PT86381B - Processo de clonagem molecular e de expressao de interleuquina-3 (il-3) humana - Google Patents

Description

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Eurupeia,em 16 de Dezembro de 1986 sob o No.86202285.2 e em 13 de Julho de 1987 sob o No. 87201322.2

INPI. MOO. 113 RF 16732

patente de invenção de GIST-BRO CADES N.V., holandesa, industri al e comercial, com sede em 1, Wateringseweg, P.O. Box 1,2600 MA Delft, Holanda, (inventores: Dr. Ir. Lambertus Christiaan Johannes Dorssers, Dr. Gerard Wagemaker, Yvonne Johanna Vos e Robert Willem Van Leen, residen tes na Holanda), para PROCESSO DE CLONAGEM MOLECULAR E DE EXPRESSÃO DE INTERLEUQUINA-3 (IL-3) HUMANA.

MEMÓRIA DESCRITIVA

Domínio da Invenção

A presente invenção descreve um pro cesso para a obtenção de ADNc que codifica para a interleuquina-3 humana (hIL-3) e a um processo que utiliza este ADN para, nomeadamente, clonagem e expressão em vários organismos, incluindo microorganismos, em particular em leveduras, bactérias e fungos, células de culturas de tecidos e animais ou plantas transgénicos,

Bases da Invenção • Designa-se por hemopoiese o proces. so activo de proliferação e de diferenciação de células progeni

Ί toras pluripotentes nos diversos tipos de células do sangue madu ras e em células de alguns tecidos especializados. A produção de células do sangue funcionais é regulada por proteínas específicas, os factores de crescimento hemopoiêticos (hemopoietic growth factors = HGFs). Alguns dos HGFs regulam a maturação duma li nhagem de maturação específica enquanto que outros estimulam a proliferação e a diferenciação dos progenitores ao longo de múltiplas vias. Grande parte do nosso conhecimento sobre o processo de diferenciação hemopoiêtico foi obtido a partir de estudos em ratos in vitro e in vivo usando factores de crescimento purifica dos. 0 factor murino de crescimento conhecido por interleuquina-3 murina (mIL-3), também designado por multi-CSF (cell stimulation factor: factor de estimulação celular), por factor de crescimento de células em bastonete, por factor de activação das células indiferenciadas ou por várias outras designações, estimula a proliferação de células multipotentes (CFU-S) de desenvolvimen to precoce, efeito que é detectado por contagem de colónias de baço, tendo como resultado a produção de células progenitoras bem como de eritróides, megacariõcitos, granulõcitos/macrófagos, osteoblastos e várias outras linhagens. Além disso, a mIL-3 tem sido implicada na replicação de células indiferenciadas pluripotentes, provavelmente em sinergismo com outros HGFs.

Em anos recentes vários grupos tive ram êxito na clonagem de ADNc da mIL-3. Até agora não foi relata do qualquer resultado de identificação de sequências homologas em ADN humano usando ADN da mIL-3 como sonda. Ê de presumir que o gene humano divergiu em alto grau do gene da mIL-3 ou que perdeu a sua função durante a evolução dos primatas. No entanto des. cobriu-se que leucócitos humanos produzem um HGF ou HGFs que podem substituir a mIL-3 como agente da proliferação de CFU-S no rato. Deste modo foi postulada a existência dum HGF humano que partilha as propriedades biológicas com a mIL-3 e que portanto poderia ser o respectivo homólogo humano. Yang, Y-C et al., Cell (1986) 47 : 3-10, com data de 10 de Outubro, descreve ADNc que codifica para uma proteína que possui actividade semelhante ã IL -3 das células T do gibão e o isolamento de ADN genómico que codifica para uma proteína análoga humana. Ê possível deduzir a se quência dum ADNc que codifica para a IL-3 humana a partir da sequência do gene humano publicada por Yang et al.. No entanto o trabalho referido não descreve um ADNc que codifica para a IL-3 humana nem ensina um método para o isolamento deste ADNc e também não contêm qualquer descrição da produção de hIL-3. A presen te invenção descreve pela primeira vez o isolamento dum ADNc que contêm a sequência integral que codifica para a IL-3 humana.

A proteína IL-3 humana nunca foi preparada sob a forma pura nem nunca foram descritas as respecti vas características, para além da sua actividade em análises de proliferação in vitro e da estrutura primária deduzida. A presen te invenção permite o isolamento de IL-3 humana pura e a identificação das respectivas características por meio de produção por técnicas recombinantes a partir dum clone de ADNc.

Resumo da Invenção

Como anteriormente afirmado, a presente invenção descreve pela primeira vez o isolamento dum ADNc que contém a sequência integral que codifica para a IL-3 humana. 0 baixo grau de homologia entre as sequências de ADN que codificam para a IL-3 murina e para a IL-3 humana não permite o isolamento do ADNc da hIL-3 por hibridação com a sequência que codifi^ ca para a mIL-3. Verificou-se surpreendentemente que ê possível isolar o clone de ADNc da hIL-3 aproveitando o grau de homologia relativamente alto na parte 3' não codificante dos ADN's. Quando se dispõe do clone de ADNc torna-se possível a produção de hIL-3 por uma grande variedade de organismos hospedeiros. Depois de se proceder à produção da proteína em grande escala é possível proceder à sua purificação e à utilização terapêutica.

A presente invenção permite a produ ção da proteína IL-3 humana recombinante numa grande variedade de células hospedeiras por transcrição e tradução duma sequência de ADNc que codifica para a proteína IL-3 humana. A produção da proteína ê ilustrada seguidamente em vários hospedeiros, incluin do E. coli, células COS, células C127, B. subtilis e B. licheniformis, S. cerevisiae, e K. lactis. Também se tornou possível a produção em outros hospedeiros mediante o uso de sistemas de expressão apropriados por meio da utilização de ADNc sem intrões. Mais geralmente, o facto de se dispor de anticorpos de IL-3 anti -humanos que permitem a identificação de colónias que levam a uma produção viável da proteína recombinante possibilita a produ ção de IL-3 humana a partir de qualquer sistema recombinante.

De acordo com um aspecto da presente invenção, por conseguinte, refere-se a preparação de ADN recombinante sem intrões que codifica para a proteína IL-3 humana.

De acordo com outro aspecto da presente invenção descreve-se a preparação de sistemas de expressão com capacidade para efectuar a expressão da sequência referida de ADN que codifica para a hIL-3 num hospedeiro apropriado.

De acordo com outros aspectos, a presente invenção diz respeito à preparação da proteína IL-3 humana recombinante sob a forma glicosilada ou não glicosilada, de IL-3 humana isenta das substâncias que normalmente acompanham a referida proteína e de anticorpos que reagem de forma especifica com estas proteínas recombinantes ou purificadas.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 apresenta uma comparação das sequências de ADN e das proteínas de multi-CSF humana e da IL-3 de rato. A sequência de hmulti-CSF e a do ADN (Clone Dll, linhas da parte superior) foram alinhadas com a sequência do ADN de mIL-3 (11, 35) e a da respectiva proteína (30). Os nucleõtidos idênticos estão indicados por uma linha vertical e os ácidos aminados idênticos estão contidos em caixas. Os sinais de poliadenilação são indicados por pontos e as unidades de repetição ATTTA estão marcadas por traços horizontais.

A figura 2 apresenta a construção do plasmídeo pLB4 que contêm o ADNc da IL-3 humana. E = EcoRI, Sm = Smal, B = BamHI, S = SstI e K = Kpnl.

A figura 3 apresenta a actividade biológica de COS/pLB4 CM em progenitores da medula óssea humana. Apresentam-se os números médios (+ DP) de colónias de eritróides (BFU-E), de granulõcitos-macrõfagos (CFU-GM), de granulocitos (CFU-G), de eosinôfilos (CFU-Eo), de macrõfagos (CFU-M) e de cul turas mistas (CFU-MIX) para culturas em duplicado estimuladas com volumes crescentes de COS/pLB4 CM.

A figura 4 mostra a indução da proliferação de AML por COS/pLB4 CM medida por analise duma cultura de colónias (painel A) e por análise numa síntese de ADN (incorporaçao de H-TdR) (painel B).

A figura 5 mostra um diagrama de construção dos vectores de expressão em E. coli pGB/IL-301, GB/II. -302, pGB/IL-303, pGB/IL-304, pGB/IL-305 e pGB/IL-306, Nesta figura, X representa um local Xhol, E representa um local EcoRI, B representa um local BamHI e A representa um local Aval.

A figura 6 apresenta a sequência do local de multiclonagem em pTZ18R (Pharmacia) e do seu derivado pTl.

A figura 7 mostra uma representação esquemática de clones de expressão de hmulti-CSF. Apenas se apre senta a inserção de ADNc de hmulti-CSF para os plasmldeos de expressão eucariótica pLB4 e pLHl. As regiões de codificação para o peptideo guia (Q2ZZ3) e para a proteína de hmulti-CSF madura () são apresentadas em caixas. Os clones de expressão bacteriana de hmulti-CSF (derivados de pLHl) contêm a região de codificação para lacZ e para a proteína multi-adaptador (ΕΠΕΠ) _t a re gião 5' terminal não codificante de hmulti-CSF (I i) e a região de codificação hmulti-CSF. A flecha indica o codão ATG de início utilizado no vector particular.

A figura 8 apresenta as sequências das regiões de fusão de ADN de lacZ/hmulti-CSF para vários vecto res de expressão bacterianos. A sequência de clones ê dada a par tir do início da proteína lacZ tanto em pUC8 como em pTZ18R (letras minúsculas) e da sequência de ADN de hmulti-CSF atê ao local Ciai na posição 158. As mutações na sequência de ADN de hmul 13 13 ti-CSF estão sublinhadas, dando como resultado: trp —► arg (pGB/IL-302); leu⁹—» pro⁹ e trp¹³—►arg¹³ (pGB/IL-303); met³—> 3 ~ thr e uma alteraçao silenciosa (pGB/IL-304). Os numeros em expo ente significam o número do resíduo de ácido aminado na proteína ί

»Sí.

f madura.

A figura 9 apresenta uma electroforese em gel de poliacrilamida de hmulti-CSF bacteriano produzido a partir de bactérias que contêm pGB/IL-301 e pGB/IL-302.

A figura 10 apresenta a titulação de uma proteína de fusão hmulti-CSF em células blásticas AML.

A figura 11 mostra uma analise de mancha de Western que demonstra a reacção específica de IL-3 de anti-soro de coelho desenvolvido por reacção contra a proteína de 21 kd isolada a partir do lisado de E. coli transformado com pGB/IL-301.

A figura 12 mostra o efeito do anti -soro da figura 11 na actividade de IL-3.

A figura 13 mostra uma representação esquemática do plasmídeo pGB/IL-307. A caixa QgSSKJ) indica a sequEncia de codificação para a IL-3 humana. Os ácidos aminados terminais da proteína de fusão estão representados sob o desenho.

A figura 14 mostra uma representação esquemática do plasmídeo pGB/IL-308. A sequência de nucleõti dos da região do promotor está representada sob o desenho.

A figura 15 apresenta a construção do plasmídeo pGB/IL-309. A primeira caixa indica uma parte da sequência da IL-3 humana, nomeadamente a sequência de sinal mais 20 ácidos aminados da proteína madura. A outra caixa (i i) indica parte da região 3' não codificante da sequência de ADNc da IL-3.

é uma representação esmostra a sequência de apresenta a construção (^/////Λ) indica a

A figura quemática do plasmídeo pGB/IL-310.

A figura nucleõtidos do plasmídeo pBHAl.

A figura dos plasmldeos pGB/IL-311 e pGB/IL-312. A caixa região de codificação do percursor da IL-3 humana.

A figura 19 apresenta a construção do plasmídeo pGB/lL-313. A sequência do lado 5’ da sequência da IL-3 está representada sob o desenho.

A figura 20 mostra uma representação esquemática do plasmídeo pGB/IL-317.

A figura 21 mostra uma representação esquemática do plasmídeo pGB/IL-316.

A figura 22 apresenta a sequência de nucleõtidos do plasmídeo pGB/IL-316 entre o local SacII singu lar no promotor de lactase e o local HindIII depois do terminador (resíduos 4457 a 7204) .

A figura 23 apresenta a sequência de nucleõtidos do plasmídeo pGB/IL-318 entre o local SacII singu lar no promotor de lactase e o local HindIII depois do terminador (resíduos 4457 a 7190).

A figura 24 apresenta a sequência de nucleõtidos do promotor de EF-loc do adaptador SalI-BglII-Xhol e do terminador de actina tal como aparecem no plasmídeo pGB/TEFact.

Descrição pormenorizada da Invenção

A - Definições

Na presente descrição utilizam-se os termos IL-3 humana, hIL-3, multi-CSF humano e hmulti-CSF indiferentemente para designar uma proteína que apresenta as seguintes actividades:

1. A proteína estimula a formação de colónias por células progenitoras hemopoiéticas humanas e as colónias formadas incluem eritrõides, granulõcitos, granulõcitos macrõfagos e colónias mistas.

2. A proteína estimula a síntese de ADN por células blásticas de leucemia mielogénia aguda (acute myelogenous leukemia = AML), como se verifica, por exemplo, pela absorção de timidina marcada.

Para corresponder ã definição de hmulti-CSF, a actividade nas análises descritas não deve ser ini bida de modo substancial por anticorpos desenvolvidos em resposta a GM-CSF e imunoespecificos para este factor, a menos que estes anticorpos também inibam estas actividades pela forma ilustrativa de hmulti-CSF seguinte.

Na figura 1 apresenta-se uma forma ilustrativa de hmulti-CSF sob a forma de uma proteína madura de 133 ácidos aminados possuindo uma sequência de sinal de 19 ácidos aminados. A sequência de ácidos aminados da figura 1 ê idêntica à descrita por Yang, Y-C., et al., Cell (1986) 47:3-10(supra) excepto na posição 8 da proteína madura, sendo a Ser substi tulda na proteína de Yang por Pro nesta posição. Conforme demons trado em seguida, esta sequência de ácidos aminados ê efectiva na sua forma não glicosilada. No entanto esta sequência contêm dois locais de glicosilação e a forma glicosilada está também in cluída no âmbito da presente invenção. Mencione-se que a proteína pode existir sob a forma de um sal de adição de ácido, sob a forma de um sal básico ou pode ser neutra, dependendo do pH do meio. Por derivatização por meio de fosforilação, de acetilação ou por outros meios, desde que a actividade não seja destruída, ê obtida uma proteína também incluída no âmbito da presente invenção,

Mencione-se também que pode acontecer que não seja necessária a sequência integral para que se manifeste a actividade. Conforme ilustrado na presente memória dess critiva, a alanina na posição 1 pode ser suprimida, podendo também ser suprimidos os primeiros resíduos de ácidos aminados até um máximo de catorze se forem substituídos por uma sequência de resíduos duma sequência peptídica fundida. Além disso crê-se que a forma murina da proteína apenas requer os primeiros 79 resíduos para a actividade; esta situação corresponde aproximadamente aos 83 primeiros resíduos da forma humana. Deste modo, os fragmentos que contêm apenas os 83 primeiros resíduos de ácidos aminados da proteína e as suas formas contendo substituições na extremidade N-terminal estão também incluídas no âmbito da presente invenção. Além disso deve ser considerado que a extremidade N-terminal da hIL-3 madura é formada pelos resíduos ala-pro-met etc. (ver figura 1). Sabe-se que a proteína, quando segregada por uma levedura hospedeira, pode, em alguns casos, ser encurtada em dois ácidos aminados (ala-pro), devido à interacção com uma dipeptidil-aminopeptidase (72) . A hIL-3 sem a alanina e a prolina

N-terminais conserva ainda a actividade biológica. As estirpes de levedura que contêm uma mutação de anulação no gene de X-prolil-dipeptidilaminopeptidase produzirão hIL-3 completa (ácidos aminados 1 a 133). Deste modo consideram-se incluídos nos multi-CSFs da presente invenção tanto os que contêm como os que não contêm a alanina e a prolina N-terminais, produzidos por hospedeiros mutantes de X-prolil-dipeptidilaminopeptidase e por hospe deiros de tipo selvagem, respectivamente.

Quando a proteína ê produzida sob a forma duma proteína madura num hospedeiro procariõtico, a sequên cia de codificação para a proteína madura ê prefaciada por um co dão de início. A metionina N-terminal resultante pode em seguida ser eliminada, ou removida parcialmente, por processamento no in terior da célula hospedeira, dependendo da natureza da sequência de ácidos aminados que se segue. Novamente ambas as formas de hIL-3 são biologicamente activas. Por conseguinte, consideram-se incluídos nos hmulti-CSFs da presente invenção tanto os que contêm como os que não contêm a metionina N-terminal.

Do que ficou dito ê claro que podem ser introduzidas alterações de ácidos aminados da proteína IL-3 humana sem afectar a respectiva função biológica. Alterações menores nas sequências de ácidos aminados por modificação química do resíduo codificado, por substituição dum resíduo diferente ou por supressão ou por adição de um ou vários resíduos, de preferência apenas de um, têm como resultado proteínas que conservam a actividade. Deste modo, estas mutações não destrutivas estão também abrangidas na presente invenção, em particular as variações alêlicas de ocorrência natural e outras mutações que não se jam letais para a actividade.

Por outro lado, deve ter-se em conta que alterações de ácidos aminados na proteína IL-3 humana podem ser benéficas para a utilização terapêutica da proteína. Tal como reconhecido na presente especificação, a proteína madura contêm quatro domínios conservados nos resíduos 15 a 36, 54 a 61, 74 a 91 e 107 a 118. São possíveis proteínas contendo alterações de ácidos aminados simples ou múltiplas nas regiões não conserva das, 1 a 14 (que podem ser, de qualquer modo, substituídas pelas sequências de proteínas de fusão derivadas do hospedeiro), 37 a 53, 62 a 73, 92 a 106 e 119 a 133. No entanto crê-se que os resí duos de cisteína nas posições 16 e 84 podem ser necessários para formação de pontes de dissulfureto uma vez que estes resíduos são conservados de espécie para espécie. As alterações nos domínios conservados mencionadas anteriormente podem influenciar as propriedades biológicas da proteína, tais como ligação ao receptor e transduçao do sinal. Considera-se que a hIL-3 com as propriedades alteradas terá utilidade terapêutica. Estes derivados de hIL-3, que podem ser preparados por intermédio de técnicas de manipulação de proteínas conhecidas, são considerados abrangidos pelo âmbito da presente invenção.

O preparado da proteína pode conter os peptídeos de hmulti-CSF sob uma forma monomérica ou agregada, desde que os agregados mantenham a actividade tal como acima definida.

Na presente memória descritiva o termo sistema de expressão diz respeito a uma sequência de ADN que contêm tanto a sequência de codificação cuja expressão se pretende como as sequências de regulação apropriadas em ligação operacional com a sequência de codificação referida, de forma a possibilitar a respectiva expressão quando as sequências de regu lação são compatíveis com o hospedeiro no qual o sistema de expressão esta colocado. Em geral considera-se que o termo sequên cias de regulação diz respeito a segmentos de ADN necessários para regular a expressão da sequência de codificação com a qual esses segmentos se encontram ligados de modo operacional.

As sequências de regulação incluem, em todos os hospedeiros, os promotores, os quais podem ser ou não reguláveis por modificações no respectivo ambiente. Os promo tores típicos adequados para procariontes incluem, por exemplo, o promotor de trp (inductível por privação de triptofano), o pro motor de lac (inductível com o análogo de galactose IPTC), o pro motor de beta-lactamase e o promotor P^ derivado de um fago (inductível por variação de temperatura). Adicionalmente, especialmente para a expressão em Bacillus, são também promotores úteis os promotores de alfa-amilase, de protease, de Spo2 e sequências

promotoras sintéticas. Os promotores adequados para expressão em leveduras incluem o promotor de 3-fosfoglicerato-quinase e os promotores para outras enzimas glicolíticas, bem como as regiões de promotor para desidrogenase de ãlcool e para fosfatase de levedura. Também são uteis o promotor do factor de elongação de transcrição (transcription elongation factor = TEF) e o promotor de lactase. A expressão em mamíferos geralmente utiliza promotores derivados de vírus tais como os sistemas de promotores de adenovírus e do promotor de SV40, mas também pode utilizar promo tores reguláveis, tais como o promotor de metalotioneína, que ê regulado pela concentração de metais pesados ou de glucocorticói des. Também se encontram disponíveis sistemas de expressão em cê lulas de insectos com base em vírus bem como sistemas de expressão baseados em promotores de células de plantas, como sejam os promotores de sintetase de nopalina.

Além da sequência de ADN do promotor, que é necessária para a transcrição do gene pela polimerase de ARN, são também úteis para a regulação da expressão uma varie dade de sequências de regulação, incluindo as que comandam a ter minação (por exemplo provocando sequências de poliadenilação em sistemas eucariõticos). Alguns sistemas contêm também elementos de reforço que são convenientes mas não necessariamente indispen sáveis para a efectivaçao da expressão.

Os comandos de tradução incluem um local de ligação ribossõmico (ribosome binding site = RBS) em sistemas procarioticos, enquanto que em sistemas eucariõticos a tradução pode ser comandada pela sequência de nucleõtidos junto do codão AUG.

De acordo com as considerações ante riores, pode efectuar-se a produção de proteína recombinante numa larga variedade de hospedeiros, incluindo bactérias (predominantemente E. coli, Bacillus e Streptomyces), leveduras e fungos (tais como Saccharomyces, Kluyveromyces e Aspergillus) e culturas de células de mamífero ou outras, tais como células COS, células C127, células de ovário de hamster chinês, células de Spodoptera frugiperda (Sf9) e outras. A proteína pode ser produzida sob a forma duma proteína intracelular madura ou de fusão ou pode ser segregada quando o gene contêm incluído o ADN que codifica para um sinal compatível apropriado.

A presente invenção possibilita pela primeira vez a produção em larga escala de IL-3 humana recombinante, podendo por conseguinte esta proteína ser agora usada - sob uma forma purificada - como agente terapêutico. Os métodos descritos seguidamente proporcionam meios para a produção de for mas glicosilada e não glicosilada da proteína, as quais podem ser purificadas para se obter IL-3 humana sob a forma substancialmente pura. A expressão IL-3 humana purificada” significa II-3 humana tal como anteriormente definida que se encontra sob uma forma isenta de outras proteínas que normalmente a acompanham.

B. Isolamento de ADNc que codifica para IL-3 humana

A IL-3 humana foi isolada de acordo com a seguinte estratégia:

1. Foi desenvolvido um procedimento que possibilita a produção de modo reproductível de factores de crescimento hemopoietico (HGFs) por leucócitos humanos.

2. Preparou-se ARNm a partir das cê lulas produtoras referidas e transcreveu-se o mesmo em ADNc de dupla cadeia.

3. Seleccionou-se a partir do ADNc com um ADNc completo de mIL-3 contendo tanto a porção de codificação como a porção 3' não traduzida a juzante de forma a obter DII.

4. Inseriu-se o clone DII de ADNc que hibrida num vector de expressão pLO a fim de obter pLB4, o qual é expresso em células COS para confirmar a presença da sequência que codifica para a IL-3 humana. Meios condicionados obtidos a partir destas células apresentaram a actividade biológica esperada de hIL-3.

ADNc humano foi isolado usando es; te procedimento apesar de uma considerável falta de homologia com a sequência de codificação murina porque se verificou existir um grau de homologia surpreendente na região 3' não traduzida. Os requerentes não têm conhecimento de qualquer descrição an terior da utilização de uma homologia numa sequência 3' não traduzida para o isolamento dum gene duma espécie diferente.

Mais em pormenor, um meio condicionado de linfôcitos na presença de 13-acetato de 12-o-tetradecanoilforbol (TPA) e de concanavalina A (Con A) constitui uma origem adequada de HGFs humanos, o que se pode verificar por análise do meio usando uma estimulação de CFU-S de rato em culturas em suspensão, proliferação de células DA-1 dependentes de mIL-3, análise de progenitores hemopoiéticos humanos por formação de co lõnias in vitro e estimulação in vitro de células blásticas de leucemia aguda. Construiu-se um banco de ADNc a partir de linfõcitos humanos no fago gt-10 lambda (20) e seleccionou-se usando o fragmento HindIII-Xbal de ADNc de mIL-3 relativamente à ocorrência de sequências relacionadas com a mIL-3. Não foram identificados quaisquer clones que hibridassem.

No entanto, quando se usou para son da o ADNc integral de IL-3 murina, foram identificados quatro clones. Por análise por enzimas de restrição do clone maior (Dll) verificou-se a existência duma inserção de 910 pb contendo um lo cal EcoRI interno (na posição 411 na figura 1).

(Investigou-se se este local EcoRI era originário de ligação de dois fragmentos independentes de ADNc ou se era um local de ocorrência natural. Por meio de anãli se de Southern de ADN humano digerido com enzimas de restrição usando fragmentos EcoRI 5' e 3' marcados do clone Dll como sonda, verificou-se a existência de fragmentos de ADN idênticos a seguir a digestão com HindIII (15 kb) e BamHI (4,6 kb). Para além disso, a sequência de ADN junto do local EcoRI não corresponde à sequência do adaptador (pCCGAATTCGG) usado para a inserção do ADNc em ADN fágico, indicando que estes fragmentos EcoRI são derivados dum único ARNm.)

A partir de experiências de hibrida ção e de sequenciação concluiu-se que os clones menores (II, IV e VI) são idênticos à sequência de necleõtidos 3' do clone Dll e derivam da mesma espécie de ARNm.

Por meio de alinhamento assistido por computador (figura 1) do ADNc de Dll e do ADNc de mIL-3 veri_ ficou-se a existência de homologia de sequências na extremidade 5' terminal de 100 pb entre os nucleõtidos 236 e 269 e entre os nucleotidos 598 e 803 na região 3' terminal (68%, 71% e 73% de homologia, respectivamente). Em particular, a região entre os nu cleotidos 706 e 763 apresenta um alto grau de conservação (93% de homo logia) e contêm sequências repetitivas ricas em AT. A baixa homologia na extremidade 5' terminal de 600 pb do ADNc humano (52%) exclui a detecção por hibridação com o fragmento HindIII-Xbal da mIL-3.

Por analise do clone de ADNc humano quanto a uma proteína codificada verificou-se a existência dum quadro de leitura livre antes do codão de terminação TGA na posi ção 495 a 497 (figura 1). O primeiro tripleto ATG ê provavelmente o verdadeiro codão de inicio do polipeptideo codificado. A presumível proteína codificada consiste num peptídeo guia hidrofõbico de 19 ácidos aminados, o qual provavelmente ê cindido entre os resíduos de glicina e de alanina (22 e 23).

O alinhamento dos resíduos previstos de ácidos aminados da IL-3 humana e do rato (figura 1) revela uma homologia de 50% para o peptídeo guia (residuos -26 a +1) e de 28% para a proteína madura (resíduos 1 a 133). No interior do peptídeo guia existem duas regiões conservadas de quatro ácidos aminados (resíduos -13 a -10 e -3 a +1), dos quais o segundo contêm o local de processamento. A proteína madura tem um compri mento de 133 ácidos aminados e tem um peso molecular de 15 kd. A proteína madura tem quatro domínios conservados (resíduos 15 a 36, 54 a 61, 74 a 91 e 107 a 118) e contêm dois locais de potencial glicosilação (resíduos 15 a 17 e 70 a 72). Os dois resíduos de cisteína presentes na proteína humana (posições 16 e 84) são conservados e podem desempenhar uma função essencial na dobragem da proteína por formação de ponte de dissulfureto.

A fim de se verificar que este ADNc humano codifica para uma proteína funcional que ê semelhante à mIL-3, inseriu-se o ADNc do Dll num vector de expressão eucariõtico (pLO, contendo uma unidade de transcrição de SV40) a fim de obter o vector de expressão pLB4 e transfectou-se para células COS 1. Experimentou-se o meio condicionado por COS/pLB4 (CM) com o fim de (1) verificar a respectiva capacidade para estimular a formação de colónias por células da medula õssea humana e (2) pa ra estimular células blãsticas de leucemia mielogénia aguda (AML) humana.

crescimento in vitro de colónias de progenitores hemopoiêticos humanos desprovidos de células aces sõrias mielomonocíticas (positivas em relação a Vim-2) e linfoci ticas T (positivas em relação a T-3) foi estimulado eficientemen te por CM COS/pLB4. Os dados demonstram a existência de estimula ção dos progenitores de várias linhagens de diferenciação hemopoiética e de uma subpopulação de BFU-E por CM COS/pLB4.

Numa experiência separada, enriqueceu-se em relação a células progenitoras medula õssea por centri fugação com gradiente de densidade, com sedimentação de rosãcea E para remoção de linfõcitos T e por aderência para remover os fagõcitos mononucleares, e em seguida cultivou-se em meio enriquecido contendo soro fetal de vitela. Nestas condições, a maioria das colónias obtidas apôs estimulação com CM/COS/pLB4 continham duas ou mais linhagens de diferenciação hemopoiéticas: todas continham macrôfagos, aproximadamente metade de células blãs ticas imaturas e/ou células eritrõides imaturas e/ou granulõcitos neutrofílicos e uma minoria, adicionalmente, de granulõcitos basofilicos e eosinofilicos. Estes resultados demonstram as propriedades de estimulação multilinhagem da proteína codificada pe lo clone Dll de ADNc humano e a respectiva acção nas células hemopoiêticas multipotentes de desenvolvimento precoce.

Com respeito ã estimulação de AML, foram estimuladas células AML blãsticas de cinco pacientes por meio de CM COS/pLB4 e analisou-se para verificar uma resposta por medida da incorporação de °H-TdR e de formação de colónias. Três das cinco amostras de células de leucemia responderam ao CM COS/ /pLB4 em ambas as analises; foram obtidas relações caracteristicas dose-resposta para a formação de colónias e para a síntese de ADN de células blãsticas AML de diferentes pacientes. As respostas a GM-CSF demonstraram adicionalmente diferenças fenotípicas entre as leucemias que responderam a CM COS/pLB4.

Estes dados demonstram que o clone

Μη

de ADNc Dll contém a informação genética completa para uma proteína biologicamente activa que ê exportada para o meio de cultu ra nas células COS transformadas. Apesar da aparente falta de ho mologia com respeito à sequência proteica entre a proteína humana e a mIL-3 (apenas 30%), as proteínas são comparáveis com respeito à respectiva função biológica. Ambas as proteínas exercem o seu efeito em progenitores hemopoiéticos de várias linhagens de desenvolvimento precoce. A baixa homologia ao nível dos ácidos aminados ê também reflectida por uma baixa homologia na sequência dos nucleõtidos de codificação. No entanto, de forma inteiramente inesperada, verificou-se que existe um alto grau de homologia - suficiente para isolamento do clone de ADNc humano na região 3’ não traduzida.

Por análise de Southern do ADN huma no verificou-se a existência de um único gene que hibrida, indicando que este ADNc não pertence a uma família de genes infimamente relacionados.

A partir dos resultados anteriores concluimos que a inserção de ADNc humano em Dll codifica para a proteína humana homóloga de mIL-3. Decidimos usar o termo operacional de hmulti-CSF para a proteína codificada pelo clone Dll de ADNc tendo em vista o seu principal efeito biológico e análise.

A identificação de clones de ADNc de hmulti-CSF em virtude de hibridação com a região terminal 3’ do ADNc da mIL-3 era inesperada. Enquanto que as sequências de ADN homólogo são em geral encontradas predominantemente na região de codificação, a sequência de hmulti-CSF divergia extensivamente (45% de homologia) nesta parte do gene. Uma análise do domínio altamente conservado na região não codificante terminal 3’ revela a ocorrência de 5 unidades repetidas ATTTA que se conservam todas no ADNc da mIL-3 (figura 1).

As proteínas hmulti-CSF e mIL-3 apresentam um grau de homologia consideravelmente inferior ao de outros factores de crescimento ou linfoquinas murinos e humanos, tais como GM-CSF (25) , interleuquina-2 (25) , interleuquina-1 (26) e interferões (27 a 29). A actividade biológica da mIL-3 madura

parece estar contida nos primeiros 79 ãcidos aminados, incluindo uma exigência absoluta da presença dum resíduo de cisteína na po sição 17 (30). Este resíduo de cisteína mantém-se conservado no hmulti-CSF (Fig. 1, pos. 16) e pode desempenhar um papel essenci al na dobragem da proteína. A ocorrência dum local de potencial glicosilação na proximidade deste resíduo de cisteína pode inter ferir com a formação duma ponte de dissulfureto.

C. Produção e formulação de hmulti-CSF

Os requerentes conseguiram uma variedade representativa de sistemas de expressão capazes de produ zir a proteína IL-3 humana sob uma variedade de formas - como proteínas de fusão, como proteínas intracelulares maduras e como proteínas segregadas. Os requerentes não têm conhecimento da exis. tência anterior de acordo com o estado da técnica de formas recombinantes de IL-3 humana, ou mesmo de qualquer IL-3 humana num preparado isento das proteínas que normalmente acompanham a proteína pretendida. Por conseguinte, a presente invenção proporcio na pela primeira vez a proteína IL-3 humana dum modo capaz de adaptação a utilizações terapêuticas e de diagnostico.

A IL-3 humana pode ser produzida sob a forma duma proteína de fusão com sequências heterõlogas em relação à sequência de ãcidos aminados da IL-3 humana. Por heterõ Ioga compreende-se uma sequência que não ê encontrada na própria IL-3 humana mas é uma sequência não relacionada com aquela. Esta sequência heteróloga pode ser derivada duma proteína bacteriana, duma proteína duma levedura, duma proteína dum mamífero ou pode ser qualquer uma das variedades sequências fortuitamente codificadas tais como, por exemplo, as codificadas por poliadaptadores. Ê evidente, a partir dos resultados apresentados seguidamente, que pelo menos os primeiros 14 ãcidos aminados da extre midade N-terminal da sequência da IL-3 humana podem ser substituídos por uma sequência heteróloga, pelo menos se a proteína de fusão se extende ainda para além da extremidade N-terminal.

A proteína pode também ser obtida sob a forma duma proteína madura intracelular por construção de sequências nas quais o codão de início ATG ê colocado imediataΊ *7

mente a montante da extremidade N-terminal pretendida. Estas pro teínas intracelulares, quer sejam proteínas maduras quer de fusão, podem ser recuperadas por lise das células e por purificação da IL-3 humana mediante o uso de técnicas normais de purificação de proteínas.

A purificação da proteína é mais simples se a IL-3 humana for segregada para o meio. Quando produ zida em células de mamífero com as quais a sequência nativa de sinal ê compatível, esta sequência nativa de sinal pode ser usada para provocar a secreção para o meio. Em sistemas bacterianos ou de leveduras, podem ser usadas sequências de sinal compatíveis com estes hospedeiros, tais como as sequências de penicilinase ou de alfa-amilase em bactérias ou a sequência de sinal do factor alfa em leveduras.

Quando produzida por técnicas recom binantes, a IL-3 humana apresenta-se isenta das proteínas que normalmente a acompanham e pode ser purificada das proteínas e de outros materiais indígenas do hospedeiro recombinante usando, por exemplo, métodos cromatogrãficos, filtração por gel, precipi tação por sulfato de amónio e outras técnicas.

Conforme descrito seguidamente, a proteína ê útil para fins terapêuticos e de diagnóstico. Para fins terapêuticos a proteína pode ser incorporada em formulações de acordo com as técnicas normalmente utilizadas para a preparação de composições farmacêuticas adequadas para a administração de proteínas. São excipientes adequados, por exemplo, solução sa lina fisiológica e solução de Ringer, entre outros. Também podem ser empregues formas alternativas de formulação, incluindo formu lações sólidas (p. ex. liofilizadas).

D. Preparação de anticorpos facto de se poder dispor de proteína IL-3 recombinante ou de fracções desta proteína permite a produção de anticorpos dirigidos contra a proteína ou contra as suas fracções, conforme demonstrado seguidamente. Tais anticor. pos são úteis, nomeadamente para a detecção in vitro de colónias * produtoras de hIL-3, para uso terapêutico e para a purificação de hIL-3 tanto de origem natural como recombinante.

Declaração de Utilidade

A sequência de nucleõtidos do ADNc da IL-3 humana integral ou de fracções deste ADNc ou sequências intimamente relacionadas com este ADN possibilitam com vantagem a detecção de anormalidades genéticas, incluindo rearranjos genô micos, polimorfismos de dimensão de fragmentos de restrição, mutações e expressão de genes alterados mediante o uso.de técnicas como a analise de ADN cromossomal usando enzimas de restrição, de técnicas de mancha de ADN e de ARN bem como de técnicas de hi bridação (Maniatis et al. 1982) e de electroforese em gel bidimensional (Fisher e Lerman, 1983).

hmulti-CSF recombinante proporcio nado pela presente invenção facilitará uma análise em pormenor da respectiva função na hemopoiese humana, em particular o possí vel sinergismo do hmulti-CSF e de vários outros HGFs. Para além disso, o hmulti-CSF apresenta um interesse considerável devido à sua aplicabilidade para o diagnostico in vitro de doenças humanas nas quais as células progenitoras hemopoiêticas se encontram envolvidas, doenças essas que incluem a leucemia, bem como em aplicações terapêuticas potenciais no sentido duma expansão da hemopoiese in vivo. 0 efeito do hmulti-CSF sobre várias afecçÕes malignas hemopoiêticas com respeito à diferenciação terminal das células leucémicas também necessita de ser explorado. Além disso o hmulti-CSF pode ser necessário para o estabelecimento dum esta do de proliferação de células indiferenciadas humanas em protoco los de terapia genética, uma vez que se verificou que a estimula ção com IL-3 ê necessária para se conseguir resultados positivos na infecção de células indiferenciadas de rato com retrovírus re combinantes deficientes com respeito ã replicação.

A proteína IL-3 também pode ser usa da com vantagem para a detecção de células percursoras hemopoiéticas precoces em culturas in vitro (Wagemaker e Visser, 1980; Metcalf et al., 1982; Merchav e Wagemaker, 1984; Metcalf, 1986).

A proteína IL-3 e as respectivas va

riantes podem adicionalmente ser usadas para a multiplicação de células indiferenciadas hemopoiêticas in vitro, possivelmente em conjunção com outros factores de crescimento, para a transplanta ção de medula õssea e para a manipulação genética de células indiferenciadas (Lowenberg e Dicke, 1977; Wagemaker e Petem, 1978; Lemischka et al., 1986).

A proteína IL-3 pode ser usada para a determinação do padrão de resposta de células hemopoiêticas ma lignas em experiências in vitro (Touw e Lowenberg, 1985; Griffin et al., 1986; Griffin e Lowenberg, 1986).

A proteína IL-3 pode ainda ser usada para a detecção de células leucémicas remanescentes por métodos in vitro (Touw e Lowenberg, 1986; Griffin et al., 1986; Grif fin e Lowenberg, 1986).

Para além disso, a proteína IL-3 po de ser usada in vivo para o tratamento e para a prevenção de afecções malignas e não malignas, quer por si própria quer em com binação, podendo uma resposta específica obtida pelo sistema hemopoiêtico ter como resultado um benefício clínico.

Estas aplicações incluem:

- citopenias e/ou imunossupressão devida a infecções, como por exemplo no caso de SIDA

- citopenias devidas a quimioterapia e/ou a irradiação

- afecções ósseas tais como fracturas ósseas e osteoporose

- imunodeficiências devidas a procedimentos de anestesia geral

- recuperação a seguir a transplantação de medula óssea

- adjuvante de vacinas e terapia adjuvante para infecções.

A sequência de ADN de IL-3 humana clonada ou de um ADN intimamente relacionado pode ser usada para terapia genética em desvios genéticos do gene normal da IL-3.

A fim de facilitar a analise acima descrita torna-se necessário dispor duma grande quantidade de IL -3 humana. 0 meio mais fácil de obtenção de quantidades suficien tes desta proteína consiste na sua produção por intermédio de mi croorganismos, em particular de leveduras, de bactérias ou de • fungos, por exemplo, espécies de Saccharomyces, Kluyveromyces,

Aspergillus, Streptomyces, Bacillus e E. coli. Também é possível a produção em células de mamíferos ou em outros sistemas eucarió ticos, tais como células C127, células de Spodoptera e animais ou plantas transgénicos, por peritos na matéria mediante os ensi namentos da presente invenção.

Com um fim ilustrativo de como é possível obter células humanas que produzem a proteína IL-3 huma na por expressão do ADNc da hIL-3, construíram-se vários plasmídeos e transferiram-se estes plasmídeos para E. coli, B. subtilis, B. licheniformis, S. cerevisiae, K. lactis e células C127. Mediante o uso destas estirpes hospedeiras conseguiu-se a produção de IL-3 humana recombinante. Os produtos obtidos foram exper. mentados para verificação da respectiva capacidade de estimulação de células blãsticas de AML humanas, tal como descrito anteriormente para o meio condicionado de COS/pLB4. A partir destas experiências verificou-se que as proteínas preparadas eram biolo gicamente activas. Os exemplos que se seguem tem por finalidade ilustrar a presente invenção sem que de algum modo restrinjam o seu âmbito.

EXEMPLO 1

Isolamento do ADNc que codifica para o multi-CSF humano (hmulti-CSF)

Leucócitos humanos estimulados por TPA (5 ng/ml) e ConA (10 ug/ml) produziram quantidades considera veis de HGFs de acordo com determinações efectuadas por meio da análise de proliferação de células indiferenciadas e por várias outras análises de colónias. As células foram separadas 24 h depois da estimulação, uma vez que a produção de ARNm muitas vezes tem um regime transiente a seguir a estimulação com ésteres de forbol e lecitinas. Após 24 h os HGFs já eram facilmente detectã veis no CM.

Preparação de ARNm

Separaram-se as células, lavaram-se com PBS e homogeneizaram-se em solução de isotiocianato de guani dínio (36). 0 ARN foi isolado através dum leito de cloreto de cé sio. Para a selecção dos ARN's usou-se cromatografia em oligo (dT)-celulose (36).

Síntese de ADNc

Sintetizou-se o ADNc essencialmente de acordo com a técnica de Gubler e Hoffman (37) usando oligo (dT) como iniciador e transcriptase inversa de AMV. A segunda ca deia foi sintetizada com RNaseH e polimerase I de ADN de E. coli. As interrupções foram fechadas com ligase de ADN T4 e as extremi dades foram alisadas com polimerase de ADN T4. A fim de proteger os locais de restrição EcoRI internos, metilou-se o ADNc com metilase de EcoRI. Em seguida ligou-se o ADNc a adaptadores de EcoRI fosforilados com ligase de ADN T4. Após digestão com EcoRI o excesso de adaptadores foi eliminado por cromatografia em Sepharose CL-4B. 0 material isolado no volume vazio da coluna tinha um comprimento superior a 250 pb e foi usado para a construção dos bancos.

Construção do banco de ADNc fãgico

Ligou-se o ADNc a braços do fago gtlO lambda (20) e acondicionou-se com extractos de acondicionamento comerciais (Gigapack, Vector Cloning Systems). Os fagos re combinantes foram propagados em E. coli C600 hfl.

Selacção do banco de fagos

De cada cultura contendo 1 a 5000 placas foram preparadas duas réplicas em filtro de nitrocelulose de acordo com os procedimentos normais. Os filtros foram em seguida hibridados com uma sonda de mIL-3 marcada com radioisõtopos do fragmento HindIII-Xbal do ADNc da mIL-3 ou com o clone de ADNc de mIL-3 integral marcado com isótopos radioactivos com ini ciadores aleatórios. O clone de ADNc da mIL-3 (pLIOl) foi isolado a partir dum banco de ADNc de WEHI-3B. O ARNm de WEHI-3B foi isolado mediante o uso do método de isotiocianato de guanidínio e CsCl, sendo em seguida fraccionado em função da dimensão em

gradiente de sucrose e injectado em ocôcitos de Xenopus laevis. As fracções de ARN que induziram a produção de um factor com capacidade para manter a proliferação de células indiferenciadas murinas nos oõcitos foram usadas para a síntese de ADNc como anteriormente descrito; acrescentaram-se ao ADNc extremidades com resíduos de dC e inseriu-se no local PstI do plasmldeo pUC9. Ider tifiçaram-se os clones de mIL-3 mediante o uso de oligonucleõtidos sintéticos (a partir da sequência de mIL-3 publicada, 11). A inserção de pLlOl foi purificada em gel de poliacrilamida e foi utilizada para efectuar a selecção do banco de ADNc humano. A sonda de ADN foi marcada utilizando o método do iniciador aleatõ rio (38). As placas potencialmente positivas foram novamente seleccionadas e purificadas. Deste modo foram identificados quatro clones, incluindo o fago Dll.

Sequenciação de clones de ADNc

Cultivaram-se fagos recombinantes em grande escala e purificaram-se, separaram-se as inserções de ADNc dos braços dos fagos por digestão com EcoRI e purificaram-se em gel de poliacrilamida. Os fragmentos purificados foram li gados em ADN de M13mpl8 e pTZ18R digerido com EcoRI e foram usados para transformação de E. coli JM109. Preparou-se ADN de cadeia simples e sequenciou-se de acordo com os procedimentos habjL tuais (39). Os resultados da sequenciação foram analisados por meio de vários programas de computador (40-43).

A sequência obtida para a inserção no fago Dll ê apresentada na figura 1. Esta sequência de 910 pb contém a região de codificação integral para o hmulti-CSF e a respectiva sequência de sinal e apresenta um alto grau de homolo gia com o clone murino pLlOl na região não traduzida 3'. A homologia a montante na sequência de codificação ê relativamente mais limitada. Tal como descrito anteriormente, a proteína tem uma presumível sequência de sinal de 19 ácidos aminados seguida pela proteína madura com 133 ácidos aminados contendo dois locais de glicosilação (15 a 17 e 70 a 72) e dois resíduos de cistelna nas posições 16 e 84.

A sequência de ácidos aminados dedu

zida ê idêntica ã sequência codificada pelo ADN genõmico descrito por Yang, Y-C, et al. (ver acima), excepto no que se refere a um ácido aminado - o ácido aminado na posição 8 da presumível proteína madura; o ADN de Yang codifica para Ser enquanto que o ADNc da presente invenção codifica para Pro.

A sequência isenta de intrões obtida no fago Dll pode ser usada para expressão procariêtica bem co mo para expressão em sistemas eucariõticos, de acordo com a ilus tração apresentada seguidamente.

EXEMPLO 2

Expressão em células de mamífero

A. Construção do vector de expressão eucariõtico pLB4

Digeriu-se o fago Dll (contendo a inserção maior de ADNc) com HindIII e BglII e subclonou-se no plasmídeo pTl (um derivado do plasmídeo pTZ18R contendo vários locais de restrição adicionais no multi-adaptador, ver Exemplo 3A). Identificaram-se por análise de restrição clones contendo o fragmento fãgico que continha a inserção de ADNc. A inserção de ADNc foi retirada deste plasmídeo por digestão parcial com EcoRI e foi purificada por electroforese em gel de poliacrilamida. 0 fragmento apropriado foi inserido num vector de expressão eucariõtico (pLO) numa unidade de transcrição de SV40.

vector pLO ê constituído por: EcoRI (preenchido) - PstI de pBR322 (1-755), PstI-Aval de pBR329 (756-1849), adaptador Aval-PvuII (1850-1868), PvulI-HindIII (pre enchido) de SV40 (promotor) (1869-2211), adaptador PvuII-BamHI contendo um sítio singular EcoRI (2211-2251) , fragmento de encajL xe Mbol de SV40 (2252-2861), fragmento poli A Bcil-BamHI (preenchido) de SV40 (2862-3098), fragmento promotor Pvul-HindIII de SV40 (3099-3440), gene Eco gpt HindIII-BamHI (3441-4501), fragmento de encaixe Mbol de SV40 (4502-5111) e o fragmento poli A BclI-BamHI (preenchido) de SV40 (5112-5348).

A unidade de transcrição Eco gpt

A não tem qualquer importância na expressão transiente de proteínas em células COS 1. 0 plasmídeo de expressão resultante para hmulti-CSF foi denominado pLB4 e foi purificado em CsCl. Este plasmídeo foi depositado em E. coli no Centraal Bureau von Schim melcultures (CBS), Baarn, Países Baixos, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste em 12 de Dezembro de 1986 sob o numero 568.86. A construção é apresentada na figura 2.

B. Expressão de hmulti-CSF em células COS 1 e análises biológica s

Transfectou-se o ADN do vector pLB4 em células COS 1 usando o método de co-precipitação com fosfato de cálcio (45). As células foram cultivadas durante 48 a 72 horas em meio alfa contendo 10% de soro fetal de vitela. 0 meio de cultura foi separado e filtrado, sendo usado em análises para de terminação da respectiva actividade biológica. Levaram-se a efei to análises por meio de colónias de células progenitoras de medu la õssea e de células blãsticas mielõides agudas e análises de proliferação do modo seguinte. A medula õssea foi obtida a partir de voluntários adultos hematologicamente normais por punção ilíaca posterior após consentimento consciente. As células mononucleadas foram separadas por centrifugação com gradiente de densi dade obtido com ficol (Nijegaard and Co., Oslo, Noruega), sendo em seguida lavadas e suspensas novamente em solução salina equilibrada de Hanks (Hanks balanced salt solution = HBSS). Nesta fa se as células mielõides e os linfócitos T foram separados. Para este fim as células da medula foram lisadas após incubação com anticorpos monoclonais OKT-3 (CD3; Ortho, Ravitan, N.Y.) e Vim 2 (células mielo-monocíticas, 46) a concentrações de saturação na presença de complemento de coelho (40%; 30 minutos, 259 C) de acordo com procedimentos normais (47). As células foram lavadas duas vezes em HBSS, suspensas novamente em meio de Dulbecco modi ficado de acordo com Iscove (Iscove's modified Dulbecco*s médium = IMDM) e cultivadas na presença de plasma autólogo de acordo con. Fauser e Messner (16), tal como descrito anteriormente (48), até uma concentração de 1,5 a 3 x 10^/ml. Adicionaram-se 1 U/ml de eritropoietina (carneiro, fase III, Connaught, Willowdale, Canadá) e CM COS/pLB4 para estimulação do crescimento. Também são a-

presentados resultados de culturas normalizadas com leucócitos CM estimulados por fito-hemaglutinina (PH-LCM) em comparação directa com CM COS/pLB4. Colheram-se sessenta por cento das colónias e identificaram-se por análise ao microscópio. 0 CM das cêlulas COS transfectado com o vector sem inserção (pLO) não exerceu por si só qualquer acção de estímulo da formação de colónias. Os resultados são apresentados na figura 3. Na figura apresentam-se os numeros médios de colónias de eritróides (BFU-E), de granulócitos-macrófagos (CFU-GM), de granulócitos (CFU-G), de eosinõfilos (CFU-Eo)_t de macrõfagos (CFU-M) e de colónias mistas (CFU-MIX) (+ DP) em culturas realizadas em duplicado estimuladas com volumes crescentes de CM COS/ /pLB4.

Indução da proliferação de AML (ver figura 4)

Purificaram-se células blãsticas

AML por gradiente de densidade usando uma albumina de bovino (BSA). Os linfócitos T residuais foram removidos das amostras de AML por sedimentação de rosácea E (17, 49, 50). Determinou-se a formação de colónias de AML (paciente 1) não apenas no sistema de alimentação de leucócitos PHA estabelecido (PHA l.f) mas igua] mente numa versão modificada da técnica na qual os leucócitos fo ram substituídos por CM COS/pLB4, permitindo a avaliação da respectiva actividade de estimulação das colónias (17, 18, 49, 50), tal como se apresenta na figura 4A. Todas as experiências foram levadas a efeito em triplicado. A síntese de ADN de AML blásticos (paciente 2) foi determinada por meio da integração de timidina, como descrito (51) com resultados apresentados na figura 4B. Ambas as determinações mostraram uma relação de dependência da dose para o CM COS/pLB4 adicionado. A adição de meio COS de comparação não teve qualquer efeito sobre a proliferação de AML em qualquer das análises.

C. Construção do vector de expressão eucariótico pLB4/BPV

A fim de estabelecer linhas de célu las estáveis que efectuassem a expressão de IL-3 humana, trans-

fectaram-se células C127 (ATCC CRL 1616) com um derivado de pLB4. Este derivado foi construído por inserção do genoma BPV-1 integral (69) no plasmídeo pLB4 de acordo com a seguinte estratégia. 0 fragmento BamHI de BPV-1 foi retirado do vector pdBPV-MMTneo (342-12) (70) . As extremidades coesivas BamHI foram preenchidas mediante o uso de polimerase de Klenow. Em seguida o vector pLB4 foi cortado no local EcoRV singular dentro do gene Eco gpt. Em seguida o fragmento BPV-1 de extremidades alinhadas foi clonado no plasmídeo pLB4 cortado com EcoRV, obtendo-se como resultado o vector pLB4/BPV que tem capacidade de se replicar em células C12'i I Transfectou-se o vector pLB4/BPV para células C127 usando o mêto do de precipitação de fosfato de cálcio (45). As células transfectadas foram cultivadas durante 16 dias e em seguida os focos foram colhidos das placas de cultura. Foram estabelecidas várias linhas de células independentes. Verifica-se que o vector pLB4/ /BPV é mantido de forma estável no interior das células, de acor do com análise de mancha de Southern de extractos de Hirt (71) de várias linhas de células. Experimentou-se a actividade de II-3 do meio de cultura condicionado por meio da análise de proliferação de AML. As linhas de células estáveis produzem IL-3 huma na activa.

I EXEMPLO 3

Construção de vectores de expressão de E. coli

A. Construção de pGB/IL-301 (ver figuras 5, 6, 7 e 8)

Para a construção de vectores de ex pressão de E. coli introduziram-se as seguintes modificações nos procedimentos normais (36).

1. Suprimiram-se as sequências terminais 3' não codificantes entre o local Aval (posição 541) e o local Xhol (posição 856) no plasmídeo pLB4 por fusão dos fragmen tos de ADN a seguir ao preenchimento das extremidades coesivas com enzima de Klenow (figura 5).

* 2. Para introdução da inserção de * hmulti-CSF num vector de expressão bacteriano, levaram-se a efei to as seguintes fases. Digeriu-se o vector pLHl com Aval e preen cheram-se as extremidades reentrantes com polimerase de Klenow. Após ligação dum adaptador de BglII (CAGATCTG), digeriu-se o ADN com BglII e BamHI. Purificou-se o fragmento BglII-BamHI de hmulti-CSF em gel de poliacrilamida e subclonou-se no local BglII do plasmídeo pTl, um derivado do plasmídeo pTZ18R (Pharmacia) modificado no local de clonagem múltipla (ver figura 6). Foram obtidos dois clones contendo a inserção em orientação oposta em rela ção ao promotor de lacZ (ver figura 5). Isolaram-se inserções destes dois clones em gel de poliacrilamida após digestão com BglII e EcoRV e subclonaram-se no plasmídeo pTl digerido com Bgll e HindII. A junção do adaptador de BglII e do ADN de hmulti-CSF foi verificada por analise de sequência verificando-se a existên cia duma junção do adaptador ao local Avall localizada no nt 1 do clone de ADNc (este local Avall resultou da ligação do adapta dor de EcoRI com a molécula de ADNc). Uma vez que esta construção (pGB/IL-300) não estava em fase com a proteína lacZ, subclonou-se a inserção BglII-EcoRV no plasmídeo pUC8 (52) digerido com BamHI e HindII. A construção resultante (pGB/IL-301, ver figuras 5, 7 e 8) foi experimentada para verificação da produção da proteína de fusão lacZ/hmulti-CSF.

B. Construção dos vectores pGB/IL-302, pGB/IL-303, pGB/IL-304 e pGB/IL-305 (figuras 5, 7 e 8)

Introduziram-se várias alterações de bases na sequência de codificação para a parte N-terminal das proteínas de fusão por introdução de oligo-nucleõtidos sintéticos no vector pGB/IL-300. Os novos vectores de expressão denominados pGB/IL-303 e pGB/IL-304 foram construídos do modo seguinte: Isolou-se o fragmento Hind II - Hind III do vector pGB/IL-300 em gel de agarose e ligou-se este fragmento num oligonucleõtido sin tético contendo os nucleõtidos 99 a 137 do hmulti-CSF e uma sequência de reconhecimento Sal I terminal 5, inserindo-se no vector pTZ18R digerido com Sal I e Hind III. Analisaram-se as sequências de vários clones. Constatou-se a ocorrência de várias alterações de bases tendo como resultado modificações na proteína hmulti-CSF. Transferiram-se para o vector pUC8 inserções de vã rios clones para a expressão da proteína de fusão lacZ (pGB/IL-302, pGB/IL-303). Fez-se com que o clone pGB/IL-304 ficasse em fase com a sequência lacZ por ligação do local Sal I após preenchimento das extremidades reentrantes. A construção foi verifica da por digestão com Pvu I. vários clones tinham um oligonucleõti do sintético a menos e verificou-se que estavam fundidos em fase com a proteína lacZ. Um destes clones foi denominado pGB/IL-305.

C. Construção de pGB/IL-306 (ver figuras 5, 7 e 8)

Preparou-se um vector de expressão que codifica para uma proteína sem os ácidos aminados na extremi dade N-terminal de lacZ a partir de pGB/IL-300 por meio dum ciclo de supressão tal como descrito em (53). O oligonucleótido sintético continha 22 nucleótidos a montante do gene lacZ de PTZ incluindo o codão de início ATG e os primeiros 24 nucleótidos que codificam para a IL-3 madura. Este plasmídeo foi designado por pGB/IL-306 (figuras 5, 7 e 8).

Foram depositadas no CBS em 13 de Julho de 1987 estirpes de E. coli contendo os plasmldeos pGB/IL-300, pGB/IL-301 e pGB/IL-302 sob os números CBS 377.87, CBS

379.87 e CBS 378.87, respectivamente.

A figura 8 mostra a sequência de re giões de fusão para os diversos plasmídeos construídos. A sequên cia dos clones ê dada a partir do início da região de codificação da proteína lacZ tanto no vector pUC8 como no pTZ18R (letras minúsculas) e na região de codificação do hmulti-CSF (letras maiusculas) até ao local Cia I na posição 158. As mutações na se quência do ADN do hmulti-CSF estão sublinhadas; estas mutações têm como resultado as alterações trp -► arg (pGB/IL-302); leu pro^ e trparg^^ (pGB/IL-303) ; net^—► thr^ e uma mo dificação silenciosa (pGB/IL-304).

No pedido de patente da prioridade EP 87201322.2, apresentado em 13 de Julho de 1987, foram usadas outras designações para estes plasmídeos, do modo seguinte:

pGB/IL-300 = pT-hIL3;

pGB/IL-301 = pUC/ hmulti;

pGB/IL-302 = pUC/ hmulti Δ1A;

pGB/IL-303 = pUC/ hmulti Δ1B;

pGB/IL-30 = pUC/ hmulti Δ1C;

pGB/IL-30 = pUC/ hmulti Δ 2 pGB/IL-30 = pTZ/ hmulti;

D. Expressão das proteínas de fusão lacz/ hmulti-CSF e hmulti-CSF madura em E. Coli

Cultivaram-se estirpes de E. coli (JM 109) contendo 50 g/ml de ampicilina a 379 C até se atingir uma densidade õptica de 0,5 a 550 nm. Em seguida adicionou-se IPTG (isopropil-beta-tiogalactosido, Pharmacia) à cultura até uma concentração final de 1 mM e continuou-se a incubação durante 3 a 4 horas.

Os plasmídeos pGB/IL-306 e pGB/IL-302 foram também utilizados para transformação em E. Coli DH1 (operação lacZ tipo selvagem). As estirpes foram cultivadas em meio LB ou em meio TY 2 x contendo 50 pg/ml de ampicilina a 379 C durante 16 horas.

As bactérias foram separadas por centrifugação e foram desintegradas por ultra-sons em tampão con tendo Tris/HCl 0,1 M a pH 8,0; EDTA 5 M, Nonidet p40 (NP-40) a 0,2% e fluoreto de fenil-metilsulfonilo (PMSF) 1 M. Centrifugou-se durante 30 min. a 20 000 x g. Por electroforese em gel de po liacrilamida das fracções do sólido e do sobrenadante verificou-se que a maior parte das proteínas hmulti-CSF se encontra na bactéria sob uma forma insolúvel.

Extraiu-se novamente a fracção sóli da com tampão com 0,5% de NP-40 e em seguida solubilizou-se com ureia 8 M, Tris/HCl 0,1 M a pH 8,0 e ditiotreitol 5 M. Deste modo conseguiu-se uma purificação considerável das proteínas de fu são (figura 9).

Tal como se pode verificar pela figura isolaram-se corpos de inclusão das bactérias (E. Coli) contendo os plasmídeos pGB/IL-301 e pGB/IL-302 tal como se descreve. As pistas referem-se ao sobrenadante de 0,2% de NP-40 (a amostra corresponde a 0,1 ml da cultura de bactérias original). As pis tas 2 referem-se ao sobrenadante de 0,5% de NP-40 (0,2 ml) e as pistas 3 ao sólido da centrifugação solubilizado em tampão de ureia 8 Μ (A: 0,05 ml; B 0,2 ml). As proteínas foram separadas num gel de poliacrilamida com 13,5% de SDS e foram coradas com Azul Brilhante de Coomassie. Ã direita representam-se os pesos moleculares (em kd) das proteínas de marcação (pista M). As proteínas de fusão de multi-CSF humano são indicadas por flechas. A proteína de fusão codificada pelo plasmídeo pGB/IL-301 tem um pe so molecular, tal como esperado, de cerca de 20 kd ;a proteína de fusão produzida por intermédio do plasmídeo pGB/IL-302 tem um p.m. de cerca de 16 kd.

E. Determinação da actividade biológica de preparados de hmulti-CSF bacteriano

Diluiram-se preparados da proteína bacteriana em meio alfa contendo 1% de albumina de soro de bovino, esterilizaram-se por filtração e analisaram-se por meio da analise de proliferação de AML blãsticos. Adicionaram-se amostras diluídas a células blãsticas AML e cultivaram-se durante quatro dias. A síntese de ADN foi medida usando H- timidina, como descrito (51). Uma unidade por ml ê definida como a quantidade de hmulti-CSF necessária para a proliferação de metade do máximo de células blãsticas AML. A figura 10 apresenta esta análise. Anali saram-se várias diluições da preparação de proteína extraída por ureia de bactérias contendo o plasmídeo pGB/IL-302 para verifica ção da estimulação da proliferação de células blãsticas AML usan do H-timidina. A concentração de proteína de fusão deste preparado proteico era de 33 pg/ml. Com base na curva de titulação apresentada calculou-se a actividade deste preparado em 16 000 unidades/ml.

A quantidade de proteína de fusão bacteriana nos preparados foi estimada a partir de electroforese em gel de poliacrilamida e usou-se o resultado para cálculo das actividades específicas.

Os resultados são apresentados no quadro seguinte:

QUADRO I

Actividade Biológica de Preparados de hmulti-SCF bacteriano

	P.m. (xlO de lacZ/ hmulti (D	pg/de proteína por ml (2)	Unidades por ml (3)	Actividade es pecífica em unidades pr mg de IL-3
pGB/IL-301	20	20	45	4,500
pGB/IL-302/303	16	5	2400	480,000
pGB/IL-304	18	ND(4)	18	-
pGB/IL-305	16	1	300	300,000
pGB/IL-306	15	ND	70	ND
1. Os pesos moleculares aproximados foram estimados	a partir da

2.

3.

4.

sequência de ADN correspondente à proteína de fusão (figura 8) As concentrações de IL-3 foram estimadas em gel de SDS-poliacrilamida e foram calculadas por ml da cultura de origem.

A actividade da proteína solubilizada por ureia foi determina da na análise de proliferação de AML e está expressa por ml da cultura de origem.

Não determinado.

A partir dos resultados anteriores concluiu-se que o multi-CSF humano expresso sob a forma duma pro teína de fusão em E. Coli foi obtido sob uma forma biologicamente na extremidade N-terminal das proteínas de fusão podem influenci ar a actividade específica destas proteínas.

activa. Os resultados mostram que as alterações introduzidas

EXEMPLO 4

Preparação de preparados de anticorpos com capacidade de reacção imunoespecífica com a proteína IL-3 humana

A. Anti-soro IL-3 anti-humano de coelho pollclonal

Fez-se um gel preparativo a partir

lisado de E. Coli contendo o plasmídeo pGB/IL-301. A banda a 20 kd com a proteína de fusão IL-3 foi destacada, moída num almofariz com solução salina e emulsifiçada numa proporção de 1:1 com adjuvante de Freund completo contendo 1 mg de Mycobacterium tuberculosis H37RA por ml.

Imunizaram-se coelhos brancos da No va Zelândia (spf) com 1 ml da emulsão (com + 100 ptg da proteína de fusão de IL-3) dividida por 5 locais de injecçao (2 x i.m. nas coxas, 3 x s.c. na região lombar). Administraram-se injecções de reforço do mesmo antigene em adjuvante de Freund incompleto nas semanas 2, 4 e 6. Colheu-se soro na semana 8 por punção da veia da orelha.

Um volume de soro foi absorvido com 9 volumes de E. Coli contendo pUC8 tratado por ultra-sons (dum dia para o outro a 49 C) a fim de remover os anticorpos não espe cíficos. Por análise de mancha imunolõgica de todas as construções de IL-3 feitas em E. Coli, B. licheniformis, B. subtilis,

S. cerevisiae e K. lactis verificou-se a ocorrência de reacção imunoespeclfica com os soros absorvidos numa diluição de 1 em 6500.

Alguns destes resultados são apresentados na figura 11. As proteínas foram isoladas a partir dos hospedeiros recombinantes tal como descrito anteriormente e foram separados num gel de poliacrilamida a 13,5% e depositadas so bre uma membrana de nitrocelulose. Pista 1: E. Coli contendo pTZ18R (comparação); pista 2: pGB/IL-301; pista 3: pGB/IL-301; pista 4: pGB/IL-302; pista 5: pUC19 (comparação); pista 6: pGB/IL-301; pista 7: pGB/IL-302. As pistas 6 e 7 mostram as proteínas presentes no sólido de centrifugação após tratamento por ultra-sons das bactérias. As pistas 3, 4 e 5 mostram as proteínas presentes no sólido de centrifugação após a primeira fase de lavagem. As pistas 1 e 2 mostram as fracções proteicas finais so lubilizadas por ureia.

As flechas indicam as proteínas de fusão (da dimensão esperada) expressas pelos plasmídeos pGB/IL-301 e pGB/IL-302.

A figura 12A apresenta a inibição da proliferação de células blâsticas AML dependente de IL-3 por anti-soro anti-IL-3.

A figura 12B mostra que o soro prê-imune não afecta a acção da IL-3 sobre a proliferação de células blâsticas AML. Em ambos os painéis utilizou-se a simbologia: ▲ = IL-3 a 10 U/ml; H = IL-3 a 1 U/ml; φ = comparação sem qualquer adição.

A figura 12A mostra que o crescimen to dependente de IL-3 na análise de proliferação de células blãjs ticas AML (51) foi inibido pelo soro de um modo dependente da do se; a figura 12B mostra que o soro pré-imune não tem este efeito, Como comparação, o crescimento dependente de GM-CSF não foi afec tado por estes soros do mesmo modo (figura 12A, em que^= GM-CSF a 100 U/ml).

B. Anticorpos monoclonais de rato anti-IL-3 humana

Imunizaram-se ratos Balb/C com 3 x 0,1 ml (s.c.) da mesma emulsão utilizada para os coelhos. Deu-se um reforço (0,1 ml i.p.) do antigene em adjuvante de Freund incompleto na 2- semana e três dias mais tarde fundiram-se linfõci tos de baço com células de mieloma SP2/0 de acordo com as técnicas normais (65). Seleccionaram-se os hibridomas resultantes por análise de imunosorvente ligado a enzima (ELISA) usando um lisado de E. Coli pGB/IL-302 (contendo o produto de fusão da IL-3 de 17 kd) para referência de comparação positiva e um lisado de E. coli pUC8 para referência de comparação negativa. No total selec cionaram-se 29 culturas de hibridoma de IL-3 que segregavam anti corpos específicos para IL-3, tendo-se estabilizado estas culturas .

EXEMPLO 5

Construção de vectores de expressão de Bacillus

Utilizaram-se técnicas gerais de clonagem (36).

A. Construção de pGB/IL-307 (figura 13)

Para a construção do vector pGB/IL-307 ligou-se o fragmento Sma I menor do plasmídeo pLB4 contendo o gene de hmulti-CSF ao plasmídeo pUBUO (54) digerido com PvuII. Após transformação de células competentes (56) de DB 105 (uma es_ tirpe spo” derivada da estirpe DB104 deficiente em relação a pro tease (55)), foram obtidos dois clones, como se esperava: o fraçj mento tinha sido clonado nas duas orientações possíveis. O plasmídeo que continha o fragmento na orientação correcta com respei to ao designado promotor de Hpa II (57) foi denominado pGB/IL-307. Neste caso resulta uma proteína de fusão (ver figura 13).

B. Construção de pGB/IL-310

Preparou-se um plasmídeo de expressão hmulti-CSF como descrito seguidamente.

1. Clonagem do promotor (figura 14)

Para expressão em Bacillus usou-se ,4 um promotor sintético (Γ 3 como descrito (58) (o promotor e habi 55 tualmente designado por (Γ ).

Digeriram-se os plasmídeos pPROM55s (58), o plasmídeo contendo o promotor, e pGPA14 (59) com EcoRI e Xbal. O fragmento do promotor foi ligado no fragmento do vector que tinha sido purificado num gel de agarose. Após transformação de E. Coli (JM 101) obteve-se o plasmídeo correcto, que foi designado pGB/IL-308 (fig. 14).

2. Introdução dum oligonucleõtido sintético em pGB/IL-308 (figura 15)

Ligou-se no plasmídeo pGB/IL-308 di gerido com Sall-Xma III um oligonucleõtido sintético contendo os nucleõtidos 39 a 158 e 484 a 546 do hmulti-CSF, uma sequência de reconhecimento Sal I terminal 5' e um local Xma III terminal 3'. A mistura de ligação foi introduzida na estirpe JM 101. Apôs anã lise de varias transformantes, encontrou-se o plasmídeo correcto a que se deu o nome de pGB/IL-309.

• · Introdução de hIL-3 (figura 16)

Após transformação e isolamento a partir de B. subtilis DB 105, digeriu-se o plasmídeo pGB/IL-309 com Xma III. As extremidades reentrantes foram preenchidas com polimerase de Klenow e o plasmídeo foi cortado com Ciai. Digeriu -se o plasmídeo pGB/IL-307 com Aval, preencheram-se as extremida des com Klenow e em seguida digeriu-se com Ciai. Em seguida ligou-se o fragmento contendo o hmulti-CSF no fragmento de pGB/IL-309 e transformou-se em JM101. O plasmídeo resultante foi denominado pGB/IL-310 (figura 16). Este plasmídeo continha o gene de hIL-3 com a sua própria sequência de sinal. Apôs isolamento do plasmídeo correcto, este foi também introduzido em B. subtilis DB 105.

C. Construção de pGB/IL-311 e pGB/IL-312 (figuras 17 e 18)

Digeriu-se parcialmente o plasmídeo pGB/IL-310 com Hind III e totalmente com Pvu II. Os dois fragmen tos Pvu-II - Hind III contendo limulti-CSF foram digeridos com Hind III e Sma I.

A figura 17 apresenta a sequência de nucleótidos do plasmídeo pBHAl. O plasmídeo ê constituído por: posições 11 a 105 e 121 a 215; terminador de bacteriofago FD (du pio): posições 221 a 307; uma parte do plasmídeo pBR322 (com as posições 2069 a 2153): posições 313 a 768; origem de replicação do bacteriofago F1 (com as posições 5482 a 5943): posições 772 a 2571; parte do plasmídeo pBR322 com a origem de replicação e o gene de beta-lactamase: posições 2572 a 2772; terminador de trijo tofano (duplo): posições 2773 a 3729; transposão Tn9, o gene de acetiltransferase de cloranfenicol. Os nucleótidos nas posições 3005 (A), 3038 (C), 3302 (A) e 3409 (A) diferem da sequência de codificação do tipo selvagem. Estas mutações foram introduzidas a fim de eliminar os locais Ncol, Bali EcoRI e Pvu II: posições 3730 a 3804; local de clonagem múltipla: posições 3807 a 7264; parte do plasmídeo pUBllO com a função de replicação e o gene de resistência à canamicina (fragmento EcoRI-Pvu II) (66,67): posições 7267 a 7331; local de clonagem múltipla. Os fragmentos foram reunidos por técnicas de clonagem conhecidas, por exemplo por preenchimento das extremidades coesivas com Klenow, por clonagem

National Nucleic Acid Sequence Data Bank, NH, EUA.

Após transformação em JM101 e analise de varias colónias resistentes à ampicilina, encontraram-se dois plasmídeos diferentes: pJB/IL-31? que contêm o gene completo com sequências de regulação completas e pGB/IL-311 que contêm o gene completo e o promotor sem a região -35 em orientação contraria (ver figura 18).

O plasmídeo pGB/IL-311 foi utilizado para transformação de B> subtilis DB105 e da estirpe B. lichnniformis T399 (Δ amy, spo”, exo~ protease-negativo, rif^r, ver ref68 em que esta estirpe ê denominada T9).

D· Construção de pGB/IL-313 (figura 19)

A fim de obter um plasmídeo menor com o gene de hirulti-CSF depois do promotor de Hpall, digeriu-se o plasmídeo pGB/IL-312 com BamHI e ligou-se novamente. A mis tura da ligação foi utilizada para transformar células competentes DB105. Analisaram-se varias colónias resistentes à neomicina e obteve-se o plasmídeo correcto. Este plasmídeo foi denominado pGB/IL-313.

I

E. Construção de pGB/IL-317 (figura 20) \ j

A fim de clonar o gene de hmulti-CSF depois da região de início de transcrição e de tradução de alfa-amilase de B. licheniformis e da sequência de sinal, utilizou-se um dos vectores pOL5-delta jã descritos (68) nomeadamente o vector pOL5-2-delta, Alem da sequência de sinal de alfa-amilase (com um comprimento de 29 ãcidos aminados) este plasmídeo contêm i um acido aminado da sequência da alfa-amilase madura (uma Ala) ΐ ί seguido dum local de clonagem múltipla: EcoRI - XmalII - Xmal - Sal I - Hind III (68).

O fragmento Sal I - Pvu II do plasmídeo pGB/IL-310 contendo o gene de hmulti-CSF foi ligado no vec ** í tor pOLS-Z-delta digerido com Sal I - Pvu II e utilizado para transformar a estirpe DB105. O plasmídeo resultante foi denomina do pGB/IL-317 (figura 20). O gene de hIL-3 ainda contêm a sua i

- 37 - ’ própria sequência de sinal neste plasmídeo. 0 plasmídeo foi também introduzido na estirpe B. licheniformis T 399.

F. Expressão de cinco plasmídeos de expressão em estirpes de Bacillus

Cultivaram-se estirpes de B. subtilis e de B. licheniformis contendo os plasmídeos de expressão abaixo mencionados em meio TSB contendo 20 pg/ml de neomicina ou 10 pg/ml de eritromicina a 379 C (durante 16 a 24 horas); centri fugaram-se 300 pg/ml da cultura. O sólido foi novamente suspenso em tampão de amostras e foi analisado por meio de electroforese em gel de poliacrilamida seguida e analise de mancha de Western. Precipitou-se o sobrenadante com TCA e suspendeu-se de novo o só lido em tampão de amostras. Tanto o sobrenadante como o sólido foram analisados para detectar a proteína IL-3 (ver Quadro 2).

A fim de determinar a actividade biológica das proteínas produzidas, levaram-se a efeito as seguintes fases operacionais: As células foram novamente suspensas num tampão contendo Tris/HCl 0,1 M apH 8,0 e Mg CI2 10 mM. Adicionou-se lisozima até uma concentração final de lmg/ml e PMSF até uma concentração final de 1 mM. Incubou-se a solução durante 30 min. a 379 C. Em seguida adicionou-se DNase (concentração final 20 jig/ml) e incubou-se a solução durante 15 min. a 209 C. Por fim determinou-se a actividade biológica desta preparação beir como do sobrenadante da cultura celular, como descrito. Os resul tados são apresentados no Quadro 2.

QUADRO 2

Expressão de vectores de Bacillus

Plasmídeo	Estirpe	P.M. da IL-3	Actividade Biológica
Solido (kd)	Sobrenadan te (kd)
Sólido	Sobrena- dante
pGB/IL-307	DB105	21	-	+	-
pGB/IL-310	DB105	15,-17	15; 17	-	-
pGB/IL-311	DB105	12.5,-15	-	+	-
	T399	-	-	+	-
pGB/IL-313	DB105	15;17	12.5,-15	+	-
	T399	-	-	+	-
pGB/IL-317	DB105	12.5,-15	12.5,-15		+
		17,-20	17
	T399	12.5,-15	12.5,-15	+	+
		17,-20	17

Pode concluir-se que em B. subtilis usando o plasmídeo pGB/IL-307 se produz uma proteína de fusão com actividade de IL-3. Quando o gene de IL-3 humana contém apenas a sua própria sequência de sinal não se obtêm qualquer secre ção significativa de IL-3 humana. Toda a actividade de IL-3 é en contrada intracelular. Nestes casos parece que alêm de percursor de IL-3 se formou IL-3 madura (15 kd) na célula. Deste modo pode ter tido lugar algum transporte através da membrana mas a protei na não ê transportada através da parede celular. No entanto, usan do os sinais de regulação e de secreção de alfa-amilase (pGB/Il-317) verifica-se que a maior parte da actividade de IL-3 ê segregada para o meio de cultura. Para além dum produto de degrada ção, detectam-se duas proteínas no sobrenadante, uma de cerca de 15 kd e uma cerca de 17 kd, com toda a probabilidade IL-3 madura e IL-3 percursora, respectivamente. Estes resultados indicam que são usados os dois locais de processamento, a saber os locais de . processamento de alfa-amilase e de hmulti-CSF. Na célula, o produto mais abundante é a IL-3 percursora, contendo a sequência de

sinal de alfa-amilase (a proteína de 20 kd), tal como se constata por análise de mancha de Western. Por vezes detecta-se um pro duto de degradação.

EXEMPLO 6

Construção de vectores de expressão de Kluyveromyces lactis

A. Construção de pGB/IL-316

Inseriu-se no local Sma I do vector pUC19 (63) um fragmento de ADN contendo o gene Tn5 (61), que con fere resistência à gentamicina G 418, sob a direcção do promotor de ãlcool-deidrogenase I (ADHI) de S. cerevisiae, semelhante ao descrito por Bennetzen e Hall (62) . Uma estirpe de E. Coli contendo o plasmídeo obtido, pUC - G418, foi depositada no CBS em 4 de Dezembro de 1987 sob o n9. CBS 872.87.

Inseriu-se no vector pUC-418 cortado com Xbal - Hind III do plasmídeo pGB903 (64) contendo o promo tor de K. lactis e ADN de proquimosina de vitela, dando origem ao plasmídeo pGB/IL-314.

O fragmento Sall-Hind III deste pias mídeo foi substituído por um fragmento de ADN sintético contendo um pequeno local de clonagem múltipla e o terminador de lactase (ver figura 21 e 22). O plasmídeo resultante foi denominado pGB/lL-315.

No vector pGB/IL-315 cortado por Sac II - Xho I ligaram-se os seguintes fragmentos:

1. O fragmento Sac II - Xba I de pKs 105 (pedido de patente U.S. Ser. 078 539 64) contendo a fracção 3* do promotor de lactase e a fracção 5' da sequência de sinal do factor alfa de S. cerevisiae.

2. Um oligonucleótido sintético con tendo a fracção 3’ da sequência de sinal do factor alfa com início no local Xbal e a fracção 5' da sequência de ADNc da hIL-e madura até ã metade 5' do local Hpa I (resíduo de aa n?. 14).

3. 0 fragmento Hpal - Xho I contendo a maior parte da sequência do ADNc da hIL-3 (resíduos 15 a 133

mais a região 3* não codificante).

plasmídeo resultante, denominado pGB/IL-316, ê apresentado esquematicamente na figura 21. Na figu ra 22 apresenta-se a sequência completa do vector desde o local Sac II na sequência do promotor de lactase atê ao local Hind III na extremidade do terminador sintético.

A figura 22 apresenta a sequência de nucleótidos do plasmídeo pGB/IL-316 entre o local singular Sac II no promotor de lactase e o local Hind III depois do termi nador (resíduos 4457 e 7204). Os resíduos 4457 a 6100 contêm a sequência do promotor de lactase. Os resíduos 6101 a 6355 contêm a sequência de sinal do factor alfa. Os resíduos 6356 a 7115 con têm a sequência para a IL-3 humana madura mais a sequência do ADNc 3' não codificante. Finalmente os resíduos 7116 a 7204 contêm a sequência do terminador sintético.

B. Construção de pGB/IL-318

Construiu-se um vector de expressão similar a pGB/IL-316 mas substituindo a informação de codificação para a sequência de sinal do factor alfa de S. cerevisiae pe la sequência de sinal do factor alfa de K. lactis (64) . O resto do plasmídeo ê idêntico ao plasmídeo pGB/IL-316. A sequência do plasmídeo pGB/IL-318 entre o local Sac II no promotor de lactase e o local Hind III depois do terminador (resíduos 4457 a 7190) ê apresentada na figura 23.

Os resíduos 4457 a 6087 contêm a se quência do promotor de lactase e uma pequena sequência dum adaptador. Os resíduos 6088 a 6342 contêm a sequência de sinal do factor alfa de K. lactis. Os resíduos 6343 a 7102 contêm a sequÊr cia para a IL-3 humana madura mais a sequência do ADNc 3' não co dificante. Finalmente os resíduos 7103 a 7190 contêm a sequência do terminador sintético.

C. Transformação de Kluyveromyces Lactis e analise da hIL-3 segregada

Digeriram-se os plasmídeos pGB/IL-316 e pGB/IL-318 no local singular Sac II na região do promotor

de lactase e foram utilizados para transformar a estirpe K« lactis CBS 2360 (ver 64). Deste modo a integração dos plasmldeos é dirigida para a região do promotor do gene de lactase cromossomal. Os transformantes resistentes G418 resultantes foram cultivados atê saturação em meio liquido YEPD e os sobrenadantes das culturas e os lisados celulares foram analisados para se verificar a existência de actividade de IL-3 por meio da analise de síntese de ADN das células AML.

Verificou-se que virtualmente toda a IL-3 era segregada para o meio de cultura e era activa. As pro teínas do sobrenadante da cultura foram precipitadas por etanol e foram analisados usando electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante seguida de análise de mancha de Western. O produto predominante tinha um peso molecular aparente de cerca de 21 kd, observando-se também uma banda distinta a cerca de 15 kd. Este ultimo produto corresponde com toda a probabilidade ã IL-3 madura não glicosilada, enquanto que o produto de 21 kd é o produto que contém uma glicosilação do núcleo nos dois locais de potenci al glicosilação. Por incubação com endoglicosidase H obtém-se um<i proteína que migra na região de 15 kd sugerindo que toda a IL-3 ê correctamente processada durante o processo de secreção e que a maior parte da proteína se apresenta glicosilada.

EXEMPLO 7

Construção dum vector de expressão de Saccharomyces cerevisiae

A. Construção de pGB/IL-319

Em primeiro lugar construiu-se um vector de expressão que se denominou pGB/TEFact. Neste plasmídeo derivado do plasmídeo pTZ18R (Pharmacia), a sequência do promotor do factor de elongação (EF-1 alfa) de tradução de S. cerevisiae/ clonado e sequenciado conforme já descrito (73, 74), foi acoplado por meio dum pequeno adaptador Sal I - Bgl II - Xhol ã sequência do terminador de transcrição de actina de S. cerevisiae (75), a qual foi sintetizada por meio dum sintetizador de ADN da firma Applied Biosystems. A sequência do bloco integrado de

expressão ê dada na figura 24. Os resíduos 1 a 949 contém o promotor de EF-1 alfa. Os resíduos 950 a 967 contêm a sequência do adaptador de SalI-BglII-Xhol. Finalmente os resíduos 968 a 1113 contêm a sequência do terminador de actina.

O sítio Smal singular no plasmídeo pGB/TEFact foi utilizado para introduzir o bloco integrado de re sistência ao antibiótico G418 descrito no Exemplo 6. O plasmídeo resultante denominado pGB/TEFact G418.

Por fim, construiu-se o vector pGB/IL-318 de expressão de hIL-3 por introdução das seguintes se quências de ADN no plasmídeo pGB/TEFact G418 cortado por Sall e Xhol:

- O fragmento SalI-NruI do plasmídeo pGB/IL-316 conten do a sequência de sinal do factor alfa de S. cerevisiae e a sequência que codifica para a hIL-3 até ao local Nrul.

- Um fragmento de ADN sintético Nrul-Xhol contendo os restantes nucleõtidos que codificam para a hIL-3 e a sequência de reconhecimento de Xhol imediatamente a seguir ao codão de paragem TGA.

B. Transformação de Saccharomyces cerevisiae e analise da hIL-3 segregada

Cortou-se o plasmídeo pGB/IL-319 no local EcoRI singular no promotor de EF-12. A integração do plasmídeo ê dirigida deste modo para a região cromossomal de EF-1 Transformou-se a estirpe (alfa; ATCC 25 657) tal como se descreveu para K. lactis (64). As colónias resistentes a G418 foram isc ladas e os transformantes foram cultivados em meio YEPD líquido. O sobrenadante da cultura foi analisado por meio de análise de AML a fim de se detectar a actividade de hIL-3. Verificou-se que a proteína produzida por S. cerevisiae era biologicamente activa, As proteínas do sobrenadante foram precipitadas por meio de etanol e em seguida foram analisadas por electroforese em gel de poliacrilamida seguida de análise de man cha de Western. Foi possível distinguir dois produtos principais • na análise de mancha de Western, um produto glicosilado de 21 kd . e um produto não glicosilado de 15 kd.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   Processo para a produção de interleuquina-3 (IL-3) humana por uma célula hospedeira caracterizado por compreender: a introdução na referida célula hospedeira duma construção de ADN contendo um bloco integrado de expressão (cassette), o qual contêm, na direcção da transcrição, uma região de regulação de início de transcrição funcional na referida célula hospedeira: uma sequência de ADN que codifica para a IL-3 humana: e uma região de regulação de terminação de transcrição funcional na referida célula hospedeira;

   o crescimento da referida célula hospedeira, contendo a referida construção de ADN, num meio nutriente sob condições de cultura adequadas, produzindo-se IL-3 humana; e a recuperação da IL-3 humana como produto final.

   - 2- Processo de acordo com a reivindica ção 1 caracterizado por a célula hospedeira ser uma célula hospe deira transformada contendo material genético derivado de materi al de ADN recombinante e que codifica para a IL-3.

   Processo de acordo com a reivindica ção 2 caracterizado por a célula hospedeira ser uma célula hospe deira escolhida de entre o grupo constituído por leveduras, bac-

   Processo de acordo com a reivindica ção 3 caracterizado por a célula hospedeira ser um fungo escolhi do de entre o grupo constituído por Saccharomyces e Kluyveromyces.

   Processo de acordo com a reivindica ção 3 caracterizado por a célula hospedeira ser uma bactéria escolhida de entre o grupo constituído por E. coli e Bacillus.

   Processo de acordo com a reivindica ção 3 caracterizado por a célula hospedeira ser uma célula duma cultura de tecidos escolhidos de entre o grupo constituído por células COS, C127 e células de insectos.

   Processo para a preparaçao dum sistema de expressão operacional num hospedeiro recombinante caracterizado por se inserir num sistema de expressão adequado uma se quência de ADN que codifique para a IL-3 humana ligado de modo • operacional a sequências de regulação efectivas no referido hos- pedeiro.

   Processo de acordo com a reivindica ção 7 caracterizado por o ADN que codifica para a IL-3-humana não conter intrões.

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 7 Ou 8 caracterizado por as sequências de regulação conterem um promotor seleccionado de entre o grupo constituí do pelo promotor lac, pelo promotor Hpall, pelo promotor 43, pelo promotor de alfa-amilase, pelo promotor EF-1 alfa e pelo promotor SV40.

   - 10- Processo para a preparação duma cêlula hospedeira recombinante caracterizado por se transformar uma célula hospedeira com um sistema de expressão preparado de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 9.

   - 11* _

   Processo para a preparação duma sequência de ADN que não contem intrões e que codifica para a IL-3 humana caracterizado por compreender as fases de:

   a) produção de factores de crescimento hemopoiêticos por leucõci tos humanos,

   b) preparação de APN a partir das células referidas e transcrição do mesmo em ADNc de cadeia dupla.

   c) selecção do ADNc com um ADNc murino completo de IL-3 de rato (mIL-3) contendo tanto a porção de codificação como a porção 3’ não traduzida a juzante de forma a obter DII.

   d) inserção do clone DII de ADNc que hibrida num vector de expressão pLO.

   Processo de acordo com a reivindica ção 11 caracterizado por o ADN recombinante obtido conter a sequência de nucleótidos apresentada como codificando para os ácidos aminados 1 a 133 na sequência H da Figura 1.

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 caracterizado por a célula hospedeira ser uma célula hospedeira recombinante obtida de acordo com a reivin dicação 10.

   - 14- Processo para a preparação duma pro teína dotada de actividade de IL-3 humana caracterizado por se obter a expressão da referida proteína numa célula hospedeira transformada obtida de acordo com a reivindicação 10.

   J»

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 ou 13 ou 14 caracterizado por a proteína ser obtida sob uma forma substancialmente isenta de outras substâncias que normalmente acompanham a referida proteína.

   Processo de acordo com a reivindica ção 15 caracterizado por a proteína ser obtida por meio da expreí são recombinante da sequência de ADN apresentada como codificando para os ácidos aminados 1 a 133 nã sequência H da Figura 1 ou dum mutante desta sequência de ocorrência natural.

   - 17- -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 15 ou 16 caracterizado por a proteína ser obtida sob forma glicosilada ou não glicosilada.

   - 18- -

   Processo para a preparação de um preparado de anticorpos dotado de capacidade de reacção imunoespecífica com IL-3 humana caracterizado por compreender uma fase de injecção dum hospedeiro vertebrado com a IL-3 humana purifica da obtida de acordo com qualquer das reivindicações 14 a 17.

   ros pedidos desta tente europeus em 1987, sob os n<?.s

   A requerente declara que os primei patente foram apresentados como pedidos de pa 16 de Dezembro de 1986 e em 13 de Julho de 86202285.2 e 87201322.2, respectivamente.

   Lisboa, 16 de Dezembro de 1987

   PROCESSO DE CLONAGEM MOLECULAR E DE EXPRESSÃO DE

   INTERLEUQUINA-3 (IL-3) HUMANA

   A invenção refere-se a um processo para a produção de interleuquina-3 (IL-3) humana (hIL-3) que com preende as fases de cultivar células transformadas por um vector de expressão apropriado em condições adequadas para o respectivo crescimento e para a expressão do ADN que codifica para a hIL-3 isolar a hIL-3 produzida.