JPH08505373A

JPH08505373A - Ｂ細胞前駆体刺激因子

Info

Publication number: JPH08505373A
Application number: JP6513260A
Authority: JP
Inventors: サマル，ベイブル
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1992-11-20
Filing date: 1993-11-18
Publication date: 1996-06-11
Also published as: AU680851B2; DE69314754T2; AU5613594A; DK0601360T3; EP0601360A1; US5874399A; CA2149763A1; EP0601360B1; MX9307229A; ES2108189T3; GR3025718T3; IL107642A0; CN1094093A; WO1994012535A1; US5580754A; DE69314754D1; ATE159545T1; KR950704356A

Abstract

(57)【要約】前Ｂ細胞（pre-B cell）の形成を促進するＢ細胞前駆体刺激因子（ＰＢＳＦ）を記述している。図は前Ｂ細胞コロニー形成アッセイに於けるＢ細胞前駆体刺激因子の活性を示す。ＰＢＳＦをコードするＤＮＡ配列ならびに本因子の生産方法及び精製方法を開示している。本因子は、造血系疾病の治療及び骨髄移植に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】Ｂ細胞前駆体刺激因子本発明は造血系前駆細胞の増殖及び分化を促進する活性を有する新規な因子、Ｂ細胞前駆体刺激因子に係わる。本発明はまた、このような因子をコードするＤＮＡ配列、ポリペプチドフラグメント及びそのアナログ、この因子を使用して造血系の病気を治療する方法と組成物に係わる。発明の背景造血系の成長因子は構成的及び誘導的な造血を支える主要な制御分子である（ Brachら、Acta．Haematol．86,128(1991)）。造血系成長因子（コロニー刺激因子及びインターロイキン）、成長因子共働因子（growth-factor synergizing fa ctors）、及び成長因子放出因子は、造血幹細胞と分化系統の決まった前駆細胞の増殖、分化、機能的活性化を支配する。各々のコロニー刺激因子は異なった系統の骨髄細胞に作用するが、コロニー刺激因子の間には系統別の活性にある程度の重複や相乗作用が有る。エリスロポイエチンの作用で赤血球を産生し、顆粒球コロニー刺激因子の作用で好中球を産生するように、幾つかの例で特定の造血細胞の型の成熟に成長因子が係わることが良く知られている。しかし、造血細胞の分化の段階には刺激因子の同定が不完全であるか全く欠如している段階が多い。殊に、初期の造血前駆細胞の増殖と分化に至る事象の場合がそうである。造血系前駆細胞は次第に多能性から単能性になり、その過程の間に自己再生能力を失う（Olofsson Aca．Oncol．30，889(1991)）。この分化は特定の造血系の成長因子との相互作用によっており、この成長因子は幹細胞の表面のレセプターと結合することによって、幹細胞を刺激して分化の次の段階に進める。インターロイキン−３（IL-3）は第一に、未分化の前駆細胞の増殖の刺激物質である（Po ntingら、Growth Factors 4，165(1991)）。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）もまた、多能性幹細胞の生存、増殖及び特定の成熟プログラムで幹細胞への分化に主要な役割を果たす。プログラムされた単能性の幹細胞は増殖して最終段階産物（赤血球、好中球、単球、好酸球）へ成熟するのにそれぞれエリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、IL-5による刺激を必要とする。IL-1β、IL-4、IL-6など他のサイトカインはこれらの過程に於ける共役因子として重要な役割を果たす（ Araiら、Ann．Rev．Biochem．59，783 (1990)）。幹細胞因子（SCF）は、c-キットのリガンドとも呼ばれているが、前駆細胞の増殖を刺激するサイトカインとして最近同定された（PCT出願W0 91/05795）。ＳＣＦは多数の他の造血系の成長因子と共働する能力を有し、分化運命の決まった前駆細胞の増殖と分化を引き起こす（Migliaccioら、J．Cell Physiol．148，50 3(1991)）。正常なマウスの骨髄細胞のクローンの培養で、SCFとG-CSF、GM-CSF 、またはIL-3との組み合わせは、平均細胞容積に於いて25倍の増加を引き起こし、前駆細胞の平均細胞容積に於いて６倍の増加を引き起こした（Metcalf Proc． Naｔl．Acad．Sci．USA 88，11310(1991)）。リンパ球系列の前駆細胞は、最後にはＢ又はＴリンパ球に成熟する。成熟Ｂ細胞は、血流の中で循環し外来の抗原に結合する抗体を産生することにより液性抗体反応を成立させる。抗体による抗原の結合は食作用あるいは補体の活性化による抗原の破壊へ導く。抗体産生Ｂ細胞はヒト免疫反応の主要な部分を含む。造血系の前駆細胞の成熟Ｂ細胞への増殖と分化に於ける成長因子の関与はＢ細胞レベルを維持するために必須である。このような因子の同定はＢ細胞レベルを調整するための治療戦略、特に免疫不全の患者に於いて重要であろう。研究の一つの領域は前Ｂ細胞（pre-B cell）のようなＢ細胞前駆体の産生を刺激するようにＢ細胞分化の初期段階で作用する因子の同定である。前Ｂ細胞は細胞質に免疫グロブリンのμＨ鎖を発現するが、細胞質Ｌ鎖あるいは表面の免疫グロブリンを発現しない初期の前駆細胞として特徴づけられる。米国特許第4,965,195号はインターロイキン−７（IL-7）がマウス骨髄由来の前Ｂ細胞の増殖を刺激することを開示している。McNieceら（J．Immunol．146， 3785(1991)）はＳＣＦがIL-7と相乗的に相互作用して、Ｂ系列細胞の増殖を刺激することを示した。しかし、Ｂ細胞の形成にはさらなる因子が要求されることが Billipsら（Blood 79,1185(1992)）によって示唆されている。Billipsらの文献はB220-，Ig-前駆細胞からの前Ｂ細胞の形成と免疫グロブリンのμＨ鎖の発現は S17ストローマ細胞（stromal cell）の存在に独特に依っており、IL-7，SCFでも、あるいはIL-7とSCFとが共働しても再現できないことを示している。加えて、Ｂ前駆体細胞の前Ｂ細胞への分化を単独で促進するストローマ由来リンパ球造成因子−１（stromal derived lymphopoietic factor-1）（SDLF-1）が記述されている（PCT出願 W0 89/06541）。それ故、本発明の目的は造血系の前駆細胞、特にリンパ球の前駆細胞から前Ｂ細胞のようなＢ系列細胞への増殖、分化を促進させることに関与する因子を同定することである。本発明の因子は液性抗体反応の調整物質として有用である。Ｂ細胞前駆体を刺激するように作用する因子の治療上の利点のため、上記因子をコードする遺伝子を同定し、発現させることが望ましい。発明の概要本発明は造血系の前駆細胞、とりわけＢ細胞前駆体の増殖と分化を刺激する能力を有する新規な因子を提供する。この因子をここでは、Ｂ細胞前駆体刺激因子（progenitor B cell stimulating factor）またはPBSFと呼ぶ。PBSFは配列番号１で後に与えられるアミノ酸配列を持ちうる。本発明はまた、Ｂ細胞前駆体の増殖と分化を促進する能力を有するPBSFの対立遺伝子（アレル）の変異体、フラグメント、アナログを含む。PBSFは天然源、例えば哺乳動物の組織あるいは細胞株から精製され得るし、あるいは外来DNA配列即ち組換え手法由来DNA配列の原核細胞、又は真核細胞での発現の産物で有り得る。本発明は生物的に活性あるPBSFをコードするDNA配列を含む。このようなDNA配列は、配列番号１の配列、および生物活性を有する対立遺伝子の変異体、フラグメント、アナログを包含する。また、本発明はこのようなDNA 配列を含むベクター、このようなベクターで形質転換あるいはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。さらに、形質転換あるいはトランスフェクションされた宿主細胞を適切な栄養条件で本発明のポリペプチドが発現するように培養すること及び本因子を単離することの工程による本因子の生産ももくろまれている。 PBSFは幹細胞因子及びインターロイキン−７の存在下、Ｂ細胞前駆体のようなリンパ球系列に組み込まれた造血系前駆細胞の増殖と分化を刺激することが示されている。本発明はまた、PBSF，PBSFを含む融合ポリペプチド、PBSFのアミノ酸配列の一部を含むペプチドフラグメントに特異的に結合する抗体に係わる。本発明はまた、該因子を含む医薬組成物及び該因子を使う造血系の疾病の治療法も提供する。図の簡単な説明図１はGM-CSF，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-6のシグナルペプチダーゼの切断部位をコードしているヌクレオチド配列を示す。シグナルペプチダーゼの切断部位に基づいて設計し、サイトカインに関してライブラリーをスクリーニングする際に使われた縮重オリゴヌクレオチドプローブの配列をも示す。図２はPBSFのヌクレオチド配列及びそれから導かれるアミノ酸配列を示す。図３はE.coliに於けるコンセンサスインターフェロン−PBSF融合蛋白質の発現を示す。列１、分子量マーカー；列２、間違った方向に挿入されたコンセンサスインターフェロン−PBSF融合遺伝子；列３、コンセンサスインターフェロン遺伝子；列４、５、６、正しい方向に挿入されたコンセンサスインターフェロン−PBSF融合遺伝子；列７、分子量マーカー図４はPA317細胞で発現し、固定化した抗PBSF抗体でアフィニティ精製したPBS FのSDS-PAGEを示す。図５Ａ−Ｃは前Ｂ細胞コロニー形成アッセイに於けるPBSFの活性を示す。PBSF は、トランスフェクトしたC0S細胞からのコンディショニングされた培養物由来（A），トランスフェクトしたPA317細胞からのコンディショニングされた培養物由来（B），トランスフェクトしたPA317細胞からのコンディショニングされた培養物のアフィニティ精製由来（C）である。図６は抹梢血液のリンパ球に於けるPBSF発現のノーザン分析である。コントロール列はサイトカイン発現の誘導剤の無い条件の発現レベルを示す。中央列はアメリカヤマゴボウ分裂促進因子（PWM）の存在下の発現を示す。右列はPWMとシクロヘキシミドの存在下の発現を示す。図７はヒト白血病細胞株の単球分化の間のPBSF発現のノーザン分析を示す。列１、ML-1，未処理；列２、PMAで処理したML-1；列３、腫瘍壊死因子（TNF）で処理したML-1；列４、TNFとIL-6で処理したML-1；列５、HL-60，未処理；列６、PM Aで処理したHL-60；列７、TNFで処理したHL-60；列８、TNFとIL-6で処理したHL- 6 図８は逆転写酵素とPCRで分析した種々の組織でのPBSFの発現のパターンを示す。列１と10、分子量マーカー；列２、脳；列３、ヒーラ細胞；列４、心臓；列５、骨格筋；列６、脾臓；列７、膵臓；列８、胸腺；列９、骨髄；列11、腎臓；列12、肝臓；列13、肺；列14、精巣；列15、胎盤；列16、末梢血液のリンパ球；列17、陰性コントロール。発明の詳細な説明本発明は、リンパ球系列に組み込まれている造血系の前駆体細胞の増殖と分化を刺激する能力を有するポリペプチドである新規な因子を提供する。この因子をＢ細胞前駆体刺激因子あるいはPBSFと命名する。“Ｂ細胞前駆体（progenitor B cell）”という用語は成熟Ｂリンパ球になる能力を有する細胞を意味するものとする。一つの具体例で、PBSFはIL-7とSCFと共同して、リンパ球前駆体細胞の前Ｂ細胞への増殖・分化を刺激することが示されている。 PBSFの生物活性は実施例３と４で記述されている in vivoとin Vitroアッセイで決定した。実施例３はin vitroコロニー形成アッセイを開示する。実施例３では、5-フルオロウラシルで処理したマウスの骨髄からの、PBSFと他の成長因子へさらした後で起こってくるコロニーの数とタイプが記述されている。実施例４はPBSF活性のin vivo アッセイを開示する。そのアッセイは、トランスジェニックマウスに於けるPBSF遺伝子の導入と発現、ベビーマウスのPBSF遺伝子によるレトロウイルス感染、マウス骨髄移植によるPBSF遺伝子の導入と発現を含む。 in vitro実験（実施例３）の結果は、SCFとIL-7の存在下でPBSFがマウス骨髄培養物からのＢ細胞前駆体の形成を刺激することを示す。本明細書に開示されているように、PBSFはSCFおよびIL-7と共同（相乗的に作用）してリンパ球前駆体細胞の前Ｂ細胞への増殖・分化を促進させるように思われる。図５が示すように、SCFとIL-7の組み合わせだけまたはPBSFだけをマウス骨髄細胞に添加しても前Ｂ細胞コロニー形成の刺激は無い。しかし、SCFとIL-7とPBSFを全部、培養骨髄細胞に加えると前Ｂ細胞の数に於いて50％の増加がある。本発明の因子は、例えばサイトカインまたは成長因子の源として知られる哺乳動物の組織または細胞株のような天然源から単離され得るポリペプチドである。 PBSFは、PWMで誘発された末梢血液のリンパ球で、及びPMAで誘発されたヒト細胞株Hut78で発現することが示されている（実施例１）。あるいは該因子は外来DNA 配列の原核細胞または真核細胞での発現、即ち組換え手法由来の産物として単離し得る。一つの具体例で、PBSFは図２及び配列番号１で示されているアミノ酸配列を有する。そのアミノ酸配列は、成熟したポリペプチドのものかまたはプロセシングをされてないポリペプチドのものでありうる。該因子の成熟蛋白質へのプロセシングはリーダー配列の切断を含む。その切断は配列番号１で示されるアミノ酸残基14と15の間で起こることが予測される。その場合には、成熟PBSFはアミノ末端残基Thr¹⁵を持つことになる。あるいは、リーダー配列の切断は配列番号１で示されるアミノ酸残基31と32の間で起こるかも知れない。その場合には、成熟PBSFはアミノ末端残基Lys³²を持つことになる。予測されたポリペプチドの成熟アミノ末端あるいはカルボキシ末端からの一つ以上のアミノ酸の切断のような他のプロセシングも起こり得る。これらのプロセシングの中には、ポリペプチドを生物的に活性な形に転換するものがある。生物的に活性のあるPBSF変異体もまた提供される。その変異体は自然に起きる対立遺伝子の変異体、一つ以上のアミノ酸が異なったアミノ酸に置き替わった置換アナログ、一つ以上のアミノ酸が欠損した欠損アナログ、一つ以上のアミノ酸が加わった付加アナログを含む。一つ以上のアミノ酸の欠損及び付加はポリペプチドの内部あるいはアミノ又はカルボキシ末端で起こる。本発明のポリペプチドはアミノ末端に始めのメチオニン残基も含み得る。異種ポリペプチドへ融合した本発明のポリペプチドをも提供する。好ましい具体例では、PBSFの成熟アミノ酸配列をカルボキシ末端でヒトα−インターフェロンあるいはウシ成長ホルモンと融合する。得られる融合蛋白質はE．coli宿主細胞中で高レベルに発現される。このような融合ポリペプチドは、実施例３で述べているように特異的にPBSF に結合する抗体の生産に有用である。更に、化学合成したペプチドフラグメントも特異的に該因子に結合する抗体の生産に使用できる。本発明はまた、生物的に活性なPBSFをコードする新規なDNA配列を提供する。好ましくは、その配列は、（a）配列番号１で示されるDNA配列及びその相補鎖、（b）（a）の配列にハイブリダイズするDNA配列、（c）遺伝コードの縮重を除いて（a）または（b）の配列にハイブリダイズするD NA配列を含む。本発明のDNA配列はポリペプチドの前駆体をコードする配列およびポリペプチドのプロセスを受けた成熟形をコードする配列を含む。ポリペプチドの前駆体をコードするDNA配列は、例えば分泌に必要なリーダー配列を含む。 PBSFのコード領域の一部または全部をコードしているcDNA配列は実施例１で記述されているように獲得した。末梢血液のリンパ球から調製したオリゴ（dT）先導cDNAライブラリーを、配列番号７に示されている配列を持つ一連の混合オリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。スクリーン方法を実施例IGで記述した。GM-CSF（配列番号２），IL-1β（配列番号３），IL-2（配列番号４），IL-3（配列番号５），IL-6（配列番号６）のmRNAがコードするシグナルペプチダーゼの切断部位の周辺の観察されたヌクレオチド配列相同性に基づいてプローブを設計した。このスクリーン方法の原理は、サイトカイン様分子の分泌される部分に特異的なプローブを使用して、他のサイトカインを同定することである。ハイブリダイズした一つのcDNAクローンを始めp64と命名したが、完全なコード領域に欠けていた。次に、末梢血液のリンパ球からのランダムプライマーのcDNAライブラリーの1.78kbのcDNAクローンからp64の完全なコード領域を獲得した。そのクローンは前Ｂ細胞形成を刺激する活性をもつことが分かり、それから発現した蛋白質をPBSFと命名した。PBSFをコードしているこの1.78kb．のフラグメントをプラスミドVL9.12に挿入し、E.coli株DH5 alpha F ′を形質転換した。この菌は受託番号でAmerican Type Cult ure Collection（ATCC）に寄託した。プローブ混合物の大きい縮重（約65,000倍）の故に、この分子の他の領域に、シグナルペプチダーゼ切断部位と類似の配列を持つ陽性にハイブリダイズするクローンが得られたのである。PBSF をコードする遺伝子の場合がまさにこの場合であった。本発明のDNA配列は、ヒト及び他の哺乳動物源から分離されたcDNA配列及びゲノムのDNA配列であり得る。また、PBSFをコードする合成DNA配列及びそのフラグメントも考えられる。それらは、当業界でよく知られている遺伝子合成技術で容易に作られる。本出願で開示したPBSFをコードするDNA配列及びそのフラグメントはPBSFをコードするゲノムのDNAを分離するプローブとして役立ち得る。加えて、PBSF遺伝子の一部又は全部を含むDNA配列は、生物サンプルに於けるその遺伝子の存在を検出するのに、ヒトの染色体に於いて遺伝子の位置をマッピングするのに、及びアンチセンスまたは三重ヘリックスブロックのような核酸に基礎を置く治療法（そこでは、合成されるPBSFの量を調整することが望ましい）に役立つ。 DNA配列はまた、生物的に活性なPBSF変異体をコードする配列を含む。配列は自然に起こる対立遺伝子の変異体、置換アナログ、欠損及び付加アナログをコードする配列を含む。欠損及び付加は、アミノあるいはカルボキシル末端に導入されるかもしれないし、コード領域に導入されるかもしれない。当業界で良く知られている技術がこのようなアナログを作るのに使われる。このような変異体は多数の望ましい性質を持っているかもしれない。例えば、生物活性を保持しながら、蛋白質分解に対してより耐性とか、酸化に対してより耐性とか、微生物の宿主での発現でより容易に折り畳まれるとかの性質である。 DNA配列は融合蛋白質をコードする配列を含む。そこではPBSFのDNA配列の一部または全部が異なる蛋白質と融合している。好ましくは、ヒトのコンセンサスインターフェロンあるいはウシ成長ホルモンの一部をコードするDNA配列が、PBS FをコードするDNA配列の5'末端にフレームが合って融合している場合である。融合蛋白質の造成が実施例3Aで記述されている。実施例3Bで示されるように、このような融合蛋白質は本因子に対する抗体の産生に役立つ。 PBSFは外来DNA配列の原核細胞の、あるいは真核細胞の宿主（例えば、培養できる細菌、酵母、植物、昆虫、哺乳動物の細胞）での発現の産物として特徴づけられる。そこでは、外来DNA配列はcDNA、ゲノムDNA 、あるいは合成DNAでありうる。即ち、好ましい具体例では、本因子は組換え方法で作られる。造血系の成長因子は、一般的に天然源からほんの少量生産されるので、組換え方法で本因子を生産する能力は治療のために十分な量を獲得するのに必要である。多数のベクターが、PBSFをコードしているDNA配列の宿主細胞での発現のために容易に利用できる。V19.12、pDSRα2、mpZenのようなベクターについては、実施例2A-CでそれぞれCOS 、Chinese Hamster卵巣（CHO）、PA317哺乳動物細胞株でのPBSFの発現のために述べた。加えて、PBSFは酵母と細菌株での使用のために適切な多数のベクターで発現されうる。実施例２で述べているように、ベクター pCFM756を使ってE.coliでヒトα−インターフェロンあるいはウシ成長ホルモン配列との融合蛋白質として、PBSFは発現された。PBSF配列は特別の宿主システム（それが細菌か、酵母か、哺乳動物の宿主細胞かによって）での発現のために最適化されうる。このような最適化は発現のために好ましいコドンの使用を含む。一つの好ましい具体例では、PBSF配列はE.coli宿主細胞での発現のために最適化した一つ以上のコドンを含む。実施例4Aで述べているように、トランスジェニックマウスでのPBSFの発現のためのベクターもまた提供される。組換えPBSFの生産の工程も述べる。本工程は、適切な栄養条件で、生物活性のあるPBSFをコードするDNA配列で形質転換あるいはトランスフェクションした原核あるいは真核細胞の宿主細胞を培養すること、DNA配列で発現されたPBSFを単離することを含む。好ましくは、配列は配列番号１記載のもの、及びそれとハイブリダイズする配列である。発現のために使用される宿主細胞によって、本発明のポリペプチドはグリコシル化されていることもされていないこともありうる。哺乳動物の蛋白質は通常、アミノ酸骨格に沿った特別の部位で炭水化物鎖の付加によって修飾されている。特定のアスパラギン残基に於ける炭水化物鎖の付加はN-グリコシル化と言い、セリンまたはスレオニン残基に於ける炭水化物はO-グリコシル化と言う。N-または O-連結の鎖、あるいは両者の存在はポリペプチドの生物活性かつ／または安定性のために必要であるかもしれない。N-連結グリコシル化部位の存在はAsn-X-Ser/ Thr（Xは任意のアミノ酸）の配列で予測できる。これによると、PBSFはAsn²⁹とA sn³⁹⁶に二つのN-連結グリコシル化部位を持つことが予測される。 PBSFポリペプチドは、ポリエチレングリコールのような水溶性高分子でも修飾されうる。蛋白質への水溶性高分子の共有結合での付加は当業者に知られている技術を使用して行われ、米国特許第4,179,937号明細書（引用により本明細書に含まれるものとする）に記述されている。この修飾ポリペプチドは望ましい性質、例えば水溶液に対する溶解度の増大、安定性の増大、in viv o半減期の増大、生物活性の増大を持つかも知れない。 PBSFはまた、放射性（例えばＩ¹²⁵）あるいは非放射性（例えば蛍光色素）でありうる検出可能なラベルを共有結合で付加しうる。リポーター基の付加は固形組織及び液体サンプルでのPBSFの検出に有用な試薬を提供する。同様にPBSFをコードしているDNA配列は生物サンプル中のPBSF配列に対するプローブとして使用するために検出可能なラベルを共有結合で付加しうる。例えば、ゲノム中のヒト PBSF遺伝子の位置をマッピングする場合、そしてPBSF関連配列の存在を検出する場合である。本因子に特異的に結合する抗体も本発明に含まれる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルでありうるし、完全な蛋白質と同様ポリペプチドフラグメント及び融合ポリペプチドに特異的に結合しうる。ヒトコンセンサスインターフェロン−PBSF融合蛋白質とウシ成長ホルモン−PBSF融合蛋白質に対する抗体の生産は、実施例３Bで記述されている。生物サンプル（例えば、血液、尿）に於ける本因子の定量に、抗体は有用である。本因子の異常な濃度は一定の造血系の疾病の有用な指標である。更に、PBSFに特異的に結合する抗体は、天然源から、あるいは組換えプラスミドの発現からポリペプチドの精製方法に有用である。上記方法は以下の段階を含む。 a）固体支持体に抗体を結合させること、 b）抗体にポリペプチドを選択的に結合させるように、ポリペプチドを含む溶液と上記結合抗体を接触させること、 c）結合したポリペプチドを溶出すること。ポリペプチドを含む溶液は、粗または部分精製の混合物でありうる。抗PBSF抗体アフィニティカラムを使用したPBSFの精製を実施例５で記述する。本発明は、薬学的に許容できる希釈剤、アジュバント、担体、保存剤、乳化剤および／または溶解剤と共に、PBSFの治療上有効な量を含む医薬組成物を提供する。ここで使われる“治療上有効な量”は一定の条件と投与量で治療上の効果をあげる量をさす。当業者は、取り扱われるどのような条件下でもPBSFの治療上有効な量を決定できるだろう。医薬組成物は種々の緩衝液（例えば、トリス、酢酸、リン酸）の希釈剤、溶解剤（例えば、ツイーン、ポリソルベート）、ヒト血清アルブミンのような担体、保存剤（チメロサール、ベンジルアルコール）、アスコルビン酸のような抗酸化剤を含む。本因子はまた、長時間に渡って、患者への制御されたデリバリー（delivery）のための重合体化合物の粒状調製物に組み込まれうる。医薬組成物の成分のより広い調査はRemigton ′s Pharmaceutical Sciences, 18thed，A.R.Gennaro，ed.，Mack，Easton，PA （1990）に見出だされる。造血系の疾病を治療するために使用するPBSFの投与は、治療する疾病の性質と重大さ、投与経路、他の治療法との組み合わせに於けるPBSFの使用を含む多数のファクターによって様々であろう。また、PBSFポリペプチドあるいは修飾がポリエチレングリコールのような水溶性高分子でなされうるPBSFの修飾形のin vivo 半減期も考慮するべきである。ここで使用するPBSFの“治療上有効な量”は、当業者によって、これらのファクターを考慮して決定できる。 PBSFは皮下、静脈内、筋肉内の注射によって、あるいは経口、経鼻投与によって投与されうる。投与経路は治療する個々の状態に依っていよう。多数の造血系の疾病の治療で、PBSFは単独で、あるいは他の治療法との組み合わせで使用しうる。好ましい具体例では、B細胞の疾病の治療で、PBSFはSCFおよびIL-7との組み合わせで使用される。Ｂ細胞の疾病治療のために、IL-1，IL-2， IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，低分子量Ｂ細胞成長因子（L-BCGF）、高分子量Ｂ細胞成長因子（H-BCGF）のような造血の各段階に関与することが知られている他の因子と共に、本因子はまた使用されうる。他の造血因子の投与は、PBSFの投与と同時に、前に、あるいは後で行いうる。骨髄の病気あるいは傷害から起こる多数の造血系の疾病を治療するために、PB SFは単独で、あるいは他の因子と共同で使いうる。これらの疾病は以下のものを含む。血球減少症、再生不良性貧血、脊髄形成異常症候群、白血病、幹細胞移植。更に、放射線治療あるいは化学療法から起こる骨髄傷害は、本因子での治療で克服されうる脊髄抑制（myelosuppression）に至る。好ましい具体例では、PBSF を、Ｂ細胞疾病、特にＢ細胞の減少を含む疾病の治療のために、SCFおよびIL-7 と一緒に投与する。Ｂリンパ球の減少は、免疫反応の抑制及び病気に対するより大きな感受性に至る。PBSFを免疫不全（immunocompromised）患者に投与するのも有効である。 PBSFは、同種遺伝子間の、異種遺伝子間の、あるいは自己の骨髄移植に先立って、骨髄に於けるＢ細胞の前駆体細胞の数を増大させるのに役立つだろう。本因子は患者に直接投与され骨髄でＢ前駆体細胞の産生を増大させうるし、移植に先立って骨髄培養物に体外で投与されうる。このような治療は移植の後、患者によって経験される免疫抑制の期間を減少させることが期待される。以下の実施例は、本発明をより充分に説明するために挙げるが、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例１ＰＢＳＦをコードするｃＤＮＡクローン（ｐ６４）の同定Ａ．リンパ球の分離Ｈｅｍａｃａｒｅ（ＳｈｅｒｍａｎＯａｋｓ，ＣＡ）から得た新鮮なバッフィコートから末梢血液のリンパ球を分離した。バッフィコートをリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）で３倍に希釈した。３０ｍｌの希釈したバッフィコートを５０ｍｌの培養チューブ（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）にピペットで入れ、１０ｍｌのフィコール−パック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の上に載せた。３２００×ｇで遠心の後、相間に存在する単核細胞を取り、３０ｍｌのＰＢＳで３回洗った。ペレットを５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０及び１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）に懸濁し、５０倍に希釈し、細胞数を決定した。Ｂ．サイトカイン発現の誘導約５×１０⁶細胞数／ｍｌをアメリカヤマゴボウ分裂促進因子（ｐｏｋｅｗｅｅｄｍｉｔｏｇｅｎ）（ＰＷＭ；１０μｇ／ｍｌ．Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共に１９時間インキュベートし、続いて１０μｇ／ｍｌまでシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）を加え６時間処理した。比較のため、細胞の同量をＰＷＭの存在下または不在下で、同時間インキュベートした。インキュベーションは３７℃、５％ＣＯ₂で実行した。Ｃ．ＲＮＡの分離誘導末梢血液のリンパ球からグアニジニウムチオシアネート技術（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４（１９７９））を使用して全ＲＮＡを分離した。簡単にいえば、遠心で細胞を集め、４％メルカプトエタノールを含む４Ｍグアニジニウムチオシアネート溶液に溶解した。付着性の細胞を同溶液で溶解し貯えた。１８ゲージニードルを３回通した後、５．７Ｍのセシウムクロライドのステップグラジエントに上層した。７６，０００×ｇの遠心をＢｅｃｋｍａｎＬ２超遠心機で、２４時間、２０℃で実行した。遠心後、ペレット状のＲＮＡを１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５プラス０．１％ＳＤＳに懸濁し、２．５倍量の１００％エタノールと０．３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を添加して沈殿させた。Ｄ．ポリＡ＋ＲＮＡの選別ポリＡ＋ＲＮＡをＭａｎｉａｔｉｓらの述べた方法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，１ｓｔｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒ，ＮＹ（１９８２））を使用して、オリゴ（ｄＴ）−セルロースのクロマトグラフィー（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で選別し、エタノール沈殿し、遠心した。最終のペレットを蒸留水に溶解し、分注して液体窒素にて保存した。Ｅ．ｃＤＮＡライブラリーの造成１０μｌ中の約５μｇのポリＡ＋ＲＮＡを室温で１０分、１０ｍＭの水酸化メチル水銀で変性させ、β−メルカプトエタノール最終濃度１０ｍＭ及びＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）最終濃度３ｕ／μｌを添加し、室温で５分インキュベートした。それから、示している最終濃度まで以下の成分を加えた：５０μｇ／ｍｌオリゴ（ｄＴ）、２ｍＭｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、第一鎖用緩衝液（ｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．６、７５ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、及び２０ｕ／μｌスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素（ＢＲＬ）。第一鎖合成を３７℃で１時間進行させた。混合液を第二鎖用緩衝液（２０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．５、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＫＣｌ、５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１０ｍＭジチオトレイトール、ＢＲＬ）、０．１２５ｕ／ μｌＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ（ＢＲＬ）、０．０８ｕ／μｌＲｎａｓｅＨ（ＢＲＬ）、０．１ｕ／μｌＥ．ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、及び０．１５ｍＭＮＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ）で希釈した。記述したすべての濃度は反応混合液のものである。反応混合液を１５℃で１時間、続いて２５℃で１時間インキュベートした。平滑末端を作るために、それからＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を最終濃度０．０１ｕ／μｌになるまで加え、３７℃で３０分インキュベートした。組み込まれなかったｄＮＴＰｓを２Ｍ酢酸アンモニウムの存在下で二回のエタノール沈澱で取り除いた。それから、以下の方法に従って、二重鎖ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩメチラーゼとＡｌｕＩメチラーゼ（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）でメチル化した。水中の二重鎖ｃＤＮＡへメチル化緩衝液、１００μＭＳ−アデノシルメチオニン、１ｕ／μｌのＡｌｕIメチラーゼを加え、３７℃で１時間インキュベートした。それからＮａＣｌを最終濃度０．１Ｍまで、ＥｃｏＲＩメチラーゼを最終濃度１０ｕ／μｌまで加えた。反応液を３７℃で３０分処理した。配列5′GCT TGA ATT CAA GC 3′（配列番号８参照）をもつオリゴ−アダプターをｃＤＮＡへ、一晩かけて、連結した。０．８％アガロースゲルでｃＤＮＡを電気泳動し、５００塩基対より長い分子をゲルから電気溶出した。溶出されたｃＤＮＡをフェノール／クロロホルムの１：１混合液で抽出し、エタノールで沈澱させ、水に懸濁し、続いて、分子の５′末端にＥｃｏＲＩ付着末端を、３′末端にＨｉｎｄ III付着末端を作るために、Ｈｉｎｄ IIIとＥｃｏＲＩで消化した。バクテリオファージＭ１３由来の複製起点を含む５９２塩基対のＡａｔ II／ＣｌａＩフラグメントを真核細胞の発現ベクターＶ19.8（ＰＣＴ出願ＷＯ９１／０５７９５に記述）へ挿入してベクターＶ19.10を作成し、Ｖ19.10をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ IIIで消化し、細菌のアルカリ性ホスファターゼで処理した。連結反応をｃＤＮＡとベクターＤＮＡの異なる比で実施し、トランスフェクション後の最高のクローン数を与える比を大規模の連結反応のために選択した。トランスフェクションのために受容能のあるＤＨ５ α Ｆ′Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使った。ライブラリーを１５枚の１５０ｍｍのプレート上で平板培養し、ＳＯＢ（Okayamaら， Methods in Enzymol．154,3(1987)）の存在下で掻き取って採取し、−８０℃で７％ＤＭＳＯ中に保存した。末梢血液のリンパ球から分離したポリＡ選別ＲＮＡから、別のｃＤＮＡライブラリーを造成した。この場合は、第一鎖ｃＤＮＡ合成を開始するのに、ランダムヘキサマ−プライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使った。オリゴｄＴ先導のライブラリーのために前述したように、二重鎖平滑末端ｃＤＮＡを造成した。配列番号９の配列を持つアダプター（In Vitrogen，San Diego，CA，カタログNo，N4 08-8）をｃＤＮＡに連結した。５′ ＣＴＴＴＣＣＡＧＡＣＡＣＡ３′ ＧＡＡＡＧＧＴＣＶ19.10のＨｉｎｄ IIIとＮｏｔＩ部位の間に、ｐＣＤＭ８（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄ III／ＮｏｔＩフラグメントを挿入して、Ｖ19.12を造成した。Ｖ19.12を制限酵素ＢｓｔＸＩで切断し、それからｃＤＮＡへ連結した。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ α Ｆ′宿主細胞の形質転換と細胞の保存を前述したように行なった。Ｆ．プローブの設計混合オリゴヌクレオチドプローブを、数種のサイトカインのシグナルペプチダーゼの切断部位近傍の配列相同性をもとに設計した。シグナルペプチダーゼ切断部位をコードするＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６の発表された配列（Wongら、Science 228，810(1985)；Nishidaら、Biochem．Bio phys．Res．Comm．143，345(1987)；Taniguchiら、Nature 302，305(1983)；Ya ngら、Cell 47，370(1986)；Mayら、Proc．Nall．Acad．Scl．83，8957(1986) ）を使用して、図１に示すようにプローブを設計した。プローブ混合物の縮重は、65,536であった。高い縮重度のため、シグナルペプダーゼ切断部位以外の領域で類似の配列を持つクローンを分離することが可能であった。Ｇ．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングオリゴｄＴプライマーの末梢血リンパ球のＤＨ５αＦ′Ｅ．ｃｏｌｉにおけるライブラリーの高密度（high density）スクリーニングをGENE SCREEN PLUS膜（ New England Nuclear/Dupont，Boston，MA）上に、１５０ｍｍプレート当たり約 10,000コロニーを平板培養することで行なった。二枚目の遺伝子スクリーン膜上にレプリカを作り、レプリカプレートのコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレートで一晩培養した。それから、レプリカ膜を、プラスミドＤＮＡの増幅のための１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上に置いた。一晩の増幅の後、コロニーのＤＮＡを、０．５ＮＮａＯＨと１．５ＭＮａＣｌで５分間処理し変性させ、続いて１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で再生させた。膜を空気乾燥し、真空中で８０℃、２時間焼いた。フィルターを２×ＳＳＣ中で湿らせ、続いて６ ×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で３０分間の前洗浄を２回行なった。前ハイブリダイゼーションを６×ＳＳＣ、５×Denhardt、０．１％ＳＤＳ中で、４〜５時間行なった。２０pmoleの混合オリゴヌクレオチドプローブを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使ってγ³²Ｐ−ＡＴＰでラベルし、入らなかったラベルをセファデックスＧ−５０カラムを用いて遠心で取り除いた。約２×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌを５５℃、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５×Denhardt溶液のハイブリダイゼーションで使った。２０時間後、フィルターを６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、５５ ℃で、３０分間、２回洗浄した。更にもう一回の洗浄を同温度で、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで行なった。一晩さらした後、陽性シグナル区域に対応しているマスタープレートの区域をこすりとり、ＳＯＢに懸濁した。コロニーの一連の希釈段階のものを、二次スクリーニング用のアンピシリンプレート上で培養した。個々のコロニーを同定し、プラスミドＤＮＡの分離のため一晩培養した。最終のスクリーニングを、異なるコロニーからのプラスミドＤＮＡへオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせることにより行なった。この方法で約８０の陽性クローンを同定した。陽性クローンからのプラスミドＤＮＡの両鎖の配列を、19.10ベクターの挿入ｃＤＮＡの５′と３′の配列へハイブリダイズするプライマーを使って決定した。ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列決定は、Ｓａｎｇｅｒら（Proc．Natl，Acad． Sci．74，5463(1977)）によって述べられた方法で行なった。ＤＮＡ配列を、種々のバージョンのGenBank配列データベースに存在するＤＮＡ配列と比較した。G enBankにないＤＮＡ配列だけを、完全な長さのクローンの配列を得ることによって及びGeneticsComputer Group（University of Wisconsin）のソフトウェアパッケージを使用してＤＮＡ配列を分析することによって更に特徴づけた。更に研究したクローンの一つをｐ６４と命名した。末梢血液のリンパ球由来のオリゴｄＴプライマーのｃＤＮＡライブラリーから分離したｐ６４クローンは、イニシエーターであるメチオニン残基の無いことで示されるように遺伝子の５′末端を欠いていた。ｐ６４の完全長のクローンを得るために、Clontech Laboratories（Palo Alto, CA，カタログNo，HL1068b）からのＰＭＡで活性化したＨｕｔ７８ λ ｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーを、ｐ６４ｃＤＮＡクローンをプローブとして探索した。１５０ｍｍプレート当たり、約10,000〜20,000プラークをGene Screenフィルターにレプリカ培養し、ランダムプライミング法（the random priming method）によって³²Ｐでラベルしたｐ６４クローンをプローブとして探索した。二次スクリーニングの後、個々の陽性コロニーを同定した。陽性ラムダｃＤＮＡクローンをＥｃｏＲＩで切断することで挿入ＤＮＡを得て、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ II プラスミド（St ratagene，La Jolla，CA）にサブクローンし、配列を決めた。このクローンは上流コード領域の配列を含んでいたが、イニシエーターのメチオニンのコドンをまだ欠いていた。完全長のｐ６４クローンを得るためのもう一つの試みで、プローブとしてＨｕｔ７８ライブラリーから分離されたｐ６４ｃＤＮＡクローンを使って、Ｖ19.12の末梢血液のリンパ球のランダムプライマーからのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。多数の陽性にハイブリダイズしたクローンを得て、挿入ＤＮＡをＭ１３ｍｐ２１にサブクローンし、ＤＮＡ配列を決定した。いくつかのクローンはＨｕｔ７８クローンと同一のコード領域をもっていたが、更にイニシエーターのメチオニン残基をコードする配列も含んでいた。一つの分離クローンはｐ６４の完全なコード領域を有する約１７８０塩基対の挿入を含んでいた。このクローンは、Ｂ細胞前駆体刺激因子又はＰＢＳＦと命名したポリペプチドをコードする。プラスミドＶ19.12に挿入され、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αＦ′株を形質転換したこの１．７８ｋｂのＤＮＡフラグメントを受託番号で、Amer ican Type Culture Collection（ATCC）に寄託した。Ｈ．ＤＮＡ配列決定及び解析ＰＢＳＦ配列と核酸レベルおよびアミノ酸レベルで同一の、あるいは高い相同性を有する配列を見出すために、GenBank，EMBL及びSwiss Protデータベースを検索した。GCG SoftwarePackageのＦａｓｔＡ及びＴｆａｓｔＡプログラムを使って、検索を行なった。Ｍａｐ及びＴｒａｎｓｌａｔｅプログラムを使って、核酸構造の解析を行なった。Pepplot，Pepstructure，Motifs，Isoelectricプログラムを使用して、ＰＢＳＦのアミノ酸配列を解析した。シグナルペプチダーゼの切断部位を予測するために、Ｓｉｇｓｅｑ１プログラムを使用した。ＰＢＳＦ配列とデータベースに存在する配列を比較するために、GenBank EMBLデータベースの多方面の検索を行なった。検索のどれも、ＰＢＳＦとデータベースの配列に高い相同性を示さなかった。Ｉ．ＰＢＳＦ遺伝子及びコードされる蛋白質ｈｕｔ７８ライブラリーから、オリゴｄＴプライマー及びランダムプライマーのＰＢＬライブラリーから得られたｃＤＮＡクローンから導かれるｐ６４のＤＮＡ配列は、図２と配列番号１に示されている。配列の長さは２３７６塩基対である。ＤＮＡ配列から導かれるｐ６４蛋白質のサイズは約５２ｋＤａであり、リーダー配列を含む４９１のアミノ酸を含む。シグナルペプチダーゼ切断部位は、 von Heinje（Nuc．Acid Res．14，4683(1986)）によって記載されているように、配列番号１においてポジション１４のアミノ酸残基アラニンとポジション１５のスレオニンの間にあると予測される。ポジション３１のセリンとポジション３２のリジンの間の切断の可能性もある。多数のＴＡＴＴ及びＴＴＴＴモチーフを含む長い３′端の非翻訳領域がある。前述のモチーフは多数のサイトカイン分子に存在する（Shawら、Cell49，659(1986)）。予測される蛋白質は疎水性のアミノ末端を有する。六つのシステイン残基がある。GCG software packageのISOELECTRICプログラムで予測されたように等電点は７．２５である。Ａｓｎ²⁹とＡｓｎ³⁹⁶の二つに可能性のあるＮ−連結グリコシル化部位がある。更に、四つの可能性のあるプロテインキナーゼＣのリン酸化部位と五つのクレアチンキナーゼIIのリン酸化部位がある。実施例２組換えＰＢＳＦ蛋白質の発現Ａ．Ｃｏｓ細胞での発現エレクトロポレーションによる１．７８ｋｂＰＢＳＦｃＤＮＡの挿入を含むＶ１９．１２ＤＮＡで、Ｃｏｓ細胞をトランスフェクションした。２ｍｍ間隔のキュベットを使って４００μｌの容積及び１５０ボルトの負荷電圧で、５００ボルト／容量及び抵抗、１００μＦの容量、４８オームの抵抗で、electro cell manipulator 600（BTX，San Diego，CA）を使用して、ＰＢＳ中の約３×１０⁶細胞をエレクトロポレーションした。パルスの長さは８．３ないし１０．５msecであった。キュベットを５分間氷上に保ち、続いて１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで希釈し、１０ｃｍプレート上で平板培養した。３７℃、５％ＣＯ₂で一晩インキュベーションの後、死細胞を除くために培地を替えた。無血清のＤＭＥＭをプレートに加え、７２時間後バイオアッセイのために、コンディショニングされた培地（conditioned medium）（CM）を収穫した。ＣＭをフィルター殺菌し、分注し、−２０℃で凍らせた。後述するｐ６４融合蛋白質に対し産生された抗体を使って、ウェスタンブロット分析によって、培地に於けるｐ６４蛋白質の存在を検出した。Ｂ．チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現定常的にＰＢＳＦを産生するＣＨＯ細胞は以下のように作られた。ＰＢＳＦのコード領域を含むベクターｐＤＳＲα２（ＰＣＴ出願ＷＯ９１／０５７９５）で、ＣＨＯ（ＤＨＦＲ^-）細胞をトランスフェクションした。ＰＢＳＦコード領域を増幅するために、ＰＣＲで以下のプライマーを使った： 5′TGTCCTCCGGCCCGAGATGA（配列番号１に於いてヌクレオチド12 -31）； 5′GGTTTGTGTTTTATGATACATTAC（配列番号１に於いてヌクレオチド1567-1590）増幅ＤＮＡをＨｉｎｄ IIIとＳａｌＩで切断し、ｐＤＳＲα２にクローンした。透析した血清を含む培地でトランスフェクションを受けた細胞の第一回の選別の後、プラスミド増幅のために、最終濃度１μＭまでのメトトレキセートの増大する濃度存在下、細胞を更に選別した。ＰＢＳＦ遺伝子の発現の検討のため、ドットノーザンハイブリダイゼーションによって、選別したコロニーをチェックした。無血清ＤＭＥＭ中で７２時間、ＣＨＯ（ＤＨＦＲ^-）細胞を培養することによって、バイオアッセイ用のコンディショニングされた培地を生成させた。Ｃ．ＰＡ３１７細胞での発現骨髄増殖性肉腫ウィルス（myeloproliferative sarcomavirus）（MPSV）のプロモーターの下にＰＢＳＦの発現のため、mpZenベクター（Johnson Dev．Biol． Stand，69，3(1988) ）に、ＰＢＳＦをコードする１．７８ｋｂＨｉｎｄ III フラグメントを挿入した。プラスミドＳＶ２−Ｎｅｏと一緒に、ＰＢＳＦ遺伝子を含むmpZenで、エレクトロポレーションによってＰｓｉ２細胞（Millerら，Biotechnique 7,980-990(1989)）をトランスフェクションした。高レベルのＰＢＳＦを産生するコロニーを同定するため、Ｇ４１８上でネオマイシン耐性コロニーを選別し、ＲＮＡをドットブロットし、ハイブリダイズさせた。amphitrophic packagingな細胞株ＰＡ３１７（Millerら，Mol．Cel l．Biol．6，2895-2902(1986)）を感染させるために、高レベルの生産細胞からのコンディショニングされた培地をポリブレンの存在下で使用した。バイオアッセイのために及びベビーマウスの感染のために、トランスフェクションを受けたＰＡ３１７培地からコンディショニングされた培地を生成させた（下記参照）。骨髄移植実験のためにも、これらの細胞を使用した。実施例３ＰＢＳＦ融合蛋白質の発現と抗体の生産Ａ．Ｅ．ｃｏｌｉ融合蛋白質ヒトコンセンサスインターフェロンまたはウシ成長ホルモンとの融合蛋白質を生産するために、ＰＢＳＦのためのＨｕt ７８由来のｃＤＮＡクローンを使用した。ヒトコンセンサスインターフェロンの最初の８０アミノ酸またはウシ成長ホルモンの最初の１０８アミノ酸を含むＤＮＡフラグメントをｐ６４コード領域のＡｓｎ²残基でフレームを合わせて融合させた。コンセンサスインターフェロン−ＰＢＳＦまたはウシ成長ホルモン−ＰＢＳＦ融合蛋白質を、ｐＣＦＭ７３６（ｐＣＦＭ７３６は米国特許第4,710,473号明細書に記述されている）の修飾版であるプラスミドｐＣＦＭ７５６のＰ_Lプロモーターから発現させた。融合蛋白質をコードしている遺伝子でＥ．ｃｏｌｉＦＭ５をトランスフェクションし、ＯＤ６００が０．３ないし０．５になるまで、２８℃で培養した。それから、２〜３時間、温度を４２℃に上げた。封入体（inclusion body）の出現が光学顕微鏡で観察された。それからＥ．ｃｏｌｉ細胞をラエミリ緩衝液（Laemm1i buff er）で溶菌し、１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。蛋白質バンドがクーマシーブルー染色で観察された。コンセンサスインターフェロン−ＰＢＳＦ融合蛋白質の発現を図３に示す。Ｂ．抗体生産前述したように、コンセンサスインターフェロン−ＰＢＳＦまたはウシ成長ホルモン−ＰＢＳＦ融合蛋白質を生産するＥ．ｃｏｌｉを培養し、５００ｍｌバッチに入れた。遠心後、ペレット状の細胞を冷却水に懸濁し、7500ｐｓｉで３回フレンチプレスを通して細胞を破砕した。遠心後、Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質の汚染を減少するために、ペレット状の封入体を５Ｍ尿素で抽出した。融合蛋白質を、Hunkapiller M.ら（Methods in Enzymol．91，227-236）によって記述されたように、ポリアクリルアミドゲルから分離した。ゲルから分離した融合蛋白質を凍結乾燥し、抗体を生産させるためにウサギに注射した。あるいは、配列番号１０に示してあるようなＰＢＳＦペプチドフラグメント（Cys-Arg-Glu-Lys-Lys-Thr-Glu-Asn-Ser-Lys-Leu-Arg-Ly s-Val-Lys-Tyr）を合成し、keyhole limpetのヘモシアニン（CalBiochem，La Jo lla，CA，カタログNo.374811）へ結合させ、抗体を生産させるためウサギへ注射した（Liuら，Biochem．18，690-697(1979)）。実施例４ＰＢＳＦの精製Ａ．ウサギ抗ＰＢＳＦ抗体の精製及び臭化シアン活性化セファロースでの固定化 Affi-gel Protein A MAPS kitで、製造業者によって発表された方法を使って、Affi-gel Protein Aアガロースカラム（Bio-Rad，Richmond，CA，カタログNo.153-6153）上でウシ成長ホルモン−ＰＢＳＦ融合蛋白質に対する粗ウサギ抗体を精製した。IMMUN0PURE Antigen/Antibod y Immobilization kit（Pierce，Rockford，IL，カタログNo.44890）の一部として発表されている方法を使って、臭化シアン活性化をセファロースへ精製抗体を結合させた。Ｂ．ＰＢＳＦの精製ｍｐＺＥＮ−ＰＢＳＦでトランスフェクションしたＰＡ３１７細胞からのコンディショニングされた培地がＰＢＳＦの採取源であった。抗体カラムへサンプルを流入させ、カラムからＰＢＳＦを溶出させるために使用された方法は IMMUN0 PURE kitに述べられている。カラムからの溶出後、精製ＰＢＳＦをＰＢＳに対し透析し、１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色で解析した。結果を図４に示す。実施例５ＰＢＳＦのｉｎｖｉｔｒｏでの生物活性コロニー形成アッセイ以前に述べられた方法（Bradleyら，J．Cell Physiol．94，507(1978)）で、３５ｍｍのプレートの二重層寒天に、正常な成長Ｂａｌｂ／ｃマウスまたは５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）で前もって処理したマウスから得られた骨髄細胞を置いた。２０％ウシ胎児血清で補給したＥａｇｌｅ’s ＭＥＭのα修飾（Flow Labs，McLean，VA）を、すべての培養に使用した。全培養容積（１．５ｍｌ／プレート）の１３．２％に当たる最大に達した時、下層に成長因子（SCF，IL-7及びPBSF）を注入した。培養物に５％Ｏ₂：１０％ＣＯ₂：８５％Ｎ₂の混合ガスを供給し、１０ないし１４日間インキュベートした。５０以上の細胞を含むコロニーだけを記録した。 Martinらの Cell 63，203（1990）で述べられたようにＥ．ｃｏｌｉで発現させ、精製した１６４アミノ酸をもつ組換えラット幹細胞因子（ｒｒＳＣＦ１６４）と組換えヒトIL-7（Biosource International，Westlake，CA）との存在下に、すべてのコロニー形成アッセイを行なった。培養液最終濃度２００ｎｇ／ｍｌで、ｒｒＳＣＦ１６４と組換えヒトＩＬ−７を各々加えた。図５Ａで、ベクター 19.12または1.78ｋｂＰＢＳＦＤＮＡフラグメントを含むベクター19.12でトランスフェクションされたＣｏｓ細胞に由来のコンディショニングされた培地で剌激された前Ｂ細胞形成を比較するために、アッセイを行なった。図５Ｂで、レトロウィルスのベクターｐＺｅｎにＰＢＳＦ遺伝子をもつＰＡ３１７細胞から産生されたコンディショニングを受けた培地による前Ｂ細胞形成を測定するためにアッセイを行なった。図５Ｃでは、実施例４で述べたように調製した精製ＰＢＳＦを指示体積で骨髄細胞に加えた。前Ｂ細胞の出現は、形成したコロニーがＢ２２０抗原と細胞質μ鎖を発現するが、表面Ｉｇは発現しないということを実証することによって証明された。実施例６ＰＢＳＦのＩｎＶｉｖｏでの生物活性Ａ．トランスジェニックマウスＰＢＳＦ遺伝子を持つ１．７８ｋｂのＨｉｎｄ IIIフラグメントを、Ｖ19.12 に類似であるが、ＳＶ４０の初期プロモーターの代わりにラットアルブミンプロモーターを含むＶ19.13でクローンした。ラットアルブミンプロモーターとエンハンサーの３′端へ、ＤＮＡフラグメントを挿入した。アルブミンプロモーターを含むＰＢＳＦｃＤＮＡのコード配列をＣｓＣｌのバンドで精製し、１×注入用緩衝液（注入用緩衝液は１０ｍＭトリス、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に対し透析した。１〜２ｎｇ／μｌのＤＮＡ（線状ＤＮＡの約５００コピーに匹敵）を卵１個当たり注入した。注入卵を偽妊娠マウスへ移植し、２０日後に子が生まれた。子マウスに於けるＰＢＳＦＤＮＡの存在を、尾から分離したＤＮＡのＰＣＲ増幅で決定した。尾から採った血液を、白血球、赤血球、血小板の数を数えるためにＳｙｓｍｅｘで分析した。それから、そのマウスを繁殖させ、Ｆ１動物を作った。ＰＢＳＦ遺伝子の存在を検出するため、Ｆ１をスクリーニングした。ＰＢＳＦの発現を検出するため、逆転写酵素とＰＣＲで、Ｆ１マウスの肝臓、骨髄、脾臓、筋肉から分離したＲＮＡをスクリーニングした。ＰＢＳＦ発現の組織効果を特徴づけるために、Ｆ１の、異なる器官を分離し、組織化学的分析のために固定し、薄片にした。Ｂ．ベビーマウスへのレトロウィルスの感染ｍｐＺｅｎベクター、Ｇ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含むｍｐＺｅｎベクター、あるいはＰＢＳＦ遺伝子を含むｍｐＺｅｎのいずれかでトランスフェクションを受けたＰＡ３１７細胞のコンディショニングされた培地及びモロニーウィルス（Moloney virus）で感染させたＮＩＨ３Ｔ３細胞のコンディショニングされた培地の混合物５０μｌを、３〜４日齢のベビーＢａｌｂ／ｃマウスに筋肉注射した。ＰＡ３１７のコンディショニングされた培地と３Ｔ３のコンディショニングされた培地との比は１０：１（ｖ／ｖ）であった。１，２，３カ月後に、尾の静脈から血液を、ＥＤＴＡで被覆した無菌チューブ（microfug e tube）に入れた。ギムザ染色（Giemsa staining）及び構成分を数えるために、血液塗沫標本を調製した。白血球、赤血球及び血小板の数を数えるため、血液のＳｙｓｍｅｘ分析を行なった。死に際して、あるいは安楽死の後、組織化学的分析のために、選別した生きている器官を採取した。Ｃ．骨髄遺伝子移植骨髄細胞を破壊するため、Ｂ５７／Ｊマウスに放射線をあてた。それから、ｍｐＺｅｎベクター、あるいはＧ−ＣＳＦかＰＢＳＦ遺伝子を含むベクターを持つＰＡ３１７細胞の５日間の共生培養によるｉｎｖｉｔｒｏ感染の後のドナーの動物からの骨髄細胞を上記マウスに移植した。生存で移植が成功したことを確認後、血液からＲＮＡを分離し、それぞれの外来遺伝子が発現しているか確かめるために、ＲＮＡを分析した。それから、Ｓｙｓｍｅｘで血液の各成分を分析した。実施例７ＰＢＳＦ発現の誘導と組織特異性Ａ．ＰＢＳＦ発現の誘導サイトカイン合成を刺激すると一般に知られている条件下で、ｐ６４発現が誘導されうるかどうかを決めるために、様々の誘導条件下でＰＢＳＦ発現を研究した。実施例１Ｂと１Ｃで述べたように、未処理の、あるいはアメリカヤマゴボウ分裂促進因子（PWM）で処理した、またはＰＷＭとシクロヘキシミドで処理した末梢血リンパ球からＲＮＡを分離した。1.2％アガロースゲルでＲＮＡを電気泳動し、ランダムプライマー法によって³²Ｐでラベルした、末梢血リンパ球のオリゴｄＴプライマーのライブラリーからのＰＢＳＦｃＤＮＡクローンをプローブとして、ＲＮＡを研究した。結果を図６に示す。ノーザンブロットによって、ヒト白血病細胞の分化誘導の間のＰＢＳＦの発現もまた分析した。ヒト起源の骨髄腫単球細胞（myelomonocytic cell）の三つの株（HL−60，ATCC No.CCL-240；KG-1，ATCC No.CCL-246；ML-1，（Samalら，L euk.Res．14，575-580(1990)））を、ＰＭＡ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、あるいはＴＮＦとＩＬ−６での処理によってマクロファージへ分化するよう誘導した。ＲＮＡを分離し、ＰＷＭ及びシクロヘキシミド誘導のために述べたように、そのＲＮＡをノーザン分析に供した。図７にその結果を示す。ＰＭＡで誘導したＨＬ−６０細胞にＰＢＳＦのｍＲＮＡ合成の最高のレベルを観察した。ＫＧ−１とＭＬ−１細胞ではいかなる条件でも、ｐ６４のｍＲＮＡの非常に低いレベルしか検出しなかった。Ｂ．ＰＢＳＦ発現の組織特異性ノーザン分析及びＲＴ／ＰＣＲの両方で、Ｐ−６４の組織特異的発現を決めた。プローブとして、セクションＡで述べた³²ＰラベルＰＢＳＦクローンを使って、ノーザンブロットで、ヒト脳、肺、胎盤（すべてClontech Laboratoriesから購入）の全ＲＮＡ約１０μｇとヒーラ及びＰＭＡ活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞からのＲＮＡ１０μｇを分析した。ＰＢＳＦのｍＲＮＡが肺組織とヒーラ細胞に存在していることを見出した。ＲＴ／ＰＣＲ分析を使って（Noonanら，Nucleic Acid Res.16，10366(1988)）、同様の結果を得た。ヒーラ細胞及びヒト脳、心臓、骨格筋、脾臓、胸腺、骨髄、腎臓、肝臓、肺、精巣、胎盤からの全ＲＮＡ約１０μｇから、実施例１Ｅで述べたように、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。次の配列をもつ二つのプライマーを使って、自動サーモサイクラー（thermocycler）（PerkinElmer Cetus）でＰＢＳＦのｍＲＮＡを増幅した。 5′AGGGATGGAACTACATTC 3′（センスプライマー） 5′TCATAGCTATCGCTGACC 3′（アンチセンスプライマー）センスプライマー配列は、配列番号１のヌクレオチド323−340に対応し、アンチセンスプライマーは配列番号１のヌクレオチド855−872に相補的である。アニーリング温度を、プライマー−鋳型複合体の融解温度（Ｔｍ）の約２℃下にするようなストリンジェントな条件下で、計２７回のサイクルで、プライマーをハイブリダイズさせた。１．５％アガロースゲルで、結果として起こるプライマーからの産物を分析した。図８に、結果を示す。ＰＢＳＦのｍＲＮＡは、ヒーラ細胞、骨髄、肝臓、肺で発現し、４０回以上のサイクルを除いて、実験した他の組織でほとんど検出されなかった。増幅した産物がＰＢＳＦであるという同定は、サザンブロット分析で証明した。プローブとして、ランダムプライミングによって³²ＰでラベルしたＰＢＳＦクローンの１１９０塩基対のＨｉｎｄ III／Ｘｂａ I サブフラグメントを使った。本発明は好ましい実施態様で記述してあるが、当業者が変形及び修飾を考えることが理解される。それ故、以下の請求の範囲は、本発明の範囲内に入る均等な変形をすべて含むものである。配列表（１）配列番号１（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：２３７６（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：（２）配列番号２（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：４５（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：（３）配列番号３（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：４５（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：（４）配列番号４（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：４５（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：（５）配列番号５（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：４５（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：（６）配列番号６（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：４５（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：（７）配列番号７（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：３０（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：（８）配列番号８（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：１４（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：（９）配列番号９（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：１３（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：（１０）配列番号１０（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：１６（Ｂ）配列の型：アミノ酸（ｘｉ）配列：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 1/22 8318−4Ｈ 16/24 8318−4Ｈ 19/00 8318−4ＨＣ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡＣ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4ＣＵ 9284−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＹ (Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．前Ｂ細胞の産生を刺激する活性を有する精製単離したポリペプチド。２．幹細胞因子及びインターロイキン−７の存在下で、前Ｂ細胞の産生を刺激する活性を有する請求項１のポリペプチド。３．配列番号１のアミノ酸配列を有する請求項１のポリペプチドまたはその生物活性フラグメントもしくはアナログ。４．配列番号１の残基15ないし491のアミノ酸配列または残基32ないし491のアミノ酸配列を有する請求項３のポリペプチド。５．外来ＤＮＡ配列の原核細胞または真核細胞による発現の産物であることを特徴とする請求項３のポリペプチド。６．ＣＨＯ細胞による発現の産物である請求項５のポリペプチド。７．外来配列がｃＤＮＡ配列である請求項５のポリペプチド。８．外来配列がゲノムＤＮＡ配列である請求項５のポリペプチド。９．外来配列が合成ＤＮＡ配列である請求項５のポリペプチド。 10．外来配列が、自律的に複製するＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターに担われる請求項５のポリペプチド。 11．検出可能な標識と共有結合することで更に特徴づけられる請求項１または５のポリペプチド。 12．水溶性ポリマーと共有結合することで更に特徴づけられる請求項５のポリペプチド。 13．該ポリペプチドのアミノ末端部分から伸びているメチオニン残基を有する請求項５のポリペプチド。 14．1）配列番号１のＤＮＡ配列及びその相補鎖、 2）1）の配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列、 3）遺伝コードの縮重を除いて、1）及び2）の配列とハイブリダイズするであろうＤＮＡ配列、からなる群から選ばれたＤＮＡ配列であって、前Ｂ細胞の産生を刺激する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。 15．ｃＤＮＡである請求項14のＤＮＡ配列。 16．ゲノムＤＮＡである請求項14のＤＮＡ配列。 17．合成ＤＮＡである請求項14のＤＮＡ配列。 18．検出可能な標識と共有結合した請求項14のＤＮＡ配列。 19．E.coli宿主細胞での発現のために好ましい一つ以上のコドンを含む請求項14 のＤＮＡ配列。 20．本質的に配列番号１からなる請求項14のＤＮＡ配列。 21．請求項14または20記載のＤＮＡ配列を含む生物機能を有するプラスミドまたはウイルスＤＮＡベクター。 22．請求項21記載のＤＮＡベクターで安定に形質転換された、あるいはトランスフェクトされた原核細胞あるいは真核細胞の宿主細胞。 23．ポリペプチド、フラグメント、またはアナログを発現させるように請求項14 または20記載のＤＮＡ配列で形質転換された、あるいはトランスフェクトされた原核細胞あるいは真核細胞の宿主細胞により発現されたポリペプチド産物。 24．請求項１または４記載のポリペプチドの精製法であって、 1）因子に特異的に結合する抗体を、固体支持体に結合させること、 2）ポリペプチドを抗体に選択的に結合させるように、ポリペプチドを含む溶液と前記結合抗体を接触させること、 3）結合したポリペプチドを溶出すること、からなる精製法。 25．請求項４記載のポリペプチドの生産方法であって、該ポリペプチドを発現させるように、請求項13、14、または21 記載のＤＮＡ配列で形質転換された、あるいはトランスフェクトされた原核細胞あるいは真核細胞の宿主細胞を、適切な栄養条件下で培養すること、および上記ＤＮＡ配列から発現された該ポリペプチドを分離することを含む方法。 26．治療上有効量の請求項１のポリペプチドおよび医薬として受け入れられる希釈剤、アジュバント、または担体を含む医薬組成物。 27．IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、SCF、L-BCGF、またはH-BCGF の一つ以上の治療上有効量と共に、請求項１記載のＰＢＳＦの治療上有効量を投与することを含む哺乳動物の造血系疾病を治療する方法。 28．IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、SCF、L-BCGF、またはH-BCGFの一つ以上の治療上有効量と共に、請求項１記載のポリペプチドの治療上有効量を投与することを含む、骨髄移植を受けている患者を治療する方法。 29．造血系疾病が前Ｂ細胞の不足であり、IL-7およびSCFと共にＰＢＳＦを投与する請求項27の方法。 30．配列番号１の位置２ないし491のアミノ酸配列を持つポリペプチドにフレームを合わせて融合した、ヒトコンセンサスインターフェロンまたはウシ成長ホルモンのアミノ末端からのアミノ酸配列の一部または全部を含む融合蛋白質。 31．E.coli宿主細胞に於ける発現の産物である請求項30記載の融合蛋白質。 32．請求項１のポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに特異的に結合する抗体。 33．請求項31の融合蛋白質に特異的に結合する抗体。 34．モノクローナル抗体である請求項32または33の抗体。