FI102293B - Ihmisen interleukiini-3:n molekulaarinen kloonaus ja ilmentäminen - Google Patents

Description

102293

Ihraisen interleukiini-3:n molekulaarinen kloonaus ja ilmentäminen

Keksintö koskee ihraisen interleukiini-3:a (hIL-3) koodattavaa cDNArta ja sen käyttöä mm. kloonaukseen ja ilmentämiseen eri organismeissa, mm. mikro-organismeissa, erityisesti hiivoissa, bakteereissa ja kudosviljelmäsoluissa.

Hematopoieesi on aktiivinen prosessi, jossa monipuolisesti kehityskelpoiset varhaissolut muodostavat lisäkasvun ja erilaistumisen kautta kaikentyyppisiä kypsiä verisoluja ja eräitä erikoistuneita kudessoluja. Tietyt proteiinit, jotka ovat nimeltään hematopoieettisia kasvutekijöitä (engl. hemopoietic growth factors, HGFs), säätelevät toiminnallisten verisolujen tuotantoa. Eräät hematopoi-eettisista kasvutekijöistä ohjaavat tietyn polveutumis-ketjun kypsymistä, kun taas toiset stimuloivat varhaisso-lujen lisäkasvua ja erilaistumista useilla reiteillä.

Paljon hematopoieettista erilaistumisprosessia koskevasta tiedostamme on saatu hiiritutkimuksilla in vitro ja • i · in vivo, käyttämällä puhdistettuja kasvutekijöitä. Hiiren * · ' ; kasvutekijä interleukiini-3 (mIL-3), josta käytetään i « * myös nimiä multi-CSF, syöttösolujen kasvutekijä, kantasolu- I < 4 1 ·' jen aktivointitekijä ym., stimuloi varhaisessa kehitys- :.v vaiheessa olevien, monikykyisten solujen (CFU-S) lisäkas- • · :.v vua eli proliferaatiota, kun havainnointi suoritetaan pernan pesäkemäärityksellä, ja tuloksena on erytroidien, :Y: megakaryosyyttien eli luuytimen jättisolujen, granulo- syyttien/makrofaagien, osteoblastien eli luunemosolujen *. ja useiden muiden polveutumisketjujen perussolujen i i · *”*. tuotanto. Hiiren IL-3 on lisäksi liitetty monipuolisesti • · *···* kehityskelpoisten kantasolujen replikoitumiseen, jolloin « : : kyseessä on luultavasti yhteisvaikutus muiden hematopoi- eettisten kasvutekijöiden kanssa.

2 102293

Viime vuosien kuluessa ovat useat ryhmät onnistuneet kloonaamaan mIL-3:n cDNArn. Tähän mennessä ei ole julkaistu tuloksia siitä, että olisi kyetty tunnistamaan ihmisen DNA:sta homologisia sekvenssejä käyttämällä koettimena mIL-3:n DNA:ta. Luultavasti ihmisen geeni on mutaatioiden seurauksena suuresti eriytynyt mIL-3-geenis-tä tai menettänyt toimintansa kädellisten evoluution aikana. Kuitenkin ihmisen leukosyyttien havaittiin tuottavan sellaisia hematopoieettisia kasvutekijöitä, jotka kykenevät korvaamaan mIL-3:n hiiren CFU-S-solujen lisäkasvun eli proliferaation tukemisessa. Näin voitiin olettaa, että on olemassa ihmisen hemätopoieettinen kasvutekijä, jolla on samoja biologisia ominaisuuksia kuin mIL-3:lla, ja joka näin ollen saattaisi olla ihmisen vastaava homologi. Yang, Y-C et ai., Cell (1986) 47:3-10, päivätty 10. lokakuuta, selostavat gibbonin T-soluista saatua cDNA:ta, joka koodittaa proteiinia, jolla on IL-3:n kaltainen aktiivisuus, sekä ihmisen vastaavan proteiinin perimä-DNA:n esillesaamista. Ihmisen IL-3:a koodittavan cDNA:n sekvenssi voidaan päätellä Yang et ai:n julkaisemasta ihmisen geenin sekvenssistä. Mainit- « · tu artikkeli ei kuitenkaan selosta eikä neuvo menetelmää . ihmisen IL-3:n cDNA:n eristämiseksi eikä mainitse siitä, « · · ' « « · että ihmisen IL-3:a olisi saatu tuotetuksi. Esillä • · *·/·. olevassa keksinnössä selostetaan ensimmäisen kerran • · · · sellaisen cDNA:n eristäminen, joka kattaa ihmisen IL-3:n • · · • · · • * koko koodittavan sekvenssin.

Ihmisen IL-3-proteiinia ei ole koskaan valmistettu • · · *·*«* puhdistetussa muodossa eikä sen ominaisuuksia selostettu • · · v * lukuunottamatta sen aktiivisuutta eräissä in vitro-pro- :liferaatiomäärityksissä sekä pääteltyä primääristä raken-.···. netta. Esillä oleva keksintö mahdollistaa ihmisen puhdistetun IL-3:n talteenoton ja sen ominaisuuksien tunnistamisen toteuttamalla tuotanto yhdistelmä-DNA-tek-'· : nilkalla aikaansaatua cDNA-kloonia käyttäen.

Kuten edellä mainittiin, selostetaan esillä olevassa 3 102293 keksinnössä ensimmäistä kertaa sellaisen cDNA:n eristäminen, joka kattaa ihmisen IL-3:n koko koodittavan sekvenssin. Koska hiiren IL-3:a koodittavan sekvenssin ja ihmisen IL-3:a koodittavan sekvenssin välinen homologian aste on alhainen, ei ihmisen IL-3:n cDNA:ta saada esille hybridisoimalla hiiren IL-3:a koodittavan sekvenssin kanssa. Yllättäen voitiin hIL-3-cDNA-klooni eristää käyttämällä hyväksi näiden kahden cDNA:n 3'-koodit-tamattomien päiden suhteellisen korkeaa homologia-astetta. Kun cDNA-klooni on saatavilla, on hitsiä mahdollista tuottaa mitä erilaisimmissa organismeissa. Suurimittakaa-vaisen tuotannon jälkeen proteiini voidaan puhdistaa ja sitä voidaan käyttää hoitotarkoituksiin.

Esillä oleva keksintö mahdollistaa ihmisen yhdis-telmä-DNA-tekniikalla aikaansaadun IL-3-proteiinin tuottamisen mitä erilaisimmissa isäntäsoluissa siten, että suoritetaan ihmisen IL-3-proteiinia koodittavan cDNA-sekvenssin transkriptio ja luenta. Jäljempänä valotetaan tämän proteiinin tuotantoa useissa isännissä, mm. E. colissa, COS-soluissa, C127-soluissa, B. subtilis-bakteerissa ja B. licheniformis-bakteerissa,-S.cerevisiae-hiivassa ^ ja K. lactis-hiivassa. Tuotanto muissa isännissä sopi via ilmentämissysteemejä käyttäen on myös mahdollista, kun tarjolla on introni ton cDNA. Yleisemmin sanottuna : ·’ auttaa ihmisen IL-3:een kohdistuvien vasta-aineiden, • · *·*·* jotka sallivat yhdistelmä-DNA-tekniikalla aikaansaadun • · proteiinin onnistunutta tuotantoa osoittavien pesäkkeiden tunnistamisen, saatavuus ihmisen IL-3:n tuottamisessa t : : mitä tahansa yhdistelmä-DNA-systeemiä käyttäen.

• · · • - : Näin ollen keksintö koskee ensinnäkin transformoi- . *·. tunutta elävä bakteeri-, hiiva- tai kudosviljelmäisäntä- • · · solua, joka sisältää yhdistelmä-DNA-materiaalista johdet- • · tua geneettistä materiaalia, jolla on kuvan 1 sekvenssin Ή· mukainen nukleotidisekvenssi ja joka koodittaa ihmi-:.*·· sen IL-3:a, jossa on Pro kypsän proteiinimolekyylin ase massa 8. Keksintö koskee myös intronitonta DNA:ta, joka koodittaa mainittua ihmisen IL-3-proteiinia.

Vielä keksintö koskee ilmentämissysteemiä, joka ky- 4 102293 kenee saamaan aikaan mainitun hIL-3:a koodittavan DNA:n ilmentymisen mainituissa isännissä.

Edelleen keksintö koskee menetelmää mainitun ihmisen IL-3-proteiinin valmistamiseksi glykosyloituneessa tai glykosyloitumattomassa muodossa, tai joka on vapaa mainitun proteiinin yhteydessä normaalisti esiintyvistä aineista.

Kuvassa 1 on esitetty ihmisen multi-CSF:n ja hiiren IL-3:n DNA-sekvenssien ja vastaavien proteiinien aminohappo-järjestysten vertailut. Hmulti-CSF:n aminohappo- ja DNA-sekvenssi (klooni Dll, ylemmät rivit) asetettiin allekkain mIL-3:n DNA-sekvenssin (11, 35) ja aminohappo-sekvenssin (30) kanssa. Identtiset nukleotidit on osoitettu pystysuoralla viivalla ja identtiset-aminohapot on osoitettu sulkeilla. Mustat pisteet osoittavat polyadenyloi-tumisen signaalisekvenssin ja vaakasuorat viivat osoittavat toistuvia ATTTA-yksiköitä.

Kuva 2 esittää plasmidin pLB4 rakentamista, joka plasmidi sisältää ihmisen IL-3:n cDNA:n. E = EcoRI,

Sm = Smal, B = BamHI, S = SstI, K = Kpnl.

Kuva 3 esittää COS/pLB4-solujen kasvuliuoksen ·*·' biologista aktiivisuutta ihmisen luuytimen kantasolujen suhteen. Erytroidipesäkkeiden (BFU-E), granulosyytti- makrofagipesäkkeiden (CFU-GM), granulosyyttipesäkkeiden (CFU-G), eosinofiilipesäkkeiden (CFU-Eo), makrofagipesäk- keiden (CFU-M) ja sekapesäkkeiden (CFU-MIX) lukumäärien * * + :Y: keskiarvot (- keskihajonnat) on esitetty • ♦ kaksoisviljelmille, kun stimulointiin on käytetty asteit-tain kasvavia määriä COS/pLB4-solujen kasvuliuosta.

• · Λ

Kuva 4 esittää äkillisen myelooisen leukemian (AML) • · · *. proliferaation indusointia COS/pLB4-solujen kasvuliuok- sella, kun määritykset on suoritettu pesäkeviljelyllä ... 3 : (kuvio A) ja DNA-synteesin määrityksellä ( H-TdR:n si- . säänotto) (kuvio B).

I". Kuva 5 esittää E. colin ilmentämisvektorien " pGB/IL-301, pGB/IL-302, pGB/IL-303, pGB/IL-304, pGB/IL-305 ja pGB/IL-306 rakentamista. Tässä kuvassa X tarkoittaa 5 102293

XhoI-kohtaa, E tarkoittaa EcoRI-kohtaa, B tarkoittaa BamHI-kohtaa ja A tarkoittaa Aval-kohtaa.

Kuva 6 esittää pTZ18R:n (Pharmacia) ja sen johdannaisen pTl:n monikloonauskohdan sekvenssiä.

Kuva 7 on hmulti-CFS:n ilmentämiskloonien kaavio-esitys. Eukaryooteissa aikaansaatavaan ilmentymiseen tarkoitetuissa plasmideissa pLB4 ja pLHl on esitetty vain hmulti-CSF-cDNA-liitännäinen. Leader-peptidiä ( V/SSl/JJJA ) ja kypsää hmulti-CSF-proteiinia () koodattavat alueet on merkitty. Bakteereissa tapahtuvaan hmulti-CSF:n ilmentämiseen tarkoitetut kloonit (johdettu plasmidista pLHl) sisältävät lacZ:aa ja moni-kytkijäproteiinia koodittavan alueen (ESZSSSQ), hmulti-CSF:n 5'-pään koodittamattoman alueen h ) ja hmulti-CSF:n koodittavan alueen. Nuoli osoittaa kyseisessä vektorissa käytetyn ATG-aloituskodonin paikan.

Kuva 8 esittää lacZ/hmulti-CSF-DNA:n liitosaluei-ta bakteereissa käytettävissä erilaisissa ilmentämisvek-toreissa. Kulloisenkin kloonin sekvenssi on annettu joko pUC8:n tai pTZ18R:n IacZ-proteiinin alusta lähtien (pienet kirjaimet) ja hmulti-€SF:n DNA-sekvenssin alusta lähtien Clal-kohtaan asti, joka on asemassa 158. Hmulti-CSF:n DNA-sekvenssissä esiintyvät mutaatiot on alleviivattu, ja niistä seuranneet muutokset ovat seuraavat: • ·* trp1-^-*- arg13 (pGB/IL-302); leu^-^-pro9 ja trp^-—»-arg1^ (pGB/IL-303); met^—^thr-3 ja hiljainen mutaatio (pGB/IL- • · 304). Yläindeksit tarkoittavat aminohappotähteen numeroa kypsässä proteiinissa.

:Y: Kuva 9 esittää polyakryyliamidigeelielektroforee- • * siä, joka on suoritettu bakteeriperäiselle hmulti-CSF:lle, *. joka on saatu plasmidin pGB/IL-301 tai pGB/IL-302 sisäl- • · · ’·*·* tävistä bakteereista.

• · · '···' Kuva 10 esittää hmulti-CSF-fuusioproteiinin : titrausta äkillisen myelooisen leukemian emosoluilla;

Kuva 11 esittää Western-blottausta, joka osoittaa kanin vastaseerumien IL-3-spesifisen reaktion, kun vasta- 6 102293 seerumit on synnytetty pGB/IL-301:llä transformoituneen E. colin lysaatista eristettyä 21 kd:n proteiinia vastaan.

Kuva 12 esittää kuvan 11 mukaisten vastaseerumien vaikutusta IL-3-aktiivisuuteen.

Kuva 13 on kaavioesitys plasmidista pGB/IL-307. Laatikko ( itvAivAvm ) tarkoittaa ihmisen IL-3:a koodittavaa sekvenssiä. Fuusioproteiinin N-pään aminohapot on esitetty piirroksen alapuolella.

Kuva 14 on kaavioesitys plasmidista pGB/IL-308. Promoottorialueen nukleotidisekvenssi on esitetty piirroksen alapuolella.

Kuva 15 esittää plasmidin pGB/IL-309 rakentamista. Ensimmäinen laatikko (» t ) osoittaa ihmisen IL-3:n sekvenssin osaa eli signaalisekvenssiä plus kypsän proteiinin 20 aminohappoa. Toinen laatikko ( e™g=r==a ) osoittaa IL-3:n cDNA-sekvenssin 3'-koodittamattoman alueen osaa.

Kuva 16 on kaavioesitys plasmidista pGB/IL-310.

Kuva 17 esittää plasmidin ρΒΗΆΙ nukleotidisekvenssiä.

Kuva 18 esittää plasmidien pGB/IL-311 ja pGB/IL-312 rakentamista. Laatikko (Ezzzzzzzzzza) tarkoittaa ihmisen IL-3:n esiastetta koodittavaa aluetta.

Kuva 19 esittää plasmidin pGB/IL-313 rakentamista.

; IL-3:n 5'-puolen sekvenssi on esitetty piirrosten alapuo- :V: lella.

• ·

Kuva 20 on kaavioesitys plasmidista pGB/IL-317.

• ·

Kuva 21 on kaavioesitys plamidista pGB/IL-316.

Kuva 22 esittää plasmidin pGB/IL-316 nukleotidisek- • · · #·;·. venssiä alueelta, joka ulottuu laktaasipromoottorin • · · sisältämästä ainoasta Sacl-kohdasta terminaattorin \i.: takana olevaan HindiII-kohtaan (tähteet 4457 - 7204).

• « *

Ku/a 23 esittää plasmidin pGB/IL-318 nukleotidisek-. .·. venssiä alueella, joka ulottuu laktaasipromoottorin : ainoasta Sacl-kohdasta terminaattorin takana olevaan

HindiII-kohtaan (tähteet 4457 - 7190).

7 102293

Kuva 24 esittää EF-ΐΛιη promoottorin, Sall-Bglll-XhoI-kytkijän ja aktiinin terminaattorin nukleotidisek-venssejä siten, kun ne ovat läsnä plasmidissa pGB/TEFact.

Tässä selostuksessa käytetään termejä "ihmisen IL-3", "hIL-3", "ihmisen multi-CSF" ja "hmulti-CSF" vaihtoehtoisesti ja niillä tarkoitetaan proteiinivalmistetta, jolla on seuraavat aktiivisuudet: 1. Proteiini stimuloi pesäkkeidenmuodostusta ihmisen hematopoieettisista varhaissoluista niin, että muodostuu mm. erytroidipesäkkeitä, granulosyyttipesäkkei-tä, granulosyytti-makrofagipesäkkeitä ja sekapesäkkeitä.

2. Proteiini stimuloi ihmisen äkillisen myelooisen leukemian (AML) blastien DNA-synteesiä, mikä voidaan todeta esimerkiksi leimatun tymidiinln sisäänottona.

Sopiakseen hmulti-CSF:n määritelmään ei edellä mainitulla määrityksellä saatu aktiivisuus saa oleellisesti estyä sellaisten vasta-aineiden toimesta, jotka on synnytetty ja ovat immunospesifisiä granulosyytti-mak-rofagi-CSF:lie (GM-CSF)paitsi, jos nämä vasta-aineet estävät myös jäljempänä kuvatun hmulti-CSF:n näitä aktii-. . visuuksia.

Yksi hmulti-CSF:ää edustava muoto on esitetty kuvassa 1 133 aminohapon kypsänä proteiinina, jossa « V.·' on 19 aminohapon signaalisekvenssi. Kuvan 1 aminohappo- :järjestys on identtinen julkaisussa Yang, Y-C., et • · s.v ai.. Cell (1986) 47:3-10 (supra) esitetyn kanssa lukuun- :Y: ottamatta kypsän proteiinin asemaa 8, jossa Yangin prote iinin seriini on tässä korvattu Pro:11a. Kuten tässä .y. selostuksessa osoitetaan, on aminohapposekvenssi tehokas • · .·:·. glykosyloitumattomassa muodossaan. Se sisältää kuitenkin • · · kaksi glykosyloitumiskohtaa ja glykosyloitunut muoto • t · ’···’ sisältyy esillä olevan keksinnön kattamaan alaan. Huo-

• < I

·...’ mattakoon myös, että proteiini voi esiintyä happoaddi- : tiosuolamuodossa, emäksisessä suolamuodossa tai neut- • · : raalissa muodossa ympäristön pH:sta riippuen. Johdan- naismuodostus fosforyloinnilla, asetyloinnilla jne. sikäli, kun aktiivisuus ei tuhoudu, johtaa myös prote- ·.

8 102293 iiniin, joka kuuluu tämän keksinnön kattamaan alaan.

Huomattakoon myös, ettei aktiivisuus ehkä edellytä koko sekvenssiä. Osa aminohapposekvenssistä voi olla poistettu tai korvattu toisella, mutta biologinen aktiivisuus on silti jäljellä. Kuten tässä selostetaan, voidaan asemassa 1 oleva alaniini poistaa samoin kuin jopa ensimmäiset neljätoista aminohappotähdettä, jos ne korvataan fuusioidun peptidisekvenssin aminohapposekvenssillä.

Lisäksi uskotaan, että hiiren proteiinimuoto vaatii vain ensimmäiset 79 tähdettä ollakseen aktiivinen; tämä vastaa suunnilleen ensimmäisiä 83 tähdettä vastaavassa ihmisen proteiinissa. Näin ollen fragmentit, joissa on vain proteiinin ensimmäiset 83 aminohappotähdettä sekä niiden muodot, joissa N-pään osa on korvattu, kuuluvat myös esillä olevan keksinnön kattamaan alaan. Lisäksi on syytä ottaa huomioon, että kypsän hIL-3:n N-pää koostuu tähteistä ala-pro-met jne. (ks. kuva 1). Tiedetään, että hiivaisännästä erittyessään saattaa proteiini joissakin tapauksissa lyhentyä kahdella aminohapolla (ala-pro) johtuen dipeptidyyliaminopeptidaasin vaikutuksesta (72). HIL-3, josta N-pään alaniini ja proliini puuttuvat, on säilyttänyt biologisen aktiivisuutensa. Hiivakannat, joissa on nollamutaatio X-prolyy-lidipeptidyyliaminopeptidaasigeenissä, tuottavat silti : V täydellistä hIL-3:a (aminohapot 1 - 133). Näin ollen • · esillä olevan keksinnön kattamiin multi-CSF-tyyppeihin kuuluvat ne, joissa on N-päässä alaniini ja proliini, ja ne, joissa niitä ei ole, jolloin tuottaminen tapahtuu ;y: vastaavasti X-prolyylidipeptidyyliaminopeptidaasimutan- • # teillä ja villityyppisillä isännillä.

·. Kun tuotanto tapahtuu kypsän proteiinin muodossa • · · *"·* prokaryoottisessa isännässä, edeltää kypsää proteiinia • · * koodittavaa sekvenssiä ATG-aloituskodoni. Näin syntynyt : N-pään metioniini saattaa sen jälkeen poistua kokonaan : tai osaksi, riippuen sitä seuraavan aminohapposekvenssin luonteesta. Jälleen ovat nämä molemmat hIL-3:n muodot 9 102293 biologisesti aktiivisia. Näin ollen esillä olevan keksinnön kattamiin multi-CSF-tyyppeihin kuuluvat ne, joissa on N-päässä metioniini, ja ne, joissa sitä ei ole.

Edellä esitetyn perusteella on selvää, että ihmisen IL-3-proteiiniin voidaan sisällyttää aminohappomuu-toksia vaikuttamatta sen biologiseen toimintaan. Huomattakoon, että vähäiset muutokset aminohapposekvensseissä suorittamalla kooditetulle tähteelle kemiallinen muuutos, korvaamalla tähde toisella tai poistamalla tai lisäämällä yksi tai useampia, mielellään vain yksi tähde, johtavat proteiineihin, joiden aktiivisuus on säilynyt. Näin ollen keksintö kattaa myös nämä tuhoamattomat mutaatiot ja erityisesti luonnostaan esiintyvät alleeliset variaatiot ja muut mutaatiot, jotka eivät tuhoa aktiivisuutta.

Toisaalta huomattakoon myös, että aminohappomuu-tokset ihmisen IL-3-proteiinissa saattavat olla hyödyllisiä proteiinin terapeuttisen käytön kannalta. Huomattakoon, että kypsässä proteiinissa on neljä konservoi tunutta eli säilynyttä aluetta, jotka ovat tähteissä 15 - 36, 54 - 61, 74 - 91 ja 107 - 118. Proteiinit, jotka sisältävät yhden tai useampia aminohappomuutoksia ’ konservoi tumattomilla eli muuntuneilla alueilla 1 - « · · 14 (jotka on aina mahdollista korvata isännästä johdet- • · · •# \ tujen fuusioproteiinien sekvensseillä), 37 - 53, 62 *·'·* - 73, 92 - 106 ja 119 - 133. Näyttää kuitenkin siltä, *·*·* että asemissa 16 ja 84 olevat kysteiinitähteet saattavat olla tarpeellisia disulfidisiltojen muodostuksessa, • · V.; koska ne ovat säilyneet lajien välillä. Edellä mainituis- :T: sa säilyneissä osakokonaisuuksissa tapahtuneet muutokset # *·. saattavat vaikuttaa proteiinin biologisiin ominaisuuksiin, "I kuten reseptoriinsitoutumiseen ja signaalien siirtymiseen.

*" On kuviteltavissa, että muunnettuja ominaisuuksia omaaval- \j.; la hIL-3:lla on terapeuttista käyttöä. Tällaiset hIL-3:n :/·: johdannaiset, jotka voidaan valmistaa ennestään tunnettuja proteiininrauokkausmenetelmiä käyttäen, katsotaan esillä 10 102293 olevan keksinnön kattamaan alaan kuuluviksi.

Proteiinivalmiste voi sisältää hmulti-CSF-peptidiä monomeerisessä tai aggregoituneessa muodossa edellyttäen, että aggregaatit ovat säilyttäneet edellä mainitun aktiivisuuden.

Tässä käytetyllä termillä "ilmentämissysteemi" tarkoitetaan DNA:ta, joka sisältää sekä koodittavan sekvenssin, jonka ilmentyminen halutaan saada aikaan, että tarvittavat ohjaussekvenssit toiminnallisesti liitettyinä siihen, jotta ilmentyminen tapahtuu, kun ohjaus-sekvenssit ovat yhteensopivia sen isännän kanssa, johon ilmentämissysteemi sijoitetaan. Kuten yleisesti ymmärretään, tarkoitetaan "ohjaussekvensseillä" DNA-jaksoja, jotka vaaditaan sen koodittavan sekvenssin ilmentämiseen, johon ne ovat toiminnallisesti liittyneet, tai, jotka säätelevät tätä ilmentymistä.

Kaikkien isäntien ohjaussekvenssit sisältävät promoottorin, joka saattaa olla ympäristön ohjauksen alainen tai ympäristön ohjauksesta riippumaton. Proka-ryootteihin sopivia tyypillisiä promoottoreita ovat esimerkiksi trp-promoottori (-indusoitavissa tryptofaanin ·*·' puutteella), lac-promoottori (indusoitavissa galaktoosin analogilla IPTG), beeta-laktamaasin promoottori ja faagista johdettu Pr-promoottori (indusoitavissa lämpötilanmuutok- ...

I silla). Lisäksi erityisesti Bacillus-bakteereissa :V: ilmentämiseen sopivia promoottoreita ovat mm. alfa- ·*:*: amylaasin, proteaasin, Spo2:n sekä synteettiset promoot- • · torisekvenssit. Sopivia promoottoreita hiivassa ilmentä- .V. miseen ovat mm. 3-fosfoglyseraattikinaasipromoottori • · · sekä muiden glykolyyttisten entsyymien promoottorit • · · sekä alkoholidehydrogenaasin ja hiivan fosfataasin pro-moottorit. Käyttökelpoisia ovat myös transkriptionjat- • · · kamistekijän (engl. transcription elongation factor, . .·. TEF) ja laktaasin promoottorit. Nisäkkäissä ilmentämi- seen käytetään yleensä viruksista johdettuja promootto- • * · reita, kuten adenovirusten promoottoreita ja SV40-pro-moottorisysteemejä, mutta voidaan myös käyttää säädel- 11 102293 täviä promoottoreita, kuten metallotioneiinipromootto-ria/ jota voidaan ohjata raskasmetalleilla tai gluko-kortikoidikonsentraatiolla. Nyt on muös tarjolla virus-pohjäisiä systeemejä hyönteissoluissa ilmentämiseen sekä kasvisolujen promoottoreihin, kuten nopaliinisynte-taasipromoottoreihin, perustuvia iImentämissysteemejä.

Promoottori-DNA-sekvenssin lisäksi, joka tarvitaan geenin transkriptioon RNA-polymeraasin toimesta, ovat erilaiset ohjaussekvenssit, mm. lopetusta säätelevät (esimerkiksi sellaiset, jotka saavat aikaan polyade-nyloituneita sekvenssejä), myös hyödyllisiä ilmentymisen ohjauksessa. Eräät systeemit sisältävät myös tehostaja-eli enhanserielementtejä, jotka ovat toivottavia, mutta eivät aivan välttämättömiä ilmentymi-sen aikaansaamisessa.

Luennan ohjaus sisältää ribosominsitoutumiskoh-dan (RBS) prokaryoottisissa systeemeissä, kun taas eukaryoottisissa systeemeissä luentaa voidaan ohjata AUG-kodonin ympärillä olevalla nukleotidisekvenssillä.

Kuten jo edellä mainittiin, voidaan geenitekno- > logialla aikaansaatujen proteiinien tuotanto saada tapahtumaan mitä erilaisimmissa isännissä, mm.

« I

bakteereissa (pääasiassa E. coli, Bacillus- ja Strepto-:Y: myces-bakteerit), hiivoissa ja homeissa (kuten Saccha- : romyces, Kluyveromyces ja Aspergillus) ja nisäkäs- ja « 4 « :v. muissa soluviljelmissä, kuten COS-soluissa, C127-soluis- • · .·.·. sa, kiinalaisen hamsterin munasarjan soluissa, Spodop- • « · terä frugiperda (Sf9)-soluissa jne. Proteiini saattaa • · · syntyä solunsisäisenä kypsänä proteiinina tai fuusiopro- . . teiinina tai se saattaa erittyä, jos geeni sisältää • · · yhteensopivaa signaalia koodittavan DNA:n.

• ♦ · *·* * Esillä oleva keksintö mahdollistaa ensimmäistä : :‘r kertaa geeniteknologialla aikaansaadun ihmisen

IM

IL-3:n suurimittakaavaisen tuotannon niin, että tätä proteiinia - puhdistetussa muodossa - voidaan nyt käyt-tää terapeuttisena aineena. Tässä selostetut menetelmät '· ’· tarjoavat keinon proteiinin tuottamiseen sekä glykosy- loituneessa että glykosyloitumattomassa muodossa, jotka / 12 102293 voidaan puhdistaa oleellisesti ottaen puhtaaksi ihmisen IL-3:ksi. "Puhdistetulla" ihmisen IL-3:lla tarkoitetaan edellä määriteltyä ihmisen IL-3:a, joka on vapaa muista proteiineista, joita yleensä esiintyy sen yhteydessä.

B. Ihmisen IL-3:a koodittavan cDNA:n esiinsaaminen

Ihmisen IL-3 eristettiin seuraavaa toimintastrategiaa noudattaen: 1. Kehitettiin menetelmä, joka mahdollistaa he-matopoieettisten kasvutekijöiden (HGF:t) toistettavissa olevan tuotannon ihmisen leukosyyteillä.

2. Tällaisista tuottavista soluista valmistettiin mRNA ja se transkriboitiin kaksisäikeiseksi cDNA:ksi.

3. cDNA seulottiin täydellisellä mIL-3-cDNA:11a, joka sisälsi sekä koodittavan alueen ja luetuksi tulemattoman alavirran 3'-alueen, jolloin saaatiin DII.

4. Hybridisoituva cDNA-klooni DII sijoitettiin ilmentämisvektoriin pLO, jolloin saatiin pLB4f joka ilmennettiin COS-soluissa, jotta saatiin varmistetuksi ihmisen IL-3:a koodittavan sekvenssin läsnäolo. Näiden solujen kasvuliuos osoitti hIL-3:lta odotettavaa _ biologista aktiivisuutta.

• * · .;Ί Ihmisen cDNA saatiin esiin tällä menetelmällä, « · « *.* koska huolimatta huomattavasta homologian puutteesta • · · *·*·* hiiren koodattavaan sekvenssiin verrattuna, oli luetuksi • ·

• » I

'·*·* tulemattomien 3'-alueiden välillä yllättävän korkea homologia-aste. Esillä olevai patentin hakijoiden tiedos- • · V.: sa ei ole mitään aiempaa selostusta, jossa olisi käytetty luetuksi tulemattoman 3' -sekvenssin homologiaa muulle . ]·, lajille kuuluvan geenin esille hakemiseen.

i t «

Tarkemmin sanottuna on lymfosyyttien kasvuliuos, kun kasvatus on suoritettu 12-O-tetradekanoyyliforbol- \i,: 13-asetaatin (TPA) ja konkanavaliini A:n (Con A) läsnäol- • · :/·· lessa, sopiva ihmisen hematopoieettisten kasvutekijöi den lähde, kun määritys suoritetaan kasvuliuoksesta 13 102293 käyttämällä hiiren CFU-S-solujen stimulointia suspen-sioviljelmissä, mIL-3:sta riippuvaisten DA-l-solujen proliferaatiota, ihmisen hematopoieettisten varhaissolujen määrityksiä pesäkkeenmuodostuksella in vitro ja äkillisen leukemian blastien stimulointia in vitro. Ihmisen lymfosyyteistä rakennettiin cDNA-kirjasto lambda gt-10-faagiin (20) ja se seulottiin mIL-3:lle sukua olevien sekvenssien suhteen käyttämällä mlL-3:n cDNA:n Hindlll-Xbal-fragmenttia. Yhtään hybridisoituvaa kloonia ei voitu tunnistaa.

Sen sijaan, kun koettimena käytettiin hiiren IL-3:n täydellistä cDNA:ta, voitiin tunnistaa neljä kloonia. Suurimman kloonin (Dll) restriktioentsyymianalyysi osoitti 910 emäsparin liitännäistä, joka sisälsi sisäisen EcoRI-kohdan (asemassa 411, kuva 1).

(Tutkittiin, oliko tämä EcoRI-kohta syntynyt kahden erillisen cDNA-fragmentin yhteenliittymisen tuloksena, vai oliko se luontaisesti esiintyvä kohta. Kun rest-riktioentsyymillä katkaistulle ihmisen DNA:lie suoritettiin Southern-analyysi käyttämällä koettimina kloonin Dll . . leimattuja 5'- ja 31-EcoRI-fragmentteja, havaittiin * « · ; ; identtiset DNA-fragmentit HindiII-katkaisun (15 ke) ja BamHI-katkaisun (4,6 ke) jälkeen. Myöskään ei EcoRI-*·'··' kohdan ympärillä oleva DNA-sekvenssi vastaa kytkijäsek- i · · : *.· venssiä (pCCGAATTCGG), jota käytettiin cDNA:n liittämi- • · :.v seen fagiin, mikä viitaa siihen, että nämä fragmentit ovat peräisin yhdestä ainoasta mRNA:sta).

Hybridisointi- ja sekventointikokeiden perusteella vedettiin se johtopäätös, että pienet kloonit (II, IV

• · ja VI) ovat identtisiä kloonin Dll 3'-nukleotidisekvens- • · · ·φ sin kanssa ja peräisin samasta mRNA-lajista.

• · · ’·'··' Kun Dll-cDNA ja mIL-3-cDNA asetettiin tietokoneen * · avulla allekkain (kuva 1), paljastui sekvenssihomolo- ; giaa 5'-pään 100 emäsparin alueella, nukleotidien 236 « « · - 269 ja nukleotidien 598 - 803 välillä 3'-pään alueella (68 %, 71 % ja 73 % homologia vastaavasti). Erityisesti nukleotidien 706 ja 763 välissä oleva alue on säilynyt 14 102293 erittäin muuttumattomana (93 % homologia) ja sisältää toistuvia AT -pitoisia sekvenssejä. Vähäinen homologia (52 %) verrattuna ihmisen cDNArn 5'-pään 600 emäsparin alueeseen estää havaitsemisen, kun hybridisointi suoritetaan mIL-3:n HIndIII-XbaI-fragmentilla.

Ihmisen cDNA-kloonin analyysi kooditetun proteiinin suhteen osoittaa avointa lukuvaiheistusta asemissa 495 - 497 olevaan lopetuskodoniin TGA asti (kuva 1). Ensim mäinen ATG-tripletti on luultavasti kooditetun polypepti-din todellinen aloituskodoni. Oletettu kooditettu proteiini sisältää hydrofobisen leader-peptidin, jossa on 19 aminohappoa, ja joka luultavasti tulee katkaistuksi glysiinitähteen ja alaniinitähteen välistä (22, 23).

Kun ihmisen ja hiiren IL-3:n ennustetut aminohappotähteet asetetaan allekkain (kuva 1), paljastuu 50 % homologia leaderpeptideissä (tähteet -26 - +1) ja 28 % homologia kypsissä proteiineissa (tähteet 1 - 133). Leader-peptidin sisällä on kaksi neljän aminohapopn pituista säilynyttä aluetta (tähteet -13 - -10 ja -3 - +1), joista toinen sisältää prosessointikohdan. Kypsän . . proteiinin pituus on 133 aminohappoa ja sen molekyylimas- sa on 15 kilodaltonia. Kypsässä proteiinissa on neljä muuttumattomana säilynyttä osakokonaisuutta (tähteet 15 - 36, 54 - 61, 74 - 91 ja 107 - 118) ja se sisältää • · · : V kaksi mahdollista glykosyloitumiskohtaa /tähteet 15 • · V.: - 17 ja 70 - 72). Ihmisen proteiinissa läsnä olevat :V: molemmat kysteiinitähteet (asemissa 16 ja 84) ovat säily neitä ja niillä saattaa olla oleellinen osuus disulfidi- .V. sillanmuodostuksen kautta tapahtuvassa proteiinin laskos- ♦ ♦ tumisessa.

• · · • Jotta saataisiin osoitetuksi, että tämä ihmisen • * • · · *··♦* cDNA koodittaa funktionaalista proteiinia, joka muis- • · · tuttaa mIL-3:a, Dll cDNA sijoitettiin eukaryoottiseen : ilmentämisvektoriin (pLO, joka sisältää SV40:nen trans- « · · : kriptioyksikön) ja saatiin ilmentämisvektori pLB4, jolla « · transfektoitiin COS 1-solut. COS/pLB4:n kasvuliuoksesta is 102293 (CM) testattiin (1) sen kyky stimuloida ihmisen luuydin-solujen pesäkkeenmuodostusta ja (2) kyky stimuloida ihmisen äkillisen myelooisen leukemian (AML) blasteja.

COS/pLB4-solujen kasvuliuos stimuloi tehokkaasti in vitro ihmisen hematopopoieettisben varhaissoluj en pesäk-keenkasvua, kun myelomonosyyttiset (Vim-2-positiiviset) ja T-lymfosyyttiset (T-3-positiiviset) apusolut oli poistettu. Tulokset osoittavat useiden hematopoieet-tisten polveutumisketjujen varhaissolujen stimuloitumista ja erytröidipesäkkkeiden (BFU-E) alapopulaation stimuloitumista COS/pLB4-solujen kasvuliuoksen vaikutuksesta.

Erillisessä kokeessa luuydin rikastettiin varhaissoluj en suhteen tiheyssentrifugoinnilla ja E-rosetti-sedimentoinnilla poistettiin T-lymfosyytit ja kiinnitart-tumisella poistettiin mononukleaariset fagosyytit ja suoritettiin viljely rikastetussa ravinnealustässä, joka sisälsi vasikan sikiön seerumia. Näissä olosuhteissa sisälsivät COS/pLB4-solujen kasvuliuoksella suoritetulla stimuloinnilla aikaansaatujen pesäkkeiden valtaosa kahta tai useampaa hematopoieettista erilaistumisiin jaa: kaikki sisälsivät makro£ageja, noin puolet • < v.: epäkypsiä blasteja ja/tai epäkypsiä erytroidisoluja f 4 v.: ja/tai.neutrofiilisiä granulosyyttejä ja pieni osa sisälsi lisäksi basofiilisiä tai eosinofiilisiä granu-losyyttejä. Nämä tulokset osoittavat, että ihmisen cDNA-kloonin Dll koodittamalla proteiinilla on useita • · polveutumislinjoja stimuloivia ominaisuuksia, ja että • · se vaikuttaa varhaisessa kehitysvaiheessa oleviin, monipuolisesti kehityskelpoisiin hematopoieettisiin • · · !.* soluihin.

• · · *. Mitä tulee äkillisen myelooisen leukemian (AML) « :.j.: solujen stimulointiin, stimuloitiin viideltä potilaal- :”/· ta saatuja äkillisen myelooisen leukemian (AML) blas teja COS/pLB4-solujen kasvuliuoksella ja vaste määritet- *.i .* 3 tiin mittaamalla H-TdR:n sisäänotto ja pesäkkeiden- • · · muodostus. Kolme näistä viidestä leukemiasolunäyttees- 16 102293 tä reagoi COS/pLB4-solujen kasvuliuokseen kummassakin määrityksessä; eri potilaille saatiin tunnusomaiset annos-vastesuhteet äkillisen myelooisen leukemian (AML) pesäkkeidenmuodostuksessa ja DNA-synteesissä. Vasteet granulosyytti-monosyyttipesäkkeitä stimuloivalle tekijälle (GM-CSF) osoittivat lisää fenotyyppisiä eroja COS/pLB4-solujen kasvuliuokselle reagoivissa leukemioissa.

Nämä tulokset osoittavat, että Dll-cDNA-klooni sisältää täydellisen geneettisen informaation biologisesti aktiiviselle proteiinille, jonka trasnformoituneet COS-solut siirtävät kasvualustaansa. Huolimatta ilmeisestä homologian puutteesta proteiinisekvensseissä ihmisen proteiinin ja mIL-3:n välillä (vain 30 %), proteiinit ovat biologiselta toiminnaltaan verrattavissa toisiinsa. Kumpikin proteiini suuntaa vaikutuksensa eri polveutumislinjojen varhaisessa kehitysvaiheessa oleviin hematopoieettisiin varhaissoluihin. Alhainen homologia aminohappotasolla heijastuu myös alhaisena homologiana koodittavissa nukleotidisekvensseissä. Yllättäen esiintyi kuitenkin melko korkea homologiataso . . luetuksi tulemattomalla 3'-alueella, mikä riitti ihmisen cDNA-kloonin esillesaamiseen.

'·*" Ihmisen DNA:lie suoritettu Southern-analyysi pal- jasti yhden ainoan hybridi s oi tuvan geenin, mikä osoit- « · • ’.· taa, että tämä cDNA ei kuulu läheisesti toisilleen sukua 5.V olevien geenien perheeseen.

:V: Edellä esitettyjen tulosten perusteella ovat kek sinnön tekijät vetäneet sen johtopäätöksen, että Dll:n sisältämä ihmisen cDNA-liitännäinen koodittaa ihmisellä • « · • · esiintyvää mIL-3:n homologia. Keksinnön tekijät ovat • · ♦ päättäneet käyttää Dll-kloonin cDNA:n koodittamasta proteiinista toiminnallista termiä hmulti-CSF johtuen laajasta biologisesta vaikutuksesta ja määrityksissä saaduista tuloksista.

: Hmulti-CSF-cDNA-kloonien tunnistaminen sen perus- • · · teella, että ne hybridisoituivat mIL-3-cDNA:n 3'-pään 102293 alueen kanssa, oli odottamatonta. Homologisia DNA-sek-venssejä löytyy yleensä pääasiassa koodittavalta alueelta, mutta hmulti-CSF:n sekvenssi on pitkälle muuttu^ nut (45 %:n homologia) geenin tällä alueella. 3’-pään erittäin hyvin säilyneen koodittamattoman osakokonaisuuden analyysi osoittaa toistuvien 5 ATTTA-yksiköiden olemassaoloa, jotka ovat säilyneet mIL3-cDNA:ssa (kuva 1).

Hmulti-CSF ja mIL-3 osoittavat huomattavasti vähäisempää proteiinihomologiaa kuin muut hiiren ja ihmisen kasvutekijät tai lymfokiinit, kuten granulosyytti-monosyyttipesäkkeitä stimuloiva tekijä (GM-CSF) (25), interleukiini-2 (25), interleukiini-1 (26) ja interferonit (27 - 29). Kypsän mIL-3:n biologinen aktiivisuus näyttää sisältyvän ensimmäisiin 79 aminohappoon ja ehdottomana vaatimuksena aktiivisuudelle on kysteiinitähteen sijaitseminen asemassa 17 (30). Tämä kysteiinitähde on säilynyt hmulti-CSF:ssä (kuva 1, asema 16) ja sillä saattaa olla oleellinen merkitys proteiinin laskostumisessa. Potentiaalisen glykosyloitumiskohdan esiintyminen tämän kysteiinitähteen ympäri-llä saattaa häiritä disulfi-

( I

:.v disillan muodostusta.

« «

«44 4 I t I t I

C. Hmulti-CSF:n tuottaminen ja formulointi M · t ·* Patentin hakijat tarjoavat edustavan joukon erilai- • · ·.·.· siä ilmentämissysteemejä, jotka kykenevät tuottamaan • · :.V ihmisen IL-3-proteiinia erilaisissa muodoissa: yhdistel- mäproteiineina,kypsinä solunsisäisinä proteiineina ja erittyneinä proteiineina. Patentin hakijoiden tiedon • · .*·*· mukaan ei alalla ole missään saatavissa yhdistelmä- *. DNA-tekniikalla aikaansaatuja ihmisen IL-3-muotoja eikä • ♦ · *"·’ todellakaan mitään ihmisen IL-3:a valmisteena, joka • · *··* olisi vapaa tämän proteiinin yhteydessä normaalisti : esiintyvistä proteiineista. Näin ollen esillä oleva :*·.· keksintö tarjoaa ensimmäistä kertaa ihmisen lL-3-prote- • · iinin, jota voidaan soveltaa hoidollisiin ja diagnostisiin 18 102293 käyttötarkoituksiin.

Ihmisen IL-3:a voidaan tuottaa yhdistelmäproteii-nina, joka sisältää ihmisen IL-3:n aminohappojärjestykselle heterologisia sekvenssejä. "Heterologisella" tarkoitetaan sekvenssiä, jota ei löydy ihmisen IL-3:sta itsestään, ja joka sekvenssi ei ole tälle sukua. Tämä heterologinen sekvenssi voi olla johdettu bakteerin proteiinista, hiivan proteiinista, nisäkkään proteiinista tai kyseessä voi olla mikä tahansa sattumanvaraisesti koodittava sekvenssi, kuten esimerkiksi monikytkijän koodittama sekvenssi. Jäljempänä esitettyjen tulosten perusteella on selvää, että ihmisen IL-3:n N-pään 14 ensimmäistä aminohappoa voidaan korvata heterologisella sekvenssillä ainakin, jos yhdistelmäöproteiinia jatketaan vielä N-pään yli.

Proteiini voidaan saada myös kypsänä solunsisäi-senä proteiinina käyttämällä rakenteita, joissa ATG-aloituskodoni on sijoitettu välittömästi halutun N-pään ylävirtaan. Nämä solunsisäiset proteiinit, olivatpa ne sitten kypsiä tai yhdistelmäproteiineja, voidaan ottaa talteen lysoimalla solut ja puhdistamalla ihmisen

I f I

IL-3 tavanomaisia proteiininpuhdistusmenetelmiä käyttäen.

< <

Proteiinin puhdistus yksinkertaistuu, jos ihmisen :,i,: IL-3 erittyy ravinnealustaan. Jos tuotanto suoritetaan I I · i *#i nisäkässoluissa, joiden kanssa luontainen signaalisekvenssi :Vi on yhteensopiva, voidaan tätä luontaista signaalisekvens- • · ;Y: siä käyttää saamaan aikaan erittyminen ravinnealustaan.

• ·

Bakteeri- tai hiivasysteemeissä voidaan käyttää näiden isäntien kanssa yhteensopivia signaalisekvenssejä, kuten • · · penisillinaasin tai alfa-amylaasin sekvenssiä baktee- • · · reissä tai alfa-tekijän signaalisekvenssiä hiivoissa. Yhdistelmä-DNA-tekniikalla tuotettuna ihmisen « · · IL-3 on vapaa yhteydessään normaalisti olevista prote- . .·. iineista ja se voidaan puhdistaa yhdistelmä-DNA-teknii- • · : kassa käytetyn isännän omista proteiineista ja sen • ·« muista materiaaleista käyttämällä esimerkiksi kromatografisia menetelmiä, geelisuodatusta, ammoniumsulfaattisaos- 19 102293 tusta jne.

Kuten jäljempänä selostetaan, voidaan proteiinia käyttää hoidollisiin ja diagnostisiin tarkoituksiin. Hoitotarkoituksia varten voidaan proteiinit formuloida tavanomaisilla menetelmillä sellaisiksi farmaseuttisiksi koostumuksiksi, joita käytetään proteiinien antamiseen. Sopivia laimennusaineita ovat mm. fysiologinen suolaliuos, Ringer:in liuos jne. Myös muita formulaatioita, mm. kiinteitä formulaatioita (esim. kylmäkuivattuja), voidaan käyttää.

D. Vasta-aineiden valmistus

Yhdistelmä-DNA-tekniikalla aikaansaadun IL-3-prote-iinin tai sen osien saatavuus mahdollistaa sellaisten vasta-aineiden tuotannon, jotka kohdistuvat proteiiniin tai sen osiin, kuten jäljempänä osoitetaan. Tällaiset vasta-aineet ovat hyödyllisiä mm. haluttaessa in vitro osoittaa hIL-3:a tuottavat pesäkkeet, hoitotarkoituksis-sa ja sekä luontaisen että yhdistelmä-DNA-tekniikalla tuotetun hIL-3:n puhdistuksessa.

Käyttökelpoisuuus

I I

V,·' Ihmisen IL-3-cDNA:n koko nukleotidisekvenssiä : : : tai sen osia tai sille läheistä sukua olevia DNA-sekvens- ·*·': sejä voidaan edullisesti käyttää geneettisten poikkea- • · vuuksien havaitsemiseen, joista mainittakoon mm. uudel- • · .V. leenryhmitykset perimässä, restriktiofragmenttien pituuden • · polymorfismit, mutaatiot ja muuntunut geenin ilmentyminen, kun käytetään sellaisia menetelmiä kuin kromosomaalisen • · · M DNA:n analyysi restriktioentsyymejä käyttäen, DNA- ja • · · * RNA-blottaus sekä hybridisointimenetelmät (Maniatis et ai., 1982) ja kaksidimensionaalinen geelielektroforee-si (Fisher ja Lerman, 1983).

• « ·

Esillä olevan keksinnön tarjoama yhdistelmä-DNA-tekniikalla aikaansaatu hmulti-CSF helpottaa sen ihmisen * * hematopoieesissa esittämän roolin, ja erityisesti hmulti- 20 102293 CSF:n ja erilaisten muiden hematopoieettisten kasvutekijöiden (HGF:t) välisen synergian yksityiskohtaista selvittämistä. Hmulti-CSF:ään kohdistuu lisäksi huomattava mielenkiinto siksi, että sillä on käyttöä sellaisten ihmisen sairauksien in vitro-diagnosoinnissa, joissa hematopoieettisillä var-haissoluilla on osuutta, kuten leukemian diganosoinnnis-sa, sekä mahdollisesti sellaisissa hoitotarkoituksissa, joilla tähdätään hematopoieesin laajentamiseen in vivo. Hmulti-CSF:n vaikutus erilaisiin hematopoieettisiin pahanlaatuisuuksiin suhteessa leukemiasolujen loppuvaiheiseen erilaistumiseen vaatii myös selvittämistä. Lisäksi saatetaan hmulti-CSF:ää tarvita ihmisen kantasolujen proliferatii-visen tilan vakiinnuttamiseen geeniterapiamenetelmissä, koska on osoitettu, että mIL-3:a tarvitaan, jotta hiiren kantasolut voidaan onnistuneesti infektoida yhdistelmä-DNA-tekniikalla aikaansaaduilla replikoitumiskyvyttömillä retroviruksilla.

IL-3-proteiinia voidaan myös edullisesti käyttää varhaisten hematopoieettisten prekursorisolujen havaitsemiseen in vitro-viljelmissä (Wagemaker ja Visser, 1980; Metcalf et ai., 1982; Merchav ja Wagemaker, 1984, Metcalf, : V: 1986).

IL-3-proteiinia ja sen variantteja voidaan vielä , ,·. käyttää hematopoieettisten kantasolujen monistamiseen

< I

.1'^ in vitro, jolloin mukana mahdollisesti voidaan käyttää • · *. \ muita kasvutekijöitä, luuydinsiirroissa ja kantasolujen • · · *;*·* geneettisessä manipuloinnissa (Lowenberg ja Dicke, 1977; • · · *·*·* Wagemaker ja Petem, 1978; Lemischka et ai., 1986).

IL-3-proteiinia voidaan myös käyttää pahanlaatuis- • · ten hematopoieettisten solujen vasteen määrittämiseen • · · • · in vitro-kokeilla (Touw ja Lowenberg, 1985; Griffin . .·. et ai., 1986; Griffin ja Lowenberg, 1986).

• · «

Edelleen voidaan IL-3-proteiinia käyttää jäljellä • · olevien leukemiasolujen havaitsemiseen in vitro-menetel-millä (Touw ja Lowenberg, 1986; Griffin et ai., 1986; :.‘i Griffin ja Lowenberg, 1986).

2i 102293

Edelleen voidaan IL-3-proteiinia käyttää pahanlaatuisten ja ei-pahanlaatuisten sairauksien hoitoon ja ehkäisyyn in vivo, joko yksin tai yhdessä muiden aineiden kanssa niin, että tietty hematopoieettisessa systeemissä saavutettu vaste voi johtaa kliiniseen etuun.

Näitä sovellutuksia ovat mm.

- infektioista, kuten AIDS:ista, aiheutuvat sytopeniat ja/tai immunosuppressio, - kemoterapiasta ja/tai säteilytyksestä aiheutuvat sytopeniat, luusairaudet,kuten luunmurtumat ja osteoporoosi, - yleisanestesiatoimenpiteistä johtuvat immuunipuutostilat, toipuminen luuydinsiirrosta, rokotteiden lisät sekä infektioiden lisähoidot.

Kloonattua ihmisen IL-3-DNA-sekvenssiä tai sille läheistä sukua olevaa DNA:ta voidaan käyttää geeniterapiassa normaalin IL-3-geenin poikkeamien korjaamiseen.

Jotta edellä selostettuja analyysejä voitaisiin helpottaa, tarvitaan suuri määrä ihmisen IL-3:a. Helpoin tapa saada riittäviä määriä proteiinia on tuottaa sitä mikro-organismeilla, erityisesti hiivoilla, bakteereilla ,··, tai homeilla, esimerkiksi Saccharomyces-, Kluyveromyces-, ! Aspergillus-, Streptomyces-, Bacillus- ja E. coli- suvuil- ^‘1 la. Ammattitaitoiset ihmiset voivat tämän keksinnön • · · ·* avulla tuottaa tätä proteiinia myös nisäkässoluilla • · · *·*·* tai muilla eukaryoottisilla systeemeillä, kuten C127- • · soluilla ja Spodoptera-soluilla. Esillä oleva keksintö kattaa myös nämä mahdollisuudet.

• ·

Sen valaisemiseksi, kuinka saadaan aikaan eläviä • « · V : soluja, jotka tuottavat ihmisen IL-3-proteiinia ilraentä- . mällä hIL-3-cDNA:ta, rakennettiin joukko plasmideja ja ne siirrettiin E. coli-, B. subtilis-, B. lichenifor-mis-, S. cerevisiae-, K. lactis- ja Cl27-soluihin. Näitä isäntäkantoja käyttämällä saatiin aikaan yhdistelmä-DNA-tekniikalla aikaansaadun ihmisen IL-3:n tuotanto.

22 102293

Tuotteiden kyky stimuloida ihmisen akuutin myelooisen leukemian blasteja testattiin kuten edellä on selostettu COS/pLB4-solujen kasvuliuoksen osalta. Näistä kokeista ilmeni, että tuotetut proteiinit olivat biologisesti aktiivisia.

Keksintöä valaistaan, mutta ei rajoiteta seuraavil-la esimerkeillä.

Esimerkki 1

Ihmisen multi-CSF:ää (hmulti-CSF) koodittavan cDNA:n esiinsaaminen 12-0-tetradekanoyyliforbol-13-asetaatilla (TPA:11a) (5 ng/ml) ja konkanavaliini Ailia (Con A) (10 ^g/ml) stimuloidut ihmisen leukosyytit tuottivat huomattavia määriä hematopoieettisia kasvutekijöitä (HGF:iä), kun mittaus suoritettiin hiiren kantasolujen proliferaatiomäärityksellä ja erilaisilla muilla pesäkemäärityksillä. Solut otettiin talteen 24 tunnin kuluttua stimuloinnista, koska mRNAm tuotanto on usein ohimenevää, kun ensin on stimuloitu forboliestereillä ja lesitiineillä. Jo 24 tunnin kuluttua voitiin hematopoieettisia kasvutekijöitä helposti havaita solujen kasvuliuoksesta. mRNAin valmistus

Solut otettiin talteen, pestiin fysiologisella • · suolaliuoksella ja homogenoitiin guanidiniumisotiosyanaat- • · .·.·. tiliuoksessa (36). RNA pelletoitiin keesiumkloridityynyn • · · • · läpi. Eri mRNA-läatujen valintaan käytettiin oligo(dT)- , selluloosakromatografiaa (36).

« · · • · • · · • · · *\ ’ cDNAin synteesi cDNA syntetisoitiin oleellisesti ottaen siten, kuin Gubleriin ja Hoffmaniin julkaisussa (37) on selos- : tettu käyttämällä alukkeena oligo(dT)itä ja entsyyminä « « : AMV-käänteiskopioijaa. Toinen säie syntetisoitiin käyt- 23 1 0 2 2 9 3 tämällä RNaasia H ja E. colin DNA-polymeraasi I:tä.

Aukot suljettiin T4 DNA-ligaasin avulla ja päät tehtiin tasaisiksi T4 DNA-polymeraasilla. Sisäisten EcoRI-rest-riktiokohtiewn suojaamiseksi cDNA metyloitiin EcoRI-mety-laasin avulla. Tämän jälkeen cDNA:han liitettiin fosfo-ryloidut EcoRI-kytkijät käyttämällä T4 DNA-ligaasia.

Kun oli katkaistu EcoRI:llä, ylimääräiset kytkijät poistettiin Sepharose CL-4B-kromatografiällä. Pylvään välisijatilavuudessa saadun materiaalin koko oli yli 250 ep ja se käytettiin kirjastojen rakentamiseen.

Fjiaai-cDNA-kirjaston rakentaminen cDNA liitettiin lambda-gtlO-faagin käsivarsiin (20) ja pakattiin käyttämällä kaupallisia pakkaamisuutteitä (Gigapack, Vector Cloning Systems). Yhdistelmäfaageja lisättiin E. coli C600 hfl:ssä.

Faaqikirjaston seulonta

Kustakin 1 - 5000 plakkia sisältävästä maljasta tehtiin standardimenetelmiä noudattaen kaksi nitrosellu-. . loosakalvojäljennöstä. Tämän jälkeen kalvot hybridisoi- ; ; tiin radioaktiivisesti leimatun mIL-3-koettimen kanssa, joka oli peräisin mIL-3-cDNA:n Hindlll-Xbal-fragmentista, tai täydellisen mlL-3-cDNA-kloonin kanssa, joka oli ·· · : .* leimattu radioaktiivisesti sattumanvaraisia alukkeita • · käyttämällä. mIL-3-cDNA-klooni (pLIOI) eristettiin :V; WEHI-3B-cDNA-kirjastosta. WEHI-3B-mRNA eristettiin guanidinium-isotiosyanaatti-CsCl-menetelmällä, frakti- :Y: oitiin koon mukaan sakkaroosigradientissa ja injektoitiin ♦ · .*·*; Xenopus laevis-varhaismunasoluihin. Niitä RNA-jakeita, *. jotka indusoivat varhaismunasolut tuottamaan tekijää, joka kykeni tukemaan hiiren kantasolujen proliferaatio-ta, käytettiin cDNA:n syntetisoitiin edellä kuvatulla : tavalla, cDNA hännitettiin dC-tähteillä ja sijoitettiin plasmidin pUC9 Pstl-kohtaan. mIL-3-kloonit tunnistettiin käyttämällä synteettisiä oligonukleotidejä (jul- 24 102293 kaistusta mIL-3-sekvenssistä, 11). Plasmidin pLIOl sisältämä liitännäinen puhdistettiin polyakryyliamidigee-lissä ja sillä seulottiin ihmisen cDNA-kirjasto. Koetin-DNA leimattiin käyttämällä satunnaisten alukkeiden menetelmää (38). Tällä tavalla saatiin tunnistetuksi neljä kloonia, mm. faagi Dll.

cDNA-kloonien sekventointi

Yhdistelmä-DNA-tekniikalla aikaansaatuja faageja kasvatettiin suuressa mittakaavassa ja ne puhdistettiin, cDNA-liitännäiset poistettiin faagin käsivarsista EcoRI-katkaisulla ja puhdistettiin polyakryyliamidigeeIissä. Puhdistetut fragmentit liitettiin Ml3mpl8:aan ja EcoRIrllä katkaistuun pTZ18R-DNA:han ja käytettiin E. coli JM109:n transformointiin. Yksisäikeinen DNA valmistettiin ja sekventoitiin tavanomaisilla menetelmillä (39). Sekvens-situlokset analysoitiin erilaisilla tietokoneohjelmilla (40 - 43).

Faagin Dll sisältämälle liitännäiselle saatu sekvenssi on esitetty kuvassa 1. Tämä 910 ep:n sekvenssi sisältää hmulti-CSF:n koko koodittavan alueen ja sen signaalisekvenssin ja osoittaa korkeaa homologiaa hiiren kloonin pLIOl kanssa luetuksi tulemattomalla 3’-alueella.

; Koodittavan alueen ylävirrassa on homologia suhteelliseen « « < ti rajoitetumpi. Kuten jo edellä on mainittu, on prote- [·.·. iinissa oletettu 19 aminohapon signaalisekvenssi, jota 1°·' seuraa 133 aminohapon pituinen kypsä proteiini, joka • · · sisältää kaksi glykosyloitumiskohtaa (15 - 17 ja 70 - 72) ja kaksi kysteiinitähdettä asemissa 16 ja 84.

• · I

*;]·* Päätelty aminohappojärjestys on sama kuin Yang, * Y-C et ai:n (supra) ilmoittama perimä-DNA:n kooditta- : ma lukuunottamatta yhtä aminohappoa, joka on oletetun kypsän proteiinin asemassa 8; Yangin DNA koodittaa Ser-tähdettä, mutta tässä tarkoitettu cDNA koodittaa Pro-tähdettä.

• · · *· ” Faagissa Dll saatua intronitonta sekvenssiä voi- 25 102293 daan käyttää ilmentämiseen prokaryoottisissa sekä euka-ryoottisissa systeemeissä, kuten jäljempänä selostetaan.

Esimerkki 2

Ilmentäminen nisäkässoluissa A. Vektorin pLB4 rakentaminen eukaryooteissa ilmentämistä varten

Faagi Dll (sisälsi pisimmän cDNA-liitännäisen) katkaistiin HindIII:lla ja BglII:lla ja alakloonattiin plasmidiin pTl (pTZ18R:n johdannainen, joka sisältää eräitä lisärestriktiokohtia monikytkijässä, ks. esimerkki 3A). Kloonit, joissa oli faagifragmentin sisältävä cDNA-liitännäinen, tunnistettiin restriktioanalyysillä. cDNA-liitännäinen poistettiin tästä plasmidista suorittamalla osittainen katkaisu EcoRI:llä ja puhdistettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Oikea fragmentti sijoitettiin eukaryoottien ilmentämisvektoriin (pLO), SV40-transkriptioyksikköön.

Plasmidi pLO sisältää: plasmidin pBR322 EcoRI

(täytetty) - PstI-fragmentin (1 - 755), plasmidin pBR329 Pstl-Aval-fragmentin (756 - 1849), Aval-PvuII-adapterin (1850 - 1868), SV40:nen (promoottori) PvuII-Hindlll(täy-tetty)-fragmentin (1869 - 2211), PvuII-BamHI-adapterin, joka sisältää ainoan EcoRI-kohdan, (2211 - 2251), SV40: :***: nen MboI-"silmukoitumisfragmentin" (2252 - 2861), SV40: :Y: nen BclI-BamHI(täytetty)-"poly A-fragmentin" (2862 - • V. 3098), SV40:nen PvuII-Hindlll-promoottorifragmentin (3099 - 3440), Hindlll-BamHI Eco gpt-geenin (3441 -4501), SV40:nen MboI-"silmukoitumisfragmentin" (4502 • · · l.'.' - 5111) ja SV40:nen BclI-BamHI(täytetty)-"poly A-frag- *. mentin" (5112 - 5348).

:.i.: Eco gpt-transkriptioyksiköllä ei ole merkitystä : /· proteiinien ohimenevässä ilmentämisessä COS 1-soluissa.

. Näin saadulle hmulti-CSF:n ilmentämisplasmidille annet- • « » tiin nimeksi pLB4 ja se puhdistettiin CsCl:n avulla.

• * · Tämä plasmidi talletettiin E. colissa CBS-kokoelmiin 26 102293 (Centraal Bureau of Schimmelcultures, Baarn, Alankomaat) Budapestin sopimuksen mukaisesti 12. joulukuuta 1986 numerolla CBS 568.86. Rakenne on esitetty kuvassa 2.

B. Hmulti-CSF:n ilmentäminen COS 1-soluissa ja biologiset määritykset

Plasmidin pLB4 DNA:11a transfektoitiin COS 1-solut käyttämällä kalsiumfosfaattiyhteissaostusmenetelmää (45). Soluja viljeltiin 48 - 72 tuntia alfa-alustassa, joka sisälsi 10 % vasikan sikiön seerumia. Kasvatusliuos otettiin talteen, suodatettiin ja siitä määritettiin biologinen aktiivisuus. Ihmisen luuytimen varhaissolujen pe-säkemääritykset ja äkillisen myelooisen leukemian blas-tien pesäke- ja proliferaatiomääritykset suoritettiin seuraavalla tavalla. Luuydintä saatiin hematologisesti normaaleilta aikuisilta vapaaehtoisilta suorittamalla suoliluunharjuntakainen punktio, kun potilas oli ensin antanut suostumuksensa saamiensa tietojen perusteella. Yksitumaiset solut erotettiin tiheysgradienttisentrifu-goinnilla Ficoll-gradientissa (Nijegaard and Co.,

Oslo, Norja), pestiin ja uudelleensuspendoitiin Hankiin tasapainotettuun suolaliuokseen (HBSS). Tämän jälkeen poistettiin myeloidisolut ja T-lymfosyytit. Tätä : tarkoitusta varten luuydinsolut lysoitiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu monoklonaalisten vasta-aineiden OKT-3 • · « · (CD3; Ortho, Ravitan, N.Y.) ja vim 2:n (myelo- • · · monosyyttisiä soluja, 46) kanssa saturoivina konsentraa- » · · tioina kanin komplementin läsnäollessa (40 %; 30 minuut- . . tia, 25°C) vakiintuneita menetelmiä noudattaen (47).

• · *·[·' Solut pestiin kahdesti HBSS-liuoksessa, uudelleensuspen- • · · V * doitiin Iscovein muunnettuun Dulbeccoin alustaan (IMDM) : ja viljeltiin Fauseriin ja Messneriin (16) autologisen plasman läsnäollessa edellä kuvatulla tavalla (48) solu-konsentraatiossa 1,5 - 3 x 10 /ml. Kasvua stimuloi-viksi aktiivisuuksiksi lisättiin erytropoietiinia 1 p · Φ ’ ” yksikkö/ml (lampaat, vaihe III, Connaught, Willowdale,

Kanada) ja COS/pLB4-solujen kasvuliuosta. Suorana 27 102293 vertailuna COS/pLB4-solujen kasvuliuoksen suhteen on myös annettu tulokset standardiviljelmistä, joissa on käytetty fytohemagglutiniinilla stimuloitujen leukosyyttien kasvuliuosta (PH-LCM). 60 % pesäkkeistä nypittiin ja tunnistettiin mikroskooppisella analyysillä. Kasvuliuos, joka oli saatu COS-soluista, joiden transfek-tointivektori ei sisältänyt liitännäistä (pLO), ei sinänsä stimuloinut pesäkkeidenmuodostusta.

Saadut tulokset on esitetty kuvassa 3. Erytroidi-pesäkkeiden (BFU-E), granulosyytti-makrofagipesäkkeiden (CFU-GM), granulosyyttipesäkkeiden (CFU-G), eosinofiili-pesäkkeiden (CFU-Eo), makrofagipesäkkeiden (CFU-M) ja sekapesäkkeiden (CFU-MIX) lukumäärien keskiarvot (-keskihajonnat) on esitettu kahdesta viljelmästä saatuina, kun stimulointi suoritettiin asteittain kohoavilla COS/ pLB4-solujen kasvuliuoksen tilavuuksilla.

Äkillisen myelooisen leukemian proliferaation indusointi (ks. kuva 4) Äkillisen myelooisen leukemian blastit puhdistettiin käyttämällä naudan albumiinin (BSA) tiheysgradient-tia. Jäljelle jääneet T-lymfosyytit poistettiin äkillisen myelooisen leukemian solunäytteistä E-rosettisedimen-toinnilla (17, 49, 50). Äkillistä myelooista leukemiaa (AML) sairastavan (potilas 1) pesäkkeenmuodostus • · määritettiin vakiintuneella PHA-leukosyyttisyöjäsolusys- • te I ! teemillä (PHA l.f) sekä lisäksi tämän tekniikan muunne-

i · I

tulla versiolla, jossa leukosyytit korvattiin COS/pLB4-solujen kasvuliuoksella, mikä mahdollisti sen pesäkkeitä *·'·* stimuloivan aktiivisuuden määrityksen (17, 18, 49, 50), • · · V · kuten kuvasta 4A voidaan havaita. Kaikki kokeet suoritet- ; tiin kolmena kappaleena. AML:n blastien (potilas .···. 2) DNA-synteesi määritettiin tymidiinin sisäänottona, kuten julkaisussa (51) on kuvattu, ja saadut tulokset

| · I

·:·* on esitetty kuvassa 4B. Kummassakin määrityksessä ilmeni riippuvuus lisätystä COS/pLB4-solujen kasvuliuoksen 28 102293 määrästä· Kontrolli-COS-kasvuliuoksen lisääminen ei kummassakaan määrityksessä vaikuttanut AML-solujen proliferaatioon.

C. Vektorin PLB4/BPV rakentaminen eukaryooteissa tapahtuvaa ilmentämistä varten

Jotta saataisiin aikaan stabiileja solulinjoja, jotka ilmentävät ihmisen IL-3:a, Cl27-solut (ATCC CRL 1616) transfektoitiin plasmidin pLB4 johdannaisella.

Tämä johdannainen rakennettiin sijoittamalla koko BPV-1-perimä (69) plasmidiin pLB4 seuraavalla tavalla. BPV-l:n BamHI-fragmentti leikattiin irti vektorista pdBPV-MMTneo (342-12) (79). BamHI-epätasaiset pää täytettiin käyttämällä Klenow-polymeraasia. Sitten vektori pLB4 katkaistiin ainoasta EcoRV-kohdastaan, joka on Eco gpt-geenin sisällä. Sitten tasapäiseksi tehty BPV-l-fragmentti kloonattiin EcoRVrllä katkaistuun pLB4:ään, jolloin saatiin vektori pLB4/BPV, joka kykenee replikoitumaan C127-soluissa. C127-solut transfektoitiin plasmidilla pLB4/BPV käyttämällä kalsiumfosfaattisaostusmenetelmää (45). Transfektoituja soluja kasvatettiin 16 vuorokautta, jonka jälkeen pesäkkeet poimittiin viljelymaljoista.

Näin saatiin vakiinnutetuiksi useita riippumattomia : solulinjoja. pLB4/BPV-vektori näyttää pysyvän stabii- « < i*·*. listi yllä solujen sisällä, kun arviointi suoritettiin • ·

Southern-blottauksella useiden solulinjojen Hirt-uutteis- • · · ta (71). Kasvuliuoksista testattiin IL-3-aktiivisuus • · « käyttämällä äkillisen myelooisen leukemian (AML) proli- . . feraatiomääritystä. Stabiilit solulinjat tuottavat • · · *·*·* aktiivista ihmisen IL-3:a.

··· • · · • · · : Esimerkki 3 I « «

Ilmentämisvektorien rakentaminen E. colissa tapahtuvaa • « · ilmentämistä varten • · · i · ·

• I I

.·. : A. Plasmidin pGB/IL-301 rakentaminen (ks. kuvat • I · 5, 6, 7 ja 8) 29 102293

Vektorien rakentamiseksi E. colissa tapahtuvaa ilmentämistä varten suoritettiin seuraavat muuntotoimen-piteet vakiintuneita menetelmiä käyttäen (36).

1. Plasmidin pLB4 3'-pään koodittamattomat sekvenssit, jotka olivat Aval-kohdan (asema 541) ja Xhol-kohdan (asema 856) välissä poistettiin liittämällä DNA-fragmentit yhteen, kun epätasaiset päät oli ensin täytetty Klenow-entsyymin avulla (kuva 5).

2. Jotta hmulti-CSF-liitännäinen saataisiin sijoitetuksi bakteerin ilmentämisvektoriin, suoritettiin seuraavat toimenpiteet. pLHl-vektori katkaistiin Avail: 11a ja sisempänä olevat päät täytettiin Klenow-polyme-raasin avulla. Kun DNA:hän oli liitetty Bglll-kytkijä (CAGATCTG), se katkaistiin BglII:lla ja BamHI:llä. Bglll-BamHI-hmulti-CSF-fragmentti puhdistettiin polyakryyliami-digeelissä ja alakloonattiin plasmidin pTl Bgll-kohtaan, joka on plasmidin pTZ18R (Pharmacia) johdannainen niin, että muuntaminen on suoritettu monikloonausalueella (ks. kuva 6). Näin saatiin kaksi kloonia, joissa liitännäinen oli vastakkaisissa suunnissa IacZ-promoottoriin nähden (ks. kuva 5). Näiden kahden kloonin sisältämät : : liitännäiset eristettiin polyakryyliamidigeelissä sen jälkeen, kun oli ensin katkaistu BglII:lla ja EcoRV:llä, . ja tämän jälkeen suoritettiin liittäminen BglII:lla « 4 < ja Hindu:11a katkaistuun plasmidiin pTl. Bglll-kytki- • 9 ! jän ja hmulti-CSF-DNA:n välinen liitoskohta varmistet- t · · • · ] \ tiin sekvenssianalyysillä ja analyysi osoitti, että 9 9 9 *·’·’ kytkijä oli liittynyt Avail-kohtaan, joka sijaitsi cDNA- kloonin nukleotidissa 1 (tämä Avall-kohta oli syntynyt • · :.V liitettäessä EcoRI-kytkijä cDNA-molekyyliin). Koska • · · ·.· · tämä rakenne (pGB/IL-300) ei ollut vaiheistuksessa IacZ- . .·. proteiinin kanssa, Bglll-EcoRV-liitännäinen alakloonat- .···. tiin BamHI:llä ja HindII:lla katkaistuun plasmidiin *·* pUC8 (52). Näin saadusta rakenteesta (pGB/IL-301, ks.

kuvat 5, 7 ja 8) testattiin IacZ/hmulti-CSF-fuusioprote- • « ·.'·: iinin tuotto.

30 1 0 2 2 9 3 B. Plasmidien pGB/IL-302, pGB/IL-303, pGB/IL-304 ja pGB/IL-305 rakentaminen (kuvat 5, 7 ja 8).

Useita emästen muutoksia tuotiin fuusioproteiinien N-pään aluetta koodittavaan sekvenssiin sijoittamalla synteettisiä oligonukleotideja plasmidiin pGB/IL-300.

Uudet ilmentämisvektorit, nimeltään pGB/IL-302, pGB/IL-303 ja pGB/IL-304 rakennettiin seuraavalla tavalla: Plasmi- din pGB/IL-300 Hindll-Hindlll-fragmentti eristettiin agaroosigeelissä ja liitettiin synteettisiin oligonukleo-tideihin, jotka kattoivat hmulti-CSF:n nukleotidit 99 - 137 ja 5'-päässä olevan Sallin tunnistamissekvenssin, ja tuote sijoitettiin Sällillä ja Hindlllilla katkaistuun plasmidiin pTZ18R. Useiden kloonien sekvenssi analysoitiin. Useita emästen muutoksia oli todella saatu aikaan, joiden tuloksena oli muutoksia hmulti-CSF-proteiinissa. Useiden kloonien liitännäiset siirrettiin plasmidiin pUC8 IacZ-fuusioproteiinin ilmentämistä varten (pGB/IL-302, pGB/IL-303). Klooni pGB/IL-304 saatettiin vaiheistukseen IacZin kanssa täyttämällä sisempänä olevat päät Klenow-entsyymin avulla ja liittämällä mukaan Sali-kohta. Rakenne varmistettiin Pvul- ; katkaisulla. Useista klooneista puuttui synteettinen oligonukleotidi ja niiden havaittiin liittyneen vaiheis-; tuksessa IacZ-proteiiniin. Yhdelle näistä klooneista

III

annettiin nimeksi pGB/IL-305.

• · • · • · • · · • · · C. Plasmidin pGB/IL-306 rakentaminen (ks. kuvat 5, 7 ja 8) .·.·. Ilmentämisvektori, joka koodittaa proteiinia, • t « josta puuttuvat IacZin N-pään aminohapot, valmistettiin

• · I

plasmidista pGB/IL-300 silmukkadeleetiolla, kuten jul-:.i.: kaisussa (53) on esitetty. Synteettinen oligonukleotidi • i · sisälsi 22 nukleotidia pTZm IacZ-geenin ylävirrassa . .·. ATG-aloituskodoni mukaanluettuna sekä kypsää IL-3:a koodit- tavat ensimmäiset 24 nukleotidia. Tälle plasmidille • · 9 • · 31 102293 annettiin nimeksi pGB/IL-306 (kuvat 5, 7 ja 8).

E. coli-kannat, jotka sisälsivät vastaavasti plas-midin pGB/IL-300, pGB/IL-301 ja pGB/IL-302, talletettiin CBS-kokoelmiin 13. heinäkuuta 1987, joissa niille annettiin vastaavasti numerot CBS 377.87, CBS 379.87 ja CBS 378.87.

Kuva 8 esittää rakennettujen plasmidien fuusioalueiden sekvenssejä. Kunkin kloonin sekvenssi on annettu lacZ-pro-teiinia koodittavan alueen alusta joko plasmidissa pUC8 tai pTZ18R (pienet kirjaimet) ja hmulti-CSF:ää koodit-tavalta alueelta (isot kirjaimet) asemassa 158 olevaan Clal-kohtaan asti. Hmulti-CSF:n DNA-sekvenssissä olevat mutaatiot on alleviivattu ja niistä seuraa seuraavat muutokset: trp3 —»· arg33 (pGB/IL-302); leu^—»-pro^ ja trp1^-*- arg13 (pGB/IL-303); met-—*»thr3 ja hiljainen muutos (pGB/IL-304).

Prioriteettipatenttihakemuksessa EP 87201322.2, jätetty virastoon 13. heinäkuuta 1987, on näistä plas-mideista käytetty eri nimityksiä: pGB/IL-300 = pT-hIL3; pGB/IL-301 = pUC/hmulti; pBG/IL-302 = pUC/hmultiillA; ! ! pGB/IL-303 = pUC/hmultiAlB; ‘ pGB/IL-304 = pUC/hmultiAlC; pGB/IL-305 = pUC/hmulti212; pGB/IL-306 = pTZ/hmulti.

• ♦ ♦ • · · • · • · D. LacZ/hmulti-CSF-fuusioproteiinien ja kypsän hmulti-CSF:n ilmentäminen E. colissa • · • · · *·*.* E. coli-kantoja (JM 109), joissa oli eri ilmentämis- ·· · Σ vektori, kasvatettiin LB-ravinnealustassa, joka sisälsi ; 50 pq/ml ampisilliiniä, 37°C:ssa, kunnes optinen tiheys .···. saavutti arvon 0,5, kun mittaus suoritettiin 550 nm:ssä.

·. Sitten viljelmiin lisättiin IPTG:tä (isopropyyli-beeta- ’·:·* D-tiogalaktosidi, Pharmacia) niin, että sen lopulliseksi :. *: pitoisuudeksi tuli 1 mmol/1, ja inkubointia jatkettiin 32 102293 3-4 tuntia.

Plasmideilla pGB/IL-306 ja pGB/IL-302 transformoitiin myös E. coli DH1 (villityyppinen IacZ-operoni).

Näitä kantoja kasvatettiin LB-alustassa tai 2xTY-alustassa, joka sisälsi 50 pg/ml ampisilliiniä, 37°C:ssa 16 tuntia.

Bakteerit sentrifugoitiin talteen ja sonikoitiin puskurissa, joka sisälsi 0,1 M Tris/HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 0,2 % Nonidet P40 (NP-40) ja 1 mM fenyylimetyyli-sulfonyylifluoridia (PMSF), ja sen jälkeen sentrifugoitiin 30 minuuttia kiihtyvyydellä 20 000 x g. Kun pelletille ja emäliuoksen jakeille suoritettiin polyakryyli-amidigeelielektroforeesi, havaittiin, että suurin osa hmulti-CSF-proteiineista pysyi bakteerien sisällä liukenemattomassa muodossa.

Pelletti uutettiin uudestaan puskurilla, joka sisälsi 0,5 % NP-40, ja lopuksi liuotettiin liuokseen,

jossa oli 8 M ureaa, 0,1 M Tris/HCl, pH 8,0, ja 5 mM

ditiotreitolia. Näin saatiin aikaan fuusioproteiinien hyvä puhdistuminen (kuva 9).

Kuten kuvasta ilmenee, eristettiin plasmidin pGB/IL-301 tai pGB/IL-302 sisältävistä bakteereista (E. coli) inkluusiohiukkasia. Kaistat 1 edustavat 0,2 V·' % NP-40 sisältävää emäliuosta (näyte vastaa 0,1 ml alku- « > V.1 peräistä bakteeriviljelmää). Kaistat 2 edustavat 0,5 !,·.' % NP-40 sisältävää emäliuosta (0,2 ml) ja kaistat 3 Γ2: pellettiä, joka on liuotettu 8 M ureaa sisältävään :V: puskuriin (A: 0,05 ml; B: 0,2 ml). Proteiinit erotet- • · ·':1· tiin 13,5-prosenttisessa SDS-polyakryyliamidigeelissä • c ja värjättiin Coomassie Brilliant Blue-värillä. Merkki-proteiinien (kaista M) molekyylimassat (kd) on merkitty • · « oikealle. Ihmisen multi-CSF-fuusioproteiinit on osoi- • · · *. tettu nuolilla. Plasmidin pGB/IL-301 koodittaman fuu- sioproteiinin molekyylimassa on odotetusti noin 20 kd t n !,,· ja plasmidin pGB/IL-302 tuottaman noin 16 kd.

1 · t · ·

I · I

• 1 • 1 1 2 • · · • · 33 102293 E. Bakteereilla tuotettujen hmulti-CSF-valmisteiden biologisen aktiivisuuden määrittäminen

Bakteerilla tuotetut proteiinivalmisteet laimennettiin alfa-ravinnealustaan, joka sisälsi 1 % naudan seerumin albumiinia, steriloitiin suodattamalla ja tutkittiin äkillisen myelooisen leukemian (ALM) blastien proli-feraatiomäärityksellä. Laimennettuja näytteitä lisättiin puhdistettuihin emosoluihin ja viljeltiin 4 vuorokautta. DNA:n syntetisoituminen mitattiin käyttämällä ^H-tymidiiniä, kuten julkaisussa (51) on selostettu.

Yksi yksikkö per ml määritellään siksi hmulti-CSF-mää-räksi, joka tarvitaan saamaan aikaan puolet AML-blastien maksimaalisesta proliferaatiosta. Kuva 10 esittää tätä titrausta. Plasmidin pGB/IL-302 sisältävistä bakteereista urealla uutetusta proteiinivalmisteesta tehtiin useita laimennoksia ja niiden AML-blastien proli-feraatiota stimuloiva vaikutus määritettiin käyttämällä ^H-tymidiiniä. Tämän proteiinivalmisteen fuusioproteii-nikonsentraatio oli 33 pg/ml. Esitetyn titrausjcäyrän perusteella oli tämän valmisteen aktiivisuus 16 000 yksikköä/ml.

Bakteerin tuottaman fuusioproteiinin määrä valmisteissa arvioitiin polyakryyliamidigeelielektroforeesin perusteella ja sitä käytettiin ominaisaktiivisuuksien i ,i‘. laskemiseen.

• · · • · *, 1 Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: • · · • · · ♦ · « « • · · • « · « «

• I

• · · • · · • · • · · • · · • · · « « « i « I 1 «Il 4 I « « «

4 I

« · a 4 « · · • · · »Il · « · « « «a • · 34 102293

Taulukko 1

Bakteereissa tuotettujen hmulti-CSF-valmisteiden biologinen aktiivisuus _3

Mr (xlO ) pg prote- yksik- ominaisak-lacZ/hraulti iinia per köä tiivisuus (1) ml per ml yksikköä (2) (3) per mg IL-3:a pGB/IL-301 20 20 45 4 500 pGB/IL-302/303 16 5 2400 480 000 pGB/IL-304 18 ND(4) 18 pGB/IL-305 16 1 300 300 000

pGB/IL-306 15 ND 70 ND

1. Likimääräiset molekyylimassat on arvioitu fuusioproteii-nien DNA-sekvenssien perusteella (kuva 8).

2. IL-3-konsentraatiot arvioitiin SDS-polyakryyliamidi-geeldstä ja laskettiin lähtöviljelmän millilitraa kohti.

3. Ureaan liuotetun proteiinin aktiivisuus mitattiin AML:n proliferaatiomäärityksellä ja se on ilmoitettu lähtöviljelmän millilitraa kohti.

4. Ei määritetty.

. #. Näistä tuloksista voitiin vetää se johtopäätös, että E. colissa fuusioproteiinina ilmentynyt ihmisen • · multi-CSF oli biologisesti aktiivisessa muodossa. Tulok-

• I

set osoittavat, että fuusioproteiinin N-päähän aiheu-tetut muutokset saattavat vaikuttaa näiden proteiinien • « · *..I ominaisaktiivisuuteen.

• · · »

Esimerkki 4 :· Sellaisten vasta-ainevalmisteiden valmistus, jotka kykene- . vät immunospesifiseen reaktioon ihmisen IL-3-proteiinin ·" kanssa

I I f — I I

A. Kanissa tuotettu polyklonaalinen ihmisen IL-3:een kohdistuva vastaseerumi 35 102293

Preparatiivinen geeli valmistettiin plasmidin pGB/IL-301 sisältävän E. colin lysaatista. 20 kd:n vyöhyke, jossa oli IL-3-fuusioproteiini, leikattiin irti, hienonnettiin suolaliuoksessa huhmaressa ja emulgoitiin suhteessa 1:1 täydelliseen Freund:in adjuvanttiin, joka sisälsi 1 mg Mycobacterium tuberculosis H37RA:ta per ml. Uuden Seelannin valkoiset kanit (spf) immunisoitiin 1 ml:11a tätä emulsiota (- 100 ^g IL-3-fuusio-proteiinia), joka jaettiin 5 injektointikohdan kesken (2 x intramuskulaarisesti pakaroihin, 3 x subkutaanisti selkään). Samaa antigeeniä epätäydellisessä Freund:in adjuvantissa annettiin tehosteinjektioina viikoilla 2, 4 ja 6. Seerumia otettiin talteen viikolla 8 laski-mopunktiolla korvasta.

Yksi tilavuus seerumia absorboitiin 9 tilavuudella sonikoitua, plasmidin UC8 sisältävää E. colia (yön yli 4°C:ssa), jotta epäspesifiset vasta-aineet saatiin poistetuiksi. IL-3-rakenteet, jotka oli tuotettu E. colissa, B. licheniformiksessa, B. subtiliksessa, S. cerevisiaes-sa ja K. lactiksessa, immunoblotattiin adsorboidun seerumin kanssa, joka oli laimennettu suhteessa 1: 6500, jolloin kaikki osoittivat immunospesifistä reaktiota.

Eräät näistä tuloksista on esitetty kuvassa 11. Proteiinit eristettiin geeniteknologialla aikaansaaduis-. . ta isännistä, kuten edellä on selostettu, ja erotettiin 13,5-prosenttisessa polyakryyliamidigeelissä ja blotat- • · tiin nitroselluloosakalvolle. Kaista 1: E. coli, joka • * sisälsi plasmidin pTZ18R (kontrolli); kaista 2: pGB/ IL-301; kaista 3: pGB/IL-301; kaista 4: pGB/IL-302; kaista 5: pUC19 (kontrolli); kaista 6: pGB/IL-301; kaista 7: pGB/IL-302. Kaistat 6 ja 7 esittävät pelle-·,?,· tissä läsnä olevia proteiineja, kun bakteerit on sonikoi- : : tu. Kaistat 3, 4 ja 5 esittävät ensimmäisen pesuvaiheen ]·. jälkeen pelletissä lisänä olevia proteiineja. Kaistat « I · 1 ja 2 esittävät lopullisia ureaap liuotettuja prote- • · ’ * iinijakeita.

36 102293

Nuolet osoittavat pGB/IL-301:n ja pGB/IL-302:n ilmentämiä fuusioproteiineja (joilla on odotettu koko).

Kuva 12 A esittää äkillisen myelooisen leukemian (AML) blastien IL-3:sta riippuvaisen proliferaation estymistä anti-IL-3-vastaseerumin vaikutuksesta. Kuva 12B osoittaa, ettei immunisoimaton seerumi vaikuta IL-3:n vaikutukseen AML:n blastien proliferaatiossa. Kummassakin kuvassa A = IL-3 pitoisuutena 10 yksikköä/ml; B = IL-3 pitoisuutena 1 yksikkö/ml; · = kontrolli, ei lisäystä.

Kuvasta 12A ilmenee, että seerumit estivät AML:n blastien proliferaatiomäärityksessä (51) IL-3:sta riippuvasta kasvua annoksesta riippuvaisella tavalla;

Kuva 12B osoittaa, ettei immunisoimattomilla seerumeilla ole tätä vaikutusta. Kontrollina havaittiin, etteivät nämä seerumit vaikuttaneet GM-CSF:stä riippuvaiseen kasvuun tässä samassa määrityksessä (kuva 12A, jossa ♦ = GM-CSF pitoisuutena 100 yksikköä/ml).

B. Hiiressä tuotetut monoklonaaliset ihmisen IL-3:een kohdistuvat vasta-aineet

Balb/C-hiiret immunisoitiin antamalla 3 x 0,1 ml (subkutaanisti) samaa emulsiota kuin kaneihin käytettiin. Viikolla 2 annettiin tehosteena (0,1 ml intraperi-; .· toneaalisesti) antigeeniä epätäydellisessä Freund:in :V: adjuvantissa ja kolme vuorokautta myöhemmin pernan lymfosyytit fuusioitiin SP2/0-myeloomasolujen kanssa • c vakiintuneita menetelmiä käyttäen (65). Hybridoomien .·/. emäliuokset seulottiin ELISA-menetelmällä käyttämällä E. coli pGB/IL-302:n lysaattia (sisälsi 17 kd:n IL-3- • · · fuusioproteiinia) positiivisena kontrollina ja E. coli ·.*.* pUC8:n lysaattia negatiivisena kontrollina. Kaikkiaan valittiin ja stabiloitiin 29 IL-3-hybridoomaviljelmää, . .·. jotka erittivät IL-3:lie spesifisiä vasta-aineita.

• * • · « 37 102293

Esimerkki 5

Ilmentämisvektorien rakentaminen Bacillusta varten Käytettiin julkaisussa (36) selostettuja yleisiä kloonausmenetelmiä.

A. Plasmidin pGB/IL-307 rakentaminen (kuva 13)

Plasmidin pGB/IL-307 rakentamiseksi plasmidin pLB4 Smal-fragmentti, jossa oli hmulti-CSF-geeni, liitettiin PvuIIilla katkaistuun plasmidiin pUBHO (54). Kun transformointikelpoiset (56) DB105-solut (proteaasivajaan DB104-kannan spo--johdannainen (55)) transformoitiin, saatiin odotetusti kaksi kloonia niin, että fragmentti oli kloonautuneena kummassakin suunnassa. Plasmidille, jossa oli fragmentti oikeassa suunnassa ns. "Hpa II-promoottorin suhteen" (57), annettiin nimeksi pGB/IL-307. Tässä tapauksessa valmistuu fuusioproteiinia (ks. kuva 13).

B. Plasmidin pGB/IL-310 rakentaminen

Hmulti-CSF:n ilmentämisplasmidi rakennettiin seu-, , raavalla tavalla.

1. Promoottorin kloonaus (kuva 14)

Bacilluksessa ilmentämiseen käytetään synteettistä • ‘ · 43 *, * f -promoottoria, jota on selostettu julkaisussa (58) • · · ^ ^ *·*·* (promoottorista käytettiin aiemmin nimitystä (f ).

• · · ’·*·' Plasmidit pPROM55 (58), promoottorin sisältävä plasmidi ja plasmidi pGPA14 (59) katkaistiin EcoRI:llä • e V.: ja Xbalrllä. Promoottorifragmentti liitettiin vektori- :#: : fragmenttiin, joka oli puhdistettu agaroosigeelissä.

. X Kun suoritettiin E. colin (JM 101) transformointi, !. 1 saatiin oikea plasmidi ja sille annettiin nimeksi ·:·' pGB/IL-308 (kuva 14).

:/· 2. Synteettisen oligonukleotidin tuominen plasmidiin pGB/IL-308 (kuva 15).

102293 38

Synteettinen oligonukleotidi, joka sisälsi nukleotidit 39 - 158 ja 484 -546 hmulti-CSF:stä, 5'-päässä olevan Sali:n tunnistuskohdan ja 3’-päässä olevan Xmalll-kohdan, liitettiin Sali-XmalII-katkaistuun plasmidiin pGB/IL-308. Yhteenliittämisseoksella transformoitiin JM101. Kun joukko transformantteja analysoitiin, löydettiin oikea plasmidi, ja sille annettiin nimeksi pGB/IL-309.

3. hIL-3:n tuominen (kuva 16) B. subtilis DB105 transformoitiin plasmidilla pGB/IL-309 ja sen jälkeen plasmidi eristettiin ja katkaistiin XmaIII:lla. Sisempänä olevat päät täytettiin Klenow-polymeraasilla ja plasmidi katkaistiin Clal:llä. Plasmidi pGB/IL-307 katkaistiin Aval:llä ja päät täytettiin Klenow-entsyymin avulla ja sen jälkeen katkaistiin Clal:llä. Sitten hmulti-CSF:n sisältävä fragmentti liitettiin pGB/IL-309-fragmeittiin ja transformoitiin JM101. Näin saadulle plasmidille annettiin nimeksi pGB/IL-310 (kuva 16). Tämä plasmidi sisälsi hIL-3-gee-nin, jolla oli oma signaalisekvenssinsä. Kun oikea .. plasmidi oli eristetty, se sijoitettiin B. subtilis ; DB105:teen.

*··>' C. Plasmidien pGB/IL-311 ja pGB/IL-312 rakentaminen : '.· (kuvat 17 ja 18) • · · ***** Plasmidi pGB/IL-310 katkaistiin osittain HindIII:lla • · · ***** ja täysin PvuII:lla. Kaksi PvuII-Hindlll-fragmenttia, jot ka sisälsivät hmulti-CSF:n,alakloonattiin HindIII:lla ia • · *.V Smalrllä katkaistuun plasmidiin pBHAl.

• · · 1 Kuva 17 esittää plasmidin pBHAl nukleotidisekvens- . .·. siä. Plasmidi sisältää asemat 11 - 105 ja 121 - 215, jotka edustavat bakteriofaagi FD:n terminaattoria (kahtena); asemat 221 - 307, jotka edustavat plasmidin pBR322 osaa (vastaa asemia 2069 - 2153); asemat 313 - 768, jotka edustavat bakteriofaagi Fl:n replikoitumisen aloituskohtaa (vastaa asemia 5482 - 5943); asemat 772 - 2571, jotka 39 102293 edustavat plasmidin pBR322 osaa vastaten replikoitumisen aloituskohtaa ja beeta-laktamaasigeeniä; asemat 2572 - 2685, jotka edustavat transposonin Tn903 täydellistä

perimää; asemat 2719 - 2772, jotka edustavat terminaat-toria (kahtena); asemat 2773 - 3729, jotka edustavat transposonia Tn9, jossa on kloramfenikoliasetyylitrans-feraasigeeni. Asemissa 3005 (A), 3038 (C), 3302 (A) ja 3409 (A) olevat nukleotidit eroavat villityyppisestä cat:tä koodittavasta sekvenssistä. Nämä mutaatiot aiheutettiin, jotta Ncol-, Ball-, EcoRI- ja PvuII-kohta saatiin eliminoiduiksi. Edelleen plasmidi sisältää asemat 3730 - 3804, jotka edustavat monikloonausaluetta; asemat 3807 - 7264, jotka edustavat plasmidia pUBHO

(vastaa replikoitumisfunktiota ja kanamysiiniresistenssi-geeniä (EcoRI-PvuII-fragmentti) (66, 67); asemat 7267 - 7331, jotka vastaavat monikloonausaluetta. Kaikki fragmentit liitettiin yhteen ennestään tunnettuja kloonausmenetelmiä käyttäen, esim. täyttämällä epätasaiset päät Klenow-entsyymin avulla, suorittamalla kloonaus adapterin avulla jne. Kaikki tiedot saatiin Gen- p bank :istä, National Nucleic Acid Sequence Data Ba^k, NIH, USA.

Kun transformoitiin JM101 ja joukko ampisilliinil- le vastustuskykyisiä pesäkkeitä analysoitiin, löydet- i . tiin kaksi erilaista plasmidia: pGB/IL-312, jossa oli » · täydellinen geeni yhdessä täydellisten ohjausalueiden • · kanssa, ja pGB/IL-311, joka sisälsi täydellisen geenin • · ja promoottorin, josta puuttui -35-alue, vastakkaises- ^ sa suunnassa (ks. kuva 18).

• « M B. subtilis DB105 ja B. licheniformis-kanta T399 • * « \ Mamy, spo , eksoproteaasinegatiivinen, rifr, ks. viitet- tä 68, jossa tämän kannan nimi on T9) transformoitiin plasmidilla pGB/IL-311.

I 1 I

Γ'. D. Plasmidin pGB/IL-313 rakentaminen (kuva 19)

I I

Jotta saataisiin pienempi plasmidi, jossa on hmulti- 40 102293 CSF on "HpalI-promoottorin" takana, pGB/IL-312 katkaistiin BamHIrllä ja liitettiin uudestaan yhteen. Yhteenliittä-misseoksella transformoitiin transformointikelpoiset DB105-solut. Joukko neomysiiniresistenttejä pesäkkeitä analysoitiin ja oikea plasmidi löydettiin. Tälle plasmidilie annettiin nimeksi pGB/IL-313.

E. Plasmidin pGB/IL-317 rakentaminen (kuva 20)

Jotta hmulti-CSF-geeni saataisiin kloonatuksi B. licheniformiksen alfa-amylaasin transkription- ja luennanaloitusalueen ja signaalisekvenssin taakse, käytettiin erästä aiemmin selostetuista pOL5-delta-vekto-reista (68) eli pOL-5-2 deltaa. Alfa-amylaasin signaalisekvenssin (29 aminohappoa) ohella tämä plasmidi sisältää alfa-amylaasin kypsän sekvenssin yhden aminohapon (Ala) ja sitä seuraavan monikloonausalueen: EcoRI-Xmalll-Xmal-Sali-HindiII (68).

Plasmidin pGB/IL-310 Sall-PvuII-fragmentti, joka sisälsi hmulti-CSF-geenin, liitettiin Sali-PvuII-katkaistuun pOL5-2 delta-vektoriin ja suoritettiin DBl05:n trans-formointi. Näin saadulle plasmidilie annettiin nimeksi !! pGB/IL-317 (kuva 20). hIL-3-geeni sisältää tässä plasmi- ' ; dissa vielä oman signaalisekvenssinsä. Tämä plasmidi sijoitettiin myös B. licheniformis T399:ään.

• I k • · • · \V F. Viiden ilmentämisplasmidin ilmentäminen Bacillus- • · :.V kannoissa B. subtilis- ja B. licheniformis-kantoja, joissa V. oli kulloinkin joku jäljempänä mainituista plasmideista, • rt ·.· * kasvatettiin TSB-alustassa, joka sisälsi 20 jig/ml neomy- . siiniä tai 10 pg/ml erytromysiiniä, 37°C:ssa (kasvatus- aika 16 - 24 tuntia); 300 pg/ml viljelmää sentrifugoitiin. Pelletti uudelleensuspendoitiin näytepuskuriin ja ana-lysoitiin käyttämällä polyakryyliamidigeelielektroforee-siä ja sen jälkeen Western-blottausta. Emäliuos TCA-saostettiin ja pelletti uudelleensuspendoitiin näyte- 41 102293 puskuriin. Sekä emäliuoksesta että pelletistä analysoitiin IL-3-proteiini (ks. taulukko 2).

Jotta tuotettujen proteiinien biologinen aktiivisuus saataisiin määritetyksi, suoritettiin seuraavat toimenpiteet: Solupelletit uudelleensuspendoitiin puskuriin, joka sisälsi 0,1 M Tris/HCl pH 8,0 ja 10 mM MgC^. Lisättiin lysotsyymiä lopulliseen pitoisuuteen 1 mg/ml ja PMSF:ää lopulliseen pitoisuuteen 1 mM. Saatua liuosta inkuboitiin 30 minuuttia 37°C:ssa. Sitten lisättiin DNaasia (lopullinen pitoisuus 20 ;ag/ml) ja saatua liuosta inkuboitiin 15 minuuttia 20°C:ssa. Lopuksi tästä valmisteesta sekä viljeltyjen solujen emäliuoksesta määritettiin biologinen aktiivisuus kuvatulla tavalla. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2

Bacillus-vektorien ilmentyminen

Plasmidi Kanta IL-3:n molekyy- Biologinen limassa aktiivisuus pelletti emäliuos pelletti emäliuos .·; (kd) (kd) Λ pGB/IL-307 DB105 21 - + - pGB/IL-310 DB105 15;17 15;17 pGB/IL-311 DBIOS 12,5,-15 - + f T399 - - + - • · · pGB/IL-313 DB105 15; 17 12,5; 15 + :.V T399 - - + - pGB/IL-317 DB105 12,5,-15 12,5,-15 + + :!v 17,-20 17 :T: T399 12,5,-15 12,5,-15 + + 17; 20 17

• < I

Voidaan vetää se johtopäätös, että B. subtilikses- :,i.: sa saadaan plasmidia pGB/IL-307 käyttämällä fuusioproteii- • · nia, jolla on IL-3-aktiivisuutta. Kun ihmisen IL-3-geeni sisältää vain oman signaalisekvenssinsä, ei mer 42 102293 kittävää ihmisen IL-3:n erittymistä saada aikaan. Kaikki löytynyt IL-3-aktiivisuus on solunsisäistä. Näissä tapauksissa näyttää siltä, että solussa on muodostunut IL-3:n esiasteen ohella myös kypsää IL-3:a (15 kd).

Näin ollen on saattanut tapahtua jonkin verran siirtymistä membraanin läpi, mutta proteiini ei kuitenkaan ole siirtynyt solunseinän läpi. Kuitenkin, kun käytettiin alfa-amylaasin säätely- ja erittymissignaaleja (pGB/ IL-317), suurin osa IL-3-aktiivisuudesta näytti erittyvän kasvualustaan. Hajoamistuotteen ohella havaitaan emäliu-oksesta kaksi proteiinia, joiden molekyylimassat ovat noin 15 kd ja noin 17 kd, ja jotka mitä todennäköisimmin vastaavat kypsää IL-3:a ja IL-3:n esiastetta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kumpaakin prosessointi-kohtaa eli alfa-amylaasin prosessointikohtaa ja hmulti-CSF:n prosessointikohtaa, käytetään. Solun sisällä on valtatuotteena IL-3:n esiaste, joka sisältää alfa-amylaasin signaalisekvenssin (20 kd:n proteiini), kuten Western-blottaus osoittaa. Joskus havaitaan hajoamistuotetta.

v Esimerkki 6 ' Ilmentämisvektorien rakentaminen Kluyveromyces lactista : ; varten * * ·' i A. Plasmidin pGB/IL-316 rakentaminen • · • · :.V DNA-fragmentti, joka sisälsi gentamysiini G418:lle • · resistenssin antavan Tn5-geenin (61) S. cerevisiaen alkoholidehydrogenaasi I:n (ADHI) promoottorin ohDauk-sessa, kuten Bennetzenin ja Hallin julkaisussa (62) • < .·;·. on selostettu, liitettiin pUC19:n Smal-kohtaan (63).

• · « •m E. coli-kanta, joka sisälsi näin saadun plasmidin eli 9 9 · ‘ pUC-G4l8:n, talletettiin CBS-kokoelmiin 4. joulukuuta 1987 numerolla CBS 872.87.

Xbal-Hindlll:11a katkaistuun pUC-G418-vektoriin sijoitettiin plasmidin pGB903 (64) Xbal-Hindlll-fragmentti, joka sisälsi K. lactiksen laktaasipromoottorin ja 43 102293 vasikan prokymosiini-DNA:n, jolloin saatiin plasmidi pGB/IL-314.

Tämän plasmidin Sall-Hindlll-fragmentti korvattiin synteettisellä DNA-fragmentilla, joka sisälsi pienen monikloonausalueen ja laktaasin terminaattorin (ks. kuvat 21 ja 22). Näin saadulle plasmidille annettiin nimeksi pGB/IL-315.

SacI-XhoI-katkaistuun pGB/IL-315-vektoriin sijoitettiin seuraavat fragmentit: 1. Plasmidin pKS105 (USA:ssa jätetty patenttihakemus n:o 07/853,964) SaclI-Xbal-fragmentti, joka sisälsi laktaasipromoottorin 3'-osan ja alfa-tekijän signaalisek-venssin 5'-osan, jotka oli saatu S. cerevisiaesta.

2. Synteettinen oligonukleotidi, joka kattoi alfa-tekijän signaalisekvenssin 3'-osan alkaen Xbal-koh-dasta ja kypsän hIL-3:n cDNA-sekvenssin 5'-osan Hpal-kohdan 5'-puolikkaaseen asti (aminohappotähde 14).

3. Hpal-XhoI-fragmentti, jossa on suurin osa hIL-3:n cDNA-sekvenssistä (tähteet 15 - 133 plus 3'-pään koodittamaton alue). Näin saadulle plasmidille annettiin nimeksi pGB/IL-316 ja se on esitetty kaaviollisesti :Y kuvassa 21. Kuvassa 22 on esitetty vektorin täydellinen sekvenssi laktaasipromoottorisekvenssin SadI-kohdasta . synteettisen terminaattorin lopussa olevaan HindIII-koh- :v. taan asti.

• · \p*p Kuvassa 22 on esitetty plasmidin pGB/IL-316 nukleo- • · · I I tidisekvenssi, joka on laktaasipromoottorissa olevan • · · • · ainoan SadI-kohdan ja terminaattorin takana olevan

HindiII-kohdan välissä (tähteet 4457 - 7204). Tähteet • · *.v 4457 - 6100 kattavat laktaasipromoottorisekvenssin.

• * * " ·.· · Tähteet 6101 - 6355 kattavat alfa-tekijän signaalisekvens- . .*· sin. Tähteet 6356 - 7115 kattavat ihmisen kypsän IL-3:n sekvenssin plus 3-pään koodittamattoman cDNA-sekvenssin. Tähteet 7116 - 7204 muodostavat synteettisen terminaat-torisekvenssin.

44 102293 B. Plasmidin pGB/IL-318 rakentaminen

Plasmidin pGB/IL-316 kanssa samanlainen ilmentä-misvektori rakennettiin siten, että S. cerevisiaen alfa-tekijän signaalisekvenssiä koodittava informaatio korvattiin K. lactiksen alfa-tekijän signaalisekvenssillä (64). Muu osa plasmidista on identtinen plasmidin pGB/IL-316 kanssa. Kuvassa 23 on esitetty plasmidin pGB/IL-318 sekvenssi, joka on laktaasipromoottorin Sacl-kohdan ja terminaattorin takana olevan HindiII-kohdan välissä (tähteet 4457 - 7190).

Tähteet 4457 - 6087 kattavat laktaasipromoottorin ja pienen kytkijäsekvenssin. Tähteet 6088 - 6342 kattavat K. lactiksen alfa-tekijän signaalisekvenssin. Tähteet 6343 - 7102 kattavat ihmisen kypsän IL-3:n sekvenssin plus 3'-pään koodittamattoman cDNA-sekvenssin. Tähteet 7103 - 7190 kattavat synteettisen terminaattorisek-venssin.

C. Kluyveromyces lactiksen transformointi ja erittyneen hIL-3;n analysointi

Plasmidit pGB/IL-316 ja pGB/IL-318 katkaistiin , ainoasta, laktaasipromoottorialueella sijaitsevasta

SacII-kohdastaan ja käytettiin K. lactis-kannan CBS

2360 (ks. 64) transformoinein. Plasmidien integroitu- *, · minen kohdennettiin tällä tavalla kromosomaalisen laktaa- • · * '·*·* sigeenin promoottorialueeseen. Saatuja G418-resistent- :.v tejä transformantteja kasvatettiin nestemäisessä YEPD- alustassa kyllästymispisteeseen asti ja viljelmien emä- * · V,’ liuoksista ja solulysaateista analysoitiin IL-3-aktii- :T: visuus käyttämällä äkillisen myelooisen leukemian solujen , )·, DNA-synteesimääritystä.

Oleellisesti ottaen kaikki IL-3 näytti erittyvän viljelyalustaan ja olevan aktiivista. Emäliuoksen proteiinit saostettiin käyttämällä etanolia ja analysoitiin : käyttämälllä denaturoivaa polyakryyliamidigeelielektrofo- reesia ja sen jälkeistä Western-blottausta. Vallitse- 45 102293 van tuotteen näennäinen molekyylimassa on noin 21 kd, mutta selvästi erottuva noin 15 kd:n vyöhyke havaitaan myös. Viimeksimainittu tuote vastaa mitä todennäköisimmin kypsää glykosyloitumatonta IL-3:a, kun taas 21 kd:n tuote on glykosyloitunut ytimensä kahdessa mahdollisessa glykosyloitumiskohdassa. Inkubointi Endoglykosidaa- si H:n kanssa antaa proteiinin, joka vaeltaa 15 kd:n alueella, mikä viittaa siihen, että IL-3 prosessoituu oikein erittymisprosessin aikana, ja että valtaosa proteiinista glykosyloituu.

Esimerkki 7

Ilmentämisvektorin rakentaminen Saccbaromyces cerevisiae-ta varten A. Plasmidin pGB/IL-319 rakentaminen

Ensin rakennettiin ilmentämisvektori nimeltään pGB/TEFact. Tässä plasmidista pTZ18R (Pharmacia) johdetussa plasmidissa on translaationpidennystekijän (EF-lalpha) promoottorisekvenssi, joka on kloonattu ja sekvensoitu julkaisuissa (73, 74) kuvatulla tavalla, on liitettynä pienen Sali-Bglll-XhoI-kytkijän välityk- :: : sellä S. cerevisiaen aktiinin transkription terminaat- torisekvenssiin (75), joka syntetisoitiin Applied Bio- : Systemsin DNA-syntetisaattorilla. Ilmentämiskasetin • · sekvenssi on esitetty kuvassa 24. Tähteet 1 - 949 katta-vat EF-lalpha-promoottorin. Tähteet 950 - 967 kattavat • · ·

Sali-Bglll-XhoI-kytkijän sekvenssin. Tähteet 968 - • · · 1113 kattavat aktiinin terminaattorisekvenssin.

. . Plasmidin pGB/TEFact Smal-kohtaa käytettiin esi- • · '·*·* merkissä 6 kuvatun G418-resistenssikasetin sijoittamiseen.

• · · * Näin saadulle plasmidille annettiin nimeksi pGB/TEFactG418.

; Lopuksi rakennettiin hIL-3:n ilmentämisvektori pGB/IL-318 tuomalla seuraavat DNA-sekvessit Sall-Xhol- katkaistuun plasmidiin pGB/TEFactG418: - Plasmidin pGB/IL-316 Sall-NruI-fragmentti, joka sisältää S. cerevisiaen alfa-tekijän signaalisek- 46 102293 venssin ja hIL-3:a koodittavan sekvenssin Nrul-kohtaan asti.

- Synteettinen NruI-XhoI-DNA-fragmentti, joka sisältää loput hIL-3:a koodittavista nukleotideista ja välittömästi TGA-stopkodonin jäljessä olevan XhoI:n tunnistuskohdan.

B. Saccharomyces cerevisiaen transformointi ja erittyneen hIL-3:n analyysi

Plasmidi pGB/IL-319 katkaistiin ainoasta, EF-1<K.~ promoottorin alueella olevasta EcoRI-kohdastaan. Plas-midin integroituminen kohdennetaan näin kromosomaali-seen EF-1 -alueeseen. S. cerevisiaen villityyppinen kanta D273-103 (alpha; ATCC 25657) transformoitiin samoin kuin K. lactiksen osalta on selostettu (64). G418-resistentit pesäkkeet poimittiin ja transformantteja kasvatettiin nestemäisessä YEPD-alustassa kyllästymis-pisteeseen. Viljelmän emäliuoksesta määritettiin hIL-3-aktiivisuus AML-määrityksellä. S. cerevisiaen tuottama proteiini havaittiin biologisesti aktiiviseksi.

Emäliuoksen proteiinit saostettiin käyttämällä :Y: etanolia ja analysoitiin sen jälkeen polyakryyliamidigee- lielektroforeesilla ja Western-blottauksella. Western-: blottauksessa voitiin erottaa kaksi päätuotetta, glykosy- loitunut 21 kd:n tuote ja glykosyloitumaton noin 15 « · kd:n tuote.

« · · • ♦ • · • * * • * • ♦ • · • ♦ • · • · · • · • · * •

4 I I 4 4 i • I I

4 4 • 4 · · 4 4 4 4 4 4 4 4 14 1 4 4 102293

Viitejulkaisut 1 Metcalf D., Blood 67, 257-267 (1986).

2 Whetton A.D. ja Dexter T.M. TIBS 11, 207-211 (1986).

5 3 Wagemaker G., In "Bone Marrow Transplantation" (eds. Van

Bekkura D.W. ja Lowenberg B.) Marcel Dekker Inc. New York 1-72 (1985).

4 Dorssers L. et. al., Exp. Hematol.. 12, 357, 1984.

5 Till J.E. ja McCulloch E.A., Radiat. Res. 14, 213-222 10 (1961).

6 Hapel A.J., et. al., Blood 65, 1453-1459 (1985).

7 Scheven B.A.A., Nature 321, 79-81 (1986).

8 Garland J.M. ja Crompton S. Exp. Hematol. 11, 757-761 (1983).

15 9 Stanley E.R. et. al., Cell 45, 667-674 (1986).

10 Kreigler A.B. et. al., Blood 60, 503-508 (1982).

11 Fung M.C. et. al., Nature 307, 233-237 (1984).

12 Yokata T. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1070-1074 (1984).

20 13 Lowenberg B. ja Dicke K.A., Exp. Hematol. 5, 319-331 (1977).

14 Wagemaker G. ja Peters M.F., Cell. Tiss. Kinet. 11, 45-56 :Y: (1978).

15 Ihle J.N., et. al., "Advances in viral oncology", vol. 4 « · 25 (toim. Klein G.) 95-137, Raven Press, New York 1984.

16 Fauser A.A. ja Messner H.A. Blood 52, 1243-1248 (1978).

I·,!, 17 Lowenberg B. et. al., Leuk. Res. 4, 143-149 (1980).

!'!' 18 Lowenberg B. et. al., Blood 59, 64-645 (1982).

19 Buick R.N. et. al., Blood 54, 95-104 (1979).

30 20 Huynh T.V. et. al., In "DNA cloning”, voi. 1 (toim. Glover ill D.M.) IRL press, Oxford 45-78 (1985).

·; : 21 Kozak M. Cell 44, 283-292 (1986).

22 Von Heijne G. Eur J. Biochem 133, 17-21 (1983).

23 Perlman D. ja Halvorson H.O., J. Mol. Biol. 167, 391-409 35 (1983).

24 Shaw G. ja Kanien R. Cell 46, 659-667 (1986).

• · i 25 Schrader J.W., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2458-2462 (1986).

48 102293 26 March C.J., et. al., Nature 315, 641-647 (1985).

27 Higashi Y. et. ai., J. Biol. Chem. 258, 9522-9529 (1983).

28 Pijkema R. et. ai., EMBO J. 4, 761-767 (1985).

29 Zwarthoff E.C. et. ai.. Nucleic Acid Res. 13, 791-804 5 (1985).

30 Clark-Lewis I. et. ai.. Science 231, 134-139 (1986).

31 Kindler V. et. ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 1001-1005 (1986).

32 DeLamarter J.F. et. ai., EMBO J. 10, 2575-2581 (1985).

10 33 Lemischka I.R. et. ai., Cell 45, 917-927 (1986).

34 Yu-Chung Yang et. ai., Cell 47, 3-10 (1986).

35 Miyatake S. et. ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 316-320 (1985).

36 Maniatis T. et. ai., ja "Molecular Cloning, A. laboratory 15 manual". Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1982).

37 Gubler U. ja Hofmann B.J., Gene 25, 263-269 (1983).

38 Feinberg A.P. ja Vogelstein B. Anal. Biochem. 132, 6-13 (1983) .

39 Sanger F. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 20 (1977).

40 Queen C. ja Korn L.J. Nucleic Acid Res. 12, 581-599 (1984) .

41 Staden R. Nucleic Acid Res. 10, 2951-2961 (1982).

. « 42 Devereux J., et. al.. Nucleic Acid Res. 12, 387-395 25 (1984).

:·[·. 43 Lipman D.J. ja Pearson W.R. Science 227, 1435-1441 (1985) .

« · · I! 44 Subramani S. ja Southern P.J., Anal. Bioch. 135, 1-15 « a ♦ (1983).

30 45 Wigler M., et. al., Cell 14, 725-731 (1978).

;]·* 46 Majdic 0., et. al., Int. J. Cancer 33, 617-623 (1984).

»* * 47 Lowenberg B. ja Bauman J.G.J. Blood 66, 1225-1232 (1984).

48 Delwel R., et. al., Blood 68, 41-45 (1986) 49 Swart K. et. al., Blood 59, 816-821 (1982).

35 50 Swart K. ja Lowenberg B. Cancer Res. 44, 657-660 (1984).

51 Touw I. et. al., Blood 68, 1088-1094 (1986).

52 Vieira, J. ja Messing J., Gene 19, 259-268 (1982) 53 Osinga, K.A. et al., Nucleic Acids Res. 11, 8595-8608 (1983) 49 1 0 2 2 9 3 54. Gryczan, T.C. et ai., J. Bacteriology 134, 318-329 (1978) 55. Kawamura, F. ja Doi, R.H., J. Bacteriology 160, 442-444 (1984) 56. Bron, S. ja Venema, G., Mutat. Res. 15, 1-10 (1972).

5 57. Zyprian, E. ja Matzura, H., DNA 5, 219-225 (1986).

58. EPA 0224294, julkaistu 3. heinäkuuta 1987 59. EPA 0244042, julkaistu 4. marraskuuta 1987 60. Stanssens P. et al., In "Protein Engineering and Site-Directed Mutagenesis". Twenty-Fourth Harden Conference.

10 Program and Abstracts (1985) (Fersht, A.R. and Winter, G., edts).

61. Reiss, B. et al., EMBO J. 3, 3317-3322 (1984).

62. Bennetzen, J.L. ja Hall, B.D., J. Biol. Chero. 257, 3018-3025 (1982). - 15 63. Yanisch-Perron, C. et al., Gene 33, 103-119 (1985).

64. U.S. pat.hak. No. 078,539, 28. heinäkuuta 1987 65. Saifre, S. and Milstein, C., Meth Enz 73, 3-75 (1981).

66. McKenzie, T. et al., Plasmid 15, 93-103 (1986).

67. McKenzie, T. et al., Plasmid 17, 83-85 (1987).

20 68. Eurooppalainen patenttihak. 87201379.2, jätetty 20. heinäkuuta 1987.

69. Chen, E.Y. et al., Nature 299, 529-534 (1982).

70. Law, M-F. et al., Mol. Cell Biol. 3, 2110-2115 (1983) .v. 71. Hirt, B., J. Mol. Biol. 26, 365-367 (19G7).

25 72. Suarez Rendueles, M.P. et al., FEBS Lett. 131, 296-300 U98i).

73. Najata, S. et al., EMBO J. 3, 1825-1830 (1984).

!! 74. Nagashima, K. et al., Gene 45, 265-273 (1986).

* *’ 75. Gallwitz, D. ja Suree, I., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 30 2546-2550 (1980).

» · • « • « » » • * · ♦ · • ·

Claims (16)

1. Transformerad levande bakterie-, jäst- eller vävnadskul-tur-värdcell, kännetecknad därav, att den innehäller gene-tiskt material härlett frän ett rekombinant-DNA-material ; med en nukleotidsekvens enligt sekvensen Ή' i figur 1 och som kodar för humant IL-3 med Pro i ställning 8 av den • · :*: · mogna proteinmolekylen. • · .·.· 2. Transformerad jästvärdcell enligt patentkravet 1, kanne- • · · tecknad därav, att den är Saccharomyces eller Kluyveromy- • · · *. ces. • I* • » · • · · »»

1. Transformoitunut elävä bakteeri-, hiiva- tai kudosvil-jelmäisäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää yhdis-telmä-DNA-materiaalista johdettua geneettistä materiaalia, jolla on kuvan 1 sekvenssin Ή' mukainen nukleotidisek-venssi ja joka koodittaa ihmisen IL-3:a, jossa on Pro kypsän proteiinimolekyylin asemassa 8.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transformoitunut hiiva-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on Saccharomyces tai Kluyveromyces.

3. Transformerad bakterievärdcell enligt patentkravet 1, kännetecknad därav, att den är E. coli eller Bacillus. 102293

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transformoitunut baktee-ri-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on E. coli tai Bacillus.

4. Transformerad vävnadskultur-värdcell enligt patentkravet 1, kännetecknad därav, att den är en COS-cell, en C127-cell (ATCC CRL 1616) eller en insektcell.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transformoitunut kudos-viljelmäisäntäsolu, tunnettu siitä, että se on COS-solu, C127-solu (ATCC CRL 1616) tai hyönteissolu. • « : : 5. Geeniteknologialla aikaansaadussa isännässä toimiva il- : mentämissysteemi, tunnettu siitä, että se koostuu ihmisen i « · IL-3:a, jossa on Pro kypsän proteiinimolekyylin asemassa 8, .V. koodittavasta DNA-sekvenssistä, jonka nukleotidisekvenssi on kuvan 1 sekvenssin ' H' mukainen ja joka on toimivasti liittyneenä mainitussa isännässä vaikuttaviin ohjaussek- . . vensseihin. • · · • · · • · • · · • · · V ‘ 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen ilmentämissysteemi, tun- : ·'; nettu siitä, että ihmisen IL-3:a koodittava DNA ei sisällä IM .·*·. introneja. • · · ··_ 7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen ilmentämissysteemi, ' *·' tunnettu siitä, että ohjaussekvenssit sisältävät promoot torin, joka on lac-promoottori, HpaII-promoottori, σ43- „ 102293 Oi promoottori, alfa-amylaasin promoottori, EF-l-alfa-promoot-tori tai SV40-promoottori.

5. Ett expressionssystem funktlonellt i en värd ästadkommen genom genteknologi, kännetecknat därav, att det bestär av en DNA-sekvens, som kodar för humant IL-3 med Pro i ställ-ning 8 av den mogna proteinmolekylen, vars nukleotidsekvens är enligt sekvensen ' H' i figur 1 och som är funktionellt ansluten tili ledarsekvenser som verkar i nämnda värd.

6. Expressionssystem enligt patentktravet 5, kännetecknat därav, att det humant IL-3 kodande DNA:t inte innehäller introner.

7. Expressionssystem enligt patentkravet 5 eller 6, kännetecknat därav, att ledarsekvenserna innehäller en promotor, som är en lac-promotor, en HpaII-promotor, en σ43-promotor, en promotor av alfa-amylas, en EF-l-alfa-promotor eller en SV40-promotor. ,ν, 8. Gentekniskt ästadkommen värdcell enligt nägot av patentkra- , ven 1-4, kännetecknad därav, att den är transformerad med ett expressionssystem enligt nägot av patentkraven 5-7. '·' 9. Vektor, kännetecknad därav, att den är en av vektorerna *·*.* pGB/IL-300 - pGB/IL-319, vilkas konstruktioner är angivna i figurerna 5, 13-16 och 18-23. • · • · · • · · • · : 10. Vektor, kännetecknad därav, att den är pLB4 (figur 2) . eller pLB4/BPV (exempel 2). ♦ ♦ · • »Φ ··· • · *;* 11. En hybrid-DNA-sekvens, som inte innehäller introner, # >#|j' kännetecknad därav, att den kodar för humant IL-3 med Pro i ställning 8 av den mogna proteinmolekylen, och att den • · vidare innehäller en nukleotidsekvens, som kodar för amino-syrorna 1 - 133 av *H'-sekvensen i figur 1. 102293

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen geeniteknologialla aikaansaatu isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitunut jonkin patenttivaatimuksista 5-7 mukaisella ilmentämissysteemillä.

9. Vektori, tunnettu siitä, että se on jokin vektoreista pGB/IL-300 - pGB/IL-319, joiden rakenne on esitetty kuvissa 5, 13-16 ja 18-23.

10. Vektori, tunnettu siitä, että se on pLB4 (kuva 2) tai pLB4/BPV (esimerkki 2).

11. Introneja sisältämätön yhdistelmä-DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodittaa ihmisen IL-3:a, jossa on Pro kypsän proteiinimolekyylin asemassa 8, ja että se edelleen sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodittaa kuvan 1 Ή'-sekvenssin aminohappoja 1 - 133.

12. Förfarande för att producera humant IL-3 i en värdcell, kännetecknat därav, att i nämnda värdcell införs en DNA-struktur med en expres-sionskassett, som i transkriptionsriktningen räknat inne-häller - en initiationsregleringsregion för transkription, som är funktionell i nämnda värdcell, - en humant IL-3 kodande DNA-sekvens, vars nukleo-tidsekvens är i enlighet med sekvensen Ή' i figur 1, och - en terminationsregleringsregion för transkription, som är funktionell i nämnda värdcell, den nämnda värdcellen, som innehäller nämnda DNA-struktur, kultiveras i ett näringsmedium vid lämpliga kultive-ringsförhällanden, varvid humant IL-3 bildas; och humant IL-3 ätervinnes.

12. Menetelmä ihmisen IL-3:n tuottamiseksi isäntäsolussa, . .·. tunnettu siitä, että mainittuun isäntäsoluun tuodaan DNA-rakenne, jossa on ' ilmentämiskasetti, joka sisältää transkriptiosuunnassa lue- ’’ teltuna • · · ***** - transkription aloitusta säätelevän alueen, joka toimii mainitussa isäntäsolussa, • · ·.'.· - ihmisen IL-3:a koodittavan DNA-sekvenssin, jonka • · · V · nukleotidisekvenssi on kuvan 1 sekvenssin ' H' mukainen, ja . .·. - transkription päättymistä säätelevän alueen, joka .···. toimii mainitussa isäntäsolussa; • · **’ kasvatetaan mainittua isäntäsolua, joka sisältää maini- tun DNA-rakenteen, ravinnealustassa sopivissa viljelyolo-suhteissa, jolloin ihmisen IL-3:a syntyy; ja otetaan talteen ihmisen IL-3. 102293

13. Förfarande enligt patentkravet 12, kännetecknat därav, att den nämnda värdcellen är nägon som definierats i pa-tentkraven 1-4 eller 8.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on jokin patenttivaatimuksissa 1-4 tai 8 määritelty.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistettava ihmisen IL-3 on oleellisesti ottaen vapaa muista mainitun proteiinin yhteydessä esiintyvistä aineista.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ihmisen IL-3:a tuotetaan geeniteknologisesti ilmentämällä DNA-sekvenssiä, joka koodittaa kuvan 1 Ή'-sekvenssin aminohappoja 1 - 133 tai sen luontaisesti esiintyviä mutantteja, joiden 8-asemassa on Pro.

16. Patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ihmisen IL-3 on glykosyloituneessa tai glykosyloitumattomassa muodossa.

14. Förfarande enligt patentkravet 12, kännetecknat därav, att humant IL-3, som skall framställas, är väsentligen fritt frän andra substanser som förekommer i samband med .; ‘; ’ nämnda protein. • · · • t • « V.:

15. Förfarande enligt patentkravet 14, kännetecknat därav, • · att humant IL-3 produceras gentekniskt genom att uttrycka en DNA-sekvens, som kodar för aminosyrorna 1 - 133 av Ή'- :V: sekvensen i figur 1, eller dess naturligt förekommande • · :*·*. mutanter med Pro i 8-ställningen. t • · » *;j·*

16. Förfarande enligt patentkravet 14 eller 15, känneteck- • · *·..* nat därav, att humant IL-3 är i glykosylerad eller oglyko- sylerad form.