WO2005072767A1 - 糖代謝機能改善剤 - Google Patents

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WO2005072767A1
WO2005072767A1 PCT/JP2005/001256 JP2005001256W WO2005072767A1 WO 2005072767 A1 WO2005072767 A1 WO 2005072767A1 JP 2005001256 W JP2005001256 W JP 2005001256W WO 2005072767 A1 WO2005072767 A1 WO 2005072767A1
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amino acid
acid sequence
nucleotide
seq
sequence represented
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PCT/JP2005/001256
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Inventor
Iichiro Shimomura
Atsunori Fukuhara
Masako Nishizawa
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Intellectual Property Consulting Incorporated
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes

Definitions

  • the present invention relates to a glucose metabolism-related disorder, more specifically, a glucose metabolism-related disease, which has an activity of promoting insulin signaling such as a glucose uptake promoting activity in muscle or a gluconeogenesis inhibitory activity in liver. And a therapeutic or prophylactic agent.
  • Diabetes is a state in which the homeostasis of glucose metabolism (sugar renewal and clearance) in a living body is disrupted, particularly a condition in which a hyperglycemic state is maintained. Behind the pathology of diabetes are insufficiency in secretion and insufficiency of insulin, a glycemic control hormone. It can be treated or prevented.
  • insulin has been known as an in vivo substance (hormone) that improves glucose metabolism, and there is a need for a drug that is superior in the ability of insulin preparations to improve glucose metabolism.
  • Patent Document 1 a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used for diagnosing fat storage syndrome (see Patent Document 1), and has a function of promoting fat storage in fat cells (Patent Document 1). 2) are known.
  • Patent Document 1 a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used for diagnosing fat storage syndrome (see Patent Document 1), and has a function of promoting fat storage in fat cells (Patent Document 1). 2) are known.
  • Patent Document 2 the insulin-like activity of the protein was not known.
  • Patent Document 1 WO 00/62073 pamphlet
  • Patent Document 2 WO 02/10772 pamphlet
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a novel agent for improving glucose metabolic function, more specifically, a therapeutic or preventive agent for a glucose metabolism-related disease, which has an insulin signal transmission promoting activity. It is in.
  • the present inventors have conducted intensive studies under such circumstances, and as a result, it has been found that a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has an activity of improving glucose metabolism function, specifically, an activity of promoting insulin signaling.
  • the present inventors have found that they have an effect of improving the glucose metabolism function in vivo, and have completed the present invention.
  • the present invention provides
  • An agent for treating or preventing a glucose metabolism-related disease comprising as an active ingredient a protein consisting of a protein or a fragment thereof.
  • insulin-like activity is an insulin signaling promotion activity in fat cells, hepatocytes or muscle cells.
  • insulin-like activity is a gluconeogenesis inhibitory activity in hepatocytes or a glucose uptake promoting activity in muscle cells.
  • (C) a nucleotide sequence encoding a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • (G) a base sequence having at least 80% sequence identity with the base sequence represented by the 18th to 1493th nucleotides in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 Having a sequence, and having the protein power S insulin-like activity encoded by the base sequence, a base sequence, or
  • (H) a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence from the 18th nucleotide to the 1493th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions A nucleotide sequence having an insulin-like activity;
  • An agent for treating or preventing a glucose metabolism-related disease comprising a potent base sequence or a fragment thereof as an active ingredient.
  • insulin-like activity is a gluconeogenesis inhibitory activity in hepatocytes or a glucose uptake promoting activity in muscle cells.
  • a third step of evaluating the insulin-like activity of the test substance by comparing the measured values obtained when the first step and the second step are performed using a protein consisting of any one of the above amino acid sequences;
  • a method for assaying insulin-like activity comprising:
  • Insulin signaling promotion activity S Insulin signaling promotion activity S, insulin receptor, IRS_1, PI3 kinase 15.
  • test substance has any one of the following amino acid sequences (a) to (h):
  • a method for assaying the regulatory activity of a test substance for insulin-like activity comprising the step of determining whether or not to regulate the expression of a protein consisting of: or a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the protein.
  • a candidate substance for a therapeutic or prophylactic agent for a glucose metabolism-related disease is selected by using, as an index, the insulin-like activity-modulating activity of a test substance measured by the assay method described in Item 21. For searching for a therapeutic or prophylactic agent for a sugar metabolism-related disease
  • the therapeutic or preventive agent for a glucose metabolism-related disease is an insulin signal transduction promoter in muscle cells, fat cells or hepatocytes.
  • the therapeutic or preventive agent for a glucose metabolism-related disease is a gluconeogenesis inhibitor in the liver.
  • the therapeutic or prophylactic agent for the sugar metabolism-related disease is selected from the group consisting of polypeptides, nucleic acids, sugar chains, lipids, low organic molecules, and complex molecules thereof.
  • a therapeutic or preventive agent for a glucose metabolism-related disease comprising as an active ingredient a substance selected by the search method according to item 31.
  • a system for assaying a modulatory activity of a test substance for insulin-like activity comprising:
  • nucleic acid comprising a base sequence encoding the protein
  • a system comprising:
  • the determination means includes a means for measuring the expression level of the protein or a means for measuring the expression level of the nucleic acid.
  • a system for searching for a therapeutic or preventive agent for a sugar metabolism-related disease comprising:
  • nucleic acid comprising a base sequence encoding the protein
  • a system comprising:
  • the activity of regulating insulin-like activity is enhanced by insulin-like activity, and the enhancement is performed by maintaining or increasing the expression level of the protein or the nucleic acid.
  • a method for treating or preventing a glucose metabolism-related disease comprises: A) a protein having the following amino acid sequence:
  • (C) a nucleotide sequence encoding a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • (G) a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with the nucleotide sequence represented by the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and The sequence encodes a protein that has S-insulin-like activity, a base sequence, or
  • (H) a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions
  • the base sequence is A protein sequence that has S-insulin-like activity
  • a method comprising:
  • step A) comprises administering a therapeutic or prophylactic agent for the sugar metabolism-related disease according to item 1, 6, or 36 to a subject in need of treatment.
  • (C) a nucleotide sequence encoding a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • (G) a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with the nucleotide sequence represented by the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and The sequence encodes a protein that has S-insulin-like activity, a base sequence, or
  • (H) a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence from the 18th nucleotide to the 1493th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions A nucleotide sequence having an insulin-like activity;
  • composition for regulating insulin-like activity comprising a base sequence consisting of or a fragment thereof as an active ingredient.
  • (C) a nucleotide sequence encoding a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (D) a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence in which methionine is added to the amino terminus in the amino acid sequence of (C),
  • (G) a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with the nucleotide sequence represented by the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and The sequence encodes a protein that has S-insulin-like activity, a base sequence, or
  • (H) a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence from the 18th nucleotide to the 1493th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions A nucleotide sequence having an insulin-like activity;
  • nucleotide sequence consisting of or a fragment thereof in the treatment or prevention of a sugar metabolism-related disease.
  • (C) a nucleotide sequence encoding a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • (G) a base sequence having 80% or more sequence identity with the base sequence represented by the 18th to 1493rd nucleotides in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and The protein encoded by the sequence has S insulin-like activity, Base sequence, or
  • (H) a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence from the 18th nucleotide to the 1493th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions A nucleotide sequence having an insulin-like activity;
  • nucleotide sequence consisting of or a fragment thereof in the manufacture of a composition for regulating insulin-like activity.
  • (C) a nucleotide sequence encoding a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • (G) a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with the nucleotide sequence represented by the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and The sequence encodes a protein that has S-insulin-like activity, a base sequence, or
  • (H) a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions
  • Adipose tissue produces various secreted proteins (fat site force-in) and their role in metabolism is important.
  • the present inventors have identified a new fat site force-in in the present invention and have named it "visfatin”.
  • Visfatin is highly accumulated in visceral fat in both humans and mice, and its plasma levels are elevated in obese states.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a 52-kilodalton cytokinin previously known as a B cell precursor colony promoting factor (PBEF), and is expressed on a lymphocyte. It was known to be expressed, but was not known for its glucose metabolism. It has been demonstrated that visfatin exerts an insulin-mimetic effect in cultured cells and lowers plasma glucose levels in mice.
  • PBEF B cell precursor colony promoting factor
  • a therapeutic or prophylactic agent for a glucose metabolism-related disease characterized by having an activity of improving a glucose metabolic function, specifically, an activity of promoting insulin signaling, a method for assaying insulin-like activity, and the assay It has become possible to provide a method for searching for a therapeutic or prophylactic agent for a glucose metabolism-related disease using the method.
  • FIG. 1 Identification, expression and secretion of visfatin.
  • A Human from two female volunteers Differential display using a pair of sampnoles of visceral fat and subcutaneous fat. Arrows indicate PCR fragments corresponding to visfatin.
  • B 3 shows the results of Northern blot of visfatin mRNA in human visceral fat and subcutaneous fat. The fragment (a) was used as a probe.
  • C Immunoblotting of visfatin protein in human and mouse derived cell culture media, cell lysates and plasma. C ⁇ S_1 cells were transfected with a visfatin expression vector.
  • FIG. 2 is a view showing phosphorylation of IRS_1, PI3 kinase, and Akt molecules in muscle cells.
  • FIG. 3 shows phosphorylation of IRS_1, PI3 kinase, and Akt molecules in hepatocytes.
  • FIG. 7 Effects of visfatin on cultured cells (ac).
  • the effects of visfatin and insulin on glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes (a) and L6 muscle cells (b) and on glucosamine release into the medium of H4IIEC3 hepatocytes (c) were investigated. .
  • Data were expressed as mean soil SD from three experiments performed in duplicate.
  • D and e Effects of visfatin and insulin on triglyceride accumulation.
  • IRS-1 and IRS-2 protein extracts were analyzed by immunoprecipitation with anti-IRS-1 and anti-IRS-2 antibodies and detected with anti-phosphotyrosine and anti-P13K antibodies .
  • E IRS-1-related P13 kinase activity in primary cell adipocytes from testicular epithelial fat deposits from treated P47BL / 6J mice as in (b).
  • F Binding of I 125 -labeled insulin or visfatin to intact HEK-293 cells was transfected with plasmid alone or plasmid code IR.
  • protein protein
  • polypeptide oligopeptide
  • peptide a polymer of amino acids of any length and variants thereof.
  • This polymer may be linear, branched, or cyclic.
  • the amino acids may be naturally occurring or non-naturally occurring or modified amino acids.
  • the term also includes those that can be assembled into a complex of multiple polypeptide chains.
  • the term also embraces naturally or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • a "protein” is preferably a protein that is compatible in the host in which the composition is to be used, but can be treated to be compatible in that host. As long as you use any protein. Whether a protein is compatible with, or can be treated to be compatible with, the host is determined by transplanting the protein into the host and, if necessary, suppressing side effects such as immune rejection The determination can be made by observing whether or not the colonization of the host is established.
  • the above-mentioned compatible proteins include, but are not limited to, proteins derived from the host.
  • an "isolated" biological agent eg, a nucleic acid or protein
  • a nucleic acid or protein is defined as another biological agent in a cell of a naturally occurring organism in which the biological agent occurs.
  • Factors for example, in the case of a nucleic acid, a factor other than the nucleic acid and a nucleic acid containing the base sequence IJ other than the target nucleic acid; and in the case of a protein, a factor other than the protein and an amino acid sequence other than the target protein are used.
  • isolated nucleic acids and proteins include nucleic acids and proteins that have been purified by standard purification methods. Thus, isolated nucleic acids and proteins include chemically synthesized nucleic acids and proteins.
  • a “purified" biological agent eg, a nucleic acid or protein
  • a biological agent in which at least a part of a factor naturally associated with the biological agent has been removed. Say. Thus, typically, the purity of the biological agent in the purified biological agent is higher (ie, more concentrated) than in the state in which the biological agent is normally present.
  • the biomolecule used in the present invention can be collected from a living body or can be chemically synthesized by a method known to those skilled in the art.
  • a method of synthesis using an automated solid phase peptide synthesizer is described by: Stewart, JM et a 1., ⁇ 984).
  • Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemica LCo .; Grant, GA (1992) .Synthetic Peptides: A User's Guide, WH Freeman; Bodanszky, M. (1993) .Principles of Peptide Synthesis, Springer—Ver lag; Bodanszky, M. et al.
  • the term “homology” of a biomolecule refers to a sequence having a comparable sequence.
  • the higher the homology between two sequences the higher the identity or similarity between those sequences.
  • Whether the two sequences have homology can be determined by a direct comparison of the sequences, or, in the case of nucleic acids, by a hybridization method under stringent conditions.
  • sequences between the sequences are typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80% , 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical, the genes are homologous.
  • similarity of a biomolecule (eg, base sequence, amino acid sequence, etc.) refers to two or more gene sequences when conservative substitutions are regarded as positive (identical) in the above homology. Are the degrees of identity with each other. Thus, if there are conservative substitutions, identity and similarity will be different depending on the existence of the conservative substitution. When there is no conservative substitution, identity and similarity show the same numerical value. In the present invention, those with high identity or high similarity may also be useful.
  • sequence identity refers to sequence identity and homology between two DNAs or two proteins.
  • sequence identity is determined by comparing two sequences aligned optimally over the region of the sequence to be compared.
  • the DNA or protein to be compared may have an addition or a deletion (for example, a gap or the like) in the optimal alignment of the two sequences.
  • sequence homology for example, using the ClustalW algorithm (Nucleic Acid Res., 22 (22): 673-4680 (1994) and can be calculated by creating an alignment.
  • sequence identity was determined by using sequence analysis software, specifically, Vector NTI,
  • the public database is, for example, a homepage address
  • sequence identity in the present invention may be 80% or more, preferably 90 ° / o or more, and more preferably 95% or more.
  • the term "corresponding" gene refers to a gene that is, in a certain species, a force having the same action as a predetermined gene in a species to be compared, or a gene that is predicted to have the same effect.
  • the corresponding gene of a gene may be the ortholog of that gene. Therefore, a region corresponding to a region having a promoter activity in a sugar metabolism gene or a human adiponectin gene can be found in other animals (mouse, rat, pigeon, pea etc.).
  • corresponding genes, or promoter regions can be identified using techniques well known in the art, based on the disclosure herein. Therefore, for example, the corresponding gene in an animal can be obtained by searching the sequence database of the animal (eg, mouse, rat) using the sequence of the reference gene of the corresponding gene (eg, human adiponectin promoter) as a query sequence. Can be found by:
  • the "corresponding" amino acid or nucleic acid refers to a given polypeptide molecule or polynucleotide molecule, respectively, and is the same as a predetermined amino acid in a polypeptide or polynucleotide used as a reference for comparison.
  • Has the ability to act S has the ability to possess predicted amino acids or nucleic acids, especially in enzyme molecules, at the same position in the active site and has a similar contribution to catalytic activity refers to amino acids.
  • an antisense molecule of a polynucleotide may be a similar portion of an ortholog corresponding to a particular portion of the antisense molecule.
  • corresponding nucleotide In the case of the promoter of the present invention, a portion corresponding to the nucleotide sequence of the present invention is referred to as a “corresponding nucleotide. It is understood to correspond to "reotide”.
  • the similarity, identity, and homology comparison of the amino acid sequence and the base sequence are calculated using BLAST, a sequence analysis tool, with default parameters.
  • An identity search can be performed, for example, using NCBI's BLAST 2.2.9 (issued on May 12, 2004).
  • the value of identity usually refers to a value obtained when the above BLAST is used, and alignment is performed under default conditions. However, if a higher value comes out due to a change in the parameter, the highest value shall be the value of the identity. If the identity is evaluated in multiple areas, the highest value among them is the identity value.
  • search refers to another nucleus having a specific function and Z or property by utilizing a certain nucleobase sequence electronically, biologically or by another method. This refers to finding an acid base sequence.
  • Electronic search includes BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444). —2448 (1988)), Smith and Waterman method (Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147: 195—197 (1981)), and Needleman and Wunsch method (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol.
  • Bio searches include stringent hybridization, macroarrays in which genomic DNA is shell-filled on a nylon membrane or the like, microarrays attached to glass plates (microarray assays), PCR and in situ Examples include, but are not limited to, hybridization.
  • the PPAR used in the present invention should also include a corresponding gene identified by such an electronic search and a biological search.
  • the percentages of "identity”, “homology”, and “similarity” of a sequence are determined by comparing two sequences that are optimally aligned in the comparison window. Is determined by comparing.
  • the portion of the polynucleotide or polypeptide sequence within the comparison window is the reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (a gap may occur if other sequences contain additions).
  • the reference sequence here has no additions or deletions. Yap) may be included.
  • the number of match positions is determined, the number of match positions is divided by the total number of positions in the comparison window, and the result obtained Multiply by 100 to calculate percentage identity.
  • homology is evaluated using an appropriate one of various sequence comparison algorithms and programs well known in the art.
  • sequence comparison algorithms and programs include TBLA STN, BLASTP, FASTA, TFASTA and CLUSTALW (Pearson and Lipman, 1988, Pro Natl. Acad. Sci. USA 85 (8): 2444-2448, Altschul et al., 1990. 215 (3): 403-410, Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res.
  • the BLAST program uses a similar sequence called a "high score segment pair" between an amino acid query sequence or a nucleic acid query sequence and a test sequence, which is preferably obtained from a protein sequence database or a base sequence database.
  • the homologous sequence is identified by specifying the segment of the sequence.
  • many high score segment pairs are identified (ie, organized 1J) by a scoring matrix well known in the art.
  • a BLOSUM62 matrix (Gonnet et al., 1992, Science 256: 1443-1445, Henikoff and Henikoff, 1993, Proteins 17: 49-61) is used as the scoring matrix.
  • PAM or PAM250 matrices can also be used (eg, Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protocol Sequence and Structure, Washington: National Biomedical See Research Foundation).
  • the BLAST program evaluates the statistical significance of all identified high score segment pairs and preferably selects segments that meet a user-defined significance threshold level, such as a user-specific homology. Do It is preferable to evaluate the statistical significance of high-score segment pairs using Karlin's formula for statistical significance (see Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2267-2268). That).
  • the nucleic acid molecule used in the present specification has a part of the nucleic acid sequence deleted as described above, as long as the expressed polypeptide has substantially the same activity as the naturally-occurring polypeptide. Alternatively, it may be substituted by another base, or a part of another base sequence may be inserted. Alternatively, another nucleic acid may be bound to the 5 ′ end and the Z or 3 ′ end. Further, a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions and has substantially the same function (promoter activity in the present invention) may be used.
  • amino acid may be natural or non-natural.
  • “Derivative amino acids” or “amino acid analogs” refer to amino acids that differ from naturally occurring amino acids but have the same function as the original amino acids. Such derivatives amino acids and amino acids Nalog is well known in the art.
  • natural amino acid refers to the L-isomer of a natural amino acid. Natural amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, methionine, threonine, fenylalanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, gnoletamic acid, gnoletamine, and 7 — Carboxyglutamic acid, anoreginin, orditin, and lysine. Unless otherwise indicated, all amino acids referred to herein are L-forms, but forms using D-form amino acids are also within the scope of the present invention.
  • amino acid variant refers to a molecule that is not a natural amino acid but is similar in physical properties and Z or function to a natural amino acid.
  • amino acid variants include those in which an alkyl group, a halo group, a nitro group, etc. are bonded to the benzyl side chain (para, meta, ortho, etc.) of phenylalanine, etyonine, canavanine, 2_methylglutamine And so on. It is understood that, in the present invention, amino acid variants may include unnatural amino acids and amino acid mimetics.
  • unnatural amino acid means an amino acid that is not normally found in nature in a protein.
  • unnatural amino acids include norleucine, para-nitrophenylalanine, homophenylalanine, para-fluorophenylalanine, 3-amino-12-benzylpropionic acid, D- or L-form of homoarginine, and D_phenylalanine Are listed.
  • fragment refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of up to 11-1 relative to a full-length polypeptide or polynucleotide (having a length of n). Polynucleotide.
  • the length of the fragment can be appropriately changed depending on the purpose.For example, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 for a polypeptide. , 15,20,25,30,40,50 and more amino acids, and the lengths represented by specifically listed non-integer integers (eg, 11 and the like) are also lower limits. As appropriate.
  • nucleotide 5 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides may be mentioned, and specifically listed here.
  • a length expressed as a non-integer integer eg, 11, etc.
  • such a fragment can also be used in the same manner as the full-length one, as long as a desired purpose (eg, a cell attracting effect, etc.) is achieved. Is understood.
  • the length of a polypeptide or a polynucleotide is a force that can be represented by the number of amino acids or nucleic acids, respectively, as described above.
  • the above-mentioned number as an upper limit or a lower limit is intended to include a few above and below (or, for example, 10% above and below) the number.
  • “about” may be used before the number. However, in this specification it should be reasoned that the presence or absence of “about” does not affect the interpretation of that number.
  • polynucleotide As used herein, the terms “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to a nucleotide polymer of any length. The term also includes “oligonucleotide derivatives" or “polynucleotide derivatives”. The term “oligonucleotide derivative” or “polynucleotide derivative” includes oligonucleotide derivatives or polynucleotides or polynucleotides having unusual linkages between nucleotides, and is used interchangeably.
  • oligonucleotide examples include, for example, 2,1-O-methyl-ribonucleotide, an oligonucleotide derivative in which a phosphoric diester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and an oligonucleotide.
  • nucleotide sequence may also be conservatively modified (e.g., degenerate codon substitutions) and complemented with the same sequence as the explicitly indicated sequence. It is contemplated to include System 1J. Specifically, degenerate codon substitutions create a sequence in which the third position of one or more selected but not all codons is replaced with a mixed base and a Z or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Oht Snorelephoninoleurea ka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-26 08 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)).
  • nucleotide refers to a nucleoside in which the sugar moiety is a phosphate ester, including DNA, RNA, and the like, whether natural or non-natural.
  • a nucleoside refers to a compound in which a base and a sugar form an N-glycoside bond.
  • nucleotide derivative or “nucleotide analog” refers to a substance having the same function as a nucleotide having a different force from a naturally occurring nucleotide. Such derivative nucleotides and nucleotide analogs are well known in the art.
  • nucleotides and nucleotide analogs include, but are not limited to, phosphorothioates, phosphonoreamidates, methylphosphonates, chiral methylphosphonates, 2-0-methylribonucleotides, peptide mononucleic acids (PNA) .
  • DNA includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA.
  • variant refers to a substance in which a substance such as an original polypeptide or polynucleotide is partially changed. Such variants include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like. Such variants can also be used as the cell growth factor of the present invention as long as the desired purpose can be achieved. Alleles refer to genetic variants that belong to the same locus and are distinct from each other. Therefore, “allelic variant” refers to a variant that has an allelic relationship to a certain gene. Such allelic variants usually have sequences that are identical or very similar to their corresponding alleles, usually have nearly identical biological activities, but rarely differ in biological activities. It may also have. A "species homolog or homolog” is a species Among them, homology (preferably, amino acid level or nucleotide level)
  • ortholog is also called an orthologous gene, and refers to a gene derived from speciation from a common ancestor having two genes.
  • the human and mouse spleen hemoglobin genes are orthologs.
  • the human spleen hemoglobin gene and the ⁇ hemoglobin gene are paralogs (genes generated by gene duplication). It is.
  • Orthologs are useful for estimating molecular phylogenetic trees. Oronologs of the present invention may also be useful in the present invention, since onoresologs can usually perform the same function in another species as the original species.
  • a conservatively modified variant refers to a nucleic acid that encodes the same or essentially the same amino acid sequence, and if the nucleic acid does not encode an amino acid sequence, To the same sequence. Due to the degeneracy of the genetic code, many functionally identical nucleic acids encode any given protein. For example, the codons GCA, GCC, GCG, and GCU all encode the amino acid alanine. Thus, at every position where an alanine is specified by a codon, that codon can be changed to any of the corresponding codons described, without altering the encoded polypeptide.
  • Such a nucleic acid can be obtained by a well-known PCR method, and can also be chemically synthesized. These methods may be combined with, for example, a site-specific displacement induction method, a hybridization method, or the like.
  • Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemica LNomenclature Commission. Nucleotides may also be referred to by the generally recognized one-letter code.
  • vector refers to a vector that can transfer a target polynucleotide sequence into a target cell.
  • vectors include those capable of autonomous replication in host cells such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, animal individuals and plant individuals, or capable of integration into chromosomes. Is done.
  • cloning vector the one suitable for cloning is called “cloning vector”.
  • Such cloning vectors usually contain a multiple cloning site which contains multiple restriction enzyme sites. Such a restriction enzyme site and a multiple cloning site are well known in the art and can be appropriately selected and used by those skilled in the art according to the purpose. Such techniques are described in the literature described herein (eg, Sambrook et al., Supra).
  • expression vector refers to a structural gene and a promoter that regulates its expression, as well as various regulatory elements that are operably linked in a host cell.
  • the regulatory elements may preferably include a terminator, a selectable marker such as a drug resistance gene, and a heterogeneous gene. It is well known to those skilled in the art that the type of expression vector of an organism (for example, an animal) and the type of regulatory element used S may vary depending on the host cell.
  • Examples of the "recombinant vector" for prokaryotic cells that can be used in the present invention include pcDNA3 (+), pBluescript-SK (+ Z-), pGEM-T, pEF-BOS, pEGFP, pHAT, pUC18, and pFT_DEST. TM 42GATEWAY (Invitrogen) and the like.
  • Examples of the "recombinant vector" for animal cells that can be used in the present invention include pcDNAI / Amp, pcDNAI, pCDM8 (also available from Funakoshi), pAGE107 [Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-229 (Invitrogen), pAGE103 U. Biochem., 101, 1307 (1987)], pAMo, pAMoAU. Biol. Chem., 268, 22782-22787 (1993)], based on Murine Stem Cell Virus (MSCV). And retroviral expression vectors, pEF-B ⁇ S, pEGFP and the like.
  • terminal 1 is located downstream of the gene coding region of a gene, terminates transcription when DNA is transcribed into mRNA, and imposes a poly-A sequence. It is an array that contributes to kan. It is known that the terminator is involved in mRNA stability and affects the expression level of a gene.
  • promoter refers to a region on DNA that determines the transcription initiation site of a gene and that directly regulates the frequency of transcription, and is usually bound by RNA polymerase to regulate transcription.
  • the starting base sequence Therefore, in the present specification, a portion of a gene having a promoter function is referred to as a “promoter portion”. Since the promoter region is usually a region within about 2 kbp upstream of the first exon of the putative protein coding region, if the protein coding region in the genomic nucleotide sequence is predicted using DNA analysis software, The area can be estimated.
  • the putative promoter region varies for each structural gene, but is usually located upstream of the structural gene, but is not limited thereto, and may be located downstream of the structural gene. Preferably, the putative promoter region is within about 2 kbp upstream of the first exon translation start site. In the present invention, a region about 3.6 kb upstream of the translation start point is identified as a promoter region, and this region is They have been found to result in high expression capacity and high specificity in adipocytes.
  • the term “enhancer” refers to a sequence used for enhancing the expression efficiency of a target gene. Such enhancers are well known in the art. A plurality of forces that can be used may be used or one may not be used.
  • operably linked refers to a transcriptional / translational regulatory system (eg, promoter, enhancer, etc.) or a translational regulatory sequence that is capable of expressing (operating) a desired sequence. Is placed under the control of.
  • the promoter is usually located immediately upstream of the gene, but need not necessarily be located adjacent to the gene.
  • any technique for introducing a nucleic acid molecule into a cell may be used. Examples thereof include transformation, transduction, and transfusion. Techniques for introducing such nucleic acid molecules are well known and commonly used in the art, and are described, for example, in Ausubel FA et al. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York; NY; Sambrook J et al. "987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. And its two counterparts, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Co., 1997. Gene transfer can be confirmed using the methods described herein, such as Northern blot, Western blot analysis, or other well-known techniques.
  • any of the above-described methods for introducing DNA into cells can be used, and examples thereof include transfection, transduction, and transformation (for example, Calcium phosphate method, ribosome method, DEAE dextran method, electroporation method, method using particle gun (gene gun), etc.).
  • transformant refers to all or a part of an organism such as a cell produced by transformation.
  • examples of the transformant include prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, and the like.
  • a transformant is also called a transformed cell, a transformed tissue, a transformed host, or the like, depending on the target.
  • the cells used in the present invention may be transformants.
  • prokaryotic itoda vesicles include those belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium j3 ⁇ 4, Microbacterium U, Pseudomonas U, and the like.
  • Cells for example, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Bue, and Escherichia coli DH1 are shown in column f.
  • animal cells include mouse myeloma cells, rat myeloma cells, mouse hybridoma cells, Chinese mouse cells, CH ⁇ cells and BHK cells, And African green monkey kidney cells, human leukemia cells, HBT5637 (JP-A-63-299), and human colon cancer cell lines.
  • African green monkeys such as ps20 and NSO for mouse 'myeloma cells, YB2Z0 for rat' myeloma cells, HEK293 (ATCC: CRL-1573) for human fetal kidney cells, and BALL-1 for human leukemia cells
  • kidney cells include COS_1 and C ⁇ S_7
  • human colon cancer cell lines include HCT-15, human neuroblastoma SK—N_SH, SK—N_SH_5Y, and mouse neuroblastoma Neuro2A.
  • any method for introducing a recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA.
  • a calcium chloride method an etatroporation method, and the like.
  • lipofection method lipofection method
  • spheroplast method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)]
  • lithium acetate method Bacteriol., 153, 163 (1983) Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).
  • a retrovirus infection method is well known in the art, for example, as described in Current Protocols in Molecular Biology, supra (particularly Units 9.9-9.14),
  • the culture supernatant of virus-producing cells (virus-producing cells) (packaging cell lines) is By co-culturing together for 1-2 hours, a sufficient amount of infected cells can be obtained.
  • biomolecule refers to a molecule related to a living body and an aggregate thereof.
  • organ refers to a biological organism, including but not limited to animals, plants, fungi, viruses, and the like.
  • Biomolecules include, but are not limited to, molecules extracted from living organisms and aggregates thereof, and are defined as biomolecules as long as they are molecules and aggregates that can affect living organisms. Therefore, small molecules that can be used as pharmaceuticals (for example, small molecule ligands) are also included in the definition of biomolecules as long as their effects on living organisms can be expected.
  • biomolecules include proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNA such as cDNA, genomic DNA, and RNA such as mRNA), Polysaccharides, oligosaccharides, lipids, small molecules (eg, hormones, ligands, messengers, small organic molecules, etc.), their complex molecules, and their aggregates (eg, extracellular matrix, fibers, etc.) Included, but not limited to. As used herein, a biomolecule is intended to include any factor that interacts with glucose metabolism.
  • in vivo or “in vivo” (in vivo) refers to the inside of a living body.
  • in vivo refers to the location where the tissue or organ of interest is to be located. When performing screening, in vivo screening can be performed.
  • in vitro refers to a state in which a part of a living body has been extracted or released "out of the body" (for example, in a test tube) for various research purposes. A term that contrasts with in vivo. When performing screening, in vitro screening can be performed.
  • glucose As used herein with respect to blood, "sugar” and “glucose” are used interchangeably, and the concentration of sugar or glucose in blood is referred to as blood glucose, blood glucose, blood gnorecose, and the like. .
  • the present invention relates to a therapeutic or preventive agent for a sugar metabolism-related disease containing the present protein (also referred to as visfatin) or a fragment thereof as an active ingredient.
  • a sugar metabolism-related disease containing the present protein (also referred to as visfatin) or a fragment thereof as an active ingredient.
  • the present protein used in the present specification refers to (a) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and (b) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids are deleted or added. Or, a substituted amino acid sequence 1J, (c) a partial amino acid sequence 1J in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which 26 amino acids have been deleted from its amino terminal, (d) the above (c) (E) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (f) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence; (g) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A nucleotide sequence having a sequence identity of
  • “deletion, addition or substitution of amino acid” in the above (b) and “80% or more sequence identity” in the above (e) and (g) include, for example, SEQ ID NO: 2. It includes the intracellular processing of a protein having the indicated amino acid sequence, mutations that occur naturally due to species differences, individual differences, differences between tissues, etc., from which the protein is derived, artificial amino acid mutations, and the like.
  • a method for artificially performing the above-described method is to perform a conventional site-specific mutagenesis on a DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and then express the DNA by a conventional method.
  • the site-directed mutagenesis method include a method using an amber mutation (gapped 'duplex method, Nucleic Acids Res., 12,9441-9456 (1984)), and PCR using a mutagenesis primer. Method and the like.
  • the number of amino acids modified above is at least one residue, specifically one or several, or more.
  • the number of such modifications may be within a range where the insulin-like activity of the protein can be found.
  • substitution is more preferably an amino acid having similar properties such as hydrophobicity, charge, pK, and steric structure.
  • substitutions include, for example, (1) glycine, alanine; (2) valine, isoleucine, leucine; (3) aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine, (4) serine, threonine; (5) lysine Arginine; (6) substitution within the group of phenylalanine and tyrosine.
  • hybridize under stringent conditions in the above (h), the hybridization used herein is, for example, Sambrook J., Frisch EF, Maniatis T., Molecular Cloning 2ndedition, It can be carried out according to the usual method of self-loading in the Cold Spring Harbor Laboratory press or the like.
  • “Stringent conditions” refers to, for example, a solution containing 6X SSC (a solution containing 1.5M NaCU 0.15M trisodium citrate as 10X SSC) and a solution containing 50% formamide at 45 ° C. After forming a hybrid at C, conditions such as washing with 2 ⁇ SSC at 50 ° C.
  • the salt concentration in the washing step can be from 2 x SSC at 50 ° C (low stringency conditions) to 0.2 x SSC – 50 ° C3 ⁇ 4-C (high stringency conditions). You can choose.
  • the temperature in the washing step can be selected, for example, from room temperature (low stringency conditions) to 65 ° C (high stringency uniform conditions).
  • the fragment of the present protein refers to a peptide fragment comprising an amino acid partial sequence of 15 to 100 residues, preferably 15 to 50 residues of the present protein, wherein the insulin-like activity of the present protein is There is no particular limitation as long as it is held.
  • a gene encoding the present protein for example, (I) a base sequence IJ encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and (II) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 And (III) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which 26 amino acids have been deleted from the amino terminus of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted.
  • a nucleotide sequence encoding a partial amino acid sequence (that is, a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence represented by amino acids 27 to 491 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2); Base sequence encoding an amino acid sequence having a methionine added to its amino terminal, (V) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and 80% or more A base sequence encoding an amino acid sequence having sequence identity, (VI) a base sequence IJ represented by SEQ ID NO: 1, and (VII) a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 from the 18th nucleotide to the 1493th nucleotide.
  • a gene having a base sequence such as a base sequence of DNA that hybridizes under stringent conditions can be prepared by a conventional genetic engineering method (for example, Sambrook J., Frisch EF, Maniatis).
  • the present protein is produced and obtained in accordance with ordinary genetic engineering methods.
  • the present protein can be prepared.
  • a plasmid capable of expressing the present gene in a host cell is prepared, and The present protein is obtained from a culture obtained by introducing into a cell, transforming, and then culturing the transformed host cell (transformant).
  • the above-mentioned plasmid is, for example, a plasmid which contains genetic information which can be replicated in a host cell, is capable of autonomous propagation, is easily isolated and purified from the host cell, and is functional in the host cell.
  • a preferable example is a vector in which a gene encoding the present protein is introduced into an expression vector having a single marker and a detectable marker.
  • Various expression vectors are commercially available.
  • an expression vector used for expression in Escherichia coli is an expression vector containing a promoter such as lac, trp, and tac, and these are commercially available from Pharmacia, Takara Shuzo, and the like. Restriction enzymes used to introduce a gene encoding the present protein into the expression vector are also commercially available from Takara Shuzo. If it is necessary to induce higher expression, a ribosome binding region may be linked upstream of the gene encoding the present protein. As the ribosome binding region used,
  • Vectors used for expression in mammalian cells include SV40 virus promoter, site megalovirus promoter (CMV promoter), Raus Sarcoma Virus promoter-1 (RSV promoter), ⁇ -actin gene promoter, aP2 gene promoter and the like.
  • CMV promoter site megalovirus promoter
  • RSV promoter Raus Sarcoma Virus promoter-1
  • ⁇ -actin gene promoter aP2 gene promoter and the like.
  • Expression vectors containing a promoter which are commercially available from Toyobo and Takara Shuzo.
  • Examples of host cells include prokaryotic or eukaryotic microbial cells, insect cells, and mammalian cells.
  • E. coli and the like can be preferably mentioned from the viewpoint that large-scale preparation of the present protein is facilitated.
  • the plasmid obtained as described above can be introduced into the above host cells by a conventional genetic engineering method.
  • the transformant can be cultured by a conventional method used for culturing microorganisms, insect cells or mammalian cells.
  • a conventional method used for culturing microorganisms for example, in the case of E. coli,
  • Culture is carried out in a medium appropriately containing trace nutrients such as a suitable carbon source, nitrogen source and vitamins.
  • the culture method may be any of solid culture and liquid culture, preferably aeration. Liquid culture such as stirring culture can be used.
  • the present protein may be obtained by combining methods generally used for isolation and purification of general proteins. For example, the transformants obtained by the above culture are collected by centrifugation or the like, and the transformants are crushed or dissolved, if necessary, proteins are solubilized, and various methods such as ion exchange, hydrophobicity and gel filtration are performed. Purification may be performed by using a step using chromatography alone or in combination. An operation of restoring the higher-order structure of the purified protein may be further performed. Alternatively, for example, the transformant obtained by the above culture may be removed by centrifugation or the like, and the present protein may be purified from the culture supernatant in the same manner as described above.
  • the present invention relates to a therapeutic or preventive agent for a sugar metabolism-related disease, which comprises, as an active ingredient, a nucleic acid molecule containing a base sequence encoding the present protein (also referred to as visfatin) or a fragment thereof.
  • the nucleic acid molecule may be any one of the following nucleotide sequences: ⁇ base sequence group> (A) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and (B) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Base sequence 1J encoding an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted
  • C In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 26 amino acids have been deleted from the amino terminus A base sequence encoding a partial amino acid sequence
  • D a base sequence encoding an amino acid sequence obtained by adding a methionine to the amino terminus of the amino acid sequence of (C)
  • E a sequence sequence of SEQ ID NO: 2
  • a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by (F), a nucleotide sequence from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 1;
  • G a base sequence represented by the nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and 80% or more (preferably, 90
  • a protein base encoded by S that has insulin-like activity Includes sequences, potential base sequences or fragments thereof.
  • “deletion, addition or substitution of amino acid” in the above) and “80% or more sequence identity” in the above (E) and (G) are, for example, represented by SEQ ID NO: 2. It includes the processing that a protein having an amino acid sequence undergoes in a cell, a mutation that occurs naturally due to a species difference, an individual difference, a difference between tissues, and the like of an organism from which the protein is derived, and an artificial amino acid mutation.
  • a conventional site-specific method for DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 for example, a conventional site-specific method for DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • the target DNA is subjected to a mutagenesis and then the DNA is expressed by a conventional method.
  • the site-directed mutagenesis method include a method using an amber mutation (gapped 'duplex method, NUCLEICACIDS RES., 12,9441-9456 (1984)), and PCR using a mutagenesis primer. Method and the like.
  • the number of amino acids modified as described above is at least one residue, specifically one or several, or more.
  • the number of such modifications may be within a range where the insulin-like activity of the protein can be found.
  • substitution is more preferably an amino acid having similar properties such as hydrophobicity, charge, PK, and steric structure.
  • substitutions include, for example, (1) glycine, alanine; (2) valine, isoleucine, leucine; (3) aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine, (4) serine, threonine; (5) lysine Arginine; (6) substitution within the group of phenylalanine and tyrosine.
  • a glucose metabolism-related disease refers to a disease accompanied by abnormal glucose metabolism function in a living body, and specifically, such as diabetes, impaired glucose tolerance, and arteriosclerosis associated with persistent hyperglycemia. Diseases. That is, the glucose metabolism-related disease is not particularly limited as long as it is a disease having various disease states directly or indirectly caused by a decrease or dysfunction of insulin.
  • the disease to which the therapeutic or prophylactic agent for a sugar metabolism-related disease of the present invention can be applied preferably includes a disease state in which blood glucose homeostasis is disrupted, such as diabetes.
  • diabetes has the same meaning as used in the art. It is a metabolic disease that shows persistent hyperglycemia and diabetes. There are insulin dependence (type I) and insulin independence (type)). The latter is slow and does not necessarily require insulin administration.
  • insulin-like activity refers to a physiological action caused by binding to insulin insulin receptor, and specifically, a hypoglycemic action, a gluconeogenesis inhibitory activity in the liver, or Glucose uptake promoting activity in muscle cells and the like.
  • insulin signal transduction By binding to the insulin receptor, the ⁇ subunit, which is the intracellular domain of the insulin receptor, is autophosphorylated, and intracellular insulin-derived signal transduction occurs (hereinafter referred to as insulin signal transduction).
  • insulin signal transduction include phosphorylation of insulin receptor, IRS_1, PI3 kinase or Akt.
  • related to insulin metabolism refers to any factor related to secretion of insulin or glucose metabolism by insulin. Representatively, it is shown in FIG. FIG. 9 shows genes involved in insulin receptor signaling in adipocytes.
  • Insulin signaling promotion activity refers to the activity of enhancing the above insulin signaling, and specifically, phosphorylation of insulin receptor, IRS-1, PI3 kinase or Akt in hepatocytes or muscle cells. It refers to an activity that enhances a response, that is, an activity that increases the phosphorylation of insulin receptor, IRS-1, PI3 kinase or Akt.
  • Gluconeogenesis in hepatocytes refers to glucose biosynthesis in the liver, and refers to intracellular metabolism that biosynthesizes glucose from pyruvate via oxaloacetate. It is known that the rate-limiting step of gluconeogenesis is a reaction catalyzed by phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPCK), and insulin is known to exhibit gluconeogenesis-inhibitory activity by suppressing the expression level of PEPCK. Has been.
  • PEPCK phosphoenolpyruvate carboxylase
  • the "sugar uptake promoting activity in muscle cells” refers to an activity that promotes the action of taking up glucose from outside the cell into the cell via the glucose transporter. Insulin is known to promote sugar uptake by translocating intracellularly stored GLUT4 onto cell membranes. The glucose taken in goes through a glycolysis system At the same time, ATP is produced and used as energy.
  • the therapeutic or prophylactic agent for a glucose metabolism-related disease of the present invention is characterized by enhancing insulin-like activity.
  • enhancing insulin-like activity includes, specifically, 1) suppressing gluconeogenesis in the liver, 2) promoting glucose uptake in muscle cells, and 3) promoting insulin signaling. , 4) lowering the blood sugar level.
  • diagnosis refers to the identification of various parameters related to the type of disease, the type and degree of a disorder, a physical condition, and the like in a subject; This refers to predicting drug responsiveness, predicting changes in disease state, or determining the cause.
  • treatment refers to the prevention of aggravation of a certain disease or disorder when such a condition occurs, preferably maintenance of the status quo, more preferably Means reducing, more preferably reducing.
  • prophylaxis or “prevention” is the treatment of a disease or disorder before it occurs so that the condition does not occur. Say. Thus, for a disease or disorder, preventing, delaying, and preventing the worsening of the condition is included. It is understood that the method of the present invention can also be used for prophylaxis as it regenerates lung tissue.
  • treatment refers to any medical action performed on a certain disease, disorder or condition, and includes actions performed to contribute to diagnosis, treatment, prevention, prognosis, and the like.
  • the procedure should be performed by a medical professional, such as a physician or nurse, who has some state license. It should be noted that even if the action worsens the course of the controversial disease and is detrimental to the patient, the action itself is still a “treatment”. is there.
  • the "instruction” describes a method of using or diagnosing the present invention for a doctor, a subject such as a subject who administers, or a person diagnosing (possibly the subject). It was done. Instructions can be attached to indicate how to use the diagnostic agent or the like when it is provided as a kit. This instruction describes a word indicating the procedure for administering the diagnostic agent, medicine, and the like of the present invention. This directive shall be governed by the competent authority of the country in which the invention is implemented, such as the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan, or the Food and Drug Administration in the United States (FD A)), and clearly indicate that it has been approved by its competent authority. Instructions are so-called package inserts, which are usually not limited to the power provided on paper, but include, for example, electronic media (eg, homepages (websites) provided on the Internet, e-mail, (SMS, PDF documents, etc.).
  • electronic media eg, homepages (websites) provided on the Internet, e-mail, (SMS
  • a second aspect of the present invention is a method for assaying insulin-like activity
  • the measured value measured in the second step is compared with the measured value obtained when the first step and the second step are performed by using the present protein instead of the test substance, and Indicating that the surin-like activity is equal to or higher than the insulin-like activity of the above protein
  • a third step of evaluating the insulin-like activity of the test substance
  • the muscle cells used in the first step include muscle cells isolated from animal muscle tissue, and muscle cells (muscle tissue) forming a population having the same function and morphology. Any cells that express the insulin receptor, exhibit the activity of promoting glucose uptake in response to insulin, and function for signal transduction downstream of insulin are not particularly limited. Is also good.
  • myoblasts and cells that have differentiated to form a myotube can be mentioned.
  • a differentiated muscle cell is used.
  • the myoblast refers to an undifferentiated cell that has acquired a base as a muscle cell, and is in a state in which multinucleation and filamentation have not occurred as in the case of differentiation.
  • Differentiated muscular cells are usually multinuclear cylindrical cells up to 30 cm in diameter at 10 100 zm and have the ability to take up sugar.
  • the "muscle tissue” includes, for example, soleus muscle (Soleus muscle) or long finger extensor muscle (Soleus muscle).
  • Muscle cells can be isolated from skeletal muscle tissue, but cell lines such as L6 (Dainippon Pharmaceutical) and C2C12 can also be used. These are commercially available or can be easily obtained from a cell depository such as RIKEN Cell Bank. These cells have, for example, fetal bovine serum (hereinafter referred to as FBS) (manufactured by GIBCO), penicillin, and streptomycin (manufactured by GIBCO) at a final concentration of 10%, 100 units / ml, and 100 ⁇ g / ml, respectively.
  • FBS fetal bovine serum
  • GIBCO penicillin
  • streptomycin manufactured by GIBCO
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium (containing 4.5 g / LD_glucose and 584 mg ZL L-gnoretamine; manufactured by GIBCO)
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium (containing 4.5 g / LD_glucose and 584 mg ZL L-gnoretamine; manufactured by GIBCO)
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium
  • DMEM medium containing 4.5 g / LD_glucose and 584 mg ZL L-gnoretamine; manufactured by GIBCO
  • the fat cells used in the first step include fat cells (adipose tissue) isolated from adipose tissue of an animal, and fat cells (adipose tissue) forming a population having the same function and morphology. Any cell that expresses the insulin receptor, exhibits a glucose uptake-promoting activity in response to insulin, and functions as a signal transducer downstream of insulin is not particularly limited. It may be. Preferably, a differentiated adipocyte (eg, 3T3-L1 cell) is used.
  • the characteristic of fat cells is that they contain a large amount of fat that forms adipose tissue as a group along the capillary movement as one of the loosely connected tissues, or as one of the loose connective tissues.
  • Intracellular fat initially appears as a number of microdroplets, which gradually become larger and merge into one and eventually occupy most of the cell body. Intracellular fat is easily detected by sudan or osmium tetroxide. Fat cells include white fat cells and brown fat cells. Methods for identifying adipocytes are known in the art, and include, for example, the above-mentioned detection of fat, expression of an adipocyte differentiation marker, expression of adipocyte-specific cytoforce, and the like. Not limited.
  • adipose tissue is a type of connective tissue, which is characteristic in that it stores lipids, and is a tissue having various other important functions. Fat accumulates in adipose tissue. Adipocytes in adipose tissue are surrounded by lattice fibers, and capillaries are densely distributed between cells. Other Tissue Forces A fat pad is one that forms an almost constant mass or tufted fat tissue independently. Adipose tissue develops, for example, in the abdomen, skeletal muscle, buttocks, chest, visceral organs, and the like. [0109] Examples of the animal from which the fat cells are derived include mammals and the like, and more specifically, humans, monkeys, mice, rats, hamsters and the like.
  • the hepatocytes used in the first step express hepatocytes in which enzymes involved in gluconeogenesis and glycolysis are functioning, ie, express the insulin receptor, and suppress gluconeogenesis in response to insulin.
  • Hepatic cells liver tissue isolated from the liver of an animal or hepatic cells that form a population with the same function and morphology Etc. are also included.
  • the animal animal origin of the hepatocyte can be, for example, a mammal, and more specifically, a human, monkey, mouse, rat, rat, muster, or the like.
  • Hepatocytes include, for example, primary cultured hepatocytes, and can be prepared by the following method. That is, a rat (Wister rat, 150 250g, abdominal incision, intestinal sideways, exposing the portal vein, inserting a 22G indwelling needle (Terumo), fixing with sutures, connecting infusion tube to tube of peristaltic pump, and perfusion Do not let out the liquid (LiverPerilision Medium) (Gibco) Connect the indwelling needle and the tube so that air does not enter from S, and at the same time incise the inferior vena cava, exsanguinate and perfuse with the perfusate kept at 37 ° C After perfusion for 10 minutes, perfuse the collagenase perfusate (LiverDigest Medium) (Gibco) maintained in a thermostat at 37 ° C for 10 minutes After the perfusion, the liver is removed and mince on a Petri dish. Washing medium (Hepatocyte
  • the number of cells is counted and spread on a collagen-coated plate (Iwaki) at a density of 0.5-1.5 x 10 5 cells m 2 . After 2-3 hours, replace the medium with the same medium.
  • the primary cultured hepatocytes prepared in this manner can be used for the next day.
  • hepatocytes can be cultured by a usual cell culture method. For example, dexamethasone (Sig Thigh) and cAMP (Sigma) were added to DMEM medium to a final concentration of 100 nM and 50 ⁇ M, respectively. It can be cultured in a medium (hereinafter, hepatocyte medium).
  • a medium hereinafter, hepatocyte medium.
  • the compound used as the test substance is not particularly limited, and examples include proteins, peptides, nucleic acids, inorganic compounds, and organic compounds prepared by natural or synthetic chemistry.
  • Methods for making libraries using combinatorial chemistry are well known in the art. For example, ER Felder, Chimia 1994, 48, 5 12—541; Gallop et al., J. Med. Chem.
  • the concentration of the test substance to be brought into contact with cells is not particularly limited, and is usually about 0: M-about 100 ⁇ M, and preferably about 100 ⁇ M. ⁇ ⁇ 50 ⁇ ⁇ ⁇ is sufficient.
  • the time for bringing the test substance into contact with the muscle cells or hepatocytes is usually about 5 minutes to 130 minutes, preferably about 10 minutes to 20 minutes.
  • the test substance can be appropriately dissolved or suspended in water, a buffer such as phosphate buffer or Tris buffer, or a solvent such as ethanol, acetate, dimethyl sulfoxide or a mixture thereof.
  • methods for measuring insulin-like activity include the following 1) -1 3) Examples include:
  • any method may be used as long as it is a method of measuring the amount of sugar taken up in muscle cells or muscle tissue. It is possible to list methods for quantifying radiolabeled glucose. Specific examples of the method for quantifying radiolabeled gnorecose incorporated into muscle tissue or cells include (1) the amount of radiolabeled glucose incorporated into tissue using muscle tissue isolated from a living body. And (2) using differentiated muscle cells to measure the amount of radiolabeled glucose incorporated into the cells. As a method of measuring sugar uptake using muscle tissue (the former), for example, a method described in Molecular Cell, vol. 2, p. 559 (1998) can be used.
  • a method for measuring the amount of gluconeogenesis in hepatocytes for example, a method described in a literature or the like can be used. More particularly, inclusion in an amount of about 3Xl0 5 cells per Ueru the H4IIE cells 12 ⁇ El plates cultured in hepatocyte medium, after the cells were Konfurue cement, except containing Gunorekosu of 5mM above Replace with the same hepatocyte culture medium as described, and culture overnight.
  • a gluconeogenesis buffer (8.3 g / L DMEM_base, 4 mM L-glutamine, ImM sodium pyruvate, 3.7 g / L sodium bicarbonate, 0.9 g / L lactic acid, 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin) and culture the cells overnight. The next day, collect the cell supernatant, dilute appropriately, and quantify the amount of sugar (glucose) contained in the supernatant.
  • kits for quantitative determination of dalcose are commercially available, and for example, F-kit Glucose (FK International Corporation) can be used.
  • methods for measuring insulin signal transmission in cells include insulin receptor and its downstream molecules such as IRS-1 protein, pI3 kinase, and Akt protein. And the method of quantifying the phosphorylation amount of the enzyme.
  • IRS-1 protein, PI3 kinase, and Akt protein are known, and their structures and functions are described in Molecular Medicine Vol. 36, 110-115 (1999; Nakayama Shoten).
  • Examples of a method for quantifying the phosphorylation amount of these molecules include a Western blotting method using an antibody.Antibodies used in the method are commercially available from, for example, Sigma and Upstate Biotechnology, and are usually used. Can be done according to the method
  • measured values when the first step and the second step are performed using the present protein instead of the test substance are defined as (i) cells (for example, fat (Cells, muscle cells or hepatocytes) and this protein such as a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and (ii) a measurement obtained by measuring insulin-like activity in the cells. Represents a value.
  • the concentration of the present protein to be brought into contact with cells is usually about 0 lng / ml (2 pM) to about 100 / ig / ml (2 ⁇ M). Approximately lng / ml (20pM) —about 20 / ig / ml (0.4 ⁇ ) is preferred.
  • the time for bringing the protein into contact with muscle cells or hepatocytes is usually about 5 minutes to 1 day, preferably about 5 minutes to 30 minutes.
  • the concentration of the test substance to be brought into contact with cells is usually about 0.1 ⁇ m to about 100 ⁇ m, preferably 1 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • the time for bringing the test substance into contact with cells is usually about 5 minutes to 11 days, preferably about 5 minutes to 30 minutes, and more preferably about 10 minutes to 30 minutes. It takes about 20 minutes.
  • the blood glucose level of the mammal was measured, and the measured value was replaced with the present protein such as the protein represented by SEQ ID NO: 2 in place of the test substance.
  • the test substance By comparing the blood glucose level in mammals, it can be determined whether or not the test substance exhibits a hypoglycemic effect equal to or higher than that of the present protein such as the protein shown in SEQ ID NO: 2 by half-IJ.
  • the blood glucose level of the mammal is measured, and the measured value is replaced with the present protein such as the protein represented by SEQ ID NO: 2 in the mammal instead of the test substance.
  • the test substance shows an insulin-like activity equal to or higher than that of the present protein such as the protein shown in SEQ ID NO: 2.
  • Methods for overexpressing the present protein in mammals include, for example, methods such as transgenic and adenovirus infection, and the methods of reversal are also known in the literature.
  • the test substance has 1) the ability to take up glucose into fat cells or muscle cells, 2) the ability to suppress gluconeogenesis in hepatocytes, and 3) cells (for example, fat cells, muscle cells or liver). Insulin-like activity such as the ability to activate insulin signal in cells) and the ability to lower blood glucose when administered to mammals.
  • an insulin-like activity promoter specifically, 1) a sugar uptake promoter into fat cells or muscle cells, 2) a gluconeogenesis inhibitor in hepatocytes, 3) Insulin signaling promoter in cells (eg, adipocytes, muscle cells or hepatocytes), and 4) Hypoglycemic agents are selected as glucose metabolism function improvers, ie, therapeutic or preventive agents for glucose metabolism-related diseases. (The search method of the present invention).
  • the insulin-like activity of the test substance is usually higher than 1.0-fold, usually 1.2-fold or more, preferably 1.
  • the test substance is a candidate substance for a therapeutic or preventive agent for a glucose metabolism-related disease having an activity of improving glucose metabolic function, specifically, an activity of promoting insulin signaling. Can be sorted out.
  • the sugar uptake promotion rate which indicates the ability of a test substance to promote sugar uptake, is statistically significant.
  • the third aspect of the present invention relates to a method for injecting a test substance, using as an index whether the test substance promotes (induces) the expression of the present protein or a gene encoding the present protein (the present gene).
  • the present invention relates to a method for assaying a surin-like activity. This will be described in detail below.
  • the present invention provides a method for assaying insulin-like activity, comprising the following steps (1) and (3). That is,
  • test substance may be the same as described above.
  • the "cells capable of expressing the gene encoding the present protein (the present gene)" are not particularly limited as long as they express the present gene, and cells capable of expressing the present gene may be used as they are. Alternatively, cells transformed with a vector containing the present gene may be used. Examples of animal species of origin include rodent mammals such as rats, mice, and guinea pigs, dogs, sanoles, and humans.
  • CH ⁇ -K1, or COS-1 or C ⁇ S_7 cells derived from African green monkey kidney.
  • mammalian fat-derived cells, liver-derived cells, muscle-derived cells, and the like may be used, and examples thereof include 3T3_L1, an established hepatocyte, and H-mark G2, an established hepatocyte.
  • RNA prepared from the above cells or its RNA was prepared using RNA prepared from the above cells or its RNA.
  • a complementary polynucleotide transcribed therefrom a known method such as Northern blotting or RT-PCR can be used.
  • a polynucleotide having at least 15 contiguous bases in the nucleotide sequence of the present protein gene and / or a complementary polynucleotide thereof as a primer or a probe the presence or absence of expression of the present gene in RNA is determined. And its expression level can be detected and measured.
  • a probe or primer is prepared based on the nucleotide sequence of the present protein gene, for example, primer3 (HYPERLINK
  • the primers or probes radioisotope such as 32 P, 33 P: RI
  • a fluorescent substance it was transferred to a nylon membrane Puren like according to a conventional method
  • the formed duplex of the primer or probe (DNA or RNA) and RNA is used as a signal derived from the primer or probe label (RI or fluorescent substance).
  • the method of detection and measurement with a radiation detector (BAS-1800II, manufactured by Fuji Film) or a fluorescence detector can be listed.
  • the above-mentioned probe is labeled according to the protocol and hybridized with RNA derived from cells.
  • a method of detecting and measuring with Imager STORM860 can also be used.
  • cDNA is prepared from cell-derived RNA according to a conventional method, and is used as a type III gene so that the region of the target protein gene can be amplified.
  • a pair of primers prepared based on the sequence positive strand binding to the above cDNA (-strand) and reverse strand binding to the + strand) were hybridized with this, followed by PCR according to a conventional method, and the obtained amplification was obtained.
  • a method for detecting double-stranded DNA can be exemplified.
  • the amplified double-stranded DNA can be detected by a method of detecting labeled double-stranded DNA produced by performing the above PCR using primers that have been labeled with RI or a fluorescent substance in advance.
  • a method may be used in which the produced double-stranded DNA is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and the above-mentioned labeled primer is used as a probe, hybridized with the probe, and detected.
  • the generated labeled double-stranded DNA product can be measured using an Agilent 2100 Bioanalyzer (manufactured by Yokogawa Analytical Systems).
  • the present invention provides a method for assaying insulin-like activity, comprising the following steps (1) and (3). That is:
  • test substance may be the same as described above.
  • Examples of “cells capable of expressing the present protein” include the same as “cells capable of expressing a gene encoding the present protein (the present gene)” in 1) above.
  • Detection and quantification of the expression level of the present protein can be determined according to a known method such as Western blotting using an antibody that recognizes the present protein.
  • Western blotting after using an antibody that recognizes this protein as the primary antibody, a radioisotope such as 125 1 as the secondary antibody, fluorescent substance,-labeled with an enzyme such as horse Wa rust pel O Kishida over peptidase (HRP) Labeling is performed using an antibody that binds to the primary antibody thus obtained, and signals derived from these labeling substances are measured with a radiometer (BAI-1800II: manufactured by Fuji Film Co., Ltd.), a fluorescence detector, or the like.
  • a radiometer BAI-1800II: manufactured by Fuji Film Co., Ltd.
  • the antibody is not particularly limited in its form, and may be a polyclonal antibody using the present protein as an immunogen, a monoclonal antibody thereof, or an amino acid sequence constituting the present protein.
  • Antibodies of the present invention also include an antibody having an antigen-binding property to a polypeptide consisting of at least contiguous, usually 8 amino acids, preferably 15 amino acids, and more preferably 20 amino acids.
  • the present invention provides a method for assaying insulin-like activity, comprising the following steps (1) and (3). That is:
  • test substance may be the same as the above.
  • the "expression control region of the gene encoding the present protein (the present gene)" usually refers to a range of several kb to several tens of kb upstream of the chromosomal gene, for example, (i) 5'_ (5'-RACE method) (for example, it can be carried out using 5, Foil Race Core Kit (Takara Shuzo) etc.), oligocap method, S1 primer mapping, etc., to determine the 5 'end. (Ii) obtaining the 5, -upstream region using a GenomeWalker Kit (manufactured by Clontech) or the like, and measuring the promoter activity of the obtained upstream region; Can be done.
  • 5'_ 5'-RACE method
  • oligocap method for example, it can be carried out using 5, Foil Race Core Kit (Takara Shuzo) etc.
  • S1 primer mapping etc.
  • a reporter gene in which the expression control region of the present protein gene is operably linked may be prepared by a method known to those skilled in the art. That is, ⁇ Molecularized ionmg: A Laboratory Manual 2nd edition j (1989), Cold Spnng Harbor Laboratory Press ⁇ ⁇ Current Protocols In Molecular Biology J (1987), John Wiley & Sons, Inc., etc.
  • the excised expression control region of the present protein gene can be incorporated into a plasmid containing a reporter gene.
  • reporter genes include dalcuronidase (GUS), luciferase, chloramphenicol transacetylase (CAT), ⁇ -galatatosidase, and green fluorescent protein (GFP).
  • GUS dalcuronidase
  • CAT chloramphenicol transacetylase
  • GFP green fluorescent protein
  • a reporter gene obtained by linking the prepared expression control region of the gene of the present protein in a operable manner can be transformed into a vector that can be used in a cell into which the reporter gene is to be introduced by using a general genetic engineering technique.
  • a plasmid which can be introduced into an appropriate host cell.
  • a transformed cell can be obtained by culturing in a medium under selection conditions according to the reporter gene.
  • a method for measuring the expression level of a reporter gene a method according to each reporter gene may be used. For example, when a luciferase gene is used as a reporter gene, after culturing the transformed cells for several days, an extract of the cells is obtained, and then the extract is reacted with luciferin and ⁇ to cause chemiluminescence, and the luminescence intensity is obtained. By measuring, the promoter activity can be detected. At this time, a commercially available luciferase reaction detection kit such as Picker Gene Dual Kit (registered trademark; manufactured by Toyo Ink) can be used.
  • Picker Gene Dual Kit registered trademark; manufactured by Toyo Ink
  • a cell capable of expressing a gene encoding the present protein "a cell capable of expressing the present protein”, or "a cell capable of functioning the expression control region of the present gene”
  • the cells containing the reporter gene linked in a form can be contacted with a test substance while culturing them under conditions that allow the cells to grow.
  • a test substance for example, the transformation of the present invention using mammalian cells as a host
  • the cells can be cultured in a commercially available medium such as D_MEM, OPTI_MEM, RPMI1640 medium (manufactured by Gibco-BRL) to which serum derived from mammals such as fetal bovine serum is appropriately added.
  • the "control cells not contacted with the test substance” include the “cells capable of expressing the gene encoding the present protein” and “the present protein” used in each of the first steps. And “a cell having the ability to express protein” or "a cell containing a reporter gene operably linked to the expression control region of the present gene” when not contacted with a test substance.
  • the same amount of solvent (blank) as the test substance is added instead of the test substance, or a negative control substance that does not affect the expression of this gene, this protein or the reporter gene Is also included.
  • the substance can be selected. That is, the expression of the present gene, the present protein or the reporter gene in the cells to which the test substance was added was 1.2 times or more, preferably 1.5 times or more, compared to the expression level in control cells to which no test substance was added. If it is more preferably twice or more, the test substance can be selected as an expression promoter (expression inducer) of the present gene or the present protein (screening method of the present invention).
  • the agent for inducing the expression of the present gene or the present protein selected as described above also has an activity of improving the glucose metabolic function, specifically, a therapeutic agent for a glucose metabolism-related disease of the present invention having an insulin signal transduction promoting activity. Or it is a candidate substance for a prophylactic agent.
  • the therapeutic or prophylactic agent for a sugar metabolism-related disease that can be searched for in the present invention can be a polypeptide, a nucleic acid, a sugar chain, a lipid, a small organic molecule, or a complex molecule thereof.
  • the present invention is a system for assaying the modulatory activity of a test substance for insulin-like activity, which system comprises:
  • nucleic acid comprising a base sequence encoding the protein
  • a system is provided.
  • the present invention provides a system for searching for a therapeutic or prophylactic agent for a glucose metabolism-related disease, the system comprising:
  • a powerful protein or a nucleic acid comprising a base sequence encoding the protein
  • a system is provided.
  • the expression means, a system using cells or a system using no cells (cell-free system) can be used as described elsewhere in this specification.
  • a system using cells it is preferable to use cells having the ability to express the present protein.
  • any means capable of directly or indirectly identifying the expressed protein or nucleic acid can be used, for example, SDS-PAGE and the like. And subsequent protein staining (silver staining, coomassie brilliant blue, detection using antibodies (eg, Western blot, dot blot, etc.), Northern blot using specific probes, PCR using specific primers, etc. Means for detecting nucleic acids may be mentioned, but are not limited thereto.
  • a screening means for selecting a candidate substance for a therapeutic or prophylactic agent for a glucose metabolism-related disease using the activity of modulating the insulin-like activity of the test substance as an index a method based on the identified regulatory activity ( Examples include, but are not limited to, a computer in which a program for selecting a test substance having an activity of a certain level or higher as a candidate substance by comparison with a control) is not limited thereto. Understand that screening means can be used.
  • the regulatory activity of the insulin-like activity is enhancement of the insulin-like activity, and the enhancement can be characterized by selecting or maintaining the expression level of the present protein or the nucleic acid.
  • the present invention provides a method for treating or preventing a glucose metabolism-related disease.
  • This method includes: A) a protein having the following amino acid sequence: an amino acid sequence group> (a) an amino acid sequence IJ represented by SEQ ID NO: 2; (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (C) a partial amino acid sequence 1J in which 26 amino acids have been deleted from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (d) In the amino acid sequence of (c), an amino acid sequence having a methionine added to its amino terminal, (l) an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (f) ) Amino acid sequence 1J encoded by DNA having base sequence IJ represented by nucleotides 18 to 1493 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, (g) SEQ ID NO: Is encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence
  • / ⁇ has a nucleotide sequence having a sequence identity of at least or more, and the protein sequence encoded by the nucleotide sequence has an insulin-like activity, or ( ⁇ ) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • step i) is a step in which the protein of the present invention or a nucleic acid molecule encoding the same, or a sugar containing a factor that regulates (eg, enhances, suppresses, maintains, etc.) the insulin-like activity of the protein of the present invention.
  • the present protein and its fragments, or the compounds found by the search method of the present invention can be used as such or as known pharmaceutically acceptable carriers (excipients, diluents, bulking agents, binders, (Including lubricants, flow aids, disintegrants, surfactants, etc.) and conventional additives to prepare a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in the form to be prepared (for oral administration such as tablets, pills, capsules, powders, granules, syrups, emulsions, suspensions, etc .; injections, drops, external preparations, suppositories, etc.) Orally or parenterally, systemically or locally, depending on parenteral administration) Can be administered.
  • parenteral administration intravenous, intradermal, subcutaneous, rectal, transdermal administration and the like are possible.
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” refers to a substance that is used when producing a medicament or an animal drug, and does not adversely affect the active ingredient.
  • Such pharmaceutically acceptable carriers include, for example, antioxidants, preservatives, colorants, flavors, and diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents, buffers, delivery agents, and the like. Vehicles, diluents, excipients and Z or agricultural or pharmaceutical adjuvants and the like.
  • acceptable carriers, excipients, or stabilizers are non-toxic to recipients, and preferably are inert at the dosages and concentrations employed. And include: phosphates, citrates, or other organic acids; antioxidants (eg, ascorbic acid); low molecular weight polypeptides; proteins (eg, serum anolevumin, gelatin or immunoglobulins) A) hydrophilic polymers (eg, polyvinylpyrrolidone); amino acids (eg, glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine); monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (including gnorecose, mannose, or dextrin); (Eg, EDTA); sugar alcohols (eg, mannitol or sorbitol) A salt-forming counterion (eg, sodium); and / or a non-ionic surfactant (eg, Tween, pluronic or polyethylene glycol (P
  • a method for producing a medicament is well known in the art, and the medicament of the present invention may contain a physiologically acceptable carrier, excipient, or stabilizer as necessary (Japanese Pharmacopoeia, 14th Edition). (See Remington's Pharmaceutica LSI Sciences, 18tn Edition, AR Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990, etc.) and a cell composition having the desired degree of purity. It can be prepared and stored in a dried form, but is preferably stored in a suitable storage solution.
  • the "instruction” describes a method of using the present invention or a method of diagnosing for a physician, a subject such as a subject who administers, or a person diagnosing (possibly the subject). It was done. Instructions are provided on how to use the diagnostic reagents, if provided as a kit. Can be attached to indicate. This instruction describes a word indicating the procedure for administering the diagnostic agent, medicine, and the like of the present invention. This instruction is prepared in accordance with the format prescribed by the competent authority of the country where the present invention is implemented (for example, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan and the Food and Drug Administration (FDA) in the United States), and is issued by the competent authority. It is clearly stated that approval has been received.
  • FDA Food and Drug Administration
  • the instruction sheet is a so-called package insert, which is usually provided in a paper medium, but is not limited thereto.
  • a paper medium for example, an electronic medium (for example, a homepage (website) provided on the Internet, (E-mail, SMS, PDF documents, etc.).
  • the above-mentioned appropriate dosage form is prepared by adding an active ingredient (the present protein or a substance selected by the search method of the present invention or a substance thereof) to an acceptable usual carrier, excipient, binder, stabilizer, diluent, or the like.
  • an acceptable buffer, solubilizing agent, isotonic agent and the like should be added.
  • the dose varies depending on the type of the active ingredient, the route of administration, the subject of administration, or the age, weight, and symptoms of the patient, and cannot be specified unconditionally.
  • several mg to about 2 g, preferably about 5 mg to about several tens of mg, of the active ingredient can be administered in one or several doses a day.
  • an adult can administer about 0.1 mg to about 500 mg of the active ingredient in a daily dose that can be administered once or in several divided doses.
  • Examples of the active ingredient substance include the present gene itself. In this case, it may be possible to integrate the gene into a vector for gene therapy and perform gene therapy. Also in these cases, the dose and administration method of the composition for gene therapy vary depending on the patient's body weight, age, symptoms and the like, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the gene therapy can be performed, for example, by directly administering the present gene or a chemically modified product thereof to a mammal directly afflicted with a glucose metabolism-related disease in the same manner as this type of gene therapy. It can be carried out by a method of controlling the expression of a target gene by administering it into the body of an animal (patient), or a method of controlling the expression of a target gene by a target cell of a patient by introducing these genes into the cell. [0161] In certain embodiments, the invention can be used in conjunction with gene therapy. Gene therapy refers to therapy performed by the administration of a nucleic acid that is expressed or has the ability to express to a subject. In this embodiment of the invention, the nucleic acid produces the encoded protein, and the protein mediates a therapeutic effect.
  • any method for gene therapy available in the art can be used according to the present invention.
  • Exemplary methods are general reviews of methods for gene therapy, Goldspie Let al., Clinica LPharmacy 12: 488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993). ); May, TIBTECH 11 (5): 155-215 (1993).
  • Commonly known recombinant DNA techniques used in gene therapy are described in Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY "993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A. Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
  • the amount of the composition of the present invention to be administered depends on the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), age, weight, sex, medical history, cell morphology or type of the patient, and the like. Thus, those skilled in the art can easily determine.
  • the frequency of applying the treatment method of the present invention to a subject (or patient) also depends on the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), patient age, weight, sex, medical history, and course of treatment. In consideration of the above, a person skilled in the art can easily determine. Frequently, for example, dosing once every few months (eg, once a week, once a month). It is preferable to administer once a week to once a month while observing the progress.
  • patient refers to an organism to which the treatment of the present invention is applied, and is also referred to as “subject” or “subject”.
  • the patient can preferably be a human.
  • the present invention provides methods of treatment, inhibition and prevention by administering to a patient an effective amount of a composition of the present invention.
  • the compositions of the present invention can be substantially purified (eg, having the ability to limit its effect or to be substantially free of substances that cause unwanted side effects, including conditions). ).
  • the compound or composition can be delivered encapsulated in vesicles, particularly ribosomes (Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al., Liposomes m the fherapy of Infectious Disease and Ancer, Lo pez—Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, 353, p. 365 (1989); Lo pez-Berestein, ibid., pp. 317-327; thing).
  • the compound or composition may be delivered in a controlled release system.
  • administering refers to giving the medicament or the like of the present invention or a pharmaceutical composition containing the same, alone or in combination with another therapeutic agent, to a host to be treated. means.
  • the combination may be administered, for example, either as a mixture, either simultaneously, separately but simultaneously or concurrently; or sequentially. This includes a presentation in which the combined agents are administered together as a therapeutic mixture, and the procedures in which the combined agents are administered separately but simultaneously (eg, through separate mucous membranes to the same individual). Also included.
  • “Combination” administration further includes separately administering one of the compounds or agents given first, followed by the second.
  • the administration of the medicament of the present invention may be performed by any method, but it is advantageous to use needleless injection. This is because administration can be performed without imposing an excessive burden on the patient.
  • the needleless syringe according to the present invention refers to a device in which a piston is moved by gas pressure or elasticity of an elastic member to eject a drug solution to skin without using a needle, and a drug component is more preferably subcutaneously. Or a medical device administered subcutaneously into cells.
  • ShimaJet TM manufactured by Shimadzu Corporation
  • Medi-Jector Vision TM manufactured by Elite medical
  • PenJet TM manufactured by PenJet
  • examples of the above-mentioned chemically modified form include, for example, phosphorothioate, phosphorodithioate, alkylphosphotriester, alkylphosphonate, alkylphosphamidate, etc.
  • Derivatives that can increase stability (“Antisense RNA and DNA” WILEY—LISS, 192, pp.1-50, J. Med.Chem. 36: 1923-1937, 1993) included. These can be synthesized according to a conventional method.
  • the present gene Upon administration of the present gene, it can be formulated using a commonly used stabilizer, buffer, solvent and the like.
  • the polynucleotide used preferably has a length of 100 bases or more, more preferably 300 bases or more, and still more preferably 500 bases or more.
  • This method also includes an in vivo method of introducing a gene into cells in a living body and an ex vivo method of introducing a gene into a cell taken out of the body and returning the cell to the body (Nikkei Science, 1994 April, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medicine Special Edition, 12 (15), all pages (1994), etc.).
  • the in vivo method is preferred, and there are a viral introduction method (a method using a recombinant virus) and a non-viral introduction method (see the above-mentioned references).
  • the polynucleotide of the present gene is integrated into a viral genome such as a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a polio virus, or a simbis virus. And a method of introducing it into a living body.
  • a method using a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus or the like is particularly preferable.
  • the non-viral transfer method include a ribosome method and a lipofectin method, and the ribosome method is particularly preferable.
  • Other non-viral introduction methods include, for example, a microinjection method, a calcium phosphate method, and an electroporation method.
  • the pharmaceutical composition for gene therapy contains the present gene or a recombinant virus containing the gene, an infected cell into which the virus has been introduced, or the like as an active ingredient.
  • the administration form, administration route, and the like of the composition to a patient can be appropriately determined depending on the disease, symptom, and the like to be treated. For example, it can be administered to a vein, artery, subcutaneous, intramuscular, or the like in a suitable administration form such as an injection, or can be directly administered and introduced to a patient at a target site of a disease.
  • the gene therapy composition may be administered in a form in which a viral vector containing the present gene is embedded in ribosomes or membrane-fused ribosomes (Sendai Virus (HVJ) -ribosome).
  • ribosomes include suspensions, cryogens, and centrifuged concentrated cryogens. Etc. are included.
  • the composition for gene therapy can be in the form of a cell culture solution infected with a virus into which a vector containing the present gene has been introduced.
  • the dosage of the active ingredient in these various forms of preparation can be appropriately adjusted depending on the degree of the disease to be treated, the age and weight of the patient, and the like.
  • retroviral vector containing this gene as retroviral titers can be selected from the amount range of 1 day of patient body weight lkg per about lxl0 3 pfU-lxl0 15 pili.
  • about lxlO 4 cells / body-lxlO 15 cells / body may be administered.
  • screening refers to a target group such as an organism, a cell, or a substance having a specific property of interest, which includes a large number of targets by a specific operation Z evaluation method. It means selecting from inside.
  • an agent eg, an antibody
  • polypeptide or nucleic acid molecule of the invention can be used.
  • a library generated using an in silico (computer-based) system or a system using a real substance such as in vivo or in vivo may be used.
  • compounds obtained by screening having a desired activity are also included in the scope of the present invention.
  • the present invention also contemplates providing drugs, diagnostic agents, therapeutic agents, and the like by computer modeling based on the disclosure of the present invention.
  • Candidate compounds include, for example, proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNA such as cDNA, genomic DNA, and RNA such as mRNA), polysaccharides , Oligosaccharides, lipids, small organic molecules (eg, hormones, ligands, signaling substances, small organic molecules, molecules synthesized by combinatorial chemistry, small molecules that can be used as pharmaceuticals (eg, small molecule ligands) And the like, but are not limited to these complex molecules.
  • proteins polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNA such as cDNA, genomic DNA, and RNA such as mRNA), polysaccharides , Oligosaccharides, lipids, small organic
  • a candidate compound is also referred to as a candidate drug if the candidate is a drug.
  • a collection of such candidate compounds is also called a library.
  • the term "compound species" refers to a compound having desired properties, such as having a specific target activity, such as a certain set of compounds. . For example, if a compound is identified in a collection of compounds that modulate activity, such compound may be referred to as a compound species. In this specification, it is simply referred to as a compound.
  • the "library” refers to a certain set of compounds or the like for screening.
  • the library 1 may be a set of compounds having similar properties or a set of random compounds.
  • use is made of, but not limited to, a collection of compounds that are expected to have similar properties.
  • the compound library used in the present invention is prepared by any means including, but not limited to, combinatorial chemistry techniques, fermentation methods, plant and cell extraction procedures, and the like. Can be obtained, or can be obtained. Methods for making combinatorial libraries are well known in the art. For example, ER Felder, Chimia 1 994, 48, 512-541; Gallop et al., J. Med. Chem. 1994, 37, 1233-1251; R. A.
  • modulation when referring to glucose metabolism, means that its biological activity is altered.
  • inhibiting when referring to sugar metabolism, refers to a reduction or elimination of its biological activity.
  • the term “enhancement”, when referring to glucose metabolism, refers to an increase or absence of a biological activity, or the occurrence of a certain condition from a condition.
  • biological test refers to a method in which a compound using an actual biological Determining whether or not it has a certain activity. Biological tests include in vitro and in vivo tests. Therefore, biological testing is an opposite concept to in silico.
  • evaluation when used in screening, refers to determining whether or not a candidate compound has an ability to satisfy the requirements of such an index (for example, activity as a medicine). . Such evaluations can be performed using methods known in the art, and can be performed in silico (using a computer) or wet (performing the actual biological assay).
  • screening hits can be confirmed by, for example, Atsushi using gene technology.
  • the term "expression" of a gene product such as a gene, a polynucleotide, or a polypeptide means that the gene (usually in the form of DNA) or the like undergoes a certain action in vivo, and It means to be in the form of Preferably, it refers to a gene, a polynucleotide or the like, which is transcribed and translated to form a polypeptide.
  • transcription and production of mRNA may also be a form of expression.
  • such forms of the polypeptide may have undergone post-translational processing (eg, leader sequence excision).
  • telomere As used herein, "specifically express" a gene means that the gene is at a different (preferably higher) level at a particular site or stage in an organism than at other sites or stages. It is expressed.
  • Such specific expression can be realized by utilizing the characteristics of antigen-presenting cells. Therefore, the drug screening in the present invention can also be performed by confirming the specific expression of a specific index.
  • the expression "only" in a certain cell means that a certain gene is expressed only in that cell, and is not substantially expressed in another kind of cell. Therefore, expression only in a certain cell includes expression specifically in that cell. In this case, it is active in adipocytes and non-specific in other cells. Almost no abnormal expression.
  • “detection” or “quantification” of gene expression is achieved using an appropriate method including, for example, mRNA measurement and immunological measurement methods.
  • mRNA measurement and immunological measurement methods can be done.
  • the molecular biological measurement method include a Northern blot method, a dot plot method, and a PCR method.
  • the immunological measurement method include, for example, an ELISA method, an RIA method, a fluorescent antibody method, a western blot method, and an immunohistochemical staining method using a microtiter plate as necessary.
  • Examples of the quantification method include an ELISA method and an RIA method.
  • DNA arrays are widely reviewed in (Shujunsha, edited by Cell Engineering, “DNA Microarrays and the Latest PCR Method”). Protein arrays are described in detail in Nat Genet. 2002 Dec; 32 suppl: 526-32.
  • Methods for analyzing gene expression include, but are not limited to, RT-PCR, RACE, SSCP, immunoprecipitation, two-hybrid systems, in vitro translation, and the like, in addition to those described above.
  • Such further analysis methods are described in, for example, Genome Analysis Experimental Method, Yusuke Nakamura Lab, Manual, Editing, Yusuke Nakamura, Yodosha (2002), and the like. Be invoked
  • expression amount refers to the amount of a polypeptide or mRNA expressed in a target cell or the like. Such expression levels can be determined using the antibody of the present invention.
  • the expression level of the polypeptide of the present invention at the protein level which is evaluated by any appropriate method including immunoassay such as ELISA, RIA, fluorescent antibody method, Western blot, immunohistochemical staining, etc.
  • the polypeptide of the present invention evaluated by any appropriate method including molecular biological measurement methods such as Northern blotting, dot blotting, and PCR
  • the expression level of the peptide at the mRNA level may be mentioned. “Change in expression level” refers to an increase in the expression level of the polypeptide of the present invention at the protein level or mRNA level, which is evaluated by any appropriate method including the above-described immunological measurement method or molecular biological measurement method. Or it means to decrease.
  • the term "factor that specifically binds to a nucleic acid molecule or polypeptide” refers to the binding level of the factor to the nucleic acid molecule or polypeptide.
  • factors include, for example, when the target is a nucleic acid molecule, a nucleic acid molecule having a sequence complementary to the target nucleic acid molecule, a polypeptide that binds to the target nucleic acid sequence (for example, a transcription factor
  • the target is a polypeptide, antibodies, single-chain antibodies, receptor-one ligand pairs, deviations, enzyme-substrate deviations, deviations, etc.
  • an agent that specifically binds for example, an agent that specifically binds to visfatin, an antibody against a specific gene product, and the like
  • the term "agent” refers to any substance or other element (for example, energy such as light, radioactivity, heat, or electricity) as long as the intended purpose can be achieved. It may be.
  • substances include, for example, proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNA such as cDNA, genomic DNA, and RNA such as mRNA), Polysaccharides, oligosaccharides, lipids, small organic molecules (e.g., hormones, ligands, signal transducers, small organic molecules, molecules synthesized by combinatorial chemistry, small molecules that can be used as pharmaceuticals (e.g., small molecule ligands, etc.)) ) And these complex molecules, but are not limited thereto.
  • a factor specific for a polypeptide typically includes a factor specific for the polypeptide. Directed antibodies or derivatives or analogs thereof (eg, single-chain antibodies), specific ligands or receptors when the polypeptide is a receptor or ligand, and substrates when the polypeptide is an enzyme. But not limited to them.
  • compound means any identifiable chemical substance or molecule, including small molecules, peptides, proteins, sugars, nucleotides, or nucleic acids. However, the compounds are not limited thereto, and such compounds may be natural products or synthetic products.
  • small organic molecule refers to an organic molecule having a relatively small molecular weight. Normally, the organic low molecular weight refers to those having a molecular weight of about 1,000 or less, but may be higher.
  • the organic small molecule can be synthesized usually using a method known in the art or a combination thereof. Such small organic molecules may be produced by living organisms. Examples of the organic small molecule include hormones, ligands, signaling substances, organic small molecules, molecules synthesized by combinatorial chemistry, and small molecules that can be used as pharmaceuticals (eg, small molecule ligands). Not limited to.
  • contacting refers to bringing a compound into physical proximity, either directly or indirectly, to a polypeptide or polynucleotide of the present invention. Means that. A polypeptide or polynucleotide can be present in many buffers, salts, solutions, and the like. Contacting includes placing the compound, including, for example, a polypeptide encoding a nucleic acid molecule or fragment thereof, in a beaker, microtiter plate, cell culture flask, or microarray (eg, a gene chip), and the like.
  • the term "complementary” or “complement” is used herein to refer to the entire complementary region as is and another specific polynucleotide and Watson & Crick base pairs.
  • 1 shows a sequence of a polynucleotide capable of forming a DNA.
  • a first polynucleotide is considered to be complementary to a second polynucleotide if each base of the first polynucleotide is paired with its complementary base.
  • the complementary bases are generally A and T (some are A and U) or C and G.
  • complementary is used as a synonym for "complementary polynucleotide", “complementary nucleic acid” and “complementary nucleotide arrangement IJ". These terms are It applies to a pair of polynucleotides based solely on their sequence, and does not apply to a particular set of two polynucleotides in effect associated.
  • the present invention provides a composition for regulating insulin-like activity, comprising a base sequence encoding the present protein or a fragment thereof, or the present protein, or a fragment thereof as an active ingredient.
  • a composition for regulating insulin-like activity comprising a base sequence encoding the present protein or a fragment thereof, or the present protein, or a fragment thereof as an active ingredient.
  • I will provide a.
  • the present protein or a fragment thereof any of the preferable forms described above in the present specification can be adopted.
  • the present invention also provides a method of modulating insulin-like activity, comprising providing the protein or a fragment thereof in a subject.
  • the present invention relates to a method for producing a therapeutic or prophylactic agent for a disease associated with glucose metabolism, or a method for preparing a therapeutic agent or a prophylactic agent for a fragment comprising the present protein or a fragment thereof, or a base encoding the present protein.
  • a composition for modulating activity Use in the manufacture of a composition for modulating activity.
  • the present protein or a fragment thereof any of the preferable forms described above in this specification can be adopted.
  • the gnorecose clamp method is one of the methods to evaluate insulin in peripheral tissues.
  • the glucose clamp method is currently considered to be the most accurate evaluation.
  • glucose is infused while monitoring blood glucose level under continuous infusion of insulin so that the blood insulin level is maintained at a constant level, and the blood glucose level is maintained at the fasting blood glucose level.
  • the required glucose infusion rate is defined as the insulin metabolic rate and is a sign of insulin.
  • the result of the test can be expressed as the average soil standard error.
  • the significance test can be determined to be significant when the t-test is performed, for example, when the p-value is less than 0.05.
  • Study design example 1 20 type 2 diabetic patients are randomly assigned to 2 groups of 10 patients each. Age, gender, body mass index, oral hypoglycemic medication, hunger between study and placebo Adjusted for differences in background factors such as blood glucose and hemoglobin A during lc
  • the candidate compound is orally administered daily at a test dose three times a day for one week.
  • Patients in the placebo group will receive one similar placebo tablet orally three times daily for 1 week.
  • blood is collected from the patient's vascular catheter into a tube containing 1.2 mg of EDTA and 400 KIU of Aprotune (Trasylor, Bayer, Germany) on an empty stomach. Plasma collected by centrifugation was stored at -40 ° C until analysis.
  • Dalcose, fructosamine and hemoglobin A in the blood are, for example, glucose lc
  • the amount of insulin in plasma and the amount of C-peptide in urine were measured using commercially available kits, insulin-III (Boehringer-Mannheim, Germany) and C-peptide kit (Daiichi Kagaku, Japan), respectively.
  • the amount of C-peptide in urine is calculated as an average value over two days.
  • the strength of the insulin potentiating action can be evaluated by the blood glucose lowering rate when the drug is administered to KKAy mice.
  • the KKAy mouse is a model animal of diabetes with insulin resistance (Japanese clinical volume 60, extra number 8, 38-44, (2002)), and a sulfonylurea-based glycemic drug for the treatment of type 2 diabetes based on the action of promoting insulin secretion. Depressants are not effective and can be used (Medical Pharmacy, Vol. 24, No. 3, 131-136, (1990)). In an oral hypoglycemic test using KKAy mice, if the blood glucose level of KKAy mice is suppressed by about 45%, the blood glucose level will be almost the same as that of normal mice. preferable.
  • the measurement of the blood glucose lowering rate by an orally administered blood glucose lowering test using KKAy mice can be performed by a known method, and a preferable method is shown below.
  • mice For example, six 11-week-old male mice (KKAy / Ta) are used as a group in the test. Then, as a control, blood is collected from the tail to measure the blood glucose level before the treatment. After blood collection, the biguanide derivative is dissolved at an appropriate concentration in 0.5% CMC-Na (Sodium Carboxymetyl Cellulose) solution and orally administered at a dose of 10 mL / kg. As a control, a mouse to which only the vehicle is administered is prepared. One, two, four, and six hours after drug administration, blood is collected from the tail to measure blood glucose levels. The blood glucose level is measured using a gnorecose CII-I Test Co. (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • CMC-Na Sodium Carboxymetyl Cellulose
  • the blood glucose lowering rate is determined by the following equation.
  • Hypoglycemic rate (%) [(AUC of control group's blood glucose level-AUC of blood glucose level of compound administration group) / AUC of control group's blood glucose level] x 100
  • the AUC of the blood glucose level represents the area up to 6 hours after the drug administration with the gnorecose value 0 as the baseline in a graph in which the change in the blood glucose level after the drug administration is plotted against time.
  • A blood glucose level before drug administration
  • B blood glucose level 1 hour after drug administration
  • C blood glucose level 2 hours after drug administration
  • D blood glucose level 4 hours after drug administration
  • E drug glucose level 6 o'clock
  • the blood glucose AUC is given by the following formula:
  • AUC of blood glucose 1 X ((A + B) / 2) + l X ((B + C) / 2) + 2 X ((C + D) / 2) + 2 X ((D + E) / 2)
  • the strength of the insulin-enhancing effect was determined by administering the drug to db / db mice, a diabetes model animal exhibiting insulin resistance (Japanese clinical journal, Vol. 60, extra number 8, 38-44, (2002)). It can also be evaluated by the blood glucose lowering rate at that time.
  • suppressing the blood glucose level in db / db mice by about 50% is almost the same as that in normal mice, so the hypoglycemic rate is 40% or more. More preferably, it is more preferably 50% or more.
  • the measurement of the blood glucose lowering rate by the glucose tolerance test of oral administration using db / db mice is performed by a known method. Preferred methods are described below. First, 11-17 week old female mice (C57BLKS / J_m + / + Lepr / db> (db / db)) are fasted for 18-24 hours. At this time, use 5-6 animals as a group for the test. Blood is collected from the tail to measure pre-treatment blood glucose levels as a control. After blood collection, the biguanide derivative is dissolved at an appropriate concentration in phosphate buffered saline and administered subcutaneously at a dose of 5 ml / kg.
  • a mouse to which only the solvent is administered is prepared.
  • gnorecose is orally administered at a dose of 3 g / 6 ml / kg, and an oral glucose tolerance test is performed.
  • Blood is collected from the tail at 30 minutes, 1 hour, and 2 hours after glucose administration to measure blood glucose.
  • the blood glucose level is measured using New Blood 'Sugar Test (Roche's Diagnostics Co., Ltd.)' or Gunorecose CII I-Test Co. (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the blood glucose lowering rate can be calculated from the following equation.
  • Hypoglycemic rate (%) [(AUC of elevated blood glucose in vehicle-administered group-AUC of elevated blood glucose in compound-administered group) AUC of elevated blood glucose in vehicle administered group] X 100
  • the AUC of the blood glucose elevation value is the change in blood glucose level after administration of gnorecose with respect to time.
  • the plotted graph shows the area of the increased portion up to 2 hours after the administration of darcos, using the blood glucose level before glucose administration as a baseline.
  • A blood glucose before glucose administration
  • B blood glucose 30 minutes after glucose administration
  • C blood glucose 1 hour after glucose administration
  • D blood glucose 2 hours after glucose administration
  • the AUC for elevated blood glucose is calculated using the following formula:
  • AUC of blood glucose elevation 0.5 X ((A + B) / 2-A) + 0.5 X ((B + C) / 2-A) + 1 X (
  • the measurement of the blood glucose lowering rate and the blood lactate level by the oral glucose tolerance test can be performed by a known method, and the former measurement can be performed by the above-described method.
  • the latter measurement can be suitably performed by the following method. That is, first, 11- to 17-week-old female mice (C57BLKSZJ-m + Z + Lepr-db> (dbZdb)) are fasted for 18-24 hours. At this time, use 5-6 animals as a group for the test. As a control, blood is collected from the tail to measure the blood lactate level before treatment.
  • the biguanide derivative is dissolved at an appropriate concentration in phosphate buffered saline and administered subcutaneously at a dose of 5 ml / kg.
  • a mouse to which only the solvent is administered is prepared.
  • 30 minutes after the administration of the compound or vehicle, gnorecose is orally administered at a dose of 3 g / 6 ml / kg, and an oral glucose tolerance test is performed.
  • Blood is collected from the tail at 30 minutes, 1 hour, and 2 hours after glucose administration to measure blood lactate.
  • the blood lactate level can be measured by using “Asu Riki 'Sigma” (manufactured by Sigma Diagnostics Co., Ltd.).
  • the blood lactate increase rate is calculated by the following formula:
  • Increase rate of blood lactate (%) [(AUC of blood lactate in compound administration group-AUC of blood lactate in solvent administration group) AUC of blood lactate in solvent administration group] X 100
  • the AUC of blood lactate value represents the area up to 2 hours after glucose administration in a graph in which the change in blood lactate value after administration of gnorecose is plotted against time.
  • £ blood lactate before gnorecose administration
  • F blood lactate 30 minutes after glucose administration
  • G blood lactate 1 hour after glucose administration
  • H blood lactate 2 hours after glucose administration.
  • blood The AUC of blood lactate, given the medium lactate level is given by the following formula:
  • the present invention provides a transformant (for example, an organism, organ, tissue or cell) into which a nucleotide sequence encoding the present protein or a variant thereof has been introduced.
  • a transformant for example, an organism, organ, tissue or cell
  • Such a transformant is also called a transgenic animal if it is an animal.
  • Such a transformant may be useful in the search for a factor that regulates insulin-like activity, a therapeutic or prophylactic agent for a disease associated with glucose metabolism.
  • Various methods are known in the art for producing transgenic animals. For example, in the case of producing transgenic mice, general production techniques are described in International Publication No. 01/13150. Inst. Cancer Res.). U.S. Pat. No.
  • transgenic (including knockout and knockin) animals through homologous recombination of embryonic stem (ES) cells.
  • efficient selection of recombinants is achieved by, for example, positive selection using the neomycin resistance gene and negative selection using the HSV thymidine kinase gene or diphtheria toxin gene.
  • Selection of homologous recombinants is also performed by PCR or Southern blotting. In other words, a part of the target gene is replaced with a neomycin resistance gene for positive selection, etc., and a targeting vector having the HSVTK gene, etc. for negative selection ligated to the end of the target gene, and transferred to ES cells by electoporation.
  • the obtained recombinant ES cells are mixed with normal embryos by the scutellum injection method or the assembly chimera method to produce chimeric mice of ES cells and host embryos .
  • blastocyst injection ES cells are injected into blastocysts with a glass pipette.
  • assembly chimera method a mass of ES cells is adhered to an 8-cell stage embryo from which the zona pellucida has been removed.
  • the blastocyst into which the ES cells have been introduced is transplanted into the uterus of a surrogate mother who has been pseudopregnant to obtain a chimeric mouse.
  • ES cells Since ES cells have totipotency, they can be differentiated into all kinds of cells, including germ cells, in vivo.
  • mice having heterologous ES cell chromosomes are obtained, and when these mice are crossed with each other, transgenic mice having homologous modified chromosomes of ES cells are obtained. Is obtained.
  • transgenic mice homozygous for the modified chromosome from the obtained chimeric mice male chimeric mice and female wild-type mice were bred to produce F1 generation heterozygous mice. Male and female heterozygous mice are bred to select F2 generation homozygous mice.
  • Whether or not the desired gene mutation has been introduced into each generation of F1 and F2 can be determined by methods commonly used in the art, such as Southern blotting, PCR, and decoding of the base sequence, as in the case of recombinant ES cells. Can be analyzed using
  • Cre can be expressed in adults using the ability to breed with a transgenic mouse having the Cre gene or a viral vector having the Cre gene.
  • the promoter of the present invention highly expresses a gene in an adipocyte-specific manner. Therefore, the use of the promoter of the present invention makes it possible to express Cre in an adipocyte-specific manner. Therefore, it is possible to disrupt or mutate the target gene only in adipocytes without affecting other tissues. This is considered to contribute greatly to the function analysis of adipocytes, whose importance has been attracting increasing attention in recent years. For other organisms, transgenic organisms can be produced using the same mechanism.
  • a new fat site which is preferentially produced in human visceral visceral fat, was intensively searched for and found to accumulate in metabolic diseases.
  • 8800 polymerase chain reaction (PCR) products were searched comparing subcutaneous and visceral fat obtained from two volunteer women. A total of 31 bands were exclusively detected in visceral fat (Fig. La).
  • Fig. La When used as a probe for Northern plots, one of these cDNAs was more abundantly expressed in visceral fat than subcutaneous fat (Fig. Lb).
  • PBEF B cell precursor colony promoting factor
  • PBEF mRNA expression was It was markedly increased by the tendon ( Figure ld, upper).
  • the guanidine thiosinate / cesium chloride method (Chirgwin, J. ⁇ et al., Biochemistry, 18) was used from human abdominal adipose tissue to isolate visfatin for use in the following experiments. , 5294, 1979), and mixed with the oligo dT primer attached to the cDNA synthesis kit (Takara Shuzo) in the presence of ImM dNTP.
  • a single-stranded cDNA was synthesized by adding 50 units of MMTV reverse transcriptase (Takara Shuzo) and keeping the mixture at room temperature for 10 minutes, then at 42 ° C for 15 minutes, and further at 99 ° C for 5 minutes.
  • the obtained PCR reaction product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis (electrophoresis buffer; Tris-borate buffer (manufactured by Nacalai Tester)), a DNA band of about 1.5 kbp was cut out from the gel, and the DNA band was cut out from Sambrook, J., Fntsch, EF, Mamatis, T .: "Molecular Cloning
  • the plasmid was cloned into the Hindi site of plasmid vector pUC118 (Takara Shuzo) according to the method described in Second Edition J, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
  • the nucleotide sequence of the cloned DNA was determined by using a TaqDye Primer Cycle Sequencing Kit and a Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (manufactured by Pfidno Biosystems) by a DNA sequencer of type 373A manufactured by Applied Biosystems.
  • the DNA consisted of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence encoded the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Example 3 Preparation of an expression plasmid for a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • the expression plasmid for producing a protein having an amino acid sequence represented by the first amino acid to the 491st amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was amplified and isolated in Example 2.
  • the expression plasmid thus prepared was used to transform monkey-derived COS1 cells (manufactured by ATCC) in the same manner as described in the protocol attached to the reagent using Fugene reagent (manufactured by Boehringer).
  • Example 4 Preparation of protein: Preparation of protein sample consisting of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2)
  • the protein having the amino acid sequence represented by the first amino acid to the 491st amino acid was obtained by transforming the monkey-derived COS1 cells transformed in Example 3 into penicillin, streptomycin (GIBCO) was added to a final concentration of 100 units / ml and 100 ⁇ g / ml, respectively, and the protein was secreted into the medium by culturing in ⁇ - ⁇ medium (GIBCO). Cell culture supernatants from day 2 to day 8 were collected.
  • the culture supernatant was filtered through an ultrafiltration membrane, and sequentially supplied to DEAEs-marked harose, ANX-Sepharose, Octyl-Sepharose, and Mono_Q columns (all manufactured by Amersham Pharmacia) for purification.
  • the protein preparation finally obtained was a single band in silver staining.
  • Dulbecco's modified Eagle obtained by adding awakened rat L6 cells to FBS (GIBC ⁇ ), penicillin, and streptomycin (GIBCO) at final concentrations of 10%, 100 units / ml and 100 ⁇ g / ml, respectively.
  • a medium containing 4.5 g / LD_glucose and 584 mg ZL L_gnoletamine; manufactured by GIBCO) (hereinafter referred to as FBS-containing medium) (hereinafter referred to as FBS-containing medium) is suspended in 30 ml, and the suspension is suspended in a cell culture flask (T150 for adherent cells; Iwaki Glass) And cultured overnight at 37 ° C in the presence of 5% CO. Cells were diluted with 15 mL of phosphate buffer (0.20 g / L KC1, 0.2
  • EDTA'4Na trypsin monosodium ethylenediaminetetraacetate
  • Example 5 The same operation was carried out except that a phosphate buffer was added instead of the protein sample to the well containing the test cells obtained in Example 1 (1), and the total radioactivity was measured (hereinafter referred to as measurement. From these measured values, the sugar uptake promoting rate of the present protein was calculated from the measured values according to the following formula.
  • Example 6 Measurement of insulin signal activation rate of this protein in muscle cells
  • L6 cells awakened in Example 5 (1) were spread on a 90 cm dish, and confluent in a medium containing FBS. Cultured until After removing the medium, the cells were washed with a phosphate buffer, cultured in a serum-free medium for 20 hours, and then the medium was removed again. The cells were incubated at 37 ° C for 10 minutes in a serum-free medium containing 100 ng / mL of the present protein preparation obtained in Example 3. The reaction was stopped by removing the medium, and the cells were washed twice with a phosphate buffer previously cooled with ice.
  • ImL of cell disruption buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 2 mM CaCl, ImM MgCl, 140 mM NaCl, 1% NP-40, 2 ⁇ g / m
  • ⁇ 4 ⁇ cells purchased from Dainippon Pharmaceutical
  • FBS penicillin, streptomycin, cAMP (Sigma), and dexamethasone (Sigma) each at a final concentration of 10. /.
  • Dulbecco's modified Eagle's medium containing 4.5 g / L glucose and 584 mg ZLL-glutamine; GIBCO
  • GIBCO Dulbecco's modified Eagle's medium
  • Example 5 The cells were recovered from the culture vessel by the method described in, Makikomi 12 ⁇ El plates at a concentration of 3XL 0 5 cells Z Ueru, 37. C, and cultured in the presence of 5% CO. The culture was continued until the cells became confluent. The cells were washed with a phosphate buffer, replaced with a medium for hepatocytes containing 5 mM gnorecose, and cultured for 24 hours.
  • Example 4 The cells were washed twice with a phosphate buffer, and the present protein preparation obtained in Example 4 lmL gluconeogenesis buffer containing 0-InM (8.3 g / L DMEM base, 4 mM L-glutamine, ImM Sodium pyruvate, 3.7 g / L sodium bicarbonate, 0.9 g / L lactic acid, 100 units / mL penicillin, and 100 ⁇ g / mh streptomycin, filtered through a 0.22 ⁇ m filter) The cells were cultured overnight, and the cell supernatant was collected the next day. Using F-kit Glucose (IK International), the concentration of sugar (glucose) contained in the culture supernatant collected according to the protocol was measured.
  • 0-InM 8.3 g / L DMEM base, 4 mM L-glutamine, ImM Sodium pyruvate, 3.7 g / L sodium bicarbonate, 0.9 g /
  • the sugar concentration in the medium when the protein sample was not added that is, the concentration of each protein of the present protein when the time of 4.01 fmolZ cells, Z time, was 100%, which is the amount of sugar production.
  • the amount of gluconeogenesis due to is 0.01%, 0.1% and 0.2%, respectively, and is 98%, 32% and 3%, respectively.
  • This protein inhibits hepatic gluconeogenesis in a concentration-dependent manner. That was confirmed.
  • the values of 0.01 nM, 0.1 InM and InM insulin were 82%, 20% and 4%, respectively.
  • ⁇ 4 ⁇ cells (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) were cultured in a medium for hepatocytes in the same manner as in Example 7, spread into a 90 mm petri dish, and cultured until the cells became confluent. After removing the medium, the cells were washed with a phosphate buffer, cultured in a hepatocyte medium without FBS (hereinafter, serum-free hepatocyte medium) for 20 hours, and then the medium was removed again. Furthermore, the cells were incubated at 37 ° C for 10 minutes in a serum-free hepatocyte medium containing lOOngZmL of the present protein preparation. The reaction was stopped by removing the medium, and the cells were washed twice with a phosphate buffer pre-cooled on ice. Subsequent operations were performed by the method described in Example 6, and each phosphorylated molecule was detected and quantified.
  • Example 1 the DNA amplified and isolated in Example 1, ie, the recombinant virus particles having the gene encoding the present protein, was obtained by using the adenovirus expression vector kit (Takara Shuzo) according to the method described in the kit. It was produced according to.
  • a virus particle containing a galatatosidase gene attached to a kit was used as a negative control having no amplified and isolated DNA in Example 1, a virus particle containing a galatatosidase gene attached to a kit was used.
  • HEK293 cells American Type Culture Collection
  • the obtained partially purified virus solution was diluted with 10 mM Tris_HCl and ImM EDTA (pH 8.0), and subjected to CsCl density gradient ultracentrifugation (100,000 gxl6 hours) to collect the virus solution layer again.
  • the purified virus solution obtained was dialyzed against 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 mM MgC12, and 5% gnorecose, and stored frozen at -80 ° C.
  • plasma glucose levels in (+ / _) mice were modestly higher than wild-type at 60 and 120 minutes after darcose overload (FIG. 6h).
  • the sensitivity of the insulin tolerance test was examined in (+/-) and wild-type mice. The results of these analyzes indicate that, like insulin, visfatin also plays a role in plasma glucose levels.
  • visfatin induced triglyceride accumulation in adipocyte precursors from both cells and accelerated triglyceride synthesis from gnorecose ( Figure 7e).
  • Visfatin treatment also included peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR), CCAAT enhancer binding protein (C / EBP) _ ct, fatty acid synthesis (FAS), diasylglycerol monoacinole transferase (DGAT) -1, fat Expression of genes encoding fat markers such as P2 (aP2) and adiponectin was also induced (FIG. 7f). Similar adipogenesis-inducing effects were seen for visfatin for 3T3-L1 cells and 3T3-F442 cells.
  • PPAR peroxisome proliferator-activated receptor
  • C / EBP CCAAT enhancer binding protein
  • FAS fatty acid synthesis
  • DGAT diasylglycerol monoacinole transferase
  • visfatin plays a role in the insulin signaling pathway
  • Intravenous injection of visfatin in mice induced tyrosine phosphorylation of insulin receptor (IR), insulin receptor substrate (IRS) _1 and IRS-2 in the liver to a similar extent as insulin injection (FIG. 8a).
  • Visfatin treatment of cultured 3T3-F442 adipocytes results in the phosphorylation of IR, IRS-1 and IRS-2, and the binding of phosphatidylinositol _3_kinase (PI3K) to IRS-1 and IRS-2 , And phosphorylation of Akt and MAP kinase.
  • PI3K phosphatidylinositol _3_kinase
  • visfatin shares properties with insulin at in vivo and in vitro levels.
  • substances capable of modulating insulin-like activity are screened using Reporter Gene Atssay.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • Lysis solution 25 mM Tris (7.5), 2 mM dithiothreitol (DTT), 10% glycerol, 1% TritonX-100; Luciferin mix: 20 mM Tricine (Tricine) / 1. 07 mM (MgCO) Mg (OH) _5H 0 / 2.67mM MgSO / 0. ImM EDTA / 33.
  • Hepatocytes ⁇ 4 ⁇ , HepG2
  • These cells are optionally placed in Dulbecco's modified Eagle's medium 10. Incubate with / ⁇ ⁇ fetal serum.
  • Luciferase is an enzyme that produces fluorescence (about 560 nm).
  • a plasmid containing a visfatin-encoded nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 1) and a reporter plasmid (noresiferase reporter) are simultaneously forcibly expressed in the cells, and the reporter activity is measured.
  • SEQ ID NO: 1 a visfatin-encoded nucleic acid sequence
  • reporter plasmid noresiferase reporter
  • Example 15 Automation
  • the screening performed in Example 14 can be automated using a robot.
  • Beckman Coulter's Biomek series can be used to construct a system using a microplate
  • Zymark's Staccato Mini-System series can be used to construct a system.
  • the lead compound thus obtained can be used in animal experiments. Alternatively, other compounds can be designed based on such a lead compound.
  • Examples 14, 15 etc. compounds identified as having the potential to activate visfatin were administered to animals such as mice, rats or monkeys to specifically target adipose tissue, muscle cells or hepatocytes. Screen for compounds that reduce visfatin mRNA expression or protein levels.
  • adipocyte differentiation is actually performed in an animal; diabetes; hyperglycinemia; low glucose tolerance; insulin resistance; obesity; lipopathy; dyslipidemia (dyslipidemia); Hypertriglyceridemia; hypercholesterolemia; low HDL level; high LDL level; atherosclerosis; vascular stenosis; irritable bowel syndrome; inflammatory bowel disease; Crohn's disease; intestinal ulcer; Substances that act on diseases such as knee inflammation, abdominal obesity, neurodegenerative disease, retinopathy, psoriasis, metabolic syndrome, ovarian hyperandrogenesis, and the like.
  • Example 16 Among the substances that actually showed a test effect in Example 16, those that showed no toxicity are administered to a human subject to observe the effect on glucose metabolism. Here, clinical tests are performed using energy metabolism, body weight, fat mass, body fat percentage, blood glucose level, and other indicators as indexes. This makes it possible to determine whether or not the compound identified as the lead compound in Example 16 is actually effective in the above-mentioned diseases.
  • the present invention is useful in the pharmaceutical industry and the like for the treatment and prevention of sugar metabolism diseases such as diabetes, and for research and development of such medicines.

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Abstract

　本発明は、新規な糖代謝機能改善剤、詳しくは、インスリンシグナル伝達促進活性を有することを特徴とする、糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤を提供する。この治療財または予防剤は、ビスファチンのアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのフラグメントを有効成分として含有する。本発明はまた、ビスファチンの活性を調節するための因子、組成物、それを利用した医薬（特に、糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤）をスクリーニングするための方法、システム、キットなどを提供する。

Description

明 細 書
糖代謝機能改善剤
技術分野
[0001] 本発明は、糖代謝機能改善剤、詳しくは、筋肉における糖取り込み促進活性また は肝蔵における糖新生抑制活性等のインスリンシグナル伝達促進活性を有すること を特徴とする、糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤等に関する。
背景技術
[0002] 生体における糖代謝 (糖の新生およびクリアランス）の恒常性が破綻した状態、特に 高血糖状態が持続した病態が糖尿病である。糖尿病の病態の背景には、血糖調節 ホルモンであるインスリンの分泌不全や作用不全があり、インスリン作用を是正あるい は代替することにより、糖代謝に密接に関連する疾患 (糖代謝関連疾患）の治療また は予防が可能となる。これまでに、糖代謝機能を改善する生体内物質 (ホルモン）とし てはインスリンが知られており、インスリン製剤が糖代謝機能の改善に用いられている 力 更に優れた薬剤が求められている。
[0003] 一方、配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、脂肪蓄積症候群 の診断に用いられること（特許文献 1を参照）や、脂肪細胞において脂肪蓄積促進作 用を有すること（特許文献 2を参照）等が知られている。しかしながら、前記タンパク質 のインスリン様活性については知られていなかった。
特許文献 1：国際公開第 00/62073号パンフレット
特許文献 2：国際公開第 02/10772号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 最近の肥満に関する研究によって、種々の分泌因子（レブチン、アディポネクチン、 腫瘍壊死因子ひ、レジスチン、プラスミノゲンァクチベータ一^ fンヒビター 1など）の脂 肪組織内分泌器官として機能することが明らかになつてきた。これらのいわゆる脂肪 サイト力インは、代謝性ホメォスタシスで重要な役割を果たしており、その生産が適切 に調節されないと、代謝性疾患、動脈硬化などの種々の疾患の原因となる。 [0005] 本発明が解決すべき課題は、新規な糖代謝機能改善剤、詳しくは、インスリンシグ ナル伝達促進活性を有することを特徴とする、糖代謝関連疾患の治療剤または予防 剤を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、配列番号 2で示されるアミノ酸 配列からなるタンパク質が、糖代謝機能を改善する活性、詳しくはインスリンシグナル 伝達促進活性を有し、イン ビボで糖代謝機能を改善する作用を示すことを見出し、 本発明を完成するに至った。
[0007] 即ち、本発明は、
(1)下記の（a)—（h)のいずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 カロもしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)上記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配歹 1J、または
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列、
からなるタンパク質またはそのフラグメントを有効成分として含有する、糖代謝関連疾 患の治療剤または予防剤。
(2)インスリン様活性を亢進することを特徴とする、項目 1に記載の治療剤または予防 剤。
(3)上記インスリン様活性が、脂肪細胞、肝細胞または筋肉細胞におけるインスリン シグナル伝達促進活性である、項目 2に記載の治療剤または予防剤。
(4)上記インスリン様活性が、肝細胞における糖新生抑制活性または筋肉細胞にお ける糖取り込み促進活性である、項目 2に記載の治療剤または予防剤。
(5)上記インスリン様活性が、血糖降下作用である、項目 2に記載の治療剤または予 防剤。
(6)下記のレ、ずれかの塩基配列：
<塩基配列群 >
(A)配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(B)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、 付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(C)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、
(D)上記（C)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたアミ ノ酸配列をコードする塩基配列、
(E)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列をコードする塩基配列、
(F)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列、
(G)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列と 80%以上の配列同一性を有する塩基配 列を有し、かつ上記塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、 塩基配列、または
(H)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列と、ストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、かつ上記塩基配列がコー ドするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、塩基配列、
力 なる塩基配列またはそのフラグメントを有効成分として含有する、糖代謝関連疾 患の治療剤または予防剤。
(7)インスリン様活性を亢進することを特徴とする、項目 6に記載の治療剤または予防 剤。
(8)上記インスリン様活性が、肝細胞または筋肉細胞におけるインスリンシグナル伝 達促進活性である、項目 6に記載の治療剤または予防剤。
(9)上記インスリン様活性が、肝細胞における糖新生抑制活性または筋肉細胞にお ける糖取り込み促進活性である、項目 7に記載の治療剤または予防剤。
(10)上記インスリン様活性が、血糖降下作用である、項目 7に記載の治療剤または 予防剤。
(11)インスリン様活性の検定方法であって、
(I)細胞と、被験物質とを接触させる第一工程、
(2)上記細胞におけるインスリン様活性を測定する第二工程、および
(3)上記第二工程により測定された測定値を、上記被験物質の代わりに下記の（a) - (h) :
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 加もしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)上記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配列、
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質を用いて上記第一工程および第二ェ 程を行った場合の測定値と比較して、被験物質のインスリン様活性を評価する第三 工程、
を有することを特徴とするインスリン様活性の検定方法。
(12)上記細胞が肝細胞、筋肉細胞および脂肪細胞からなる群より選択される細胞で ある、項目 11に記載の方法。
(13)上記第三工程において、上記被験物質のインスリン様活性が上記タンパク質の インスリン様活性と同等以上である場合にインスリン様活性を有すると判定することを さらに包含する、項目 11に記載の方法。
(14)上記タンパク質は、配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなる、項目 11に記載 の方法。
(15)上記インスリン様活性が、インスリンシグナル伝達促進活性である項目 11に記 載の検定方法。
(16)上記インスリンシグナル伝達促進活性力 S、インスリン受容体、 IRS_1、 PI3キナー ゼまたは Aktのリン酸化量を指標として測定されることを特徴とする、項目 14に記載の 検定方法。
(17)上記インスリン様活性が、肝細胞における糖新生抑制活性である、項目 11に記 載の検定方法。
(18)上記インスリン様活性が、筋肉細胞または脂肪細胞への糖取り込み促進活性 である、項目 11に記載の検定方法。
(19)上記第一工程で使用される細胞が骨格筋細胞である、項目 11に記載の検定 方法。
(20)上記第一工程で使用される細胞が株化脂肪細胞、初代培養脂肪細胞、株化 肝細胞または初代培養肝細胞である、項目 11に記載の検定方法。
(21) 被験物質が、下記の（a)—（h)のいずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 加もしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)上記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配列、 (h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列
からなるタンパク質または上記タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸の発現を 調節するかどうかを判定する工程を包含する、被験物質のインスリン様活性の調節活 性を検定するための方法。
(22) 下記の工程（1)一（3)：
(1) 発現条件下で項目 21に記載のタンパク質をコードする遺伝子を発現する能力 を有する細胞と、被験物質とを接触させる第一工程、
(2) 上記発現条件下で被験物質を接触させた細胞における、上記遺伝子の発現 量を測定し、上記発現量を、上記発現条件下で被験物質に接触させない対照細胞 における上記遺伝子の発現量と比較する第二工程、および
(3) 上記第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が上記遺伝子の発現を調節 するか否かを指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程 を包含する、項目 21に記載の方法。
(23) 下記の工程（1)一（3) :
(1)発現条件下で項目 21に記載のタンパク質を発現する能力を有する細胞と、被験 物質とを接触させる第一工程、
(2)上記発現条件下で上記被験物質を接触させた細胞における、上記タンパク質の 発現量を測定し、上記発現量を、上記発現条件下で上記被験物質に接触させない 対照細胞における上記タンパク質の発現量と比較する第二工程、および
(3)上記第二工程の比較結果に基づいて、上記被験物質が上記タンパク質の発現 を調節するか否力 ^指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程 を包含する、項目 21に記載の方法。
(24) 下記の工程：
(1) 発現条件下で項目 21に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現制御領域 に作動可能に連結されるレポーター遺伝子をコードする塩基配列を含有する細胞と 、被験物質とを接触させる第一工程、
(2) 上記発現条件下で被験物質を接触させた細胞における、上記レポーター遺伝 子の発現量を測定し、上記発現量を上記発現条件下で被験物質に接触させなレヽ対 照細胞における上記遺伝子の発現量と比較する第二工程、および
(3) 上記第二工程の比較結果に基づいて、上記レポーター遺伝子の発現量を調 節するか否かを指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程
(1)一（3)を含むことを特徴とする、項目 21に記載の方法。
(25)上記調節は、亢進、維持または抑制を含む、項目 21に記載の方法。
(26)上記調節は、亢進である、項目 21に記載の方法。
(27)上記レポーター遺伝子の発現量の調節は、増カロ、維持または減少を含む、項 目 25に記載の方法。
(28)上記インスリン様活性が、インスリンシグナル伝達促進活性である、項目 21に記 載の方法。
(29)上記インスリン様活性が、筋肉細胞または脂肪細胞への糖取り込み促進活性 である、項目 21に記載の方法。
(30)上記インスリン様活性が、肝細胞における糖新生抑制活性である、項目 21に記 載の検定方法。
(31)項目 21に記載の検定方法により測定された、被験物質のインスリン様活性の調 節活性を指標として、糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤の候補物質を選別す ることを特徴とする、糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤を探索するための方法
(32)上記糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤が、筋肉細胞、脂肪細胞または肝 細胞におけるインスリンシグナル伝達促進剤であることを特徴とする、項目 31に記載 の方法。
(33)上記糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤が、脂肪細胞または筋肉細胞に おける糖取り込み促進剤であることを特徴とする、項目 31に記載の方法。
(34)上記糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤が、肝臓における糖新生抑制剤 であることを特徴とする、項目 31に記載の方法。 (35)上記糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤がポリペプチド、核酸、糖鎖、脂 質、有機低分子、およびこれらの複合分子からなる群より選択される、項目 31に記載 の方法。
(36)項目 31に記載の探索方法により選抜された物質を有効成分として含有する、 糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤。
(37)被験物質のインスリン様活性の調節活性を検定するためのシステムであって、 上記システムは：
A)下記の（a) (h)のレ、ずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 加もしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)上記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配列、
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列
からなるタンパク質または上記タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
B)上記タンパク質または上記核酸の発現をする発現手段；
C)上記発現を調節するかどうかを判定する判定手段
を備える、システム。
(38)上記発現手段は、上記タンパク質を発現する能力を有する細胞を含む、項目 3 7に記載のシステム。
(39)上記判定手段は、上記タンパク質の発現量を測定する手段または上記核酸の 発現量を測定する手段を含む、項目 37に記載のシステム。
(40)糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤を探索するためのシステムであって、 上記システムは：
A)下記の（a) (h)のレ、ずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 加もしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)上記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配列、
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列
からなるタンパク質または上記タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
B)上記タンパク質または上記核酸の発現をする発現手段；
C)上記発現を調節するかどうかを判定する判定手段；および
D)被験物質のインスリン様活性の調節活性を指標として、糖代謝関連疾患の治療 剤または予防剤の候補物質を選別する選別手段
を備える、システム。
(41) 上記選別手段において、上記インスリン様活性の調節活性力 Sインスリン様活 性の亢進であり、上記亢進は、上記タンパク質または上記核酸の発現量を維持また は増加させること選別することを特徴とする、項目 40に記載のシステム。
(42)糖代謝関連疾患を治療または予防するための方法であって、上記方法は： A)以下のアミノ酸配列を有するタンパク質
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 加もしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)上記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配歹 1J、または
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配歹 1J、あるいは以下の塩基配列を有する核酸分子：
<塩基配列群 >
(A)配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(B)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、 付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(C)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、
(D)上記（C)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたアミ ノ酸配列をコードする塩基配列、
(E)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列をコードする塩基配列、
(F)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列、
(G)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列と 80%以上の配列同一性を有する塩基配 列を有し、かつ上記塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、 塩基配列、または
(H)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列と、ストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、かつ上記塩基配列がコー ドするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、塩基配列、
によって達成されるインスリン様活性を維持または亢進させる工程
を包含する、方法。
(43) 上記工程 A)は、項目 1、 6または 36に記載の糖代謝関連疾患の治療剤また は予防剤を処置が必要な被験体に投与することを包含する、項目 42に記載の方法
(44)下記の（a)— (h)のレ、ずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 加もしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)上記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配歹 1J、または
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列、 からなるタンパク質またはそのフラグメントを有効成分として含有する、インスリン様活 性を調節するための組成物。
(45)下記のレ、ずれかの塩基配列：
<塩基配列群 >
(A)配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(B)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、 付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(C)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、
(D)上記（C)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたアミ ノ酸配列をコードする塩基配列、
(E)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列をコードする塩基配列、
(F)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列、
(G)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列と 80%以上の配列同一性を有する塩基配 列を有し、かつ上記塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、 塩基配列、または
(H)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列と、ストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、かつ上記塩基配列がコー ドするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、塩基配列、
からなる塩基配列またはそのフラグメントを有効成分として含有する、インスリン様活 性を調節するための組成物。
(46)下記の（a)— (h)のレ、ずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、 (b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 加もしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)上記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配歹 1J、または
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列、
からなるタンパク質またはそのフラグメントの、糖代謝関連疾患の治療剤または予防 剤の製造における、使用。
(47)下記のレ、ずれかの塩基配列：
<塩基配列群 >
(A)配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(B)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、 付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(C)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、 (D)上記（C)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたアミ ノ酸配列をコードする塩基配列、
(E)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列をコードする塩基配列、
(F)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列、
(G)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列と 80%以上の配列同一性を有する塩基配 列を有し、かつ上記塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、 塩基配列、または
(H)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列と、ストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、かつ上記塩基配列がコー ドするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、塩基配列、
からなる塩基配列またはそのフラグメントの、糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤 における使用。
(48)下記の（a)—（h)のレ、ずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 加もしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)上記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配歹 1J、または
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列、
からなるタンパク質またはそのフラグメントの、インスリン様活性を調節するための組成 物の製造における使用。
(49)下記のレ、ずれかの塩基配列：
<塩基配列群 >
(A)配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(B)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、 付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(C)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、
(D)上記（C)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたアミ ノ酸配列をコードする塩基配列、
(E)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列をコードする塩基配列、
(F)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列、
(G)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列と 80%以上の配列同一性を有する塩基配 列を有し、かつ上記塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、 塩基配列、または
(H)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列と、ストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、かつ上記塩基配列がコー ドするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、塩基配列、
からなる塩基配列またはそのフラグメントの、インスリン様活性を調節するための組成 物の製造における使用。
(50)下記のレ、ずれかの塩基配列：
<塩基配列群 >
(A)配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(B)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、 付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(C)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、
(D)上記（C)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたアミ ノ酸配列をコードする塩基配列、
(E)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列をコードする塩基配列、
(F)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列、
(G)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列と 80%以上の配列同一性を有する塩基配 列を有し、かつ上記塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、 塩基配列、または
(H)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列と、ストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、かつ上記塩基配列がコー ドするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、塩基配列、 またはこれらの塩基配列の改変体が導入された、形質転換体。
(51)上記形質転換体は、生物、臓器、組織または細胞である、項目 50に記載の形 質転換体。
に関する。
[0008] (発明の要旨）
脂肪組織は、種々の分泌タンパク質 (脂肪サイト力イン)を生産し、その代謝に役割 は重要である。本発明者らは、本発明において新たな脂肪サイト力インを同定し「ビス ファチン (visfatin)」と命名した。ビスファチンは、ヒトおよびマウスの両方の内臓脂肪 において高度に蓄積されており、肥満状態において、その血漿レベルが上昇する。 配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、これまでに B細胞前駆体コ ロニー促進因子（PBEF)として知られていた 52キロダルトンのサイト力インであり、リ ンパ球にぉレ、て発現することが知られてレ、たが、糖代謝にっレ、ては知られてレ、なか つた。ビスファチンは、インスリン様（insulin-mimetic)効果を培養細胞において発揮し 、マウスにおいて血漿グルコースレベルを下げることが実証された。ビスファチン遺伝 子でターゲット変異を行ったヘテロ接合のマウスは、野生型の同腹子よりも比較的高 レ、ことが示された。驚くべきことに、ビスファチンは、インスリンレセプターに結合し、活 性化させることが本発明において示された。従って本発明は、ビスファチンの生理学 的役割を研究し、グルコース恒常性および/または代謝性疾患 (例えば、糖尿病）の 新たな治療/予防のための薬剤をスクリーニングする強力なツールを提供する。
[0009] 本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を 読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
発明の効果
[0010] 本発明により、糖代謝機能を改善する活性、詳しくはインスリンシグナル伝達促進 活性を有することを特徴とする糖代謝関連疾患の治療剤もしくは予防剤、インスリン 様活性の検定方法、および当該検定方法を用いる糖代謝関連疾患の治療剤もしく は予防剤の探索方法などを提供することが可能になった。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]ビスファチンの同定、発現および分泌。 （a) 2人の女性ボランティアからのヒト内 臓脂肪および皮下脂肪の一対のサンプノレを用いたディフエレンシャルディスプレイ。 矢印は、ビスファチンに相当する PCRフラグメントを示す。 （b)。ヒト内臓脂肪および 皮下脂肪におけるビスファチン mRNAのノーザンブロット結果を示す。プローブとし て、（a)のフラグメントを使用した。 （c)ビスファチンタンパク質のヒトおよびマウスに由 来する細胞培地、細胞溶解物および血漿における免疫ブロッテイング。 C〇S_1細胞 をビスファチン発現ベクターにてトランスフエタトした。 （d)インビトロ（上）でのビスファ チン mRNAのノーザンブロットおよびこのプロセスの間の細胞培地へのビスファチン タンパク質の分泌の免疫ブロッテイング（下)。 （e)血漿ビスファチンレベルと内臓脂肪 面積 (左)または皮下脂肪面積 (右）との相関を 101人の男女ヒト被験体において調 ベた。 （f)雄性 C57BL/6Jマウスおよび KKAyマウスにおける体重を 6週齢および 12週 齢において示す（1群あたり 6匹）。 （g)雄性 C57BL/6Jマウスおよび KKAyマウスにお ける血漿ビスファチンレベル（6週齢および 12週齢、 1群 6匹）。 （h) 6週齢および 12 週齢の雄性 C57BL/6Jマウスおよび KKAyマウスにおける内臓脂肪および皮下脂肪、 ならびに肝臓におけるビスファチン mRNAの相対濃度。 1群あたり 8匹のマウスから 総 RNAをプールし、これを、リアルタイム RT— PCRにて調べた。ビスファチン mRNA の発現レベルを、シクロフィリン mRNAのものと比べた。 WATは白色脂肪組織を示 す。すべてのデータは、平均土 SDとして表す。群間の差について、スチューデントの t検定を用いて統計学的な有意性について調べた。
[図 2]筋肉細胞における、 IRS_1、 PI3キナーゼ、 Akt分子のリン酸化を示す図であ る。
[図 3]肝細胞における、 IRS_1、 PI3キナーゼ、 Akt分子のリン酸化を示す図である。 園 4]KKAyマウスに、実施例 3で得られた本タンパク質標品、またはインスリンを投 与し、投与前および投与 15分、 30分、 45分、 60分および 120分後に血糖値 (各群 n=4の平均値）を測定した結果を示す図である。
園 5]KKAyマウスに、実施例 9で得られる本タンパク質遺伝子を有するウィルスを感 染させ、血糖値を測定した結果を示す図である。
[図 6]マウスモデルにおけるビスファチンのグルコース低下効果（aおよび b)。 PBSま たはビスファチンの単回ボーラス注射後の血漿グルコース濃度（a)および血漿インス リン濃度（b) (1群 5匹）。 （cおよび d) PBS、インスリンまたはビスファチンの単回ボーラ ス注射後の雄性 KKAyマウス（c)およびストレプトゾトシン処理した雄性 C57BJ/6J マウス（d)での血漿グルコース濃度（1群 5匹）。 （eおよび f) lacZ遺伝子産物またはビ スファチンを発現するアデノウイルスに感染させて 7日後の雄性 C57BL/6Jマウスおよ び KKAyマウスにおける飢餓状態血漿グルコースレベル（e)および飢餓状態インスリ ンレベル (f) (1群 10匹）。 （g) 12時間の飢餓状態または食餌状態での雄性の野生型 マウスおよびビスファチン（ + /_)マウスにおける血漿グルコースレベル（1群 7匹）。
(h)雄性の野生型マウスおよびビスファチン（ + /_)マウスにおけるグルコース寛容 試験。すべてのデータは、平均土 SDとして表した。群間の差について、スチューデ ントの t検定を用いて統計学的な有意性について調べた。
[図 7]培養細胞におけるビスファチンの効果（a— c)。 3T3— L1脂肪細胞（a)および L6 筋肉細胞（b)におけるグルコース取り込みに対するビスファチンおよびインスリンの効 果、ならびに H4IIEC3肝細胞（c)の培地中へのグルコース放出に対するビスファチ ンおよびインスリンの効果を調べた。データは、二連で行った 3回の実験の平均土 S Dとして表した。 （dおよび e)ビスファチンおよびインスリンの、トリグリセリド蓄積に対す る効果。雄性 ICR (Institute for Cancer Research)マウス（対照マウス）の内臓腸間膜 脂肪蓄積 (d左)または皮下脂肪蓄積 (d右)から得られた前駆脂肪細胞を 10ng/ml ビスファチンまたは 10ng/mlインスリンで 6日間培養した。蓄積したトリグリセリド (TG )を測定した（d)。トリグリセリドへの14 Cグノレコース取り込み（e)。すべてのデータは、 平均土 SDで示す。
園 8]ビスファチンのインスリンシグナル伝達に対する効果。 (a)類静脈への注射によ る 240pmolのインスリンまたはビスファチンの送達後のマウス肝臓における IR、 IRS— 1および IRS— 2のチロシンリン酸化。肝臓を注射後 10分で取り出し、そしてタンパク 質抽出物を、抗ホスホチロシン抗体（pTy)での免疫ブロッテイング（IB)の後に、抗 IR 抗体、抗 IRS-1抗体および抗 IRS-2抗体を用いて免疫沈降 (IP)により分析した。 (b) P BS、インスリン（ 1 OOngZml)またはビスファチン（ 100ng/ml)での処置後の培養 3 T3—F442脂肪細胞における IR、 IRS—1および IRS—2のチロシンリン酸化ならびに Aktおよび MAPキナーゼ（MAPK)のセリンリン酸化。 （Cおよび D) L6筋肉細胞（c) または H4IIE3C肝細胞（d)における、 IRS— 1のチロシンリン酸化、 Aktのセリンリン 酸化、および IRS-1に結合した P13Kの量。細胞を PBS、インスリン（100ng/ml) またはビスファチン（100ng/ml)で処理した。 Aktおよび MAPKのセリンリン酸化に ついて、タンパク質を、電気泳動で分離し、膜にブロッテイングし、そして抗ホスホ Akt 抗体および抗 MAPK抗体を用いて検出した。 IRS—1および IRS—2については、タ ンパク質抽出物を、抗 IRS—1抗体および抗 IRS—2抗体を用いた免疫沈降によって 分析し、そして抗ホスホチロシン抗体および抗 P13K抗体を用いて検出した。 （e) (b) におけるように、処理した P47BL/6Jマウスからの精巣上皮脂肪蓄積物からの初代 細胞脂肪細胞における IRS—1関連 P13キナーゼ活性。 （f)インタタトな HEK—293 細胞への I125—標識されたインスリンまたはビスファチンの結合は、プラスミド単独また はプラスミドコード IRでトランスフエタトした。 （g)ヒトインスリンレセプター (IR)へのイン ビトロでのビスファチンの直接の結合。精製したビスファチンまたはゥシ血清アルブミ ン（BSA)と、抗 Flagビーズに固定した Flag_IRまたは Flag単独とインキュベートした 。このビーズを徹底的に洗浄し、そして SDS— PAGEに供させ、その後、抗ビスファチ ン抗体を用いてウェスタンプロット分析を行った。 (h) (上) I125標識インスリンの非標識 ビスファチンまたは非標識インスリンによる、 IRでトランスフエタトしたインタタト HEK2 93細胞への結合の競合阻害。 （下） IRでトランスフエタトしたインタタトな HEK293細 胞への非標識インスリンまたはビスファチンによる、 I125標識ビスファチンの結合の競 合阻害。 （i) I125標識したインスリン (上)またはビスファチン（下）の、 IRWT (野生型）（ 上）または IR— Nl 5K (下）のベクターでトランスフエタトしたインタタト HEK293細胞へ の結合。
園 9]インスリン様シグナル伝達経路の代表的なスキームである。
配列表フリーテキスト
配列番号 1 ビスファチンの塩基配列
配列番号 2 ビスファチンのアミノ酸配列
配列番号 3 遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 4 遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 発明を実施するための最良の形態 [0013] 以下、発明の実施の形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は 、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従つ て、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など、および他の言語 における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念を も含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特 に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべ きである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門 用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解 されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
[0014] (生化学）
(一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手 法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、 Sambrook J. e t al. (1989) . Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring
Harborおよびその 3rd Ed. (2001)； Ausubei, F. M. (1987) . Current Pro tocols in Molecular Biology, Greene Pub. AssociatESand Wiley— Inte rscience ; Ausubei, F. M. " 989) . Short Protocols in Molecular Biolog y : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecul ar Biology, Greene Pub. Associates and Wiley— Interscience ; Innis, M . A. (1990) . PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications , Academic Press ; Ausubei, F. M. (1992) . Short Protocols in Molecul ar Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in
Molecular Biology, Greene Pub. Associates ; Ausubei, F. M. (1995) . Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associa tes ; Innis, M. A. et al. (1995) . PCR Strategies, Academic Press ; Ausu bel, F. M. (1999) . Short Protocols in Molecular Biology : A Compen dium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wil ey, and annual updates ; Sninsky, J. J. et al. (1999) . PCR Applications ： Protocols for Functional Genomics, Academic Press、別冊実験医'子「 遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載されており、これらは本明 細書において関連する部分 (全部であり得る）が参考として援用される。
[0015] 人工的に合成した遺伝子を作製するための DNA合成技術および核酸化学につい ては、例えば、 Gait, M. J. (1985) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, IRLPress ; Gait, M. J. (1990) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, IRL Press ; Eckstein, F. (1991) . Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approac, IRL Press ; Adams, R. L. etal. ( 1992) . The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman&Hall ; Sha barova, Z. et al. (1994) . Advanced Organic Chemistry of Nucleic A cids, Weinheim； Blackburn, G. M. et al. (1996) . Nucleic Acids in Che mistry and Biology, Oxford University Press； Hermanson, G. T. (1996 ) . Bioconjugate Techniques, Academic Pressなどに記載されており、これら は本明細書において関連する部分が参考として援用される。
[0016] 以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙しつつ以下に本発明 を詳細に説明する。
[0017] (一般生化学）
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」 および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸 のポリマーおよびその改変体をいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していても よぐ環状であってもよレ、。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであっても よぐ改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複 合体へとアセンブルされ得るものを包含する。この用語はまた、天然または人工的に 改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィ ド結合形成、グリコシル化、脂質化、ァセチル化、リン酸化または任意の他の操作もし くは改変（例えば、標識成分との結合体化)。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の 1 または 2以上のアナログを含むポリペプチド (例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、 ペプチド様化合物（例えば、ぺプトイド）および当該分野にぉレ、て公知の他の改変が 包含される。本発明の組成物において使用される場合は、「タンパク質」は、その組 成物が使用されるべき宿主において適合性のあるタンパク質であることが好ましいが 、その宿主において適合するように処置され得る限り、どのようなタンパク質を用いて もよレ、。あるタンパク質が宿主に適合性があるかどうか、または宿主において適合す るように処置され得るかどうかは、そのタンパク質をその宿主に移植して、必要に応じ て免疫拒絶反応などの副反応を抑制することによりその宿主に定着するかどうかを観 察することによって、判定することができる。代表的には、上述の適合性があるような タンパク質としては、その宿主に由来するタンパク質を挙げることができるがそれに限 定されない。
[0018] 本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質な ど）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因 子 (例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の塩基配 歹 IJを含む核酸;タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタン パク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製され たものをいう。 「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって 精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタ ンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
[0019] 本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質な ど）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたも のをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の 純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高レ、 (すなわち濃縮されてい る)。
[0020] 本発明において使用される生体分子は、生体から採取され得るほか、当業者に公 知の方法によって化学的に合成され得る。例えば、タンパク質であれば、自動固相 ペプチド合成機を用いた合成方法は、以下により記載される： Stewart, J. M. et a 1. 、丄 984) . Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce ChemicaLCo. ； Gran t, G. A. (1992) . Synthetic Peptides : A User' s Guide, W. H. Freeman ; Bodanszky, M. (1993) . Principles of Peptide Synthesis, Springer— Ver lag ; Bodanszky, M. et al. (1994) . The Practice of Peptide Synthesis , Springer— Verlag； Fields, G. B. (1997) . Phase Peptide Synthesis, Ac a demic Press； Pennington, M. W. et al. (1994) . Peptide Synthesis Pro tocols, Humana Press ; Fields, G. B. (1997) . Solid— Phase Peptide Synt hesis, Academic Press。その他の分子もまた、当該分野において周知の技術を 用いて合成することができる。
[0021] 本明細書にぉレ、て生体分子（例えば、糖代謝機能を担うポリペプチドなどをコード する塩基配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、比較可能な配列を有する場合、 2以上の配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある 2つの配列の相同 性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高レ、。 2種類の配列が相同性 を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下 でのハイブリダィゼーシヨン法によって調べられ得る。 2つの配列を直接比較する場 合、その配列間で配列が、代表的には少なくとも 50%同一である場合、好ましくは少 なくとも 70%同一である場合、より好ましくは少ヽなくとも 80%、 90%、 95%、 96%、 9 7%、 98%または 99%同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細 書において、生体分子（例えば、塩基配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記 相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、 2以上の遺伝 子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、そ の保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない 場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。本発明では、このように同一性が高い ものまたは類似性が高いものもまた、有用であり得る。
[0022] 本発明において「配列同一性」とは、 2つの DNAまたは 2つのタンパク質間の配列 の同一性および相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわ たって、最適な状態にアラインメントされた 2つの配列を比較することにより決定される 。ここで、比較対象の DNAまたはタンパク質は、 2つの配列の最適なアラインメントに おいて、付加または欠失（例えばギャップ等）を有していてもよレ、。このような配列同 一性に関しては、例えば、 Vector NTIを用いて、 ClustalWアルゴリズム (Nucleic Acid Res. ,22(22):673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出するこ とができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的には Vector NTI、
GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定され る。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレス
http：〃 www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
[0023] 本発明における配列同一性は、 80%以上であればよいが、好ましくは 90°/ο以上、 より好ましくは 95%以上である。
[0024] 本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種 における所定の遺伝子と同様の作用を有する力、、または有することが予測される遺伝 子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起 源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオル ソログであり得る。したがって、糖代謝遺伝子、またはヒトアディポネクチン遺伝子にお いてプロモーター活性を有する領域に対応する領域は、他の動物（マウス、ラット、ブ タ、ゥシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子、またはプロ モーター領域は、本明細書の開示に基づけば、当該分野において周知の技術を用 いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は 、対応する遺伝子の基準となる遺伝子 (例えば、ヒトアディポネクチンプロモーター） の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばマウス、ラット）の配列データベース を検索することによって見出すことができる。
[0025] 本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド 分子またはポリヌクレオチド分子にぉレ、て、比較の基準となるポリペプチドまたはポリ ヌクレオチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するカ あるレ、は有すること力 S 予測されるアミノ酸または核酸をレ、い、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同 様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、あるポリヌク レオチドのアンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応 するオルソログにおける同様の部分であり得る。本発明のプロモーターの場合、プロ モーターにおける特定の配列が使用される力 他の種の動物のプロモーターにおけ る特定の配列において、本発明のヌクレオチド配列に対応する部分が「対応するヌク レオチド」に相当することが理解される。
[0026] 本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比 較は、配列分析用ツールである BLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出 される。同一性の検索は例えば、 NCBIの BLAST 2.2.9 (2004.5.12発行)を用いて行う こと力 Sできる。本明細書における同一性の値は通常は上記 BLASTを用レ、、デフォルト の条件でァラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が 出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場 合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
[0027] 本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法によ り、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および Zまたは性質を有する他の核 酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、 BLAST (Altschul et al . , J. Mol. Biol. 215 : 403— 410 (1990) )、 FASTA (Pearson & Lipman, Pr oc. Natl. Acad. Sci. , USA 85 : 2444—2448 (1988) )、 Smith and Water man法（Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147 : 195—197 (1981) )、およ び Needleman and Wunsch法 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 : 443— 453 (1970) )などが挙げられるがそれらに限定されなレ、。生物学的な検索と しては、ストリンジェントハイブリダィゼーシヨン、ゲノム DNAをナイロンメンブレン等に 貝占り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアツ セィ）、 PCRおよび in situハイブリダィゼーシヨンなどが挙げられるがそれらに限定 されなレ、。本明細書において、本発明において使用される PPARには、このような電 子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであること が意図される。
[0028] 本明細書にぉレ、て配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「 類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列 2つを 比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配 列の比較ウィンドウ内の部分には、 2つの配列の最適なァライメントについての基準 配列（他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準 配列は付加も欠失もなレ、ものとする）と比較したときに、付加または欠失 (すなわちギ ヤップ）が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列 にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置 の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に 100を掛けて同一性のパ 一センテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来 技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適 当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、 TBLA STN、 BLASTP、 FASTA、 TFASTAおよび CLUSTALW (Pearson and Lip man, 1988, Pro Natl. Acad. Sci. USA 85 (8) : 2444— 2448、 Altschul et al.， 1990, J. Mol. Biol. 215 (3) : 403— 410、 Thompson et al. , 1994， Nucleic Acids Res. 22 (2) : 4673— 4680、 Higgins et al.， 1996, Method s Enzymol. 266： 383-402, Altschul et al. , 1990, J. Mol. Biol. 215 (3) : 403-410, Altschul et al. , 1993, Nature Genetics 3 : 266— 272)力あげ られる力 何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技 術において周知の Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (たとえ ば、 Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 2267—2 268、 Altschul et al. , 1990, J. Mol. Biol. 215 : 403— 410、 Altschul et al . , 1993, Nature Genetics 3 : 266— 272、 Altschul et al. , 1997, Nuc. A cids Res. 25 : 3389—3402を参照のこと）を用いてタンパク質および塩基配列の相 同性を評価する。特に、 5つの専用 BLASTプログラムを用いて以下の作業を実施す ることによって比較または検索が達成され得る。
(1) BLASTPおよび BLAST3でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データ ベースと比較；
(2) BLASTNでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比 較；
(3) BLASTXでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を 6つの読み枠で変換し た概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
(4) TBLASTNでタンパク質のクエリー配列を 6つの読み枠（両方の鎖）すべてで 変換したヌクレオチド配列データベースと比較； (5) TBLASTXでヌクレオチドのクエリ配列を 6つの読み枠で変換したものを、 6 つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
[0030] BLASTプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタ ンパク質配列データベースまたは塩基配列データベースから得られた被検配列との 間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相 同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術にお いて周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整歹 1J化）されると好ましい。 好ましくは、スコアリングマトリックスとして BLOSUM62マトリックス（Gonnet et al. , 1992, Science 256： 1443— 1445、 Henikoff and Henikoff, 1993， Prote ins 17 : 49—61)を使用する。このマトリックスほど好ましいものではなレ、が、 PAMま たは PAM250マトリックスも使用できる（たとえば、 Schwartz and Dayhoff, eds. , 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships： Atlas of Pr otein Sequence and Structure, Washington : National Biomedical Re search Foundationを参照のこと）。 BLASTプログラムは、同定されたすベてのハ イスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率 などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する 。統計的な有意性を求める Karlinの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有 意性を評価すると好ましい（Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad . Sci. USA 87 : 2267-2268参照のこと）。
[0031] 本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリ ペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部 が欠失または他の塩基により置換されていてもよぐあるいは他の塩基配列が一部揷 入されていてもよい。あるいは、 5 '末端および Zまたは 3 '末端に他の核酸が結合し ていてもよい。また、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、実質的に同一の機 能 (本発明においてはプロモーター活性）を有する核酸分子でもよい。
[0032] 本明細書において、「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよレ、。 「誘導体 アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとの アミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸ァ ナログは、当該分野において周知である。
[0033] 用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸の L一異性体を意味する。天然のァミノ 酸は、グリシン、ァラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチォニン、トレオニ ン、フエ二ルァラニン、チロシン、トリプトファン、システィン、プロリン、ヒスチジン、ァス パラギン酸、ァスパラギン、グノレタミン酸、グノレタミン、 7—カルボキシグルタミン酸、ァ ノレギニン、オル二チン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全 てのアミノ酸は L体であるが、 D体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にあ る。
[0034] 本明細書において「アミノ酸改変体」とは、天然のアミノ酸ではなレ、が、天然のァミノ 酸の物性および Zまたは機能に類似する分子をいう。アミノ酸改変体としては、例え ば、フエ二ルァラニンのベンジル側鎖（パラ位、メタ位、オルト位など）にアルキル基、 ハロ基、ニトロ基などが結合したもの、ェチォニン、カナバニン、 2_メチルグルタミンな どが挙げられる。本発明では、アミノ酸改変体は、非天然アミノ酸およびアミノ酸模倣 物を包含することがあることが理解される。
[0035] 本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されな いアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ-ニトロフエニル ァラニン、ホモフエ二ルァラニン、パラ一フルオロフェニルァラニン、 3—ァミノ一 2_ベン ジルプロピオン酸、ホモアルギニンの D体または L体および D_フエ二ルァラニンが挙 げられる。
[0036] 本明細書にぉレ、て、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（ 長さが n)に対して、 1一 n— 1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオ チドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例え ば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 2 0、 25、 30、 40、 50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙して レ、ない整数で表される長さ（例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。また 、ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20、 25、 30、 40、 50、 75、 100 およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表 される長さ（例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。本発明では、生体分 子としてポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどが使用される場合、所望の目的（例 えば、細胞誘引効果など）が達成される限り、このようなフラグメントもまた、全長のも のと同様に使用され得ることが理解される。
[0037] 本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそ れぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができる力 上述の個数は絶対的なもの ではなぐ同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数 の上下数個（または例えば上下 10%)のものも含むことが意図される。そのような意 図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。 しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理 角军されるべきである。
[0038] 本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「 核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリ マーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘 導体」を含む。 「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌク レオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌク レオチドまたはポリヌクレオチドをレ、い、互換的に使用される。そのようなオリゴヌタレ ォチドとして具体的には、例えば、 2，一 O—メチルーリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチ ド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合に変換されたオリゴヌクレオチ ド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N3 ' -P5 'ホスホロアミデ ート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリ ン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C—5プロピニルゥラシルで置換されたオリゴヌタレ ォチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C—5チアゾールゥラシルで置換され たオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンが C—5プロピニルシトシ ンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキ サジン修飾シトシン（phenoxazine—modified cytosine)で置換されたオリゴヌタレ ォチド誘導体、 DNA中のリボースが 2，一 0—プロピルリボースで置換されたオリゴヌク レオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが 2，—メトキシェトキシリボース で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示され なければ、特定の塩基配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に 改変された改変体 (例えば、縮重コドン置換体)および相補配歹 1Jを包含することが企 図される。具体的には、縮重コドン置換体は、 1またはそれ以上の選択されたほたは 、すべての）コドンの 3番目の位置が混合塩基および Zまたはデォキシイノシン残基 で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzerら、 Nucleic Acid R es. 19 : 5081 (1991) ; Ohtスノレホニノレ尿素 kaら、 J. Biol. Chem. 260 : 2605-26 08 (1985)； Rossoliniら、 Mol. Cell. Probes 8 : 91—98 (1994) )。
[0039] 本明細書において「ヌクレオチド」は、糖部分がリン酸エステルになっているヌクレオ シドをいい、 DNA、 RNAなどを含み、天然のものでも非天然のものでもよレ、。ここで 、ヌクレオシドは、塩基と糖とが N—グリコシド結合をした化合物をいう。 「ヌクレオチド 誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なる 力 Sもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチド およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌク レオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチォエート、ホスホノレアミ デート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、 2_0—メチルリボヌクレオチド 、ペプチド一核酸（PNA)が含まれるが、これらに限定されない。 DNAは、 cDNA、ゲ ノム DNA、合成 DNAを含む。
[0040] 本明細書において「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの 物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改 変体、付加改変体、欠失改変体、短縮 (truncated)改変体、対立遺伝子変異体な どが挙げられる。このような改変体もまた、所望の目的を達成することができる限り、 本発明の細胞増殖因子として使用することができる。対立遺伝子（allele)とは、同一 遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝 子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。その ような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似 性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生 物学的活性を有することもある。 「種相同体またはホモログ (homolog)」とは、ある種 の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは
、 60%以上の相同性、より好ましくは、 80%以上、 85%以上、 90%以上、 95%以上 の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の 記載から明らかである。 「オルソログ（ortholog)」とは、オルソロガス遺伝子（ortholo gous gene)ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝 子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると 、ヒトおよびマウスのひヘモグロビン遺伝子はオルソログである力 \ヒトのひへモグロビ ン遺伝子および βヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）であ る。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オノレソログは、通常別の種にお いてもとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログ もまた、本発明において有用であり得る。
[0041] 本明細書にぉレ、て「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および塩基配 列の両方に適用される。特定の塩基配列に関して、保存的に改変された改変体とは 、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をレ、い、核酸がァミノ 酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のた め、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コ ドン GCA、 GCC、 GCG、および GCUはすべて、アミノ酸ァラニンをコードする。した がって、ァラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされた ポリペプチドを変更することなぐ記載された対応するコドンの任意のものに変更され 得る。
[0042] このような核酸は、周知の PCR法により得ることができ、化学的に合成することもで きる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダィゼーシヨン法な どを組み合わせてもよい。
[0043] アミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号か、または IUPAC—IUB Biochemica LNomenclature Commissionにより推奨される 1文字記号のいずれかにより、本 明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された 1文字コードによ り言及され得る。
[0044] その文字コードは以下のとおりである。 アミノ酸
3文字記号 1文字記号 意味
Ala A ァラニン
し ys C システィン
Asp D ァスノ、。ラギン酸
Glu E グルタミン酸
Phe F フエニノレアラニン
Gly G グリシン
His H ヒスチジン
lie I イソロイシン
Lys K リジン
Leu L ロイシン
Met M メチォニン
Asn N ァス /、°ラギン
Pro P プロリン
Gin Q グルタミン
Arg R ァノレギニン
Ser S セリン
Thr T トレオニン
Val V ノくリン
Trp W トリブトファン
Tyr Y チロシン
Asx ァスパラギンまたはァスパラギン酸
Glx グルタミンまたはグルタミン酸
Xaa 不明または他のアミノ酸。
塩基
記号 意味
a アデニン g グァニン
c シトシン
t チミン
U ゥラシノレ
r グァニンまたはアデニンプリン
y チミン/ゥラシルまたはシトシンピリミジン
m アデニンまたはシトシンアミノ基
k グァニンまたはチミン Zゥラシノレケト基
s グァニンまたはシトシン
w アデニンまたはチミン/ゥラシル
b グァニンまたはシトシンまたはチミン Zゥラシル
d アデニンまたはグァニンまたはチミン/ゥラシル
h アデニンまたはシトシンまたはチミン/ゥラシル
V アデニンまたはグァニンまたはシトシン
n アデニンまたはグァニンまたはシトシンまたはチミン/ゥラシル、不明、または他 の塩基。
[0046] 本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えべ クタ一」とは、 目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるべ クタ一をいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、 昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、ま たは染色体中への組込みが可能なものが例示される。ベクターのうち、クローニング に適したベクターを「クローニングベクター」とレ、う。そのようなクローニングベクターは 通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制 限酵素部位およびマルチプノレクローニング部位は、当該分野にぉレ、て周知であり、 当業者は、 目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、 本明細書に記載される文献 (例えば、 Sambrookら、前出）に記載されている。
[0047] 本明細書にぉレ、て「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプ 口モーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結 されている塩基配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネータ一、薬剤耐性 遺伝子のような選択マーカーおよび、ェンノヽンサ一を含み得る。生物（例えば、動物 )の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類力 S、宿主細胞に応じ て変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
[0048] 本発明において用いられ得る原核細胞に対する「組み換えベクター」としては、 pc DNA3 ( + )、 pBluescript— SK ( + Z―)、 pGEM— T、 pEF— BOS、 pEGFP、 pHA T、 pUC18、 pFT_DEST™42GATEWAY (Invitrogen)などが例示される。
[0049] 本発明において用いられ得る動物細胞に対する「組み換えベクター」としては、 pc DNAI/Amp, pcDNAI、 pCDM8 (レ、ずれもフナコシより市販）、 pAGE107 [特開 平 3— 229 (Invitrogen)、 pAGE103 U. Biochem.， 101， 1307 (1987) ]、 pAM o、 pAMoAU. Biol. Chem.， 268, 22782-22787 (1993) ] ,マウス幹糸田胞ウイ ルス（Murine Stem Cell Virus) (MSCV)に基づいたレトロウイルス型発現べク ター、 pEF— B〇S、 pEGFPなどが例示される。
[0050] 本明細書にぉレ、て「ターミネータ一」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下 流に位置し、 DNAが mRNAに転写される際の転写の終結、ポリ A配列の付力卩に関 与する配列である。ターミネータ一は、 mRNAの安定性に関与して遺伝子の発現量 に影響を及ぼすことが知られている。
[0051] 本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、また その頻度を直接的に調節する DNA上の領域をレ、い、通常 RNAポリメラーゼが結合 して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロ モーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、 通常、推定タンパク質コード領域の第 1ェキソンの上流約 2kbp以内の領域であること が多いので、 DNA解析用ソフトウェアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード 領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領 域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限 定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、 第一ェキソン翻訳開始点から上流約 2kbp以内に存在する。本発明においては、翻 訳開始点の約 3. 6kb上流の領域をプロモーター領域として同定し、この領域が、脂 肪細胞における高度な発現能力および高い特異性をもたらすことを見出した。
[0052] 本明細書において「ェンハンサー」とは、 目的遺伝子の発現効率を高めるために用 レ、られる配列をいう。そのようなェンハンサ一は当該分野において周知である。ェン ハンサ一は複数個用いられ得る力 S1個用いられてもよいし、用いなくともよい。
[0053] 本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現 (作動） 力 Sある転写翻訳調節配歹 IK例えば、プロモーター、ェンハンサーなど）または翻訳調 節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結 されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ず しも隣接して配置される必要はなレ、。
[0054] 本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよぐ 例えば、形質転換、形質導入、トランスフエクシヨンなどが挙げられる。 そのような核 酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、 例えば、 Ausubel F. A.ら編 (1988)、 Current Protocols in Molecular Bi ology、 Wiley、 New York；、 NY; Sambrook Jら "987) Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 2nd Ed.およびその 二片反, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブ ロット、ウェスタンプロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣 用技術を用いて確認することができる。
[0055] また、ベクターの導入方法としては、細胞に DNAを導入する上述のような方法であ ればいずれも用いることができ、例えば、トランスフエクシヨン、形質導入、形質転換な ど（例えば、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DEAEデキストラン法、エレクトロボレ ーシヨン法、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
[0056] 本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生 命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植 物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転 換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられ る細胞は、形質転換体であってもよい。 [0057] 本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核 生物糸田胞としては、 Escherichia属、 Serratia属、 Bacillus属、 Brevibacterium属 、 Corynebacteriumj¾、 Microbacterium禹、 Pseudomonas禹などに属す 原核 生物細胞、例えば、 Escherichia coli XL 1 -Blue, Escherichia coli XL2-B1 ue、 Escherichia coli DH1が f列示される。
[0058] 本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス'ミエローマ細胞、ラ ット.ミエローマ細胞、マウス'ハイプリドーマ細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞で ある CH〇細胞、 BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、 HBT563 7 (特開昭 63—299)、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス'ミエローマ 細胞としては、 ps20、 NSOなど、ラット 'ミエローマ細胞としては YB2Z0など、ヒト胎 児腎臓細胞としては HEK293 (ATCC： CRL-1573)など、ヒト白血病細胞としては BALL—1など、アフリカミドリザル腎臓細胞としては COS_l、 C〇S_7、ヒト結腸癌細 胞株としては HCT— 15、ヒト神経芽細胞腫 SK— N_SH、 SK— N_SH_5Y、マウス神 経芽細胞腫 Neuro2Aなどが例示される。
[0059] 本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、 DNAを 導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレ タトロポレーシヨン法 [Methods Enzymol. , 194, 182 (1990) ]、リポフエクシヨン 法、スフエロプラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978) ]、酢酸 リチウム法 . Bacteriol. , 153, 163 (1983) ]、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 5, 1929 (1978)記載の方法などが例示される。
[0060] 本明細書において、レトロウイルスの感染方法は、例えば、 Current Protocols i n Molecular Biology 前出（特に Units 9. 9-9. 14)などに記載されるように、 当該分野において周知であり、例えば、トリプシナイズして胚性幹細胞を単一細胞懸 、蜀物 single—cell suspension)にした後、ウイノレス産生糸田胞 (virus— producing cells) (パッケージング細胞株 = packaging cell lines)の培養上清と一緒に 1—2 時間共培養（co— culture)することにより、十分量の感染細胞を得ることができる。
[0061] 本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において 用いられる、 Cre酵素の一過的発現、染色体上での DNAマッピングなどは、細胞ェ 学別冊実験プロトコールシリーズ「FISH実験プロトコール ヒト 'ゲノム解析から染色 体'遺伝子診断まで」松原謙一、吉川 寛 監修 秀潤社 (東京)などに記載されるよ うに、当該分野において周知である。
[0062] 本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子およびそ の集合体をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、 植物、菌類、ウィルスなどを含むがそれらに限定されない。生体分子は、生体から抽 出される分子およびその集合体を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与 え得る分子およびその集合体であれば生体分子の定義に入る。したがって、医薬品 として利用され得る低分子 (たとえば、低分子リガンドなど)もまた生体への効果が意 図され得るかぎり、生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポ リペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオ チド、核酸（例えば、 cDNA、ゲノム DNAのような DNA、 mRNAのような RNAを含 む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子 (例えば、ホルモン、リガンド、情 報伝達物質、有機低分子など）、これらの複合分子、およびその集合体 (例えば、細 胞外マトリクス、線維など）などが包含されるがそれらに限定されない。本明細書にお いて、生体分子は、糖代謝と相互作用する任意の因子を含むことが意図される。
[0063] 本明細書において「生体内」または「インビボ」（in vivo)とは、生体の内部をいう。
特定の文脈において、「生体内」は、 目的とする組織または器官が配置されるべき位 置をいう。スクリーニングを行う場合、インビボでのスクリーニングを行うことができる。
[0064] 本明細書において「インビトロ」（in vitro)とは、種々の研究目的のために生体の 一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。 インビボと対照をなす用語である。スクリーニングを行う場合、インビトロでのスクリー二 ングを行うことができる。
[0065] 本明細書において血液に関して言及される場合「糖」および「グルコース」は交換可 能に用いられ、血中の糖またはグルコースの濃度は、血糖値、血液グルコース、血中 グノレコースなどと呼ばれる。
[0066] (好ましい態様の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本 発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に 限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参 酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
[0067] 第一の局面において、本発明は、本タンパク質 (ビスファチンともいう）またはそのフ ラグメントを有効成分として含有する糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤に関す る。
[0068] 本明細書において使用される本タンパク質とは、 （a)配列番号 2で示されるアミノ酸 配列、（b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠 失、付加もしくは置換されたアミノ酸配歹 1J、（c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列に おいて、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配歹 1J、 （d)上記 (c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたアミノ酸配列 、 (e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸 配列、（f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 14 93番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミ ノ酸配列、（g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから 第 1493番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上（好 ましくは、 90%以上、より好ましくは 95%以上）の配列同一性を有する塩基配列を有 する DNAによりコードされるアミノ酸配歹 IJ、および (h)配列番号 1で示される塩基配 列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番目までのヌクレオチドで示される 塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DNAと、ストリンジヱントな条件下で ハイブリダィズする DNAによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン様活 性を有するタンパク質である。
[0069] ここで、上記 (b)における「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」や上記（e)および (g) にある「80%以上の配列同一性」には、例えば、配列番号 2で示されるアミノ酸配列 を有するタンパク質が細胞内で受けるプロセシング、該タンパク質が由来する生物の 種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異 等が含まれる。
[0070] 上記 (b)における「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」（以下、総じてアミノ酸の改変 と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号 2で示さ れるアミノ酸配列をコードする DNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その 後この DNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入 法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法 (ギャップド'デュプレックス法、 NucleicAcids Res., 12,9441-9456(1984))、変異導入用プライマーを用いた PCRによ る方法等が挙げられる。
[0071] 上記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも 1残基、具体的には 1若しくは 数個、またはそれ以上である。かかる改変の数は、当該タンパク質のインスリン様活 性を見出すことのできる範囲であれば良い。
[0072] また上記欠失、付加または置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。
当該置換は、疎水性、電荷、 pK、立体構造上における特徴等の類似した性質を有 するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、（1)グリシン、 ァラニン；（2)バリン、イソロイシン、ロイシン；（3)ァスパラギン酸、グルタミン酸、ァス パラギン、グルタミン、 （4)セリン、スレオニン；（5)リジン、アルギニン；（6)フエニルァ ラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
[0073] 上記 (h)における「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする」に関して、ここで 使用されるハイブリダィゼーシヨンは、例えば、 Sambrook J., Frisch E. F.， Maniatis T. 著、 Molecular Cloning 2ndedition、 Cold Spring Harbor Laboratory press等に 己載 θ れる通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例え ば、 6 X SSC (1. 5M NaCU 0. 15M クェン酸三ナトリウムを含む溶液を 10 X SSCと する）、 50%フオルムアミドを含む溶液中で 45°Cにてハイブリッドを形成させた後、 2 X SSCで 50°Cにて洗浄するような条件（MolecularBiology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6)等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例え ば、 2 X SSCで 50°Cの条件（低ストリンジエンシーな条件）から 0. 2 X SSC ?50°C¾-C の条件（高ストリンジエンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおけ る温度は、例えば、室温 (低ストリンジエンシーな条件）から 65°C (高ストリンジェンシ 一な条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる [0074] 本明細書において、本タンパク質のフラグメントとは、上記本タンパク質の 15— 100 残基、好ましくは 15— 50残基のアミノ酸部分配列からなるペプチドフラグメントを表し 、本タンパク質のインスリン様活性が保持されている限り特に限定はない。
[0075] 本タンパク質の調製方法について以下に説明する。
[0076] まず、本タンパク質をコードする遺伝子 (本遺伝子）、例えば、 (I)配列番号 2で示さ れるアミノ酸配列をコードする塩基配歹 IJ、 (II)配列番号 2で示されるアミノ酸配列にお いて、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコード する塩基配列、（III)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列（即ち、配列番 号 2で示されるアミノ酸配列における第 27番目から第 491番目までのアミノ酸で示さ れるアミノ酸配列をコードする塩基配列）、（IV)上記（III)のアミノ酸配列において、そ のァミノ末端にメチォニンが付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配歹 IJ、 (V)配列 番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコー ドする塩基配列、（VI)配列番号 1で示される塩基配歹 IJ、（VII)配列番号 1で示される 塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番目までのヌクレオチドで示 される塩基配列、 (VIII)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレ ォチドから第 1493番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80% 以上の配列同一性を有する塩基配歹 lj、または (IX)配列番号 1で示される塩基配列に おける第 18番目のヌクレオチドから第 1493番目までのヌクレオチドで示される塩基 配列を有する DNAに対し相補性を有する DNAと、ストリンジヱントな条件下でハイプリ ダイズする DNAの塩基配列等の塩基配列を有する遺伝子を、通常の遺伝子工学的 方法（例えば、 SambrookJ., Frisch E. F.， Maniatis Τ·著、モレキュラークローニング第 2版（Molecular Cloning 2nd edition)、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発 行（ColdSpring Harbor Laboratory press)等に記載されている方法）に準じて取得す る。次いで、得られた本遺伝子を用いることにより、通常の遺伝子工学的方法に準じ て本タンパク質を製造 ·取得する。このようにして本タンパク質を調製することができる
[0077] 例えば、本遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主 細胞に導入して形質転換し、さらに形質転換された宿主細胞 (形質転換体)を培養 することで得られる培養物から本タンパク質を取得すればょレ、。上記プラスミドとして は、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、 自立的に増殖できるもので あって、宿主細胞からの単離 ·精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモ 一ターを有し、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、本タンパク質をコードす る遺伝子が導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、 各種のものが市販されている。例えば、大腸菌での発現に使用される発現ベクター は、 lac, trp, tacなどのプロモーターを含む発現ベクターであって、これらはフアルマ シァ社、宝酒造等から市販されている。当該発現ベクターに本タンパク質をコードす る遺伝子を導入するために用いられる制限酵素も宝酒造等から市販されている。さら なる高発現を導くことが必要な場合には、本タンパク質をコードする遺伝子の上流に リボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、
Lruarenteしら (し ell 20, p543) " 谷口ら (Genetics of Industrialfviicroorgamsms, p202, 講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
[0078] 哺乳動物細胞での発現に使用されるベクターは、 SV40ウィルスプロモーター、サ イトメガロウィルスプロモーター（CMVプロモーター）、 Raus Sarcoma Virusプロモータ 一（RSVプロモーター）、 βァクチン遺伝子プロモーター、 aP2遺伝子プロモーター 等のプロモーターを含む発現ベクターであって、これらは、東洋紡社、宝酒造社等か ら巿販されている。
[0079] 宿主細胞としては、原核生物もしくは真核生物である微生物細胞、昆虫細胞または 哺乳動物細胞等を挙げることができる。例えば、本タンパク質の大量調製が容易にな るという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができる。
[0080] 上記のようにして得られたプラスミドは、通常の遺伝子工学的方法により上記宿主 細胞に導入することができる。
[0081] 形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用 される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当
な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。 培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれの方法でもよぐ好ましくは、通気 撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
[0082] 本タンパク質の取得は、一般のタンパク質の単離'精製に通常使用される方法を組 み合わせて実施すればよい。例えば、上記の培養により得られた形質転換体を遠心 分離等で集め、該形質転換体を破砕または溶解せしめ、必要であればタンパク質の 可溶化を行い、イオン交換、疎水、ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いたェ 程を単独で、若しくは組み合わせることにより精製すればよい。精製されたタンパク質 の高次構造を復元する操作をさらに行ってもよい。また、例えば、上記の培養により 得られた形質転換体を遠心分離などで除去し、培養上清から本タンパク質を上記と 同様にして精製してもよい。
[0083] 別の局面において、本発明は、本タンパク質 (ビスファチンともいう）またはそのフラ グメントをコードする塩基配列を含む核酸分子を有効成分として含有する糖代謝関 連疾患の治療剤または予防剤に関する。ここでこの核酸分子は、下記のいずれかの 塩基配列： <塩基配列群 > (A)配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基 配列、（B)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が 欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配歹 1J、 （C)配列番号 2で 示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸を欠失させた部分 アミノ酸配列をコードする塩基配歹 IJ、 （D)上記（C)のアミノ酸配列において、そのアミ ノ末端にメチォニンが付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配歹 lj、 (E)配列番号 2 で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする 塩基配列、（F)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドか ら第 1493番目までのヌクレオチドで示される塩基配歹 U、 (G)配列番号 1で示される 塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番目までのヌクレオチドで示 される塩基配列と 80%以上 (好ましくは、 90%以上、より好ましくは 95%以上）の同 一性を有する塩基配列を有し、かつ該塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン 様活性を有する、塩基配列、または (H)配列番号 1で示される塩基配列における第 1 8番目のヌクレオチドから第 1493番目までのヌクレオチドで示される塩基配列に対し 相補性を有する塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列 を有し、かつ該塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、塩基 配列、力 なる塩基配列またはそのフラグメントを含む。
[0084] ここで、上記 ）における「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」や上記 (E)および (G )にある「80%以上の配列同一性」には、例えば、配列番号 2で示されるアミノ酸配列 を有するタンパク質が細胞内で受けるプロセシング、該タンパク質が由来する生物の 種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異 等が含まれる。
[0085] 上記（B)における「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」を人為的に行う場合の手法 としては、例えば、配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする DNAに対して慣用 の部位特異的変異導入を施し、その後この DNAを常法により発現させる手法が挙げ られる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方 法（ギャップド'デュプレックス法、 NUCLEICACIDS RES. , 12,9441-9456(1984))、変 異導入用プライマーを用いた PCRによる方法等が挙げられる。
[0086] 上記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも 1残基、具体的には 1若しくは 数個、またはそれ以上である。かかる改変の数は、当該タンパク質のインスリン様活 性を見出すことのできる範囲であれば良い。
[0087] また上記欠失、付加または置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。
当該置換は、疎水性、電荷、 PK、立体構造上における特徴等の類似した性質を有 するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、（1)グリシン、 ァラニン；（2)バリン、イソロイシン、ロイシン；（3)ァスパラギン酸、グルタミン酸、ァス パラギン、グルタミン、 （4)セリン、スレオニン；（5)リジン、アルギニン；（6)フエニルァ ラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
[0088] 本明細書において、糖代謝関連疾患は、生体における糖代謝機能の異常を伴う疾 患をいい、具体的には、糖尿病、耐糖能異常、高血糖の持続に伴う動脈硬化症等の 疾患が挙げられる。すなわち、糖代謝関連疾患は、インスリンの機能低下または機能 不全によって直接的または間接的に生ずる種々の病態を有する疾患であれば特に 限定は無い。本発明の糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤を適用可能な疾患と して、好ましくは、糖尿病などの血糖の恒常性が破綻した病態をあげることができる。
[0089] 本明細書において「糖尿病」とは、当該分野において使用されるのと同じ意味で用 いられ、持続的な高血糖'糖尿を呈する代謝疾患をいう。インシュリン依存性 (I型）と インシュリン非依存性 (Π型）があり、前者は発症が急で症状が重ぐインシュリンの投 与が必要。後者は経過緩慢で必ずしもインシュリン投与を必要としない。
[0090] 本明細書において、 「インスリン様活性」とは、インスリンカ Sインスリン受容体に結合 することにより生じる生理作用を表し、具体的には、血糖降下作用、肝臓における糖 新生抑制活性、または筋肉細胞における糖取り込み促進活性等が挙げられる。
[0091] インスリンカ Sインスリン受容体に結合することによって、インスリン受容体の細胞内ド メインである βサブユニットが自己リン酸化され、細胞内でインスリン由来のシグナル 伝達が生ずる（以下インスリンシグナル伝達と称する。）。インスリンシグナル伝達とし て、具体的には、インスリン受容体、 IRS_1、 PI3キナーゼまたは Aktのリン酸化反応等 が挙げられる。
[0092] 本明細書において「インスリン代謝に関連する」とは、インスリンの分泌またはインス リンによる糖代謝に関連する任意の因子をいう。代表的に、図 9に示される。図 9には 、脂肪細胞におけるインスリンレセプターのシグナル伝達に関与する遺伝子が示され ている。
[0093] 「インスリンシグナル伝達促進活性」とは、上記インスリンシグナル伝達を亢進する 活性を表し、具体的には、肝細胞もしくは筋肉細胞におけるインスリン受容体、 IRS-1 、 PI3キナーゼまたは Aktのリン酸化反応を亢進させる活性、すなわちインスリン受容 体、 IRS-1、 PI3キナーゼまたは Aktのリン酸化体を増加させる活性を表す。
[0094] 「肝細胞における糖新生」とは、肝臓におけるブドウ糖生合成を表し、ピルビン酸か らォキサロ酢酸を経てグルコースを生合成する細胞内の代謝を表す。糖新生の律速 段階はホスホェノールピルビン酸カルボキシナーゼ（PEPCK)が触媒する反応である ことが知られており、インスリンは、 PEPCKの発現量を抑制することによって糖新生抑 制活性を示すことが知られている。
[0095] 「筋肉細胞における糖取り込み促進活性」とは、グルコーストランスポータを介して 細胞外から細胞内へグルコースを取り込む作用を促進する活性を表す。インスリンは 、細胞内に貯蔵された GLUT4を細胞膜上へトランスロケーションさせることによって糖 取り込みを促進することが知られている。取り込まれたブドウ糖は解糖系を経てピルビ ン酸へと変わり同時に ATPを産生しエネルギーとして利用される。
[0096] 本発明の糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤は、インスリン様活性を亢進させ ることを特徴とする。ここで、インスリン様活性を亢進するとは、具体的には、 1)肝臓に おける糖新生を抑制すること、 2)筋肉細胞における糖取り込みを促進すること、 3)ィ ンスリンシグナル伝達を促進すること、 4)血糖値を低下させること等を表す。
[0097] 本明細書において「診断」とは、被験体における疾患の種類、障害の種類と程度、 身体状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の 現状、薬物反応性予測、病態変化予測または原因を判定することをいう。
[0098] 本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態にな つた場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好 ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。
[0099] 本明細書にぉレ、て「予防」（prophylaxisまたは prevention)とは、ある疾患または 障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状態が起こらないよ うに処置することをいう。従って、ある疾患または障害について、そのような状態にな ることを防止、遅延など、および悪化を防ぐことを包含する。本発明の方法は、肺組 織を再生することから、予防にも用いられることが理解される。
[0100] 本明細書において「処置」とは、ある疾患、障害または状態に対して行う任意の医 学的行為をいい、診断、治療、予防、予後などに資するために行う行為が包含される 。好ましくは、処置は、医師、看護師など何らかの国家免許を所有する医療従事者に よって行われるべきである。その行為が結果論敵にある疾患の経過を悪化させ、患 者にとって不利益となる場合であっても、その行為そのものは「処置」であることには 変わりはなレ、ことに留意すべきである。
[0101] 本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法または診断する方法などを 医師、被検体など投与を行う人、診断する人 (被検体本人であり得る）に対して記載 したものである。指示書は、診断薬などがキットとして提供される場合、その使用方法 を指示するために添付され得る。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与 する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国 の監督官庁（例えば、 日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（FD A)など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が 明記される。指示書は、いわゆる添付文書 (package insert)であり、通常は紙媒体 で提供される力 それに限定されず、例えば、電子媒体 (例えば、インターネットで提 供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール、 SMS、 PDF文書など）のような形 態でも提供され得る。
[0102] 本発明の第二の態様は、インスリン様活性の検定方法であって、
(1)細胞 (例えば、脂肪細胞、筋肉細胞または肝細胞）と、被験物質を接触させる第 一工程、
(2)上記細胞におけるインスリン様活性を測定する第二工程、および
(3)上記第二工程により測定された測定値を、被験物質の代わりに本タンパク質を用 レ、て上記第一工程および第二工程を行った場合の測定値と比較し、被験物質のイン スリン様活性が上記タンパク質のインスリン様活性と同等以上であることを指標として
、被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程、
を有する。
[0103] 上記第一工程において用いられる筋肉細胞には、動物の筋肉組織から分離された 筋肉細胞や、同一の機能 ·形態を持つ集団を形成している筋肉細胞（筋肉組織)等 も含まれ、インスリン受容体を発現しており、インスリンに応答して糖取り込みの促進 活性を示し、インスリンの下流のシグナル伝達が機能する細胞であれば特に限定は 無ぐいかなる分化過程にある細胞であってもよい。例えば、筋芽細胞や分化し筋筒 を形成した細胞等を挙げることができる。好ましくは、分化した筋肉細胞が挙げられる 。ここで筋芽細胞とは、筋肉細胞としての素地を獲得した未分化細胞を指し、その形 態としては分化後のように多核化、フィラメントィ匕していない状態である。分化した筋 肉細胞とは、通常 10 100 z m径で 30cmまでの多核の円筒状細胞であり、糖を取 り込む能力を有する。
[0104] ここで「筋肉組織」としては、例えばヒラメ筋（Soleus muscle)もしくは長指伸筋（
Extensor digitorium longus)などの骨格筋組織が挙げられる。
[0105] 上記筋肉細胞の由来動物としては、例えば哺乳動物等を挙げることができ、さらに 具体的にはヒト、サル、マウス、ラット、ハムスターなどを挙げることができる。 [0106] 筋肉細胞は、骨格筋組織から単離することもできるが、 L6 (大日本製薬）、 C2C12な どの株化された細胞を用いることもできる。これらは市販されているカ もしくは容易 に理研細胞バンクなどの細胞寄託機関から入手できる。これらの細胞は、例えば、ゥ シ胎児血清（以下、 FBSと記す。）（GIBCO製）、ペニシリン、ストレプトマイシン（GIB CO製）をそれぞれ終濃度 10%、 100ユニット/ mlおよび 100 x g/mlとなるように 添加したダルベッコ改変イーグル培地（4. 5g/LD_グルコースおよび 584mgZL Lーグノレタミン含有。 GIBCO製）（以下、 DMEM培地と記す。）などの通常の培地中 で培養することができ、細胞はコンフルェントになった後、円筒状の多核筋肉細胞に 分化する。
[0107] 第一工程において用いられる脂肪細胞は、動物の脂肪組織から分離された脂肪細 胞ゃ、同一の機能 ·形態を持つ集団を形成してレ、る脂肪細胞 (脂肪組織)等も含まれ 、インスリン受容体を発現しており、インスリンに応答して糖取り込みの促進活性を示 し、インスリンの下流のシグナル伝達が機能する細胞であれば特に限定は無ぐいか なる分化過程にある細胞であってもよい。好ましくは、分化した脂肪細胞（例えば、 3 T3-L1細胞）が挙げられる。脂肪細胞の特徴は、組織間に散在、または疎性結合組 織の一つとして毛細血管の走行に沿う集団として脂肪組織を形成する多量の脂肪を 含むことなどが挙げられる。細胞内の脂肪ははじめいくつかの微小滴として現われ、 しだいに大きくなり、一つに融合してついには細胞体の大部を占める。細胞内の脂肪 はスダン ΙΠまたは四酸化オスミウムにより容易に検出される。脂肪細胞には、白色脂 肪細胞および褐色脂肪細胞がある。脂肪細胞を識別するための方法は、当該分野 において公知であり、例えば、上記脂肪の検出、脂肪細胞分化マーカーの発現、脂 肪細胞特異的サイト力インの発現などを挙げることができるがそれらに限定されなレ、。
[0108] 本明細書において「脂肪組織」とは、結合組織の一種で、脂質を貯蔵する点で特徴 的であり、この他にも種々の重要な機能を有する組織である。脂肪組織には、脂肪が 蓄積される。脂肪組織中の脂肪細胞は、格子繊維によって囲まれ、細胞間に毛細血 管が密に分布する。他の組織力 独立してほぼ一定した塊状もしくは房状の脂肪組 織を形成している場合、脂肪体という。脂肪組織は、例えば、腹部、骨格筋、臀部、 胸部、内臓などにおいて発達する。 [0109] 上記脂肪細胞の由来動物としては、例えば哺乳動物等を挙げることができ、さらに 具体的にはヒト、サル、マウス、ラット、ハムスターなどを挙げることができる。
[0110] 上記第一工程において用いられる肝細胞は、糖新生よび解糖系に関与する酵素 等が機能している肝細胞、すなわちインスリン受容体を発現し、インスリンに応答して 糖新生の抑制が認められる細胞であればレ、かなる肝細胞でも良ぐ動物の肝臓から 分離された肝実質細胞や、同一の機能 ·形態を持つ集団を形成してレ、る肝細胞 (肝 臓組織)等も含まれる。上記肝細胞の由来動物動としては、例えば哺乳動物等を挙 げること力 sでき、さらに具体的にはヒト、サル、マウス、ラット、ノ、ムスターなどを挙げる こと力 sできる。
[0111] 肝細胞として、例えば、初代培養肝細胞が挙げられ、以下の方法で調製することが できる。すなわち、ラット (Wister rat, 150 250g 腹部切開、腸を脇に寄せ門脈を露 出させ、 22G留置針（テルモ）を揷入し縫合糸で固定する。ペリスタポンプのチューブ に輸液チューブ結合させ、灌流液 (LiverPerilision Medium) (Gibco社）を流出させな 力 Sら空気が入らないように留置針とチューブを結合し、同時に腹部下大静脈を切開、 放血し 37°Cに保った灌流液で灌流を開始する。 10分間灌流後、恒温層で 37°Cに保 たれたコラーゲナーゼ灌流液（LiverDigest Medium) (Gibco社）を 10分間灌流する。 灌流終了後、肝臓を摘出、シャーレ上で minceし洗浄用培地（Hepatocyte
WashMedium) (Gibco社），あるいは 5%FBSを含む Medium 199 (Gibco社）で懸濁、 250 μ mメッシュフィルターでろ過した後、 500卬 m、 lmin.遠心分離し上清を除去する。沈 殿は洗浄用培地で懸濁、遠心分離、上清除去をさらに 3回繰り返し、 100 / mセルスト レーナ一 (FALCON社)でろ過後、 10%FBSを含む William'sMedium E (Sigma社）で懸 濁、遠心分離、上清除去を行う。最後に沈殿を 10%FBS、 InMインスリン (Sigma製）、 ΙΟΟηΜデキサメサゾン（Sigma製）を含む William'sMedium Eで懸濁し、 70 μ mセルスト レーナ一 (FALCON社)でろ過後、血球計算版をもちいて細胞数を計測し、コラーゲン コートプレート（イワキ製）に 0.5— 1.5 X 105cellsん m2の密度でまきこむ。まきこみ力、ら 2 一 3時間後に同じ培地で培地交換する。このように調製された初代培養肝細胞は、通 常は翌日力 アツセィに使用可能である。
[0112] また、 Η4ΠΕ、 Η印 G2などの株化された細胞を用いることもでき、これらは大日本製 薬などから市販されており、容易に入手できる。これらの肝細胞は通常の細胞培養法 にて培養可能であり、例えば DMEM培地に、デキサメサゾン（Sig腿社）、 cAMP ( Sigma社）をそれぞれ終濃度 100nM、および 50 μ Μとなるように添加した培地（以下 、肝細胞用培地)などにて培養できる。
[0113] 被験物質として用いられる化合物には特に限定は無ぐタンパク質、ペプチド、核 酸、無機化合物、天然もしくは合成化学的に調製された有機化合物等が挙げられる 。被験物質として、具体的には、アミノ酸 3 50残基、好ましくは 5 20残基のぺプチ ドライブラリーや、当業者に公知のコンビナトリアルケミストリーの技術を用いて調製さ れた分子量 100 2000、好ましくは 200 800の低分子有機化合物ライブラリーを 挙げること力 Sできる。コンビナトリアルケミストリーを利用したライブラリーを作成する方 法は、当該技術分野で周知である。例えば、 E. R. Felder, Chimia 1994， 48， 5 12— 541 ; Gallopら、 J. Med. Chem. 1994, 37, 1233— 1251 ; R. A. Houghten , Trends Genet. 1993, 9, 235— 239 ; Houghtenら、 Nature 1991 , 354, 84 —86 ; Lamら、 Nature 1991 , 354, 82— 84 ; Carellら、 Chem. Biol. 1995, 3, 1 71— 183 ; Maddenら、 Perspectives in Drug Discovery and Design2, 26 9_282 ; Cwirlaら、 Biochemistry 1990, 87, 6378—6382 ; Brennerら、 Pro Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 5381— 5383 ; Gordonら、 J. Med. Chem. 1994, 37, 1385-1401 ; Leblら、 Biopolymers 1995, 37 177—198 ;およびそ れらで引用された参考文献を参照のこと。これらの参考文献は、その全体を、本明細 書中で参考として援用する。
[0114] 細胞 (脂肪細胞、筋肉細胞もしくは肝細胞など）と接触させる被験物質の濃度として は、特に限定は無ぐ通常約 0.： M—約100 μ Mでぁればょぐ好ましくは Ι μ Μ 一 50 μ Μであればよい。筋肉細胞もしくは肝細胞と被験物質とを接触させる時間は 、通常 5分間一 30分間程度あり、好ましくは 10分間一 20分間程度である。被験物質 は適宜、水、リン酸バッファーもしくはトリスバッファ一等のバッファー、エタノール、ァ セトン、ジメチルスルホキシドもしくはこれらの混合物などの溶媒に溶解または懸濁し て用いることができる。
[0115] 上記第二工程において、インスリン様活性を測定する方法としては、以下の 1)一 3) が挙げられる：
1)細胞または組織 (脂肪細胞、筋肉細胞、脂肪組織、または筋肉組織）における糖 取り込み促進活性
筋肉細胞あるいは筋肉組織に含まれる取り込み糖量を測定する方法としては、筋 肉細胞あるいは筋肉組織中の取り込み糖量を測定する方法であればどのような方法 であってもよいが、例えば、取り込まれた放射標識グルコースを定量する方法等を挙 げること力 sできる。筋肉組織あるいは細胞内に取り込まれた放射標識グノレコースを定 量する方法の具体的な例としては、（1)生体から単離した筋肉組織を用いて、組織 中に取り込まれた放射標識グルコースの量を測定する方法、（2)分化筋肉細胞を用 いて、当該細胞中に取り込まれた放射標識グルコースの量を測定する方法等が挙げ られる。筋肉組織を用いた糖取り込み測定方法（前者）としては、例えば、 Molecular Cell, vol.2, p.559 (1998)等に記載される方法を用いることができる。分化筋肉細胞を 用いて、当該細胞中に取り込まれた放射標識グノレコースの量を測定する方法 (後者) としては、例えば、「Am.J. Physiol., vol.276, E849 (1999) 」や「医学の歩み， 184(6), 503-506, 1998」等に記載される方法を用いることができる。
2)肝細胞における糖新生抑制活性
肝細胞における糖新生量を測定する方法としては、例えば、文献等に記載される 方法を用いることができる。より詳細には、肝細胞用培地にて培養した H4IIE細胞を 12ゥエルプレートに 1ゥエル当たり約 3xl05細胞の量でまきこみ、細胞がコンフルェ ントになった後に、 5mMのグノレコースを含む以外は上記記載と同一の肝細胞用培 地に交換し、終夜培養する。細胞をリン酸緩衝液で洗浄後、糖新生用バッファー（8. 3g/L DMEM_base、 4mM L—グルタミン、 ImMピルビン酸ナトリウム、 3. 7g/ L 炭酸水素ナトリウム、 0. 9g/L 乳酸、 100ユニット/ mLペニシリン、および 100 μ g/mL ストレプトマイシン）に交換して、さらに終夜細胞を培養する。翌日、細胞 上清を回収して、適宜希釈し、上清中に含まれる糖 (グルコース）量を定量する。ダル コース定量のためのキットは多数市販されており、例えば F—キットグルコース FKンタ 一ナショナル社)などを用いることが出来る。
3)細胞（例えば、脂肪細胞、筋肉細胞または肝細胞）におけるインスリンシグナル伝 達促進活性
ここで、細胞（例えば、脂肪細胞、筋肉細胞または肝細胞）におけるインスリンシグ ナル伝達を測定する方法としては、インスリン受容体やその下流分子である IRS-1タ ンパク質、 pI3キナーゼ、 Aktタンパク質のリン酸化量を定量する方法などがあげられ る。ここで、 IRS-1タンパク質、 PI3キナーゼ、 Aktタンパク質は公知であり、その構造や 機能については、 MolecularMedicine Vol.36, 110-115(1999 ;中山書店)に記載され ている。これらの分子のリン酸化量を定量する方法としては、抗体を用いたウェスタン ブロッテイング法などがあげられ、当該方法に用いる抗体は、例えばシグマ社や Up stateBiotechnology社などから市販されており、通常の方法に準じて行うことができる
[0116] 本発明の第三工程において、「被験物質の代わりに本タンパク質を用いて上記第 一工程および上記第二工程を行った場合の測定値」とは、（i)細胞（例えば、脂肪細 胞、筋肉細胞または肝細胞）と、配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク 質等の本タンパク質を接触させ、（ii)次いで上記細胞におけるインスリン様活性を測 定することによって得られる測定値を表す。
[0117] ここで細胞（例えば、脂肪細胞、筋肉細胞または肝細胞）と接触させる本タンパク質 の濃度としては、通常約 0· lng/ml (2pM)—約100 /i g/ml (2 μ M)でぁればょく 、約 lng/ml (20pM)—約 20 /i g/ml (0. 4 μ Μ)が好ましレ、。筋肉細胞もしくは肝 細胞と本タンパク質とを接触させる時間は、通常 5分間一 1日、好ましくは 5分一 30分 間程度である。細胞（例えば、脂肪細胞、筋肉細胞または肝細胞）と接触させる被験 物質の濃度としては、通常約 0· 1 μ Μ—約 100 μ Μであればよぐ 1 μ Μ— 50 μ Μ が好ましい。細胞 (例えば、脂肪細胞、筋肉細胞または肝細胞）と被験物質とを接触 させる時間は、通常 5分間一 1日程度、好ましくは 5分一 30分間程度であり、更に好 ましくは 10分間一 20分間程度である。
[0118] 本発明第二工程により測定された測定値と、被験物質の代わりに配列番号 2で示さ れるアミノ酸配列からなるタンパク質等の本タンパク質を用いた場合の上記第一工程 および上記第二工程を行った場合の測定値を比較し、本タンパク質と同等以上のィ ンスリン様活性を示す被験物質を、インスリン様活性を有する物質であると評価する こと力 Sできる。
[0119] また、被験物質を哺乳動物に投与した後、当該哺乳動物の血糖値を測定し、該測 定値を、被験物質の代わりに配列番号 2で示されるタンパク質等の本タンパク質を投 与した哺乳動物における血糖値を比較することによって、当該被験物質が配列番号 2で示されるタンパク質等の本タンパク質と同等以上の血糖降下作用を示すか否か を半 IJ断することもできる。
[0120] 更に、被験物質を哺乳動物に投与した後当該哺乳動物の血糖値を測定し、該測 定値を、被験物質の代わりに配列番号 2で示されるタンパク質等の本タンパク質を哺 乳動物内で過剰発現させた場合の血糖値を比較することによって、当該被験物質が 配列番号 2で示されるタンパク質等の本タンパク質と同等以上のインスリン様活性を 示すか否かを判断することもできる。本タンパク質を哺乳動物内で過剰発現させる方 法としては、たとえば、トランスジヱニックやアデノウイルス感染などの方法があり、レヽ ずれの方法も文献等で公知である。
[0121] 上記のようにして被験物質が有する 1)脂肪細胞または筋肉細胞への糖取り込み能 力、 2)肝細胞における糖新生抑制能力、 3)細胞 (例えば、脂肪細胞、筋肉細胞また は肝細胞）におけるインスリンシグナル活性化能力、 4)哺乳動物に投与した際の血 糖低下能力等のインスリン様活性を検定することができる。本発明検定方法により評 価された能力に基づき、インスリン様活性促進剤、具体的には、 1)脂肪細胞または 筋肉細胞への糖取り込み促進剤、 2)肝細胞における糖新生抑制剤、 3)細胞 (例え ば、脂肪細胞、筋肉細胞または肝細胞）におけるインスリンシグナル伝達促進剤、お よび 4)血糖低下剤を、糖代謝機能改善剤、即ち糖代謝関連疾患の治療剤または予 防剤として選抜することができる (本発明探索方法)。
[0122] 具体的には、被験物質のインスリン様活性が、本タンパク質のインスリン様活性に比 ベて通常、 1. 0倍より高ぐより通常には、 1. 2倍以上、好ましくは 1. 5倍以上、更に 好ましくは 2倍以上である場合、当該被験物質を、糖代謝機能を改善する活性、詳し くはインスリンシグナル伝達促進活性を有する糖代謝関連疾患の治療剤または予防 剤の候補物質として選別することができる。
[0123] 例えば、被験物質の糖取り込み促進能力を表わす糖取り込み促進率が、統計学的 に有意な値を示す物質、具体的には、配列番号 2で示されるタンパク質の糖取り込 み促進率の 1. 0倍より高い値、より通常には 1. 2倍以上の値、より好ましくは 1. 5倍 以上を示す物質を、糖取り込み促進能力を有する物質として選抜する。
[0124] 本発明の第三の態様は、被験物質が、本タンパク質または本タンパク質をコードす る遺伝子 (本遺伝子）の発現を促進 (誘導)するか否かを指標とする、被験物質のイン スリン様活性の検定方法に関する。以下に詳細に説明する。
1)本遺伝子の発現量を指標とする検定方法
本発明は、下記の工程（1)一（3)を含むことを特徴とする、インスリン様活性の検定 方法を提供する。すなわち、
(1) 該発現条件下で本タンパク質をコードする遺伝子を発現する能力を有する細 胞と被験物質とを接触させる第一工程、
(2) 該発現条件下で被験物質を接触させた細胞における、上記遺伝子の発現量を 測定し、該発現量を該発現条件下で被験物質に接触させない対照細胞における上 記遺伝子の発現量と比較する第二工程、および（3) 上記第二工程の比較結果に 基づいて、被験物質が上記遺伝子の発現量を増加させるか否かを指標として被験物 質のインスリン様活性を評価する第三工程。
[0125] ここで、被験物質としては上記と同じものが挙げられる。
[0126] 「本タンパク質をコードする遺伝子 (本遺伝子）を発現する能力を有する細胞」として は、本遺伝子を発現する細胞であれば特に限定はぐ本遺伝子を発現し得る細胞を そのまま用いてもよいし、本遺伝子を含むベクターで形質転換した細胞を用いてもよ レ、。由来動物種としては、ラット、マウス、モルモット等のげつ歯類哺乳動物、ィヌ、サ ノレ、ヒト等が挙げられる。
[0127] 具体的には、ヒト腎臓由来細胞である HEK293、ハムスター卵巣由来細胞である
CH〇-K1、またはアフリカミドリザル腎臓由来細胞である COS-1もしくは C〇S_7が挙げ られる。また、哺乳動物の脂肪由来細胞、肝臓由来細胞、筋肉由来細胞などを用い てもよく、例えば、株化脂肪細胞である 3T3_L1、株化肝細胞である H印 G2等が挙げ られる。
[0128] 本遺伝子の発現レベルの検出および定量は、上記細胞から調製した RNAまたはそ れから転写された相補的なポリヌクレオチドを用いて、ノーザンブロット法、 RT-PCR 法など公知の方法で実施できる。具体的には、本タンパク質遺伝子の塩基配列にお いて連続する少なくとも 15塩基を有するポリヌクレオチドおよび/またはその相補的 なポリヌクレオチドをプライマーまたはプローブとして用いることによって、 RNA中の本 遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。そのようなプ ローブもしくはプライマーは、本タンパク質遺伝子の塩基配列をもとに、例えば primer3 ( HYPERLINK
http://www.genome.wi.mit.edU/cgi-bin/pnmer/primer3xgihttp:/ /www.genome.wi.m it.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)あるレヽはべクタ1 ~ NTI (Infomax社 )を IJ用して 設計することができる。
[0129] ノーザンプロット法を利用する場合、上記プライマーもしくはプローブを放射性同位 元素 (32P、 33Pなど： RI)や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメン プレン等にトランスファーした細胞由来の RNAとハイブリダィズさせた後、形成された 上記プライマーもしくはプローブ（DNAまたは RNA)と RNAとの二重鎖を、上記プライ マーもしくはプローブの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルとして放射 線検出器 (BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方 法を列示することができる。また、 AlkPhosDirect Labelling and Detection System (Amersham PharamciaBiotech社製)を用いて、該プロトコ一ノレに従って上記プローブ を標識し、細胞由来の RNAとハイブリダィズさせた後、上記プローブの標識物に由来 するシグナルをマルチバイオイメージヤー STORM860 (AmershamPharmacia Biotech 社製)で検出、測定する方法を使用することもできる。
[0130] RT-PCR法を利用する場合は、細胞由来の RNAから常法に従って cDNAを調製して 、これを錡型として標的の本タンパク質遺伝子の領域が増幅できるように、本タンパク 質遺伝子の配列に基づき調製した一対のプライマー（上記 cDNA (—鎖）に結合する 正鎖、 +鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダィズさせて、常法に従って PCR法を 行レ、、得られた増幅二本鎖 DNAを検出する方法を例示することができる。なお、増 幅された二本鎖 DNAの検出は、上記 PCRを予め RIや蛍光物質で標識しておいた プライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖 DNAを検出する方法、 産生された二本鎖 DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて 、標識した上記プライマーをプローブとして使用してこれとハイブリダィズさせて検出 する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖 DNA産物はアジ レント 2100バイオアナライザ (横河アナリティカルシステムズ社製)などで測定すること ができる。また、 SYBRGreen RT-PCR Reagents (Applied Biosystems社製)で該プロト コールに従って RT-PCR反応液を調製し、 ABIPRIME 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
2)本タンパク質の発現量を指標として用いる検定方法
本発明は、下記の工程（1)一（3)を含むことを特徴とする、インスリン様活性の検定 方法を提供する。すなわち：
(1)該発現条件下で本タンパク質を発現する能力を有する細胞と被験物質とを接触 させる第一工程、
(2)該発現条件下で被験物質を接触させた細胞における、上記タンパク質の発現量 を測定し、該発現量を該発現条件下で被験物質に接触させない対照細胞における 上記タンパク質の発現量と比較する第二工程、および
(3)上記第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が上記タンパク質の発現量を 増加させるか否力を指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程。
[0131] ここで、被験物質としては上記と同じものが挙げられる。また、「本タンパク質を発現 する能力を有する細胞」としては、上記 1)における「本タンパク質をコードする遺伝子 (本遺伝子）を発現する能力を有する細胞」と同じものが挙げられる。
[0132] 本タンパク質の発現レベルの検出および定量は、本タンパク質を認識する抗体を 用いたウェスタンプロット法等の公知方法に従って定量できる。ウェスタンプロット法は 、一次抗体として本タンパク質を認識する抗体を用いた後、二次抗体として1251などの 放射性同位元素、蛍光物質、西洋ヮサビペルォキシダーゼ (HRP)等の酵素等で標 識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを 放射線測定器 (BAI-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで測定すること によって実施できる。また、一次抗体として本タンパク質を認識する抗体を用いた後、 ECLPlus Western Blotting Detection System (アマシャム ファノレマシアバイオテク社 製）を利用して該プロトコールに従って検出し、マルチバイオメージャー STORM860 ( アマシャム フアルマシアバイオテク社製）で測定することもできる。
[0133] 抗体は、その形態に特に制限はなぐ上記本タンパク質を免疫抗原とするポリクロ ーナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよぐさらには本タン パク質を構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常 8アミノ酸、好ましくは 15アミノ酸、より好ましくは 20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有す る抗体も、本発明の抗体に含まれる。
[0134] これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従 つて製造 1ることかできる (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987)Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12 11.13)。
3)本遺伝子の発現制御領域を用いたレポーター遺伝子アツセィを用いる検定方法 本発明は、下記の工程（1)一（3)を含むことを特徴とする、インスリン様活性の検定 方法を提供する。すなわち：
(1) 発現条件下で本タンパク質をコードする遺伝子の発現制御領域に作動可能に 連結されるレポーター遺伝子を含有する細胞と被験物質とを接触させる第一工程、
(2) 該発現条件下で被験物質を接触させた細胞における、上記レポーター遺伝子 の発現量を測定し、該発現量を該発現条件下で被験物質に接触させない対照細胞 における上記遺伝子の発現量と比較する第二工程、および
(3) 上記第二工程の比較結果に基づいて、上記レポーター遺伝子の発現量を増 カロさせるか否力を指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程。
[0135] ここで、被験物質は、上記と同じものが挙げられる。
[0136] 「本タンパク質をコードする遺伝子 (本遺伝子）の発現制御領域」とは、通常、当該 染色体遺伝子の上流数 kbから数十 kbの範囲を指し、例えば、（i) 5 ' _レース法（ 5'-RACE法） (例えば、 5， foil Race Core Kit (宝酒造社製）等を用いて実施されうる)、 オリゴキャップ法、 S1プライマーマッピング等の通常の方法により、 5 '末端を決定する ステップ；（ii) GenomeWalker Kit (クローンテック社製)等を用いて 5，-上流領域を取得 し、得られた上流領域について、プロモーター活性を測定するステップ；、を含む手 法等により同定することが出来る。 [0137] 本タンパク質遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター 遺伝子は、当業者に公知の方法で調製すればよい。すなわち、「Molecular し ionmg:A Laboratory Manual 2nd editionj (1989), Cold SpnngHarbor Laboratory Press Λ「Current Protocols In Molecular BiologyJ (1987),JohnWiley & Sons, Inc.等 ίこ 記載される通常の遺伝子工学的手法に従って切り出された本タンパク質遺伝子の発 現調節領域を、レポーター遺伝子を含むプラスミド上に組み込むことができる。
[0138] レポーター遺伝子としては、ダルクロニダーゼ（GUS)、ルシフェラーゼ、クロラムフエ 二コールトランスァセチラーゼ（CAT)、 β -ガラタトシダーゼおよびグリーン蛍光タンパ ク質 (GFP)等が挙げられる。
[0139] 調製した本タンパク質遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレ ポーター遺伝子を、通常の遺伝子工学的手法を用いて、当該レポーター遺伝子を導 入する細胞において使用可能なベクターに揷入し、プラスミドを作製し、適当な宿主 細胞へ導入することができる。レポーター遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養す ることにより、形質転換細胞を得ることができる。
[0140] また、レポーター遺伝子の発現量を測定する方法としては、個々のレポーター遺伝 子に応じた方法を利用すればよい。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ 遺伝子を用いる場合には、上記形質転換細胞を数日間培養後、当該細胞の抽出物 を得、次いで当該抽出物をルシフェリンおよび ΑΤΡと反応させて化学発光させ、その 発光強度を測定することによりプロモーター活性を検出することができる。この際、ピ ッカジーンデュアルキット（登録商標;東洋インキ製)等の市販のルシフェラーゼ反応 検出キットを用いることができる。
[0141] 上記 1)一 3)において、「本タンパク質をコードする遺伝子を発現する能力を有する 細胞」、「本タンパク質を発現する能力を有する細胞」または「本遺伝子の発現制御 領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞」と、被験 物質との接触は、当該細胞が成育可能な条件で培養しながら行えばよぐ例えば、 哺乳動物細胞を宿主とする本発明形質転換細胞の場合、適宜ゥシ胎児血清等の哺 乳動物由来の血清を添加した D_MEM、 OPTI_MEM、 RPMI1640培地（Gibco 一 BRL製）等の市販の培地中で培養できる。 [0142] 上記 1)一 3)において、「被験物質に接触させない対照細胞」とは、各第一工程で 用いられる「本タンパク質をコードする遺伝子を発現する能力を有する細胞」、「本タ ンパク質を発現する能力を有する細胞」または「本遺伝子の発現制御領域を機能可 能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞」において、被験物質を 接触させない場合の当該細胞を表す。「被験物質を接触させない場合」には、被験 物質の代わりに被験物質と同量の溶媒 (ブランク）を添加する場合や、本遺伝子、本 タンパク質もしくはレポーター遺伝子の発現に影響を与えないネガティブコントロール 物質を添加する場合も含まれる。
[0143] 上記 1)一 3)において、各第一工程および第二工程で測定した本遺伝子、本タンパ ク質またはレポーター遺伝子の発現レベルに基づき、本遺伝子もしくは本タンパク質 の発現誘導活性を有する被験物質を選択することができる。すなわち、被験物質を 添加した細胞における本遺伝子、本タンパク質またはレポーター遺伝子の発現が被 験物質を添加しない対照細胞での発現量と比較して 1. 2倍以上、好ましくは 1. 5倍 以上、更に好ましくは 2倍以上であれば、該被験物質は本遺伝子もしくは本タンパク 質の発現促進剤 (発現誘導剤）として選択することができる (本発明探索 (スクリー二 ング)方法)。
[0144] 上記のように選択される本遺伝子もしくは本タンパク質の発現誘導物質もまた、糖 代謝機能を改善する活性、詳しくはインスリンシグナル伝達促進活性を有する本発 明の糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤の候補物質である。
[0145] 本発明において探索され得る糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤は、ポリぺプ チド、核酸、糖鎖、脂質、有機低分子、およびこれらの複合分子であり得る。
[0146] 別の局面において、本発明は、被験物質のインスリン様活性の調節活性を検定す るためのシステムであって、該システムは：
A)下記の（a) (h)のレ、ずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 カロもしくは置換されたアミノ酸配列、 (c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)上記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配列、
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列
からなるタンパク質または該タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
B)該タンパク質または該核酸の発現をする発現手段；
C)該発現を調節するかどうかを判定する判定手段
を備える、システムを提供する。
あるいは、本発明は、糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤を探索するためのシ ステムであって、該システムは：
A)下記の（a) (h)のレ、ずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 加もしくは置換されたアミノ酸配列、 (c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)上記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配列、
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列
力 なるタンパク質または該タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
B)該タンパク質または該核酸の発現をする発現手段；
C)該発現を調節するかどうかを判定する判定手段；および
D)被験物質のインスリン様活性の調節活性を指標として、糖代謝関連疾患の治療 剤または予防剤の候補物質を選別する選別手段
を備える、システムを提供する。
[0148] ここで、発現手段は、本明細書において別の箇所に記載されるように、細胞を用い る系かまたは用いなレ、系（無細胞系）を利用することができる。細胞を用いる系の場 合、本タンパク質を発現する能力を有する細胞を用いることが好ましい。
[0149] ここで、判定手段としては、直接または間接的に発現されたタンパク質または核酸 を同定することができる任意の手段を利用することができ、例えば、 SDS—PAGEお よびそれに続くタンパク質の染色（銀染色、クマシ一ブリリアントブルー、抗体を用い た検出（例えば、ウェスタンブロット、ドットブロットなど）、特異的プローブを用いたノー ザンブロット、特異的プライマーを用いた PCRなどの発現核酸の検出手段などを挙 げることができるがそれらに限定されない。
[0150] ここで、被験物質のインスリン様活性の調節活性を指標として、糖代謝関連疾患の 治療剤または予防剤の候補物質を選別する選別手段としては、同定された調節活性 をもとに (例えば、対照と比較することによって）、一定基準以上の活性を持つ被験物 質を候補物質として選択するプログラムが格納されたコンピュータなどを挙げることが できるがそれに限定されず、当業者は、任意の選別手段を用いることができることを 理解する。例えば、この選別手段において、インスリン様活性の調節活性がインスリン 様活性の亢進であり、亢進は、本タンパク質または上記核酸の発現量を維持または 増加させること選別することを特徴とすることができる。
[0151] 別の局面において、本発明は、糖代謝関連疾患を治療または予防するための方法 を提供する。この方法は: A)以下のアミノ酸配列を有するタンパク質くアミノ酸配列 群 > (a)配列番号 2で示されるアミノ酸配歹 IJ、（b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列 において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配歹 U、 (c )配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸を 欠失させた部分アミノ酸配歹 1J、 （d)上記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端 にメチォニンが付加されたアミノ酸配歹 lj、 (e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80 %以上の配列同一性を有するアミノ酸配歹 1J、 (f)配列番号 1で示される塩基配列にお ける第 18番目のヌクレオチドから第 1493番目までのヌクレオチドで示される塩基配 歹 IJを有する DNAによりコードされるアミノ酸配歹 1J、 （g)配列番号 1で示される塩基配 列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番目までのヌクレオチドで示される 塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性を有する塩基配列を有する DNA によりコードされ、かつインスリン様活性を有するアミノ酸配歹 1J、または (h)配列番号 1 で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番目までのヌクレ ォチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DNAと、ストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有 するアミノ酸配歹 1J、あるいは以下の塩基配列を有する核酸分子：く塩基配列群〉（A )配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、 （B)配列番号 2で示され るアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたァ ミノ酸配列をコードする塩基配列、 （C)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 そのアミノ末端から 26個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基 配列、（D)上記（C)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加され たアミノ酸配列をコードする塩基配歹 1J、 (E)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80% 以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、（F)配列番号 1で示 される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番目までのヌクレオチ ドで示される塩基配歹 1J、 (G)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌ クレオチドから第 1493番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と 80。/ο以上の配 列同一性を有する塩基配列を有し、かつ該塩基配列がコードするタンパク質力 Sインス リン様活性を有する、塩基配列、または (Η)配列番号 1で示される塩基配列における 第 18番目のヌクレオチドから第 1493番目までのヌクレオチドで示される塩基配列に 対し相補性を有する塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基 配列を有し、かつ該塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、 塩基配列、によって達成されるインスリン様活性を維持または亢進させる工程を包含 する。ここで、工程 Α)は、本発明のタンパク質またはそれをコードする核酸分子、ある レ、は、本発明のタンパク質のインスリン様活性を調節（例えば、亢進、抑制、維持など )する因子を含む糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤を処置が必要な被験体に 投与することを包含する。
本タンパク質およびそのフラグメント、あるいは本発明探索方法で見出される化合 物は、これらを医薬品として用いるにあたり、そのままもしくは公知の薬学的に許容さ れる担体 (賦形剤、希釈剤、増量剤、結合剤、滑沢剤、流動助剤、崩壊剤、界面活性 剤等などが含まれる)や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製すること 力 Sできる。当該医薬組成物は、調製する形態 (錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒 剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤な どの非経口投与剤）等に応じて、全身的にまたは局所的に、経口投与または非経口 投与することができる。非経口投与する場合には、静脈投与、皮内投与、皮下投与、 直腸投与、経皮投与すること等が可能である。
[0153] 本明細書において「薬学的に受容可能な担体」は、医薬または動物薬を製造する ときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのよう な薬学的に受容可能な担体としては、例えば、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料 、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル 、希釈剤、賦形剤および Zまたは農学的もしくは薬学的アジュバントなどが挙げられ るがそれらに限定されない。
[0154] 本明細書で使用される受容可能な担体、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに 対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活 性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クェン酸塩、または他の有機酸;抗酸 化剤（例えば、ァスコルビン酸）；低分子量ポリペプチド;タンパク質 (例えば、血清ァ ノレブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリ ドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニンまたはリジン） ；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グノレコース、マンノース、またはデ キストリンを含む）；キレート剤（例えば、 EDTA)；糖アルコール（例えば、マンニトー ルまたはソルビトール）；塩形成対イオン (例えば、ナトリウム）；ならびに/あるいは非 イオン性表面活性化剤（例えば、 Tween、プル口ニック（pluronic)またはポリエチレ ングリコール（PEG) )。
[0155] 医薬を製造する方法は、当該分野において周知であり、本発明の医薬は、必要に 応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第 14版 たはての最新片反、 Remington s PharmaceuticaLSciences, 18tn Edition, A. R. Gennaro, ed.， Mack Publishing Company, 1990などを参照）と、所 望の程度の純度を有する細胞組成物とを混合することによって、凍結乾燥された状 態で調製され保存され得るが、適切な保存液中に保存されることが好ましい。
[0156] 本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法または診断する方法などを 医師、被検体など投与を行う人、診断する人 (被検体本人であり得る）に対して記載 したものである。指示書は、診断薬などがキットとして提供される場合、その使用方法 を指示するために添付され得る。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与 する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国 の監督官庁 (例えば、 日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局 (FD A)など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が 明記される。指示書は、いわゆる添付文書 (package insert)であり、通常は紙媒体 で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体 (例えば、インタ-ネットで提 供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール、 SMS、 PDF文書など）のような形 態でも提供され得る。
[0157] 上記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈 剤等に有効成分 (本タンパク質、または本発明探索方法により選抜される物質または その薬学的に許容される塩等）を配合することにより製造することができる。また注射 剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加すること あでさる。
[0158] また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、 症状などによって異なり一概に規定できなレ、が、通常、経口の場合には成人で 1日あ たり有効成分量として、数 mg— 2g程度、好ましくは 5mg—数十 mg程度を、 1日 1一 数回にわけて投与することができる。注射の場合には成人で有効成分量として約 0. lmg—約 500mgを投与すればよぐ 1日の投与量を 1回または数回に分けて投与す ること力 Sできる。
[0159] 上記有効成分物質として、本遺伝子そのものを挙げることができる。この場合は、本 遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。これ らの場合も、遺伝子治療用組成物の投与量、投与方法は患者の体重、年齢、症状な どにより変動し、当業者であれば適宜選択することが可能である。
[0160] 上記遺伝子治療にっき詳述すれば、該遺伝子治療は、通常のこの種の遺伝子治 療と同様にして、例えば本遺伝子またはそれらの化学的修飾体を直接糖代謝関連 疾患に罹患した哺乳動物（患者）の体内に投与することにより目的遺伝子の発現を制 御する方法、もしくはこれらの遺伝子を患者の標的細胞に導入することにより該細胞 による目的遺伝子の発現を制御する方法により実施できる。 [0161] 特定の実施形態において、本発明は遺伝子治療と併用することができる。遺伝子 治療とは、発現されたか、または発現する能力を有する核酸の、被験体への投与に より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、コードされたタン パク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
[0162] 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用 され得る。例示的な方法は、遺伝子治療の方法の一般的な概説書である、 Goldspie Let al. , ClinicaLPharmacy 12 : 488-505 (1993)； Wu and Wu, Bioth erapy 3 : 87—95 (1991)； Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 3 2 : 573-596 (1993)； Mulligan, Science 260 : 926-932 (1993)；ならび に Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 : 191-217 (1993)； May, TIBTECH 11 (5) : 155-215 (1993)に記載されてレ、る。遺伝子治療に おいて使用される一般的に公知の組換え DNA技術は、 Ausubelら（編）， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY " 993) ; および Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual , Stockton Press, NY (1990)に記載される。
[0163] 本発明の組成物の投与すべき量は、使用目的、対象疾患 (種類、重篤度など）、患 者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が 容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体 (または患者）に対して施 す頻度もまた、使用目的、対象疾患 (種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、 既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻 度としては、例えば、毎日 数ケ月に 1回（例えば、 1週間に 1回 1ヶ月に 1回）の投与 が挙げられる。 1週間- 1ヶ月に 1回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
[0164] 本明細書において「患者」とは、本発明の処置が適用される生物をレ、い、「被検体」 または「被験体」ともいわれる。患者は好ましくは、ヒトであり得る。
[0165] 本発明は、患者への有効量の本発明の組成物の投与による処置、阻害および予 防の方法を提供する。好ましい局面において、本発明の組成物は実質的に精製され たものであり得る（例えば、その効果を制限する力、または望ましくない副作用を生じる 物質が実質的に存在しなレ、状態が挙げられる)。 [0166] 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リボソーム中に封入 された状態で送達され得る（Langer, Science 249 : 1527-1533 (1990)； Treat ら, Liposomes m the fherapy of Infectious Disease and し ancer, Lo pez— Beresteinおよび Fidler (編）， Liss, New York, 353 365頁（1989) ; Lo pez-Berestein,同書 317— 327頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
[0167] さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、制御された徐放系中で送 達され得る。
[0168] 本明細書中、「投与する」とは、本発明の医薬などまたはそれを含む医薬組成物を 、単独で、または他の治療剤と組み合わせて処置が意図される宿主に与えることを意 味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは 並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬 剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、 別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の粘膜を通じての場合)投与される手 順もまた含む。 「組み合わせ」投与は、第 1に与えられ、続いて第 2に与えられる化合 物または薬剤のうちの 1つを別々に投与することをさらに含む。
[0169] 本発明における医薬の投与は、どのような手法を用いて行ってもよいが、好ましくは 、針無し注射を用いることが有利である。患者に過度の負担を与えることなく投与を 行えるからである。
[0170] ここで本発明における針無注射器とは、注射針を用いずに、ガス圧または弾性部 材の弾力によりピストンを移動させて薬液を皮膚に噴射し、薬物成分を皮下、より好 ましくは皮下の細胞内に投与する医療機器を意味する。
[0171] 具体的には例えば、シマジェット™ (島津製作所製）、メディ 'ジヱクタ一 ビジョン（ Medi-Jector Vision)™、 (Elite medical社製）、ペンジェット（PenJet)™(PenJ et社製）などが市販されてレ、る。
[0172] ここで上記化学修飾体としては、例えばホスホロチォエート、ホスホロジチォエート、 アルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート、アルキルホスホアミデートなどの 、細胞内への移行性または細胞内での安定性を高め得る誘導体（"Antisense RNA and DNA" WILEY— LISS干 lj、 1992年、 pp.1-50, J. Med.Chem. 36: 1923-1937, 1993)が 含まれる。これらは常法に従い合成することができる。
[0173] 本遺伝子は、その投与に当たり、通常慣用される安定化剤、緩衝液、溶媒などを用 いて製剤化され得る。
[0174] 本遺伝子を患者の標的細胞に導入する方法において、用いられるポリヌクレオチド は、好ましくは 100塩基以上、より好ましくは 300塩基以上、さらに好ましくは 500塩基 以上の長さを有するものとすればよい。また、この方法は、生体内の細胞に遺伝子を 導入する invivo法およびー且体外に取り出した細胞に遺伝子を導入し、該細胞を体 内に戻す ex vivo法を包含する（日経サイエンス， 1994年 4月号， 20-45頁、月刊薬事 ，36 (1), 23-48 (1994)、実験医学増刊， 12 (15)，全頁（1994)など参照）。この内では in vivo法が好ましぐこれには、ウィルス的導入法 (組換えウィルスを用いる方法)と非ゥ ィルス的導入法がある（上記各文献参照)。
[0175] 上記組換えウィルスを用いる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、 アデノ関連ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ポリオウイルス、シンビス ウィルスなどのウィルスゲノムに本遺伝子のポリヌクレオチドを組込んで生体内に導 入する方法が挙げられる。この中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ゥ ィルスなどを用いる方法が特に好ましい。非ウィルス的導入法としては、リボソーム法 、リポフエクチン法などが挙げられ、特にリボソーム法が好ましい。他の非ウィルス的 導入法としては、例えばマイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポ レーシヨン法なども挙げられる。
[0176] 遺伝子治療用製剤組成物は、本遺伝子またはこれらを含む組換えウィルスおよび これらウィルスが導入された感染細胞などを有効成分とするものである。該組成物の 患者への投与形態、投与経路などは、治療目的とする疾患、症状などに応じて適宜 決定できる。例えば注射剤などの適当な投与形態で、静脈、動脈、皮下、筋肉内な どに投与することができ、また患者の疾患対象部位に直接投与、導入することもでき る。 in vivo法を採用する場合、遺伝子治療用組成物は、本遺伝子を含む注射剤など の投与形態の他に、例えば本遺伝子を含有するウィルスベクターをリボソームまたは 膜融合リボソームに包埋した形態 (センダイウィルス (HVJ) -リボソームなど)とすることが できる。これらのリボソーム製剤形態には、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤な どが含まれる。また、遺伝子治療用組成物は、本遺伝子を含有するベクターを導入さ れたウィルスで感染された細胞培養液の形態とすることもできる。これら各種形態の 製剤中の有効成分の投与量は、治療目的である疾患の程度、患者の年齢、体重な どにより適宜調節することができる。通常、患者成人 1人当たり約 0.0001_100mg、好ま しくは約 0.001-lOmgが数日ないし数力月に 1回投与される量とすればよい。本遺伝子 を含むレトロウイルスベクターの場合は、レトロウイルス力価として、 1日患者体重 lkg 当たり約 lxl03pfU-lxl015piliとなる量範囲から選ぶことができる。本遺伝子を導入した 細胞の場合は、 lxlO4細胞/ body-lxlO15細胞/ body程度を投与すればよい。
[0177] (スクリーニング）
本明細書にぉレ、て「スクリーニング」または「検索」とは、 目的とするある特定の性質 をもつ生物、細胞または物質などの標的を、特定の操作 Z評価方法で多数を含む集 団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗 体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビト 口、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよぐインシリコ（コンピュータを用い た系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性 を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含され ること力 S理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリング による薬物、診断剤、治療薬などが提供されることも企図される。
[0178] 本明細書において「候補化合物」とは、スクリーニングにおいて用いられる場合、そ のスクリーニングが対象とする目的に関して候補となる化合物をいう。そのような化合 物は、どのような因子であってもよい。候補化合物としては、例えば、タンパク質、ポリ ペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチ ド、核酸（例えば、 cDNA、ゲノム DNAのような DNA、 mRNAのような RNAを含む） 、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子 (例えば、ホルモン、リガンド、情 報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリーで合成された分子、医薬品と して利用され得る低分子 (例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子を上 げることができるがそれらに限定されない。候補化合物は、その候補が薬物である場 合、候補薬物とも言う。このような候補化合物の集合をライブラリーとも言う。 [0179] 本明細書にぉレ、て「化合物種」とは、ある化合物の集合にぉレ、て、特定の目的とす る活性を有するなど、所望の性質を有する 1種の化合物についていう。例えば、活性 を調節する化合物の集合において、化合物が特定される場合、そのような化合物は 、化合物種と称され得る。本明細書では、単に化合物とも称される。
[0180] 従って、本明細書において「ライブラリー」とは、スクリーニングをするための化合物 などの一定の集合をいう。ライブラリ一は、同様の性質を有する化合物の集合であつ ても、ランダムな化合物の集合であってもよい。好ましくは、同様の性質を有すると予 測される化合物の集合が使用されるが、それに限定されない。本発明で使用する化 合物ライブラリ一は、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術、醱酵方法、植物およ び細胞抽出手順などが挙げられるがこれらに限定されなレ、、いずれかの手段により、 作製することができる力、または入手することができる。コンビナトリアルライブラリーを 作成する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、 E. R. Felder, Chimia 1 994, 48, 512-541 ; Gallopら、 J. Med. Chem. 1994, 37, 1233—1251 ; R. A . Houghten, Trends Genet. 1993, 9, 235— 239 ; Houghtenら、 Nature 19 91 , 354, 84— 86 ; Lamら、 Nature 1991 , 354, 82— 84 ; Carellら、 Chem. Biol . 1995, 3, 171—183 ; Maddenら、 Perspectives in Drug Discovery and Design2, 269— 282 ; Cwirlaら、 Biochemistry 1990, 87, 6378— 6382 ; Bren nerら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 5381— 5383 ; Gordonら、 J. Med. Chem. 1994, 37, 1385— 1401 ; Leblら、 Biopolymers 1995, 37 177 -198 ;およびそれらで引用された参考文献を参照のこと。これらの参考文献は、その 全体を、本明細書中で参考として援用する。
[0181] 本明細書において「調節」とは、糖代謝について言及するとき、その生物学的活性 が変更されることをいう。
[0182] 本明細書において「阻害」とは、糖代謝について言及するとき、その生物学的活性 が低減または消失することをレ、う。
[0183] 本明細書において「促進」とは、糖代謝について言及するとき、その生物学的活性 が増加または無レ、状態から有る状態が生じることをレ、う。
[0184] 本明細書において「生物学的試験」とは、実際の生体反応を用いてある化合物が ある活性を有するかどうかを判定することをいう。生物学的試験は、 in vitroおよび i n vivoでの試験を包含する。したがって、生物学的試験は、 in silicoとは対立する 概念である。
[0185] 本明細書において「評価」とは、スクリーニングにおいて用いられるとき、ある指標（ 例えば、医薬としての活性）に関して、候補化合物がそのような指標の要件を満たす 力、どうか決定することをいう。そのような評価は、当該分野において公知の方法を用 いて行うことができ、インシリコ（コンピュータを用いる）力 たはウエット（実際の生物学 的アツセィを行う）によって行うことができる。
[0186] 本発明のスクリーニング技術において、スクリーニングのヒットは、遺伝子技術を用 いたアツセィなどによって確認することができる。
[0187] 本明細書にぉレ、て遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現 」とは、その遺伝子（通常は、 DNA形態）などがインビボで一定の作用を受けて、另 IJ の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなど力 S、転写および翻 訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されて mRNAが作製されるこ ともまた発現の一形態であり得る。別の実施形態では、そのようなポリペプチドの形態 は、翻訳後プロセシング (例えば、リーダー配列切除）を受けたものであり得る。
[0188] 本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、生物の特 定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レべ ルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位 (例えば、罹患部位など の特異的部位）にのみ発現してもよぐそれ以外の部位においても発現していてもよ レ、。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。そ のような特異的発現は、抗原提示細胞の特性を利用して実現することができる。従つ て、本発明における医薬のスクリーニングは、特定の指標の特異的発現を確認するこ とによっても行うことができる。
[0189] 本明細書においてある細胞において「のみ」発現するとは、その細胞においてのみ ある遺伝子が発現し、他の種の細胞においては実質的に発現しないことをいう。従つ て、ある細胞においてのみ発現することは、その細胞において特異的に発現すること を包含する。この場合、脂肪細胞において活性であり、かつ他の細胞における非特 異的発現がほとんどない。
[0190] 本明細書にぉレ、て「活性」とは、核酸、タンパク質などの遺伝子または遺伝子産物 について言及されるとき、その遺伝子または遺伝子産物が本来発揮しょうとする機能 についての活性をいう。そのような活性としては、例えば、糖代謝についていえば、脂 肪細胞分化、糖代謝の調節、脂質代謝の調節などを挙げることができるがそれらに 限定されない。
[0191] 本明細書において遺伝子発現 (たとえば、 mRNA発現、ポリペプチド発現）の「検 出」または「定量」は、例えば、 mRNAの測定および免疫学的測定方法を含む適切 な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブ ロット法、ドットプロット法または PCR法などが例示される。免疫学的測定方法としては 、例えば、方法としては、必要に応じてマイクロタイタープレートを用いる、 ELISA法 、 RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などが例示される。ま た、定量方法としては、 ELISA法または RIA法などが例示される。アレイ（例えば、 D NAアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。 DNA アレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新 PCR法」） に広く概説されている。プロテインアレイについては、 Nat Genet. 2002 Dec ; 32 suppl : 526-32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、 RT-PCR, RACE法、 SSCP法、免疫沈降法、 two— hybridシステム、インビトロ翻 訳などが挙げられるがそれらに限定されなレ、。そのようなさらなる分析方法は、例えば 、ゲノム解析実験法 ·中村祐輔ラボ，マニュアル、編集 ·中村祐輔 羊土社 (2002)な どに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される
[0192] 本明細書にぉレ、て「発現量」とは、対象となる細胞などにぉレ、て、ポリペプチドまた は mRNAが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いて
ELISA法、 RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫 学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタン パク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、 PCR法などの 分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリぺ プチドの mRNAレベルでの発現量が挙げられる。 「発現量の変化」とは、上記免疫学 的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価され る本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたは mRNAレベルでの発現量が増加 あるいは減少することを意味する。
[0193] 本明細書においてある核酸分子またはポリペプチドに「特異的に結合する因子」と は、その核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベル力 その核酸 分子またはポリペプチド以外の核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結 合レベルと同じかまたはそれよりも高い因子をいう。そのような因子としては、例えば、 対象が核酸分子の場合、対象となる核酸分子に対して相補的な配列を有する核酸 分子、対象となる核酸配列に対して結合するポリペプチド (例えば、転写因子など)な どが挙げられ、対象がポリペプチドの場合、抗体、単鎖抗体、レセプタ一一リガンドの 対のレ、ずれか一方、酵素一基質のレ、ずれか一方などが挙げられるがそれらに限定さ れない。本明細書において、このような特異的に結合する因子（例えば、ビスファチン に特異的に結合する因子、特定の遺伝子産物に対する抗体など）は、シグナル伝達 を測定する際に利用され得る。
[0194] 本明細書において「因子」（agent)としては、意図する目的を達成することができる 限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー )でもあってもよレ、。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリ ゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例え ば、 cDNA、ゲノム DNAのような DNA、 mRNAのような RNAを含む）、ポリサッカリド 、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子 (例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、 有機低分子、コンビナトリアルケミストリーで合成された分子、医薬品として利用され 得る低分子 (例えば、低分子リガンドなど)など）、これらの複合分子が挙げられるがそ れらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、 そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、 70%以上の配 列同一性)もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転 写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチド に対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指 向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリ ペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター 、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定さ れない。
[0195] 本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を 意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が 挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物 であり得る。
[0196] 本明細書にぉレ、て「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さな ものをいう。通常有機低分子は、分子量が約 1000以下のものをいうが、それ以上の ものであってもよレ、。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるか それらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産 させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有 機低分子、コンビナトリアルケミストリーで合成された分子、医薬品として利用され得る 低分子 (例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されなレ、。
[0197] 本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、化合物を、直接的または間接的の いずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接さ せることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液 などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリぺプ チドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマ イクロアレイ (例えば、遺伝子チップ)などに化合物を置くことが挙げられる。
[0198] 本明細書にぉレ、て「相補的」または「相補体」とレ、う用語は、本明細書では、相補領 域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドと Watson & Crick塩基対を形成す ることのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第 1のポリヌクレオチ ドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第 1のポリヌクレオチドは第 2のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、 Aと T (あるレ、は Aと U )、または Cと Gである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「 相補核酸」および「相補ヌクレオチド配歹 IJ」の同義語として使用する。これらの用語は 、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、 2つのポリ ヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
[0199] (インスリン様活性調節組成物）
別の局面において、本発明は、本タンパク質またはそのフラグメント、あるいは本タ ンパク質をコードする塩基配歹 [ほたはそのフラグメントを有効成分として含有する、ィ ンスリン様活性を調節するための組成物を提供する。ここで、本タンパク質またはそ のフラグメントとしては、本明細書において上記される任意の好ましい形態を採用す ること力 Sできる。本発明はまた、本タンパク質またはそのフラグメントを被験体におい て提供する工程を包含する、インスリン様活性を調節する方法も提供する。
[0200] (使用）
別の局面において、本発明は、本タンパク質またはそのフラグメント、あるいは本タ ンパク質をコードする塩基配歹 [ほたはそのフラグメントの、糖代謝関連疾患の治療剤 または予防剤の製造における、あるいはインスリン様活性を調節するための組成物の 製造における使用、使用を提供する。ここで、本タンパク質またはそのフラグメントとし ては、本明細書において上記される任意の好ましい形態を採用することができる。
[0201] (グルコースクランプ法）
以下に、アツセィ例を挙げて本発明の糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤また はインスリン様活性の調節のための組成物としての有用性を支持する効果について 説明する。一例としてグノレコースクランプ法は末梢組織のインスリンを評価する方法 の 1つである。このグルコースクランプ法は、現在のところ最も正確に評価できるとされ ている。本法では血中インスリン値を一定レベルに保つようにインスリンの持続的注 入下に、血糖値をモニターしながらグルコース液を注入し、血糖値を空腹時血糖に 保持するもので、この際に必要なグルコース注入速度をグノレコース代謝速度としてィ ンスリンの旨標とする。
[0202] 試験の結果は平均値土標準誤差で示すことができる。有意差検定は t -検定で行 レ、、例えば、 p値が 0.05より小さいときに有意であると判断することができる。
[0203] 試験計画例 1： 2型糖尿病患者 20名を 10名ずつ 2群に無作為に割り付ける。試験 群とプラセボ群との間には、年齢、性別、肥満指数、経口血糖降下剤の服用、空腹 時の血糖およびヘモグロビン A のような背景因子には差が認められないように調整 lc
する。また、全ての患者はインスリン投与を受けさせなレ、。これらの患者は、例えば、 試験の少なくとも 2週間前に入院し、 1日当たり少なくとも 200gの炭水化物を含む体 重維持食を摂取させる。
[0204] 試験群の患者には候補化合物を試験量 1日 3回 1週間にわたり連日経口投与する 。プラセボ群の患者には同様のプラセボ錠 1個ずつを 1日 3回 1週間にわたり連日経 口投与する。治療前と最終治療日には、空腹時に患者の血管カテーテルから血液を EDTA1. 2mgとァプロチュン（Trasylor、 Bayer,ドイツ） 400KIUを含む管に採取 する。遠心分離により集めた血漿は分析するまで- 40°Cで保存した。血中のダルコ ース、フルクトサミンおよびヘモグロビン A は、例えば、それぞれグルコースォキシダ lc
ーゼ法、 NBT (Nitro Blue Tetrazoliumchloride)法および HPLC (高速液体ク 口マトグラフィー）法により測定する。血漿中のインスリン量および尿中の Cペプチド量 は、それぞれ市販のキットであるインスリン一 III (ベーリンガ一—マンハイム社製、ドイツ )および Cペプチドキット（第一化学、 日本）を用いて測定した。なお、尿中の Cぺプチ ド量は、 2日間の平均値として計算する。
[0205] 試験群およびプラセボ群ともに全患者について、治療前と最終治療日に、体重 lkg 当たり 0. 2gのグノレコースを静脈内投与し、経時的に血糖およびインスリン分泌を測 定するグルコース負荷試験を実施する。
[0206] また、両群ともに一部の患者 (例えば、 5名）について、治療前と最終治療日に、高 インスリン _ι£^"皿 If (hyperinsulmemic— normog丄 ycemic— ciamp； 以下「グルコースクランプ法」という）試験を実施するとともに、 ELISA (enzyme-link edimmunosorbentassay により赤血球 300 μ 1当 7こりのインスリンレセプターの全 量およびチロシン自己リン酸化量を測定し、インスリンを評価する。 ELISAによるイン スリンレセプターの視 IJ定 fま、 Diabetes, 43， 274—280 (1994) (こ記載の方法 (こ準じ て行う。
[0207] グノレコースクランプ法試験では、肝のグノレコース産生を抑制するために、インスリン を 0. 8mUZkg/分の割合で 4時間注入し、血漿中インスリン濃度は 100 x U/ml ( 600pmol/L)に維持した。血糖値は 95mgZdl (5. 32mmol/L)に保持するよう にグルコース液を注入する。インスリン注入開始後 2— 4時間のグルコース注入速度 を測定し、グルコース代謝速度とする。
[0208] 次に、本発明の化合物が有する作用の一つである「インスリン増強作用」について 説明する。
[0209] すなわち、インスリン増強作用の強さは、 KKAyマウスに薬物を投与した時の血糖 降下率により評価することができる。 KKAyマウスはインスリン抵抗性を示す糖尿病 モデル動物であり（日本臨床 60卷、増刊号 8、 38—44、 (2002) )、インスリン分泌促 進作用に基づく 2型糖尿病治療剤であるスルホニル尿素系血糖降下剤は有効では なレヽこと力 S矢口られてレヽる（MedicalPharmacy, Vol. 24, No. 3， 131—136、 (1990 ) )。 KKAyマウスを用いた経口投与の血糖降下試験においては、 KKAyマウスの血 糖値を約 45%抑制すると正常マウスの血糖値とほぼ同じになることから、血糖降下 率力 S40 50%であることが好ましい。
[0210] KKAyマウスを用いた経口投与の血糖降下試験による血糖降下率の測定は公知 の方法により行うことができるが、好ましい方法を以下に示す。
[0211] 例えば、 11週齢の雄性マウス（KKAy /Ta)の 6匹を 1群として試験に用いる。そし て、コントロールとして処置前の血糖値を測定するため、尾部から採血しておく。採血 後に、ビグアナイド誘導体を適切な濃度で 0. 5% CMC— Na (SodiumCarboxymet hylCellulose)液に溶解し、 10mL/kgの用量で経口投与する。また、対照として溶 媒のみを投与したマウスを準備する。薬物投与の 1時間、 2時間、 4時間、 6時間後に 、血糖値を測定するため尾部から採血する。血糖値はグノレコース CII一テストヮコー（ 和光純薬株式会社製)を用いて測定する。
また、血糖降下率は次式により求める。
[0212] 血糖降下率（％) = [ (対照群の血糖値の AUC—化合物投与群の血糖値の AUC) /対照群の血糖値の AUC] X 100
ここで、血糖値の AUCとは、薬物投与後の血糖値変化を時間に対してプロットした グラフにおいて、グノレコース値 0をベースラインとして薬物投与 6時間後までの面積を 表す。具体的には、 A =薬物投与前の血糖値、 B =薬物投与 1時間後の血糖値、 C =薬物投与 2時間後の血糖値、 D =薬物投与 4時間後の血糖値、 E =薬物投与 6時 間後の血糖値としたとき、血糖値の AUCは以下の式：
血糖値の AUC = 1 X ( (A+B) /2) + l X ( (B + C) /2) + 2 X ( (C + D) /2) + 2 X ( (D + E) /2)
力、ら求めることができる。
[0213] この血糖降下率が約 45%である場合、正常マウスの血糖値とほぼ同じレベルに血 糖値が低下する。
[0214] また、インスリン増強作用の強さは、インスリン抵抗性を示す糖尿病モデル動物であ る db/dbマウス（日本臨床 60卷、増刊号 8、 38-44、（2002) )に薬物を投与した時 の血糖降下率によって評価することもできる。 db/dbマウスを用いた経口投与の糖 負荷試験においては、 db/dbマウスの血糖値を約 50%抑制すると正常マウスの血 糖上昇とほぼ同じになることから、血糖降下率が 40%以上であることが好ましぐさら に 50%以上であることがより好ましレ、。
[0215] db/dbマウスを用いた経口投与の糖負荷試験による血糖降下率の測定は公知の 方法により行うことができる力 好ましい方法を以下に示す。すなわち、先ず、 11ー1 7週齢の雌性マウス（C57BLKS/J_m + / + Leprく db > (db/db) )を 18— 24時 間絶食させる。このとき、 5— 6匹を 1群として試験に用いる。コントロールとして処置前 の血糖値を測定するため、尾部から採血しておく。採血後に、ビグアニド誘導体を適 切な濃度でリン酸バッファー生理食塩液に溶解し、 5ml/kgの用量で皮下投与する 。また、対照として溶媒のみを投与したマウスを準備する。更に、化合物あるいは溶 媒投与の 30分後に、グノレコースを 3g/6ml/kgの用量で経口投与し、経口糖負荷 試験を実施する。グルコース投与の 30分、 1時間、 2時間後に、血糖値を測定するた め、尾部より採血する。血糖値は新ブラッド 'シュガーテスト（ロシュ'ダイァグノステイク ス株式会社製）、またはグノレコース CII一テストヮコー（和光純薬工業株式会社製）を 用いて測定する。
[0216] 血糖降下率は以下の式より求めることができる。
[0217] 血糖降下率（％) = [ (溶媒投与群の血糖上昇値の AUC—化合物投与群の血糖上 昇値の AUC)Z溶媒投与群の血糖上昇値の AUC] X 100
ここで、血糖上昇値の AUCとは、グノレコース投与後の血糖値変化を時間に対して プロットしたグラフにぉレ、て、グルコース投与前の血糖値をベースラインとしてダルコ ース投与 2時間後までの増加部分の面積を表す。具体的には、 A=グルコース投与 前の血糖値、 B =グルコース投与 30分後の血糖値、 C =グルコース投与 1時間後の 血糖値、 D =グルコース投与 2時間後の血糖値としたとき、血糖上昇値の AUCは、 以下の式：
血糖上昇値の AUC = 0. 5 X ( (A + B) /2-A) +0. 5 X ( (B + C) /2-A) + 1 X (
(C + D) /2-A)
力、ら求めることができる。
[0218] なお、経口糖負荷試験による血糖降下率および血中乳酸値の測定は公知の方法 により行うことができ、前者の測定は前述の方法により行うことができる。また、後者の 測定は以下の方法により好適に行うことができる。すなわち、まず、 11一 17週齢の雌 性マウス（C57BLKSZJ— m+Z + Leprく db > (dbZdb) )を 18— 24時間絶食さ せる。このとき、 5— 6匹を 1群として試験に用いる。コントロールとして処置前の血中 乳酸値を測定するため、尾部から採血しておく。採血後に、ビグアニド誘導体を適切 な濃度でリン酸バッファー生理食塩液に溶解し、 5ml/kgの用量で皮下投与する。 また、対照として溶媒のみを投与したマウスを準備する。更に、化合物あるいは溶媒 投与の 30分後に、グノレコースを 3g/6ml/kgの用量で経口投与し、経口糖負荷試 験を実施する。グルコース投与の 30分、 1時間、 2時間後に、血中乳酸値を測定する ため、尾部より採血する。血中乳酸値は、「ァス力'シグマ」（シグマ ·ダイァグノステイク ス株式会社製)を用いて測定することができる。
[0219] そして、血中乳酸値上昇率は、以下の式：
血中乳酸値上昇率（％) = [ (化合物投与群の血中乳酸値の AUC -溶媒投与群の 血中乳酸値の AUC) Z溶媒投与群の血中乳酸値の AUC] X 100
力 求められる。
[0220] ここで、血中乳酸値の AUCとは、グノレコース投与後の血中乳酸値変化を時間に対 してプロットしたグラフにおいて、グルコース投与 2時間後までの面積を表す。具体的 には、 £ =グノレコース投与前の血中乳酸値、 F =グルコース投与 30分後の血中乳酸 値、 G =グルコース投与 1時間後の血中乳酸値、 H =グルコース投与 2時間後の血 中乳酸値としたとき、血中乳酸値の AUCは、以下の式：
血中乳酸値の AUC = 0. 5 X (E + F) /2 + 0. 5 X (F + G) /2 + 1 X (G + H) /2 カゝら求めることができる。
(形質転換体）
別の局面では、本発明は、本タンパク質をコードする塩基配列またはその改変体が 導入された、形質転換体 (例えば、生物、臓器、組織または細胞）を提供する。このよ うな形質転換体は、動物であれば、トランスジェニック動物とも称される。このような形 質転換体は、インスリン様活性を調節する因子、糖代謝関連疾患の治療剤または予 防剤の探索において有用であり得る。トランスジヱニック動物の作製については、当 該分野で種々の方法が知られている。例えば、トランスジヱニックマウスの作製の場 合、ー般的な作製技術は、国際公開 〇01/13150
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Inst. Cancer Re s. )に記載されている。米国特許第 4， 873, 191号 (Wagnerら）は、哺乳動物接合 体への DNAのマイクロインジェクションによって得られた、外因性 DNAを有する哺乳 動物を教示している。この他では、トランスジヱニック動物を作り出すための様々な方 法として、例えば、 M. Markkulaら， Rev. Reprod. , 1 , 97—106 (1996)； R. T. Wallら， J. Dairy Sci. , 80, 2213—2224 (1997)； J. C. Daltonら， Adv. Exp. Med. Biol. , 411 , 419—428 (1997)；ぉよび H. Lubonら， Transfus. Med. Re v. , 10, 131-143 (1996)に記載される方法などが挙げられるがそれらに限定され なレ、。さらに近年、胚性幹 (ES)細胞の相同組換えを介したトランスジヱニック（ノック アウト、ノックインを含む）動物の作製が可能となってきている。高等生物では、例えば 、ネオマイシン耐性遺伝子を用いる陽性選択および HSVのチミジンキナーゼ遺伝子 またはジフテリア毒素遺伝子を用いる陰性選択により組換え体の効率的な選別が行 われる。 PCRまたはサザンブロット法によっても相同組換え体の選択が行われる。す なわち、標的遺伝子の一部を陽性選択用のネオマイシン耐性遺伝子等で置換し、そ の末端に陰性選択用の HSVTK遺伝子等を連結したターグティングベクターを作成 し、エレクト口ポレーシヨンにより ES細胞に導入し、 G418およびガンシクロビルの存 在下で選択して、生じたコロニーを単離し、さらに PCRまたはサザンブロットにより相 同組換え体を選択する。 [0222] このようにして内在する標的遺伝子を置換または破壊して、機能が喪失した力また は変更された変異を有するトランスジエニック (標的遺伝子組換え）マウスを作製する 方法は、標的とした遺伝子だけに変異が導入されるので、その遺伝子機能の解析に 有用である。
[0223] 所望の相同組換え体を選択した後、得られた組換え ES細胞を胚盤注入法または 集合キメラ法により正常な胚と混合して ES細胞と宿主胚とのキメラマウスを作製する。 胚盤注入法では、 ES細胞を胚盤胞にガラスピペットで注入する。集合キメラ法では、 ES細胞の塊と透明帯を除去した 8細胞期の胚とを接着させる。 ES細胞を導入した胚 盤胞を偽妊娠させた代理母の子宮に移植してキメラマウスを得る。 ES細胞は、全能 性を有するので、生体内では、生殖細胞を含め、あらゆる種類の細胞に分化すること ができる。 ES細胞由来の生殖細胞を有するキメラマウスと正常マウスを交配させると ES細胞の染色体をへテロに有するマウスが得られ、このマウス同士を交配すると ES 細胞の改変染色体をホモに有するトランスジエニックマウスが得られる。得られたキメ ラマウスから改変染色体をホモに有するトランスジヱニックマウスを得るには、雄性キメ ラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、 F1世代のへテロ接合体マウスを産出させ 、生まれた雄性および雌性のへテロ接合体マウスを交配して、 F2世代のホモ接合体 マウスを選択する。 F1および F2の各世代において所望の遺伝子変異が導入されて いるか否かは、組換え ES細胞のアツセィと同様に、サザンブロッテイング、 PCR、塩 基配列の解読など当該分野において慣用される方法を用いて分析され得る。
[0224] さらに近年、多様な遺伝子機能を選択的に解析する目的で、上記のような Cre— lo xPの部位特異的組み換えを併用する技術が注目されている。 Cre— ΙοχΡを用いるト ランスジヱニックマウスは、標的遺伝子の発現を阻害しない位置にネオマイシン耐性 遺伝子を導入し、ェキソンをはさむようにして ΙοχΡ配列を揷入したターグティングベタ ターを ES細胞に導入し、その後相同組換え体を単離する。この単離したクローンか らキメラマウスを得、遺伝子改変マウスが作製される。次に、大腸菌の P1ファージ由 来の部位特異的組換え酵素 Creを組織特異的に発現するトランスジェニックマウスと このマウスを交配させると、 Creを発現する組織中でのみ遺伝子が破壊される（ここで は、 Creは、 ΙοχΡ配列（34bp)を特異的に認識して、 2つの ΙοχΡ配列にはさまれた配 列で組換えを起こさせ、これが破壊される）。組織特異的なプロモーターに連結した
Cre遺伝子を有するトランスジヱニックマウスと交配させる力、または Cre遺伝子を有 するウィルスベクターを使用して、成体で Creを発現させることができる。上記のように 、本発明のプロモーターは、脂肪細胞特異的に遺伝子を高発現するので、本発明の プロモーターを用いれば、 Creを脂肪細胞特異的に発現させることが可能となる。従 つて、他の組織に影響を与えることなぐ脂肪細胞においてのみ標的遺伝子を破壊 または変異することが可能となる。これによつて、近年その重要性がますます注目さ れている脂肪細胞の機能解析に大きく寄与するものと考えられる。他の生物であって も、同様のメカニズムを用いてトランスジエニック生物を作製することができる。
[0225] 本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、そ の全体力 S、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援 用される。
[0226] 以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以 下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は 、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従つ て、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限 定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
実施例
[0227] 以下に本発明を実施例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[0228] (実施例 1：ビスファチンの同定および機能解析）
本実施例では、ヒトの腹腔内臓脂肪において優先的に生産される新たな脂肪サイト 力インを鋭意探索し、代謝性疾患において蓄積することを見出した。ディフエレンシャ ルディスプレイによって、 8800のポリメラーゼ連鎖反応（PCR)産物を、 2人のボランテ ィァ女性から得た皮下脂肪と内臓脂肪とを比較しながら探索した。合計 31本のバンド が内臓脂肪において排他的に検出された（図 la)。ノーザンプロットのプローブとして 使用したところ、これら cDNAのうち 1本が皮下脂肪に比較して内臓脂肪において豊 富に発現されていた（図 lb)。この cDNAフラグメントの解析を行ったところ、 5 '非翻 訳領域に対応する cDNAフラグメントが B細胞前駆体コロニー促進因子（PBEF ; GenBank番号 U02020 ; B. Samal et al" Mol. Cell. Biol. 14, 1431 (1994))をコードす る遺伝子の非翻訳領域であることが明らかになった。 PBEFは、初期段階での B細胞 の成長因子であり、骨髄から主に分泌されるタンパク質であることが知られていた。最 近になって、 Marshallet al. (S. H. Jia et al., J. Clin. Invest. 113， 1318(2004))は、敗 血症（臨床および実験レベル)で好中球アポトーシスを阻害することを報告した。ヒト ビスファチンに対するゥサギポリクローナル抗体は、培地および PBEF遺伝子をトラン スフヱタトした COS—1細胞の溶解物中に 52kDタンパク質を検出した。この抗体は、 ヒトおよびマウスの血漿において同様のサイズのタンパク質を検出した（図 lc)。 3T3 一 L1脂肪細胞のインビト口での分化の間、 PBEF mRNA発現は、腱著に増加して いた（図 ld、上）。このとき、 PBEFタンパク質（ビスファチン）が培地中に分泌されて いた（図 ld、下）。
ビスファチンの血清レベルと脂肪過多との関係を調べるために、本発明者らは、ヒト およびマウスの両方において実験を行った。 101人のヒト被験体（男女含む）におい て、 CTによって見積もったところ、内臓脂肪の量と血漿ビスファチン濃度との相関が 強く示唆された（図 le、 r=0.68; pく 0.001)。しかし、皮下脂肪では、ほとんど相関が無 力つた（図 le、 r=0.22;pく 0.05)。本発明者らは、 KKAyマウス（日本クレア）での分析 も行った。 KKAyマウスは、肥満性 II型糖尿病のモデル動物である。 KKAyは、 6週 一 12週齢で迅速に肥満になる（図 If)。本研究者らは、ビスファチン血漿レベル（図 1 g)および内臓脂肪ビスファチン mRNAレベル（図 lh)が顕著にこの間に増加するこ とを見出した（図 lg)。皮下脂肪および肝臓におけるビスファチン mRNAレベルは、 ほとんど変化しなかった。最後に、本発明者らは、血漿ビスファチンレベルを正常な 食餌を与えた力、または高脂肪もしくは高スクロース食餌を与えた C57BL/6Jマウス（日 本クレア）において測定した。高脂肪食を与えたマウスは、正常食餌を与えたマウスよ り高いビスファチン血漿濃度を示した（9.94± 1.70pM対 6.86± 1.35pM，平均 ± SD， p く 0.05)。これと同時に、内臓腸間膜脂肪におけるビスファチン mRNAレベルにおけ る顕著な増加が見られた。これらの結果は、ビスファチンが内臓脂肪において豊富に 生産される分泌因子であることを示す。ビスファチン (visfatin)の由来のこの性質に 由来する。 [0230] (実施例 2 :本遺伝子の単離:配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 をコードする遺伝子の単離）
この実施例では、以下の実験に使用するためのビスファチンを単離するために、ヒト 腹腔内脂肪組織からグァニジンチオシァネート/セシウムクロライド法（Chirgwin, J. Μ· et al.， Biochemistry, 18， 5294, 1979)により調製された全 RNA1. O z gを錡型に して、これと cDNA合成キット（宝酒造社製）に添付のオリゴ dTプライマーとを混合し た後、 ImM dNTPの存在下で MMTV逆転写酵素（宝酒造製） 50ユニットを添加 し、室温で 10分間、次いで 42°C、 15分間、さらに 99°C、 5分間保温することによって 、 1本鎖 cDNAを合成した。
[0231] 続いて当該 1本鎖 CDNA2. Ο μ gを铸型に用いて、配列番号 3で示される塩基配 歹 IJからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号 4で示される塩基配列からなるオリゴヌ クレオチドの各 20pmolをプライマーとして、 200 μ Μ dNTP, 1. 5mM MgCl存 在下で DNAポリメラーゼ（パーキンエルマ一製） 1ユニットを添加し、 94°C、 1分間、さ らに 72°C、 2分間の保温を 1サイクルとしてこれを 55サイクル行う条件下で PCR反応 を行った。得られた PCR反応産物を 1 %ァガロースゲル電気泳動に供し (泳動バッフ ァー；トリスー硼酸緩衝液（ナカライテスタ製））、約 1 · 5kbpの DNAバンドをゲルから 切り出し、 Sambrook, J.、 Fntsch, E. F.、 Mamatis, T.著：「Molecular Cloning
SecondEditionJ、 Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989年)に己載される方法 により、プラスミドベクター pUC1 18 (宝酒造製）の Hindiサイトにクローニングした。 クローニングされた DNAの塩基配列を、 TaqDye Primer Cycle Sequencing Kitおよび Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (,プフィドノくィォシスアムズ製)を 用いてアプライドバイオシステムズ製の 373A型の DNAシークェンサ一により決定し た。当該 DNAは配列番号 1で示される塩基配列からなり、当該塩基配列は、配列番 号 2で示されるアミノ酸配列をコードしていた。
[0232] このようにして配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺 伝子を単離した。
[0233] (実施例 3：配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現プラスミド の調製） 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における第 1番目のアミノ酸から第 491番目まで のアミノ酸で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を産生させるための発現プラス ミドは、実施例 2において増幅 ·単離された DNAを、通常の遺伝子工学的方法によ つて公知の発現ベクター（pcDL- SRひ 296 : Takebe,Y.， Seiki, M.， Fujisawa, J., Hoy, P., Yokota, K" Arai, K.， Yoshida, M.， and Arai'N" Mol. Cell Biol. Jan. 1988， P466-472)に組み込みことにより調製した。このようにして調製した発現プラスミドで、 フュージーン試薬（ベーリンガー製）を用いて、試薬に添付のプロトコールに記載の 方法と同様な方法によりサル由来の COS1細胞 (ATCC製）を形質転換した。
[0234] (実施例 4：タンパク質の調製：配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク 質標品の調製）
配列番号 2で示されるアミノ酸配列における第 1番目のアミノ酸から第 491番目まで のアミノ酸で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、実施例 3で形質転換された サル由来の COS1細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシン（GIBCO製）をそれぞれ終 濃度 100ユニット/ mlおよび 100 μ g/mlとなるように添加した ΟΡΤΙ-ΜΕΜ培地（GI BCO製）中で培養することにより培地中に当該タンパク質を分泌させ、形質転換後 2 日目から 8日目までの細胞培養上清を集めた。培養上清を限外ろ過膜にてろ過し、 順次 DEAEs印 harose、 ANX-Sepharose, Octyl-Sepharose, Mono_Qカラム (すべてァ マシャムフアルマシア製）に供して精製した。最終的に得られた本タンパク質標品は、 銀染色的に単一のバンドであった。
[0235] (実施例 5 :本タンパク質の筋肉細胞における糖取り込みに関する試験）
(1)筋肉細胞の培養
起眠したラット L6細胞を、 FBS (GIBC〇製）、ペニシリン、ストレプトマイシン（GIBC O製）をそれぞれ終濃度 10%、 100ユニット/ mlおよび 100 μ g/mlとなるように添 加したダルベッコ改変イーグル培地（4. 5g/LD_グルコースおよび 584mgZL L_ グノレタミン含有。 GIBCO製）（以下、 FBS含有培地と記す。） 30mlに懸濁し、当該懸 濁液を細胞培養用フラスコ（接着細胞用 T150。岩城硝子製）に注入し、 37°C、 5% CO存在下で終夜培養した。細胞を 15mLのリン酸緩衝液（0. 20g/L KC1、 0. 2
2
0g/L KH P〇、 8. OOg/L NaCl、 2. 16g/L Na HPO · 7Η〇、以下 PBSと 記す）で洗浄した後、当該フラスコにトリプシン一エチレンジァミン四酢酸四ナトリウム（ 以下、 EDTA'4Naと記す。）溶液（0· 05%トリプシン、 0. 53mM EDTA'4Naを含 む。
GIBCO製） 1一 2mlを細胞が浸るように添加し、 37°Cで 5分放置した。これに、 FBS 含有培地をトリプシン - EDTA'4Na溶液の約 10倍量添カ卩し、細胞懸濁液を得た。 当該細胞濁液を 12ゥエルプレートに lxlO5細胞 Zゥエルの濃度で捲き込み、 37°C、 5% CO存在下で培養した。 2日後に、 2%の FBSを含む FBS含有培地に置換し、さ
2
らに 5日間培養した。
(2)糖取込み活性の測定
(1)で得られた供試細胞を含むゥエルをリン酸緩衝液で洗浄し、 FBS含有培地か ら FBSのみを除いた培地（以下、無血清培地と記す。）に置換して、 18時間培養した 。ゥエルを KRB緩衝液（25mM Hepes (pH7. 4)、 120mM NaCl、 5mM KC1、 1. 2mM MgSO、 1. 3mM CaCl
4 2、 1. 2mM K HPO
2 4、 23. 8mM炭酸水素ナ トリウム、 0. ImM ピノレビ'ン酸ナトリウム、 0· 1% BSA、0. 22 μ mのフイノレターでろ 過）で洗浄し、 500 /i Lの KRB緩衝液を加えて 37°Cで 30分間インキュベートした。ゥ エル内の緩衝液を除去し、 500 μ Lの KRB緩衝液に 0— 30nMとなるように実施例 3 で得られた本タンパク質の標品を添加し、さらに 37°Cで 30分間インキュベートした。 さらに、 KRB緩衝液で 0· 01 μ Ci/ μ Lに希釈した 2—デォキシー D_[l—3 Η]ダルコ ース（アマシャム製）を 10 i L添加し、 37°Cで 10分間インキュベートした。ゥエル内の 液を除去し、予め氷冷しておいたリン酸緩衝液 lmLを添加し、ゥエルを洗浄した。さ らに 1回リン酸緩衝液でゥエル内を洗浄した後、 IN NaOH を 300 μ L添カロし、よく 攪拌した。ゥエルから 250 z Lの液を回収し、予め液体シンチレ一ター（パッカード社 製） 4mlを注入したバイアルびんに添加し、液体シンチレーシヨンカウンター（パッカ ード社製)で総放射能量を測定した (以下、測定値 1と記す。）。実施例 5 (1)で得られ た供試細胞を含むゥエルに本タンパク質標品の代わりにリン酸緩衝液を添加する以 外は同様の操作を行い、総放射能量を測定した (以下、測定値 2と記す。）これらの 測定値から、下記の式に従って、本タンパク質の糖取込み促進率を算出した。
糖取込み促進率（％) = (測定値 1/測定値 2) X 100 3nM、 ΙΟηΜおよび 30nMの本タンパク質標品による糖取込み促進率は、それぞ れ 116 %、 139 %および 145 %であった。
[0237] また、本タンパク質標品の代わりに 3ηΜ、 ΙΟηΜおよび 30nMのインスリンを添加 すること以外は上記に記載される方法と同様な方法に準じてインスリンによる糖取込 み促進率を算出した結果それぞれ、 100%、 138%および 150%であった。
[0238] (実施例 6 :本タンパク質の筋肉細胞におけるインスリンシグナル活性化率の測定） 実施例 5 (1)にて起眠した L6細胞を 90cmのディッシュにまきこんで、 FBS含有培 地でコンフルェントになるまで培養した。培地を除去した後、リン酸緩衝液で洗浄し、 無血清培地で 20時間培養した後、再び培地を除去した。 100ng/mLの実施例 3で 得られた本タンパク質標品を含む無血清培地で 37°C、 10分間インキュベートした。 培地を除去して反応を停止させ、予め氷冷したリン酸緩衝液で 2回細胞を洗浄した。 液体窒素で細胞を凍結した後、 ImLの細胞破砕用緩衝液（20mM Tris— HCl (pH 7. 4)、 2mM CaCl、 ImM MgCl、 140mM NaCl、 1 % NP-40, 2 μ g/m
2 2
Lァプロチニン、 10 /i g/mL ロイぺプチン、 ImM PMSFおよび 2mM Na VO
3 4
)をカ卩えることで細胞を破砕した後、 4°C、 15, OOOgで 30分遠心し、細胞破砕上清を 得た。抗 IRS—1抗体 # 06—248 (Upstate Biotechnology製） 5 μ gを予め Protei nG-sepharose (アマシャムフアルマシア製）ビーズ 20 β Lに結合しておき、得られた 細胞破砕上清 ImLと混合し、 4°Cで終夜インキュベートした。翌日、ビーズを数回細 胞破砕用緩衝液で洗浄し、 SDS—P AGE用サンプルバッファー（60mM Tris-HC 1 (ρΗ6. 7)、 3%SDS、 2% メルカプトエタノール、 5% グリセロール）を添加して 10 0°C、 5分間過熱してビーズに結合したタンパク質を溶出した。溶出タンパク質を SDS —PAGE (第一化学製）にて分離後、抗リン酸化チロシン抗体 RC20 (BDBioscienc e製）あるいは抗 PI3キナーゼ p85抗体 # 06—195 (Upstate Biotechnology製）を 用いてィムノブロットを実施し、 ECL検出キット（アマシャム製）を用いて、それぞれリ ン酸化 IRS—1およびリン酸化 PI3キナーゼタンパク質を検出'定量した。
[0239] また、細胞破砕上清 10 μ Lを直接 SDS—PAGE (第一化学製）にて分離し、抗リン 酸化 Akt抗体 # 9271 (Cell Signaling製）を用いてィムノブロットを実施し、 ECL検 出キット（アマシャム製）を用いてリン酸化された Aktタンパク質を検出'定量した。 [0240] その結果、本タンパク質標品を添加した場合、無添加の陰性対照と比較して、 IRS 1、 PI3キナーゼ、 Akt分子のリン酸化が促進されていた（図 2)。陽性対照として、 本タンパク質の代わりにインスリン 100ng/mLを添加した場合の各リン酸化タンパク 質シグナルも表されてレ、る。
[0241] (実施例 7 :本タンパク質の肝細胞における糖新生抑制に関する試験）
( 1 )供試細胞の調製
Η4ΠΕ細胞 (第日本製薬より購入)を、 FBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、 cAMP (シグマ製）、デキサメサゾン (シグマ製）をそれぞれ終濃度 10。/。、 100ユニット/ ml、 100 μ g/ml、 50 μ Μおよび Ι ΟΟηΜとなるように添加したダルベッコ改変イーグル 培地（4. 5g/Lグルコースおよび 584mgZLL—グルタミン含有。 GIBCO製）（以下 、肝細胞用培地)で培養した。実施例 5に記載の方法にて細胞を培養器から回収し、 12ゥエルプレートに 3xl 05細胞 Zゥエルの濃度で捲き込み、 37。C、 5% CO存在下 で培養した。さらに細胞がコンフルェントになるまで培養を続けた。細胞をリン酸緩衝 液で洗浄し、 5mMグノレコースを含む肝細胞用培地に置換して、 24時間培養した。
[0242] 細胞をリン酸緩衝液で 2回洗浄し、実施例 4で得られた本タンパク質標品 0— InM を含む糖新生緩衝液 lmL (8. 3g/L DMEM base、 4mM L グルタミン、 ImM ピルビン酸ナトリウム、 3 · 7g/L 炭酸水素ナトリウム、 0· 9g/L 乳酸、 100ユニット /mLペニシリン、および 100 μ g/mh ストレプトマイシン、 0 · 22 μ mのフィルター でろ過）に交換して、さらに終夜細胞を培養し、翌日、細胞上清を回収した。 F-キット グルコース IKンターナショナル社）を用いて、プロトコールに従って回収した培養上 清中に含まれる糖 (グルコース)濃度を測定した。
[0243] 陽性対照であるインシュリンによる糖新生促進試験については、実施例 4で得られ た本タンパク質標品の代わりに 0 InMのインシュリンを添カ卩する以外は同様の操作 を行い、測定を行った。
[0244] その結果、本タンパク質標品を添加しない場合の培地中の糖濃度、すなわち糖新 生量である 4. 01 fmolZ細胞 Z時間を 100%とした時の、本タンパク質標品の各 濃度による糖新生量は、 0. 01nM、 0. InMおよび InMにおいて、それぞれ、 98% 、 32%および 3%であり、本タンパク質が濃度依存的に肝細胞の糖新生を抑制する ことが確認できた。一方、 0· 01nM、 0. InMおよび InMのインスリンにおいては、そ れぞれ、 82%、 20%および 4%であった。
[0245] (実施例 8 :本タンパク質の肝細胞におけるインスリン作用促進率の測定）
Η4ΠΕ細胞（大日本製薬製）を、実施例 7と同様に肝細胞用培地で培養し、 90mm のシャーレにまきこみ、細胞がコンフルェントになるまで培養した。培地を除去した後 、リン酸緩衝液で洗浄し、 FBSを含まない肝細胞用培地（以下、無血清肝細胞用培 地）で 20時間培養した後、再び培地を除去した。さらに、 lOOngZmLの本タンパク 質標品を含む無血清肝細胞用培地で 37°C、 10分間インキュベートした。培地を除 去して反応を停止させ、予め氷冷したリン酸緩衝液で 2回細胞を洗浄した。以降の操 作は、実施例 6に記載の方法で行い、リン酸化された各分子を検出'定量した。
[0246] その結果、実施例 4で得られた本タンパク質標品を添加した場合、無添加の陰性対 照と比較して、 IRS— 1、 PI3キナーゼ、 Akt分子のリン酸化が促進されていた（図 3)。 陽性対照として、本タンパク質の代わりにインスリン 100ng/mLを添加した場合の各 リン酸化タンパク質シグナルも表されてレ、る。
[0247] (実施例 9：本タンパク質の生体における糖代謝制御に関する試験 1)
10週齢の雄性 KKAyマウス（日本クレア）の麻酔下に、尾静脈からリン酸緩衝液 ( 陰性対照）あるいは 487pmolの本タンパク質標品あるいは 487pmolのインスリンを投 与した。投与前および投与 15分、 30分、 45分、 60分および 120分後に当該マウス の眼窩より採血した。採取した血液中の糖濃度は、 F—キットグルコース CJKンターナ ショナル社）を用いて、プロトコールに従って測定した。表 1に KKAyマウスの血糖値 (各群 n=4の平均値）を示した。
[0248] 上記の結果、表 1および図 4に示すように、本タンパク質は、陽性対照として用いた インスリンと同等の血糖降下作用を示した。
[0249] [表 1]
分 分 分 分 。分 分 リ ン酸緩衝液 平均値
標準偏差
イ ンス リ ン 平均値
標準偏差
本蛋白質 平均値
標準偏差 [0250] 種々の機能解析によりビスファチンがグルコース低下効果を有することが明らかに なったので本実施例においてさらに、 C57BL/6J (日本クレア）に、組み換えビスファチ ンを静脈注射したところ、 30分以内に血漿グルコースレベルが顕著に統計学的に有 意なレベルで減少した（図 6a)。この効果は、用量依存的であり、血漿インスリンレべ ルにおける変化には起因していな力、つた（図 6b)。本発明者らは、次に、インスリン抵 抗性の KKAyマウス（日本クレア）にビスファチンを投与した。ビスファチンは、インス リン投与と同程度の血漿グノレコース（図 6c)。ストレブトゾトシン (STZ)処理したインス リン欠損マウスでも同様の結果が得られた（図 6d)。
[0251] (実施例 10 :本タンパク質の生体における糖代謝制御に関する試験 2)
(1) 組換えアデノウイルス作製
実施例 1におレ、て増幅 ·単離された DNA、すなわち本タンパク質をコードする遺伝 子を有する組換えウィルス粒子は、アデノウイルス発現ベクターキット（宝酒造製）を 用いて、キットに記載の方法に従って作製した。実施例 1において増幅 ·単離された DNAを有さないネガティブコントロールとしては、キットに添付されている —ガラタト シダーゼ遺伝子含有ウィルス粒子を用いた。 HEK293細胞（American Type Culture Collection製）にウィルス粒子を感染させて 3回増幅し、 100, 000gx90分の CsCl密度勾配超遠心により得られるウィルス液の層をシリンジで抜き取った。得られ た部分精製ウィルス液を 10mM Tris_HCl、 ImM EDTA (pH8. 0)で希釈し、 C sCl密度勾配超遠心（100, 000gxl6時間）を行って、再びウィルス液の層を回収し た。得られた精製ウィルス液を 10mM Tris-HCl (pH8. 0)、 2mM MgC12、 5% グノレコースに対して透析し、 -80°Cで凍結保存した。
(2) アデノウイルス投与による本タンパク質の生体内糖代謝制御試験
8週齢の雄性 C57BL/6Jマウスおよび 10週齢の雄性 KKAyマウス（日本クレア） に、（1)で作製したウィルスをマウス 1匹当たり 1. OxlO8ユニット接種した後、飼育を 続け、接種 4日後のマウスより採血した。血中の糖濃度は、 F—キットグルコース CFKン ターナショナル社）を用いて、プロトコールに従って測定した。試験は、各群 5匹で行 つた。
[0252] その結果、表 2および図 5に示したように、本遺伝子を有するウィルスを感染させた 場合、 C57BL/6Jマウスにおいては有意な血糖値降下が起こらなかったのに対して 、遺伝的に糖尿病を発症し、高血糖である KKAyマウスの血糖値を降下させる作用 が認められた（Pく 0· 007)。
[表 2]
Figure imgf000094_0001
[0254] さらにビスファチン投与の慢性効果を詳細に調べるために、本研究者らは、
C57BL/6Jマウスおよび KKAyマウスを、ビスファチン遺伝子または LacZ遺伝子をコー ドする配列を含むアデノウイルスベクター（adeno) (図 6eまたは 6f)に感染させた。血 漿ビスファチンレベルは、アデノウイルス感染によってほとんど 2倍に上昇した。アデノ ウィルスによるビスファチンの慢性的な産生によって、両方のマウス系統における血 漿インスリンレベルおよび血漿グルコースレベルが顕著に抑制された（図 6eまたは 6f ) 0
[0255] (実施例 11：ノックアウトマウスでの調査）
ビスファチンの生理学的機能を探索するために、本研究者らは、ビスファチン欠損 マウスを作製した。 （一/一)ホモマウスは、胚性期に死んだので、本発明者らは、へテ 口接合性のマウス（+ /—)を使用して調べた。これらのマウスは生存しており、血漿ビ スファチンレベルは、野生型（WT)のほぼ 3分の 2であった（WT; 7.2±0.5 pM対 (+/-)； 4.8 ± 0.3pM)。成長速度、食餌摂取、総体重、ならびに精巣上体脂肪、褐色脂 肪、肝臓、腓腹筋、および心臓の組織重量は、野生型と（+ /—)マウスとで相違は無 かった。血漿インスリンレベルは、これらのマウスの間で顕著には異ならなかった（ WT;0.9 ± 0.2 ng/ml対 (+/_); 1.0±0.3 pM)0し力、し、血漿グルコースレベルは、飢餓 状態および摂食状態の両方の条件下で、（+ /—)マウスにおいて野生型よりも高か つた。この効果は、緩和なものであり、統計学的に有意ではなかった（図 6g)。ダルコ ース寛容試験を行ったところ、 （ + /_)マウスの血漿グルコースレベルは、ダルコ一 ス過負荷の 60分後および 120分後において野生型よりも緩和に高かった（図 6h)。 インスリン寛容試験の感受性を、 （+ /—)および野生型マウスにおいて調べた。これ らの分析結果は、インスリンと同様に、ビスファチンもまた、血漿グルコースレベルに ぉレ、て役割を果たしてレ、ることを示す。
[0256] (実施例 12 :培養細胞でのさらなる解析）
ビスファチンのインスリン様効果をより詳細に調查するために、本研究者らは、培養 細胞を種々使用して実験を行った。ビスファチン処理によって、 3T3— L1脂肪細胞（ 図 7a)、 L6筋肉細胞（図 7b)におけるグルコース取り込みが増加した。また、 H4IIEC 3肝臓細胞ではグルコース放出が抑制された（図 7c)。これらの効果は、インスリンで も同様であった（図 7a)。本発明者らは、ビスファチンの脂肪細胞分化における効果 も調べた。対照の ICR (Institute for Cancer Research)マウスの初代培養細胞の脂肪 細胞前駆体（内臓腸間膜脂肪；図 7d、左および皮下脂肪；図 7d右)を、リン酸緩衝化 生理食塩水（PBS)、ビスファチンまたはインスリンで処理した。インスリンと同様に、ビ スファチンでも、両方の細胞からの脂肪細胞前駆体においてトリグリセリドの蓄積が誘 導され、グノレコースからトリグリセリド合成が加速された（図 7e)。ビスファチン処置はま た、ペルォキシソーム増殖因子活性化レセプター（PPAR)、 CCAATェンハンサー結 合タンパク質（C/EBP)_ ct、脂肪酸合成（FAS)、ジァシルグリセロール〇一アシノレ トランスフェラーゼ（DGAT) -1、脂肪 P2 (aP2)およびアディポネクチンのような脂肪 マーカーをコードする遺伝子の発現も誘導した（図 7f)。同様の脂肪生成誘導効果が 、ビスファチンについて、 3T3—L1細胞および 3T3—F442細胞について見られた。
[0257] (実施例 13：インスリンシグナル伝達経路におけるビスファチンの役割のさらなる解 析）
実施例 6においてビスファチンがインスリンシグナル伝達経路において役割を果た すことが示唆されたことから、本発明者らは、次に、ビスファチンがインスリンシグナル 伝達に効果を有するかどうかを調べた。ビスファチンのマウス静脈注射を行ったところ 、肝臓におけるインスリンレセプター（IR)、インスリンレセプター基質（IRS)_1および IRS—2のチロシンリン酸化力 インスリン注射と同程度に誘導された（図 8a)。培養し た 3T3—F442脂肪細胞のビスファチン処理は、 IR、 IRS—1および IRS—2のリン酸化 、ホスファチジルイノシトーノレ _3_キナーゼ（PI3K)の IRS—1および IRS—2への結合 、ならびに Aktおよび MAPキナーゼのリン酸化を誘導した。これもまた、インスリンの 効果に類似した（図 8b)。インスリンシグナル伝達経路の同様の活性化が L6筋肉細 胞（図 8c) , H4IIEC3肝細胞（図 8d)において観察された。ビスファチンはまた、 IRS 一 1関連 PI3K活性を、精巣上体脂肪由来初代脂肪細胞において増強させた。ビスフ ァチンおよびインスリンの効果は、このアツセィでは、相加的であった（図 8e)。ビスフ ァチンが IRに結合するかどうかを調べるために、本発明者らは、ビスファチンの IRへ の結合活性を分析した。ヒト胚性腎臓細胞（HEK) 293細胞での細胞表面での IRの 発現は、ビスファチン（〇）およびインスリン（△)の両方の細胞への結合を増強した（ 図 8f)。ビスファチンの IRへの結合平衡解離定数（KD ; 4. 4nM)は、インスリン（6. 1 nM)と類似した。しかし、ビスファチンのインスリン様増殖因子 Iレセプター（IGF-IR) への結合は、非常に弱かった。本研究者らはまた、 IR遺伝子をトランスフエタトした H EK293細胞力も免疫沈降した IRタンパク質にビスファチンが結合することを見出し た（図 8g)。インスリンおよびビスファチンは、 IRにおいて共通の結合部位を有するか どうかを決定するために、本発明者らは、競合阻害アツセィを用いた。標識されてい ないインスリンは、インタタトの HEK293細胞において発現された IRへの放射標識ィ ンスリンを置き換えたが標識しなかったビスファチンは置き換えな力 た（図 8f上）。 同様に、標識していないビスファチンは、 IRへの放射標識ビスファチンへの結合を置 き換えたが、インスリンは置き換えな力 た（図 8h)。本発明者らはまた、ビスファチン 、 aサブユニット（IR-N15K)における変異を伴う IRへ結合したかどうかを調べた 。インスリンは、 IRの細胞外の αサブユニットに結合し、 N15K変異体は、インスリン の結合親和性を消失されることが報告されている（T. Kadowaki, H. Kadowaki, D. Accili, S. I. Taylor, J. Biol. Chem.265, 19143 (1990))。以前に報告されるように、 IR —N15Kのインスリンの結合親和性（KD = 69. 7nM)は、 IR (野生型； IR—WT)のィ ンスリンへの結合親和性を鈍らせた（図 8i上）。し力、し、ビスファチンは、強力に IR— N 15Kと結合した（KD = 6. 6nM)。これは、ビスファチンの IR— WTに匹敵した（KD = 3. OnM) (図 8i、下）。まさに、本発明者らは、 IR— N15Kのビスファチン依存性の自 己リン酸化がインタタトな IR— N15Kを発現する CHO細胞において観察したことにな る。これらの結果は、ビスファチンが、 IRを直接活性化するが、インスリンとは異なる様 式で活性化することを示す。
[0258] まとめると、種々の証拠から、ビスファチンは、インスリンとインビボおよびインビトロレ ベルで特性が共通することが明らかになった。第一に、高用量の組み換えビスファチ ンの投与は、インスリン抵抗性およびインスリン欠損性のマウスの両方において血漿 グルコースレベルを低下させた。第二に、 KKAyマウスにおいて、アデノウイルスべク ターによって達成される血漿ビスファチンレベルが二倍になったことによって、血漿グ ルコース濃度およびインスリン濃度の減少がもたらされた。第酸に、本発明者らの実 験によって、ビスファチンは、インスリンシグナル伝達を、 IRを経由して活性化するが 、インスリンとは異なる経路をとることが明らかになった。ビスファチンとインスリンとに は、重要な相違がある。
[0259] 血漿ビスファチンレベルは、マウスにおける飢餓状態または食餌状態において顕著 に変わらなかった。他方、血漿インスリンレベルは、食餌状態において増加し、飢餓 状態において減少した。ビスファチンの血漿濃度は、飢餓状態ではインスリンの 10% であり、食餌状態では 3%であった。ビスファチンのこのように濃度が低いことは、ビス ファチン（+ /—)マウスの分析によって示されるように、インスリンに比べてビスファチ ンの血漿グルコースレベルに対する効果が緩和であることを説明し得る。本発明者ら の生化学的な実験によって、同程度の濃度では、ビスファチンおよびインスリンは、 同程度のインスリンシグナル伝達グルコース取り込みを活性化し、グルコース放出を 抑制する能力を有することが明らかになった。さらに、 （+ /—)マウスにおいて、 3pM の血漿ビスファチンレベルの減少によって、 10_20mg/dlの血漿グルコース濃度の 上昇が見られる。これらをまとめると、ビスファチンは、血漿グルコース濃度の低下に おいて生理学的な役割を持っている力 S、生理学的濃度が低いのでその生体内での 寄与は低いということがいえる。
[0260] これまでに報告されているビスファチンの機能は、インターロイキン 7および B細胞 前駆体コロニー形成の効果である（B. Samal et al.,Mol. Cell. Biol. 14, 1431 (1994)) 。インスリンおよびインスリン様増殖因子 (IGF)もまた、 B細胞前駆体コロニー形成を 強化することが知られている（K.S. Landreth, R. Narayanan, K. Dorshkind, Blood 80， 1207 (1992))。従って、ビスファチンの効果は、別のインスリン様効果に寄与すると考 えられる。やせたマウスの脂肪組織に比較して、肥満マウスの脂肪組織には、前炎症 性サイト力イン（例えば、 TNF—ひ、 IL一 6など）の量が増加していた。これらのサイト力 インは、ビスファチンの mRNAレベルを増加させる（S. Ognjanovic etal., J. Mol. Endocrinol.26, 107 (2001))。従って、これらのサイト力インカ、内臓脂肪のビスファチ ンの mRNAレベルの増加をになうと考えられる。ビスファチンのインスリン様機能の発 見は、インスリン関連生物学 (例えば、グノレコースおよび脂質の恒常性、細胞増殖お よび細胞分化など）の理解を促進する。ビスファチンと代謝性疾患とノ間の関連は、 興味深い。血漿ビスファチンレベルは、内臓脂肪蓄積に比例して増加しているからで ある。本発明者らの結果は、ビスファチンが糖尿病約の開発の標的として有用である ことを示す。
[0261] (実施例 14 :スクリーニング）
本実施例では、インスリン様活性を調節する能力のある物質を、レポータージーン アツセィを用いてスクリーニングする。
[0262] (レポータージーンアツセィ）
(方法）
リン酸緩衝化生理食塩水（PBS ; 10 mM リン酸塩； 150 mM 塩化ナトリウム， pH 7. 2 to 7. 3. )
ノレシフェラーゼレポーターアツセィキット：
溶解溶液： 25mM Tris (7. 5)、 2mM ジチオスレィトール（DTT) , 10%グリセ口 ール、 1 % TritonX-100 ;ルシフェリンミックス： 20mMトリシン（Tricine) /1. 07 mM (MgCO ) Mg (OH) _5H 0/2. 67mMMgSO /0. ImM EDTA/33.
3 4 2 2 4
3mM DTT/270 μ M コェンザィム（Coenzyme) A/470 μ Mルシフェリン /5 30 μ ΜΑΤΡ (二ツボンジーンのピツカジーン（Code No. PGK—L100)を使用する ことができる）。
[0263] (使用する脂肪細胞）
白色脂肪細胞 ：3T3_L1， 3T3-F442A, Obl771
褐色脂肪細胞 ： HIB1B
白色および褐色の脂肪細胞の初代培養細胞 筋肉細胞： L6、 C2C12
肝細胞： Η4ΠΕ、 HepG2
その他： C3H 10Τ1/2 (多分化能細胞なので、脂肪細胞になることもある） (培地）
これらの細胞は、適宜 Dulbecco改変 Eagle培地に 10。/οゥシ胎仔血清などを用い て培養する。
[0264] (ルシフェラーゼ）
ルシフェラーゼは、蛍光（約 560nm)作る酵素である。細胞内に、ビスファチンをコ ードした核酸配列（配列番号 1)を含むプラスミドとレポータープラスミド (ノレシフェラー ゼレポーター）を同時に細胞に強制発現し、レポーター活性を測定する。ルシフェラ ーゼ遺伝子産物の発現による蛍光を測定することにより、遺伝子発現を測定すること ができる。ここで、トランスフエクシヨンなどは、本明細書上記（3T3— L1脂肪細胞にお けるトランスフエクシヨン研究）に記載されている手法に従って行うことができる。
[0265] (方法）
(1) 上記プラスミドを用いて上記各々の細胞のトランスフエクシヨンを行う。
(2) 48— 72時間、上記細胞を培養する。
(3) 培養上清を除去する。
(4) 培養に使用されているゥエルまたはディッシュを洗浄する。
(5) 細胞の溶解（24穴プレートの場合、溶解溶液 200 β 1/ゥエル)。
(6) ライゼートを Eppendorfチューブへうつす。
(7) 脱核 (遠心分離 15Krpm、 3分， 4°C)する。
(8) 上清を別の Eppendorfチューブへうつす
(9) 液体シンチレーシヨンカウンターにサンプルを揷入する。
(10) ルシフェリンミックスにサンプル上清を 0. 5 μ 1加える。
(11) 蛍光に起因するカウントを測定する。
[0266] このようにして得られた蛍光から、候補化合物が、ビスファチンの機能の抑制または 亢進を測定することができる。
[0267] (実施例 15 :自動化） 実施例 14で実施するスクリーニングは、ロボットを用いて自動化することができる。 この場合、例えば、ベックマンコールターの Biomekシリーズを用いて、マイクロプレ ートを用いたシステムを構築する力、または Zymarkの Staccato Mini— Systemシ リーズを用いてシステムを構築することができる。
[0268] このようにして得られたリード化合物は、動物実験に用いることができる。あるいは、 このようなリード化合物をもとに、他の化合物を設計することができる。
[0269] (実施例 16 :動物実験）
実施例 14、 15などで、ビスファチンを活性化する可能性があることが判明した化合 物について、マウス、ラットまたはサルなどの動物に投与して脂肪組織、筋肉細胞ま たは肝細胞特異的にビスファチン mRNA発現量またはタンパク質量を低下させる 化合物をスクリーニングする。
[0270] このようなスクリーニングにより、動物において実際に脂肪細胞の分化;糖尿病；高 グリシン血症；低グルコース寛容；インスリン抵抗性；肥満；脂肪障害；異脂血症 (dysli pidemia)；高脂血症；高トリグリセリド血症；高コレステロ一ノレ血症；低 HDLレべノレ；高 LDLレベル；粥状硬化症；血管狭窄；過敏性腸症候群；炎症性腸疾患；クローン病； 腸潰瘍；炎症疾患；膝炎；腹部肥満；神経変性病；網膜症；乾癬；代謝性症候群；卵 巣高アンドロゲン症などの疾患に作用する物質をスクリーニングすることができる。
[0271] (実施例 17：ヒト被検体における臨床試験）
実施例 16で実際に試験効果があった物質のうち、毒性が見られなかったものにつ いて、ヒト被検体に投与して糖代謝に対する効果を観察する。ここでは、エネルギー 代謝、体重、脂肪量、体脂肪率、血糖値などを指標として臨床試験を行う。これにより 、実施例 16でリード化合物として同定された化合物が、実際に上記疾患に効果があ るかどうかを判定することができる。
[0272] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発 明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解され る。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体 的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として 援用されるべきであることが理角军される。 産業上の利用可能性
本発明は、医薬品産業などにおいて糖尿病などの糖代謝疾患の治療、予防および それらの医薬の研究、開発のために有用である。

Claims

請求の範囲
[1] 下記の（a)— (h)のレ、ずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 カロもしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)前記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配歹 1J、または
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列、
力 なるタンパク質またはそのフラグメントを有効成分として含有する、糖代謝関連疾 患の治療剤または予防剤。
[2] インスリン様活性を亢進することを特徴とする、請求項 1に記載の治療剤または予防 剤。
[3] 前記インスリン様活性が、脂肪細胞、肝細胞または筋肉細胞におけるインスリンシグ ナル伝達促進活性である、請求項 2に記載の治療剤または予防剤。
[4] 前記インスリン様活性が、肝細胞における糖新生抑制活性または筋肉細胞における 糖取り込み促進活性である、請求項 2に記載の治療剤または予防剤。
[5] 前記インスリン様活性が、血糖降下作用である、請求項 2に記載の治療剤または予 防剤。
[6] 下記のいずれかの塩基配列：
<塩基配列群 >
(A)配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(B)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、 付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(C)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、
(D)前記（C)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたアミ ノ酸配列をコードする塩基配列、
(E)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列をコードする塩基配列、
(F)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列、
(G)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列と 80%以上の配列同一性を有する塩基配 歹 IJを有し、かつ該塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、塩 基配列、または
(H)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列と、ストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、かつ該塩基配列がコード するタンパク質がインスリン様活性を有する、塩基配列、
力 なる塩基配列またはそのフラグメントを有効成分として含有する、糖代謝関連疾 患の治療剤または予防剤。 [7] インスリン様活性を亢進することを特徴とする、請求項 6に記載の治療剤または予防 剤。
[8] 前記インスリン様活性が、肝細胞または筋肉細胞におけるインスリンシグナル伝達促 進活性である、請求項 6に記載の治療剤または予防剤。
[9] 前記インスリン様活性が、肝細胞における糖新生抑制活性または筋肉細胞における 糖取り込み促進活性である、請求項 7に記載の治療剤または予防剤。
[10] 前記インスリン様活性が、血糖降下作用である、請求項 7に記載の治療剤または予 防剤。
[11] インスリン様活性の検定方法であって、
(1)細胞と、被験物質とを接触させる第一工程、
(2)該細胞におけるインスリン様活性を測定する第二工程、および
(3)該第二工程により測定された測定値を、該被験物質の代わりに下記の（a)— (h)
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 カロもしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)前記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配列、
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、力、つインス リン様活性を有するアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質を用いて該第一工程および第二工程 を行った場合の測定値と比較して、被験物質のインスリン様活性を評価する第三ェ 程、
を有することを特徴とするインスリン様活性の検定方法。
[12] 前記細胞が肝細胞、筋肉細胞および脂肪細胞からなる群より選択される細胞である
、請求項 11に記載の方法。
[13] 前記第三工程において、該被験物質のインスリン様活性が該タンパク質のインスリン 様活性と同等以上である場合にインスリン様活性を有すると判定することをさらに包 含する、請求項 11に記載の方法。
[14] 前記タンパク質は、配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなる、請求項 11に記載の 方法。
[15] 前記インスリン様活性が、インスリンシグナル伝達促進活性である請求項 11に記載 の検定方法。
[16] 前記インスリンシグナル伝達促進活性力 インスリン受容体、 IRS-1、 PI3キナーゼまた は Aktのリン酸化量を指標として測定されることを特徴とする、請求項 14に記載の検 定方法。
[17] 前記インスリン様活性が、肝細胞における糖新生抑制活性である、請求項 11に記載 の検定方法。
[18] 前記インスリン様活性が、筋肉細胞または脂肪細胞への糖取り込み促進活性である
、請求項 11に記載の検定方法。
[19] 前記第一工程で使用される細胞が骨格筋細胞である、請求項 11に記載の検定方法 [20] 前記第一工程で使用される細胞が株化脂肪細胞、初代培養脂肪細胞、株化肝細胞 または初代培養肝細胞である、請求項 11に記載の検定方法。
[21] 被験物質が、下記の（a)— (h)のいずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 カロもしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)前記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配列、
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列
力 なるタンパク質または該タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸の発現を調 節するかどうかを判定する工程を包含する、被験物質のインスリン様活性の調節活性 を検定するための方法。
[22] 下記の工程（1)一（3)： (1) 発現条件下で請求項 21に記載のタンパク質をコードする遺伝子を発現する能 力を有する細胞と、被験物質とを接触させる第一工程、
(2) 該発現条件下で被験物質を接触させた細胞における、該遺伝子の発現量を測 定し、該発現量を、該発現条件下で被験物質に接触させない対照細胞における該 遺伝子の発現量と比較する第二工程、および
(3) 該第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が該遺伝子の発現を調節する 力、否力、を指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程
を包含する、請求項 21に記載の方法。
[23] 下記の工程（1)一（3)：
(1)発現条件下で請求項 21に記載のタンパク質を発現する能力を有する細胞と、被 験物質とを接触させる第一工程、
(2)該発現条件下で該被験物質を接触させた細胞における、前記タンパク質の発現 量を測定し、該発現量を、該発現条件下で該被験物質に接触させない対照細胞に おける前記タンパク質の発現量と比較する第二工程、および
(3)該第二工程の比較結果に基づいて、該被験物質が該タンパク質の発現を調節 するか否かを指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程 を包含する、請求項 21に記載の方法。
[24] 下記の工程：
(1) 発現条件下で請求項 21に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現制御領 域に作動可能に連結されるレポーター遺伝子をコードする塩基配列を含有する細胞 と、被験物質とを接触させる第一工程、
(2) 該発現条件下で被験物質を接触させた細胞における、該レポーター遺伝子の 発現量を測定し、該発現量を該発現条件下で被験物質に接触させない対照細胞に おける該遺伝子の発現量と比較する第二工程、および
(3) 該第二工程の比較結果に基づいて、該レポーター遺伝子の発現量を調節する 力、否力、を指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程
(1)一（3)を含むことを特徴とする、請求項 21に記載の方法。
[25] 前記調節は、亢進、維持または抑制を含む、請求項 21に記載の方法。 [26] 前記調節は、亢進である、請求項 21に記載の方法。
[27] 前記レポーター遺伝子の発現量の調節は、増力 Q、維持または減少を含む、請求項 2 5に記載の方法。
[28] 前記インスリン様活性が、インスリンシグナル伝達促進活性である、請求項 21に記載 の方法。
[29] 前記インスリン様活性が、筋肉細胞または脂肪細胞への糖取り込み促進活性である
、請求項 21に記載の方法。
[30] 前記インスリン様活性が、肝細胞における糖新生抑制活性である、請求項 21に記載 の検定方法。
[31] 請求項 21に記載の検定方法により測定された、被験物質のインスリン様活性の調節 活性を指標として、糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤の候補物質を選別するこ とを特徴とする、糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤を探索するための方法。
[32] 前記糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤が、筋肉細胞、脂肪細胞または肝細胞 におけるインスリンシグナル伝達促進剤であることを特徴とする、請求項 31に記載の 方法。
[33] 前記糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤が、脂肪細胞または筋肉細胞における 糖取り込み促進剤であることを特徴とする、請求項 31に記載の方法。
[34] 前記糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤が、肝臓における糖新生抑制剤である ことを特徴とする、請求項 31に記載の方法。
[35] 前記糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤がポリペプチド、核酸、糖鎖、脂質、有 機低分子、およびこれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 31に記載の 方法。
[36] 請求項 31に記載の探索方法により選抜された物質を有効成分として含有する、糖代 謝関連疾患の治療剤または予防剤。
[37] 被験物質のインスリン様活性の調節活性を検定するためのシステムであって、該シス テムは：
A)下記の（a) (h)のレ、ずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 > (a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 カロもしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)前記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配列、
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列
力 なるタンパク質または該タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
B)該タンパク質または該核酸の発現をする発現手段；
C)該発現を調節するかどうかを判定する判定手段
を備える、システム。
[38] 前記発現手段は、前記タンパク質を発現する能力を有する細胞を含む、請求項 37 に記載のシステム。
[39] 前記判定手段は、前記タンパク質の発現量を測定する手段または前記核酸の発現 量を測定する手段を含む、請求項 37に記載のシステム。 糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤を探索するためのシステムであって、該シス テムは：
A)下記の（a)— (h)のレ、ずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 加もしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)前記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配列、
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列
からなるタンパク質または該タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
B)該タンパク質または該核酸の発現をする発現手段；
C)該発現を調節するかどうかを判定する判定手段；および
D)被験物質のインスリン様活性の調節活性を指標として、糖代謝関連疾患の治療 剤または予防剤の候補物質を選別する選別手段
を備える、システム。
[41] 前記選別手段にぉレ、て、前記インスリン様活性の調節活性力 Sインスリン様活性の亢 進であり、該亢進は、前記タンパク質または前記核酸の発現量を維持または増加さ せること選別することを特徴とする、請求項 40に記載のシステム。
[42] 糖代謝関連疾患を治療または予防するための方法であって、該方法は：
A)以下のアミノ酸配列を有するタンパク質
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 カロもしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)前記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配歹 1J、または
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配歹 1J、あるいは以下の塩基配列を有する核酸分子： <塩基配列群 >
(A)配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(B)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、 付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(C)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、
(D)前記（C)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたアミ ノ酸配列をコードする塩基配列、
(E)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列をコードする塩基配列、
(F)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列、
(G)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列と 80%以上の配列同一性を有する塩基配 列を有し、かつ該塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、塩 基配列、または
(H)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列と、ストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、かつ該塩基配列がコード するタンパク質がインスリン様活性を有する、塩基配列、
によって達成されるインスリン様活性を維持または亢進させる工程
を包含する、方法。
前記工程 A)は、請求項 1、 6または 36に記載の糖代謝関連疾患の治療剤または 予防剤を処置が必要な被験体に投与することを包含する、請求項 42に記載の方法 下記の（a)— (h)のレ、ずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、 (b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 加もしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)前記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配歹 1J、または
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列、
からなるタンパク質またはそのフラグメントを有効成分として含有する、インスリン様活 性を調節するための組成物。
下記のレ、ずれかの塩基配列：
<塩基配列群 >
(A)配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(B)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、 付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(C)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、 (D)前記（C)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたアミ ノ酸配列をコードする塩基配列、
(E)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列をコードする塩基配列、
(F)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列、
(G)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列と 80%以上の配列同一性を有する塩基配 列を有し、かつ該塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、塩 基配列、または
(H)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列と、ストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、かつ該塩基配列がコード するタンパク質がインスリン様活性を有する、塩基配列、
からなる塩基配列またはそのフラグメントを有効成分として含有する、インスリン様活 性を調節するための組成物。
下記の（a)—（h)のレ、ずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 加もしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)前記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配歹 1J、または
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列、
からなるタンパク質またはそのフラグメントの、糖代謝関連疾患の治療剤または予防 剤の製造における、使用。
下記のレ、ずれかの塩基配列：
<塩基配列群 >
(A)配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(B)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、 付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(C)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、
(D)前記（C)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたアミ ノ酸配列をコードする塩基配列、
(E)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列をコードする塩基配列、
(F)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列、
(G)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列と 80%以上の配列同一性を有する塩基配 列を有し、かつ該塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、塩 基配列、または
(H)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列と、ストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、かつ該塩基配列がコード するタンパク質がインスリン様活性を有する、塩基配列、
力 なる塩基配列またはそのフラグメントの、糖代謝関連疾患の治療剤または予防剤 における使用。
[48] 下記の（a)— (h)のレ、ずれかのアミノ酸配列：
<アミノ酸配列群 >
(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付 カロもしくは置換されたアミノ酸配列、
(c)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列、
(d)前記（c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァミノ 酸配列、
(e)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列、
(f)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸配 列、
(g)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一性 を有する塩基配列を有する DNAによりコードされ、かつインスリン様活性を有するァ ミノ酸配歹 1J、または
(h)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する DN Aと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつインス リン様活性を有するアミノ酸配列、
力 なるタンパク質またはそのフラグメントの、インスリン様活性を調節するための組成 物の製造における使用。
[49] 下記のいずれかの塩基配列：
<塩基配列群 >
(A)配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(B)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、 付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(C)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、
(D)前記（C)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたアミ ノ酸配列をコードする塩基配列、
(E)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列をコードする塩基配列、
(F)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列、
(G)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列と 80%以上の配列同一性を有する塩基配 歹 IJを有し、かつ該塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、塩 基配列、または
(H)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列と、ストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、かつ該塩基配列がコード するタンパク質がインスリン様活性を有する、塩基配列、
力 なる塩基配列またはそのフラグメントの、インスリン様活性を調節するための組成 物の製造における使用。
[50] 下記のいずれかの塩基配列：
<塩基配列群 > (A)配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(B)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が欠失、 付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(C)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から 26個のアミノ酸 を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、
(D)前記（C)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたアミ ノ酸配列をコードする塩基配列、
(E)配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配 列をコードする塩基配列、
(F)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列、
(G)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493番 目までのヌクレオチドで示される塩基配列と 80%以上の配列同一性を有する塩基配 列を有し、かつ該塩基配列がコードするタンパク質力 Sインスリン様活性を有する、塩 基配列、または
(H)配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列と、ストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、かつ該塩基配列がコード するタンパク質がインスリン様活性を有する、塩基配列、
またはこれらの塩基配列の改変体が導入された、形質転換体。
前記形質転換体は、生物、臓器、組織または細胞である、請求項 50に記載の形質 転換体。
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