PT94992B - Processo para a preparacao de polipeptidos mutantes de interleucina-3-humana - Google Patents

Description

I A presente invenção refere-se a mutantes de factores estimulantes de colónias, obtidos por técnicas , recombinadas de ADN. Especificamente, a invenção refere-se a ί mutantes de interleucina-3. Mais especificamente, os refeί ridas mutantes contêm uma ou mais eliminações e/ou uma ou

I ; mais substituições. A utilidade farmacológica destes mutantes I depende das suas propriedades ligantes receptoras específicas l e de transdução de sinal.

í!

íi í Antecedentes da Invenção

Historicamente, os factores que afectam as células hematopoiéticas foram detectados num ensaio que *: mede a proliferação e/ou diferenciação das células da espinal • ί ·: medúla em culturas de ágar macio. Os factores que mostram — i ί

I * J,

I esta actividade -foram colectivamente designados como -factores estimuladores de colónias(CSF). Mais recentemente verificou-se que existiam várias CSF que, emparte, podem ser classificados pelas linhagens hematopoiéticas que são estimuladas.

¹

Em sistemas humanos e de murina, estas j; proteínas incluem S-CSF e M-CSF. Estas proteínas estimulam a ; formação in vitro de colónias de granolócitos e macrofago _; respectivamente predominantemente neutrófilas. A interleu! cina-2 (IL-2”) estimula a proliferação de células-T activadas e células-B activadas, mas não é considerada um factor ' estimulante de colónias.

1, 'í j i η 0 SM-GSF a a Interleucina-3 (IL-3, ! também conhecida como Muiti-CSF) estimulam a formação de colónias de granulócidos macrófagos, neutrófilas e easina; fílicos. Além disso, a IL-3 estimula a formação de mastos, megacariócitos e colónias puras e mistas de eritróides (D. Metcalf, The hematopoietic calony-stimulating factors, 1884, Elsevier, Amsterdão, e D.Metcalf, Science 289 (1985) 16-22).

A proliferação de células induzidas pelo factor de crescimento é um processo complicado. Após uma li\ gação altamente específica do factor de crescimento ao seu receptor na superfície da célula, o complexo é internaiizado por indocitose e induz uma resposta intracelular, muitas vezes precedida por fosforilação do receptor (Sibley e col., Cell 48 (1987) 913-922). Estes sinais intracelulares resultam numa transcrição específica da gene e finalmente na síntese de ADN e na replicação das células.

I

Existe um interesse considerável nos CSF, dado que eles têm um potencial terapêutico que consiste em restaurar níveis baixos de células derivadas hematopoiéticas e linfóides.

A IL—3 humana (hIL-3) é um desses CFS.

j ί A hIL-3 madura consiste em 133 aminoácidos, a proteína contém uma ponte de dissulfureto e tem dois sítios de glicolização potenciais ÍYang e col., Cell 47 (1986) 3-10). Ela tem também as seguintes actividades!

1) estimulação da -formação de colónias de células progenitoras hemopoiéticas humanas em que as colónias formadas incluem eritróides, granulócitos, megaeariócitos, granulócitos macrofagos e suas misturas;

2) estimulação da síntese do ADN por blastos de leucemia mielogenosa aguda humana (AMD.

Qs agonistas ε antagonistas úteis de uma proteína podem ser criadas laga que a relação de estrutura-função da molécula conhecida. Geralmente, esta relação é estudada por modificação, substituição ou eliminação de aminoácidos. Desta forma pode ser obtida informação sobre a importância de cada um dos ácidos para a aetividade da proteína. Os domínios importantes de proteínas podem ser o sítio activo, Os sítios de ligação de metal e cofactor, os sítios de ligação de receptores, os aminoácidos envolvidos em interaeções de subunidades e os determinantes antigénicos.

Logo que a sequência primária de uma proteína tiver sido determinada, podem ser utilizados vários procedimentas para estudar as caracteristicas acima mencionadas. F'or exemplo, se as estruturas primárias de proteínas homólogas de outras espécies estiverem disponíveis estas sequências podem ser alinhadas. As sequências conservadas são frequentemente indicadoras da importância de certos amino— ácidos.

As estruturas secundárias podem ser previstas com a utilização de algoritmos conhecidos. Ver, por exemplo, Hopp e Woods, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 3824-3828, Garnier e col., J. Mol. Biol. 120 (1978) 97-120,

Biou e col. . Prot. Eng. 2 (1988) 185-191, Cármenes e col,

Biochem. Biophys. Res. Cammun. 159 (1989) 687-693.

‘ ·>

Se a homologia interespécies entre proteínas homólogas -for elevada e a estrutura tridimensianal de uma delas for conhecida, qs aminoácidos importantes podem também ser induzidas desta estrutura.

Os dados de estrutura primária e/ou esi pacial podem ser utilizados para fazer uma estimativa raΐ zoável para esperiências de mutagénese. A expressão de pro- teínas mutageneizadas e o ensaio destas muteínas em ensaios í biológicos proporciona informação acerca de importância relaί. tiva de certas aminoácidos.

l· i;

, □ objectivo da presente invenção é pro™ '1 ;; porcionar mutantes de IL-3 com propriedades farmacêuticas i semelhantes ou superiores em relação à IL-3 nativa, utilili ’ zando de preferência os procedimentos acima referidos.

Literatura relevante

Inter1eucina-3 humana j Em 19S4, foram isolados os clones cDNA ' codificando para IL-3 de nturina CFung e col. . Nature 307 j (1984) 233-237 e Yokota e col. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA Sl i Í1984) 1070-1074. Este cADN não se podia hibridizar com '|| ^; clones de ADN ou cADN humano. Assim, pensou-se que a

Í!

l· contrapartida humana para IL-3 de murina CmIL-3> não existia.

! Esta opinião era reforçada pelo largo espectro de actividades i

! da GM-CSF humana. Finalmente, em 1986, uma biblioteca de expressão de cADN de gibão proporcionou a sequência de IL-3 ! de gibão. Esta sequência foi posteriormente utilizada como sonda contra uma biblioteca genómica humana. Este facto

I proporcionou evidência para a presença de IL-3 em seres humanos (Yang e col., Cell 47 C19S6) 3-10.

Entretanto, Dorssers e col., Gene 55 i (1987) 115-124, descobriu um clone de uma biblioteca de cADN \ humana que hibridizava surpreendentemente com mIL--3. Esta i

hibridizaçao era o resultado do alto grau de homologia existente entre as regiões 3’ de não codificação de mIL-3 e hIL-3.

' .....

Moonen e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 4428-4431 descrevem a produção de GM-CSF humana por várias -fontes recombinantes incluindo E. Coli. fungos e células animais. Os produtos de expressão parcialmente i purificados de fungas e células animais foram ensaiados para il a determinação do efeito de dasglicosilação. A imunorij

Í! reactividade foi aumentada de 4 a 8 vezes após a remoção dos oligossacáridos ligados a IM» A actividade biológica específica foi aumentada de um factor de 20 quer na leucemia il mielogenosa crónica ÍCML) quer no ensaio da espinal medula

- humana.

Kaushansky e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 1213-1217, tentaram definir as regiões de polipéptidos GM-CSF necessários para a actividade biológica Dado que SM-CSF humana e de murina não reagiam cruzadamente nos seus ensaios de formação de colónias respectivos, a técnica utilizada foi baseada na utilização de moléculas de ADN híbridas contenda vários comprimentos das regiões de codificação para h- e mGM-CSF. Apôs expressão das células de COS, as proteínas híbridas foram ensaiadas por meio ensaios de formação de colónias humanas

Verificou-se que duas regiões de SM-CSF eram críticas para a função hematopoiética. Estas regiões são estruturalmente caracterizadas por uma hélice antifílica e por um anel ligado de dissulfureto.

Sough e col.,Eur. J. Biochem 169 (1987) 353-358, descrevem mutantes de eliminação internos da murina SM-CSF. Nenhum dos mutantes é referido como apresentando ' actividade biológica.

de e de murina.

Kuga e col., Biochem. Biophys. Res. Com. 159 (1989) 183-111, descrevem a mutagánese de S-CSF humana. Qs resultados indicam que a maior parte dos produtos de expressão com mutações localizadas nas regiões internas ou ; terminais C eliminam a actividade de hG-CSF. Por outro lado as mutantes de eliminação de terminais N em que faltam 4, 5, 7 ou 11 aminoácidos, de um total de 174 aminoácidos, , conservavam a actividade. Alguns dos mutantes de aminoácidos

I

I com terminais N apresentavam uma maior actividade.

r Os mutantes de eliminação da interleucina—1 humana (IL-í) foram criados utilizando sítios de restri1 ção de endonuclease disponíveis e expressão em células ; eucaríóticas. 0 terceiro terminal de carboxilo (63 amino• i ácidos) do polipéptido contém o sítio activo (Makino e col. ,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 7841-7845). Um estuda recente de IL-la e IL—lfl mostraram que 148 e 147 aminoácidos respectivamente (de um total de 153 aminoácidos), são necessários para a actividade biológica total (Mosley a col. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 4572-4576). Alterações simples de aminoácidos em ambos os terminais resulta numa diminuição significativa da actividade biológica. Contudo, não foi obtida nestes estudos informação detalhada em relação ao domínio de ligação dos receptores de IL-Í.

I

A actividade da interleucina-2 humana revelou ser muito inibida pela remoção quer do Cys·-® e Cys^®^, ί enquanto que a eliminação do terceiro resíduo Cys (125) não i tinha efeito (Wang g. col. , Science 224 (1984) 1431-1433;

) Cohen e col.. Science 234 (1986) 349-352). Todas as substii ! tuições resultantes na perturbação da dobragem helicoidal í

I desta proteína, revelaram dar reduções significativas da ί actividade biológica. 0 sítio potencial de ligação de IL-2 foi mapeado num péptido com um comprimento de il aminoácidos. As substituições individuais de aminoácidos nesta região tinham grandes efeitos (Cohen e col., (supra); Zurawski e , Zurawski, EMBO J. 7 (1988) 1861-1869). A análise mutacional revelou ainda que domínios diferentes de IL-2 estão enI ί _ I i !

I i

volvidos na ligação ds alta e baixa afinidade do complexo receptor de IL-2 (Robb e col. Proc. Natl. Acad. Sei» USA 85 (1988) 5654-5658; Collins e col., Proc» Natl. Acad. Sei. USA §5 Í19SS) 7709-7713).

’ Pode concluir-se que as modificações de

CSF resultam geralmente em grandes alterações na actividade ;í biológica destas moléculas, por exemplo α S-CSF humana perde a sua actividade após mutações internas ou no terminal-C j terem sido introduzidas. As eliminções do terminal-M em S-CSF ji humano com até 11 aminoácidos (de entre 174 aminoácidos) não afectam prejudicialmente a actividade, o mesmo acontece para h IL.-1 em que pelo menos 140 de entre 153 aminoácidos são • necessários para a actividade completa. Obviamente, menos do íi _que m dos amonoácidos podeo ser ausentes nestas

I

I

I i IL-3 Modificada

Clark-Lewis e col., Science 231 (1986)

134-139, efectuaram uma análise funcional de análogas de IL-3 de murina sintética. Eles concluíram que era necessária a estrutura terciária da molécula completa para a actividade total. Um estudo do papel das pontes de sulforeto revelou que i a substituição de dois dos quatro resíduos de Cys por Ala (Cys^®, Cy_S140 —> Ala^7<?, Ala¹⁴⁰) resultava numa maior actividade (Clark-Lewis e col.. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.

i 85 (1988) 7897-7901).

I A literatura sobre modificações propostas ' de hIL-3 é muito pouca. A literatura sobre modificações efec! tivamente efectuadas em hIL-3 é ainda menor. 0 Pedido de Patente Internacional (PCT) WO 88/00598 refere uma substituição de Ser^·' —> Pro^·' de ocorrência natural. (Deve notar-se que a numeração de aminoácidos em WO 88/00598 inclui os péptidos de sinal de 19 aminoácidos). Além disso, foram feitas sugestões para substituir Cys po Ser, rompendo assim a ponte de dissulfureto, e substituindo um ou mais aminoácidos nos , ! sítios de glicolização, Asn^Cys^Ser·-’^’ e Asn^Ala^Ser⁵?·*·.

— *7 ί

))

ι EP-A-0275598 CWO 88/04691) ilustra que

Ala¹ pode ser eliminado embora retendo a actividade biológica. São proporcionadas algumas sequências de mutantes de hlL3, isto é, duas duplas mutantes, Ala¹ —> Asp*, Trp¹³ —>

' Arg¹³ (pSB/IL-302) e Ala¹ —> Asp¹, Met³ —> Thr³ (pGB/IL-304) e um triplo Ala¹ —> Asp¹, Leu? —> Pro*?, Trp¹³ —>

Arg¹³ CpGB/IL-303) Ca numeração começa com o primeira amínoácido da proteína madura).

WO 88/05469 descreve a forma como os mu! tantes de desglicolização acima referidos podem ser obtidos i também os mutantes de Arg^Arg^ _e ^_rg¹®®Argl®^<?Lys¹1® conver tidos na mesma numeração como em EP-A-0275598. Esta última é ; sugerida de modo a evitar a proteólise após expressão em !|

I ί

i

Saccharomyces cerevisiae por protease KEX2. Não são referidas proteínas matadas. A glicolização e a actividade de protease do KEX2 são apenas importantes, neste contexto, após expressão no fungo.

Pinalmente, EP-A-0282185 menciona vários j mutantes que podem ser conformadamente e antigenicamente

I neutrais. Para conseguir isto é sugerido uma série de substituições de aminoácidos sinónimos. As alterações de ^! aminoácidos sugeridas pretendem manter a estrutura e a distribuição de carga da molécula de IL-3 inalterada. As ! únicas mutações efectivamente feitas são Met^ —> Ile^ e • ji_e131 —> Leu¹⁰¹. Não é referido se as neutralidades ί contempladas são conseguidas.

! Não foram referidos até agora experiên' cias de mutagénese extensivas em hIL-3.

í

A presente invenção proporciona duas novas classes de compostos farmacolagicamente interessantes, isto é, mutantes de eliminação e mutantes de substituição de hIL-3, que mostram actividades biológicas semelhantes e

I . i nalguns casos antagónicas de hIL-3.

i

r.

RESUMO DA INVENSSQ

Num dos aspectos da invenção, os análogos < de polipéptidos biologicamente activos de interleucina-3 (também referidos em seguida como mutantes hIL-3“ ou I; mutaínas) são proporcionados com uma eliminação de pelo í menos dois aminoácidos.

ã Ds mutantes preteridos são aqueies que í possuem uma ou mais eliminações no terminal-N (aminoácidos f! 1-14) e/ou o terminal-C (aminoácidos 120-130 e/ou 130-133).

i Num outro aspecto desta invenção sao

í) ji referidos mutantes de substituição de hIL-3 possuindo pelo H menos uma das seguintes substituições:

I

Asp-^Sl u·4·^·	—>	Lys2lArg22
Asp^ó	—>	Arg3^
Glu43Asp44	.......... 5*	Lys43Arg44
Arg54Arg^5	·»,	Glu54Asp55
Asp46	— >	LyS4ó Ou Arg4^
Glu50		Lys^S ou Arg30
61 uS?	— y	Lys3* qu Arg3*
Glu59		Gly38 au Pra3* (rompedar da hélice-a)
Arg63Ala64		Pro63Sly64
Glu75	—>	Arg73 ou Gly73
Lys7*		Glu7*
Arg*4	—	Pro*4
His^Lysl^Aspl®!	J,'	Glu*8Asp*00Glni0l
Glu106	—>	Ly<g 1
^rgl0S^rgl0?Lysl10	— >	G!u10SA5Pí09G1u1ÍS
Ph e ~ T yr 114	—>	Ala113Thr114
Cys^	— >	Ala16
Cys84	—>	Ala04
Cys16Cys84	—>	AlaláiAla84

Ainda noutro aspecto desta invenção, são referidos mutantes de substituição de hlL-3 que são mais potentes na ligação de recepção do que na estimulação da síntese do ADN, e assim são proporcionados antagonistas. Mais i especificamente esses são mutantes de Cys simples ou duplos.

Cys é preferivelmente substituído í Ala (Cys¹⁶ —> Ala¹⁶, Cys¹⁶Cys⁸⁴ —> Ala¹⁶Ala⁸⁴>. Outros ; mutantes possuem um efeito antagonista são Glu⁵⁰ —> Lys⁵⁰ e 'I _Lys79 _Glu79_u

Ρ Os polipéptidos mencionados são obtidos !i por expressão de sequências de ADN adequadamente modificadas, p Até agora a presente invenção também proporciona vectores de ^: expressão adequados e células hospedeiras compatíveis com I¹ eles.

Em ainda outros aspectos, a invenção compreende composições farmacêuticas que incluem análogas de péptido biologicamente activos de hIL-3 tal como acima descrito, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitãvel.

Finalmente, a anticorpos monoclonais dirigidas entre os aminoâcidos 29 e 54.

presente invenção refere a um epitopo localizada i Estes e outros aspectos serão ainda desí ! cri tos na seguinte descrição detalhada.

BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra a sequência de nucleótidas de aminoâcidos transladados da inserção da proteína de fusão de pGB/IL-336. Os aminoâcidos indicadas com letras pequenas são aminoâcidos não hIL—3, a sequência de ·; proteínas em IL-3 começa em ALA 1.

! A Figura 2 mostra as alterações da sequência 5’ e 3’ introduzidas para se obter pBB/IL-339. Tal coma na Figura 1 os aminoácidos com letra pequena indicam j aminoácidos não hIL-3, e a sequência de proteína madura hIL-3 ; começa em ALA í.

: A Figura 3 é uma fotografia de um gel de

I ₍j poliacrilamida com os seguintes 19 mutantes de IL-3 (linhas í j _a 19 respectivamente): pGB/IL-336, pSB/IL-339, 932, 810, 934, ; 812, 935, 813, 936, 820, 937, 821, 938, 822, 939, 9329, 904, ί 905, 9045; e α marcador de Pharmacia U*fW (linha 20). As muii ^! tações correspondentes a estes números são dadas na tabela 4.

ii i A Figura 4 mostra um ensaio de prolih feração de AML para IL-3 (*) e mutante de IL-3 821 (·).

A Figura 5 mostra uma experiência de ligação do receptor de IL-3. A ligação IL-3 radiomarcada aos μ blastos de paciente AML compete com a proteína IL-3 não mari cada (preparação de referência). Os níveis de ligação não específica (barra inferior) e ligação total máxima (barra superior) nesta experiência são indicadas também (ver Exemplo 5).

A Figura é mostra uma comparação de i proteínas mutantes de 11-3 escolhidas em relação á actividade , biológica relativa (barras abertas) e a actividade ligante i

ί relativa (barras fechadas). A percentagem da actividade μ comparada com a preparação de IL-3 de referência é indicada ·!

na tabela 4«

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO i

Tal como aqui utilizada a IL-3 humana corresponde ao aminoácido (1-133) tal como representada na Figura 1. As variantes de ocorrência natural são também incluídas. Além disso, as moléculas de hIL-3 que são post, -transiaccionalmente modificadas (por exempla par glica‘ ι silação) são também englobadas pelo termo IL-3. Com derivados f

de IL-3 pretende-se dizer qualquer molécula de IL-3 que tenha sido quimicamente ou enzimat icamente modificad, retendo assim pela menos uma parte da sua actividade biológica.

Os análogos de IL-3 humana tal como aqui utilizada pertencem a moléculas que possuem uma sequência que diferem da IL-3 madura por uma ou mais eliminações ou substituições.

:i A IL-3 humana é ainda caracterizada pela í! sua actividade biológica para estimular a formação de !i

H colónias com as células progenitoras hematopoiéticas humanas, ί As colónias formadas incluem eritróides, granulócitos, li ί megacariócitos, macrófagos de granolócitos e as suas

Il misturas. A actividade biológica de hIL-3 pode (para os presentes objectivos) ser ainda dividida em duas partes; uma j transduçãa de sinal e uma ligação de receptor.

Com melhores propriedades, j uma melhor proporção receptor, em que um análoga de hlL-3, que apresente pretende-se dizer que α análogo tem de transdução de sinal/1igação de melhor depende das propriedades pretendidas, por exemplo, um coeficiente de ligação mais elevado para um antagonista ou uma actividade biológica igual ou superior para um mutante de eliminação. Melhor pode também significar que o polipéptido análogo é menos susceptível à formação de agregados.

Para o presente objectivo a actividade (biológica) dos análogos de IL-3 humana é determinada por meio de síntese de ADM por blastos mielogenosos agudos humanos. Além disso, os ensaios de ligação de receptor são efectuados com leucócitos dadores, células AML de pacientes ou células MV 4-11.

A IL-3 é activa na ligação de receptores e transdução do sinal. Se fosse possível atribuir estas actividades a sequências específicas de aminoácidos, que podem ser contínuas ou descontínuas, seria passível desdobrar as actividades ligantes e de transdução de sinal. Isto permitiria a produção de antagonistas específicos do receptor de IL-3.

Como primeiro passo para conseguir estes objectivos, é necessária uma compreensão segura da relação entre a estrutura e a função, de hIL-3. As propriedades de IL-3 que sofreu mutação ou de ocorrência natural podem ser alteradas por introdução de uma variedade de mutações na proteína. Estas alterações são adequadamente introduzidas utilizando as técnicas de mutagénese aqui descritas e as moléculas que sofreram a mutação ímuteinas hIL-3) são adequadamente sintetizadas utilizando as vectores de expressão descritos. Para determinar a relação entre a estrutura e a funçaõ podem ser consideradas as seguintes técnicas de mutagénese entre outras:

a) Substituição de um aminoácido por um resídua isostérica de uma função diferente, por exemplo Asp por Asn. Isto mantém as características de ligação de hidrogénio, embora removendo a carga;

b) Substituição de um aminoácido par outra de função idêntica mas com uma estrutura diferente por exempla Glu por Asp, em que um grupa carboxilo seria movido de serca de 1 A;

c) Substituição de um aminoácido por outro de função diferente;

d) Introdução ou remoção de pontes de dissulfureto;

e) Construção de mutantes de eliminação;

f) Introdução de rompedores de hélice (par exemplo Pro);

g) Construção de mutantes de inserção;

h) Produção de mutantes de glicasilaçãa.

Um dos aspectos da presente invenção é o desenvolvimento de um antagonista específico que bloqueia o fe

S receptor por ligação específica a ele, preferivelmente com um elevada coeficiente de ligação, ocultando assim o sinal de transdução.

! Um antagonista pode ser qualquer molécula química que se ligue ao receptor e evite assim a ligação do agonista. A presnte invenção dirige-se especificamente a i proteínas que possuem esse efeito bloqueador. Num dos seus : aspectos, a presente invenção proporciona muteinas hIL-3 que ; podem ter pelo menos um efeito antagonista. Mais ’ especificamente estes são mutantes de Cys simples ou duplas, i Preferivelmente, Cys é substituído par Ala (Cys^ —> Ala^, i Cys^Cys⁸⁴ —> Ala^Ala®^) „ Outros mutantes que têm um efeito antagonista são Blu^® —> Lys^® e Lys?¹? —> Slu?*?. Pode ^! tentaf—se que a administração de uma dose significativa dos ; mutantes descritos evite a ligação da IL-3 fisiologicamente disponível, revelando assim a sua actividade antagonista.

Num outro aspecto da presente invenção, são proporcionadas proteínas que possuem uma actividade de hIL-3 ou do tipo de hIL-3, que são mais pequenas, preferivelmente com cerca de 3 molécula nativa de hIL-3.

a cerca de 25%, em relação ã Como é ainda ilustrada pelos Exemplos ela pode ser determinada introduzindo eliminações ; específicas em que parte da molécula é indispensável para a ! ligação de receptor e transdução de sinal.

! Em ainda outro aspecto da presente • invenção, os aminoácidos são substituídas, o que também ' permite a determinação das aminoácidos que são importantes na ligação de receptor e/ou na transdução de sinal.

Foram preparados especificamente tipos de mutantes:

a) mutantes de eliminação e b> mutantes de substituição.

dois

- Í4 -

Deve também entender-se que as combinações destes mutantes podem ser facilmente obtidas pelos processos acima referidas.

Os mutantes de eliminação foram preparados, cobrindo em conjunta virtualmente a região de codificação completa. As eliminações tal como aqui utilizadas podem ser a eliminação de aminoácidos de minimamente 2 aminoácidos consecutivas (ou separados). De preferência, ; podem ser eliminados 4 ou mais aminoácidos. As referidas ί· eliminações podem partir de qualquer aminoácido na molécula

Η h (com a excepção obviamente na proximidade do terminal C). é jí também passível ter duas eliminações separadas na molécula (por exemplo, duas vezes uma eliminação de um aminoácido, '1 í; duas vezes duas, etc.). Numa das realizações mais preferidas i são eliminadas 32 aminoácidos, 14 no terminal N e 18 do ί terminal C da proteína. Surpreendentemente, todas as j proteínas mutantes da eliminação expressa revelaram uma actividade biológica específica de IL-3, ainda que muito fortemente reduzida. Assim, pode ser concluída que não existe um domínio de péptidos único e contínuo na proteína que se ligue com o receptor.

	Quatro	dos	mutantes,	o mutante	de
eliminação	do terminal N a	que	faltam as aminoácidos 1 a	14,
1 o mutante	de eliminação	do	terminal C a	que faltam	os
í ι aminoácido	s 120 a 130, 0	seu	duplo mutante	e 0 mutante	da
ί j terminal C	130-133, revelaram	actividade	biológica e	de

i ligação que é comparável com a da molécula de IL-3 nativa. é ' surpreendente que hIL-3 a que faltam 25 aminoácidos (cerca de j 20% do comprimento total de hIL-3) ainda retem a sua actividade total. Dado que Cys^& está envolvido na formação de uma ponte de dissulfureto, pensa-se que um mutante de eliminação do terminal 15N retenha a sua actividade total. Os mutantes de eliminação dupla a que falta ao terminal 14N e até 18 aminoácidos terminal-C (Tabela 4, X e Z) ainda retêm a actividade total» Esses mutantes, a que faltam até 32 ί

,' aminoácidos perdem pelo menos aproximadamente 25% da molécula '1 nativa. Dado que este mutante duplo retem a sua actividade

total pensa~se que o mutante terminal 18C será totalmente activa.

I li Os mutantes possuindo apenas eliminações h

! internas também têm sido fabricados. Um mutante de eliminação

I ' interna com actividade totalmente retida é descrito nesta ; invenção, faltando a este mutante os aminoácidos 120 a 130 j (Tabela 4, 9395. έ provável que se possam obter mais desse mutantes. Por razões de processamento pode ser vantajoso ‘j reter os primeiros aminoácidos da proteína IL-3 madura. Dado h que o mutante de eliminação do terminal 14N retem toda a ' actividade é de esperar que um mutante de eliminação interna jí na região do terminal M também retenha a sua actividade.

Outra região em que se podia introduzir uma eliminação com ^! sucesso parece ser a região 01n^9 ~ Leu35. A eliminação de 1 a 7 aminoácidos, possivelmente em combinação com uma substituição de Lys-^θ —> Pro^S pode proporcionar outro conjunto de mutantes de eliminação interna.

H j A descoberta de que a actividade de hIL-3 é retida nos mutantes duplos referidas ou para qualquer outro mutante a que falta grande parte da proteína (por exempla aproximadamente 257.) tem outra vantagem potencial. Uma composição farmacêutica contendo hlL-3 pode ser administrado jl parentericamente, intravenosamente ou subcutaneamente. A l; utilização de um hidrogel constituído por um polímero ji biodegradável envolvendo o polipéptido e libertando conti™ j nuamente o referida polipéptido é limitada pela quantidade de

I i péptido que pode ser envolvida. Utilizando um mutante de ! eliminação do polipéptido com uma actividade específica > superior implica que numa base muiar mais substância activa pode ser introduzida no mesmo volume aumentando assim o tempo entre administrações sucessivas ou evitando possivelmente administrações repetidas.

: Os mutantes de substituição podem ser . > fabricados introduzindo mutações específicas ao nivel do ADN '! introduzindo assim substituições de aminoácidos na proteína

codificada. Estas substituí ções podem ser introduzidas em regiões que são importantes para a conformação ou para a actividade da proteína. Um exemplo dessa mutação ê uma mutação que perturba ponte de dissulfureto que está presente em Cys^⁶ e Cys^. Substituindo um deles (ou ambos) os resíduos de cisteina por uma alanina a ponte não pode ser formada, resultando numa actividade fortemente diminuída. Todos os três mutantes possíveis foram já fabricados e eles mostram uma actividade ligante relativamente elevada (comparada com a actividade biológica), num ensaia de ligação específica. Dado que diferentes proporções de actividade ligante relativa em relação à actividade biológica relativa (Tabela 4) são encontradas, pode ser vantajosa utilizar combinações dos análogos de IL-3 referidos. Além disso, pode ser vantajoso utilizar análogas de polipéptidas possuindo uma ou mais eliminações e uma ou mais substituições.

Rompendo a ponte de dissulfureto resulta numa alteração substancial na estrutura tridimensional na proteína em análise, e outras substituições de aminoácidos também influenciam essa estrutura e assim a actividade.

As medidas de estrutura secundária (dicroísmo circular) mostram que a molécula de hIL_3 tem uma elevada percentagem (707. a 20®C) de hélices->x. Os programas de previsão de estrutura secundária ( por exemplo Hopp e Woods, Proc. Natl. Acad. Scí. USA 78 (1981) 3824-3828, Garnier e col., Mol. Biol. 120 (1978) 97-128, Biou e col., Prot. Eng. 2 (1988) 185-191, Cármenes e col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159 (1989) 687-693) sugerem que estas hélices-cs estão localizadas entre as seguintes aminoácidos

Met¹⁹ - His²⁶, Gly⁴²

Arg

-SU

Slu^6<?, Ala⁷¹

Leu®Leu θ⁷ - His⁷^. His®® - Leu^H e Leu*^ - Aia^²*.

Dada a distribuição de carga nas a-hélices e dado que é possivel que estas cargas joguem um papel ., importante na interacção com o receptor são também englobadas ι

na presente invenção

as seguintes substituições de inversão de cargas

Asp21Glu22		Lys-iiArgz-j£·
Asp3&		Arg36
Glu43Asp44		Lys43Arg44
Arg34Arg35	—>	Glu54Asp35
Asp46	_______	j_ys46 ou Arg46
Glu50		Lys^0 qu Arg3®
Glu.39	— >	Lys39 au Arg3*?
G1u5<?	—>	Gly39 qu Pj.~q59

(rompedar de hélice-a*)

Arg63Ala64	“**· ,?♦*	proó3sly64
—yi*· Glu·	—>	Arg75 ou Gly75
Lys · -	—>	Glu74?
Arg4?4	*“***“	Pro4?4
His4?8Lys100Asp ^·01	MN S·	Glu?sAsp100Gln101
Glu106	__	Lys 0^
Ar g 3·0® Ar g 0<?Lys 110	-->	Glu* 00Asp * 0Í?G1 u110
Phe -’Τ yr 114	— >	Alail^Thr114

ι Quer os mutantes de eliminação quer os mutantes de substituição podem ser utilizados para alterar os sítios de glicosilação, permitindo assim a produção de ' polipéptidos glicosilados ou não glicosilados em células eucarióticas de hospedeiro à vontade.

Qs mutantes acima descritas foram utili! I zados em experiências ds mapeamento de epitopas de modo a determinar os locais onde os segmentos expostas da molécula, ¹ _ _ ! que podem ser importantes na ligaçao de receptor, estão

II h localizados. Para conseguir isto, foram preparadas anticorpos i

monoclonais contra hIL-3 madura. Posteriormente, estes anticorpos foram utilizados em experiências de revelação de “western contra proteínas mutantes. Podia ser detectado pelo menos um fragmento antigénico.

As novas mutantes hIL-3 de acordo com a ! presente invenção são convenientemente preparadas por mutagénese orientada para os sítios, mas podem também ser utilizadas várias outras técnicas que são conhecidas para produzir proteínas modificadas.

Os vectores adequadas que são susceptíveis de transformar mocroorganismos, que podem expressar as sequências de ADN que sofreram mutação codificando os mutantes de hIL-3 pretendidas, incluem vectores de expressão compreendendo as referidas sequências que sofreram mutações derivadas da sequência de codificação de hIL,~3 maduras, ligadas a regiões terminadoras. Estas regiões são escolhidas dependendo das células procarióticas ou eucarióticas que são utilizadas como células hoepedeiro. São utilizadas de preferência E. coli ou Bacillus como estirpes hospedeiro. Contudo, podem também ser utilizadas células de fungos, de levedura e células de cultura de tecidos íver EP-A-027559S).

Os ‘vectores de expressão para E. coli incluem pSB/IL-336 e pGB/IL-339, cada um contendo o promotor lacZ, ε para o Baci ilus pGB/IL--322, contenda o promotor de «-amilase e o péptido de sinal, e os seus derivadas» Outros vectores adequadas para a expressão em Bac i11us são, por exemplo, os vectores contendo o promotor Hpall e os seus derivados. Estas e outros vectores são todos descritos em EPA-0275598 e EPA 90200624.6 (apresentada em 15 de Março de 1990, com base nas seguintes prioridades: EPA 8920Θ660.2 apresentada em 15 de Março de 1989 e EPA 89201967.0 apresentada em 25 de Julho de 1989).

Por conveniência pode ser útil utilizar construções de expressão que são susceptiveis de segregar a proteína da célula hospedeiro. Isto é por exemplo feito nas construções de Bacillus utilizadas. 0 isolamento dos carpos de inclusão, tal como aqui exemplifidados em E.coli, é também possível.

A purificação do polipéptido obtido após expressão é dependente da célula hospedeira e da construção

de expressão que é utilizada. Seralmente a purificação das muteinas hIL-3 pade ser afectada da mesma maneira que a purificação de hlL-3 nativa. Para se obter muteinas de hIL-3 altamente purificadas devem ser afectadas as seguintes fases?

; cromatografia de interseção hidrofóbica, seguida de ί cromatografia de permuta aniónica e opcionalmente seguida de I filtração de gel. Pode também ser suficiente utilizar apenas j uma ou mais dessas fases de purificação (uma descrição ΐ detalhada da purificação do hIL-3 é referida na Patente EPA ;j 90200624.6, apresentada em 15 de Março de 1990, com base nas íj seguintes prioridades: EPA 89200660.2 apresentada em 15 de ; Março de 1989 e EOPA 89201967.0 apresentada em 25 de Julho de • 1989).

li il η Resumidamente, após expressão em E.coli ^! como primeira fase foram isolados os corpos de inclusão j contendo a proteína. Após tratamento com som em ureia 8 M a i proteína foi ainda purificada por aplicação de cromatografia de permuta aniónica. Após remução da ureia, a esterlização ί por filtração produziu uma proteína que foi utilizada para a caracterização biológica e bioquímica posterior.

A utilização de BaciIlus como estirpe : hospedeira, em combinação com a segregação dos polipéptidos, produziu polipéptidos altamente purificados após a combinação de interaeção hidrofóbica e cromatografia de permuta anii ιί ónica. Além disso, é óbvio que os mutantes que possuem cargas I alteradas podem apresentar propriedades físicas diferentes, ί que necessitam de uma eluição especial ou outros materiais de coluna em relação ás especificamente utilizadas nos Exemplos.

I As muteinas purificadas podem ser formuladas em composições farmacêuticas por mistura com adição de um veículo não tóxico farmaceuticamente aceitável. Tal como acima referida, essas composições podem ser preparadas para utilização em administração parentérica , ; (subcutânea, intramuscular ou intravenosa) particularmente ’! sob a forma de soluções ou suspensões líquidas. As composições podem ser convenientemente administradas numa forma de unidade de dosagem e podem ser preparadas por qualquer dos processos conhecidos da técnica farmacêutica, por exemplo, coma é descrito em Remingtan’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 197®. As formulações para administração parentériça podem conter como excipientes comuns água esterilizada ou solução salina, polialquxleno glicóis como por exemplo polietileno glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e produtos semelhantes.

Os materiais desta invenção podem ser utilizados como agentes activas ú.nicos numa composição farmacêutica ou podem ser utilizados em combinações com outros agentes activas. Outros ingredientes activas podem ser escolhidos por exemplo de entre hematopoietinas apropriadas,

CSF e interleucinas. Estas incluem GM-CSF, CSF-Í,

G-CSF, MCSF, eritropoietina, IL-la, IL-íf2, factor de necrose de tumores.

IL-2, IL-4 a IL-8 e

Existem vários ensaias para determinar a actividade biológica e a potência de análogos da hIL-3 da invenção. Por exemplo, pode ser ensaiada o análoga utilizando técnicas bem conhecidas, para verificar se a proteína estimula a formação de colónias progenitoras hematopoiéticas humanas. As colónias formadas incluem eritróides, granulócitos e macrófagos de granulócitos. Alternativamente, a capacidade dos análogos em estudo para estimular a síntese do ADN por blastos de leucemia mielogenosa aguda ÍAML), evidenciada por exempla par absorção de timidina marcada, pode ser utilizada para indicar actividade.

Os análogos de polipéptidos biologicamente activos de IL-3 humana proporcionados pela presente invenção podem ser utilizados para fins terapêuticos e de diagnóstico. As utilizações terapêuticas incluem o tratamento e a prevenção de doenças malignas e não malignas.

r.

ι ·

Devida às propriedades especificas dos presentes mutantes pode ser ainda aperfeiçoada a aplicação.

As aplicações incluem o tratamento de: ί - citopenias e/ou imunossupressão devidas a infecções;

- citopenias devida a quimioterapia e/ou irradiação;

, - doenças dos ossos como por exemplo fracturas dos ossos e [ osteoporose;

' - imunadeficiências devidas a procedimentos anestésicas i gerais;

! - recuperação após a transplantação da medula óssea;

: - como aditivos à terapia de vacinação e auxiliar das ! infecções.

A invenção é ainda guintes exemplos não limitativas.

ilustrada pelos sePARTE EXPERIMENTAL

EXEMPLQ í

Construção dos Vectores de Expressão

Construção de pGB/IL-330

De modo a produzir um polipéptido que seja muito parecido com a IL—3 humana, foi feita uma ί construção em que faltam as sequência 5’ não deslocadas e as j sequências codificadoras dos sinais de péptido. A inserção de j cADN de IL-3 de pLHl (ver EP-A-0275598) foi retirada com ; HincII e HindIII, ligadas a um oligonucleótido sintética S (SaíI-sobressuspenso/cego, 419/420, Tabela 1) compreendendo a , sequência codificando os 14 aminoácidos do terminal N da IL-3 I madura e inseridas em pTZíSR digeridas com Sal_I-Hindi 11 (Pharmacia). Após verificação da sequência, a inserção completa foi transferida para pUCS para a produção de •j proteínas (da forma descrita na Patente EP-A-0275598, • I ,! resultando no plasmídio pSB/IL-335. Para permitir a —* *3*3 —

sequenciação directa e mutagénese, o fragmenta Pvuí da plasmídio pTZISR contenda a origem fl da replicação foi i utilizado para substituir o fragmento de Pvuí de pUCS. 0 j plasmídio de expressão bacteriana resultante pGBZIL-336 dá ¹ origem a uma proteína de fusão de 145 aminoácidos com um peso molecular calculado de 16 384 dalton (Figura 1).

C.o.n.s.t,c.u.,ç.ão,......d,Q,.....p,GBZlLr3.3-g.

plasmídio de expressão alternativa foi construído para facilitar uma transferência eficiente dos mutantes potencialmente interessantes em vectores de expressão de Bacilus (ver adiante). Para este fim foi digerida pGB/IL™336 Hpal e HindiII para remover a maior parte do terminal 3’ do cADN de IL-3. As extremidades salientes tornaram-se cegas e consequentemente uma fragmenta cego contendo as sequências de IL-3 correspondentes (nt 137-497) e o terminador de alfa-amilase de Β. 1icheniformis a partir do plasmídio pGB/IL-337 foi ligado a ele, resultando no plasmídio GB/IL-338. 0 pGB/IL-337 tinha sido construído a partir do pGB/IL-324 (tal como é referido no Pedido de

Patente Europeia NS 892019678 que é aqui incorporado como referência) por ciclização das sequências estruturais de 3’ não codificando cADN IL-3 e de alfa-amilase do códão de paragem IL-3 no terminador de cADN e de alfa-amilase, utilizando um oligonucleótido sintético (Tabela 1, 944). Este oliganucleótido também introduzia um sítio Xhol justamente a juzante do códão de paragem de IL-3. 0 plasmídio pGB/IL~338 foi digerido com BamHI e HincII e uma parte do poligante e das sequências do terminal 5’ de IL-3 foram substituídas por oligonucleótidos sintéticos fosforilados 1055/1056 (Tabela 1) dando origem ao plasmídio pGB/IL-339. Assim o gene de IL-3 foi reconstruído com uma sequência codificando um péptido de sinal heterólogo ligeiramente modificado. Depois uma fusão da proteína de 148 aminoácidos com um peso molecular de 16 541 dalton é sintetizada (Figura 2). A sequência de ADN do pGB/IL-339 foi verificada e viu-se que era correcta. Verificou-se que a actividade biológica da proteína de fusão expressa estava inalterada.

- 23 Construiu-se um outro vector de expressão E. coli pSB/IL-340, em que o promotor lacZ é seguida imediatamente por sequências codificando o péptido de sinal de alfa-amilase de Bacilus precisamente fundida na IL-3 madura, com o seu terminador de amilase a juzante. Este plasmídio, que também serve como intermediário para a construção dos vectores de expressão de Bacilus. foi contruído introduzindo o fragmento Ndel-Kpnl do pGB/IL-337, efectuando todas as sequências jã mencionadas, no vector pTZISRN de E. coli clivada com NdeX-Kpnl. D pTZISRN é o pTZISR (Pharmacia) modificado justamente a montante do côdão de partida lacZ ATG para introduzir um sítio Ndel, utilizando o oligonucleótido 73Í (ver Tabela 1). 0 pGB/IL-340 deu origem a uma alta produção do UIL-3 em E. coli.

EXEMPLO 2

Construção dos Mutantes de Eliminação e de Substituição

A mutagénese in Vitro foi efectuado utilizando oligonucleótidos sintéticos (Tabelas 1 e 2) de acorda com o procedimento desenvolvida por Kunkel e cal., (1987) Meth. Enzymol. 154 .367-382. 0 ADN modelo de banda única foi preparada pela transfarmação do ADN de pGB/IL-336 ou pGB/IL-339 numa estirpe CJ236 de E.coli (BioRad) e superinfecçâo com o fago auxiliar M13K07 (Pharmacia). 0 ADN do fago foi preparado de acordo com os procedimentos convencionais e fracionada em agarose de baixo ponto de fusão a 0,6% para remover o fago auxiliar ssADM. A banda retirada, foi fundida e extraída com fenol. G ssADN de pGB/IL-336 ou pGB/IL-339 foi recuperado pela concentração de butanol e precipitação em etanol e ensaiadas para síntese do ADn dependente do iniciador numa reacção sequêncial.

ssADN de pGB/IL-336 ou pGB/IL-339 purificada (± 100 ng) foi estabilizada com 20 ng iniciador ; fosforilado a 65^eC e lentamente arrefecido para a temperatura ambiente. A síntese da banda complementar foi efectuada

utilizando i-2 pg da proteína do gene 32, 4 unidades T4-ADN í polimerase e 2,5 unudades de T4-ADN ligase. A reacção foi efectuada a 0*C durante 5 min., a 20°C durante 10 min. e a

37°C durante 90 min. Após terminar, um terço da mistura i

reacianal foi misturado com células JM109 convenientemente descongeladas (Hanahan, D.(1985) em: DNA Cloning (ed.D.M.

j Slover) Vol.1, IRL Press, Washington) e placadas. Foram j[ utilizadas colónias individual mente recolhidas para inocular ]i o meio líquido e as células foram superinfectadas com o fago ^! auxiliar M13KQ7 para produzir ssADN. A sequência dos clones : f_ai verificada utilizando o iniciador de sequênciação inverso J MÍ3 e dois iniciadores especificas de sequências de IL-3 d (Tabela 1, 823: nt 118-137 e 824: nt 261-280).

* mutante de cisteina dupla (9045) foi construída por ligação dos fragmentos correspondentes de j BstBI-BamHI dos plasmídios contendo os genes mutantes 904 e ί 905 de IL-3, Da mesma forma, os mutantes de combinação X e Z ' foram construídas pela ligação de fragmentas contendo uma j eliminação 5’ e fragmentos contendo eliminações 3’, Qs clones resultantes foram verificados pela análise de enzima de restrição e análise de sequências.

; 0 mutante 9329 foi derivado de 939 após a digestão com Hpal e BamHI e a ligação com os oligonucleótidos ; 1424/1425. Qs clones foram verificados primeiramente para i

: determinar a perda do sítio de Hpal e posteriormente a ί correcta sequência do ADN.

Q plasmídio ADN foi isolada a partir de todas os transfarmantes, para uma segunda volta de transformação em células JM109 para excluir uma contaminação patêncial com a construção do IL-3 parente, Após a verificação de sequências, estes clones foram utilizados para a produção de proteína.

9329)

Alguns dos mutantes aqui descritas (811, foram introduzidos em pSB/IL-340. Isto foi β

possível por ligação do fragmento de FstI-Xhol de um mutante derivada de pGB/IL-339 em pGB/IL-340 clivado com FstI-Xhol, e j isto resultou nos plasmídios pGB/IL-340 /811, pGB/IL-340/933 ; e pGB/IL-340/9329.

Os vectores de expressão de BaciIlus para muteinas IL-3 foram construídos por permuta do fragmento de PstI-HindiII de pGB/IL-322 (parte contendo o péptido de sinal de alfa-amilase, a sequência cABN do IL-3 mutante ε o ^H terminador de alfa-amilase). Os vectores de expressão de : Bacillus para as muteinas 811, 933 e 932? foram designadas por pGB/IL-322/81í, pGB/IL-322/933 e pGB/IL-322/9329, respecli h tivamente.

h Um outro mutante (a que faltavam 1455 aminoâcidos 130-133) foi construído directamente em pGB/IL340 por mutagénese de ciclisação, utilizando o oligonucleótido 1455 (Tabela 1), resultando na plasmidio pGB/IL340/1455» Posteriormente, a sequência mutante foi transferida para pGB/IL-322 de modo semelhante ao descrito para os mutantes 811, 933 e 8329 resultando no plasmidio pBB/IL-341.

TABELA 1

Qliqonucleótidos dg Mutagénese

Código	Sequência (5?— >3 ’ >	Aminoàcidos envolvidos
_—-------.	-----—----------— — —	----------
810	• w AACTGCTCTAACATGCCTTTGCCTTTGCTG	20 - 30
811	* a CACTTAAAGCAGCCAGAAAATAACCTTCGA	31 - 49
812	a a ATGGAAAATAACCTTAACAGGGCTGTCAAG	54 - 61
813	a a TTCAACAGGGCTGTCCTCCTGCCATGTCTG	66 — 80
820	a a AATCTCCTGCCATGTGCACCCACGCGACAT	85 - 90
821	a a ACGGCCGCACCCACGGACTGGAATGAATTC	94 - 102
822	a a GGTGACTGGAATGAAAATGCGCAGGCTCAA	107 - 119
932	a α CGGGGATCCGTCGACAACTGCTCTAACATG	1 - 14
933	ATAACACACTTAAAGAACAACCTCAATGGG	29 _ 37
934	a a GGGGAAGACCAAGACAGGCCAAACCTGGAG	47 - 54
QXcr t w w	AG6CCAAACCTGSAGGCATCABCAAATGAG	60 - 70
936	GCATCAGCAATTGAGTGTCTGCCCCTGGCC	76 - 83
937	TGTCTGCCCCTGGCCCCAATCCATATCAAG	89 - 95
938	a a CATATCAAGGACGGTACGTTCTATCTGAAA	103 - 111
939	a a CTGAAAACCCTTGAGGCGATCTTTTGAGTC	120 - 130
_--------.		_-------------.

823 CCTTGAAGACAAGCTGGGTT

824 CCAAACCTGGAGGCATTCAA

419 TCGACGCTCCCATGACCCAGACAACGCCCTTGAAGACAAGCTGGGTT

420 AACCCAGCTTGTCTTCAAGGGCGTTGTCTGGGTCATGGGAGCG 731 CAGGAAACACATATGACCATGATT

944 TGAGCCTCGCGATCTTTTGACTCGAGTAGAAGAGCAGAGAGGACGG

1055 GATCCTCTGCAGCAGCGGCGGCTCCCATGACCCAGACAACGCCCTTGAAGACA AGCTGGGTT

1056 AACCCAGCTTGTCTTCAAGGGCGTTGTCTGGGTCATGGGAGCCGCCGCTGCTG CAGAG

1424 GATCCTCTGCAGCAGCGSCG

1425 CGCCGCTGCTGCAGAG

1455 CTCAACAGACGACTTTGAGCTGACTCGAGTAGAAGAGCAGAG

Índica nucleótido próximo da eliminação no gene IL~3

TABELA 2

Oligonucleótidos para mutaqénsese de substituição

Código	Sequência (5’—>3’)	Aminoácidos envolvidos
.-------.	_------·---------------------------------.	--------------.
904	GACAAGCTGGGTTAACGCTAGCAACATGATC8ATGAA	16
905	CTTAAAAATCTCCTGCCGGCGCTGCCCCTGGCCACG8	84
1480	GTGCCTTTGCTGCGCTTCAACAACCTC	36
1481	AACCTCAATGGGAAACGCCAAGACATTCTG	43 - 44
1482	GGGGAAGACCAACGCATTCTGATGGAA	46
1483	GACATTCTGATGAAAAATAACCTTCGA	50
1484	GAAAATAACCTTGAAGATCCAAACCTGGAG	54 - 55
1485	AGGCCAAACCTGAAAGCATTCAACAGG	59
1486	GAGGCATTCAACCC8G8CGTCAAGAGTTTA	63 - 64
1487	GCATCAGCAATT C C/G 3GTAGCATTCTTAAA	75
1488	GAGABCATTCTTGAAAATCTCCTGCCA	vo < *
1489	8CCGCACCCACGCCGCATCCAATCCAT	94
1490	CGACATCCAATCGAAATCGATCAGGGTGACTGGAAT	98 - 101
1491	GGTGACTGGAATAAATTCCGGAGGAAA	106
1492	TGGAATGAATTCGAAGATGAACTGACGTTCTAT	108 - 110
1493	AGGAAACTGACGBCGACCCTGAAAACCCTT	113 - 114

EXEMPLO 3

Purificação das Muteinas de IL-3 de E. coli ou de Bacillus

Foram inoculadas culturas de E. coli JM109 (100 ml) com 0,5 ml de uma cultura fresca preparada durante a noite do clone de IL-3 (mutante) e cultivou-se a 37^eC até se atingir um valor de OD de 0,4-0,6 a 550 nm. A síntese de proteína dirigida a plasmídio foi induzida por adição de 1 mM de XPTS (Pharmacia). Após uma cultura adicional durante 3-16 horas, as células foram recolhidas por centrifugação (10 min, 4000 rpm a 4^flC) e armazenadas com congelação.

As bactérias foram suspensas em 10 ml de TE (10 mM de Tris-HCl pH 8; 1 mM de EDTA) e foi adicionada lisozima (0,0257 = 500 pg/ml. Após incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente, foram adicionados MgCls a BNase até concentrações finais de 10 mM e 20 gg/ml, f * fc

respeetivamente. Após incubação a 37°C durante 15 min, foram adicionados Tween 20 ¢0,27.), DTT (2 mM) e PMSF (0,1 mM). A suspensão foi arrefecida em gelo e vigorosamente tratada com som (duas vezes durante 35 segundos). 0 homogeneizado foi clarificada par centrifugação (30 min 15000xg, 10000 rpm num

1'

I rotor de Beckman JS13.1) a 4°C e o sobrenadante foi

1' desprezada.

ij

H

A pastilha foi ressuspensa em 4 ml de sacarose a 55% em tampão TPD (50 mM de Tris-HCl, pH 8? 0,1 mM l· de PMSF e 2 mM de DTT) por sonificação e ou centrifugado e í solubilizado em ureia para avaliação directa da actividade í!

‘ biológica ou depositada num gradiente descontínuo de sacarose h

, (porções de 2ml de sacarose a 75% e 60% em tampão TPD), essencial mente da forma descrita em WO 88z'00598. Após ί!

' centrifugação a 200 000xg (35 000 rpm numrotor de Sorvall íi TH641) a 25°C durante 2 horas, foram recuperados os corpos de ij i inclusão contendo as proteínas de IL-3 da interfase de sacarose a 75%.

Após uma diluição de pelo menos 4 vezes, os corpos de inclusão foram centrifugados a 25 000xg (30 min a 13 000 rpm no rotor de Beckman JS13.1) e sonifiçados a 5 ml de ureia 8 M contenda 50 mM de Tris-HCl pH 8,9 e 2mM de DTT e deixadas durante a noite a 4³C. A solução clarificada foi posteriormente aplicada a 3ml de uma coluna de Caudal Rápido de DEAE-Sepharose (Pharmacia), equilibrada com ureia 8 M, 50 mM de Tris-HCl pH 8,9 e 1 mM tampão DTT. A proteína IL-3 foi ligada á coluna e foi eluída em fases com 75 mM de NaCl no mesmo tampão. A proteína eluída foi dialisada contra várias porções de 10 mM de Tris-HCl a pH 8,0 e 1 mM de tampão DTT e tornada isotónica por adição de meio de cultura de células PPMI concentrada 10 vezes (Sigma) contendo 1 % de albumina de soro de bovino. A solução esterilizada num filtra (0,22 pm Milex-GV, Millipore) foi utilizada para a caracterização bioquímica e biológica.

i

I * ^r *

c

As proteínas mutantes 811, 933, 1455,

9329, X e Z produzidas pelo Bacillus •foram exportadas para o meia de cultura e não necessitaram desses procedimentos severos de purificação para o ensaio da actividade biológica. Assim o supernadante clarificado (1 litro) ajustado a 5 mM de EDTA, 1 mM de PMSF e 1 M de sulfata de amónio, foi feito passar em 15-20 ml de Coluna de Fractogel TSK-Butil 650 íc) (Merck) equilibrada com sulfato de amónia 1 M em 10 mM pH 7,0 de tampão Tris-HCl. A proteína IL-3 ligada foi eluida com tampão de 10 mM Tris-HCl e posteriormente feita passar numa ml ds DEAE-Sspharosa de Caudal Rápido um tampão de 10 mM de Tris-HCl pH 8,0. 0 :oluna foi recolhido e ajustado a 70% de sulfata de amónio para concentrar a proteína IL-3. □ precipitado foi recolhido por centrifugação a 10 000 rpm (rotor JS-13), dissolvido e dializado contra um tampão de 10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM de DTT.

coluna de 1,5 equilibrada com caudal através da

Amostras correspondentes a 25-100 μΐ da cultura original de bactérias foram analisadas em 0,75x75x100 mm (BioRad miniprotean II) 13,5% ds géis de 5DS-poliacrilamida (acri1Zbisacri1=29/1). As proteínas foram visualizadas por processos de Azul Brilhante de Coomassie j 8250 ou processos imunológicos. A figura 4 mostra um exemplo ! das muteinas purificadas expressas em E^çoli.j A expressão em E. coli do pGB/IL—339 i mutante derivada da proteína IL-3 foi geralmente superior do j que α mesmo mutante da proteína do vector de expressão I p8B/IL-33ó. 0 procedimento de purificação aplicado não foi j concebido de modo a tornar completamente puras as preparações de proteína IL-3. Seralmente, foram observadas poucas contaminantes com peso molecular superior em géis SDS. Utilizando varrimento densitométrico de géis de SDS revelados, a quantidade de proteína IL-3 foi determinada. Embora ocorresse ocasionalmente uma grande perda de proteína após dialise, a recuperação total foi geralmente de 0,1-1 mg de proteína IL-3 purifiçada. A única excepção foram os * «4 t, mutantes 81í e 933, que não deram produção de proteína de •fusão em qualquer dos vectores de expressão de E. coli. A análise de Northern indicou uma forte redução do ARN específico de IL-3 nas bactérias, e não foi observada i

^! diferença significativa no teor de ADN de plasmídio. Este resultado sugere que provavelmente a estabilidade de mARN é diminuída por meio ds eliminações introduzidas na sequência !· de cADN eucariótica.

único processo conveniente para as ! muteínas 811 e 933 é a expressão em Baci 1 lus 1 icheniformis.

Embora a quantidade de proteína produzida seja muito baixa, ^; comparada com a quantidade de proteína produzida pelas ii estirpes de Bacillus que sintetizam outras muteínas como por il exempla 9329 e 1455, foi obtida suficiente para purificar parcialmente as muteínas com 811 e 933 em quantidades h suficientes para efectuar os ensaios biológicos aqui descritos.

ί !

i

H

EXEMPLO 4

Caracterização Imunológica das Muteínas de IL-3 ^! A preparação de antisoro policlonal e ι monoclonal foi descrita no documento WO/04691.

ί

Para a detecção imunológica das muteínas i

de IL-3, as proteínas fraccionadas com gel (Ver Exemplo 3) foram transferidas para nitrocelulose (0,2 pm, Schleicher e Schuell BA83) utilizando o sistema de revelação semi-seco (Novablot, Pharmacia/LKB) com um sistema de tampão contínuo (39 mM de glicina, 48 mM de Tris, 0,03752 de SDS e 202 de metanol a 1,2 mA/cm² durante 90 min. 0 filtra de nitrocelulose foi posteriormente seco com ar, pré-incubado i com solução de albumina de soro de bovino a 32 (BSA, Sigma) : (10 mM de Tris-HCl pH 7,6; 350 mM de NaCl; 0,12 de PMSF e , 0,12 de azida de sódio) e incubau-se durante 4-16 horas com

os anticorpos policlonais (diluição de ΙΘ”·^) ou manoclonal (dependendo do objectivo pretendido das experiências) dirigido contra IL-3 humana (MCA Ai, A4, A5, AS, AIS a diluição a 10”⁴ em tampão RIA (10 mM de Tris/HCl pH 7,6; 150 mM de NaCl; 1% de Triton Χ-1ΘΘ; 0,17. de SDS; 0,57 tíe Na[ desoxicolato; 0,1 mM de PMSF e 0,3% de BSA)

Os complexos imunológicos foram visua; lizados utilizando Ig biotinilado anti-coelho ou rato, ! peroxidase de rábano biotinilada com estreptavidina (Amersham ;; Internacional, Amersham, UK) e 4-cl oro- 1-naf tol (Gibco-BRL)

- de acordo com os procedimentos referidos pelo produtor, ií Alternativamente, as incubações antisoro foram efectuadas em H solução salina tamponada com Tris juntamente 0,05% de Tween l· 20. Os complexas de fasfatase alcalina ligadas a Ig anti-rato ; foram visualizados de acordo com os procedimentos conj vencionais (Promega).

Os dados, referentes ã interacção de anticorpos monoclonais específicos com mutaínas de hIL~3 em ensaios de revelação de Western, são apresentados na Tabela

I 3.

ί TABELA 3 i

I

Avaliação dos dados ds IL-3/MCA

MUTANTE 4S10	933	811 31-48	934 47-54	812 54-61	835 60-70	4813 66—80	TODOS OS OUTROS
(AA) MCA	20-30
Al	++	—	—	4* 4*	4-4-	4.4.	4.4.	44·
A4	++	++	++	-h-l·	4*	4.	+	++
A5	++	4—l··	—	—	+	4-4-	++	++
AS	++	++	•—	++	++	-l··*·	++	++
AIS	4-4·	—	—	++	++	4·*+·		++
r?	++	—	—	4-4-	++	++	++	++
3	++	++	—	—	+	++	++	++
6	++	++	—	+	++	++	4*4*	4·+
10	++	++	—	+	++	4* Hl·	++	++
12	++	—	—	++	++	++	++	++
13	+	—	—	++	++	+	+	++
14	++	++	—	—	+	++	++	++

fe

				•
15	44	— —	44		4-4·	4-4-	4-4-	+4
26	44	4-4- --	4		4-4-	4-4-	4*4*	4-4-
27	4*4*	44 4-4-	44		+	4·	4-	44
7·“)	44	-- --	4*4*		4-4-	4- 4-	4-4*	44
33	4*4“	— —	44		4*4*	4-4-	4-4-	44
		36—>R	43ED—	>KR	46D—>R
		1480		1481			1482
Al		4*4*		4-4-			4-4·
!: A4		4-4-		4-4-			4· 4*
h A5		4-4-		4-4*			—
J AS		4*4*		—			4
ί AIS		4*		44			4-4-

·; A : ascites monoclanais ++ s resposta total à revelação de western

H + s resposta reduzida de pelo menos 5 vezes i; — : não foi observada reacção h

j A partir da análise dos resultados íi apresentados na Tabela 3 é evidente que a maior parte dos ί anticorpos monoclonaís criados contra a proteína de fusão desnaturada purificada com gel, são dirigidas contra epítopos localizados entre os resíduas 33 e 53 da polipéptido IL-3 j madura. Estes epítopos reflectem principalmente as cadeias de 'i polipéptidos lineares, apenas foi identificado um exempla de

I ! epitopo descontínuo. 0 grupo maior é susceptível de identificar o mutante 933, mas não é capaz de reagir com o mutante 811. Assim, o epitopo deve ficar entre os resíduas 33 ' e 50. Verificou-se que esta região era altamente hidrofílica it ii com uma valta-fl e uma hélice-~ix postuladas (programa DNASIS) e ii

Ι· foi proposta para ser um determinante antigénico utilizando o algoritmo de Hopp e Wood. 0 segunda grupa de anticorpos é caracterizado pela ausência de reacção com o mutante 933 (a que faltam 9 aminoácidos). Esta região enrolada rica em í

| prolína hidrafóbica não é prevista como sítio antigénico íj

I importante.

i

A localização mais refinada destes epitapas aparece da reacção das ascites monaclunais com os seguintes mutantes de substituição Asp36—>Arg, Glu^-^^sp—>Lys^^Arg e Asp^6—>Arg.

-J J

A ensaios imunológicos forma seguintes

A caracterização adicional das ascites monoclunais por ensaio de ELISA de sanduíche dupla revelaram a falta de interferência entre Al e A5 ou AS, e entre A5 e AIS. □ ensaio de competição de ELISA revelou uma competição i

; cruzada entre Al e AIS, entre A5 e AS, e entre AS e A18. Não foi observada competição cruzada com A4. Estes dados estão de _; acordo com as experiências de imunorrevelação. Além disso, foram encontrados anticorpos de ascites que reagiam com preparações de hIL~3 de mamíferos, bactérias e culturas de fungos, sem relação com o estada de glicosi 1ação.

ii

1' partir da informação combinada destes os epitopos podem ser localizados da

Al e AIS são dirigidas contra um h epitopo localizada entre os aminoácidos Ξ9 e 37. Além disso a : partir do mutante 36 D —> R pode concluír-se que o epitopo AIS está localizado um pouco mais em direcção ao terminal C do que o epitopo Al.

j ~ A5 está dirigida contra um epitopo

I localizado entre os aminoácidos 45 e 54.

- A8 está dirigida contra um epitopo i

j localizada entre os aminoácidos 36 e 47.

I

II

Ί ί

EXEMPLO 5 i

! Caracter.i..zagãQ..-b.i oloógi ca das mutei nas de IL-3 ί

A síntese ds ADN de AML foi ensaiada em células AML193 humanas» As células AML193 humanas (ATCC? CRLj -9589) foram mantidas num Meio Isenta de Soro (SFM), CMeio de i

i

Dulbecco Modificada de Isccve CSibca BRL) contendo 8,17 de • j BSA CBehringwerke AG, Marburg), 10 p.g/ml de Insulina (Qrganon) e tranferrina, 0,1 mM de fl-mercaptoetanal 3 e 1® a 20 unidades de IL-3 humana.

Foram preparadas diluições de composições de IL~3 (mutante) (50 pl) em placas de 96 furos de fundo redondo em SFM. Foram adicionadas células lavadas (1-2 x l®⁴ em 5® pl de SFM) e foi feita a cultura durante 6 dias. Foi adicionada ^H-Timidina (0,1 pCi, 2 pCi/mmol) em 2® pl ds SFM e foram recolhidas as células passadas 16 horas. Foi definida uma unidade de actividade de IL-3 como a quantidade necessária para se obter 50% da síntese máxima de ADN neste ensaio. Para a preparação de IL-3 de referência a actividade especifica variava entre 2 x Í0& a 2 x 1®? unidades por mg de proteína. Em geral, a actividade biológica das muteinas era comparável com a desta composição de referência.

A Figura 4 mostra um exemplo do ensaio de proliferação de AML em que a muteina 812 é comparada com a IL—3 ds referência expressa em Baci 1lus. O gráfico mostra que a muteina 812 tem uma actividade que é reduzida de cerca de 4 ordens de grandeza em relação á IL-3 não modificada. Contudo a muteina é ainda susceptível de estimular as células AML até uma actividade máxima, sendo apenas necessária uma proteína.

Foi efectuado um ensaio de ligação de receptor de IL-3 com hIL-3 recombinante purificada (ver EP-A-0275598 e ΕΡΑ 90200624.6).

A IL-3 foi radiomarcada com reagente de Bolton-Hunter (tal como descrito por Budel e Col. Blood, 74 (1989) 565-571). A actividade especifica foi estimada a 80.000 cpm/ng de IL-3. Como alvo foram utilizadas células de leucócitos dadores, células AML de pacientes, ou células MV4-11 (ATC: CRL-959Í). As células foram lavadas em solução salina ds Hanks equilibrada e suspensas em meio AIpha-MEM mais 1% de BSA. Foram, geralmente, incubadas 3-10 χ 10⁶ células com 200-300 pM de IL-3 radiomarcado e várias concentrações de proteínas de mutantes não marcadas num

, volume total de 200 μΐ durante i hora a 37°C. Foi centrifugada a IL-3 marcada ligada a células durante 10 min. a 1000 x g a 4°C através de uma almofada de 0,5 ml de soro de ί vitela num tubo de Eppendorf CBudel e col., 1989). Os tubos [ foram congelados em azoto líquido e as pontas cortadas para : contagem num contador gama de Packard. A ligação de : competição foi determinada em relação à composição da rejj ferência. A Figura 5 mostra um exempla de uma experiência de ; ligação do receptor de IL-3. A ligação radiomarcada de IL-3 ' aos blastos AML do paciente compete com a proteína de IL-3 í

não marcada (composição de referência). Devido ao baixo ;! numero de receptores (menos ds 200) nas células alvo, os H dados de competição variam em geral de uma ardem de grandeza.

Os resultados obtidos dos ensaios acima referidos referentes aos mutantes de eliminação e substituição específicas são apresentados na Tabela 4. Parte dos resultadas são também apresentadas graficamente na figura 6.

Como se pode ver as proteínas de fusão de IL-3 derivadas de plasmídios de expressão pGBZIL-336 e pSB/IL-339 eram idênticas em actividade biológica e não eram significativamente diferentes da composição da referência de

B. licheniformis derivadas da expressão da comprimento total de cADN de IL-3 em pGB/IL-322 (ver EPA 89201967.0). Aparentemente, não é exercido efeito negativo na actividade biológica no péptido líder heterólogo em proteínas de fusão de E. coli. A maior parte dos mutantes de eliminação IL-3 foram significativamente reduzidos na sua actividade biológica. As eliminações entre os aminoácidos 50 e 105, resultavam em mais do que uma redução de 10 000 vezes da Contudo, em todos os casos foi biológica residual, sensibi1 idade do bio-ensaio e a ausência tóxicos nas composições de proteína. A recuperação completa de actividade biológica foi observada para os mutantes de eliminação 932 (1-14) e 939 (120-130) e o mutante duplo correspondente 9329 bem como para o mutante terminal C 1455.

actividade específica, detectada actividade indicando uma de componentes

As sequências com terminais Ne C nao estão aparentemente envolvidas na ligação ao recptor ou dobragem adequada da

I í molécula. Em contraste, as substituições simples dos resíduos i

j de cisteína (mutantes 904 e 905) resultam numa redução de j 5000 vezes da actividade biológica. Foram observados efeitos semelhantes com um mutante de cisteína duplo (9045), indicando que a ponte S-S jogam um papel estabilizante importante na molécula de IL-3 nativa.

ii

J As muteinas expressas em E. coli descritas na secção acima referida são todas proteínas de fusão.

Para proporcionar a evidência que os aminoácidos N—terminal íj

P extra não são necessárias coma compensação para a perda dos li aminoácidos específicos de IL-3 eliminadas, fez-se a

H _cont_ruçã_Q de pSB/iL-322/9329 e expressou-se em B. licheni,j for mis. Esta construção dá origem a uma muteina 1--14/Í20-130 de IL-3 sem quaisquer aminoácidos extra no terminal N. A actividade desta muteina é comparável com a molécula do tipo , natural provando que apenas os 108 aminoácidos residuais são responsáveis pela actividade de IL-3.

' A ligação de receptores da maior parte

I das proteínas de IL-3 mutantes foi também determinada. As experiências de ligação não permitem a comparação detalhada da actividade de ligação receptora devida ao pequena número ι

li de receptores nas células alvo. Contudo, existe em geral uma jj boa correlação entre a actividade biológica e a ligação de j receptor (Tabela 4). Para a maior parte das proteínas de IL-3 ί

; mutantes, a proporção entre a ligação relativa e a actividade biológica é aproximadamente de 1. As muteinas 1483, 1488, 904 ^! e 9045 apresentam proporções consideravelmente mais elevadas (Tabela 4 e Figura 6), indicando uma actividade antagonistica potencial. Isto significa que estas moléculas podem ser encaradas como antagonistas parciais de IL-3. Após mais experimentação foi verificado que as muteinas que tinham a mesma capacidade ligante tal como a IL-3 nativa têm uma , actividade 104 vezes inferior. Essas moléculas seriam verdadeiras antagonistas de IL-3. A aproximação nesta inven37 sistemas e processas para obterem essas ção proporciona as moléculas.

TABELA 4

	Actividades biolóaicas	de mutantes IL-3
C ó d x g o do mutante	Eliminação ou substitui ção de aminoácido*	Actividade Potencial biológica antagónico Rei. Spec.-*· relativo·^

Ref.		1.0
pGB/IL-339		3.7x10“*
pGB/IL-336		7.9x10”*	1.1 Í0.2-3.3)
932	1-14	7.Ixl0~*	2.8 (0.6-4.9)
810	28-30	2.íxl03	O 4 η τ
934	47-54	7.3xl0~5	M. C.
812	54-61	5.3xl0”5	1.2 (0.9-1.4)
935	60-70	1.2xl05	N.C.
813	66-80	2.4xl05	N.C.
936	76-83	ó.4xlW~6	N.C.
820	85-90	1.1x10-5	N.C.
937		1.0x10-5	N.C»
821	94-102	1.8xl05	N.C.
938	103-111	6.6x10-5	N.C.
822	107-119	2.1x10”4	1.9 (1.6-3.9)
939	120-130	2.0	1.8 (0.3-2.8)
0300	1-14/120-130	4.0x10”*	2.0 (1.8-2.1)
904	16C—>A	2.4xl04	100 (33-210)
905	84C—>A	1.9xl0~4	11 (4.8-38)
9045	16/84C—>A	3. 1x10“4	88 (13-170)
1480*	36D—>R	3.1x10-3	12
1481	43ED—>KR	<1.5x10~4	N.C.
1482*	46B-->R	7.5x10-3	0.6
1483	50E—>K	2.7xí03	37 (4-67)
1484	54RR— >EB	8.0xl0“5	3.5 (2.3-4.7)
1485*	59E—>K	1.1x10-2	“3*
1486	63RA—>PG	9.8x10-5	14 (3.5-27)
1487A*	75E—>G	1.5x10-2	3
1487B*	75E—>R	8.6xl0“J	•~r ·>
1488	79K—>E	1.9x10”3	65 (54-77)
1489	94R—>P	1.7x10”3#	N.C.
1490*	98HIKD—>EIKQ	2.2x10~3	5
1491*	106E—>K	3.2x10“4	6
1492	10SRRK—>EDE	3.Ixl0“5	2 (1.2-3)
1493	113FY— >AT	<1.2xIS5	N.C.
X#	1-14/120-133	2.3x10”*	3.9(3.6-14)
Z#	1-14/116-133	1.1x10“*#	1.6(1-1.9)
933#	29-37	5.7x10-3$	1.1 (0.2-2.9)
811#	31-49	4.8x10-^$	1.6(0.5-3.2)

V

1) é indicada a eliminação entre números de animoácidos de IL-3 humana madura. São indicadas as substituições de aminoácidos em código de letra única.

' 2) A actividade biológica específica média é expressa em

I i relação às preparações de IL-3 de referência.

i;

jj 3) 0 potencial antagonista é representado como actividade h

ligante de receptores relativa dividida pela actividade ' biológica relativa. A gama é apresentada entre parenteses.

j * Os corpos de inclusão foram centrifugados a partir de ji soluções de sacarose e solubi1izados em ureia. As muteinas foram diluídas num meio adequado e ensaiadas para a ' determinação da actividade biológica. As experiências de ¹ i ligação de receptores foram efectuadas uma vez.

' # As proteínas mutantes foram expressas em Bacillus a que I faltava uma sequência de polipéptido líder.

•I $ A concentração de proteína de muteina era demasiadamente baixa para os ensaios de varrimento densitométrico e foi estimada a partir de géis e revelações de western.

' N.C. Não foi observada competição para a composição |’ particular de muteina.

ί Todas as publicações (incluindo patentes í

! e pedidos de patentes) mencionadas nesta especificação são ^!! indicativas para os especialistas a que esta invenção se dirige. Todas as publicações são aqui incorporadas como referência na mesma extenção em que cada publicação individual seja especificamente e índividualmente indicada como incorporada como referência.

Embora tenha sido descrita a invenção • anterior com algum pormenor como ilustração e exempla para objectivos de compreenção,será óbvio para o especialista que i

» * se poderão efectuar muitas alterações e modificações sem se afastar do espírito ou âmbito das reivindicações anexas»

Claims (1)

1. Processo para a preparação de um polipéptido mutante de interleucina-3 biologicamente aetivo, caracterizada por compreender a introdução de sequência que codifica o referido polipéptido num vector de expressão de tal maneira que fica sob o controla de sequência que regulam a expressão, í a introdução do mencionado vector ds expressão numa célula hospedeira apropriada, a cultura das células hospedeiras e a recuperação da proteína produzida pelas citadas células hospedeiras.

   •?a

   Processo para a obtenção de uma sequência de ADN que codifica um polipéptido análogo da interleucina-3 humana biológicamente activa, caracterizada por se isolar uma sequência de ADN que codifica a proteína hlL-3 madura e se realizar a mutagéness in vitro para suprimir ou substituir as nucleótidos pretendidos» ί

   • i

   40 í\ b 5

   -=ca

   Processo de acorda com a reivindicação i, caracterizado por se obter um polipéptido biológicamente activo análogo da interleucina-3 humana que compreende uma suspensão de pelo menos 2 aminoâcidos em comparação com a molécula de interleucina-3 humana madura e possui melhores propriedades.

   Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se obter um polipéptido biológicamente activo análogo da interleucina-3 humana que compreende a supressão de, pelo menos, 4 aminoâcidos.

   sa

   Processo de acordo com as reivindicações 3 ou 4, caracterizado por se obter um polipéptido biológicamente activa análoga da interleucina-3 humana que compreende uma supressão de 4 aminoâcidos na extremidade de C.

   Processo de acordo com as rei vindicações 3 ou 4, caracterizada por se obter um polipéptido bialógicamente activa análoga da interleucina-3 humana que compreende uma supressão da até 14 aminoâcidos na extremidade N e/ou uma supressão de atê IS aminoâcidos na extremidade C.

   4Í

   Λ

   Processo de acorda com as reivindicações

   1 ou 2, caracterizada por se obter um polipéptido biológicamente activo análoga da interleucina-3 humana que compreende uma supressão interna.

   - Sã ί\ !'à

   - va h Processo de acorda com a reivindicação í,

   11 ^a ’ ii caracterizado por se obter um polipéptido biológicamente i; activo análogo de IL-3 humana que tem pelo menos uma das ii seguintes substituições

   Asp-¹Glu-² — Lys²¹Arg²² Asp-⁶ __·> Arg*⁶ Slu⁴³Asp⁴⁴ — > Lys^Arg⁴⁴ Arg-⁴Arg^^ s. X Glu⁵⁴Asp⁵⁵ Asp⁴⁶ __> Lys⁴⁶ ou Arg⁴⁶ Glu-⁰ --> Lys-⁰ ou ArgS® Glu⁵⁹ \ X Lys-’⁹ ou Arg^⁹ Glu⁵⁹ X GlySV au Pro^⁹ (interruptor de hélio Arg⁶³Ala⁶⁴ x p_ro63gi_y 64 Glu⁷⁵ — > Arg⁷^ ou Gly⁷^ Lys⁷⁹ —> 61 u* ' Arg⁹⁴ —> Pro⁹⁴ Hi s⁹®Lys ¹⁰⁰Asp¹⁰¹ — > 61u⁹⁸Asp¹⁰⁰Gln Glu¹⁰⁶ Lys¹⁰⁶ Arg¹⁰³Arg¹⁰⁹Lys¹¹⁰ Glu¹⁰⁸Asp¹⁰⁹SL Phe¹¹-^Tyr¹¹⁴ — y Alaii-Thr¹¹⁴ Cys¹⁶ — > Ala¹⁶ Cys⁸⁴ *··. Ala³⁴ Cys¹⁶Cys⁸⁴ — Ala^í6Ala⁸⁴

   .... oa í ι Processa de acorda com a reivindicação 1, j caracterizado por se obter um polipêptido biológicamente ! activo análogo de hIL-3 que tem actividade antagonóstica.

   j ί h “ 10ã I íj Processo ds acordo com a rei vindicação 9, caracterizado por se obter um polipêptido biológicamente

   - activo análogo de hIL-3, escolhido do grupo que consiste nos mutantes !Í Cys¹⁶ — > Ala¹⁶, Cys¹⁶Cys⁸⁴ Ala¹⁶Ala^S4, r _Glu50 _Lys50, _Lys79 _Siu79.

   H í - ilã I !

   : Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada par se obter um polipêptido biológicamente activo análogo de IL~3 humana que supressão e uma subsÍ! tituíção.

   _ i2ã Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se obter um fragmenta de ADN que contém uma sequência de ADN que codifica o polipêptido de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 16.

   Processo de acordo com a rsivindicação 1, caracterizado por se utilizar um veiculo da clonação que contém a sequência de ADN que codifica qualquer dos polipéptidos de acordo com as reivindicações 3a 16 em combinação com sequências ds regulação de transcrição e

   translação que permitem expressão dos referidos polipêptidos dentro das células hospedeiras apropriadas.

   -- 14ã

   Células hospedeiras transfarmadas com um veículo de clonação de acordo com a reivindicação 13.

   15ã

   Processo para a preparação ds anticorpos monoclonais de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por se obter um anticorpo monoclonal dirigido contra um epitopo situado entre os aminoácidos 29 e 54 de IL--3 humana madura.

   A requerente reivindica as prioridades dos pedidos de patente europeia apresentadas em 14 de Agosto de 1989 e em 14 de Setembro de 1989, sob os números 89202082.7 e 89202331.8, respectivamente.