WO2005082412A1

WO2005082412A1 - 癌の治療および予防薬

Info

Publication number: WO2005082412A1
Application number: PCT/JP2005/003032
Authority: WO
Inventors: Takashi Minami; Tatsuhiko Kodama; Takao Hamakubo; Hiroko Iwanari; Masahiro Hayashi
Original assignee: Perseus Proteomics Inc.
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2005-02-24
Publication date: 2005-09-09
Also published as: JPWO2005082412A1

Abstract

　新規作用機序に基づく抗癌剤の提供。　ＤＳＣＲ−１蛋白、ＤＳＣＲ−１遺伝子又はＤＳＣＲ−１蛋白発現を亢進する物質を有効成分とする癌の治療・予防薬。

Description

明細書

癌の治療および予防薬

技術分野

[0001] 本発明は癌の治療および予防薬に関する。

背景技術

[0002] 癌による死亡者は年々増加し、多くの化合物により治療が試みられている力未だ癌に対する特効薬はない。癌の発症機序が分子生物学的な方法で解明されつつあり、新たな抗癌剤が待たれている。

[0003] DSCR— 1は DOWN SYNDROME CRITICAL REGION 1の略称であり、 MCIP1 (MYOCYTE- ENRICHED CALCINEURIN— INTERACTING P ROTEIN)、 CSP1 (CALCIPRESSIN)および MODULATORY CALCINEU RIN INTERRACTING PROTEINと同一である。

[0004] 癌は細胞の異常増殖を伴う疾患である。細胞の異常増殖には血管新生、アポトーシスの停止、細胞周期の異常が関与するということが知られている。し力しながら、 D SCR— 1がそれらの現象に関与するとの報告は殆ど知られていないが、唯一 DSCR— 1遺伝子欠損マウスにおいて Thl細胞に FASLが誘導され細胞死に繋がるとの報告がある（非特許文献 1)。これは DSCR— 1欠損による細胞死であり、本発明が DSCR 1亢進による癌細胞の異常増殖の抑制を目標としていることとは逆の現象である。非特許文献 l :Nature Immun. 2003, 4 : 874-881

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明の目的は、新たな作用機序を有する癌の治療および予防薬を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0006] そこで本発明者は、 DSCR— 1について種々の作用を検討していたところ、全く意外にも、 DSCR - 1に血管新生抑制作用、細胞遊走の抑制作用、細胞接着の抑制作用及び細胞周期の停止作用があることを見出した。さらに、ゼノグラフトによる移植癌細胞増殖への影響を検討した結果、移植癌細胞の増殖抑制を確認し、 DSCR— 1蛋白、 DSCR— 1遺伝子又は DSCR— 1蛋白発現を亢進する物質が癌の治療および予防薬として有用であることを見出した。

[0007] すなわち、本発明は、 DSCR— 1蛋白、 DSCR— 1遺伝子又は DSCR— 1蛋白発現を亢進する物質を有効成分とする癌の治療および予防薬を提供するものである。また、本発明は、 DSCR— 1蛋白、 DSCR— 1遺伝子又は DSCR— 1蛋白発現を亢進する物質を投与することを特徴とする癌の治療'予防方法を提供するものである。また、本発明は、癌の治療'予防薬製造のための DSCR— 1蛋白、 DSCR— 1遺伝子又は DSCR - 1蛋白発現を亢進する物質の使用を提供するものである。

発明の効果

[0008] 本発明の抗癌剤は、従来の抗癌剤に比較し、多機能性、すなわち血管新生の抑制、細胞遊走の抑制、細胞接着の抑制および細胞周期を停止するのみならず炎症抑制を示す抗癌剤である。

図面の簡単な説明

[0009] [図 1]DSCR - 1 による血管新生誘発 ·成長刺激因子および炎症誘発遺伝子発現抑制の RT-PCRによる検討結果を示す図である。

[図 2]管腔形成能に対する DSCR— 1の影響を示す図である。

[図 3]DSCR— 1の細胞遊走能への影響の検討を示す図である。

[図 4]細胞創傷の回復に与える DSCR— 1の影響を示す図である。

[図 5]細胞創傷後 10日後の細胞の状態を示す図である。

[図 6]FACS により解析した DSCR— 1 発現による Gl (GO) 抑制効果の検討を示す図である。

[図 7]へマトキシリン &ェォシン染色検体の観察を示す図である。

[図 8]マトリゲルプラグ中のヘモグロビン含量への影響を示す図である。

[図 9]DSCR-1の腫瘍抑制効果の検討を示す図である。

[図 10]DSCR-1遺伝子構造の模式図である。

[図 11]HUVECで発現誘導されるァイソフォームを特定するためのリボプローブ配列を示す図である。 [図 12]RNase プロテクションアツセィの結果を示す図である。

[図 13]DSCR— 1 (ェクソン 1567)特異的 PCRプライマーを用いた RT— PCRの結果を示す図である。

[図 14]TRAPによる DSCR-1遺伝子発現亢進を示す図である。

[図 15]リンパ腫由来細胞株の血管内皮細胞への接着における DSCR— 1による阻害の検討結果を示した図である。

[図 16]リンパ腫由来細胞株の血管内皮細胞への接着における DSCR— 1による阻害の検討結果を示した図である。

[図 17]リンパ腫由来細胞株の血管内皮細胞への接着における DSCR— 1による阻害の検討結果を示した図である。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明について詳細に説明する。

DSCR— 1遺伝子発現系の構築は、次のようにして行うことができる。

DSCR— 1の全長 cDNAは、トロンビン刺激で発現が亢進する HUVEC等の細胞株や定常状態で発現して、る HepG2等の細胞株の total RNA力 RT— PCR法により取得後、当業者に一般的に用いられるクローユングベクターに組み込むことができる。 DSCR-1蛋白を大腸菌、動物細胞、昆虫細胞、酵母などで発現させるためにはそれぞれの宿主での発現に適した公知の発現ベクターに DSCR— 1の全長 cDNA を組み込むことができる。また、プラスミドに限らず、レトロウイルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、単純へルぺスウィルスベクター、ヮクシユアウィルスベクター等、一般的に遺伝子発現に使われるウィルスも用いることができる。 DSCR— 1を発現させるためのプロモーターとしては宿主に応じた CMV等の一般的に用いられているプロモーターを用いることができる。また、人体への遺伝子導入の際には、癌細胞特異的に働くプロモーターを用いたり、ある一定条件下発現を誘導できるプロモーターを用いたりすることにより副作用を抑えることもできる。タンパク精製の際には効率的な精製を目的に GST、 HA、 FLAG, His等のタグを付加することが出来る。 DSCR— 1蛋白発現細胞の識別ィ匕のためにたとえば pIRES— EGFP (Clontech)等の発現ベクターを用いて GFPタンパク質を共発現させることも出来る。また、精製の簡便化のために、 DSCR— 1蛋白にシグナルペプチドを付加し、細胞外に分泌させ、培地中に DSCR— 1蛋白を回収することもできる。構築した DSCR— 1 発現用ベクターは大腸菌、 CHO、 COS— 7等の動物細胞、 Sf— 9等の昆虫細胞、酵母等の一般的に組み換えタンパク質の発現に用いられて、る宿主にお、て発現させることが出来る。また、癌細胞の治療や予防のためにヒト癌細胞等においても発現させることがでさる。

[0011] DSCR— 1蛋白は、例えば次の方法により取得できる。

強制発現細胞株は公知の一般的な方法により培養し、 DSCR— 1蛋白を含む培養物を得ることができる。ウィルスの場合、公知の宿主細胞に感染させることにより DSC R— 1蛋白を含む培養物を得ることができる。また、大腸菌、酵母など、その他の公知の一般的に組み換えタンパク発現に用いられる生物においても同様に DSCR— 1蛋白を含む培養物を得ることができる。さらに、天然に DSCR-1を発現している HepG 2等の細胞株や、トロンビン刺激後に天然の DSCR— 1発現を亢進する HUVEC等の細胞株からも、同様に公知の培養方法により培養することにより DSCR— 1蛋白を含む培養物を得ることができる。

[0012] DSCR— 1蛋白を含む培養物から蛋白の一般的な分離 ·精製法である陽 Z陰ィォン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ァフニティークロマトグラフィー、キレートクロマトグラフィー等にて DSCR— 1蛋白を精製することができる。

[0013] DSCR— 1産生亢進物質は、例えば次の方法によりスクリーニングできる。

DSCR— 1遺伝子発現ならびに蛋白発現を測定する方法として、当業者により良く知られた方法が用いられる。具体的には、 DSCR— 1発現組織、細胞株および DSC R— 1強制発現細胞を用い、スクリーニングィ匕合物を加えて培養し、 DSCR— 1遺伝子あるいは蛋白量を知られた方法にて測定した後、無添加時の量と比較することによりスクリーニングすることができる。

遺伝子量の測定には遺伝子抽出後に RT— PCR、定量的 PCR等、当業者が一般的に用いる方法が利用できる。 DSCR— 1蛋白量を測定する方法としては ELISA等の知られた方法が利用できる。

また、 DSCR— 1遺伝子の発現を向上する物質のスクリーニングのためには、一般的に用いられているレポータージーンアツセィを用いることもできる。一般的な方法とは、 DSCR— 1遺伝子のプロモーター領域をルシフェラーゼゃガラタトシダーゼ、 GF P等のマーカータンパク質の cDNAの上流に接続したベクターを作製し、このべクタ一を一般的な方法により、動物細胞にトランスフエクシヨンする。トランスフエクシヨンされた細胞に、スクリーニングィ匕合物をカ卩えて培養し、マーカータンパク質をそれぞれに適した方法で検出することによって目的の化合物をスクリーニングすることができる上記の如くして得られる DSCR— 1蛋白、 DSCR— 1遺伝子および DSCR— 1蛋白発現を亢進する物質は、血管新生抑制作用、細胞遊走抑制作用、細胞接着の抑制作用、細胞周期の停止作用、および癌細胞の増殖抑制作用を有し、種々の癌の治療および予防薬として有用である。

[0014] DSCR— 1の血管新生抑制能を調べるには、 HUVECを用いた管腔形成アツセィや鶏卵や角膜、トリの絨毛尿膜、ゥサギ、マウス、ラットの角膜を用いた血管新生測定法がある。一般的な方法としては、コラーゲンゲルやマトリゲル上に HUVECを播種し、 DSCR— 1蛋白を細胞内への移行を促進するためのポリリジン、ポリアルギニン、 HIV— Tat、 HSV VP22等の担体と結合し、培地に加えて培養後の管腔形成を顕微鏡下で観察する。また、 DSCR— 1の遺伝子を導入した際の効果を調べる方法としては、遺伝子導入した HUVECを用いて capillary network, tube形成能を調べることができる。また、鶏卵や角膜、トリの絨毛尿膜、ゥサギ、マウス、ラットの角膜へ、 D SCR— 1を含んだ担体を注入したり、 DSCR— 1遺伝子を導入したりし、その後の血管新生を観察することにより DSCR— 1血管新生抑制能を調べることができる。

[0015] 細胞周期の停止を評価するには公知の方法を用いて行う。すなわち、 DSCR— 1蛋白の細胞内への移行を促進するためにポリリジン、ポリアルギニン、 HIV-Tat, HS V VP22等の結合したものを加えた培地で培養した細胞、もしくは評価対象物質を発現して!/、る細胞を一般的な方法で回収し、たとえばョー化プロビジゥムなどの DN Aに結合する蛍光色素で染色する。こののち、細胞の蛍光量を FACS等で測定することによって細胞が細胞周期のどの状態にいるのかを推定できる。また、 DSCR— 1の遺伝子を導入した際の効果を調べる方法としては、遺伝子導入した細胞を用い効果を調べることができる。このことによって、細胞周期が停止しているかどうかを確認できる。

[0016] 細胞接着の抑制を評価するには公知の方法を用いて行うことができる。すなわち、各種細胞刺激剤としてサイト力イン、トロンビン等を用いて培養容器付着性の血管内皮細胞等を刺激することにより、細胞表面に接着因子を発現させる。次いで、浮遊性の単球系細胞である THP - 1、 U - 937等の細胞と混合培養する。未接着細胞を洗浄した後、接着細胞数を計測する。薬物による細胞接着抑制効果を評価するには、薬物未添加との比較により判定することができる。

[0017] 癌細胞の増殖抑制をみる一般的方法として、 B16メラノーマ細胞等の癌細胞株をマウスに移植し、腫瘍のサイズが一定の大きさ（約 50mm³)に達したところで、腫瘍中に薬物あるいは遺伝子を導入したウィルス、細胞、評価対象物質を発現できるプラスミドベクター等を静脈内投与あるいは経口投与する。その後、経時的に腫瘍の大きさを caliper により測定することにより移植癌細胞抑制効果を判定することができる。

[0018] 本発明の癌の治療および予防薬の対象となる癌は特に限定されないが、メラノーマ、肝癌、肺癌、大腸癌、直腸癌、胃癌、脾臓癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫などが挙げられる。

[0019] DSCR-1蛋白の投与は、目標とする細胞内への移行を促進するためポリリジン、ポリアルギニン、 HIV— Tat、 HSV VP22等の担体と結合し生理食塩水等の適当な溶液に溶解し、 0. 1一 lOOmgZ人を静脈内投与することができる。

DSCR— 1遺伝子の投与は当業者に知られた一般的な方法で行う。一般的な方法とは DSCR— 1の cDNAを組み込んだレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、単純へルぺスウィルスベクター、ワクシニアウィルスべクタ一等を直接あるいは局所に留めるための一般的な担体と共に、腫瘍中へ投与することが出来る。またウィルスを用いな、遺伝子導入法として DSCR— 1を発現できるプラスミドベクターをリボソーム、ジーンガンやポリリジン等を用いて遺伝子を導入することちでさる。

実施例

[0020] 以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

[0021] 実施例 1 ヒト DSCR— lcDNAのクローニング

ヒト DSCR— 1 (exon 4— 7)をコードする全長 cDNAは、 HUVEC total RNA 5ugより Superscript (Invitrogen, Cat No. 11904— 018を用いて調製した 1 st strand cDNAを铸型とし、 Ex— Taq (Takara, Cat No. RROOIA)を用いた P CR反応により増幅した。 PCRの条件としての HUVEC由来 cDNA、 50pmol のセンスプライマー（配列番号 3)、アンチセンスプライマー（配列番号 4)、 5 1 10 X Ex— Taq buffer、 4 Lの dNTP mix (2. 5mM each)、 2. 5Unitsの Ex— T aq DNA ポリメラーゼを含む 50 μ Lの反応液を、 94°C、 1分、 62°C、 1分、 72°C、 3 分からなるサイクルを 30回行った。 PCR反応による増幅産物は（pGEM— T Easy Vector System I (Promega社 Cat. No. A1360)を用いて TAベクター pGEM— T easyに挿入した) ABI3100 DNAシーケンサーを用い配列の確認を行った結果、ヒトの全長 DSCR— 1 (ェクソン 4—7)をコードする cDNAを単離した。配列番号 1 で表される配列はヒト DSCR— 1遺伝子の塩基配列を、配列番号 2で表される配列はヒト DSCR— 1タンパク質のアミノ酸配列を示す。

[0022] 配列番号 3： AAGGAACCTACAGCCTCTTGGAAAGG

配列番号 4： TTGGAATGCGTCCTCGTCGCGTGCCAG

[0023] 実施例 2 adeno— DSCR— 1の作製

DSCR— 1全長 cDNAを RT— PCR法により、 HUVEC total RNAから取得後、 p IRES-EGFP (Clontech)にサブクローユングした。 DSCR— 1— IRES— EGFP配列を切り出し、 CMVプロモーターを有する pAdeno ベクター（Clontech)に組み込むことにより DSCR— 1発現用コンストラクトを構築した。 DSCR— 1発現アデノウイルスは HEK— 293細胞への感染、増幅によって得られた。

[0024] 実施例 5 トロンビン刺激での HUVEC DNAマイクロアレイ解析

サブコンフルェント HUVECを 0. 5%FBS, EBM— 2基礎培地中で一夜処理した後、 1. 5units/mLのトロンビンを添カ卩した。 Total RNA は Trizolを用いて精製した。 cRNAの作製と Affimetrix Human Focus Arrayへのハイブリダィゼーシヨンは Affimetrixのプロトコールに基づき行った。 2種類の HUVEC Badgeを用い、 1, 4, 18時間後のトロンビン刺激での遺伝子変動を二重に観察した。表 1はトロンビン刺激での HUVEC DNAマイクロアレイの結果である。トロンビン刺激で最も発現誘導される遺伝子を上から 5番目までを示した。 DSCR— 1はトロンビン刺激において最も誘導される遺伝子として示された。

[0025] [表 1] トロンビン刺激で最も発現誘導される遺伝子（5番目まで）

1 DSC -1 2 FosB-del ta 3 IL-8 4 COX- 2 5 GR0- /3

17. 7倍 17. 5倍 10. 7倍 10. 4倍 1倍

[0026] 表 2は DSCR— 1プローブを用いた Affimetrixマイクロアレイデータである,

DSCR— 1はトロンビン刺激 1時間でピークになる早期誘導遺伝子である。

[0027] [表 2]

D S C R - 1プロ一ブを用い)-マイク "Jァ Ϊ ヽデータ

トロンビン刺激 T N F - α刺激コン卜コン卜 π

lh 4h 18h lh 4h 181ι ロールール

1 遺伝子発現量 28. 1 435. 4 316. 3 55. 6 29. 5 39. 6 85. 9 77. 2 遺伝子誘導倍率 15. 2 9. 9 1. 8 1. 2 2. 1 0. 9

2 遺伝子発現量 23. 1 506. 6 190. 2 11. 8 34. 0 131. 8 102. 7 63. 2 遺伝子誘導倍率 17. 9 8. 9 0. 5 3. 8 3. 4 1. 8

3 遺伝子発現量 27. 4 463. 8 350. 4 63. 6 N. D. N. D. N. D. N. D. 遺伝子誘導倍率 20. 0 12. 2 2. 5

[0028] 表 3— 5は DSCR— 1構成的発現下での HUVECトロンビン刺激 1時間に対す遺伝子変動を網羅的に解析した結果である。得られた総合データは 3つに分類された。 ( l) adeno—コントロール感染の HUVEC上で 2倍以上トロンビン刺激によって誘導される力 DSCR— 1存在によって少なくとも 2倍以上その誘導が減少する遺伝子:合計 8974遺伝子中 25遺伝子が得られた。そのうち 7つが細胞増殖や血管新生に関わるものであり、 8遺伝子が炎症に関わるものであった。その他の 10遺伝子に関しては、セリンスレオニンキナーゼゃ転写因子であり、 DSCR— 1の抗血管新生、抗炎症効果に反するものは抽出されなかった。（2) adeno—コントロール感染の HUVEC上で 2 倍以上トロンビン刺激によって抑制される力 DSCR— 1存在によって少なくとも 2倍以上その誘導が回復する遺伝子： 7遺伝子が得られた。この中に細胞周期のブレーキ役である p21および p27が得られた。（3) adeno—コントロール感染の HUVEC上で 2倍以上トロンビン刺激によって誘導される力 DSCR— 1存在によってさらにその発現が誘導する（高発現)遺伝子： 7遺伝子が得られた。この中に強力な抗血管新生作用を誘起する ADAMTS 1も含まれた。

[表 3]

DSCR- 1構成的発現下での HUVECトロンピン刺激 1時間に対する遺伝子変動 (低下) トロンビン刺激

カテゴリー Unigene 名称

Ad-Con trol/Ad-DSCR-1

Hs. 115181 Angiopoiet in-2 47. 4

Hs. 2258 NMP-10 9. 01 血管新生誘発 Hs. 252820 PIGF 10. 1

及び Hs. 1976 PDGF- /3 3. 33

成長刺激因子 Hs. 44 Pleiotrop in 4. 48

Hs. 73853 BMP-2 1. 99

Hs. 41746 ESM-1 6. 15

Hs. 62192 Tissue factor 17. 7

Hs. 624 IL-8 7. 79

Hs. 386467 ICAM-1 1. 27

Hs. 89546 E-se lect in 2. 36 炎症誘発因子

Hs. 154299 PAR - 2 3. 60

Hs. 408864 DAF, CD55 6. 38

Hs. 89414 CXCR4 12. 7

Hs, 248917 TNFSF18 1. 12

Hs. 103755 RICK, CARDIAK 3. 77

Hs. 2227 C/EBP r 2. 87

Hs. 99029 C/EBP β 2. 37

Hs. 76095 IER3 2. 28

Hs. 35120 RFC4 1. 60 その他

Hs. 100016 PP0X 1. 39

Hs. 169840 TTK 2. 14

Hs. 85482 USP13 1. 91

Hs. 34578 ST3GALVI 2. 18

Hs. 159161 Rho-GDI 2. 22 [0030] [表 4]

DSCR- 着成的発現下での HUVECトロンピン刺激 1時間後の遺伝子変動 (増加)

[0031] [表 5]

DSCR- 冓成的発現下において、 HUVECトロンビン刺激 1時間後での誘導がさらに上昇した遺伝子

[0032] 実施例 6 DSCR— 1によるトロンビン刺激誘導性の血管新生誘発 ·成長刺激因子および炎症誘発遺伝子発現の RT - PCRによる検討

Adeno—コントロール感染未刺激（レーン）、 adeno—コントロール感染トロンビン刺激 1時間（レーン 4)、 adeno— DSCR— 1感染トロンビン刺激 1時間（レーン 5)、 adeno —DSCR— 1感染未刺激（レーン 6)の RNAをもとに RT— PCRを行った結果である（図 D oサイクロフィリン Aは内因性コントロールとして用いた。 PCRプライマーとサイクル数は以下に示す。

ティシュファクター（22サイクル），フォワード 5， -TCAGAGTTTTGAACAGGT GGGAACA-3，（配列番号 5)およびリバース 5，— TTCTCCTGGCCCATACAC TCTACCG— 3，（配列番号 6)； E—セレクチン（22サイクル），フォワード 5，一 CATG TGGAGCCACAGGACACTGGTCTG— 3，（配列番号 7)およびリバース 5，— TC TGATTCAAGGCTTTGGCAGCTGCTG-3 ' (配列番号 8)；アンジォポェチン -2 (20サイクル），フォワード 5， -ACAAATGTATTTGCAAATGTTCACAAA -3，（配列番号 9)およびリバース 5， -GAAATCTGCTGGTCGGATCATCATG GT— 3，（配列番号 10)； P1GF (20サイクル），フォワード 5，— CCGGTCATGAGGC TGTTCCCTTGC-3，（配列番号 11)およびリバース 5，— CTCGCTGGGGTAC TCGGACACGAC-3 ' (配列番号 12)； p27 (26サイクル），フォワード 5，— CGCA GGAATAAGGAAGCGACCTGC— 3，（配列番号 13)およびリバース 5，—CGTT TGACGTCTTCTGAGGCCAGGCTT-3 ' (配列番号 14)； p21 (18サイクル），フォワード 5，— AGCAAGGCCTGCCGCCGCCTCTTC— 3，（配列番号 15)およびリバース 5，— TGACAGGTCCACATGGTCTTCCTC— 3，（配列番号 16)； AD AMTS 1 (20サイクル），フォワード 5， -AGCTTTCTTGCCATCAAAGCTGC T-3，（配列番号 17)及びリバース 5， -AACCTGGATGGTCAAGGGCTCTTT —3，（配列番号 18) ;1 —8 (23サィクル），フォワード 5，一 TGTCAGTGCATAAAG ACATACTCCA-3，（配列番号 19)およびリバース 5， -CTTCTCCACAACCC TCTGCACCCAG-3 ' (配列番号 20) ;ICAM— 1 (23サイクル），フォワード 5，一 G TGCAAGAAGATAGCCAACCAATG-3 ' (配列番号 21)およびリバース 5，—A GGAGTCGTTGCCATAGGTGACTG-3 ' (配列番号 22)；サイクロフィリン A ( 23サイクル），フォワード 5，— TTCGTGCTCTGAGCACTGGAGA— 3，（配列番号 23)およびリバース 5， -GGACCCGTATGCTTTAGGATGAAG-3，（配列番号 24)。

実施例 7 管腔形成能に対する DSCR— 1の影響

HUVECに adeno—コントロールと adeno—DSCR—1を MOI = 20 で感染させ、その HUVECをゲル処理ディッシュ（24ゥエルに EGM— 2 MV media (Clonetics ) (bFGF不含）を含むタイプ Iコラーゲンを 400 μ 1加えて 37°C下でゲル化させたもの )上に l X 10⁵cells/ディッシュの割合で播いた。 24時間後、さらに HUVECの上に 400 /z Lのタイプ Iコラーゲンを置き、 24時間後キヤビラリ一ネットワーク、管腔形成能を顕微鏡下で観察した。管腔領域は NIHイメージを用いて定量ィ匕した。図 2はその結果である。（a, d)は明部 X 40拡大図、（b, e)は蛍光部 X 40拡大図、（c, f )は蛍光部 X 100拡大図を示している。 EGFPの量は上下とも同程度（アデノウイルスの感染効率は同一）であるのに対し、管腔形成能は DSCR— 1発現により減少していた。

[0034] 実施例 8 DSCR— 1の細胞遊走能への影響の検討

HUVECに adeno—コントロール、 adeno— DSCR— 1、又は adeno— DSCR— 1プラス adeno— CANFATを MOI=40にて感染させ、 24時間後その HUVECの中心部をピペットで傷を入れた。その 1日、 2日後、細胞の遊走のレベルを顕微鏡観察し、 N IHイメージにより定量化した。又は HUVECを感染、 0. 5%FBS、 EBM— 2培地で培養後、トロンビン存在下 4時間で遊走する細胞を Boyden chamber法により測定した。 DSCR— 1高発現の HUVECは創傷治癒のレベルがコントロールに比べ減少しており、その欠如は adeno— CA— NF— ATを共感染することで回復した。さらに、 Ade n_o—コントロール感染の HUVECはポストコンフルェントを超えて細胞がディッシュからはがれ始めているのに対し、 adeno— DSCR— 1感染 HUVECは傷が完全に除去できないまま (矢印）静止状態であった（図 3、図 4および図 5 (A、 B) )。

[0035] 実施例 9 FACSにより解析した DSCR— 1発現による Gl (GO)抑制効果の検討

サブコンフルェント HUVECに adeno コントロールあるいは、 adeno— DSCR— 1を感染させ、細胞の細胞周期をョー化プロビジゥム含量を測定することにより同定した。

=3ント p—ノレ HUVECで ίま、 67. 2⁰/₀力 SG0/G1期、 17. 7⁰/₀力 S期、 15. 1⁰/₀力 G2 ZM期であったのに対し、 DSCR 1を過発現した HUVECでは 90. 5%が G0ZG1 期、 1. 4%が S期、 8. 1%が G2ZM期であった。また、 50%コンフルェントの HUV ECでも同様の結果が得られた（図 6)。

[0036] 実施例 10 へマトキシリン &ェォシン染色検体の観察

Adeno—コントロールでは毛細血管の遊走が多数検出されるのに対し、 adeno— D SCR— 1では顕著に抑制されていた（図 7および図 8)。

[0037] 実施例 11 DSCR— 1の腫瘍抑制効果の検討

対数増殖期の B16メラノーマ細胞 1 X 10⁶を 8週齢の C57/BL6マウスに異種移植として皮下投与した。腫瘍のサイズが 50mm³になったところで、 5 X 10⁹pfuの adeno コントロールあるいは adeno— DSCR— 1を腫瘍中に投与し、その後経時的に腫瘍の大きさをカリパーにより測定した。 Adeno— DSCR— 1投与群は adeno—コントロール投与群に比べて 4日後で 9. 1倍、 6日後で 7. 7倍、 8日後で 7. 4倍 (いずれも P<

0. 04)の腫瘍抑制効果が認められた（図 9)。

[0038] 実施例 12 DSCR— 1遺伝子発現量を測定する方法

図 10はヒト DSCR— 1遺伝子構造の模式図である。 mRNAは 4つのオルタナティブ第 1ェクソン（ボックス lto4)と 3つの共通エタソン（ボックス 5to7)力も成り立って!/、る。図示したものは 2つの主なアイソフォーム DSCR— 1 (ェクソン 4— 7)と DSCR— 1 (エタソン 1567)である図 11は HUVECで発現誘導されるァイソフォームを特定するためのリボプローブ配列を示している。図 12は RNaseプロテクションアツセィの結果である。 10 μ g酵母 RNA (レーン 2) , 10 g total RNA未処理 HUVEC (レーン 3) ,トロンビン処理（レーン 7— 9) , TNF— α処理（レーン 10— 12)。矢印で示すバンドが D SCR-1 (ェクソン 4— 7)力らなるアイソフォームである。一方 DSCR— 1 (ェクソン 1567 )力なる発現物は RNaseプロテクションアツセィでは検出されなかった（図中 * )。 G APDHはロードした RNA量の内因性コントロールである。早期に DSCR— 1 (ェクソン 4-7から構成される）遺伝子が発現誘導されることが、ェクソン 4-7特異的リボプロ一ブを用いた RNaseプロテクションアツセィにより明ら力となった。図 13は DSCR— 1 (ェクソン 1567)特異的 PCRプライマーを用いた RT— PCRの結果である。増幅サイクル 40回目でその発現が検出されたが、トロンビン、 TNF- a刺激によっても発現に変ィ匕は認められな力つた。同様操作で PAR— 1選択的ァゴ-ストである TRAPを 10pm

01、 50pmol (B,レーン 8and9)添カ卩することにより、トロンビン添加と同様の強い誘導が認められた (図 14)。

[0039] DSCR— 1はカルシ-ユーリン（Ca²⁺Zカルモジュリン依存性ホスファターゼ）を阻害することにより NF— ATを阻害すること（Hum. Molec. Genet. 2000, 9 : 1681—16 90)は周知である。しかしながら、 DSCR— 1のシグナルの全てがカルシ-ユーリン NF— AT経路で伝達されるのではなぐ細胞周期のブレーキ役である p21、 p27ならびに抗血管新生作用を誘起する ADAMTS 1の発現亢進が他の伝達経路由来であることが本試験により推察された。

[0040] カルシ-ユーリンと細胞の異常増殖に関係する（1)血管新生、（2)アポトーシスおよび（3)細胞周期につ、ての関わりにつ、ては下記のようである。 (1)血管新生：カルシ-ユーリンが血管新生に関与するとの報告はな、。

(2)アポトーシス:カルシ-ユーリンがアポトーシスを誘導するとの報告が多数認められる（Clin Cancer Res. , 1998, 4 (12) : 2967-76, Science, 1999, 284 (54 12) : 339-43, J Biol Chem. , 1999, 274 (48) : 34450-8, J Neurosci. , 2 000, 20 (19) : 7426-51, J Biol Cem. , 2000, 275 (44) : 34528— 33)。この事は、カルシ-ユーリン阻害が逆の細胞の異常増殖の亢進に繋がると言うことである。し力しながら先に記述した力 DSCR— 1によるカルシ-ユーリンを阻害することが周知であり、可能性として DSCR— 1によるカルシ-ユーリン経由以外のアポトーシスの抑制が考えられる。

(3)細胞周期： FGFによるサイクリン Aおよび Eの発現をカルシ-ユーリン阻害薬であるサイクロスポリン Aが抑制する（Arch Biochem Biophys. 1998, 353 (2) : 37 4-8) o一方で、サイクロスポリン Aが細胞周期に対し逆の現象である cdk4キナーゼ活'性を促進する（Oncogene. 2000, 19 (24) : 2820— 7)こと力ら、カノレシニューリンの阻害が必ずしも細胞周期を抑制するとは限らない。

[0041] 従って、 DSCR— 1による癌細胞の異常増殖の抑制に対するカルシ-ユーリン経由の関与は極めて薄いことが推察される。

[0042] 実施例 13 リンパ腫由来細胞株の血管内皮細胞への接着における DSCR— 1による阻害

癌の転移において、細胞接着は重要な現象である。一方、癌組織において炎症像が確認できる力炎症の場における細胞接着は重要な現象であることは言うまでもない。 DSCR— 1の細胞接着への関与を明らかにするため、以下の検討をした。

すなわち、 HUVECを 24well plateに lxl0⁵cellsZwellまき、 6時間後、 Ad— C ontrol, Ad—DSCR—l, Ad—CA—NFAT, Ad—I κ Β αを MOI=40にて感染させた。 48時間後、細胞の培地を serum— starved media (EBM-2 plus 0. 5% F BS) (Clonetics)に換て、 overnight cultureして力ら、 thrombin (2unitsZ ml ) (Calbiochem)あるいは PBSを添カ卩し、 6時間刺激した。 HUVECは RPMI— 1640 plus 1%FBS (1 & ）で洗ぃ、その上に1¾：11—26 (31₈111&)で赤色標識したリンパ腫由来細胞株 U— 937細胞を 7. 5xl0⁵cellsZwellの条件でカ卩え、 1. 5時間静置した。その後、 HBSS (Invitrogen)で 2回、接着していない U— 937細胞を洗い除き、接着した U— 937細胞を透過光、及び蛍光下顕微鏡観察した。

接着した U— 937の定量は少なくとも 4つの独立した視野から、存在する蛍光の量を NIH imageを用いて換算した。

Ad— Controlを感染させた HUVECでは thrombin刺激に伴!、、 U— 937細胞の接着が 6倍上昇するのに対し、 Ad— DSCR— 1感染 HUVECでは thrombin刺激に伴う U— 937細胞の接着は 2. 5倍であり、 Ad— controlに比べ約 58%減少している（図 1 5および図 17)。この減少効果は Ad— CA— I κ Β αの存在下の 77%抑制に比べ少ないものの、 DSCR— 1が構成的に発現することで有意に単球接着を抑制できることが明ら力となった。また DSCR— 1の主たる標的阻害転写因子である NF— ATを構成的に発現させると、 thrombinの刺激なしでも常に単球の接着状態、炎症下にあること力 Sこのデータから示唆され（図 16および図 17)、 DSCR— 1が癌の転移および炎症阻害に有効であると推察された。

産業上の利用可能性

癌による死亡者は年々増加し、多くの化合物により治療が試みられている力未だ癌に対する特効薬はない。癌の発症機序が分子生物学的な方法で解明されつつあり、新たな抗癌剤が待たれている。 In vitroにおいては DSCR— 1は細胞遊走の抑制、細胞接着の抑制、細胞増殖の停止および毛細血管形成抑制、 in vivoにおいてもゼノグラフトによる移植癌細胞増殖の抑制を示すことが確認された。さらに、カルシ-ユーリンの阻害に基づく炎症の抑制も考えられることから、本発明により新規な作用機序に基づく癌の抑制および治療薬を提供することができると思われる。

Claims

請求の範囲

[1] DSCR— 1蛋白、 DSCR— 1遺伝子又は DSCR— 1蛋白発現を亢進する物質を有効成分とする癌の治療 ·予防薬。

[2] 血管新生の抑制、細胞遊走の抑制、細胞接着の抑制又は細胞周期の停止をするものである請求項 1記載の癌の治療 ·予防薬。

[3] 癌がメラノーマ、肝癌、肺癌、大腸癌、直腸癌、胃癌、脾臓癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、白血病およびリンパ腫からなる群力選択される請求項 1記載の癌の治療 -予防薬。

[4] DSCR— 1蛋白、 DSCR— 1遺伝子又は DSCR— 1蛋白発現を亢進する物質を投与することを特徴とする癌の治療 ·予防方法。

[5] 血管新生の抑制、細胞遊走の抑制、細胞接着の抑制又は細胞周期の停止をするものである請求項 4記載の癌の治療 ·予防方法。

[6] 癌がメラノーマ、肝癌、肺癌、大腸癌、直腸癌、胃癌、脾臓癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、白血病およびリンパ腫からなる群力選択される請求項 4記載の癌の治療 -予防方法。

[7] 癌の治療'予防薬製造のための DSCR— 1蛋白、 DSCR— 1遺伝子又は DSCR— 1 蛋白発現を亢進する物質の使用。