JPH0420295A - ヒトインターロイキン―３の変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はｘ１■換えＤＮＡ技術によって得られるコロニ
ー刺激因子変異体に関する。特に本発明はインターロイ
キン−３変異体に関する。さらに該変異体は１つ以上の
欠失および、または１つ以上の置換を含む。これらの変
異体の医薬的応用はそれらの特異的レセプター結合性お
よびシグナル誘導性に依存している。

歴史的に造血細胞に影啓する因子は軟寒天培地における
骨髄細胞の増殖および、または分化を測定する検定法で
検出された。この活性を示す因子は集約的にコロニー刺
激因子（ＣＳＦ、エリスロポイエチン）と呼ばれてきた
。最近、部分的には刺激を受ける造血系で分類し得る多
種多様なＣＳＦ、エリスロポイエチンが存在することが
分った。

ヒトおよびマウスの系のこれらのたんばく質にはＧ−Ｃ
ＳＦ、エリスロポイエチンおよびＭ−ＣＳＦ、エリスロ
ポイエチンが含まれる。これらのたんばく質は各々中好
性顆粒球およびマクロファージのコロニーのインビトロ
での生成を刺激する。インターロイキン−２（ｕＩＬ−
２″）は活性Ｔ細胞および活性Ｂ細胞の両方の増殖を刺
激するがコロニー刺激因子とは考えられていない。

ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポイエチンおよびインターロイ
キン−３（“ＩＬ−３”、また“マルチＣＳＦ、エリス
ロポイエチン”としても知られている）はマクロファー
ジおよび酸好性顆粒球の両コロニーの形成を刺激する。

さらにＩ　Ｌ３はマスト、巨核球、および純粋および混
合赤芽球のコロニーの形成を刺激する（Ｄ、メカルフ（
Ｍｅｔｃａｌｆ）、“造血性コロニー刺激因子”　１９
８４、エルセピア版、アムステルダム、およびり、メカ
ルフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）、５ｃｉｅｎｃｅ　２９９　（
１９８５）１６−２２）。

増殖因子誘導の細胞増殖は複雑な過程である。

増殖因子による細胞表面のレセプターへの非常に特異的
な結合につづいて、その複合体はエンドザイ］・−シス
により内部に入り、しばしばそのレセプターのリン酸化
により先行される細胞内応答を誘導するくシブリー（Ｓ
ｉｂｌｅｙ）　、等、Ｃｅ１ｌ　４８（１９８７）９］
１−９２２）。これらの細胞内シグナルは特異的遺伝子
転写を起こし、最終的にＤＮＡ合成および細胞増殖を引
き起こす。

ＣＳＦ、エリスロポイエチンは造血性およびリンパ性幹
細胞由来の細胞レヘルの抑制を回復する治療能力を有す
ることからたいへん興味がもたれている。

ヒトＩＬ−，３（ｈＩＬ−３”）はそのような性質を有
するＣＳＦ、エリスロポイエチンである。成熟ｈｌＬ−
３は１３３個のアミノ酸からなる。このたんばく質は１
個のジスルフィド結合と２個の潜在的グリコジル化部位
を有している（ヤン（Ｙａｎｇ）等、Ｃｅ１１４７　　
（１９８６）　　３−１０）。それはとりわけ次のよう
な活性を有している。

１、形成する細胞が赤芽球、顆粒球、巨核球、顆粒性マ
クロファージおよびこれらの混合物を含むヒト造血性前
駆細胞によるコロニー形成の刺激、 ２、　ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）幼若化によるＤ
ＮＡ合成の刺激。

たんばく質の有用なアゴニスＩ・およびアンタゴニスト
はその分子の構造−機能関係が理解されれば作り得る。

一般にこの関係はアミノ酸の修飾、置換または欠失によ
り研究される。この方法では該たんばく質の活性に対す
る各アミノ酸の重要性に関する情報が得られる。たんば
く質の重要なドメインは活性部位、金属および共因子結
合部位、レセプター結合部位、ザブユニットの相互作用
に関するアミノ酸および抗原決定基である可能性がある
。

たんばく質の一次配列が決定されれば上述の特性を調べ
る種々の操作が応用できる。たとえば他の種に由来する
相同たんばく質の一次構造が入手できればこれらの配列
を整列させてみることが可能である。保存されている配
列は特定のアミノ酸の重要性の指標となることがよくあ
る。

既知のアルゴリズムを用いて二次構造を予測することも
できる。たとえば゛ポツプ（ｔｌｏｐｐ）およびウソズ
（Ｗｏｏｄｓ）、ｐｒＯｃ、　Ｎａｔｌ、Δｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７８　（１９８１）３８２４−３８２
８、ガーニア（Ｇａｒｈｉｅｒ）等、Ｊ、　Ｍｏｌ、　
Ｂｉｏｌ、１２０　（１９７８）　９７１２０、ビオラ
（Ｂｉｏｕ）等、Ｐｒｏｔ、　Ｅｎｇ、　２　　（１９
８８）１８５−１９１、カーメンス（Ｃａｒｍｅｎｅｓ
）等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｂｙｓ、　Ｒｅｓ、
　Ｃｏｍｍｏｎ、±５９　（＋９８９）６８７−６９３
゜ もし相同たんばく質問で種間相同性が高くかつ、それら
のうちの１つのｉＤ構造が分っていればごの構造から重
要なアミノ酸が誘導し得る。

−次および、または空間的構造データを用いて突然変異
誘発実験の推測が可能となる。変異たんばく質の発現お
よび生物学的検定におけるこれら変異たんばく質のテス
１〜は特定のアミノ酸の相対的重要性に関する情報を提
供する。

本発明の目的は、好ましくは上述の操作を用いて、天然
のｒ　ｒ、−，３と同程度か、もしくはそれ以上の医薬
的性質を有するＩ　Ｌ　−３変異体を提供することであ
る。

（関連文献） （ヒトインターロイキン−３） １９８４年マウスＩＩ−〜３をコードするｃ　ＤＮＡク
ローンが単離された（フアツジ（Ｆｕｎｇ）等、Ｎａｔ
ｕｒｅ３０７　（１９８４）２３３−２３７およびヨコ
タ（Ｙｏｋｏｊａ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８　］、　　（１９Ｂ　４．）　１０７０−１
０７４）。このｃＤＮＡはヒｌ−Ｄ　Ｎ　Ａもしくはｃ
ＤＮＡクローンとはハイブリダイズしなかった。したが
ってマウスＩＬ−３（ｍＪＪ、−３）ば対するヒＩ・の
対応部分は存在しないことが推察される。このことはヒ
１−ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポイエチンＯ巾広い活性に
よっても支持された。１９８６年テナガザルのｃＤＮＡ
発現ライブラリーはテナガザ月、ＩＬ−３配列を提供し
た。ひきつづきこの配列はヒトゲノムライブラリーに対
するプローブとして使用された。このことはヒトにおけ
るＴ　Ｌ　−３の存在に関する証拠を提供した（ヤン（
Ｙａｎｇ）等、Ｃｅ１ｌ　　↓７　（１９８６）３１０
）。

一方、ドーザーズ（Ｄｏｒｓｓｅｒｓ）等（Ｇｅｎｅ５
５（１，９８７）１．１５−１２４）は驚くべきことに
ｍ　Ｉ　Ｌ−３にハイブダイズするヒ１ｃＤＮＡライブ
ラリー由来のクローンを発見した。このハイブリダイゼ
ーションはｍＴＬ−３とｈＩＴ−−−３の３′側非コー
ド領域の高いホモロジーによるものであった。

（修正ＣＳＦ、エリスロポイエチン（ＩＬ−３以外））
ムーネン（Ｍｏｏｎｅｎ）等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．
八ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ　ＳΔ８４　　（１９８７）　４４２８−４４３１）
は大腸菌、イースＩ・および動物の細胞を含むいくつか
の組換え源によるヒトＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポイエチ
ンの生産について述べている。イースＩ・および動物細
胞由来の部分精製発現産物を脱グリコジル化の効果につ
いて検定した。Ｎ結合オリゴ糖の除去でその免疫活性は
４〜８倍増加した。この特異的生物学的活性は慢性骨髄
性白血病（ＣＭＬ）およびヒト骨髄検定において２０侑
の増加をみせた。

カラシャンスキー（Ｋａｎｓｈａｎｓｋｙ）等（Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　　ＵＳＡ　　８
　６　　（］　　９　８　９）　　１２１３］、２１７
）は生物学的活性に必要なＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポイ
エチンポリペプチドの領域の決定を試みた。ヒトおよび
マウスのＣＭ−ＣＳＦ、エリスロポイエチンが各々のコ
ロニー形成検定で交叉反応しないのでその方法は種々の
長さのｈ−およびｍＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン
のコード領域を含むハイブリッドＤＮＡ分子の使用に基
づくものであった。

ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポイエチンの２つの領域が造血
機能に重要であるこ七が分った。これらの領域は構造的
に両親媒性ヘリックスおよびジスルフィド結合ループと
い・う特徴を有している。

ゴー（にｏｕｇｈ）等、（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　１６９（１９８７）３５３−３５８）はマ、ウ
スＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポイエチンの内部欠失変異体
について述べた。これらの変異体のいずれも生物学的活
性を示さないことが報告された。

クガ（Ｋｕｇａ）等（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、１５９　（１，９８９）　１０３　１１
１）はヒＩ−Ｇ　−ＣＳ　Ｆの突然変異誘発について報
告した。

その結果は内部またはＣ末端領域に変異をもつほとんど
の発現産物はｈＧ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン活性を
有さないことを示した。一方、全部で１７４個のアミノ
酸のうち、４．５．７、または１１個のアミノ酸を欠く
Ｎ末端欠失変異体は活性を保持していた。Ｎ末端アミノ
酸変異体のうちのいくつかは活性の増加を示した。

ヒトインターロイキン−１（ＴＬ−１）の欠失変異体は
使用可能なエンドヌクレアーゼ制限部位および真核細胞
中ての発現を用いて作られる。このポリペプチドのカル
ボキシル末端３分の１は（６３個のアミノ酸）活性部位
を含んでいる（−ン４−）　（Ｍａｋｉｎｏ）　等、Ｐ
ｒｏｃ、、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ８４．（１９８７）７８４ｉ７８４５）。

Ｉ　Ｌ−１αおよび＋　１．−１βに関する最近の研究
は各々１４０個および１４７個のアミノ酸が（計１５３
個のアミノ酸の・うち）完全な生物学的活性に必要であ
ることを示した（モスレー（Ｍｏｓｌ、ｅｙ）等、Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、Δｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ
　８４　　（１９８７）４５７２　４５７６）。両末端
における単一のアミノ酸変化は有意な生物学的活性の減
少を引き起こす。しかしｌ　１．、、−１のレセプター
結合ドメインに関する詳細な情報はこれらの研究から得
られていない。

ヒトインターロイキン−２の活性は両ＣｙｓＳ［ｌおよ
びＣｙｓ１０５の除去により著しく聞書されることが示
されたが、３番目のＣｙｓ残基の欠失はなんの影をも示
さなかった（ワン（Ｗａｇ）等、５ｃｉｅｎｃｅｌユ４
　（１９８４，）］、４．３１−１４３３；コーエン（
にｏｈｅｎ）等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４　　（］　９
８６）３．１．９−３５２）、このたんばく質のへリソ
クス構造を乱す全ての置換はその生物学的活性に有意に
減少することが分った。Ｉ　Ｌ−２の潜在的レセプター
結合部位はアミノ酸７残基長のペプチドに割りふられた
。この領域の各アミノ酸置換は著しい影響を与えた（コ
ーエン（Ｃｏｂｅｎ）等、」−述；ズラウスギー（Ｚｕ
ｒａｗｓｋｉ）およびズラウスキー（Ｚｕｒａｗｓｋｉ
）　、ＥＭＢＯＪ、　７　　（１９８８）１０６＋−１
０６９）。さらに変異分析はＩ　Ｌ２の種々のドメイン
がＩＬ−２レセプタ一複合体の高および低アフィニティ
ー結合に関係しているごとを明らかにした（ロブ（Ｒｏ
ｂｈ）等、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、ＵＳＡ８　５　
　　（１９８Ｂ）　　５　６　５４、−５６５８．コリ
ンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）等、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５　　（１
９８８）　　７７０９−７７１３＞。

一般にＣＳＦ、エリスロポイエチンの修正はこれらの分
子の生物学的活性に著しい変化を起こずと結論づげられ
る。たとえばヒｌ−Ｇ　−ＣＳ　Ｆは内部またはＣ末端
変異の導入後その活性を失う。ヒ）　Ｇ　−ＣＳ　Ｆの
Ｎ末端における１１個までのアミノ酸の欠失（１７４個
のアミノ酸中）はその活性に著しい影響を与えない。こ
のことば完全な活性を維持するのに１５３個のアミノ酸
中少なくとも１４０個のアミノ酸を必要とするＩ　Ｌ　
−１と同しレヘルである。明らかにこれらの分子のうら
の１０％以下ならそのアミノ酸を失い得る。

（修正■Ｌ−３） クラークルイス（Ｃ１ａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ）等（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２３１　　（１９８（ｉ）１３ｍ−１３９）は
合成マウスｌ　Ｌ−３類似体の機能分析を行った。彼等
は完全な分子の安定な三次構造が完全な生物学的活性に
必要であると結論した。ジスルフィド結合の役割りに関
する研究は４個のＣｙｓ残基のうちの２個の八１ａによ
る置換（Ｃｙｓ７９、Ｃｙｓ”’−Ａｌａ７９Δ１ａ１
４Ｑ）は活性の増加を起こすことを示した（クラークル
イス（Ｃ１，１１（−Ｌｅｗｉｓ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ８５　（１９８８）７
８９７７９０１）。

ｈｌＬ−３の修正について提唱された文献は少ない。ｈ
　Ｉ　Ｌ−３について実際に行った修正の文献はさらに
少ない。国際特許出願（ＰＣＴ）Ｗ２Ｏ８１００５９Ｂ
は“天然の゛５ｅｒ２７−ｒ’ｒｏ２７置換を公開した
。（ｗｏ　　８８１００５９８におけるアミノ酸の番号
は１９個のアミノ酸からなる単一ペプチドを含むことに
注意せよ〕。さらにジスルフィド結合を切断するＣｙｓ
のＳｅｒによる置換およびグルコシル化部位、Ａｓｎ”
Ｃｙｓ３５Ｓｅｒ”およびＡｓｎ”Ａｌａ９°Ｓｅｒ”
　における１個以上のアミノ酸の置換への示唆が与えら
れている。

ＥＰ−Ａ−０２７５５９８（Ｗｏ　　８８１０４６９］
、）はＡｌａ’が欠失しても生物学的活性が保持される
ことを示している。いくつかの変異ｈ　Ｉ　１．、−３
配列が提供されている。たとえば２個の２重変異体Ａｌ
ａ’−十へｓｐ’、、　Ｔｒｐ＋３−”Ａｒｇ”’　　
　（ｐ　　ＧＢ／　　Ｉ　　＋−−３０２）および八ｌ
ａ’−＾ｓ　ｐ　＋、Ｍｅｔ３−Ｔｈｒ３（ｐ　Ｇ　Ｂ
　／　Ｉ　ＬａＯ２）および１個の３重変異体八Ｉａ’
−＝Ａｓｐ’、Ｌｅｕ　９−　Ｐｒｏ　９、Ｔｒｐ１３
＝Ａｒｇ１３（ｐ　Ｇ　Ｂ　／　Ｉ　Ｔ−３０３）〔成
Ｗまたんばく質の第１アミノ酸から始まる番号何番用。

Ｗ　Ｏ８８／　０５４６９は先に述べた脱グリコジル化
変異体がどのようにして得られ、かつＡ　ｒ　ｇ　５４
Ａｒｇ”およびＡｒｇＩＯＲＡ、ｇＩ０９Ｌｙｓ１１０
の変異体がどのようにして得られたか３ａＣべている（
ＥＰ＝Ａ０２７５５９８と同じ番号付けに変換しである
）。後者はザヮカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈｏ
ｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現の
際のＫＥＸプロテアゼによるたんばく質分解の回避が示
唆される。

変Ｗしたたんばく質は公開されていない。前後関係から
イース［・における発現にはグリコジル化およびＫＥＸ
２プロテアーゼ活性のみが重要である。

最後にＥ　Ｐ−Ａ−０２８２１８５は構造的かつ抗原的
に中立な種々の変異体について述べている。これを行う
ため、一連の同意語的アミノ酸置換が示唆された。提案
されたアミノ酸置換ばＩ　Ｌ−３分子の構造および荷電
分布を変化させないことを目的とした。実際に行った変
異ばＭｅｔ２−＋Ｉ］ｅ２および１１ｃｌｌ＋−１，ｅ
ｕ１３１のみである。企まれた中立性が得られたかどう
かは公開されていない。

ｈ　Ｉ　１．、−３に関するさらに広範な突然変異誘発
実験は今日まで公開されていない。

本発明は２つの新しいクラスの医薬的に興味ある化合物
すなわちｈＩＩ、−３の欠失変異体および置換変異体を
提供しており、これらばｈＴＬ−３と同等の生物学的活
性を有し、またある場合にはアンタゴニスト的性質を有
する。

本発明の１つの特徴は少なくとも２個のアミノ酸欠失を
有するインターロイキン−３の生物学的に活性なポリペ
ブチＩ”　Ｊｆｉ似体（以後“ｈ　Ｉ　Ｌ　−３変異体
”または“変異体゛とも呼ぶ）を提供することである。

好ましい変異体はＮ末端（アミノ酸１〜１４）および、
またはＣ末端（アミノ酸１２０〜１３０および、または
１３０〜１３３）に１つ以上の欠失を有するものである
。

本発明のもう１つの特徴は以下の置換のうちの少なくと
も１つを有するｈ　Ｔ　Ｌ　−３の置換変異体を公開す
ることである。

八ｓｐ”　　Ｇｌｕ２２ 八５ｐ３６ Ｇｌｕ”　　Ａｓｐ” Ａｒ　ｇ　Ｓ　４　　八ｒ　ｇ５　Ｓ へｓ　ｐ　４６ Ｇｌｕ５゜ Ｇｌｕ”９ Ｇ　Ｉ　１１５９ Ａｒ、６３　　八１ａ６４ １ｕ７５ １、、ｙｓ７９ Ａｒ、、９４ １１；ｓ’Ｉｎ　　１．ｙ、、ＩＱＱＡｓｐｌｏｌＧｌ
ｕ”６ へｒｇｌＯ８ＡｒＩＸ＋０９１．ｙｓ目０Ｐｈｅ　”　
’Ｔｙｒ にｙｓＩ　６ Ｃｙ　ｓ　ｆｌ　４ Ｃｙｓ”　　Ｃｙｓ” Ｈ，ｙｓ２１　　八ｒ　ｇ　２２ Ａｒｇ：＋６ Ｉ、ｙｓ４１　八ｒｇ４４ Ｇｌｕ”　＾ｓ　ｐ　Ｓ　５ Ｌｙｓ４６　ｏｒ　　　Ａｒｇ” ｌｙｓ”　　ｏｒ　　　ＡｒＩ！” Ｌｙｓ５９　ｏｒ　　　Ａｒｇ５９ Ｇｌｙ”　ｏｒ　　Ｐｒｏ５９ （α−ヘリックス　プレーカー） Ｐｒｏ”　　Ｇａｙ” Ａｒｇ７５　ｏｒ　　　Ｇａｙ７５ Ｇｌｕ” Ｐｒｏ” Ｇｌｕ９８　八５ｐ１００Ｇｌｎ Ｈ，Ｖｓ１０６ Ｇｌｕ”’へｓｐ”９Ｇｌｕ Ａ］　ａＩ　＋　３７　ｈｒ　Ｉ　＋　’へＩａ１６ Ａｌｇ” Ａ　ｌ　ａ　’　”　　八１ａ９４ また本発明の別の特徴はＤＮＡ合成の刺激においてアン
タゴニストにより示されるものより強力なレセプター結
合能を示ずｈｌｌ、−３の置換変異体を公開することで
ある。より特定するとこれらは単一または二重Ｃｙｓ変
異体である。ＣｙｓはＡｈａと置換するのが好ましい（
Ｃｙｓ”　＝ＡＩａ”Ｃｙ　ｓ　Ｉ　６　Ｃｙ　ｓ　８
　’　→Ａ　Ｉ　ａ　Ｉ　ｂへ１ａ１１４　）。アンタ
ボニス１−効果を示す別の変異体はＧｌｕ５０−＋Ｌｙ
ｓ５°およびＬｙｓ７９−＝Ｇ］ｕ７９である。

上述のポリペプチドは適当に修正したＤＮＡ配列の発現
により得られる。これを行うために本発明は適当な発現
ヘクターおよびこれに適合する宿主細胞も提供している
。

また本発明の別の特徴には医薬的に許容し得るキャリヤ
ーとともに上述のｈＴＬ−３の生物学的に活性なペプチ
ド類似体を含む医薬組成物が含まれる。

最後に本発明はアミノ酸２９および５４の間に存在する
エピトープを指向するモノクローナル抗体を公開してい
る。

これらの特徴は以下の詳細な説明でより明確となろう。

本明細書で使用しているヒｌ−Ｉ　ｌ−−３は第１図に
示すアミノ酸（１，−１３３）に対応している。

天然の変異体も含まれている。さらに翻訳後に修正され
た（たとえばグリコジル化）ｈｌＬ−３分子もｌ　１．
、−３で表わされる。化学的または酵素的Ｑこ修正を受
け、それによってもなおその生物学的活性の少なくとも
一部を保持するＩ　Ｌ−３分子は＋１、−３誘導体と呼
ばれる。

本明細書で取り扱われているヒｌ−Ｉ　Ｌ　−３の類似
体は１つ以上の欠失または置換により成熟Ｔ　Ｉ−３と
は異なる配列を有する分子を示している。

さらにヒトＩ　Ｌ−３はヒト造血前駆体細胞によるコロ
ニー形成を刺激する生物学的活性を特徴とする。形成し
たコロニーには赤芽球、顆粒球、巨核球、顆粒球性マク
ロファージおよびこれらの混合物が含まれる。ｈＩＬ−
３の生物学的活性（本発明の目的である）しよさらにシ
グナル誘導とレセプター結合の２つに分けることができ
る。

より良い性質を示すｈｒＬ−３［似体を用いて我々はこ
の類似体が優れたシグナル誘導／レセプター結合比を有
することを示した。どこが優れているかは目的とする性
質に依存している。たとえばアンタゴニストとじてのよ
り高い結合係数もしくは欠失変異体としての等価または
より大きい生物学的活性などである。またより優れてい
るということはそのポリペプチド類似体が凝集し難くい
ことも意味する。

本目的のためのヒｌ−Ｉ　Ｌ　−３類似体の（生物学的
）活性はヒト急性骨髄幼若化細胞によるＤＮＡ合成によ
り測定される。さらに、レセブクー結合アッセイは提供
者の白血球、患者のＡ　Ｍ　Ｌ細胞またはＭＶ４．−１
．１細胞を用いて行なう。

Ｉ　Ｌ　−３はレセプター結合およびシグナル誘導の両
方で活性を示す。もしごれらの活性を特定のアミノ酸配
列（連続または不連続を問わず）に帰着させることがで
きるならこれらの結合およびシグナル誘導活性を分離し
得るであろう。したがって特異的Ｉ　Ｌ−３レセプター
アンタゴニストを生産し得る。

これらの目的を達成する第１ステツプとして、ｈＩＬ−
３の構造−機能関係のしっかりした理解が必要である。

天然の、もしくは天然に変異した＋　Ｌ−３の性質をこ
のたんばく質に多くの変異を導入することにより修正し
得る。このような修正は本明細書で述べている突然変異
誘発技術を用いてうまく導入され、かつその変異した分
子（ｈＴＬ−３ミユーテイン）はここで述べられている
発現ヘクターを用いてうまく合成される。構造−機能関
係を決定するため、とりわけ次に示す突然変異誘発技術
が考えられた。

ａ）　あるアミノ酸の異なる機能を有する等立体的残基
による置換、たとえばＡｓｎによるＡｓｐの置換。これ
は水素結合性は維持されるが荷電が除去される。

ｂ）　あるアミノ酸の機能は等しいが構造が異なる別の
アミノ酸による置換、たとえばＡｓｐによるＧｌｕの置
換（これによるカルボキシル基の移動は約１人となる）
。

Ｃ）　あるアミノ酸の機能の異なる別のアミノ酸による
置換。

ｄ）　ジスルフィド結合の感大または除去。

ｅ　欠失変異体の構築。

ｆ　ヘリックスブレーカ−の導入（たとえばＰｒｏ）。

ｇ　挿入変異体の構築。

ｈ　グリコジル化変異体の生成。

本発明の］つの特徴、は好ましくはレセプターに高結合
定数で結合してこれをブロックし、そうすることにより
シグナル誘導を阻害する特異的アンタゴニストの開発で
ある。

アンタゴニストとはレセプターに結合し、そうするごと
によりアゴニストの結合を阻害する化学物質である。特
に本発明はこのような阻害効果を有するたんばく質を目
標とする。その特徴の１つとして本発明は少なくとも部
分的なアンタゴニスト効果を有するｈｌＬ−３ミユーテ
インを提供している。より特定するとこれらは単一また
は二重Ｃｙｓ変異体である。ＣｙｓはＡｌａで置換され
るのが好ましい（Ｃｙｓｌ′′−八１ａ１６ Ｃｙｓ”　Ｃｙｓ”　→Ａｌｅ”八１ａＩｌｌ　）。ア
ンタコ゛ニスト効果を有する別の変異体にはＧ　Ｉ　ｕ
　５０−・１ｙＳ５（ｌおよびＬ　ｙＳ　”　−Ｇ　ｌ
　ｕ　７９がある。上述の変異体を有効量投与すると生
理的に使用可能なＩ　Ｌ−３の結合を阻害し、それによ
りアンタゴニスト活性が示される。

本発明のもう１つの特徴は、天然のｈ　Ｉ　Ｌ−３分子
よりも好ましくは約３〜約２５％小さいｈ　ｌ　１．、
−３またはｈ　Ｉ　Ｌ　−３様活性を有するたんばく質
を提供することである。さらに実施例で説明されている
ように、特定の欠失を導入するごとに上り分子のどの部
分がレセプター結合およびシグナル誘導に関係している
か決定することができる。

また本発明の別の特徴にはアミノ酸を置換することによ
っても、レセプター結合および、またはシグナル誘導に
重要なアミノ酸を決定し得ることがある。

特に２種類の変異体が作られた。

ａ）　欠失変異体およびｈ）置換変異体。これらの変異
体の絹合せは従来法により容易乙こ入手し得ることが理
解されよう。

事実−Ｉ−完全なコード領域を含む欠失変異体を作った
。ここで使用している欠失とは最小２つの連続（または
分離している）アミノ酸の欠失を示している。４個以と
のアミノ酸が欠失するごとが望ましい。この欠失は分子
上のどのアミノ酸でも開始し得る（Ｃ末端付近を除いて
）。また分子中離れた２個の欠失も可能である（たとえ
ば１個のアミノ酸欠失が２カ所、２個の欠失が２カ所な
ど）。

もっとも好ましい態様の１つではこのたんばく質のＮ末
端で１４個、Ｃ末端で１８個、計３２個のアミノ酸が欠
失している。驚くべきことに発現した欠失変異体たんば
く質全ては特異的Ｉ　Ｌ　−３の生物学的活性を示した
がその活性は非常に減少していた。したがってレセプタ
ーに結合するたんばく買上の単一の連続するペプチドド
メインは存在しないと結論できる。

変異体のうちの４個、アミノ酸１〜１４を欠くＮ末端欠
失変異体、アミノ酸１２０−１３０を欠くＣ末端欠失変
異体、それらの二重変異体およびＣ末端変異体１３０−
１３３は天然ＩＬ−３分子と同等の生物学的および結合
活性を示した。２５個までのアミノ酸（全ｈ　ｌ　Ｔ、
、　−３の約２０％）を失ったｈｆＬ−３がなおその全
活性を維持していることは驚くべきことである。ジスル
フィド結合の形成乙こ関係するＣｙＳＩ６から考えて、
−１５Ｎ末端欠失変異体がその全活性を維持しているこ
とが期待される。１４．Ｎ−末端および１８以下Ｃ末端
アミノ酸を欠いた二重欠失変異体（第４表、ＸおよびＺ
）はなお全活性を保持している。３２個のアミノ酸を欠
いている変異体は天然分子のおよそ２５％を失っている
。この二重変異体は全活性を保持し２ていることから一
１８Ｃ末端変異体も全活性を維持していることが期待さ
れる。

内部欠失のみを有する変異体も作成した。完全に活性を
維持する内部欠失変異体が本発明で示されている。この
変異体はアミノ酸１２０−１３０を欠いている（第４表
、９３９）。もっとそのような変異体を作り得るようだ
。処理の都合上成熟Ｉ　Ｌ　−３たんばく質の最初のい
くつかのアミノ酸を保持しておいた方がよい。−１４Ｎ
末端欠失変異体は完全な活性を保持していることがらＮ
末端領域の内部欠失変異体もそのような活性を保持して
いることが期待される。欠失を導入する別の領域でばＧ
１ｎ２９−Ｌｅｕ３５領域がうまくいっているようだ。

おそら、ＣＬｙ３２８→Ｐｒｏ”置換とともに１〜７個
のアミノ酸の欠失が別の内部欠失変異体を提供する。

ｈＩＬ−３活性が公開された二重変異体またはたんばく
質の一部分（たとえばおよそ２５バーセン１へ）を欠く
別の変異体で保持されているという発見は別の潜在的利
点を有している。ｈＩＬ−３を含む医薬組成物は腹腔内
、静脈または皮下注射で投与し得る。該ポリペプチドを
包み、徐々に該ポリペプチドを放出する生分解ポリマー
からなるハイドロゲルの使用は包み込むペプチド量によ
り制限される。より高い比活性を有するポリペプチドの
欠失変異体を使用することはモル濃度でより多くの活性
物質を一定容積中に包み込め、それにより投与間陥を増
大し、または反復投与を回避できることを意味している
。

置換変異体はＤＮＡレヘルで特定の変異を導入し、その
コードするたんばく質にアミノ酸置換を導入することで
作られる。これらの置換は該たんばく質の構造または活
性に重要な領域に導入される。このような変異の例にば
Ｃｙ、、、＋６およびＣｙｓ８４間に存在するジスルフ
ィド結合に影口する変異がある。これらの各システィン
残基（または両残基）をアラニンで置換することにより
この結合は形成されず活性は大きく減少する。３種全て
の可能な変異体が作られ、それらはレセプター結合アッ
セイにおいて比較的高い結合活性（生物学的活性と比較
して）を示す。相対的生物学的活性に対する相対的結合
活性の比が分ったので（第４表）、公開されたＩ　Ｌ　
−３類似体を組合せて使用するのが望ましい。さらに１
つ以上の欠失および１つ以上の置換の両方を有するポリ
ペプチドを使用するのが望ましい。

ジスルフィド結合の切断は該たんばく質の３Ｄ構造の実
質的変化を起こし、他のアミノ酸置換もこの構造すなわ
ち活性に影響する。

二次構造測定（円二色性）はｈ　Ｉ　Ｉ−−３分子が高
いパーセンテージでα−ヘリックス（２０°Ｃで７０％
）を含んでいることを示している。二次構造予測プログ
ラム（たとえばホップ（Ｈｏｐｒｌ）およびウソズ（Ｗ
ｏｏｄｓ）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＋　八ｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ＋　［ｌ５Ａ７８　（１，９８１）３８２４−３８
２８、ガーニア（Ｇａｒｎｉｅｒ）等１．鳳Ｍｏｌ＋　
Ｂｉｏｌ、　］じ２０　　（１９７８）９７１２０、ビ
オラ（Ｂｉｏｕ）等、Ｐｒｏｔ、　ｌ’ｉｎｇ、　２　
（１９８８）１、８５−　］　９　］、カーメンス（Ｃ
ａｒｍｅｎｅｓ）等、Ｒ４ｏｃｈｅｍ、　Ｒｉｏｐｈｙ
ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ＋　１５９　　（１９８
９）６８７−６９３）はα−ヘリックスが以下のアミノ
酸Ｍｅｔ”　−旧ｓ２６　、に　１ｙ　４２−八ｒ　ｇ
　Ｓ　５Ｌｅｕ５８−Ｇｈｉ”　　、八Ｉａ”　　−Ｌ
ｅｕｏＬｅ［ｌ８７１１ｉｓ９５．、　ｔｉｔｓ９８−
Ｌｅｕ”’およびＨ，ｅｕ１１５−Ａｌａ”’間に存在
することを示唆している。

α−ヘリックス内の荷電分布およびこれらの荷電がレセ
プターとの相互作用に重要な役割を果たすことが考えら
れることから以下の“ヂャージリバー・す′ル゛置換も
本発明の範囲に入る。

八５ｐ２１　　に１ｕ２２　　　　　　　　　−）　　
　　　Ｌｙｓ２１　　Ａｒｇ２２八ｓｐ″′°　　　　
　　　　　　　　　　　→　　　　八ｒ　ｇ　２６Ｇ　
ｌ　１１　”　　八５ｐａｓ　　　　　　　　　　　→
　　　　Ｌｙｓ”’　　八ｒ　ｇ　４４八ｒ　ｒ　５４
　　Ａ　ｒ　ｇ　Ｓ　５→Ｇ　Ｉ　Ｕ　Ｓ　４　　八ｓ
　ｐ　５５Ａｓｐ４６→Ｌｙｓ４６ｏｒ　　Ａｒｇ４６
Ｇｌｕ”　　　　　　　　→Ｌｙｓ５ｏｏｒ　　Ａｒｇ
”Ｇｌｕ５０→Ｌｙｓ５９ｏｒ　　Ａｒｇ５９Ｇｌｕ５
９→Ｇｌｙ５９ｏｒ　　Ｐｒｏ”９（α−ヘリックス　
プレーカー） Δｒ　ｇ　６３　　八１ａＩｔ　４　　　　　　　　−
　　　　ｐ　ｒｏ６３　　に　）　ｙ　６４Ｇｌｕ”　
　　　　　　　　　　　　　　　−）　　　　　Ａｒｇ
７５　ｏｒ　　　Ｇｌｙ７５Ｈ，ｙｓ７９　　　　　　
　　　　　　　　　−４　　　　　Ｇｌｙ７９Δｒｇ”
　　　　　　　　　　　　　　　　　→　　　　Ｐｒｏ
”１１ｉｓ９［＋　Ｌｙｓ”’Ａｓｐ”’　　　−）　
　　　　Ｇｌｕ”　　Ａｓｐ’８０ＧＩｎ’。

Ｇ　ｌ　ｕ　”　６−→Ｉ、　ｙ　ｓ　＋　０６八ｒｇ
ＩＯｆＩＡｒｇＩ０９Ｌｙｓ１１０　　　→　　　　Ｇ
ｌｕ””八５ｐ１０９に４ｕ１１０ｐｈｅＩＩＱｙｒ＋
１４　　　　　　　　　、　　　　　へ１ａｌＩ３Ｔｈ
ｒ■４欠失および置換側変異体はグリコジル化部位の修
正に使用し得る。従って思いどおりに真核宿主細胞中で
グリコジル化または非グリコジル化ポリペプチドを生産
し得る。

エピトープマツピング実験において、レセプター結合に
関するその分子の露出セグメントがどこに存在するかを
決定するために上述の変異体を使用した。これを行うた
め成熟ｈｌＬ−３に対するモノクローナル抗体を調製し
た。つづいてこれらの抗体を変異体たんばく質に対する
ウェスタンブロッティング実験で用いた。最後に１つの
抗原フラグメントが検出し得た。

本発明の新しいｈＩＬ−３変異体は部位指定突然変異誘
発により簡便に調製されるが、当分野で知られている他
の多くの技術もたんばく質を修正するのに用いられる。

微生物をトランスボームし得、目的とするｈｒｌ、、−
３変異体をコードする変異ＤＮＡ配列を発現し得る適当
なヘクターには発現調節領域およびターミネータ−領域
に結合する成μ１ｈＴＬ−３コード配列由来の前記変異
配列を含む発現へクタが含まれる。これらの領域は宿主
細胞として使用される原核性または真核性細胞に依存し
て選ばれる。宿主株としてδコ大腸菌またはバチルス（
Ｂａｃｉ　］　Ｉｕｓ）を使用することが好ましい。し
かし、菌類、イースト細胞および組織培養細胞も使用さ
れる（ＥＰ〜Ａ　−０２７５５９８参照）。

大腸菌用の発現ベクターに０３各々１、ａｃ　Ｚブロモ
−ターを含むｐＧＢ／ＴＬ−３３６およびｐＧＢ／　Ｉ
　Ｌ、　−３３９が含まれ、バチルス用にはα−アミラ
ーゼプロモーターおよびシグナルペプチドを含むｐＧＢ
／■Ｔ−−３２２およびその誘導体が含まれる。バチル
スにおける発現用のその他の適当なベクターには、たと
えばＨｐａ　Ｈブロモ−クー含有ベクターおよびその誘
導体がある。これらのベクターおよびその他のベクター
は全てＥＰ−Ａ０２７５５９８およびＥＰ　Ａ９０２０
０６２４．６　（以下の優先権、１９８９年３月１５日
登録のＥ　Ｐ　Ａ　８９２００６６０．２および１９８
９年７月２５日登録のＩＥＰ八Ｂへ２０１．９６７．０
に基づき１９９０年３月１５日登録された）。

宿主細胞からたんばく質を分泌し得る発現構築物を使用
するのが便利である。これはたとえばバチルス構築物で
行なわれろ。大腸菌で例示される内容物からの単離も可
能である。

発現後前られるポリペプチドの精製は使用される宿主細
胞および発現構築に依存する。一般にｈ　Ｉ　Ｉ−−３
ミユーテインの精製は天然のｈ　Ｉ　Ｔ−３の精製と同
し方法で行ない得る。高精製ｈｌＬ３ミューティンを得
るために以下のヌテ・ノブが用いられる；疎水性相互作
用クロマトグラフィそれにつづくアニオン交換クロマト
グラフィーおよび場合によってはそれにつづくゲル濾過
。またこれらの精製ステップのうちのわずか１つか２つ
を用いるだけで十分である（ｈＩＬ−３、発明の詳細な
説明は以下の優先権；　１９８９年３月１５日登録のＥ
　Ｐ　Ａ３９２００６６０．２および１９８９年７月２
５日登録のＥＰ　Ａ３９２０１９６７．０に基づく、１
９９０年３月１５日登録のＥ　Ｐ　Ａ　９０２００６２
４．６に公開されている）。

簡単に云うと、第１ステツプとして大腸菌中での発現後
該たんばく質を含む内容物を単離する。

８Ｍ尿素中での超音波処理後このたんばく質をさらにア
ニオン交換クロマトグラフィーで精製する。

尿素の除去後、濾過除菌によりたんばく質を入手し、ひ
きつづき生物学的および生化学的特性を調べた。

ポリペプチドの分泌を伴う宿主株としてバチルスを使用
すると疎水相互作用およびアニオン交換クロマトグラフ
ィー後に非常に純粋なポリペプチドが得られる。さらに
荷電が変化した変異体が異なる物理的性質を示し、特に
実施例で使用したものとは異なる溶出条件やカラム物質
を必要とすることは明らかである。

精製したミューティンは医薬的に許容し得る無毒キャリ
ヤーと合せて医薬組成物に成型することができる。先に
述べたようにこのような組成物は特に溶液またはサスペ
ンションの形で非経口（皮下、筋肉または静脈）投与用
に調製される。この組成物は単一投与型で投与するのが
便利であり、たとえば１９７０年、Ｐａ、イースト細胞
、マソク出版社“レミントン医薬科学パに述べられてい
る医薬技術分野知られている方法で調製することができ
る。非経口投与用の成型には一般的賦型剤、無菌水また
は生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアル
キレングリコール、植物油、ハロゲン化ナフタレン類な
どが使用される。

本発明の物質は医薬中唯−の活性成分として用いられる
ことも、他の活性成分と合せて使われることもある。別
の活性成分はたとえば適当なヘマＩ・ボイエチン、ＣＳ
Ｆ、エリスロポイエチンおよびインターロイキンから選
択し得る。これらにはＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポイエチ
ン、、ＣＳＦ、エリスロポイエチン１、Ｇ−ＣＳＦ、エ
リスロポイエチン、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン、
エリスロボイエチン、ＴＩ、−１α、Ｔ　Ｉ−−１β、
Ｔ　Ｌ　−２、Ｉ　Ｌ４〜Ｉ　Ｌ　−８および腫瘍壊死
因子が含まれる。

本発明のｈ　Ｉ　Ｌ　−３類似体の生物学的活性および
能力を検定するには多くのテストが使用可能である。た
とえばたんばく質がヒト造血前駆細胞によるコロニー形
成を刺激するかどうかを見るための当分野でよく知られ
ている技術を用いこの’Ｒ４Ｑ１体をテストし得る。形
成したコロニーには赤芽球、顆粒球および顆粒球性マク
ロファージが含まれる。

それとは別にヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）幼若化に
よるＤＮＡ合成を刺激する本類似体の能力は標識化デミ
ジン取込みなどで示されるように活性の指標として用い
られる。

本発明で提供されるヒｌ−Ｉ　Ｌ−３の生物学的に活性
なポリペプチド類似体は治療と診断の両方に使用し得る
。治療的使用には悪性および非悪性の病気の治療および
予防が含まれる。提供される変異体の特性によりその応
用が改善された。

その用途には、 感染による血球減少症および、または免疫抑制化学療法
および、または照射による血球減少症、骨折および骨多
孔症などの骨の障害 −静的麻酔操作による免疫不全、 骨髄移植後の回復 感染の予防や（ｊ随する治療の補助 本発明を以下の非制限的実施例で説明する。

実施例　１ （発現ヘクターの構築） （ｐＧＢ／ＩＬ−３３６の構築） 成熟ヒｌ−Ｔ　Ｌ　−３に非常に似たポリペプチドを生
成するため、５′側非翻訳配列およびシグナルペプチド
コード配列を欠く構築物を作った。

ｐ　Ｌ　Ｈ１のｒＬ−３ｃＤＮＡ挿入物（ＥＰ−Ａ０２
７５５９８参照）をｌｌ１ｎｃｌＴおよびｌ１ｉｎｄｎ
［で切断し、成熟ＩＬ−３のＮ末端１４アミノ酸を含む
合成オリゴヌクレオチド（Ｓａｉ　　Ｉ−突出／平滑、
４１９／４２０、第１表）にライゲーションし、Ｓａｌ
　　１１１ｉｎｄｌＩ［消化ｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシ
ア社）に挿入した。配列の確認役完全な挿入物をたんば
く質生産用のｐＵＣ８に移行しプラスミドｐＧＢ／Ｔ　
Ｌ　−３３５を作った。直接的シーケンシングおよび突
然変異誘発を行なうため、ｆ１複製オリジンをもつプラ
スミドｒｌＴＺ１８ＲのＰｖｕ　　ＩフラグメンＩ・を
ｐｕｃｓの相当するＰｖｕ　　Ｉフラグメントとの置換
に用いた。この細菌用発現プラスミドｐ　Ｇ　Ｂ　／　
Ｉ　Ｌ　−３３６ば分子量１６．３８４ダルトンと計算
される１４５個のアミノ酸からなる融合たんばく質を生
ずる（第１図）。

（ｒ＋ＧＢ／＋Ｌ−３３９の構築） 潜在的に興味ある変異体をハヂルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）発現ヘクターに効率的に移行させるために別の発現プ
ラスミドを構築したく以下参照）。この目的のためｐ　
ＧＢ／　　Ｉ　Ｌ　−３３６をＨｐａ　　Ｔおよびｌ１
ｉｎｄｌｌｌで消化し■Ｌ−３０ＤＮＡの３′末端部分
のほとんどを除去した。突出末端を平滑化し、つづいて
対応するＩ　Ｌ−３配列（ｎｔｌ　３７−４９７）およ
びプラスミドｐ　Ｇ　Ｂ　／　Ｉ　Ｌ−３３７由来のＢ
、リチェニホルミス（Ｉ　ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）
アルファアミラーゼターミネーターを含む平滑末端フラ
グメントをそれにライゲーションし、プラスミドｐＧＢ
／ＩＬ−３３８を作った。ｐＧＢ／ＩＬ３３７は合成オ
リゴヌクレオチドを用い、ｃＤＮＡ中のＩ　Ｌ−３停止
コドンとアルファーアミラーゼターミネータ−との間の
アルファ−アミラーセ構造配列と３′非コードＩＬ−３
ｃＤＮＡのループアウトによりｐＧ１３／■Ｌ−３２４
（参考として本明細書で引用しているヨーロッパ特許出
願ｍ　８９２０１９６７０に公開されている）から構築
した（第１表、９４４参照）。またこのオリゴヌクレオ
チドはＩＬ−３停止コドンの直く下流にＸｈ。

■部位を導入する。プラスミドｐＧＢ／ＩＬ３３８をＢ
ａｍ　ＨＩおよびＨｉｎｃ　ＩＩで消化し、ポリリンカ
ーの一部および５′末端Ｉ　Ｌ　−３配列をリン酸化合
成オリゴヌクレオチド１０５５／１０５６　（第１表）
で置換しプラスミドｐＧＢ／＋　Ｌ−３３９を生成した
。したがってわずかに修正した異質シグナルペプチドコ
ード配列をもつＩ　Ｌ　−３遺伝子が再構築された。こ
こで分子量１６５４１ダルトンと計算される１４８ａａ
からなる融合たんばく質が合成された（第２図）。ｐＧ
Ｂ／ＩＬ、−３３９のＤＮＡ配列を確認しこれが正しい
ことが分った。発現した融合たんばく質の生物学的活性
は変化していないことが分った。

別の大腸菌発現ヘクターｐＧＢ／ｌ１−−３４０を構築
した。そのｆｆａｃＺプロモーターは下流にアミラーゼ
ターミネータ−をもつ成熟ＩＬ−３と精密に融合するバ
チルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファーアミラーゼシグ
ナルペプチドをコードする配列の直前に位置している。

またバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現ヘクターの構築
用の中間体としても使用されるこのプラスミドは先に述
べた全ての配列を含むｐ　Ｃ；　＋３　／　ｌ　Ｌ　−
３３７由来のＮｄｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントをＮｄｅ
Ｉ−Ｋｐｎ■切断大腸菌ヘクターｐＴＺ１８ＲＮに導入
することにより構築した。

ｐＴＺＩ８ＲＮは１ｆａｃＺＡＴＺ開始コドンの直く上
流をオリゴヌクレオチド７３１　（第１表参照）を用い
Ｎｄｅ　　Ｔ部位が導入されたｐＴＺ１８Ｒ（ファルマ
シア）である。ｐＧＢ／Ｔ　Ｌ−３４０は大腸菌におい
てｌ　Ｌ　−３を非常に大量に生産する。

（実施例　２） （欠失および置換変異体の構築） キュンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）等（１９８７）　、Ｍｅｔ
ｈＥｎｚｙｍｏｌ、　１５４　３６７−３８２　）によ
り開発された操作に従かい合成オリゴヌクレオチド（第
１表および第２表）を用いてインビトロ突然変異誘発を
行った。大腸菌ＣＪ２３６　（バイオラド社）へのｐＧ
Ｂ／ＩＬ−３３６またはｐ　Ｇ　Ｂ　／　Ｔ　Ｌ〜３３
９ＤＮＡのトランスホーメーションおよびＭ１３ＫＯ７
（ファルマシア）へルバーファージヲ用いたスーパーイ
ンフェクションにより一本鎖テンブレー）　Ｄ　Ｎ　Ａ
を調製した。標準法に従かいファージＤＮＡを調製し、
０．６％低融点アガロースによる分画でヘルパーファー
ジ５ｓＤＮＡを除去した。切り出したバンドを融解しフ
ェノールで抽出した。ブタノール？農縮およびエタノー
ル沈殿によりｐＧＢ／ｌｌ−−３３６またはｐＧＢ／Ｉ
Ｌ３３９ｓｓＤＮＡを回収し、シーケンシング反応にお
けるブライマー依存ＤＮＡ合成をテストした。

精製したｐＧＢ／ＩＬ−３３６またはｐＧＢ／Ｉ　Ｌ　
−３３９ｓｓＤＮＡ　（±１０１００ｎを６５℃でリン
酸化したプライマー２０ｎｇとアニールし、ゆっくり室
温まで冷却した。相補鎖の合成は１〜２μｇの遺伝子３
またんばく質、４ユニ、７　）のＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼおよび２．５ユニツトのＴ０ｎ　Ｎ　Ａ　Ｕガーゼを
用いて行った。反応は０°Ｃ１５分間、２０°Ｃ２１０
分間および３７℃、９０分間で行った。完結後、反応混
合物の３分の１を融解したコンピテント（ハナハン（Ｈ
ａｎａｈａｎ）、Ｄ。

（１，９８５）　　“ＤＮＡクローニング”　　（Ｄ、
　Ｍ。

グローバー　（Ｇｌｏｖｅｒ）　編）　、第１巻、Ｔ　
ＲＩ−プレス版、ワシントン）ＪＭｌ、０９細胞と混合
し、ブレーティングした。個々にピンクアンプしたコロ
ニーを液体培地への接種に用い、その細胞にＭｌ　３Ｋ
Ｏ７ヘルバーフアージをスーパーインフェクトシて５ｓ
ＤＮＡを生成させた。このクローンの配列をＭ１３リバ
ースシーケンシングプライマと２個のＴ　Ｌ−３配列特
異的プライマー（第１表、８２３；ｎｔ１１８〜１３７
および８２４；ｎｔ２６ｍ−２８０）を用いて確めた。

重システィン変異体（９０４５）を変異体Ｉ　Ｌ　−３
遺伝子９０４および９０５を持つプラスミドの対応する
Ｂｓｔ　Ｂ　Ｉ−ＢａｍＨＴフラグメントのライゲーシ
ョンにより構築した。同様に組合せ変異体ＸおよびＺは
５′欠失を含むフラグメンＩ〜と３′欠失を含むフラグ
メントのライゲーションにより構築した。生成したり１
コーンは制限酵素分析および配列分析でチエツクした。

変異体９３２９はＨｐａ　　ＩおよびＢａｍ　ＨＩ消化
およびオリゴヌクレオチド］、　４２４．　／　１４２
５とのライゲーションにより９３９から誘導した。クロ
ンをまず１ｌｐａ　　１部位の消失で確認し、ついで正
しいＤＮＡ配列を確認した。

全てのｌ・ランスポーマントからプラスミドＤＮＡを単
離し、親ＩＬ〜３構築物の潜在的混入を排除するためＪ
ＭＩ０９細胞へ２回のトランスホーメーションを行った
。配列の確認後これらのクローンをたんばく質生産に使
用した。

ここで述べているいくつかの変異体（ａ１１，９３３お
よび９３２９）をｐＧＢ／ＩＬ−３４，０に導入した。

これはｐＧＢ／Ｔｌ−−３３９由来の変異体のＰｓｔ　
　Ｔ　−Ｘｈｏ　　ＴフラグメンＩ・をＰｓｔ　　Ｉ　
−Ｘｈｏ　　１切断ｐＧＢ／ＩＬ−３４０にライゲーシ
ョンすることによって行った。これによりプラスミドｐ
ＧＢ／ＴＬ−３４０／８１１、ｐ　Ｇ　Ｂ　／　Ｔ　Ｔ
−３４０／９３３およびｐ　Ｇ　Ｂ　／　Ｉ　Ｔ−−３
４０／９３２９ができた。Ｉ　Ｌ　−３ミユーテイン用
のハチルス（Ｂａｃｉ　ｌ　１ｕｓ）発現ヘククーはｐ
　Ｇ　Ｂ　／　Ｔ　Ｔ−。

３２２Ｉ’ｓｔ　　Ｉ−ｔｌｉｎｄＩＩｌフラグメント
（アルファアミラーゼシグナルペプチドの一部、完全な
成！２！！ＩＬ−３ｃＤＮＡ配列およびアミラーゼター
ミネータ−を含む）をｐＧＢ／ＩＬ−３４０変異体誘導
体のＰｓｔ　　Ｔ−１１ｉｎｄｌＩＩフラグメン１〜（
アルファアミラーゼシグナルペプチ１ξ、変異体ＩＬ−
３ｃ　ｌ）　Ｎ　Ａ配列およびアルファアミラーゼクー
ミネーターを含む）と交換することにより構築した。

ミューティン８１１．９３３および９３２９用のバチル
ス（Ｒａｃｉｌｌｕｓ）発現ヘクターを各々ｐＧＢ／Ｉ
Ｌ−３２２／８１１、ｐＧＢ／ＩＩ−−−３２２／９３
３およびｐ　Ｇ　Ｂ　／　Ｉ　１．−−−３２２　／　
９３２９と命名した。

他の変異体（アミノ酸１３０〜１３３を欠く１４５５）
はオリゴヌクレオチド１４５５　　（第１表）を用いた
ループアウト突然変異誘発によりｐＧＢ／ＩＬ−３４０
で直接構築し、プラスミドｐ　Ｇ　Ｂ　／　Ｉ　Ｉ−−
３４０／　１４５５と命名した。つづいて、この変異体
配列を変異体８１１．９３３および９３２９について述
べた方法と同様にｐ　Ｇ　Ｂ　／　Ｉ　Ｌ　−３２２に
移行し、プラスミドｐＧＢ／ＩＩ−−−３４１を作った
。

第 ］ 表 突然変異誘発オリゴヌクレオチド ＣＣＴＴＧＭＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＡＡＣＣＣＡ
ＧＣＴＴＧＴＣＴＴＣＭ　　　　　　　　　　　　　　
　　ＴＧＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＡＡＡＣＡＣＡＴＡＴＧ
ＡＣＣＡＴＧＡＴＴＴＧＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＴＣＴＴ
ＴＴＧＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧ
ＧＡＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＧ
ＧＣＴＣＣＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴ
ＴＧＭＧ−１４２４ＧＡＴＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣ
ＧＧＣＧ１４２５　　　ＣＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧ
ＡＧ１４５５　　　ＣＴＣＡＡＣＡＧＡＣＧＡＣＴＴＴ
ＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡ
ＧはＩＬ ３Ｉｆｉ伝子にちける欠失に隣り合うヌクレメチドを示
している。

第 表 置換突然変異誘発用のオリゴヌクレオチド（実施例　３
） （大腸菌またはバチルスからのＩＬ−３ミユーテインの
精製） 大腸菌ＪＭ１０９培養物（１００）に（変異体）ＩＬ−
３クローンの新鮮な一晩培養物０，５を接種し５５［］
ｎｍにおけるＯＤ値が０．４〜０．６に到達するまで３
７°Ｃで増殖した。プラスミド指定たんばく質の合成は
１ｍＭのＩＰＴＧ（ファルマシア社）の添加で誘導した
。さらに３〜１６時間培養したのち、遠心によって細胞
を収集し、凍結保存した。

１０　のＴＢ（１０ｍＭ）リス−ＨＣＡ、ｐＨ８：１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ）に細菌を懸濁し、さらにリゾチーｌ、
（０，０２５％−５００１！ｇ／）を加えた。

室’／ＦＡで３０分間インキュベーションした後、Ｍｇ
（１２とＤＮａｓｅを各々最終濃度１０ｍＭおよび２０
μｇ／　となるように添加した。３７°Ｃで１５分間イ
ンキュベーションした後、トライーン２０　（０，２％
）　、ＤＴＴ　（２ｍＭ）およびＰＭＳＦ（０，１ｍＭ
）を添加した。このサスペンションを氷上で冷却してか
ら激しく超音波処理した（３５秒２回）。このホモジネ
ートを４℃の遠心（ヘンクマンＪ　Ｓ　１３．１０−タ
ー、］、００００　ｒｐｍ　、１５０００Ｘｇ、３０分
間）により清澄化し、上清を廃棄した。

超音波を用いてこのペレットをバッファＴＰＤ（５０ｍ
Ｍｌ−リス−ＨＣβ、ｐＨ８；　０．１　ｍＭＰＭＳＦ
および２　ｍ　Ｍ　　Ｄ　Ｔ　Ｔ　）中５５％スクロー
ス溶液４Ｇご再懸濁し、生物学的活性の直接検定用にベ
レット化し尿素中で可溶化するか、またはＷｏ　　８８
１００５９８で述べられているように不連続スクロース
勾配（ＴＰＤバッファ中７中筋５％び６０％スクロース
各２　）上に重層した。

２５°ｃ、　２００，０００　ｘ　ｇ　（ツルパルＴＨ
６４１１：ｌ−ターで３５００Ｏｒｐｍ）　、２時間の
遠心後、ＩＬ−３たんばく質を含む内容物を７５％スク
ロース層から回収した。

少なくとも４倍希釈後、２５０００Ｘ　ｇ　（ヘソクマ
ン、Ｊ　Ｓ　１．３．１．　＋コーター１３００Ｏｒｐ
ｍ　、３０分間）でベレット化し、５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｆｆ　、　ｐｌ＋８．’９、および２ｍＭ　　ＤＴＴ
を含む８Ｍ尿素溶液５　中で超音波処理し、−晩４°Ｃ
で放置した。つづいてそのｆｑ澄化溶液を８Ｍ尿素、５
　ｍ　Ｍ　ｔ・リスＨ（１！ｐｌ＋８．９および１ｍＭ
　ＤＴＴハソファで平衡化した３　のＤＢＡＥ−セファ
ロースファーストフローカラム（ファルマシア社）に通
した。

ｌ　Ｌ　−３たん白質はごのカラムに結合するので同バ
ッファ中７５ｍＭ　　ＮａＣ６で段階的に溶出した。

溶出たんばく質を数部の１０ｍＭトリス−ＨＣβｐＨ８
，０および１ｍＭ　　ＤＴＴバッファに対して透析し、
１％ウシ血清アルブミンを含む１０倍濃度のＲＰＭ＋細
胞培養培地を添加して等張化した。

このフィルター除菌溶液を生化学的、および生物学的特
性を調べるのに用いた。

バチルス（Ｂａｃ　ｉ　ｌ　Ｉ　ｕｓ）から生産された
変異体たんぽ（質８１１．９３３．１４５５．９３２９
、ＸおよびＺは培養培地中に放出されたが住物学的活性
をテストするのにこのような精製操作は必要としなかっ
た。それゆえ、清澄化上清（１リツトル）（５ｍＭ　　
ＥＤＴＡ、１ｍＭ　　ＰＭＳＦおよび１Ｍ硫酸アンモニ
ウムに調整）を１０ｍＭ）リス−ＨＣ７！　（ｐＨ７，
０）ハソファ中１Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化した１５
〜２０　のフラクトゲル”Ｉ”　ＳＫブチル６５０（Ｃ
）カラム（メルク社製）に通した。結合したＩ　Ｌ　−
３たんばく質を１０ｍＭトリス−Ｈ（１２ハソフアで？
岩田し、つづいて］、００ｍＭ１リス−ＨＣＥ　　（ｐ
Ｈ８，０＞　バッファで平衡化した１、５　のＤＥＡＥ
−セファロースファーストフローカラムに通した。流出
物を集め、７０％硫酸アンモニウムとなるように調整し
てＩＬ３たんばく質を濃縮した。沈殴を１００００　ｒ
ｐｍ（ＪＳ−１３０−ター）での遠心により集め、溶解
２１ｔ　１．０　ｍ　Ｍ　）リス−ＨＣｎ　　（ｐＨ８
，０）　、１ｍＭＤＴＴバッファに対して透析した。

元の細菌培養物２５〜１００μβに相当するサンプルを
０．７５Ｘ７５Ｘ１００ｍｍ（バイオラド、ミニプロテ
ーンｎ）］、３３．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ルアクリル／ビスアクリル−２９／１）で分析した。た
んばく質はコマージブリリアントブルＧ２５０染色また
は免疫学的方法により観測した。第４図は大腸菌で発現
した精製ミューティンの例である。

変異体ｐＧＢ／ＩＬ−３３９由来のＩＬ−３たんぽ（質
の大腸菌における発現は一般にｐＧＢ／ＩＬ−３１６発
現ベクター由来の同変異体よりも多い。使用した精製操
作は完全に純粋なｒＬ−３たんばく質を調製するよう考
えられてはいない。

一般にＳＤＳゲルで若干高分子側の混入物が観察された
。染色したＳＤＳゲルのデンシトメータースキャンニン
グを用いＩＬ−３たんぽ（質の量を測定した。場合によ
っては透析後相当のたんばく質の損失があるが、一般に
全回収量は“精製”ＩＬ−３たんば←質０．１〜１■で
あった。例外は変異体８１１および９３３であり、これ
らはいずれの大腸菌発現ヘクターでも融合たんばく質の
生産は起こらなかった。ノーザン分析はＩ　Ｌ　−３特
異的ＲＮＡが大腸菌において大きく減少していることを
示した一方、プラスミドＤＮＡ含量に有意の差は観察さ
れなかった。この結果はおそらく真核性ＩＬ−３ｃＤＮ
Ａ配列中に導入された欠失によりｒｒ＋ＲＩＡの安定性
が減少したことを示している。

ミューティン８１１および９３３合成の簡便な方法はバ
チルスリチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓ）における発現である。生産されるた
んばく質量は９３２９や１４５５など他のミューティン
を合成するバチルス（Ｒａｃｉｌｌｕｓ）　株により生
産されるたんばく質量と比較して非常乙こ少ないがここ
で述べている生物学的アッセイを行なうのに十分な量の
ミューティン８１１および９３３を部分的に精製するに
は十分である。

（実施例　４） （Ｉ　Ｌ　−３ミユーテインの免疫学的特徴）ポリクロ
ーナルおよびモノクローナル抗血清の調製法はｗｏ　　
８８１０４６９１に説明されている。

Ｉ＋、−３ミ１−ティンの免疫学的検出のためゲル分画
化たんばく質（実施例３参照）は連続的バッファシステ
ム（３９ｍＭグリシン、４８ｍＭトリス、０．０３７５
％５ＤＳａｎｄ２０％メクノル）を用いたセミトライブ
ロッティングシステム（ツバプロット、ファルマシア／
ＬＫＢ）　　（１，２ｍＡ／ｃＩＡ、　９０ｍ１ｎ　）
によりニトロセルロース（０，２μｒｎ、シュレイチャ
ーアンドシュニル社Ｂ△８３）に（多行させた。つづい
てこのニトロセルロースフィルターを空気乾燥し、３％
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ社）溶液＜１０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，６；　３５０　ｒｎ’ｖＩ
　　ＮａＣ１１！；０．１％ＰＭＳＦおよびＯ，１％ア
ジ化す１〜リウム）中で前処理した後、ＲＩＡバッファ
（１０ｍＭｔ−リス／ＨＣＩ、ｐｌ＋７．６　；　１５
０ｍＭ　　ＮａＣｅ　；　１％トリト：／Ｘ−＋００；
０．１％ＳＤＳ；０．５％デオキシコール酸すＩ・リウ
ム；０．１　ｒｎＭ　　ＰＭＳ　Ｆおよび０．３％ＢＳ
Ａ）中ヒｌ−Ｔ　Ｉ−−３（ＭＣＡＡｌ、Ａ４、Ａ５、
Ａ８、Ａ１８の１０−４希釈物）を指向するポリクロー
ナル（１０−３希釈）またはモノクローナル（実験の目
的に依存）抗体と４〜１６時間インキュベートシた。免
疫学的複合体は業者の説明書に従いビオチン化抗ウサギ
または抗マウスＩｇ、ストレプトアビジン−ビオチン化
ホースラデイツシュパーオキシダーゼ（アマ−シャムイ
ンターナショナル、アマ−ジャム、ＵＫ）−Ａよび４−
クロロ−１−ナフトール（ギブコーＢｌ？Ｌを用いて観
察した。別に抗血清インキュベーションを０．０５％ト
ウィーン２０を含むトリス緩衝沼中で行った。アルカリ
ホスファターゼ結合抗マウスＩｇ複合体は標準的方法（
プロメガ社）で観呻した。

ウェスタンブロッティング実験における特異がモノクロ
ーナル抗体とｈｌＬ−３ミユーテインの相互作用を示す
データを第３表に示しまた。

第 表 ＩＬ〜３／ＭＣＡデータの言平価 八１８ 一一二反応観測されず。

第３表に示した結果の解析から、ゲル精製した変性たん
ばく質に対する大部分のモノクローナル抗体は成：！７
ｑ　Ｉ　Ｌ　−３ポリペプチドの残基３０と５０との間
に存在するエピトープを指向する。これらのエピトープ
はほとんどが線型ポリペプチド鎖であり、不連続エピト
−プの唯一の例（１３）が同定された。最も大きいグル
ープは９３３変異体を同定し得るが８１１変異体とは反
応しない。

したがって、このエピト−プば残基３７と５０の間に存
在するはずである。この領域は、β−ターンとα−ヘリ
ックスを含むと推定される（ＤＮΔＳ■Ｓソフトウェア
）非常に親水的領域であることが分っており、ホップ（
ｌ（ｏｐｐ）およびウッド（Ｗｏｏｄ）のアルゴリズム
を用いて抗原決定基であると提唱されている。第２グル
ープの抗体は変異体９３３（９個のアミノ酸を欠く）と
は反応しないという特徴をもつ。この疎水的なプロリン
リッチコイル領域は主要な抗原部位ではないと予習、さ
れている。

ごれらのエピトープのより詳細な位置は腹水モツクロー
ナルと以下の置換変異体；＾ｓｐ″６−Ａｒｇ、ＧＩＬ
１４３八ｓｐ　→Ｌ　ｙ　ｓ　４３へｒｇおよびＡｓｐ
”　→Ａｒｇとの反応により決められる。

一重ザンドイソチＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａによる腹水モノク
ローナルの特徴としてＡ１およびＡ５またはＡ８、およ
びＡ５，１−？よびＡ１８間には干渉がないことが明ら
かになった。競合ＥＬＩＳＡは、Ａ１およびＡ１８、Ａ
５およびＡ８、およびＡ８およびＡ１８の間の交差競合
が存在することを示した。

Ａ４とは交差競合は観察されなかった。これらのデータ
はイムノブロッティング実験と一致している。さらに腹
水抗体は哺乳類、細菌類、イース）・培養物由来のｈ　
Ｉ　Ｌ、　−３とグリコジル化状態とは無関係反応する
ことが分った。

これらの免疫学的テストの情報を合せるとエピトープは
以下のように特定し得る。

Ａ１およびＡ　１．８はアミノ酸２つと３７の間に存在
するエピトープを指向する。さらに３６Ｄ−Ｒ変異体か
らＡ１８エビＬ−プはＡＩエピトープよりもいくぶんＣ
末端側に位置すると結論し得る。

Ａ５はアミノ酸４５と５４の間に存在するエピトープを
指向する。

Ａ８はアミノ酸３６と４７の間に存在するエピトープを
指向する。

（実施例　５） （Ｉ＋、、−３ミユーテインの生物学的特徴）Ａ　Ｍ　
１．−　　Ｄ　Ｎ　Ａ合成はヒトＡＭＬ　１９３細胞で
テストした。ヒトＡＭＬ　１９３細胞（Ａ’ＦＣＣ：Ｃ
ＲＬ−９５８９）を０．１％ＢＳＡ　（ベーリンガ−Δ
Ｇ、マーハーグ）、１０μｇ／　インシュリン（オルガ
ノン）およびトランスフェリン、Ｑ、　１ｍＭ　　β−
メルカプトエタノールおよび１０〜２０ユニツトのヒト
■Ｌ−３を含む無血清培地（ＳＦＭ）Ｃアイコブ修正ダ
ルヘソコ培地（キブコ１３ＲＬ））中に維持した。

ＩＬ、−３（変異体）調製物を９６穴丸底プレト内でＳ
ＦＭで希釈した（５０μ＋り。洗浄細胞（５０ｐｉ　　
ＳＦＭ中１〜２Ｘ１０’個）を加え、６日間培養した。

２０μＩＩ！　　ＳＦＭ中の３Ｈ−チミジン（０，１μ
Ｃｉ　、２μＣｉ　／ｍｍｏ６）を加えた後１６時間後
に細胞を収穫した。Ｉ　Ｌ−３活性の１ユニツトは、こ
のアッセイ中最高のＤＮＡ合成量の５０％を与えるのに
必要な量と定義される。

レファレンスｌ　Ｌ、　−３調製物の場合、たんばん質
■当り２Ｘ１０６〜２Ｘ１０７ユニツトの比活性を示す
。一般にミューティンの生物学的活性はこのレファレン
ス調製物と比較される。

第４図はミューティン８１２をバチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）において発現したレファレンスＩＬ−３と比較す
るＡ　Ｍ　Ｌ増殖アッセイの例を示している。

このグラフはミューティン８１２が未修正ＩＬ−３に比
べ４桁も低い活性を有していることを示している。しか
し、このミューティンでもなおＡ　Ｍ　Ｌ細胞を刺激で
き、最高活性にまで刺激するのにわずかに多いたんばん
質量が必要なだけである。

精製した組換えｈｌＬ−３を用いてＩＬ−３レセプク一
結合アッセイを行った（Ｅｌ”−Ａ０２７５５９８およ
びＥ　Ｐ　−Ａ−９０２００６２４，６参照）。

＋　１．−３はポルトン−ハンター試薬で放射能ラベル
した（ハデル（Ｂｕｄｅｌ）等、旧ｏｏｄ　、　７４　
（１９８９）５６５−５７１）、その比活性はＩＬ−３
Ｂ当り８００００ｃｐｍと見積もられた。標的としては
提供者の白血球、患者のＡＭＬ細胞、またはＭＶ４−１
１（ＡＴＣＣ；　ＣＲＬ−９５９１＞細胞を用いた。

細胞をハンクス平衡塩溶液で洗い、１％ＢＳＡを含むア
ルファーＭＥＭに懸濁した。通常３〜ｌ０Ｘ１０’個の
細胞を２００−３００ｐＭの放射能ラヘル化Ｉ　Ｌ、　
−３および種々の濃度の非ラベル化変異体たんばん質と
計２００μ！−溶液中３７゛Ｃで１時間インキュベート
した。細胞結合ラベル化Ｉ　Ｌ　−３をエソベンドルフ
チューフ中ウシ血清０．５　　のクツションを通し、４
℃、１０００×ｇ、１０分間で遠心した（へチル（Ｂｕ
ｄｅｌ）等、１９８９）。このチューブを液体窒素中で
凍らせ、バ・７カードガンマカウンター中での計数のた
め先端を切り落した。競合結合はレファレンス調製物に
対して測定した。第５図はＩ　Ｌ　−３レセプタ一結合
実験の例を示している。患者Ａ　Ｍ　Ｌ幼若化細胞に対
する放射能ラヘル化Ｉ　Ｌ　−３結合は非ラベル化Ｉ　
Ｌ３たんぱん質（レファレンス調製物）と競合させた。

標的細胞上には少数のレセプターしかないため（２００
以下）競合データはほとんど一部の変化をみせた。

特定の欠失および置換変異体に関する上述のアッセイの
結果を第４表に示す。この結果の一部は第６図にグラフ
で示した。

これから分るように両発現プラスミｌ”　ｐ　Ｇ　Ｂ　
／ＩＬ−３３６およびｐＧＢ／ＩＬ−３３９由来のＩ　
Ｌ−３融合たんばん質は生物学的活性は同一であるがｐ
ＧＢ／ＩＬ−３２２中の全ＩＬ−３ｃＤＮＡの発現に由
来するＢ、リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ）レファレンス調製物とは有意に違わなかった（　
Ｅ　Ｐ　Ａ３９２０１９６７、Ｏ参照）。大腸菌融合た
んばん質における異種のリーダーペプチドにより生物学
的活性にネガティブな効果が引き起こさハ、ないことは
明白である。はとんどのＩ　ｌ−３欠失変異体は生物学
的活性が有意乙こ減少している。アミノ酸５０と１０５
の間の欠失は比活性の［０００倍以上の減少をもたらず
。しかし、全ての場合に生物学的活性の残存が検出され
た。このことはハイオアソセイの感度およびたんばくｖ
調製物における毒性成分の不在を示している。生物学的
活性の完全な回収は欠失変異体９３２（１１４）および
９３９　（１２（１−１３０）について観察され、これ
らに相当する二重変異体９３２９およびＣ末端変異体に
ついても観察された。欠失したＮおよびＣ末端配列は明
らかにレセプターへの結合またはこの分子の適正な折り
たたみ構造には関係しない。一方、システィン残基の単
一置換（変異体９０４および９０５）は生物学的活性が
５０００倍も減少する。同様の効果は二重システィン変
異体（９０４５）でも見られ、このことはＳ−８結合が
天然のｒＬ−３分子における安定化に重要な役割を果し
ていることを示している。

上のセクションで述べた大腸菌中で発現したミューティ
ンは全て融合たんばん質である。余分なＮ末端アミノ酸
が欠失したＩ　Ｌ　−３特異的アミノ酸の損失の補償に
必要ないという証拠を得るため、ｐＧＢ／ＩＬ−３２２
／９３２９を構築し、Ｂリチェニホルミス（Ｉｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓ）で発現させた。

この構築物はＮ末端に余分なアミノ酸を含まない１−１
４／１２０−１３０１Ｌ−３ミユーテインを生した。こ
のミューティンの活性は野生型の分子と同等であり、こ
のことは残存する１０８個のアミノ酸のみがＴ　Ｌ〜３
活性に効いていることを示している。

はとんどの変異体ＩＬ３たんぱん質のレセプター活性を
測定した。この結合実験では標的細胞上のレセプター数
が少ないことから詳細なレセプター結合活性の比較はで
きない。しかし、一般に生物学的活性とレセプター結合
にはよい相関関係が成り立つ（第４表）。はとんどの変
異体■Ｌ３たんばん質に関し、相対的結合と生物学的活
性の比はほぼ１である。ミューティン１４８３．１４８
８．９０４および９０４５ばかなり高い比を示した（第
４表および第６図）。このことは潜在的アンタゴニスト
活性を示している。このことはこれらの分子がＩ　Ｌ、
　−３の部分的アンタボニストと見なし得ることを意味
している。さらに実験していくと、これらのミューティ
ンは天然のＩ　Ｌ３と同じ結合能を有しているが、その
活性は１０４倍も低いことが分った。これらの分子はＩ
Ｌ−３の真のアンタゴニストと云える。本発明で述べて
いる方法はこのような分子を得る方法を提供する。

第 表 ！Ｌ−３変異体の生物学的活性 ８月社 ３］−４９ ４，８ＸＩＯ−＄ １．６（υ、５ ３．２） 】）成熟ヒトＪ　Ｌ　−３のアミノ酸番号間の欠失を示
している。アミノ酸の置換は一文字コードで示と７であ
る。

２）中間の比生物活性はレファレンスＩ　ｌ−−３調製
物七の比較で表わさ力、でいる。

３）アンクゴニスト能は相対的レセプター結合実験を相
対的生物学的活性で割った値で表わされる。その範囲は
カッコに示した。

水　内容物はスクロース溶液からベレット化し尿素で可
溶化した。ミューティンを培地で希釈し、その生物学的
活性を測定した。レセプター結合実験は１度行った。

＃　変異体たんばん質をバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
中で発現させた。これはリーダーポリペプチド配列を欠
いている。

３　−、ｉ−ティンのたんばん質濃度はデンシトメータ
ースキャンニングには低くずぎるのでゲルおよびウェス
タンプロットから見積った。

Ｎ、Ｃ特定のミューティン調製物に関して競合は観察さ
れない。

本明細書にｊｚＮべた全ての出版物（特許および出顎を
含む）は本発明が属する分野の専門家のレベルで示しで
ある。全ての出版物は各々の出版物が個々に参考として
引用されているのと同じ程度に参考として引用されてい
る。

本発明についてその理解のため説明あるいは実施例によ
り詳細に説明してきたが、当業者にとって請求の範囲を
逸脱することなしに多くの変化および修正が可能である
ことは明白であろう。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＧＢ／ＩＬ−３３６の融合たんばん質挿入物
のヌクレオチド配列および翻訳されたアミノ酸配列を示
している。下段の文字で示したアミノ酸は非Ｉ　Ｌ　−
３アミノ酸であり、Ｉ　Ｌ３たんぱん質の配ダ１襲；１
ＡＩａ　Ｉから開始している。 第２図はｐＧＢ／ＩＬ−３３９を得るために導入された
５′側および３′側の配列変化を示している。第１図と
同様に下段文字のアミノ酸は非ＩＬ−３のアミノ酸を示
しており、成熟ＩＬ３たんぱん質の配列はＡｌａ　　ｌ
から開始している。 第３図は以下の１９個の変異体（各々レーン１〜１９）
ｐｃＢ／Ｉ　Ｌ−３３６、ｐ　Ｇ　Ｂ　／　Ｉ　ｌ−３
３９，９３２，８１０，９３４，８１２，９３５，８１
３，９３６，８２０，９３７，８２１，９３８，８２２
，９３９，９３２９，９０４，９０５，９０４５および
ファルマシア変異は第４表に示しである。 第４図はＩＬ、−３（＊）およびＩＬ−３変異体８２１
　（・）に関するＡ　Ｍ　Ｉ−増殖アソセイを示してい
る。 第５図はＩ　Ｌ、　−３−レセプター結合実験を示して
いる。放射能ラベル化Ｉ　Ｌ　−３の患者ＡＭＬ幼若化
紺胞への結合を非ラベル化Ｉ　Ｌ　３たんぱん質（レフ
ァレンス調製物）と競合させた。本実験ｔこおける非特
異的（下捧）および総結合最大値（上控）のレベルを示
しである（実施例５参照）。 第６囲は相対的生物学的活性（内棒）と相対的結合活性
（黒捧）に関して選択した変異体１１３たんぱん質を比
較している。 レファレンスＩＬ ３調製物に対する活性の割合いが示されている（第４表
） Ｆｉｇｕユ ＡＣＣ ＴＴ ＡＧ Ｔ ＣＧＧ ＡＧ ＧＣ’１ Ａ ：ｅ ＾ ＣＣＴ ＣＧＧ ＣＧＧ ＡＣＴ ＴＴ 八ＡＡ ＣＴ（ ＡＣＡ ＡＴＧ ＡＣＡ ＡＣＡ　ＡＡＡ 八ＡＡ ｌＪ ＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＧＡＴ ＴＡ 八ＡＣ Ｔ ｌ −１５ｍｅｔ　ｔｈｒ　ｍｅｔ　　ｉｌｅ　ｔｈｒ　　
ａｓｎ　　５ｅｌｌ　　ＡＴＧ　ＡＣＣＡＴＧ　ＡＴＴ
　ＡＣＧ　　ＡＡＴ　　ＴＣ（ＡＴＧ ＣＧＧ ＡＴＧ ＴＴ ＡＣＡ ＡＴＧ ＡＧ ＣＣＴ ＴＧ ＣＧＧ ＴＴ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＣＡ ＡＧ ；　　ＧＴＴ　　ＣＣＴ　　ＡＧＧ　　ＧＡＴ　　ＧＴ
Ｇ　　ＴＧＡ　　ＧＡＡ　　ＴＡＡ　　ＡＣＴ　　５２
８〜　ＡＡＡ ＡＡＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡＡＡ ＡＡＧ ＡＣＡ ｉｇｕｒｅ ＝　　ａｒｇ ：　　ＣＧＧ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、成熟ヒトインターロイキン−３分子と比較して少な
   くとも２個のアミノ酸の欠失を含み、かつその性質が改
   良されたヒトインターロイキン−３の生物学的に活性な
   ポリペプチド類似体。 ２、少なくとも４個のアミノ酸の欠失を含む請求項１記
   載のヒトインターロイキン−３の生物学的に活性なポリ
   ペプチド類似体。 ３、Ｃ末端における４個のアミノ酸の欠失を含む請求項
   １または２記載のヒトインターロイキン−３の生物学的
   に活性なポリペプチド類似体。 ４、Ｎ末端における１４個までのアミノ酸の欠失および
   、またはＣ末端における１８個までのアミノ酸の欠失を
   含む請求項１または２記載のヒトインターロイキン−３
   の生物学的に活性なポリペプチド類似体。 ５、内部欠失を含む請求項１または２記載のヒトインタ
   ーロイキン−３の生物学的に活性なポリペプチド類似体
   。 ６、ヒトインターロイキン−３の生物学的に活性なポリ
   ペプチド類似体で、以下の置換、 Ａｓｐ＾２＾１Ｇｌｕ＾２＾２→Ｌｙｓ＾２＾１Ａｒｇ
   ＾２＾２ａｓｐ＾３＾６→Ａｒｇ＾３＾６ Ｇｌｕ＾４＾３Ａｓｐ＾４＾４→Ｌｙｓ＾４＾３Ａｒｇ
   ＾４＾４Ａｒｇ＾５＾４Ａｒｇ＾５＾５→Ｇｌｕ＾５＾
   ４Ａｓｐ＾５＾５Ａｓｐ＾４＾６→Ｌｙｓ＾４＾６ｏｒ
   Ａｒｇ＾４＾６Ｇｌｕ＾５＾０→Ｌｙｓ＾５＾０ｏｒＡ
   ｒｇ＾５＾０Ｇｌｕ＾５＾９→Ｌｙｓ＾５＾９ｏｒＡｒ
   ｇ＾５＾９Ｇｌｕ＾５＾９→Ｇｌｙ＾５＾９ｏｒＰｒｏ
   ＾５＾９（α−ヘリックスブレーカー） Ａｒｇ＾６＾３Ａｌａ＾６＾４→Ｐｒｏ＾６＾３Ｇｌｙ
   ＾６＾４Ｇｌｕ＾７＾５→Ａｒｇ＾７＾５ｏｒＧｌｙ＾
   ７＾５Ｌｙｓ＾７＾９→Ｇｌｕ＾７＾９ Ａｒｇ＾９＾４→Ｐｒｏ＾９＾４ Ｈｉｓ＾９＾８Ｌｙｓ＾１＾０＾０Ａｓｐ＾１＾０＾１
   →Ｇｌｕ＾９＾８Ａｓｐ＾１＾０＾０Ｇｌｎ＾１＾０＾
   １Ｇｌｕ＾１＾０＾６→Ｌｙｓ＾１＾０＾６ Ａｒｇ＾１＾０＾８Ａｒｇ＾１＾０＾９Ｌｙｓ＾１＾１
   ＾０→Ｇｌｕ＾１＾０＾８Ａｓｐ＾１＾０＾９Ｇｌｕ＾
   １＾１＾０Ｐｈｅ＾１＾１＾３Ｔｙｒ＾１＾１＾４→Ａ
   ｌａ＾１＾１＾３Ｔｈｒ＾１＾１＾４Ｃｙｓ＾１＾６→
   Ａｌａ＾１＾６ Ｃｙｓ＾８＾４→Ａｌａ＾８＾４ Ｃｙｓ＾１＾６Ｃｙｓ＾８＾４→Ａｌａ＾１＾６Ａｌａ
   ＾８＾４のうち少なくとも１つを有する類似体。 ７、アンタゴニスト活性を有するｈＩＬ−３の生物学的
   に活性なポリペプチド類似体。 ８、請求項７記載のｈＩＬ−３の生物学的に活性なポリ
   ペプチド類似体で以下の変異体、 Ｃｙｓ＾１＾６→Ａｌａ＾１＾６、Ｃｙｓ＾１＾６Ｃｙ
   ｓ＾８＾４→Ａｌａ＾１＾６Ａｌａ＾８＾４、Ｇｌｕ＾
   ５＾０→Ｌｙｓ＾５＾０、Ｌｙｓ＾７＾９→Ｇｌｕ＾７
   ＾９、からなる群から選ばれる類似体。 ９、欠失および置換の両方を有するヒトＩＬ−３の生物
   学的に活性なポリペプチド類似体。 １０、医薬的に許容し得るキャリヤーとともに活性成分
   として請求項１乃至９のいずれか１項記載のヒトインタ
   ーロイキン−３の生物学的に活性なポリペプチド類似体
   またはその誘導体を含む医薬組成物。 １１、請求項１０記載の医薬組成物でさらにＧＭ−ＣＳ
   Ｆ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、 Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン、ＩＬ−１α、ＩＬ−
   １β、ＩＬ−２、ＩＬ−４乃至ＩＬ−８および腫瘍壊死
   因子からなる群から選ばれる医薬的効果量の物質を含む
   医薬組成物。 １２、請求項１乃至９のいずれか１項記載のポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメント。 １３、適当な宿主細胞内で請求項１乃至９記載のポリペ
   プチドのいずれか１つを発現し得る転写および翻訳調節
   配列とともに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を
   含むクローニングベヒクル。 １４、請求項１３記載のクローニングベヒクルでトラン
   スホームした宿主細胞。 １５、請求項１乃至９記載のヒトインターロイキン−３
   の生物学的に活性なポリペプチド類似体をコードするＤ
   ＮＡ配列を得る方法で、以下のステップ； （ａ）成熟ｈＩＬ−３たんぱん質をコードするＤＮＡ配
   列の単離、 （ｂ）イソヒドロ突然変異誘発による目的とするヌクレ
   オチドの欠失または置換、 を含む方法。 １６、請求項１乃至９のいずれか１項記載のヒトインタ
   ーロイキン−３の生物学的に活性なポリペプチド類似体
   を得る方法で、以下のステップ；（ａ）前記ポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに導入し適当
   な発現調節配列の制御下におく、 （ｂ）該発現ベクターを適当な宿主細胞に導入する、 （ｃ）該宿主細胞を培養する、 （ｄ）該宿主細胞が産生するたんぱく質を回収する、 を含む方法。 １７、成熟ヒトＩＬ−３のアミノ酸２９および５４の間
   に存在するエピトープに対するモノクローナル抗体。 １８、成熟ヒトＩＬ−３のアミノ酸２９および５４の間
   に存在するエピトープに対するモノクローナル抗体の製
   造法。