−３タンパク質を治療および 診断使用に適応できる状態で提供する。

ヒトＩＬ−３はヒトＩＬ−３アミノ酸配列に非相同性の配列との融合タンパク質 として生産することができる。「非相同」という語によりヒトＩＬ−３自体に認 められず、非関連配列である配列を意味する。この非相同配列は細菌タンパク質 、酵母タンパク質、哺乳動物タンパク質、または任意の種類の種々の偶然エンコ ードされた配列例えばポリリンカーによりエンコードされた配列に由来すること ができる。下記の結果から、少くとも融合タンパク質がさらにＮ末端を通り越し て延長されるならば、ヒトＩＬ−３配列のＮ末端の少くとも初めの１４個のアミ ノ酸を非相同配列により置換できることが明らかである。

該タンパク質はまた、ＡＴＧ出発コドンを所望Ｎ末端のすぐ上流に配置する構築 により成熟細胞内タンパク質として得ることができる。これらの細胞内タンパク 質は、成熟または融合タンパク質であっても、細胞を溶解し、ヒ）ＩＬ−３を標 準タンパク質精製手法を用いて精製することにより回収することができる。

タンパク質精製は、ヒ）ＩＬ−３が培地中に分泌されれば単純化される。未変性 シグナル配列が適合する補乳動物中に生成されるとこの未変性シグナル配列が培 地中への分泌を行なうために使用されることができる。細菌または酵母系におい て、これらの宿主に適合するシグナル配列例えばペニシリナーゼあるいは細菌中 のα−アミラーゼ配列または酵母中のα因子シグナル配列が使用されることがで きる。

組換的に生産されるとヒトＩＬ−３はそれに通常伴なわれるタンパク質を含まず 、組換宿主に固有のタンパク質および他の物質から、例えばクロマトグラフィー 法、ゲル濾過、硫酸アンモニウム沈降などを用いて精製することができる。

後記のように、該タンパク質は治療および診断目的に有用である。治療に使用す るためにタンパク質を、タンパク質の投与に使用される薬学的組成物に対する標 準的な方法で配合することができる。適当な賦形剤には例えば生理食塩水、リン ゲル溶液などが包含される。固体配合物（例えば凍結乾燥した）を含む代替配合 物もまた用いることができる。

Ｄ、五体坐握翌 組換ＩＬ−３タンパク質またはその一部の有用性は後に示すように、タンパク質 またはその一部を指向する抗体の生産を可能にする。そのような抗体は、中でも ｈｌＬ−３を生産するコロニーの試験管内検出、治療用途、および天然および組 換ｈ　Ｉ　Ｌ−３の両方の精製に有用である。

有用性の陳述 ヒトＩＬ−３のｃＤＮＡの全部または一部のヌクレオチド配列、あるいは密接に 関連するＤＮＡ配列はゲノム再配列、制限フラグメント長多形性、変異および改 変遺伝子発現を含む遺伝異常の検出を、制限酵素を用いる染色体ＤＮＡの分析、 ＤＮＡおよびＲＮＡブロフティング、並びにハイブリッド形成手法〔マニアティ ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ほか、１９８２）および二次元ゲル電気泳動〔フィッ シャーはか（Ｆｉｓｈｅｒ　ａｎｄ　Ｌｅｒ＋ｗａｎ、　１９８３　）のような 手法の使用により有利に可能にする。

本発明により提供される組換ｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆはヒト造血におけるその 役割、殊にｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆおよび種々の他のＨＧＦｓの潜在的相乗作 用の詳細な分析を容品にする。さらに、ｈＩａｕｌ　ｔｉ　−ＣＳＦは、造血前 駆細胞が含まれ白血病を包含するヒト疾患の試験管内診断に対する適用性、並び に生体内の造血の拡張を目的とする潜在的用途のためにかなり重要である。白血 病細胞の末端分化に関連する種々の造血悪性に対するｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆ の効果もまた調べることが必要である。さらに、ｈｍｕｌｔｉ　ＣＳ　Ｆは、ｍ １Ｌ−３による刺激がマウス幹細胞の組換複製欠陥レトロウィルスによる成功感 染に必要であることが示されたので、遺伝子療法プロトコルにおいてヒト幹細胞 の増殖状態の確立に要求されることができる。

ＩＬ−３タンパク質はまた標準化試験管内培養における初期造血前駆細胞の検出 に有利に使用できる〔ウェイジメーカーはか（Ｗａｇｅｍａｋｅｒ　ａｎｄ　Ｖ ｉｓｓｅｒ　）　１９８０　；メトカーフ（Ｍｅｔｃａｌｆ　）ほか、１９８２ ；？−ショウはか（Ｍｅｒｃｈａｗ　ａｎｄ　Ｗａｇｍａｋｅｒ）、１９８４　 ；メトカーフ（Ｍｅｔｃａｌｆ　）、１９８６）　。

ＩＬ−３タンパク質および変異体はさらに試験管内造血幹細胞の増殖に、おそら く他の増殖因子とともに骨髄移植および幹細胞の遺伝増殖に使用できる〔ロウエ ンベルブはか（Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ　ａｎｄＤｉｃｋｅ　）　、１９７７　；ウ ェイジメーカーはか（Ｗａｇｅｍａｋｅｒ　ａｎｄＰｅｔｅｍ）、１９７８　； レミシュカ（Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ　）ほか、１９８６）。

ＩＬ−３タンパク質は試験管内試験における悪性造血細胞の応答パターンの決定 に使用できる〔タウ−ほか（Ｔｏｕｗ　ａｎｄ　Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ）。

１９８５；グリフイン（Ｇｒｉｆｆｉｎ　）ほか１９８６；グリフインはか（Ｇ ｒｉｆｆｉｎ　ａｎｄ　Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ　）＋　１９８６１］　ｍさらに、 ＩＬ−３タンパク質は試験管内方法による残留白血病細胞の検出に使用できる〔 タウ−ほか（Ｔｏｕｗ　ａｎｄ　Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ）　＋１９８６、グリフイ ン（Ｇｒｉｆｆｉｎ　）ほか、１９８６；グリフインはか（Ｇｒｉｆｆｉｎ　ａ ｎｄ　Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ　）＋　１９８６　）　＠さらに、ＩＬ−３タンパク 質は、悪性および非悪性障害の治療および予防に、それ自体または組合せで生体 内に使用でき、得られる造血系による特異応答が臨床利益を生ずることができる 。

これらの通用には、 −例えばＡＩＤＳ感染による白球減少および（または）免疫抑−制、 −化学療法および（または）放射線療法による血球減少、−骨障害例えば骨折お よび骨粗鬆症、 −全身麻酔法による免疫不全、 −骨髄移植後の回復、 −感染の予防接種および付加療法に対する佐剤、が包含される。

クローン化ヒトＩＬ−３ＤＮＡ配列または密接関連ＤＮＡは正常夏Ｌ−３遺伝子 からの遺伝偏位における遺伝子療法に使用できる。

前記分析を容易にするために多量のヒ）ＩＬ−３が必要である。

十分な量のタンパク質を得る最も容易な方法は微生物、殊に酵母、細菌および真 菌、例えばサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）、クロイベロミセ ス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇ　ｉ　１ １ｕｓ）　。

ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　）およびＥ、コ！Ｊ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）種による生産である。哺乳動物 および他の真核系、例えばＣ１２７細胞、スポドブテラ（５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ 　）細胞並びに形質転換した動物および植物中の生産もまた本発明の教示によっ て当業者に可能である。これらの可能性もまたすべて本発明の範囲内に包含され る。

ｈＩＬ−３ｃＤＮＡの発現によりヒトＩＬ−３タンパク質を生ずる生細胞を得る 方法の例示として、多くのプラスミドを構築し、Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ　）、 　Ｂ、　サチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　）、　Ｂ、リシエニフォルミス（Ｂ 、　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　）、ｓ、セレビシェ（Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）、　Ｋ、ラクチス（Ｋ、　１ａｃｔｉｓ　）およびＣ １２７細胞に移入させた。これらの宿主株を用いて組換ヒ）ＩＬ−３の生産が達 成された。生成物はＣＯ３／ｐＬＢ４ならし培地に対して前に記載したようにそ れらのヒトＡＭＬ芽球を刺激する能力について試験した。これらの試験から生成 タンパク質が生物活性であると思われた。

以下の実施例は本発明の例示であって、それを限定するものではない。

実施例１ ヒトａ＋ｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆ　（ｈｓｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆ　）をエンコード するｃＤＮＡのレトリーバル ＴＰＡ　（５ｎｇ／ａ＋ｊりおよびＣｏｎＡ　（１０Ｌｇ／ｍｊｉりで刺激した ヒト白血球はマウス幹細胞増殖検定および種々の他のコロニー検定により測定し てかなりの量のＨＧＦｓを生じた。細胞は、ｍＲＮＡ生産がホルボールエステル およびレクチンによる刺激後時間後すてにＨＧＦｓをＣＭ中で容易に検出できた 。

二且Σ人坦里１ 細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、グアニジウムイソチオシアナート溶液（３６） 中で均質化した。ＲＮＡを塩化セシウムクッションによりペレット化した。オリ ゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーをｍＲＮＡの選択に用いた（３６） 。

二旦笠へ企虞 ガブラーはか（Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ　）　（３７）に実質的 に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとして、およびＡＭＶ逆転写酵素を用いて ｃＤＮＡを合成した。第二鎖はＲＮａｓｅＨおよびＥ６コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ） 　Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩで合成した０間隙を７４−ＤＮＡリガーゼで閉じ、 末端を７４−ＤＮＡポリメラーゼによりフランシュした。内部ＥｃｏＲＩ制御部 位を保護するためにｃＤＮＡをＥｃｏＲＩメチラーゼでメチル化した０次にｃＤ ＮＡをＴ４−ＤＮＡリガーゼでリン酸化ＥｃｏＲＩリンカ−に連結させた。Ｅｃ ｏＲＩで消化した後、過剰のリンカ−をセファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　） 　ＣＬ４Ｂクロマトグラフィーにより除去した。カラムのボイド容積中に回収さ れた物質は２５０ｂｐより大きく、ライブラリーの構築に用いた。

フ　−ジｃＤＮＡ−イブ−１−の ｃＤＮＡをλｇｔｌｏファージアーム（２０）に連結させ市販パフケージング抽 出物〔ギカバフク（Ｇｉｇａｐａｃｋ　）、ベクター・クローニング・システム ズ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｗｒｓ　））でパフケージした ０組換ファージをＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　Ｃ６００ｈ　ｒ　１中に繁殖 させた。

ｌエニｉラヱ１壽巳駈づＬ（外九二五Ｚ久１〜５００プラークを含む各プレート の２ニトロセルロースフイルターレプリカを標準操作に従って作った０次いでフ ィルターを、ｍＩＬ　３ｃＤＮＡのＨｉｎｄＩ［［−Ｘｂａ　Ｉフラグメントの 放射性標識ｍ１Ｌ−３プロプと、またはランダムプライマーで標識した完全ｍ１ Ｌ−３ｃＤＮＡクローンとハイブリッド形成させた。

ｍ１Ｌ−３ｃＤＮＡクローン（ｐ　Ｌ　１０１）　ＷＥＨＩ　−３ＢｃＤＮＡラ イブラリーから分離した。ＷＥＨＩ−３Ｂｌ−３Ｂをグアニジウムイソチオシア ナートＣｓＣ１法を用いて分離し、スクロース勾配上でサイズ分画し、アフリカ ッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ　）卵母細胞中へ注入した。卵母細 胞を誘発してマウス幹細胞増殖を支持できる因子を生産するＲＮＡ画分を前記ｃ 　Ｄ　Ｎ　Ａの合成に用い、ｃＤＮＡにｄＣ残基を末端につなぎ、ｐＵｃ９のＰ ｓｔ１部位中に挿入した。ｍ１Ｌ−３クローンは合成オリゴヌクレオチド（発表 されたｍ１Ｌ−３配列、１１）を用いて確認した。ｐＬｌｏｌの挿入断片はポリ アクリルアミドゲル上で精製し、ヒトｃ　ＤＮＡライブラリーのスクリーニング に用いた。プローブＤＮＡはランダムプライマー法（３８）を用いて標識した。

ｆａ在陽性プラークを再びスクリーニングし、プラークを精製した。この方法で ファージＤｌｌを含む４クローンが確認された。

ｃＤＮＡクローンの配■゛ 組換ファージを大規模に増殖させ、精製し、ｃＤＮＡ挿入断片をＥｃｏＲＩによ る消化によりファージアームから除き、ポリアクリルアミドゲル上で精製した。

精製フラグメントをＭ１３ｍｐ１８およびｐＴＺｌ　８ＲＤＮＡ　（ＥｃｏＲＩ で消化）中へ連結し、Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭ１Ｇ９の形質転換に用いた 。一本鎖ＤＮＡが調製され、確立された操作（３９）により配列決定された。配 列データは種々のコンピュータプログラム（４０〜４３）を用いて分析した。

ファージＤｌｌ中の挿入断片に対して得られた配列が第１図に示される。この９ １０ｂｐ配列はｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆおよびそのシグナル配列に対する全コ ーディング領域を含み、３′非翻訳領域中にマウスクローンｐＬ１０１に対する 高い相同性を示す。コーディング配列の上流の相同性は比較的多く制限される。

前記のように、該タンパク質は推定１９個のアミノ酸シグナル配列、次に２つの グリコジル化部位（１５〜１７および７０〜７２）並びに１６および８４におけ る２つのシスティン残基を含む１３３個のアミノ酸成熟タンパク質を有する。

演縄アミノ酸配列はヤン（Ｙａｎｇ、　Ｙ−Ｃ）はか（前掲）により開示された ゲノムＤＮＡによりエンコードされるものと、１個のアミノ酸〔推定成熟タンパ ク質の位置８；ヤン（Ｙａｎｇ　）ＤＮＡはＳｅｔをエンコードし、このｃＤＮ ＡはＰｒｏをエンコードする〕を除いて同様である。

ファージＤｌｌ中に得られたイントロンのない配列は下記のように原核発現、並 びに真核系中の発現に使用できる。

実施例２ ファージＤ１１　（最長ｃＤＮＡ挿入断片を含む）を旧ｎｄＩＩ［およびＢｇｌ ＩＩで消化し、プラスミドｐＴ１　（ｐＴＺ１８Ｈの誘導体、マルチリンカ−中 に若干の追加制限部位を含む、実施例３Ａ参照）中でサブクローン化した。ｃＤ ＮＡ挿入断片を含むファージフラグメントを含むクローンを制限分析により確認 した。ｃＤＮＡ挿入断片をＥｃｏＲＩによる部分消化によりこのプラスミドから 除き、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。適当なフラグメントを ＳＶ４０転写単位中の真核発現ベクター（ｐＬｏ）中に挿入した。

ｐＬｏは、ＥｃｏＲＩ（充填）−ｐＢＲ３２２のＰｓｔｌ　（１〜７５５）　、 ｐＢＲ３２９のＰｓｔＩ−Ａｖａｌ　（７５６〜１８９４）、Ａｖａ　Ｉ　−Ｐ ｖｕＩ［アダプター（１８５０〜１８６８）　、５Ｖ４０（プロモーター）のＰ ｖｕｎ　−）１ｉｎｄＩ［［（充填）　（１８６９〜２２１１）　、特有ＥＣ０ Ｒ１部位を含むＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩアダプター（２２１１〜２２５１）　、 ＳＶ４０のＭｂｏｌｒスプライスフラグメント」（２２５２〜２８６１）　、Ｓ Ｖ４０のＢｃｌ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　（充填）「ポリＡ７ラグメントＪ　（２８ ６２〜３０９８）　、５Ｖ４０（７）ＰｖｕｌＩ−旧ｎｄｎ［プロモーターフラ グメント（３０９９〜３４４０）、旧ｎｄｌ［［ＢａｍＨＩ　Ｅｃｏ　ｇｐｔ遺 伝子（３４４１〜４５０１）　、ＳＶ４０のＭｂｏｌｒスプライシングフラグメ ントＪ　（４５０２〜５１１１）およびＳＶ４０のＢｃｌｌ　ＢａｍＨｌ　（充 填）「ポリＡ７ラグメン）Ｊ（５１１２〜５３４８）を含む。

Ｅｃｏ　ｇｐｔ転写単位はＣＯ３１細胞中のタンパク質の移行発現に重要でない 、生じたｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆに対する発現プラスミドはｐＬＢ４と名づけ られ、ｃｓｃｚ上で精製された。Ｅ、コリ（Ｅ。

ｃｏｌｔ　）中のこのプラスミドはセントラール・ビューロー・オブ・シメルカ ルチャーズＣＣＢ　Ｓ）　（Ｃｅｎｔｒａａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｏｆ　Ｓｃｈｉ ｍｍｅｌ−ｃｕｌｔｕｒｅ＋　Ｂａａｒｎ＋　ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ 　）に１９８６年１２月１２日にブタペスト条約の規定に従ってＣＢ５５６８． ８６のもとで寄託された。構築物は第２図に示される。

Ｂ、ＣＯ３１細胞中のｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆの　および生物ｐＬＢ４ＤＮＡ をリン酸カルシウム共沈法（４５）を用いてＣＯ３１細胞に移入した。細胞を、 １０％ウシ胎仔血清を含むα培地中で４８〜７２時間培養した。培地を回収し、 濾過し、生物活性を確認する検定に用いた。ヒト骨髄前駆物質コロニー検定並び に急性骨髄芽球コロニーおよび増殖検定を次のように行なった。

骨髄は血液学的に正常な成人ボランティアから告知承諾後に腸骨稜穿刺により得 た。単核細胞をフィコール勾配〔ニーガード社（Ｎｉｊｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　 Ｃｏ、＋　０ｓｌｏ＋　Ｎｏｒ％４ａｙ　）製〕上の密度勾配遠心分離により分 離し、洗浄し、ハンクス（Ｂａｎｋｓ　）平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中に再懸濁 した０次いで骨髄細胞およびＴリンパ球を除去した。この目的のため、骨髄細胞 を、確立された操作（４７）により単クローン性抗体０ＫＴ−３［ＣＤ３　；オ ルト（０ｒｔｈＯ＋Ｒａｖｉｔａｎ＋　Ｎ、　Ｙ、　）製〕およびＶｉ＊２　（ 骨髄単球細胞、４６）とともにウサギ補体の存在下に飽和濃度で（４０％、３０ 分、２５℃）インキユベートした後溶解した。細胞をＨＢＳＳ中で２回洗浄し、 イズコフ（ｌ５ｃｏｖｅ　）３９性ダルベンコ培地（ＩＭＤＭ）中に再懸濁し、 ファウザーほか（Ｆａｕｓｅｒ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｎｅｒ　）　（１６）に従っ て自己血漿の存在下に、前に記載されたように（４８）、１．５〜３×１０４／ ■ｌの濃度で培養した。エリスロポイエチンＩＵ／ｍｊ（ヒツジ、段階■、コノ −）（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ、　Ｗｉｌｌｏｗｄａｌｅ、　Ｃａｎａｄａ　）製） ！８よびＣＯ３／ｐＬＢ４ＣＭを増殖刺激活性として加えた。

ＣＯ３／ｐＬＢ４ＣＭとの直接比較において、フィトヘマグルチニン刺激白血球 ＣＭ　（ＰＨ−ＬＣＭ）との標準培養の結果もまた与えられる。コロニーの６０ ％を摘み、顕微鏡分析により確認した。ＣＯＳ細胞のＣＭは挿入（ｐＬｏ）のな いベクターを移入し、単独でコロニー形成を刺激しなかった。

結果は第３図に示される０図に示されるように、赤芽球（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球 −マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）　、顆粒球（ＣＦＩＪ−〇）、好酸球（ＣＦ Ｕ−Ｅ、”）　、マクロファージ（ＣＦＵ−Ｍ）および混合（ＣＦＵ−ＭＩＸ） コロニーの、変量のＣＯ５／ｐＬＢ４ＣＭで刺激した重複培養の平均数（±ＳＤ ）が示される。

２配ｙユＳ１舛！１（λ（第４図参照）ＡＭＬ芽球はウシアルブミン（Ｂ　Ｓ　 Ａ）密度勾配を用いて精製した。残余Ｔリンパ球をＥ、ロゼツト沈降（１７，４ ９，５０）によりＡＭＬ試料から除いた。ＡＭＬ　（愚者１）コロニー形成は確 立されたＰＨＡ白血球フィーダー（ＰＨＡ　１．ｆ、）系中だけでなく、また白 血球をｃｏｓ、”ｐＬ８４ＣＭにより置換させた変形型の手法で測定し、第４Ａ 図に示されるように、そのコロニー刺激活性の評価を可能にした（１７．１８． ４９．５０）、ＡＭＬ芽球（愚者２）のＤＮＡ合成を、文献（５１）に記載され たチミジン取込みにより検定し、結果は第４Ｂ図に示した０両検定は加えたＣＯ ３／ｐＬＢ４ＣＭに対する用量依存関係を示した。対照ＣＯ５培地の添加はどち らの検定においてもＡＭＬ増殖に影響を与えなかった。

Ｃ，ベタ　−　ＬＢ／ＢＰＶの ヒトＩＬ−３、Ｃ１２７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）を発現する安定細胞系 を確立するためにｐＬＢ４の誘導体を移入した。この誘導体は次の方策により全 ＢＰＶ−１ゲノム（６９）をｐＬＢＡ中へ挿入することにより構築した。　ＢＰ Ｖ　−Ｉ　ＢａｍＨＩフラグメントをベクターｐ　ｄ　Ｂ　ＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ 　（３４２−１２）（７０）から切除した。ＢａｍＨＩ粘着末端をフレノウ（Ｋ ｌｅｎｏｗ　）ポリメラーゼで満たした０次いでベクターｐＬＢ４をＥｃｏ　ｇ ｐｔ遺伝遺伝子持有ＥｃｏＲＶ部位で切断した０次いでプラントエンドＢＰＶ− １７ラグメントをＥｃｏＲＶ切断ｐＬＢ４中へクローン化し、Ｃ１２７！ｉｔ胞 中で複製できるベクターｐＬＢ４／ＢＰＶが生じた、ｐＬＢ４／ＥＰＶを、リン 酸カルシウム沈降法（４５）を用いてＣ１２７細胞に移入した。移入した細胞を １６日間培養し、その後フォーカスを培養皿から採集した。若干の独立細胞系が 確認された。ｐＬＢ４／ＢＰＶベクターは、若干の細胞系のハート（Ｈ５ｒｔ　 ）抽出物（７１）のサザンプロフティングにより判断して細胞内に安定に維持さ れると思われる。ならし培地を、ＡＭＬ増殖検定を用いてＩ　Ｌ−３活性につい て試験した。該安定細胞系は活性ヒトｒＬ−３を生産する。

実施例３ Ｅ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　ベクター（Ｄｍ’ＪＡ、ｃＢ／ｒＬ−３０１の 　築（第５．６．７および８図参照）Ｅ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）発現ベクタ ーの構築のため、次の変形をｔｓ準操作（３６）に従って行なった。

１、ｐＬＢ４中のＡｖａｒ部位（位置５４１〕とＸｈｏ１部位（位置８５６）と の間の３′末端非コーディング配列を、フレノウ酵素で粘着末端を満たした後の ＤＮＡフラグメントの融合により欠失させた（第５図）。

２、細菌発現ベクター中へｈｍｕｌｔｉ　ＣＳ　Ｆ挿入断片を導入するために次 の段階を行なった。ｐＬＨ１ベクターをＡνａｌｌで消化し、陥凹末端をタレノ ウポリメラーゼで満たした。Ｂｇｌｎリンカ−（ＣＡＧＡＴＣＴＧ）の連結後、 ＤＮＡをＢｇｌｎおよびＢａｍＨＩで消化した＊Ｂａ１ＩＩ　ＢａｍＨＩｈｍｕ ｌｔｉ−Ｃ５Ｆフラグメントをポリアクリルアミドゲル上で精製し、ｐＴＩのＢ ａ１Ｉ［部位中に、多重クローン化部位中を修飾されたｐＴＺ１８Ｒ（ファルマ シ７（Ｐｈａｒ＋ｍａｃｉａ　）製〕の誘導体をサブクローン化した（第６図参 照）、２クローンが得られ、それらはＩａｃ　Ｚプロモーターに関して逆配向に 挿入断片を有した（第５図参照）、これらの２つのクローンの挿入断片をＢｇｌ Ｉ［およびＥｃｏＲＶで消化した後ポリアクリルアミドゲルで分離し、Ｂｇｌｎ およびＨｉｎｄＩＩで消化したｐＴＩ中にサブクローン化した。ＢｇｌＩ［リン カ−およびｈｍｕｌｔｉ−Ｃ３Ｔ　ＤＮＡの結合が配列分析により確認され、ｃ ＤＮＡクローンのｎｔｌに位置するＡｖａ１１部位に対するリンカ−の融合を示 した（このＡｖａ１１部位はｃＤＮＡ分子に対するＥｃｏＲＩリンカ−の連結に より生じた）、この構築物（ｐＧＢ／ＩＬ−３００）がｌａｃ　Ｚタンパク質を 有する相中でないので１３ｇ１　ＩＩ　−ＥｃｏＲＶ挿入断片をＢａｍＨＩおよ び旧ｎｄＩ［消化ｐｔＪｃ８（５２）中ヘサブクローン化した。生じた構築物（ ｐＧＢ／ＩＬ−３０１，第５．７および８図参照）をＩａｃ　Ｚ　／　ｈｍｕｌ ｔｉ　−Ｃ５Ｆ融合タンパク質の生産について試験した。

Ｂ、ｐＧＢ／ＩＬ−３０２、ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０３、ｐＧＢ／ＩＬ−３０４お よび　ＣＢ／ＩＬ〜３０５の（第５．７および８図） 合成オリゴヌクレオチドをｐＧＢ／ＩＬ−３００中へ導入することにより融合タ ンパク質のＮ末端部に対するコーディング配列中へ若干の塩基変換を導入した。

ｐＧＢ／ＩＬ−３０２、ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０３およびｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０４ と名付けた新発現ベクターを次のように構築した＝　ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３００の ＨｉｎｄＩｌ−）１ｉｎｄｌｌｌフラグメントを７ガロースゲルで分離し、ｈｍ ｕｌｔｉ　ＣＳ　Ｆのヌクレオチド９９〜１３７および５′末端５ａｉｌ認識配 列を含むヌクレオチドに連結し、５ａｉｌおよび旧ｎｄＩ［ｌで消化したｐＴ２ １８Ｒ中へ挿入した。若干のクローンの配列が確立された。事実若干の塩基変換 が認められ、ｂ＋ｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆタンパク質の修飾が生じた。若干のク ローンの挿入断片がｌａｃ　Ｚ融合タンパク質の発現のためｐＵＣ８に移入され た（ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０２、ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０３）　、クローンｐＧＢ／ ＩＬ−３０４がフレノウで陥凹末端を満たした後の５ａｉｌ部位の連結により１ ａｃＺＧ！する相中に作られた。構築物はＰｖｕｌ消化により立証された。若干 のクローンは合成ヌクレオチドを欠き、ｌａｃ　Ｚタンパク質に、フレーム中に 融合すると認められた。これらのクローンの１例はｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０５と名 づけだ。

Ｃ，ＧＢ／ＩＬ−３０６の　（第５．７および８図参照）１ａｃＺＮ末端アミノ 酸を欠くタンパク質をコードする発現ベクターが、文献（５３）に記載された欠 失ルーピングによりｐＧＢ／ＩＬ−３００から作られた６合成オリゴヌクレオチ ドには、ＡＴＧ出発コドンを含むｐＴＺ１ａｃＺ遺伝子の上流の２２個のヌクレ オチド、および成熟ＩＬ−３をコードする初めの２４個のヌクレオチドが含まれ た。このプラスミドはｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０６と名付けた（第５．７および８図 ）。

プラスミドｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３００，ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０１およびｐＧＢ／Ｉ Ｌ−３０２を含むＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）株は１９８７年７月１３日、Ｃ Ｂ５３７７．８７、ＣＢ５３７９．８７およびＣＢ５３７８．８７のもとでＣＢ Ｓに寄託された。

第８図は構築された種々のプラスミドに対する融合領域の配列を示す、クローン の配列はｐＵＣ８またはｐＴＺ１８Ｒ中の］ａｃＺタンパク質コーディング領域 （下段文字）およびｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆコーディング領域（上段文字）の 出発点から位置１５８におけるＣｌａｌ部位まで示される。　ｈｍｕｌｔｉ−Ｃ ５Ｆ　ＤＮＡ配列中の変異は下線を引かれ、ｔｒｐ”　→ａＢ”　（ｐ　ＧＢ／ 　Ｉ　Ｌ　−３０２）　；ｌｅｕ”−Ｉｐｒｏ”およびｔｒｐ”　−＋ａｒｇ” 　（ｐ　ＧＢ／　Ｉ　Ｌ　−３０３）　；ｍｅｔ”＝ｔｈｒ’およびサイレント 変化（ｐＧＢ／ＩＬ−３０４）を生じた。

１９８７年７月１３日に提出した優先権出願ＥＰ第８７２０１３２２．２号にお いてこれらのプラスミドには次のように他の名称が使用された： ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３００−ｐＴ−ｈ　Ｉ　Ｌ３　；１）ＧＢ／ＩＬ−３０１−ｐ ＵＣ／ｈｍｕｌｔｉ；ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０２−ｐＵＣ／ｈｍｕｌｔｉΔＩＡ； ｐＧＢ／ＩＬ−３０３−ｐＵｃ／ｈｍｕｌｔｉΔｌＢ；ｐＧＢ／ＩＬ−３０４＝ ｐＵＣ／ｈｍｕｌｔｉΔｌＣ；ｐＧＢ／ＩＬ−３０５−ｐＵＣ／ｈｍｕｌｔｉΔ ２；ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０６−ｐＴＺ／ｈｍｕｌｔｉ；Ｄ、　Ｅ、コリ（Ｅ、ｃ ｏｌｉ　）中のｌａｃ　Ｚ　／　ｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆ融合タンパク　およ び　Ｔｈｈｍｕ％ｔｉ　−ＣＳ　Ｆの種々の発現ベクターをもつＥ、コリ（Ｅ、 　Ｃｏ１１　）株（ＪＭ］０９）を、アンピシリン５０μｇ／■ｌを含むＬＢ培 地中で３７℃で、５５０ｎｍ′Ｔ：０．５の光学濃度に達するまで増殖させた。

次いでＩＰＴＧ（イソプロピルβ〜Ｄ−チオガラクトシド、ファルマシア（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ　）、製〕を培養に１ｍＭの最終濃度に加え、インキュベーシヨ ンを３〜４時間続けた。

プラスミドｐｃＢ／ＩＬ−３０６およびｐＧＢ／ＩＬ−３０２もまたＥ、コリ（ Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＤＨＩ　（野生型１ａｃ　Ｚオペロン）に形質転換させた。こ れらの株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｔｉ、を含むＬＢ培地または２ＸＴＹ培 地中で３７℃で１６時間増殖させた。

細菌を遠心分離により捕集し、０．１　Ｍ　）リス／ＨＣＩ、　ｐＨ８，ｏ　； ５ｍＭ−ＥＤＴＡｏ、２％ノニデフト（Ｎｏｎ１ｄｅｔ　）　Ｐ　４０　（ＮＰ −４０）および１ｍＭフェニルメチルスルホ二ルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む 緩衝液中で音波処理し、２０．０００ｘｇで３０分間遠心分離した。ペレットを ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、上澄み画分はｔ＋ｓ＋ｕｌｔｉ　−ＣＳ　 Ｆタンパク質の大部分が不溶性形態で細菌中に貯蔵されることを示した。

ペレフトを０．５％ＮＰ−４０緩衝液で再抽出し、最後に８Ｍ尿素０．　Ｉ　Ｍ 　Ｆリス／ＨＣ１、ｐＨ８，０および５ｍＭジチオトレイトールで可溶化した。

従って融合タンパク質の広範な精製が達成された（第９図）。

図に示されるように、ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０１およびｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０２を 含む細菌ＣＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　）の混在体が前記のように分離され た。レーン１は０．２％ＮＰ４０上澄み（原綿菌培養０．１ｍＡに相当する試料 ）を示す、レーン２は０．５％ＮＰ４０上澄み（０，２園ｊ）を示し、レーン３ は８Ｍ尿素緩衝液（Ａ：０゜０５閤１　；　Ｂ　：　０．２ｍ１）を示す、タン パク質を１３．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、クーマシーブリ リアントプルーで染色した。標識タンパク質（レーンＭ）の分子量（ｋｄ）が右 に示される。ヒ）ｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆ融合タンパク質が矢印により示される 。ｐＧＢ／ＩＬ−３０１によりエンコードされた融合タンパク質は約２０ｋｄの 、ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０２から生成されたものは約１６ｋｄの、予期ＭＪを有す る。

Ｅ、　ｈｍｕｌｔｉ　ＣＳ　Ｆｊ　の　；　の測細菌タンパク質調製物を１％ウ シ血清アルブミンを含むα培地中に希釈し、濾過滅菌し、ＡＭＬ芽球増殖検定で 検定した。希釈試料を精製ＡＭＬ芽球に加え、４日間培養した。ＤＮＡ合成を、 文献（５１）に記載されたように″Ｈチミジンを用いて測定した。

１単位毎−４をＡＭＬ芽球の半最大増殖に必要なｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆの量 と規定する。第１０図はこの力価測定を示す、プラスミドｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０ ２を含む細菌の、種々の希釈度の尿素抽出タンパク質調製物を３Ｈチミジンを用 いるＡＭＬ芽球増殖の刺激について検定した。このタンパク質調製物の融合タン パク質濃度は３３μｇ　／　ｓ　１であった。与えられた力価測定曲線に暴きこ の調製物の活性は１６．０００単位／ＩＩＪである。

調製物中の細菌融合タンパク質の量をポリアクリルアミドゲル電気泳動から評価 し、相対活性の計算に用いた。

結果は次表に示される。

表−よ ｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　ＦｔＪ　リ　の　活（１）　近位分子量は融合タンパク 質のＤＮＡ配列（第８図）から評価した。

（２１Ｉ　Ｌ　−ｓ　ｓ度は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で評価し、出発 培養毎ｍＡで計算した。

（３）尿素可溶化タンパク質の活性はＡＭＬ増殖検定で測定し、出発培養毎−ｔ で示される。

（４）　測定せず これらの結果からＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）中の融合タンパク質として発現 されたヒ）ｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆが生物活性形態で得られたと結論された。結 果は融合タンパク質のＮ末端中へ導入された変化がこれらのタンパク質の相対活 性に影響を与えることができることを示す。

実施例４ ヒトＩＬ−３タンパク質と免疫特異反応できる抗体調製物の調Ａ、　クローン　 ウサギ　ヒトＴＬ−３血−調製用ゲルをプラスミドｐＧＢ／ＩＣ−３０１を含む Ｅ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）の溶解物から作った。ＩＬ−３融合タンパク質を 有する２０ｋｄバンドを薄く切り、乳鉢で食塩水中で細かくし、マイコバクテリ ウムパンベルクローシス ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　）　Ｈ　３　７　Ｒ　Ａ　１　ｍｇ毎ａｌｌを含む 完全フロイント（　Ｆｒｅｕ１１６’ｓ　）アジュバント中に１＝１比で乳化し た．ニューシーラント・ホワイト・ラビット（ｓｐｆ）を、乳濁液１−！　（± １００μｇｌＬー３融合タンパク質を有する）で５注射部位（２×ｉ．ｍ．大腿 中、３Ｘｓ．ｃ．背上）に分けて免疫処置した．不完全フロインドアジュバント 中の同一抗原の追加免疫注射を第２、４および６週に与えた．血清を第８週に静 脈穿刺により耳から採取した。

血清１容積を音波処理ｐＵＣ８含有Ｅ．コリ（　Ｅ．　ｃｏｌｔ　）　９容積で 吸収させ（４℃で一夜）、非特異性抗体を除去した．Ｅ．コリ（　Ｅ．　ｃｏｌ ｔ）　、Ｂ．　リシェニフオルミス（　Ｂ．　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　） 、Ｂ．サチリス（　Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　）　、Ｓ．セレビシェ（Ｓ．　ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびに、ラクチス（　Ｋ，　ｌａｃｔｉｓ　）中に作っ たすべてのＩＬ−３構築物の免疫プロッティングは６５００中１の希釈で吸収血 清との免疫特異反応を示した。

これらの結果の若干が第１１図に示される．タンパク質を前記の組換宿主から分 離し、１３．５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上に プロットした．レーン１：ｐＴＺ１８Ｒ含有Ｅ．コリ（　Ｅ．　ｃｏｌｔ　）　 （対照）：レーン２：ｐＧＢ／ＩＬー３０１；レーン３：ｐＧＢ／ＩＬ−３０１ 　；レーン４：ｐＧＢ／ＩＬ−３０２；レーン５：ｐＵＣ１９（対照）；レーン ６：ｐＧＢ／ＩＬ−３０１；レーン７：ｐＧＢ−ＩＬ−３０２。

レーン６および７は細菌の音波処理後のベレット中に存在するタンパク質を示す ．レーン３、４および５は初めの洗浄段階後のベレット中に存在するタンパク質 を示し、レーン１および２は最終尿素可溶化タンパク質画分を示す。

矢はｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３　０　１およびｐＧＢ／ＩＬ−３０２から発現された融 合タンパク質（予期大きさの）を示す。

第１°２Ａ図は抗ＩＬ−３抗血清によるＡＭＬ芽球細胞のＩＬ−３依存増殖の阻 止を示す．第１２Ｂ図は免疫前血清がＡＭＬ芽球細胞増殖に対するＩＬ−３の作 用に影響を与えないことを示す。

両パネル中、ム＝ＩＬ−３、１０Ｕ／蒙ｆ．−＝ＩＬ−３、ＩＵ乙ｉ；・一対照 、非添加である。

第１２Ａ図はＡＭＬ芽球増殖検定（５１）におけるＩＬ−３依存増殖が用量依存 的に血清により阻止されたことを示し、第１２Ｂ図は免疫前血清がこの効果を有 しないことを示す．対照としてのＧＭ−ＣＳＦ依存増殖は、同一検定においてこ れらの血清により影響されなかった（第１２Ａ図、◆ーＧＭーＣＳＦ，１００Ｕ Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ウサギに用いたと同し乳濁液３Ｘ０．１ｍｊ！（ｓ．ｃ ，）で免疫処置した．不完全フロインドアジュバント中の抗原の追加免疫（０． １園ｊ，ｉ．ｐ，）を第２週に与え、３日後に牌リンパ球を標準操作（６５）に 従ってＳＰ２１０骨髄細胞と融合せさた。ハイプリドーマ上澄みを、Ｅ、コリ（ Ｅ、　ｃｏｌｉ　）ｐＧＢ／ＩＬ−３０２（１７ｋｄｌｌ−３融合生成物を含む ）の。

溶解物を陽性対照として、およびＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　ｐＵＣ８の溶 解物を陰性対照として用いて酵素結合抗体免疫吸着検定でスクリーニングした。

ＩＬ−３に特異性の抗体を分泌する合計２９個のＩＬ−ハイブリドーマ培養が選 択され、安定化された。

実施例５ バシース　ベク　−の槽 −ｉクローン化手法を用いた（３６）。

Ａ、ＧＢ／ＩＬ−３０７のｔ築（第１３図）ｐＧＢ／ＩＬ−’３０７の構築のた めに、ｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆ遺伝子をもつｐＬＢ４の５ｅａｌフラグメント をｐｖｕＩｌ消化ｐＵＢ１１０（５４）中へ連結させた。ＤＢ１０５（プロテア ーゼ欠失株ＤＢ１０４の５ｐｏ−誘導体（５５））の適格細胞（５６）に形質転 換した後、２つのクローンが予想どおり得られ、フラグメントは両配向にクロー ン化された。いわゆるｒＨｐａｎプロモーターＪ　（５７）に関して正しい配向 にフラグメントを収容するプラスミドをｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３０７と名づけた。こ の場合に融合タンパク質が作られる（第１３図参照）。

Ｂ、ＧＢ　ＩＬ−３１０の ｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆ発現プラスミドを次のように潤製した。

１、ブロモ−−クローンヒ（第１４図）バララス中の発現のために、文献（５８ ）に記載された合成σ４３プロモーターを用いた（該プロモーターは通常σｓｓ と称される）。

プラスミドｐＰＲＯＭ５５ｓ　（５８）　、プロモーター含有プラスミド、およ びｐＧＰＡ１４　（５９）をＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌ特表千１−５０２１５７ 　（１１） で消化した。プロモーターフラグメントを、アガロースゲルで精製したベクター フラグメント中へ連結させた。Ｅ、コリ（Ｅ。

ｃｏｌｉ　）　（ＪＭＩ　Ｏ１）に形質転換した後、正しいプラスミドが得られ 、ｐｃＢ／ＩＬ３０８と名づけだ（第１４図）。

２、合成オリゴヌクレオチドのｐＧＢ／ＩＬ−３０８中への導入（第１５゛） ｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆのヌクレオチド３９〜１５８および４８４〜５４６． ５′末端５ａｌｌｔ！２１！配列並びに３′末端Ｘｍａｌ［［部位を含む合成ヌ クレオチドをＳａｌ　Ｉ　−Ｘｅａａｍ消化ｐＧＢ／ＩＬ−３０８中へ連結させ た。連結混合物をＪＭＩ　０１中へ導入した。

多くの形質転換体の分析後に正しいプラスミドｐＧＢ／ＩＬ−３０９が見出され た。

３、−篤」」に］コλ尊フ、（第１６図）Ｂ、サチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉ ｓ　）　Ｄ　Ｂ　Ｉ　Ｏ５に形質転換し、それから分離した後、プラスミドｐＧ Ｂ／ＩＬ−３０９をＸｗｈａｍで消化した。陥凹末端をタレノウポリメラーゼで 満たし、プラスミドをＣ１ａｌで切断した。プラスミドｐＧＢ／ＩＬ−３０７を Ａｖａｌで消化し、末端をフレノウで満たし、次いでＣ１ａＩで切断した０次に ｈｍｕｌｔｉ　ＣＳ　Ｆ含有フラグメントをｐＧＢ／ＩＬ−３０９フラグメント 中へ連結し、ＪＭｌｏｌに形質転換した。生じたプラスミドをｐＧＢ／ＩＬ−３ １０と名づけた（第１６図）、このプラスミドはｈ　Ｉ　Ｌ−３遺伝子をそれ自 体のシグナル配列とともに収容した。正しいプラスミドの分離後、それをまたＢ 、サチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　Ｄ　Ｂ　１０５中へ導入した。

Ｃ，ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３１１およびｐＧＢ／ＩＬ−３１２の構築（第１７．１８ ゛） ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３１０を旧ｎｄｌ［Ｉで一部、ＰｖｕＩＩで全部消化した。

Ｐｖｕｎ−を含む２つのｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　ＦをＨｉｎｄ　ｍおよび５ｅａ ｌで消化した。

第１７図はプラスミドｐＢＨＡ１のヌクレオチド配列を示す。

該プラスミドは位置１１〜１０５および１２１〜１２５；バクテリオファージＦ Ｄターミネータ（重複）二位置２２１〜３０７；プラスミドｐＢＲの部分（すな わち位置２０６９〜２１５３）：位置３１３〜７６８；バクテリオファージＦ１ 、複製開始点（すなわち位置５４８２〜５９４３）；位１７７２〜２５７１；プ ラスミドｐＢＲ３２２の部分；すなわち複製開始点およびβ−ラクタマーゼ遺遺 伝子２置置２５７２〜２６８５）ランスポゾンＴｎ９０３、完全ゲムム：位置２ ７１９〜２７７２；トリプトファンターミネータ−（重複）：位置２７７３〜３ ７２９　；　）ランスポゾンＴ　ｎ　９　％クロラムフェニコールアセチルトラ ンスフェラーゼ遺伝子からなる０位２３００５　（Ａ）　、３０３８　（Ｃ）　 、３３０２（Ａ）および３４０９（Ａ）におけるヌクレオチドは野生型ネココー ディング配列とは異なる。これらの変異はＮｅｏ　Ｉ　、　Ｂａｌ　Ｉ、Ｅｃｏ ＲＩおよびＰｖｕ１１部位：位置３７３０〜３８０４　；マルチクローン化部位 二位置３８０７〜？２６４ｉプラスミドｐＵＢ１１０すなわち複製機能およびカ ナマイシン耐性遺伝子（ＥｃｏＲＩ　−ＰｖｕＩｒフラグメント）（６６，６７ ）：位置７２６７〜？　３３１、マルチクローン化部位を排除するように導入さ れた。フラグメントは公知クローン化手法例えばフレノウによる粘着末端の充填 、アダプタークローン化などにより構成された。データはすべてゲンバンク（Ｇ ｅｎｂａｎｋ”、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　５ｅｑｕｅ ｎｃｅ　ＤｅｔａＢａｎｋ、　Ｎ　Ｉ　Ｈ，ＵＳＡ）から得られた。

ＪＭＩ　０１に形質転換し、多くのアンピシリン耐性コロニーを分析した後、２ つの異なるプラスミド：ｐＧＢ／ＩＬ−３１２（完全遺伝子を完全制御配列とと もに収容）およびｐＧＢ／ＩＬ−３１１（完全遺伝子および一３５領域を欠くプ ロモーターを他の配向中に含む）が見出された（第１８図参照）。

ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３１１をＢ、サチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　Ｄ　Ｂ １０５およびＢ、リシェニルフォルミス（Ｂ、　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　 ）株Ｔ３９９（Δ”ＬＳｐＯ−、エキソプロテアーゼ陰性、ｒｉｆ’　、文献６ ８参照）に形質転換した。

Ｄ、ＧＢ　ＩＬ−３１３の　（第１９図）ｒＨｐａＩ［プロモーター」の後にｈ ａ＋ｕｌｔｉ　ＣＳ　Ｆ遺伝子を有する小プラスミドを得るために、ｐＧＢ／Ｉ Ｌ−３１２をＢａ５Ｈ，！で消化し、再び連結させた。連結混合物をＤＢ１０５ 適格細胞中へ形質転換させた。多くのネオマイシン耐性コロニーを分析し、正し いプラスミドが得られた。該プラスミドをｐＧＢ／ＩＬ　−３１３と名づけだ。

Ｅ、ＣＢ／ＴＬ−３１７（７）”（第２０図）Ｂ、リシェニフォルミス（Ｂ、　 １ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｓｉｓ　）α−アミラーゼ転写および翻訳開始領域並びに シグナル配列の後にｈｍｕｌｔｉ−Ｃ５Ｆ遺伝子をクローン化するために、先に 記載されたｐＯＬ５−デルタベクター（６８）の１つ、すなわちｐＯＬ５−２デ ルタを用いた。このプラスミドはα−アミラーゼシグナル配列（２９アミノ酸長 ）のほかに、α−アミラーゼ成熟配列の１アミノ酸（Ａｌａ　）、次に多重クロ ーン化部位：ＥｃｏＲＩ−Ｘｍａｍ−Ｘｍａｌ−３ａｉｌ　−Ｈｌｎｄｌ［ｌを 収容する（６８）。

ｈｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆ遺伝子を含むプラスミドｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３１０のＳ ａｔ　Ｉ　−ＰｖｕｌｌフラグメントをＳａｌ　Ｉ　−ＰｖｕＩ［消化ｐＯＬ５ −２デルタベクター中へ連結し、ＤＢ１０５に形質転換させた。生じたプラスミ ドをｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３１７と名づけた（第２０図）。

ｈｌＬ−３遺伝子はなおそれ自体のシグナル配列をこのプラスミド上に収容する 。該プラスミドはまたＢ、リシェニフォルミス（Ｂ、　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ ｉｓ　）Ｔ　３９９中へ導入させた。

Ｆ、バシース（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）　の５　ブースミドの下記発現プラスミド をもつＢ、サチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）およびＢ、リシェニフォルミ ス（Ｂ、　１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒ■ｉｓ　）株をネオマイシン２０μｇ／ｍｊま たはエリスロマイシンｌＯμｇ　／　ｔａ　Ｊを含むＴＳＢ培地中で、３７℃で （１６〜２４時間）増殖させ、培養株３００μｇ／■ｌを遠心分離した。ペレッ トを試料緩衝液中に再び懸濁させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、次にウェ スタンブロッティングを用いて分析した。上澄みをＴＣＡ沈降し、ペレットを試 料緩衝液中に再び懸濁させた。上澄みおよびベレー／　）の両方をＩＬ−３タン パク質について分析した（表２参照）。

生じたタンパク質の生物活性を測定するために次の工程を行なった：細胞ペレッ トを、０．１　Ｍ　）リス／ＨＣＪ！、ｐＨ８，０および１０ｍＭ−ＭｇＣｊ、 を含む緩衝液中に再び懸濁させた。リゾチームを１＋ｇ／ｍｊ！の最終濃度に、 およびＰＭＳＦを１ｍＭの最終濃度に加えた。溶液を３７℃で３０分間インキュ ベートした０次にＤＮａｓｅ　（最終濃度２０μｓ／ｍＡ）を加え、溶液を２０ ℃で１５分間インキュベートした。最後にこの調製物および培養細胞の上澄みの 生物活性を記載したように測定した。結果は表２に示される。

表−セ バシース（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベタ　−のＢ、サチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉ ｓ　）中に、ｐＧＢ／ＩＬ−３０７を用いてＩＬ−３活性を有する融合タンパク 質が作られると結論できる。ヒトＩＬ−３遺伝子が単にそれ自体のシグナル配列 のみを含むときにはヒトＩＬ−３の有意な分泌が得られない、ＩＬ−３活性はす べて細胞内に認められる。これらの場合に、前駆体ＩＬ＝３のほかに成熟ＩＬ− ３（１５ｋｄ）が細胞中に形成されたと思われる。従って、膜を横切って若干の 輸送が起ったかもしれないが、しかし、タンパク質は細胞壁を横切って輸送され ない、しかし、α−アミラーゼ調節および分泌シグナル（ｐＧＢ／ＩＬ−３１７ ）を用いるとＩＬ−３活性の大部分が培地中へ分泌されると思われた０分解生成 物のほかに、約１５ｋｄおよび約１７ｋｄの２つのタンパク質、おそらくそれぞ れ成熟ＩＬ−３および前駆体ＩＬ−３、が上澄み中に検出される。これらのデー タは両プロセシング部位、すなわちα−アミラーゼおよびｈ■ｕｌｔｉ　ＣＳ　 Ｆプロセシング部位、が使用されることを示す、細胞中の最も豊富な生成物は、 ウェスタンブロンティングにより示されるように、α−アミラーゼシグナル配列 を含む前駆体ＩＬ−３（２０ｋｄタンパク質）である、ときどき分解生成物が検 出される。

実施例６ クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ　） 発現ベタ　−の Ａ、ＧＢ　ＩＬ−３１６の ベネツエンはか（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ　ａｎｄ　Ｈａｌｌ　）　（６２）による 記載と同様に、Ｓ、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）のアルコール デヒドロゲナーゼＩ　（ＡＤＨＩ）プロモーターの指示下にゲンタマイシン０４ １８耐性を与えるＴｎ　５遺伝子（６１）を含むＤＮＡフラグメントをｐＵｃ１ ９　（６３）の５ｅａ１部位中へ挿入した。得られたプラスミドを含むＥ、コリ （Ｅ、　ｃｏｌｉ　）株、ｐＵｃ−Ｇ４１８は１９８７年１２月４日にＣＢ５８ ７２．８７のもとでＣＢＳに寄託された。

Ｘｂａｌ　Ｈｉｎｄ　ｍ切断ｐＵＣ−Ｇ４１８中へに、ラクチス（Ｋ。

１ａｃｔｉｓ　）ラクターゼプロモーターおよび仔ウシプロキロシンＤＮＡを含 むプラスミドｐＧＢ９０３　（６４）のＸｂａ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ　ｍフラグメン トを挿入するとプラスミドｐＧＢ／ＴＬ−３１４が生じた。

このプラスミドの５ａｌｌ　Ｈｉｎｄｌ［［フラグメントを、小多重クローン化 部位およびラクターゼターミネータ−を含む合成りＮＡフラグメントにより置換 させた（第２１．２２図参照）、生じたプラスミドはｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３１５と 名づけた。

５ａｃｌｌ　−Ｘｂｏ　Ｉ切断ｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３１５ベクター中へ次のフラグ メントを連結させた： 】、　ラクターゼプロモーターの３′部およびＳ、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ　）のα因子シグナル配列の５′部をもつＩ））［５１０５（米国 特許出願第０７８，５３９号、６４）の５ａｃＩＩ　−Ｘｂａｌフラグメント、 ２、Ｘｂａ１部位で出発するα因子シグナル配列の３′部およびＨｐａ１部位の ５′ハーフ（ａａ−残基１４）までの成熟ｈｌＬ−３ｃＤＮＡ配列の５′部を含 む合成オリゴヌクレオチド、３、ｈＩＬ−３ｃＤＮＡ配列の大部分（残基１５〜 １３３プラス３′非コーデイング領域）をもつＨｐａ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉフラグ メント。

生じたプラスミド（ｐＧＢ／ＴＬ−３１６と名づけた）は第２１図に略本される 。ラクターゼプロモーター配列中の５ａｃＩＩ部位から合成ターミネータ−の末 端におけるＨｉｎｄｍ部位までの完全ベクター配列が第２２図に示される。

第２２図はラクターゼプロモーター中の特有５ａｃｎ部位とターミネータ−の後 のＨｉｎｄ　ｍ部位との間のプラスミドｐＧＢ／ＩＬ−３１６（残基４４５７〜 ７２０４）のヌクレオチド配列を示す。

残基４４５７〜６１００はラクターゼプロモーター配列を含む。

残基６１０１〜６３５５はα因子シグナル配列を含む、残基６３５６〜７１１５ は成熟ＩＬ−３に対する配列プラス３′非コーデイングＣＤＮＡ配列を含む、残 基７１１６〜７２０４は合成ターミネータ−配列を含む。

Ｂ、ＧＢ／ＩＬ−３１８の　築 Ｓ、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）のα因子シグナル配列に対す るコーディング情報をに、ラクチス（Ｋ、　１ａｃｔｉｓ　）　（６４）のα因 子シグナル配列により１換させたｐＧＢ／ＩＬ−３１６に類僚する発現ベクター を構築した。プラスミドの残余部分はｐＧＢ／Ｉ　Ｌ−３１６に等しい、ラクタ ーゼプロモーター中の５ａｃＩＩ部位とターミネータ−の後のＨｉｎｄｍ部位と の間のｐＧＢ／ＩＬ−３１８の配列（残基４４５７〜７１９０）が第２３図に示 される。

残基４４５７〜６０８７はラクターゼプロモーターの配列および小リンカ−配列 を含む、残基６０８８〜６３４２はに、ラクチス（Ｋ、　Ｉａｃｔｉｓ　）α因 子シグナル配列を含む、残基６３４３〜７１０２は成熟ヒ）ＩＬ−３に対する配 列プラス３′非コーデイングｃＤＮＡ配列を含む、残基７１０３〜７１９０は合 成ターミネータ−配列を含む。

Ｃ，クルイベロミセス・ラクチス（Ｋ１ｕｙｖｅｒｏａ＋ｙｃｅｓ　１ａｃｔｉ ｓ　）の形−および　２゛、したｈｌＬ−３の プラスミドｐＧＢ／ＩＬ−３１６およびｐＧＢ／ＩＬ−３１８をラクターゼプロ モーター領域中の特有Ｂａｃ１１部位で消化し、Ｋ、−ラクチス（Ｋ、　１ａｃ ｔｉｓ　）株ＣＢ５２３６０　（６４参照）の形質転換に用いた。従ってプラス ミドの組込みは染色体ラクターゼ遺伝子プロモーター領域に標的させる。生じた Ｇ４１８耐性形質転換体を液体ＹＥＰＤ培地中で飽和に増殖させ、培養上澄みお よび細胞熔解物を、ＡＭＬ細胞ＤＮＡ合成検定を用いてＩＬ−３活性について検 定した。

事実上すべてのＩＬ−３が培地中へ分泌され、活性であると思われた。培養上澄 みのタンパク質を、エタノールを用いて沈澱させ、変性ポリアクリルアミドゲル 電気泳動、次にウェスタンブロッティングを用いて分析した。主生成物は約２１ ｋｄ見掛けＭＷを有し、また約１５ｋｄに明らかなバンドが認められる。後者の 生成物はおそらく成熟非グリコジル化ＩＬ−３に相当し、２１ｋｄ生成物は２潜 在グモ 物である。エンドグリコシダーゼＨとともにインキュベートするとタンパク質の １５ｋｄ範囲への移動を生じ、ＩＬ−３がすべて分泌過程中に正しくプロセシン グされることおよびタンパク質の大部分がグリコジル化されていることを示唆す る。

実施例７ サツカロミセス−セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ　）発ベクターの　築 Ａ、ＣＢ／ＴＬ−３１，９の 初めにｐＧＢ／ＴＥＦａｃｔと称される発現ベクターを構築した。

このｐＴ２１８Ｒ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）製〕由来プラスミド 上にＳ、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）翻訳延長因子（ＥＦ−１ α）プロモーター配列〔文献（７３，７４）に記載されたようにクローン化し、 配列決定した〕を、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ　）　Ｄ　Ｎ　Ａ合成装置を用いて合成したＳ、セレビシェ（Ｓ、 　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）アクチン転写ターミネータ−配列（７５）に小５ａ ｌｌ　ＢｇｌＩｌ−Ｘｈｏｌリンカ−により結合させる０発現カセントの配列は 第２４図に示される。残基１〜９４９はＥＦ−１４プロモーターを含む、残基９ ５０〜９６７はＳａｉｌ−ＢｇｌＩＩ−Ｘｈｏ１リンカ−の配列を含む、残基９ ６８〜１１１３はアクチンターミネータ−配列を含む。

ｐＧＢ／ＴＥＦａｃｔ中の特有５ｓａＩ部位を用いて実施例６に記載した０４１ ８耐性カセツトに導入した。生じたプラスミドをｐ　ＧＢ／ＴＥＦａｃｔ　Ｇ　 ４１８と名づけた。

最後にＳａｔ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ切断ｐＧＢ／ＴＥＦａｃｔ　Ｇ４１８プラスミ ド中へ次のＤＮＡ配列を導入することによりｈｌＬ−３発現ベクターｐＧＢ／Ｉ Ｌ−３１８を構築したニー　Ｓ、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　） α因子シグナル配列およびＮｒｕ１部位までのｈｌＬ−３コーディング配列をも つｐＧＢ／ＩＬ−３１６のＳａｌ　Ｉ　−Ｎｒｕ　Ｉフラグメント、−ｈｌＬ− ３をコードする残余ヌクレオチドおよびＴＧＡＲ止コドン直後のＸｈｏｌ認識配 列を含む合成Ｎｒｕｌ　ＸｈｏｌＤＮＡフラグメント。

Ｂ、サツカロミセス８セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｖｉｓ ｉａｅ　）のノ　−　および　パ、ｈｌＬ−３の プラスミドｐＧＢ／ＩＬ−３１９をＥＦ−１αプロモーター中の特有ＥｃｏＲ１ 部位で切断した。従ってプラスミドの組込みは染色体ＥＦ−１α領域に標的させ る。Ｓ、セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）野生型株Ｄ２７３−１０３　 （アルフｙＣａｌｐｈａ　）　；　ＡＴＣＣ２５６５？）をに、ラクチス（Ｋ、 　１ａｃｔｉｓ　）に対して記載されたように形質転換した（６４）、０４１８ 耐性コロニーを摘み、形質転換体を液体ＹＥＰＤ培地中で飽和させた。培養上澄 みは、ＡＭＬ検定を用いてｈ　Ｉ　Ｌ−３活性について検定した。Ｓ、セレビシ ェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）により生成されたタンパク質は生物活性で あると認められた。

上澄みのタンパク質を、エタノールを用いて沈澱させ、次にポリアクリルアミド ゲル電気泳動、次いでウェスタンプロンティングにより分析した。２つの顕著な 生成物、２１ｋｔｉグリコジル化生成物および約１５ｋｄの非グリコジル化生成 物、をウェスタンプロット上で識別できた。

参照文献 １、　メトカーフ（Ｍｅｔｃａｌｆ　Ｄ、　）＋　ブランド（Ｂｌｏｏｄ　）　 ６７．２５７〜２６７　（１９８６）。

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３８、フェインベルグはか（Ｆｅｉａｂｅｒｇ　Ａ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｖｏｇｅ ｌｓｔｅｉａ　Ｂ、）＋アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｓ、　）１３２．６〜１３（１９８３）。

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４０、クイーンはか（Ｑｕｅｅｎ　Ｃ，ａｎｄ　Ｋｏｒｎ　Ｌ、Ｊ、　Ｌニエク リーク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　）　１２． ５８１〜５９９（１９８４）。

４１、スタテン（５ｔａｄｅｎ　Ｒ，）−ニュクリーク・アシズ・リサーチ（Ｎ ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ、）１０，２９５１〜２９６１　（１９８２）。

４２、ドベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　Ｊ、　）ほか、ニュクリーク・アシド・リ サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　）　１２．３８７〜３９５（１ ９８４）。

４３、リップマンほか（Ｌｉｐｓａｎ　Ｄ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｐｅａｒｓｏａ　 Ｈ，Ｒ，Ｌ　サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２２７．１４３５〜１４４１　 （１９８５）。

４４、サブラマニほか（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　Ｓ、　ａｎｄ　５ｏｕｔｈｅｒｎ 　Ｐ、　Ｊ、　Ｌアナ４５、ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ　Ｍ、　）ほか、セル（ Ｃｅｌｌ）１４．７２５〜７３１　（１９７８）。

４６、マイディック（Ｍａｊｄｉｃ　Ｏ，）ほか、インタナショナル・ジャーナ ル・オブ・カンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　）　３３．６１７〜６２ ３　（１９８４）。

４７、ロウエンベルレグはか（Ｌｏｉｅｅｎｂｅｒｇ　Ｂ、　ａｎｄ　Ｂａｕｍ ａｎ　Ｊ、　Ｇ、　Ｊ、　）＋ブラッド（Ｂｌｏｏｄ　）　６６．１２２５〜１ ２３２　（１９８４）。

４８、デルウェル（Ｄｅｌｗｅｌ　Ｒ，）ほか、ブランド（Ｂｌｏｏｄ　）　６ ８．４１〜４５（１９８６）。

４９、スワート（Ｓｗａｒｔ　Ｋ、　）ほか、ブランド（Ｂｏｏｌｄ　）　５９ ．８１６〜８２１　（１９８２）。

５０、スワートはか（Ｓｗａｒｔ　Ｋ、　ａｎｄ　Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ　Ｂ、　 Ｌカンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）　４４．６５７〜６６０　 （１９８４）。

５１、タウ−（Ｔｏｕｗ　１．　）ほか、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ　）　６８．１ ０８８〜１０９４　（１９８６）。

５２、ビエイラはか（Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、　 Ｌジーン（Ｇｅｎｅ）１９．２５９〜２６８　（１９８２）。

５３、オシンガ（Ｏｓｉｎｇａ、　Ｋ、＾、）ほか、ニュクリーク・アシヅ・リ サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）　１１．８５９５〜８６０ ８（１９８３）。

５４、グリクツアン（Ｇｒｙｃｚａｎ＋　Ｔ、　Ｃ，）ほか、ジャーナル・オプ ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）　１３４．３１８〜 ３２９（１９７８）。

５５．カワムラほか（ｉ［ａｗａｍｕｒａ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｄｏｉ＋　Ｒ，Ｂ 、　）＋ジャーナＡ／−オプ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ ｇｙ　）　ｌ　６０．４４２〜４４４　（１９８４）。

５６、プロンほか（Ｂｒｏｎ、　ｓ、　ａｎｄ　Ｖｅｎｅｍａ＋　Ｇ、　）＋ム チージョン・リサーチ（Ｍｕｔａｔ、　Ｒｅｓ、　）　１５．１〜１０　（１９ ７２）。

５７、ジプリアンはか（Ｚｙｐｒｉａｎ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｍａｔｚｕｒａ、　 Ｂ、　）　ＤＮＡ　５．２１９〜２２５　（１９８６）。

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６０、スタンセンズ＜　５ｔａｎｓｓｅｎｓ　Ｐ、　）ほか、「タンパク質工学 および部位特異的変異誘発（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ 　５ｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　）Ｊ　＊第２４回ハ ーデン・コンフェレンス・プログラム・アンド・アブストラクツ（τｗｅｎｔｙ −ＦｏｕｒｔｈＨａｒｄｅｔ＋　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、　Ｐｒｏｇｒａｍ　ａ ｎｄ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　）　（１９８５）〔ファージエトほか（Ｆｅｒｓｈ ｔ、　Ａ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｗｉｎｔｅｒ＋　Ｇ、　）［３＊６１、レイス（Ｒｅ １ｓｓ、　Ｂ、　）ほか、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）３．３３１７〜 ３３２２　（１９Ｂ４）。

６２、ベネツエンはか（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、　Ｊ、　Ｌ、　ａｎｄ　Ｈａｌｌ 、　Ｂ、　Ｄ、　）＋　ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ 、　Ｂｉｏｌ。

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６４、米国出願第０７８．５３９号、１９８７年７月２８日提出。

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６６、マンケンジー（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ、　Ｔ、　）ほか、プラスミド（−Ｐｌ ａｓｍｉｄ　）１５．９３〜１０３　（１９８６）。

６７．７７ケンジー（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ＋　Ｔ、　）ほか、プラスミド（Ｐｌａ ｓｍｉｄ　）１７．８３〜８５（１９８６）。

６８、欧州特許出願第８７２０１３７９．２号、１９８７年７月２０日提出。

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７０、ロウ（Ｌａｗ、Ｍ−Ｆ）ほか、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ ロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　）　３．２１１０〜２１１５（１９ ８３）。

フ１．バーＦ　（Ｂｚｒｔ、　Ｂ−）＋　ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ イオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）　２６．３６５〜３６７（１９６ ７）。

７２、スアレンッ・レンジュールス（５ｕａｒｅｚ　Ｒｅｎｄｕｅｌｅｓ、　Ｍ 、　Ｐ、　）ほか、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　）１３１．２９ ６〜３００　（１９８１）。

７３、ナヤタ（Ｎａｊａｔａ、　Ｓ、　）ほか、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢ　 ＯＪ、）３．１８２５〜１８３０　（１９８４）。

７４、ナガシマ（Ｎａｇａｓｈｉｍａ、　Ｋ、　）ほか、ジーン（Ｇｅｎｅ　） 　４５．２６５〜２７３　（１９８６）。

７５、ガルライフッはか（Ｇａ１１ｗ１ｔｚ、　Ｄ、　ａｎｄ　５ｕｒｅｓ、　 ！、　）、プロシーディングズ・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サ イエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　Ｕ　Ｓ　Ａ　 ７７．２５４６〜２５５０　（１９８０）。

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Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．組換ＤＮＡ物質から誘導された遺伝物質を含み、ヒトＩＬ−３をコードする 形質転換生宿主細胞。
2. ２．酵母、細菌、真菌および組織培養細胞からなる群から選ばれる、請求の範囲 １記載の形質転換生宿主細胞。
3. ３．サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクルイべロミセス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の群から選ばれる、請求の範囲２記載の形質転換 酵母宿主細胞。
4. ４．Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバシラス（ＢａｃｉｌＩｕｓ）の群から選 ばれる、請求の範囲２記載の形質転換細菌宿主細胞。
5. ５．ＣＯＳ、Ｃ１２７および昆虫細胞の群から選ばれる、請求の範囲２記載の形 質転換組識培養宿主細胞。
6. ６．発現系が宿主中の有効な制御配列に作動可能に連結されたヒトＩＬ−３をエ ンコードするＤＮＡ配列から実質的になる組換宿主中で作動できる発現系。
7. ７．ヒトＩＬ−３をエンコードするＤＮＡがイントロンを含まない、請求の範囲 ６記載の発現系。
8. ８．制御配列が１ａｃプロモーター、ＨｐａＩＩプロモーター、σ４３プロモー ター、α−アミラーゼプロモーター、ＥＦ−１αプロモーターおよびＳＶ４０プ ロモーターからなる群から選ばれるプロモーターを含む、請求の範囲６または７ 記載の発現系。
9. ９．請求の範囲６〜８のいずれか一項に記載の発現系で形質転換された請求の範 囲１〜５のいずれか一項記載の組換宿主細胞。
10. １０．ｐＧＢ／ＩＬ−３００〜ｐＧＢ／ＩＬ−３１９からなる群から選ばれるベ クター。
11. １１．ｐＬＢ４およびｐＬＢ４／ＢＰＶの群から選ばれるベクター。
12. １２．ヒトＩＬ−３をエンコードする、イントロンを含まない組換ＤＮＡ配列。
13. １３．第１図の配列「Ｈ」中にアミノ酸１〜１３３をエンコードするとして示さ れるヌクレオチド配列を含む、請求の範囲１２記載のＤＮＡ。
14. １４．宿主細胞によりヒトＩＬ−３を生産する方法であって、転写の方向に前記 宿主細胞中で機能する転写開始調節領域、ヒトＩＬ−３をエンコードするＤＮＡ 配列、および前記宿主中で機能する転写終結調節領域、を含む発現カセットを含 むＤＮＡ構築物を前記宿主細胞中へ導入し、 前記ＤＮＡ構築物を含む前記宿主細胞を栄養培地中で適当な培養条件下に増殖さ せ、それによりヒトＩＬ−３を生産させ、ヒトＩＬ−３生成物を回収する、 ことを含む方法。
15. １５．宿主細胞が請求の範囲１〜５または９のいずれか一項に記載されたとおり である、請求の範囲１４記載の方法。
16. １６．ヒトＩＬ−３活性を有するタンパク質であって、前記タンパク質に伴なわ れる他の物質を実質的に含まない精製タンパク質。
17. １７．第１図の配列「Ｈ」中にアミノ酸１〜１３３をエンコードするとして示さ れるＤＮＡ配列またはその天然存在変異体の組換発現により生産される、請求の 範囲１６記載のタンパク質。
18. １８．グリコシル化または非グリコシル化形態における、請求の範囲１６または １７記載のタンパク質。
19. １９．請求の範囲１〜５または９のいずれか一項に記載の形質転換宿主細胞中で 生産された請求の範囲１６〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
20. ２０．ヒトＩＬ−３と免疫特異反応できる抗体調製物。
21. ２１．請求の範囲１６〜１９のいずれか一項に記載の精製ヒトＩＬ−３を脊椎動 物に注入することを含む、ヒトＩＬ−３と免疫特異反応できる抗体調製物を生産 する方法。