JP2008029293A

JP2008029293A - 癌の治療薬のスクリーニング方法及び癌の治療薬

Info

Publication number: JP2008029293A
Application number: JP2006208699A
Authority: JP
Inventors: Akira Nakagawara; 章中川原
Original assignee: Chiba Prefectural Government; Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc
Current assignee: Chiba Prefectural Government; Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc
Priority date: 2006-07-31
Filing date: 2006-07-31
Publication date: 2008-02-14

Abstract

【課題】Ｕｎｃ５Ｈ４の機能を解析し、そこから導かれる様々な疾患の治療薬のスクリーニング方法及び治療薬を提供することを目的とする。
【解決手段】被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞におけるＵｎｃ５Ｈ４の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下で培養した細胞のＵｎｃ５Ｈ４の発現量が被検化合物の非存在下で培養した細胞のＵｎｃ５Ｈ４の発現量よりも多い場合に、当該被検化合物を癌の治療薬と判定する工程と、を備える、癌の治療薬のスクリーニング方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、癌の治療薬のスクリーニング方法及び癌の治療薬に関し、特に、神経芽腫のスクリーニング方法及び神経芽腫の治療薬に関する。

Ｕｎｃ５Ｈ４（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＢ０５５０５６；別名Ｕｎｃ５Ｄ）は、ヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリーから同定されたＵｎｃ遺伝子ファミリーの一つである（特許文献１）。

また、神経芽腫の予後良好群及び予後不良群を比較した場合に、予後良好群でＵｎｃ５Ｈ４の発現が高いことを、本発明者らは報告している（特許文献２）。

特開２００２−１５３２９０国際公開第０１／０６６７３３号パンフレット

しかしながら、Ｕｎｃ５Ｈ４の機能は解明されておらず、Ｕｎｃ５Ｈ４の機能を解析することで様々な疾患の治療薬の開発につながる可能性がある。したがって、本発明の目的はＵｎｃ５Ｈ４の機能を解析することにある。さらに、機能解析から導かれる様々な疾患の治療薬のスクリーニング方法及び治療薬を提供することも目的とする。

本発明者らは、Ｕｎｃ５Ｈ４がｐ５３の標的分子であり、Ｕｎｃ５Ｈ４はカスペース３を活性化することで細胞死を誘導すること、また神経芽腫の予後診断のマーカーとなることを見出した。さらに、神経芽腫の自然退縮の分子機構に深く関与することが示唆された。すなわち、Ｕｎｃ５Ｈ４は細胞の生死をスイッチングする重要な受容体であり、多くの癌において分子標的となる可能性が高く、癌の治療薬の開発に役立つことを本発明者らは明らかにし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞におけるＵｎｃ５Ｈ４の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下で培養した細胞のＵｎｃ５Ｈ４の発現量が被検化合物の非存在下で培養した細胞のＵｎｃ５Ｈ４の発現量よりも多い場合に、当該被検化合物を癌の治療薬と判定する工程と、
を備える、癌の治療薬のスクリーニング方法
を提供する。本スクリーニング方法は、ｐ５３の標的分子であるＵｎｃ５Ｈ４がカスペース３を活性化することで細胞死を誘導するという分子メカニズムを応用したものである。かかる分子メカニズムは本発明者らが新たに見出したものであり、したがって、今までとは作用機序が全く異なる癌の治療薬を本スクリーニング方法により得ることが可能である。本発明は、また、配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなる癌の治療薬を提供する。配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質はヒトＵｎｃ５Ｈ４タンパク質に相当する。

本発明は、さらに、配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなる癌の治療薬を提供する。ここで、核酸は配列番号１７に示す核酸配列からなる核酸であることが好ましい。配列番号１７に示す核酸配列からなる核酸はヒトＵｎｃ５Ｈ４遺伝子に相当する。

本発明において、癌は神経芽腫であることが好ましい。

本発明の癌の治療薬のスクリーニング方法によれば、新たな作用機序の癌の治療薬を得ることが可能である。また、本発明の癌の治療薬は新たな作用機序に基づくものであり、癌治療の選択肢を広げることが可能である。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。

（癌の治療薬のスクリーニング方法）
本発明の癌の治療薬のスクリーニング方法は、
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞におけるＵｎｃ５Ｈ４の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下で培養した細胞のＵｎｃ５Ｈ４の発現量が被検化合物の非存在下で培養した細胞のＵｎｃ５Ｈ４の発現量よりも多い場合に、当該被検化合物を癌の治療薬と判定する工程と、
を備えることを特徴とする。

被検化合物は、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等）などが挙げられるが、これらに限定しない。また、スクリーニングには、任意のスクリーニング用化合物ライブラリーを用いてもよい。なお、使用する細胞の種類、細胞の培養条件及び被検化合物の処理条件は、当業者であれば、適宜調整することが可能である。

Ｕｎｃ５Ｈ４の発現量とは、Ｕｎｃ５Ｈ４遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現量及び／又はその翻訳産物であるＵｎｃ５Ｈ４タンパク質の発現量を指す。ｍＲＮＡの発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、具体的には、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ノザンブロッティング法、定量的リボヌクレアーゼプロテクション法などが挙げられる。タンパク質の発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、例えば、定量的ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。これら方法を用いることによって、Ｕｎｃ５Ｈ４の発現量を測定することが可能である。

被検化合物の存在下のＵｎｃ５Ｈ４の発現量が被検化合物の非存在下のＵｎｃ５Ｈ４の発現量よりも多い被検化合物を癌の治療薬と判定することができる。これは、Ｕｎｃ５Ｈ４がカスペース３を活性化し、その結果、細胞死を誘導するという本発明者らが見出した知見に基づくものである。

（癌の治療薬）
本発明の癌の治療薬は、配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなることを特徴とする。配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質はヒトＵｎｃ５Ｈ４タンパク質に相当する。本発明者らが見出した分子メカニズムによれば、Ｕｎｃ５Ｈ４はカスペース３を活性化し、その結果、細胞死を誘導する。したがって、本発明の癌治療薬を癌細胞、癌組織又は癌患者に接触又は投与することにより、癌の抑制・治療を行うことが可能である。ここで、癌は神経芽腫であることが好ましい。

また、本発明の癌の治療薬は、配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなることを特徴とする。ここで、核酸は配列番号１７に示す核酸配列からなることが好ましい。配列番号１７に示す核酸配列からなる核酸はヒトＵｎｃ５Ｈ４遺伝子に相当する。本発明者らが見出した分子メカニズムによれば、Ｕｎｃ５Ｈ４はカスペース３を活性化し、その結果、細胞死を誘導する。したがって、本発明の癌治療薬を適切なベクターに組み込み、ベクターを癌細胞、癌組織又は癌患者に接触又は投与することにより、癌の抑制・治療を行うことが可能である。ここで、癌は神経芽腫であることが好ましい。

ベクターは当業者にとって公知なベクターを利用することが可能であり、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスを改変したウイルスベクターなどが挙げられ、リポソーム等の非ウイルスベクター等も挙げられる。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実験材料）
ヒト組織ＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ社、アドリアマイシンはＳｉｇｍａ社から購入した。抗Ｕｎｃ５Ｈ４抗体はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社又はＢＭＬ社に特注したものを使用した。抗ｐ５３抗体はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、抗βアクチン抗体はシグマ社から購入した。リアルタイムＰＣＲキットはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。カスペース３活性キットはＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社から購入した。

ＰＣＲに用いた各種プライマーは以下の通りである。
Ｕｎｃ５Ｈ１：5'-agacgggcacagatttgaac-3'
5'-gtgaagctgtggtgttggtg-3'
Ｕｎｃ５Ｈ２：5'-GTTGCCTCTCCTCCTCCTCT-3'
5'-TAAAACCCATGGAACCCAGA-3'
Ｕｎｃ５Ｈ３：5'-ATGCCCACTTTACTCGGAGA-3'
5'-CGTCCACAGCTTCAACTTCA-3'
Ｕｎｃ５Ｈ４：5'-TGAACTGCAGATGCCATAGG-3'
5'-GGTTTCAGGGACACTGTGGT-3'
ｐ５３：5'-ATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGA-3'
5'-ACCCTTTTTGGACTTCAGGTGGCTGGAGT-3'
ｐ２１^ＷＡＦ１：5'-GACACCACTGGAGGGTGACT-3'
5'-GGCGTTTGGAGTGGTAGAAA-3'
ＢＡＸ：5'-TCTGACGGCAACTTCAACAC-3'
5'-GAGGAGTCTCACCCAACCAC-3'
ＧＡＰＤＨ：5'-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3'
5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'

（実験方法）
ＲＴ−ＰＣＲ法、ウエスタンブロット解析及びルシフェラーゼレポーターアッセイは、Ando et al., J. Biol. Chem., 279: 25549-25561, 2004に記載の方法と同様の方法で行った。リアルタイムＰＣＲ法は、Kawamoto et al., Med. Pediatr. Oncol., 35: 628-631, 2000に記載の方法と同様の方法で行った。ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、Machida et al., Oncogene, 23: 1931-1942, 2006に記載の方法と同様の方法で行った。

（実施例１）ＣＯＳ７細胞におけるＵｎｃ５Ｈ４タンパク質の発現
ＣＯＳ７細胞にＵｎｃ５Ｈ４をコードする発現プラスミド（コントロールとしてｐｃＤＮＡ３を使用した）を導入した。４８時間後に細胞からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロット法によりＵｎｃ５Ｈ４タンパク質の発現解析を行った。図１にウエスタンブロット法による解析結果を示す。図１から明らかなように、Ｕｎｃ５Ｈ４タンパク質の発現が認められ、導入したＵｎｃ５Ｈ４はタンパク質に翻訳されることが確認された。

（実施例２）ヒト組織におけるＵｎｃ５Ｈの発現解析
ヒトの様々な組織からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＵｎｃ５Ｈファミリーの発現解析を行った。図２にＲＴ−ＰＣＲ法による解析結果を示す。Ｕｎｃ５Ｈ１は、心臓、肺、結腸、脾臓、小脳、胎児の脳および副腎で、Ｕｎｃ５Ｈ２は主に肺、前立腺および小脳で、Ｕｎｃ５Ｈ３は肺、結腸、脾臓、精巣、前立腺、脳、小脳、肝臓、胎児の脳および副腎で、Ｕｎｃ５Ｈ４は主に前立腺、脳、小脳および胎児の脳で発現が高かった。

（実施例３）ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によるＵｎｃ５Ｈ４の発現解析
１１日目のマウス胎児を用いて、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によりＵｎｃ５Ｈ４の発現解析を行った。図３から分かるように、Ｕｎｃ５Ｈ４は前肢、後肢及び後根神経節で発現が認められた。

（実施例４）Ｕｎｃ５Ｈ４が細胞増殖能に及ぼす影響
Ｈ１２９９細胞（ｐ５３ヌル）にＵｎｃ５Ｈ４遺伝子を導入し、細胞の増殖速度を検討した。図４から分かるように、空ベクター（ｐｃＤＮＡ３）を導入した細胞に比べて、Ｕｎｃ５Ｈ４遺伝子を導入した細胞は細胞増殖速度が遅かった。

（実施例５）Ｕｎｃ５Ｈ４がカスペース３活性に及ぼす影響
Ｈｅｌａ細胞にＵｎｃ５Ｈ４遺伝子（２μｇ）を導入し、２４時間後にＮｅｔｒｉｎ−１（２５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた。その後、カスペース３活性を測定した。図５に示したように、Ｕｎｃ５Ｈ４遺伝子を導入した細胞は、カスペース３の活性が約２倍に上昇したが、Ｎｅｔｒｉｎ−１の添加により、その活性は抑制された。

（実施例６）神経芽腫の予後とＵｎｃ５Ｈの発現との関係
神経芽腫の予後良好群及び予後不良群のサンプルを用いてＵｎｃ５Ｈファミリー（５Ｈ１、５Ｈ２、５Ｈ３及び５Ｈ４）の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。図６に示したように、Ｕｎｃ５Ｈ１及びＵｎｃ５Ｈ４の発現は、予後良好群で高かった。

（実施例７）リアルタイムＰＣＲ法によるＵｎｃ５Ｈ４の発現解析
神経芽腫の予後良好群（ｎ＝５６）及び予後不良群（ｎ＝６２）のサンプルを用いてリアルタイムＰＣＲ法によりＵｎｃ５Ｈ４の発現解析を行った。結果を図７及び表１に示す。図７及び表１から分かるように、予後良好群においてＵｎｃ５Ｈ４の高発現が認められた。

（実施例８）Ｕｎｃ５Ｈ４の発現と神経芽腫患者の生存率
神経芽腫の予後良好群及び予後不良群について、Ｕｎｃ５Ｈ４の発現と生存率の関係をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した。解析結果を図８に示す。Ｕｎｃ５Ｈ４の発現が高いほど生存率は高かった。

（実施例９）Ｕｎｃ５Ｈ４の発現と予後不良な神経芽腫患者の生存率
神経芽腫の予後不良群について、Ｕｎｃ５Ｈ４の発現と生存率の関係をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した。解析結果を図９に示す。Ｕｎｃ５Ｈ４の発現が高いほど生存率は高かった。

（実施例１０）Ｕｎｃ５Ｈ４の発現と神経芽腫患者（Ｎ−ｍｙｃ増幅）の生存率
神経芽腫のＮ−ｍｙｃ増幅症例について、Ｕｎｃ５Ｈ４の発現と生存率の関係をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した。解析結果を図１０及び表２に示す。Ｕｎｃ５Ｈ４の発現が高いほど生存率は高かった。

（実施例１１）ｐ５３過剰発現によるＵｎｃ５Ｈ４の誘導
Ｈ１２９９細胞にｐ５３を過剰発現させ、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＵｎｃ５Ｈ４の発現を解析した。また、同時にｐ２１^ＷＡＦ１及びＢａｘの発現も調べた。結果を図１１に示す。ｐ５３の発現に伴い、Ｕｎｃ５Ｈ４の発現は増加した。このとき、ｐ２１^ＷＡＦ１及びＢａｘの発現も誘導された。

（実施例１２）アドリアマイシン処理によるＵｎｃ５Ｈ４の誘導
Ｈ１２９９細胞及びＵ２ＯＳ細胞（ｐ５３野生型）にアドリアマイシン（１μｇ／ｍｌ）を加え、所定時間経過後に細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＵｎｃ５Ｈ４の発現を解析した。結果を図１２に示す。ｐ５３を発現しているＵ２ＯＳ細胞では、アドリアマイシン処理によりＵｎｃ５Ｈ４の発現が増加したが、ｐ５３を発現していないＨ１２９９細胞ではアドリアマイシン処理によってＵｎｃ５Ｈ４の発現に変化は認められなかった。

（実施例１３）ｐ５３過剰発現によるＵｎｃ５Ｈ４タンパク質の誘導
実施例１１と同様にＨ１２９９細胞にｐ５３を過剰発現させ、ウエスタンブロット法によりＵｎｃ５Ｈ４タンパク質の発現解析を行った。結果を図１３に示す。ｐ５３の過剰発現によりタンパク質レベルにおいてもＵｎｃ５Ｈ４の発現が増加することが確認された。

（実施例１４）ｐ５３過剰発現による切断されたＵｎｃ５Ｈ４タンパク質の誘導
実施例１１と同様にＨ１２９９細胞にｐ５３を過剰発現させ、ウエスタンブロット法により切断されたＵｎｃ５Ｈ４タンパク質の発現解析を行った。結果を図１４に示す。ｐ５３の発現に伴い切断されたＵｎｃ５Ｈ４タンパク質が発現することが確認された。

ＣＯＳ７細胞からのタンパク質をウエスタンブロット解析した結果を表す図である。Ａは抗Ｕｎｃ５Ｈ４抗体を使用した時の結果を表し、Ｂは抗Ｆｌａｇ抗体を使用したときの結果を表す。ヒト組織からのＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ解析した結果を表す図である。１１日目のマウス胎児のホールマウントｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を表す図である。Ａはアンチセンスプローブを、Ｂはセンスプローブを用いた結果を表す。遺伝子導入したＨ１２９９細胞の細胞増殖速度を表す図である。Ｈｅｌａ細胞のカスペース３活性を表す図である。予後良好な、及び予後不良な神経芽腫におけるＵｎｃ５Ｈファミリーの発現をＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を表す図である。Ｕｎｃ５Ｈ４の発現をリアルタイムＰＣＲで解析した結果を表す図である。Ｕｎｃ５Ｈ４の発現と神経芽腫患者の生存率の関係をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した結果を表す図である。Ｕｎｃ５Ｈ４の発現と予後不良な神経芽腫患者の生存率の関係をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した結果を表す図である。Ｕｎｃ５Ｈ４の発現と神経芽腫患者（Ｎ−ｍｙｃ増幅）の生存率の関係をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した結果を表す図である。ｐ５３過剰発現によるＵｎｃ５Ｈ４の誘導をＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を表す図である。アドリアマイシン処理によるＵｎｃ５Ｈ４の誘導をＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を表す図である。ｐ５３過剰発現によるＵｎｃ５Ｈ４タンパク質の誘導をウエスタンブロット法で解析した結果を表す図である。ｐ５３過剰発現による切断されたＵｎｃ５Ｈ４タンパク質の誘導をウエスタンブロット法で解析した結果を表す図である。

Claims

被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞におけるＵｎｃ５Ｈ４の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下で培養した細胞のＵｎｃ５Ｈ４の発現量が被検化合物の非存在下で培養した細胞のＵｎｃ５Ｈ４の発現量よりも多い場合に、当該被検化合物を癌の治療薬と判定する工程と、
を備える、癌の治療薬のスクリーニング方法。
癌が神経芽腫である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなる癌の治療薬。
配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなる癌の治療薬。
前記核酸が配列番号１７に示す核酸配列からなる核酸である請求項４に記載の治療薬。
癌が神経芽腫である、請求項３−５いずれか一項に記載の治療薬。