JPS63159399A - Ｂ細胞刺激因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は免疫学の分野に関し、より詳細にはＢ細胞刺激
因子の精製、クローニングおよび同定に関する。

（従来技術） ３９７２球（Ｂ細胞）は恐らく骨髄でプレＢ細胞に分化
する幹細胞前駆体から発生する。プレＢ細胞はＢ細胞に
成熟し、その後Ｂ細胞は適当な刺激により抗体産生形質
細胞に分化する。Ｂｉ砲の成熟／分化は２段階で起こる
と考えられる。第１段階において、Ｂｌａ胞は免疫グロ
ブＩＪ　７Ｍ　（ＩｇＭ）を発現し得る形質細胞に成熟
する。これらの細胞。

のいくつかは血液、肺臓および末梢リンパ節に移動して
、ＩｇＭを産生じ続ける。第２成熟段階では、他のＢ細
胞が免疫グロブリンＧ　（Ｉ、Ｇ）を産生じ得る形質細
胞に分化し、そのうちのいくつかは周辺組織に移動する
が、他のものは骨髄中に残って、あとで免疫グロブリン
Ａ（ＩｇＡ）産生細胞になる。

種々のＢ細胞因子はＢ細胞の成熟抗体分泌形質細胞への
生長を調節するが、別のＢ細胞因子は抗体分泌形質細胞
の分化を調節し、またさらに別の因子はＢ細胞前駆体集
団、すなわち１プレＢ細泡１の生長および分化を調節す
ると考えられる。

７７ラー（Ｆａｒｒａｒ）らのＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
　１３１：１８３８（１９８３）　；およびハワート”
　（Ｈｏｗａｒｄ）らのＪ。

ＥＸｐｏＭｅｄ、　１５５：９１４（１９８２）　　は
Ｂ細胞の生長または増殖を刺激すると書かれたＢ細胞刺
激因子（”ＢＣＧＦ”または”ＢＳＦ’−１”　　とも
呼ばれる）を開示している。このＢ細胞因子はホルボー
ルミリステートアセテート（ＰＭＡ）で刺激したＴヘル
パー線中１から誘導された。さらに、ダット：／　（Ｄ
ｕｔｔｏｎ）らのＪ、　工ｍｍｕｎｏＬ　１３２　：　
２４５１（１９８４）は、Ｂ細胞を大型の抗体産生形質
細胞へ分化させると書かれたＢ細胞因子（’ＢＣＧＦ’
　［［”または“ＢＣＤＦ”として知られる）の単離を
報告した。比較的最近の研究は、恐ら（ＢＳＦ−１が休
止Ｂ細胞に作用して、その後の抗免疫グロブリンとの相
互作用の際にそれらが８期に入るのを促進する旨示唆し
た。ラビン（Ｒａｂｉｎ）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ’１
．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）　　８２　：　２９３５（１９８５）　；　
　およびオリバー（Ｏｌｉｖｅｒ）らのＰｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）８２　：　２４
６５（１９８５）を参照されたい。これらの研究はＢＳ
Ｆ−１が実際に生長因子ではなくむしろ分化因子であり
うることを示した。生長型であろうと分化型であろうと
、Ｂ細胞刺激因子として役立つと考えられるホルモン類
の機能に関する混同、ならびにこれらの因子の同定の不
足は、Ｂ細胞が短命であって約１５日のみの寿命を有す
ることに少なくとも幾分か原因がある。

Ｂ細胞因子の分析および同定がほとんど進行しなかった
他の理…は、これらの因子を効果的に研究するのに十分
な量および純度でそれらを生産する方法が今まで開発さ
れなかったということにある。十分な量の均質β細胞因
子の利用可能性は、Ｂ細胞が幹細胞から分化してその後
形質細胞に成熟する経路を研究するのに有用であるばか
りでなく、特にＢ細胞の欠乏によって起こる免疫不全症
で苦しむ患者の治療の際の精製因子の使用可能性を研究
する上でも極めて価値があるだろう。

さらに、Ｂ細胞因子は広範囲の病気の治療のためのヒト
モノクローナル抗体の生産に使用されるだろう。大部分
のモノクローナル抗体は、特定抗原に対する抗体を産生
ずる短命の正常Ｂ細胞と、いつまでも限シなく生存する
ことができる悪性Ｂ細胞と、の輪金により形成されるハ
イプリトーマ細胞によって生産される。このハイプリド
−マを培養して、特定抗原に特異的なモノクローナル抗
体を得る。ネズミモノクローナル抗体はすでに生産され
て同定されたが、ヒトハイブリド−マからの有意量のヒ
トモノクローナル抗体の生産はほとんど成功１〜なかっ
た。十分量の均質Ｂ細胞因子の利用可能性は、通常短命
の抗体産生ヒ）Ｂ細胞の大規模連続培養を維持するため
にこの種の因子の使用可能性を高める。これはヒトモノ
クローナル抗体を開発しようと試みるときに現存する諸
問題を解決するかも知れない。さらに、Ｂ細、中因子の
この用途は、ハイブリド−マ技術に存在するＢ細胞への
呼瘍遺伝子の導入を排除するであろう。

比較的多量の均質Ｂ細胞因子を得るための１つの可能な
方法は組換えＤＮＡ技術による。タンパク質系物質を生
産するだめの組換えＤＮＡ技術の一般的議論は５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　Ｖｏｌ　１９６（１９７７）　　の編集補助
論文に説明されている。しかしながら、この種の技術を
首尾よく使用するには、天然および組換えＢ細胞因子ま
たはその活性を確実に測定しうるばかりでなく、天然産
物と組換え産物の両方を均質になる壕で精製しうろこと
もまた必要である。

（発明の構成） 本発明はＢ細胞刺激因子（ＢＳＦ−１）、天然および組
換えＢＳＦ−１の均質精製、均質ＢＳＦ’−１の同定、
ＢＳＦ’−１をコードする遺伝子のクローニング、成熟
ＢＳＦ−１を発現させるだめの上記遺伝子の使用、なら
びに天然および組換えＢＳＦ’−１の信頼しうる検定法
に関する。本発明によれば、粗製ＢＳＦ’−１調製物は
吸着、イオン交換クロマトグラフィーおよび高性能液体
クロマトグラフィー法の組合せにより精製される。精製
工程からの分画はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミド９ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびその
後の銀染色により監視された。ひとたび均質に精製され
ると、ＢＳＦ−１モジユールのアミノ酸配列が分析され
る。

アミノ酸配列の情報は、ＢＳＦ’−１のアミノ酸配列の
一部に対応する合成ポリオリゴヌクレオチドプローブの
作製のために使用される。このプローブを用いて、比較
的高レベルのＢＳＦ’−１’ｅ産生ずると考えられる細
胞から抽出されたｍＲＮＡより作製されたｃＤＮＡライ
ブラリーからＢＳＦ’−１遺伝子を単離することができ
る。この目的のために、この種の細胞から全ＲＮＡ　　
″ｆ：抽出する。全ＲＮＡ抽出物からポＩＪ　Ａ＋ｍＲ
ＮＡ　　ｆ単離する。ｃＤＮＡライブラリーは逆転写酵
素による４　１Ｊ　Ａ　ｍＲＮＡ　　の逆転写により作
製される。そのＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼエｉ用いて
二本鎖となし、適当なりローニングベクターに挿入する
。得られる組換えクローニングベクターを使って、適当
な原核生物または真核生物宿主全形質転換する。

形質転換宿主を同定し、プール別に分け、サブ。

ンブロノト法によりスクリーニングする。この方法にお
いて、これらのプールから一部されたプラスミド″ＤＮ
Ａは、ＢＳＦ−１のアミノ酸配列の一部に対応する放射
性標識された合成オリゴヌクレオチドプローブとハイブ
リダイズさせる。プローブに対して陽性信号を与えるク
ローンのプールを同定し、その後そのプールを直接コロ
ニースクリーニングにより選別する。このスクリーニン
グ法では、陽性プールからの個々の形質転換細胞を平板
培養して、その培養物からプラスミドＤＮＡ’ｉｐ製す
る。そのプラスミドＤＮＡを全ＲＮＡとハイブリダイズ
させ、それはｉｎ　ＶｉｔｒＯで翻訳させたときにＢＳ
Ｆ−１生物活性（ＢＳＦ’−１活性ｍＲＮＡ）を生ずる
ことがわかった。この方法により、ＢＳＦ’−１をコー
ドするプラスミドＤＮＡを含む個々の形質転換細胞が同
定される。その形質転換細胞からプラスミド５ＤＮＡを
調製し、そしてその遺伝子のヌクレオチピ組成および配
列を確立するために塩基配列の決定を行う。

このクローニング法は初めに特定動物種から作製された
ｃＤＮＡライブラリーに対して行われる。

ひとたび初期動物種のＢＳＦ−１遺伝子を含むＣＤＮＡ
が単離・同定されると、その遺伝子またはその一部をプ
ローブとして用いて別の種からのｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングし、それにより第２の種の相同ＢＳＦ
−１遺伝子が単離される。

意図するＢＳＦ’−１遺伝子は適当な原核または真核細
胞系にクローニングして成熟ＢＳＦ’−１を発現させる
。その後、天然ＢＳＦ’−１’ｅｔ’ｌする際に使用し
たＨＰＬＣ法と同じ方法を用いて、組候えＢＳＦ−１を
均質になるまで精製する。

本発明はさらにコト″／の付加、置換または欠失により
野生型ＢＳＦ−１遺伝子の類似体を作製し、それにより
ＢＳＦ−１タンパク質産物の生物活性に実質的に影響を
及ぼすことなく１個またはそれ以上のアミノ酸残基が付
加、置換または欠失さ扛たＢＳＦ−１’に発現させるこ
とに関する。

本発明はまた発現されたタンパク質産物が実際にＢＳＦ
’−ｔであることを確かめるためのバイオアッセイ、な
らびに本発明方法の使用によ！７Ｍ製された天然および
組換えＢＳＦ″−１の均質性を定量するためのバイオア
ッセイに関する。精製操作中の全分画は同時にＢＳＦ’
−１、インターロイキン２（ＩＬ−２）　　およびイン
ターロイキン３　（工Ｌ−３）活性について監視され、
そして５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色法によシ分析され
る。

好ましくは、粗ＢＳＦ−１調製物はｉｎ　ｙｉｔｒｏで
ＢＳＦ−１を産生ずることが知られている細胞を血清含
有培地中で種々の添加物および活性化剤（例えば植物マ
イトジェンまたはホルボールエステル）の存在下に培養
することによってつくられる。適当な培養期間後に培地
を収穫し、　ＢＳＦ’−１をより濃縮された形へ精製す
べく処理する。

本発明によれば、正常Ｔ細胞および悪性腫瘍細胞を含め
た多種多様の細胞および細胞株が、粗ＢＳＦ−１の生産
のために利用し得る。呻瘍細胞株はいろいろな方法、例
えば自然発生、ウィルスによる形質転換または放射線照
射によって発生する。

本発明はネズミ悪性細胞株ＥＬ４を用いて有利に行われ
た。この細胞株は米国メリーランド州２０８５２、ロッ
クビル、パークローン上９ライブ１２３０１、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）　
　から入手可能である。ＥＬ４細胞は研究者の間に広く
行き渡っており、一般に多くの源から入手しうる。本発
明において使用される正常Ｔ細胞を含む組織の例には末
梢血液白血球、牌細胞、リンパ節細拘および胸腺または
扁桃腺細吻が含まれる。

前記の細胞株と共に、粗ＥＳＦ−１の生産のために用い
られる培地は例えばロスウェル・パーク・メモリアル・
インスチチュー）　（ＲＰＭＩ）−１６００培地、イー
グルの最少必須培地（ＭＥＭ）、　ダルベツコの修飾イ
ーグル培地（ＤＭＥＭ）　　およびクリソロス培地のよ
うな市販されている培地でありうる。

ＢＳＦ−１細胞の培養に用いられる血清はウシ胎児血清
（Ｆｅ２　）、正常ヒト血清および他の血清のような種
々の源から誘導される。ペニシリン、ストレプトマイシ
ンおよびゲンタマイシンのような各種の抗生物質を含め
た添加物も個々にまたは組合せで培地に添加されうる。

その他の添加物にはＨＥＰＥＳ緩衝剤（Ｎ−２−ヒトゝ
ロキシエチルピペラジンーＮ−２−エタン−スルホン酸
）のような種々の緩衝剤が含まれる。さらに別の添加物
には１−グルタミン、ＮａＨＣＯａおよび２−メルカプ
トエタノールが含まれる。

本発明においてＢＳＦ’−１分泌を誘発するために用い
られる好適な促進剤にはフイトヘマグルチニ７（ＰＨＡ
）、コンカナバリン−Ａ　（Ｃｏｎ−Ａ）およびアメリ
カヤマゴボウマイトジェンのような種々の植物マイトジ
ェン類が含まれる。さらにＰＭＡのようなホルボールエ
ステルも促進剤として使用し得る。

腫瘍細胞を培養してＢＳＦ’−１の分泌を誘発させる本
発明方法はいろいろな環境条件下で実施される。しかし
ながら、好ましくは培養物は約５〜１０％ＣＯ２／空気
の湿潤雰囲気巾約３５〜３８℃の温度範囲に保持される
。理想的には、培地のｐＨがわずかにアルカリ性条件（
約７．０〜７．４の範囲）に保たれるべきである。

腫瘍細胞の活性化剤による刺激によって放出されるＢＳ
Ｆ−１の量は時間とともに変化する。本発明者らは刺激
の約２４時間後にＢＳＦ−１発現が最適レベルに達する
ことを見出した。

検定−分析 産生されたＢＳＦ’−１を同定し、またこの因子の精製
方法を監視するために、いろいろな検定法が本発明にお
いて利用される。本発明で使用される第１のタイプの検
定法は、サブマイトジェン濃度の抗免疫グロブリンＭ（
抗１ｇＭ）（例えばヤギ、ウサギまだはラットの抗マウ
スエｇＭ）の存在下で精製Ｂ７ａｌｌＮの増殖を刺激す
る推定上のＢＳＦ’−１試料の能力を調べることにより
、ＢＳＦ−１の存在について試験するものである。この
検定法は例えば牌細胞（Ｔ細胞を除いたもの）から得ら
れる精製Ｂ細胞を使用する。上で述べたように、研究者
によってＢＳＦ−１の結果とみなされた１つの活性は、
サブマイトジェン濃度の技工ｇＭ　　の存在下で精製Ｂ
細胞の増殖を刺激する能力である。ハワードらの上記文
献およびファラーらの上記文献を参照されたい。本発明
者らは、本発明によって単離されたＢＳＦ−１が実際に
このような設定のもとて精製Ｂ細胞の増殖を誘発するこ
とを見出した。

本発明によって単離精製されたＢＳＦ−１はまたＩＬ−
２依存性Ｔ細胞の増殖を刺激するその能力について検定
した。ＩＬ−２は悪性細胞の破壊を含むいろいろな免疫
作用を行うＴ細胞の増殖を誘発するリンフ才力インであ
る。Ｔ細胞の増殖を誘発するその能力により、■Ｌ−２
はｉｎ　ＶｉｔｒＯおよびｉｎ　ｖｉｖｏ　　の両方で
正常免疫応答を増大させ且つ欠損免疫応答を回復させる
ことがわかっている。ＩＬ−２依存性細胞の増殖を誘発
するＢＳＦ’　−１の能力についての試験は、ＩＬ−２
が推定上のＥＳＦ’−１試料中に存在するかどうかおよ
びＢＳＦ’−１が’ｌ’　＋）ンパ球の増殖を促進する
能力をもつかどうかを確かめるという２重の目的にかな
っている。

ＩＬ−２増殖検定法はＣＴ６　　細胞またはギリス（Ｇ
ｔ　１１１　ｓ　）らのＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１
２０　：　２０２７（１９７８）に記載されるようなＣ
ＴＬＬ　　と呼ばれるネズミ細胞毒性ＴＲ１胞株を含め
た種々の工Ｌ−２依存性細胞株を用いて実施される。

本発明方法によって単離されて均質に精製されたＢＳＦ
’−１はＩＬ−２細胞増殖検定においてポジティブの評
価を得、このことはＢＳＦ″−１がＢ細胞系列のほかに
多数の細胞系列に作用し得ることを示している。

本発明のＢＳＦ−１’ｚ同定し且つＢＳＦ’−１の精製
を監視するために用いられる第２の検定法は、コロニー
刺激因子（Ｃ３Ｆ）依存性細胞、特に工Ｌ−３依存性細
胞の増殖を誘発するＢＳＦ’−１の能力を調べることを
伴う。ＩＬ−３は造血幹細胞から誘導される前駆細胞を
各種の成熟コロニー形成細胞（顆粒球およびマクロファ
ージを含む）へ分化させる能力をもつ多能性因子でちる
。レミック（Ｒｅｍｉｃｋ）らのＪ。

い。ＩＬ−３依存性細胞株の例には（１）　　レトロウ
ィルス感染Ｃ３Ｈ−ＨｅＪマウス骨髄培養物から誘導さ
れる３２Ｄ、グリーンバーガー（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅ
ｒ）らのＦｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４２　：　２７６２（
１９８３）’ｅ参照；および（２）ネズミ骨髄から誘導
されるＦ’ＤＣ−Ｐ２、Ｆ’ＰＣ−Ｐ２−１ａおよびｒ
ｐｃ−ｐ１細胞、デクスター（Ｄｅｘｔｅｒ）＝７４７
〜７５９（１９８３）全参照；が含まれる。

本発明方法によって単離されて均質に精製され九ＢＳＦ
−１は、３２ＤおよびＦ’ＤＣ−Ｐ２細飽増殖検定にお
いてポジティブの評価を得た。このことは本発明のＢＳ
Ｆ’−１がＣ３Ｆ（工Ｌ−３）依存性細胞の増殖を促進
し得ることを示している。この結果は。

ＩＬ−２依存性細胞株の増殖を直接刺激する本発明のＢ
ＳＦ’−１の上記能力と共に、ＢＳＦ’−１がＢ細胞系
列以外の標的細胞をもつ増殖因子であることを示してい
る。従って、ＢＳＦ−１はＢ細胞の増殖および成熟を調
節するほかに重要な作用を有するかも知れない。

ＢＳＦ’−１の手前製 本発明方法によって生産された組換えＢＳＦ−１および
天然ＢＳＦ−１は、吸着それに続くカチオンおよびアニ
オン交換クロマトグラフィーを含めた一連の技法により
、はぼ均質になるまで精製した。

その後、部分精製したＢＳＦ’−１は多段逆相高性能液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により均仙に精製し
た。それぞれの精製工程のあとに、ＢＳＦ’−１の存在
および純度を上記のバイオアッセイにより分析した。ま
た、精製工程からの生物学的に活性な分画を５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥおよび銀染色法により分析した。さらに、被検分
画中に存在する全タンパク質はズラッビフォートゝ（Ｂ
ｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質検定（カリフォルニア州す
ッチモント９．バイオラッド・ラボラトリーズ）を用い
て測定した。

ＢＳＦ’−１は初めに比較的不活性の極性吸着剤（例え
ばシリカまたはアルミナ）を用いる吸着法によって濃縮
される。吸着剤はいろいろな物理的形状１例えばゲルま
たはビーズ（球形または他の形）であり得る。好ましく
は、吸着剤はメチルシリル−シリカ材料から成り、理想
的にはトリメチルシリルーンリカ（ＴＭＳ−ノリ力）か
ら成る。

ＢＳＦ’−１は当分野でよく知られた方法で吸着カラム
から溶離される。適当な溶離剤にはアセトニトリルおよ
びＮ−プロパツールが含まれる。吸着カラムの溶出液は
、以下の実施例Ａで詳しく述べるＢ細ゆ増殖検定法を用
いてＢＳＦ−１活性について分析した。溶出液は回収タ
ンパク質１マイクログラム当たり約１００単位の活性レ
ベルのＢＳＦ−１活性をもつことが判明したが、出発粗
上清はＢＳＦ−１活性が約３単位／マイクログラム（Ｕ
／μ９）タンパク質であった。先に述べたように、全回
収タンパク質はプラッビフォードタンパク質検定を用い
て測定した。

本発明方法で使用するイオン交換クロマトグラフィー法
では、タン・ξり質の酸−塩基特性の関数であるタンパ
ク質の電荷の差に基づいてＢＳＦ’〜１を他のタンパク
質から分離した。上述のように、吸着カラムから溶離さ
れたＢＳＦ−１は順次カチオンおよびアニオン交換クロ
マトグラフィーを用いてさらに分画化した。カチオン交
俣クロマトグラフィー用の適当なカラム材料にはセルロ
ースの合成誘導体が含まれ、例えば中性ｐＨで陰電荷基
を含むカルボキシメチルセルロース（ＣＭ−セルロース
）である。ＣＭ−セルロースカラムは広く市販されてい
る。他の適当なカチオン交換カラム材料はスルホプロピ
ルセファデックスにュージャージー州ピスカタウェー、
ファーマシア・ファイン・ケミカルズ）である。カチオ
ン交換カラムに結合されたＢＳＦ−１は次第に増大する
イオン強度の直線状ＮａＣｅ勾配により溶離する。本発
明者らは、カチオン交換クロマトクラフィーを使用する
ことにより、ＢＳＦ−１の比活性が吸着カラムから回収
されたＢＳＦ−１の活性レベルの少なくとも５倍だけ増
加することを見出した。

カチオン交換クロマトグラフィー法からプールされた活
性分画はさらにアニオン変態クロマトグラフィーにより
精製する。この方法に適するカラム材料にはアミノエチ
ルセルロース誘導体１例えば第４アミノエチルセルロー
スまたはジエチルアミンエチルセルロース（ＤＥ　ＡＥ
−セルロース）カ含まれる。これらの型のアニオンクロ
マトグラフィーカラム材料は広く市販されている。アニ
オンカラムは、ＢＳＦ’−１含有試料をカラムに装填す
る前に、緩衝液で平衡化する。溶離は初めに出発緩衝液
を用いて行い、次に直線状ＮａＣ４勾配を用いて行う。

分画を集めて、上記のように分析する。

本発明者らは、アニオン交換クロマトグラフィーを使用
することにより、カチオン交換クロマトグラフィーカラ
ムから溶離されたＢＳＦ−１の精製が少なくとも５倍増
加することを見出した。

アニオン交換クロマトグラフィーカラムから溶離された
生物学的に活性な分画はプールして、さらに多段ＨＰＬ
Ｃ法により精製する。本発明方法において使用するＨＰ
ＬＣ工程は、好ましくはタンバク質系ＢＳＦ−１と共に
最適に使用される十分な大きさの孔サイズ（すなわち少
なくとも＋００　Ａの孔サイズ）をもつ逆相オクタデシ
ル結合シリカカラムを使用する。

本発明の実施において使用する適当な逆相ＨＰＬＣは市
販製品である。好適なカラムにはカリフォルニア州へス
にリア、セパレーションズーグループから市販されてい
るバイダック（Ｖｙｄａｃ）系カラム、またはメイン州
ミルフォートゝ、ウォーターズ・アンシェーツから市販
されているラジオパック（Ｒａｄｉｏｐａｋ）およびボ
ラシル（Ｐｏｒａｓｉｌ、）系のカラムが含まれる。好
適なカラム充填材料にはシリカゲルの表面に１例えばシ
ロキサン（珪素−酸素−珪素）結合によって、共有結合
されたオフタデシルシラン基が含まれる。

ＨＰＬＣカラムにＢＳＦ−１を装填する前に、予め部分
精製されたＢＳＦ−１調製物は適当な緩衝液、例えばト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、　ヘプタフルオロ酪酸（Ｈ
ＦＢＡ）および酢酸で平衡化する。ＨＰＬＣカラムから
のタンパク質の溶離は当分野でよく知られた方法で行わ
れる。オクタデシルカラムから結合タンパク質を除くた
めの適当な溶離法は直線状溶離勾配、例えばＴＦ’Ａ、
ＨＦ’ＢＡ　　または酢酸中のアセトニトリルまたはＮ
−プロパツール緩衝溶液の使用をともなう。溶離剤とし
てアセトニトリルを使用する場合、好適な勾配は１％Ｔ
ＦＡ　　中の０〜７０（ｖ／ｖ）％アセトニトリルから
成９．１分画たり約１％アセトニｌ−ＩＪルの速度で加
える。溶離剤がＮ−プロパツール緩衝溶液である場合、
好適な組成はＮ、Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（
Ｄ工ＥＡ−Ａｃ）中の４（１−６０（ｖ／ｖ　）％Ｎ−
プロパツールである。溶離剤は市販されている溶剤送出
装置、例えばベックマンモデル３４４（カリフォルニア
州アービン、−４ツクマン・インスツルメント）を用い
てカラムに添加する。

溶離されたタンパク質は当分野でよく知られた検出系を
用いて有利に監視しうる。例えば、スティン（Ｓｔｅｉ
ｎ）　　およびモスケラ（Ｍｏｓｃｈｅｒａ）のＭｅｔ
ｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　７８　：　４３５（１９８１
）に記載されるような自動螢光検出系が使用される。ま
た、ＨＰＬＣカラムから集められた分画の相対的タンパ
ク質濃度は、紫外線分光光度計を用いて２１４ナノメー
トルの波長で溶離された物質の吸光度を測定することに
より求めることができる。適当な自動紫外線吸光度検出
装置は市販製品であり、例えばウォーターズ・アソシェ
ーツおよびスウェーデン国ブロマ、ＬＫＢから市販され
ている。

回収されたＨＰＬＣ分画の生物学的活性は上記のバイオ
アッセイにより分析される。活性分画はまたゲル電気泳
動／銀染色法およびブラッドフォー１タンパク質検定法
によりそれぞれ活性レイルおよび全タンパク質量につい
て測定する。

十分なタンパク質の精製が最初のＨＰＬＣ法で達成され
ない場合は、同じカラムまたは別のカラムを使ってそれ
を繰り返すことができる。別のカラムは支持材料が異な
る組成または形状でありまた結合相物質が異なる化学的
組成である充填材料を使用しうる。さらに、溶離剤は同
一であっても異なっていてもよい。十分なタンバ２質精
製が第２のＨＰＬＣ法からも得られない場合は、ＢＳＦ
−１の均質性が達成されるように、さらにＨＰＬＣ法を
繰り返す。本発明者らは、最初のオクタデシルンランＨ
ＰＬＣカラムを直線状アセトニトリル勾配で溶離し、続
いて酢酸で平衡化した同じカラム全直線状Ｎ−プロパツ
ール勾配で溶離することにより。

ＢＳＦ−１は生物学的活性の単一対称ピークとして均質
に精製されることを見出した。第１図および第２図全参
照されたい。また第１図に示すように。

ＨＰＬＣで精製したＢＳＦ−１の５ＤＳ−ＰＡＧＥおよ
び銀染色は約１８４キロダルトンの分子量をもつＢＳＦ
’−１活性の単一バンドを固定した。この均質ＢＳＦ−
１の比活性は約３．２８　Ｘ　１０５Ｕ／μ９タンパク
質であるとわかった。

本発明のＢＳＦ’−１は均質に精製されるので、本発明
者らはこのタンパク質分子のＮ末端部分のアミノ酸配列
を決定することができた。この情報はＢＳＦ’−Ｉ　Ｍ
伝子のクローニングおよび臨床試験のための、最終的に
は広範囲の医療用途のための純粋な形のＢＳＦ−１の大
量生産に役立つ。さらに。

この均質ＢＳＦ−１の利用可能性は、同時に生産される
他のＢ細胞因子の汚染を免れて、その活性の正確な生物
学的研究を可能にするであろう。

従来技術は高度に精製されたＢＳＦ−１調製物を得たと
述べているが、このような調製物全本発明のＨＰＬＣ法
で出発物質として使用したとき、その物質はＢＳＦ’−
１活性と関連のない多数の別々のタンパク質ヒ０−夕に
分割されることがわかった。このような観察に基づくと
、この種の調製物は１５％以下の純度であり、いくつか
の場合には１％未満の純度でさえありうると考えられる
。

本発明の均質ＢＳＦ’−１試料は、例えばニンヒドリン
または気相検出のいずれかを使用する自動シークエンサ
ーを用いて、アミノ酸配列について分析される。この種
の装置は市販されている。例えば、それらは英国ケンブ
リッジのＬＫＢ　（モデル４１５０アルフア）またはア
プライドゝ・バイオシステムズ（モデル４７０Ａ　）か
ら入手しうる。本発明者らは本発明のネズミＢｓＦ”−
ｔのアミン末端部分の最初の加残基が次の配列：　Ｈｉ
ｓ−工１ｅ−Ｈ１θ−Ｇ１７−Ｃｙ　ｅ−Ａｓｐ−Ｌｙ
ｓ−Ａｓｎ−Ｈｌ　ｓ　−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−工
１ｅ−工１ｓ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｕ−Ｖａｌから成ることを見出した。

第５番目の残基はＣｙｓであると推定された。自動アミ
ノ酸配列決定法の第５サイクルにおいて。

他の残基はどれも高収率で得られなかった。このことは
第５番目の残基がＣｙθ（エドマン分解によっては肯定
的に検出されない）、グリコジル化トレオニンまたはグ
リコジル化セリン残基から成るという結論に導く。これ
らの後者の２つの可能性は、グルコサミ／またはガラク
トサミンがアミノ酸組成の分析から観察されなかったの
で排除された。これは第５番目の残基がＣｙｓであると
いう結論に導く。

ＢＳＦ’−１産生細胞からのＲＮＡの調製ＢＳＦ−１’
に産生しうる細胞からの全ＲＮＡ　は、チャーライ／（
Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）らの（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１８、　５２９４（１９７９）および’ｖ＝アチス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）らのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＣｌ０ｎ
ｉｎ、　　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　、
　　コールドゝ・スプリング・バーバー−ラボラトリ−
、コールド・スプリング・ハーバ−。

ニューヨーク（１９８２）に記載されるような標準方法
によって抽出される。本発明において使用される好適な
りＳＦ’−１産生細胞には上記のＥＬ４細胞が含まれる
。

よく知られているように、細胞からＲＮＡ　　ｉ抽出す
る場合、抽出の初期段階の間中リボヌクレアーゼ（ＲＮ
ａｓｅ）活性を最小限に抑えることが重要である。これ
を達成する１つの方法は、ＲＮａｓｅによるＲＮＡ　　
の加水分解速度を超える速度で、紙中タンパク質（ＲＮ
ａｓｅ　ｆ含む）を変性することである。

チャーウィンらの上記文献およびマニアチスらの上記文
献１９６に記載の方法では、これを行うために２−メル
カプトエタノール（タンノｅり質のジスルフィド結合を
切断する）のような還元剤と共にグアニジニウムチオシ
アネーＩｆ使用している。

ＲＮＡは例えばフェノール／クロロホルム抽出。

エタノール沈殿または塩化セシウムによる沈降のような
標準方法によりタンパク質から分離される。

また別法として、ＲＮＡはグアニジンＩ′８に酸塩によ
る抽出、その後のフェノール／クロロホルム抽出により
タンパク質から分離しうる。

次に、ポリＡ＋ｍＲＮＡ　　が抽出タンパク質から分離
される。この分離工程を行うためにいくつかの技法が開
発されたが、１つの好適な方法はエドモント？（Ｅｄｍ
ｏｎｄｓ）らのＰｒｏｃ；Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、　６８　：１３３６（１９７１）　；アビプ（Ａｖｉ
ｖ）およびレーダー１４０８（１９７２）　；およびマ
ニアチスらの上記文献１９７に記載されるように、ポリ
Ａ＋ｍＲＮＡ　　ｆオリゴ（ａＴ）セルロースによるク
ロマトグラフィーにかけることである。オリゴ（ａＴ）
セルロースカラムはローディング緩衝ｇ　（ｌｏａｄｉ
ｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）を用いて調製し１次いでｍＲＮＡ
ｆｔカラムに装填する。

その後、カラムは初めに緩衝溶液で洗浄して、ｔ−０１
ＪＡ不含のｍＲＮＡ　ｆ除き、次に緩衝化低イオン強度
溶離剤を用いてポリＡｍＲＮＡ１カラムから溶出する。

ポＩＪ　Ａ＋ｍＲＮＡの完全性はゲル電気泳動により証
明される。

その後、ポリＡ＋ｍ　ＲＮ　Ａはメチル水銀アガロース
による電気泳動で分画化する。異なる大きさのｍＲＮＡ
に対応するゲル分画は、パルミター２０９５（１９７３
）　；ペルハＡ　（Ｐｅｌｈａｍ）およびジャクソン（
Ｊａｃｋｓｏｎ）のＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　６７　：２４６（１９７６）　；およびリー（Ｌｅｅ
）らのＪ、Ｂｉｏｘ。

Ｃｈｅｍ、　２５３　：　３４９４（１９７Ｂ）に記載
されるような標準ウサギ網状赤血球溶解液法を用いて、
１ｎＶｉｔｒＯで翻訳される。ウサギ網状赤血球検定用
のキットはメリーランド州ガイサースバーグ、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズまたはマサチューセッツ州
ホストン、ニューイングランド９・ヌクレアーのような
多くの源から市販されている。

また、ｍＲＮＡの翻訳は、ストマ（Ｓｔｏｍａ）らのＭ
ｅ　ｔｈ。

Ｅｎｚｙｍ、　７９　：　６８（１９８１）に記載され
るような標準技術を用いて、アフリカッメガエル（Ｘｅ
ｎｏｐｕｓｌａｓｖｉｓ　；　Ｘ、　１ａｅｖｉｓ）の
卵母細飽内へのｍＲＮＡの微量注射により実施される。

その後　網状赤血球溶解液翻訳またはｍＲＮＡ微量注射
卵母細飽から遊離された液体は、以下で詳しく述べる上
記の検定法を用いて、ＢＳＦ’−１活性の存在について
試験する。ｉｎ　ｖｉｔｒｏで翻訳させたときにＢＳＦ
’−１活性を示したｍＲＮＡゲル分画を、ｃＤＮＡ作製
のためのｍＲＮＡ源として選択する。

ｍ　ＲＮ　ＡからのｃＤＮＡの作製 ｍＲＮＡに対応する２本領ｃＤＮＡのライブラリーは逆
転写酵素を使用する既知方法によって作製される。本発
明にかいて使用しつる１つのこのような方法はマニアチ
スらの上記文献２３０に詳述されているが、それはガプ
ラー（Ｇｕｂｌθｒ）およびホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ
）のＧｅｎｅ　２５　：　２６：３〜２６９（１９８３
）により変更された。簡単に説明すると、ポリ酎ｍＲＮ
Ａは第１のｃＤＮＡ鎖のためのプライマーとしてｍＲＮ
ＡのボＩＪ　Ａ化尾部にハイブリダイズさせたオリゴ（
ｄＴ）ｅ使用することにより逆転写される。

第２ｃＤＮＡ４１はＤＮＡポリメラーゼエ、ＲＮａｓｅ
　Ｈおよび大腸菌Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼの諸酵素全用
いて合成する。この方法は初めのｃＤＮＡ鎖の３′末端
に形成されるヘアピンループの８１スクレアーゼ媒介切
断を排除するものであるが、マニアチスらの標準ｃＤＮ
Ａ合成法を単に使用する場合は前記の切断を必要とする
であろう。２零個ｃＤＮＡは慣用方法で分画化して比較
的短い鎖を除き、それにより小さいｃＤＮＡ分画の不必
要なりローニングテ膳ける。

本発明によれば、別のＦ　準方法全使用することによっ
てもｍＲＮＡから２本領ｃＤＮＡｉ作製し得ると理解す
べきである。１つのこのような別法はランド（Ｌａ　ｎ
ｄ　）らのＮｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９　：　
２２５１（１９８１）に開示されている。ラント９らの
方法では、ヘアピンループを第２　ＣＤＮＡ鎖のだめの
プライマーとして使用しない。むしろ、第１ｃＤＮＡ１
ｉの３′末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼ（ＴａＴ）ｋ用いてａＣＭＰ残基が付加
される。これはポリＣ残基の３′尾部をもたらす。

その後、第２鎖の合成がその３′尾部にハイブリダイズ
されたオリゴｄＧによって開始される。この技法は、マ
ニアチスらの方法のようなヘアピンが８１ヌクレアーゼ
によって切断される場合に起こりうる芭２ｃＤＮＡ５Ｊ
ｊの５′尾部の欠（ｉ部分金貸けるのに役立つと言われ
ている。

次に、２本領ｃＤＮＡｉクローニングベクター内に挿入
し、それを用いてベクター複製に適する原核生物または
真核生物宿主を形質転換する。その後、形質転換体を同
定して、その形質転換体からプラスミドＤＮＡ全調製す
る。

本発明全実施するために、種すのクローニングベクター
が使用される。好適なものはプラスミド８であるが、ベ
クターはバクテリオファージまたはコスミト９であって
もよい。クローニングを呻乳動物細吻内でおこなう場合
は、ウィルスもベクターとして使用できる。

プラスミドヲ使用する場合、それは天然諒または人工的
に合成されたものから得ることができる。

選ばれる特定プラスミドは、それが大腸菌や酵母のよう
な細菌であろうと他の単細胞微生物であろうと、意図す
る形質転換宿主と適合すべきである。

プラスミドは使用される特定宿主細胞のだめの適当な複
製起点をもつべきである。また、プラスミドは形質転換
された宿主細胞を容易に同定して、形質転換を受けてい
ない、？（！ｌｌ泡から分離することができるようにす
る表現型特性をもつべきである。

このような表現型特性には増殖抑制物質（例えば抗生物
質）に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。種々の
抗生物儂（テトラサイクリン、ストレプトマイシン、サ
ルファ剤、ペニシリンおよびアンピシリンを含む）に対
する耐性遺伝子をコードするプラスミドは市販されてい
る。

大腸菌を宿主細胞として使用する場合は１本発明におい
て使用し得る多くの適当なりローニングプラスミドが市
販されている。本発明を実施する上で好適なプラスミド
はｐＢＲ３２２でｊ、る。このプラスミドゝはサトクリ
フ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ）　のＣ０１ｄ７７Ｃ１９７９
）に記載されるように完全に塩基配列が決定されている
。このプラスミドの顕著な利点は、それが１１個の既知
のユニークな制限部位（アンピノリン耐性遺伝子中のＰ
ｓｔ工部工部台む）をもつということである。この特徴
はホモポリマー付加法によるクローニングにとりわけ有
用である。

プラスミド９の代わりにバクテリオファージを使用する
場合、このようなファージもプラスミドの選択について
先に述べた特性と実質的に同じ特性をもつべきである。

これには表現型マーカーの存在および外来遺伝子を挿入
するだめの連結可能な末端が含まれる。

本発明では、好ましくは、平滑末端をもつ２重鎖ｃＤＮ
Ａがホモポリマー付加法によりプラスミドベクター内に
挿入される。当分針でよく知られているように、この技
術においては、相補的ホモポリマートラックがｃＤＮＡ
鎖およびプラスミド？ＤＮＡに付加される。その後、ベ
クターおよび２重鎖ｃＤＮＡは相補的ホモポリマー尾部
間の水素結合によって一緒に連結され、それにより大腸
菌のような宿主細胞を形質転換しうる開環状ハイプリン
ト分子が形成される。

１つのホモポリマー付加法では、約５０〜１５０　ｄＡ
ヌクレオチド残基が線状プラスミ）’ＤＮＡの３′末端
に付加される。同じ数のａＴヌクレオチド残基が２重鎖
ｃＤＮＡの３′末端に付加され、その後ｃＤＮＡとプラ
スミドベクー緒に連結する。

別の好適な方法では、６０尾部が適当な制限酵素で切断
されたクローニングベクターの３′末端に付加される。

例えばｐＢＲ３２２プラスミドヲ使用する場合は、制限
酵素ＰｓｔＩｉ使用してアンピシリン耐性遺伝子のとこ
ろでこのプラスミドベクターしうる。相補的６０尾部が
２重鎖ｃＤＮＡの３′末端に付加され、その後そのｃＤ
ＮＡセグメントヲ適当なアニーリング緩衝液を用いてプ
ラスミド内に挿入する。

２重鎖ｃＤＮＡは他のいろいろな標準方法によりプラス
ミドクローニングベクター内に挿入しうると理解すべき
である。１つのこのような別法は。

ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ鎖の末端にＤ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを使
って合成ヌクレオチドリンカーを結合させることを伴う
。リンカ−は制限酵素で切断すると、同じ制限酵素で切
断したプラスミド内への挿入のだめの接着末端を形成す
る。シェラ−（Ｓｃｈｅｌｌｅｒ）らの５ｃｉｅｎｃｅ
１９６　：　１７７〜１８０（１９７７）　　；マニア
チスらの上記文献２１９を参照されたい。

上記のようにして作製した組換えＤＮＡプラスミドは宿
主細胞を形質転換するために使用される。

宿主は原核または真核細胞のいずれであってもよいが、
好ましくは大腸菌や酵母菌株のような明確に定められた
細菌である。この種の宿主は容易に形質転換されて、培
養下で急速に増殖することができる。サルモネラ菌や肺
炎球菌のような他の種類の細菌を大腸菌の代わりに使用
してもよい。細菌の代わりに、真菌や藻類のような他の
単細胞微生物も使用し得る。どのような宿主が選ばれよ
うと、それは組換えプラスミドを切断する制限酵素を含
むべきでない。

大腸菌を宿主として使用する場合、好適な菌株はＭ　Ｍ
　２９４およびＲＲＩ　　である。Ｍ　Ｍ　２９４宿主
をプラスミドベクターで形質転換する方法は、マニアチ
スらの上記文献２５５およびハナノ・ン（Ｈａｎａｈａ
ｎ）のＪ、ＭＯｌ、　Ｂｉｏｌ、　１６６　：　５５７
（１９８３）に記載されるようによく知られている。Ｒ
ＲＩ宿主をプラスミド９ベクターで形質転換する方法も
、ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）らのＧｅｎｅ　２　：　
９５（１９７７）およびピーＡｃｔａ、　６５５　：　
２４３（１９８１）に記載されるようによく知られてい
る。適当な宿主として役立つ大腸菌の他の菌株にはＤＨ
１（ＡＴＣＣ３３８４９）およびＣ６００が含まれる。

これらの菌株およびＭ　Ｍ　２９４およびＲＲＩ菌株は
広く商業的に入手可能である。

マニアチスらおよびノ・ナノ・ンの上記文献に記載のも
のを含めた形質転換法では、細胞によるプラスミドの取
込みが制限されるために、はんの少しの宿主細胞が実際
に形質転換されるにすぎない。

形質転換された細胞は、適当な増殖培地および表現型同
定剤（例えば抗生物質）ヲ含む寒天平板上でその細胞を
培養することによって同定される。

ｊ竜当′な耐性遺伝子（例えば抗生物質耐性）を含む細
胞のみが生き残るであろう。組換えｐＢＲ３２２プラス
ミドを使用して大腸菌株Ｍ　Ｍ　２９４を形質転換する
場合は、表現型同定剤としてテトラサイクリンを使用す
ることにより形質転換細０が同定される。

見 上記のようにして作製されたｃＤＮＡライブラリー４−
スクリーニングするためのプローブとじて、放射性標識
オリゴヌクレオチドゝが合成される。このプローブは先
に決定されたＢＳＦ’−１分子のアミノ酸配列の一部に
対応する。合成オリゴヌクレオチドプローグとクローン
のライブラリーから調製されたプラスミドｃＤＮＡとの
ノ・イブリダイゼーションは、オートラジオグラフィー
によって確認される。

１つの好適な組成として、オリゴヌクレオチドプローグ
はＢＳＦ’−１の最初の９個のアミノ酸：すなわちＨｉ
ｓ−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｌｙｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
−Ａｓｎ−Ｈｉｓの領域に及ぶ。より詳細には、このク
ローンはＢＳＦ−１の最初の９アミノ酸に対応するアン
チセンス配列から成る。遺伝暗号の縮重ゆえに、クロー
ンとして選ばれたＢＳＦ’−１分子の領域のアミノ酸配
列に対応しうる核酸配列に相当する異なる組成のクロー
ンが作られる。理想的には、オリゴヌクレオチドプロー
グはＢＳＦ−１遺伝子のクローンとして有用であるのに
十分な情報を含む長さであるが、比較的容易に合成でき
る長さであるべきである。

上記のオリゴヌクレオチドゝ配列は本発明の合成クロー
ンの好適な組成を構成するが、　ＢＳＦ’−１分子の別
のアミノ酸配列に対応する他の組成のプローブも本発明
の精神または範囲から逸脱することなく使用しうると理
解すべきである。

−合成オリゴヌクレオチド９プローブはホスホジエステ
ルまたはトリエステル法のような公知技術を用いて容易
に化学的に合成される。トリエステル合成法の詳細は例
えばソード（Ｓｏｏｄ）らのＩ’Ｊ’ｕ　ｃ　１゜Ａｃ
１ａ　Ｒｅｓ、　４　：　２５５７（１９７７）および
ヒロセ（Ｈｉｒｏｓｅ）らのＴｅｔ、　Ｌｅｔｔ、　２
８　＋　２４４９（１９７８）に記載されている。合成
後、オリゴヌクレオチドプローグはＴ４ボリヌクレオチ
ビキナーゼおよび３２Ｐ−ＡＴＰにより標識する。標識
化法の標準技法はマニアチスらの上記文献１２２に記載
されている。

有利には、オリゴヌクレオチドプローブはＯＨ５／末端
をもつように合成され、それにより一般に必要とされる
ホスファターゼ処理を避ける。

ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング本発明のスクリ
ーニング法では、初めに形質転換細胞が比較的大きいグ
ループ（各グループは数十個の形質転換細胞から成る）
にプールされる。

複製プラスミド５をアルカリ溶解のような公知方法のい
ずれかを用いて形質転換体から抽出する。プラスミドＤ
ＮＡは抽出プラスミドを適当な制限酵素で切断すること
により調製する。得られたＤＮＡセグメント全アガロー
スゲル電気泳動により分画化し、その後サザｙ　（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ）のＪｏＭｏｌ。Ｂｉｏｌ。

９８　：　５０３（１９７５）に記載されるサザンプロ
ノト法により直接分析する。サザンブロソト法によりニ
トロセルロースフィルターに固定したＤＮＡフラグメン
トは、標識オリゴヌクレオチドプローグとハイブリダイ
ズさせる。プローブとハイブリダイズした特定ＤＮＡフ
ラグメントはオートラジオグラフィーにより確認される
。

オートラジオグラフィー中に強いバンドヲ示したクロー
ンの推定上のプールは形質転換細胞のより小さいグルー
プに分け、その後オリゴヌクレオチドプローグを使用す
る上記のスクリーニング法を繰り返す。クローンの推定
上のプールを再分割して形質転換細胞をスクリーニング
するこの方法は、個々の陽性コロニーが同定されるまで
繰り返される。その後、同定された特定陽性コロニーか
らプラスミ）”ＤＮＡ１調製し、そして核酸配列決定に
付す。

また、直接コロニーハイブリダイゼーション（ハイブリ
ッド選択法）を使用してＢＳＦ’−１の単一クローンを
単離することもできる。この公知方法はダルンスタイン
（Ｇｒｕｎａｔｅｉｎ）　　およびホダネ（ＵＳＡ）　
７２　：　３９６１（１９７５）に記載されている。

ハイブリッド選択去では、個々の形η転換ａｉ胞がスク
リーニングのために選ばれる。を質転換細胞を液体培養
基中で増殖させ、その後、アルカリ溶解のような公知技
術のいずれかを用いて形質転換細胞から複製プラスミド
ヲ抽出する。プラスミドＤＮＡは社製プラスミド中のユ
ニークな制限部位でそのプラスミドヲ切断することによ
り調製する。

得うれた線状ＤＮＡセグメントをニトロセルロースへ移
行させる。プラスミ）’ＤＮＡＩニトロセルロース上に
固定して遊離のＤＮＡを除いた後、フィルターに固定さ
れたＤＮＡ１上記のようにして調製した全（ＢＳＦ’−
１活性）ｍＲＮＡ　　とハイブリダイズさせる。ハイブ
リダイゼーション後、未結合ＲＮＡ１フィルターから除
去する。その後、結合ハイズリノドの選択されたｍＲＮ
Ａ　　ｆ溶離して、先に詳述したウサギ網状赤血球溶解
液またはアフリカッメガエル卵母細胞の技法を用いてｉ
ｎ　ＶｉｔｒＯで翻訳させる。その後、網状赤血球溶解
液翻訳またはｍＲＮＡ微量注射卵母細胞から遊離された
液体は、上記のバイオアッセイを用いてＢＳＦ−１の存
在について試験する。

上記方法によって、本発明者らは１つの陽性コロニーを
発見した。ＭｕｓＩＬ−４と名づけたプラスミドＤＮＡ
は単離・同定されたその陽性コロニーから得られた。そ
の後、ＭｕｓＩＬ−４クローンは“スクリーニングされ
たｃＤＮＡの性状決定１のところで後述する方法を用い
てヌクレオチドゝの塩基配列決定により同定した。Ｍｕ
ｓＩＬ−４クローンのＤＮＡ配列は第４図に示され、こ
れはネズミＢＳＦ−１遺伝子のＤＮＡ組成を示すもので
ある。第４図に示すＭｕｓＩＬ−４クローンはＢＳＦ’
−１遺伝子の５′および３′隣接領域部分を含む。

の作製 上記のネズミＣＤＮＡ　またはその比較的大きい部分は
、他の動物種（例えばヒト、ウシ、ヒツジまたはブタ）
からＢＳＦ−１遺伝子を単離するためのクローンとして
使用される。１つの例として（限定するものではない）
、ネズミｃＤＮＡプローズは第４図に示すように、ネズ
ミＢＳＦ−１遺伝子のコード領域の５′末端に近接した
Ｒｓａ　Ｉ　　部位（核酸番号６７）から、その遺伝子
のコード領域の３′末端に近接したＲｓａ　工部位（核
酸番号４４０）まで、延びるｃＤＮＡフラグメントから
成る。この比較的大きいサイズのプローグは、ネズミｃ
ＤＮＡプローズが他の動物種のｃＤＮＡライブラリー中
に存在する相同ＢＳＦ”−１遺伝子とハイブリダイズす
る可能性を実質的に増大させる。第４図に示すネズミｃ
ＤＮＡフラグメントのヌクレオチビ配列の他の部分に対
応するプローグも１本発明の精神または範囲から逸脱す
ることなく使用し得ることを理解すべきである。

ネズミｃＤＮＡプローブは、他の動物種のｃＤＮＡライ
ブラリープールとハイブリダイズさせる前に放射性標識
される。比較的大きいサイズのクローンであるために、
いろいろな標識方法が使用しうるが、好ましくはプロー
ブは１ニンクトランスレーシヨン１により標識される。

リグビー（Ｒｌｇｂｙ）ｆ−）ノＪ、　）Ａｏｌ、　　
Ｂｉｏ、　　１１３　：　２３７（１９７７）およびマ
ニアチスらの上記文献１０８に論じられるような公知方
法では、ＤＮａａｅＩ　　による非常に制限された処理
によりＤＮＡのかなり離れた部位にニックが導入され、
それによって各ニックは遊離の３′−ＯＨ基をもつよう
になる。ＤＮＡ４リメラーゼ工を使用して３’−ＯＨ末
端に適当な放射性標識デオキシヌクレオチド９三リン酸
（３２Ｐ−ｄＮＴＰ）ｉ取り込ませ、同時にニックの５
′側のヌクレオチドヲ取り除いて、ＤＮＡに沿ってニッ
クを逐次移動させる。

ｃＤＮＡライブラリーは先に説明した方法？用いてｍＲ
ＮＡから作製される。これらの他の押のｍＲＮ　ＡはＢ
ＳＢ’−１ｋ産生ずることが知られている源から抽出さ
れる。例えば、ヒトの場合はマイトジェンで刺激したヒ
トＴ細１泡からライズラリ−を作製しうる。ヒト細胞か
らのｍＲＮＡは上記のような標準方法によっ′て抽出し
、その後ボＩＪ　Ａ＋ｍＲＮＡを例えばオリ：＋’（ａ
Ｔ）セルロースのクロマトグラフィーにより抽出タンパ
ク質から分離する。ヒトｍＲＮＡに対応する２本領ｃＤ
ＮＡのライブラリー（１、上記の方法音用いて作製する
。その後ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーがサチンプロット
法および／またはコロニー・・イブリダイゼーション法
により放射性標識子ズミｃＤＮＡプローブを用いてスク
リーニングされる。この方法により、上記のネズミＢｓ
Ｆ−１遺伝子に対して十分な相同性を示してネズミｃＤ
ＮＡプローブと・・イブリダイズする他の動物種のＢＳ
Ｆ’−１遺伝子を単離することが可能である。

ネズミ、ヒ）または他の源から上記のようにして作製さ
れたプラスミドゝｃＤＮＡはそのＤＮＡの核酸配列、特
にその中に含まれるＢＳＦ−１遺伝子の塩基配列を調べ
るために分析される。プラスミドＤＮＡの塩基配列を決
定する１つの公知方法は、初めにサンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　　７０　：　５４６
３（１９７７）に発表されたチェイン−ターミネーショ
ン法である。また、米国特許第４３２２４９９号を参照
されたい。チェイン−ターミネーション塩基配列決定法
はＭ１３クャムハ７　）’ズック（Ａｍｅｒｓｈａｍ　
Ｈａｎａｂｏｏｋ）　、　　ズレンハイム・クレセント
、ロンドン（１９８３）　　ｌＬ後１アマーシャムハン
ビプノク“と呼ぶ）；メッ７２、４３〜４８（１９７９
）　；フラング−（Ｈｏｒｒａｎｄｅｒ）らのＧｅｎｅ
　２６　：　１０１（１９８３）　；　セＶッチ（Ｃｅ
ｒｒｅｔｔｉ　）る。Ｍ１３線維状ファージは対象のＤ
ＮＡ配列をクローニングするためのベクターとして使用
される。

これらのファージベクターはチェイン−ターミネーショ
ン法によって容易に塩基配列が決定される１本領ＤＮＡ
テンブレーＩｆ与える。チェイン−ターミネーション法
は１本鎖テンプレート分子に遊離３′−ヒト９０キシル
基をもつ短いプライマー鎖をアニーリングし、次にＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｋ１ｅｎｏｗフラグメント）ヲ用いて
４種類すべてのデオキシリボヌクレオチド三リン酸：す
なわちａＡＴＰ、ａＣＴＰ、　　ａＧＴＰおよびａＴＴ
Ｐ　（集合的に”ａＮＴＰ“　と記す）（ａＮＴＰ　　
のうち１種は放射性標識される）の存在下に鎖伸長反応
でテンプレート鎖全コピーすることを包含する。この合
成反応において、３′ヒドロキシル末端を欠くヌクレオ
チドゝ特異的チェインターミネータ−１例えば２′。

３′−ジデオキ７ヌクレオチド三リン酸（ａａＮＴＰ）
を使用すると、一連の鎖長の異なるＤＮＡ分子が合成さ
れる。このターミネータ−は伸長しつつあるＤＮＡ鎖に
取り込まれるように通常の５′末端をもつが、３′ヒド
ロキシル末端を欠いている。ひとたびターミネータ−が
ＤＮＡ鎖に組み込まれると。

もはやデオキシヌクレオチビ三リン酸は付加されず、こ
うして鎖伸長が停止する。４種類のヌクレオチＦ−″’
ａＮＴＰ　：すなわちａＡＴＰ、ａＣＴＰ、ａＧＴＰお
よびａＴＴＰのうち１種類のｄｄＮＴＰ′ｆｔ含む４つ
の別個の合成反応が実施される。ａＮＴＰのうち１種類
は放射性標識され、従って合成釦はポリアクリルアミド
ゝゲルでの分画化の後オートラジオグラフィーにかける
ことができる。４つの反応からの鎖伸長ＤＮＡ分子は別
々のダルレーンに並置する。

こうして、オートラジオグラフィーからのフラグメント
のパターンはクローン化ＤＮＡの核酸配列に一致する。

第４図は上記のＭｕｓＩＬ−４プラスミドＤＮＡ中に含
まれるネズミＢＳＦ’−１遺伝子のヌクレオチドゝ配列
を示し、ヌクレオチドは５′末端の最初から番号が付け
られる。遺伝子の対応するアミノ酸組成もまた第４図に
示され、アミノ酸残基はヌクレオチ）／％、１７のＭｅ
ｔ残基の最初から番号が付けられる。

本発明者らは、成熟タン・ξり質が／１６２１のＨｉｓ
残基（ヌクレオチドゝ腐１５４）から始まって７Ｍ、１
４０のＳｅｒ残基（ヌクレオチドゝ、％　４３６）まで
延びていると考える。

塩基配列決定法の準備のために、ＤＮＡ挿入物を含むプ
ラスミド”ＤＮＡはＭ１３フ了−ジばフタ−にサメクロ
ーニングして１本鎖ＤＮＡテンプレートを作る。共通の
プライマーを使用してセンス鎖およびアンチセンス鎖の
ｈ糸配列全決定する。１回のチェイン−ターミネーショ
ン法による全長フラグメントの塩基配列決定から得られ
た結果全信頼するよりもむしろ、別の合成プライマーを
使用してサブクローン化ＤＮＡフラグメントの長さに沿
った中間位置からチェインーターミネーンヨン法全開始
する。合成プライマーの組成は共通プライマーを用いて
得られた塩基配列情報に基づいていた。この方法によっ
て、サブクローン化ＤＮＡフラグメントの両鎖は部分的
に重複する形で塩基配列が決定され、それによりその塩
基配列を重複して確認するのに役立つ。

上に概説したチェイン−ターミネーション法金使用する
よりもむしろ他の既知方法を使用して、本発明の精神ま
たは範囲から逸脱することなくクローン化つシｃＤＮＡ
挿入物の塩基配列を決定し得ると理解すべきである。例
えば、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　５ｃｉ（ＵＳＡ）　　７４　：　５６０（
１９７７）　　に記、成されるようなマクサム（Ｍａｘ
ａｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）　　の化学
的分解法を使用することができる。

ｃＤＮＡクローンからの機能的ＢＳＦ’−１の発現プラ
スミ）”Ｍｕ日ＩＬ−４中に含まれるＢＳＦ’−１遺伝
子のｃＤＮＡコートゝ領域が機能的ＢＳＦ’−１’ｉミ
ーコードするかどうかを調べるために、その遺伝子は酵
母発現系において発現させる。その後、得られた発現産
物２ＢＳＦ−１活性を示すその能力について試験する。

実施例Ａを参照されたい。

酵母発現系では、実質的にＢＳＦ’−１遺伝子の全コー
ド領域から成るｃＤＮＡフラグメントが、酵母宿主細胞
からの成熟ＢＳＦ’−］の直接的合成および分泌のため
に考案された発現ベクター（第５図参照）内に挿入され
る。その発現ベクター（例えばはクレーｐＹ（Ｉｆ　Ｂ
ＳＦ　−１）は好ましくは複製起点およびアンピシリン
耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）　ｋ含むプラスミ）ｐＢＲ３２
２由来の配列（第５図の太線部分）を含有する。また、
好ましくは発現ベクターは酵母由来の配列、例えば選択
マーカーとしてのトリプトファン−１遺伝子（Ｔｒｐ−
１）および２μ酵母複製起点（第５図の細線部分）を含
む。理想的には、発現にクレーはさらに酵母宿主内での
ＢＳＦ’−１の合成計よび分泌をつかさどるリーダー配
列と共に有効なプロモーターとしての酵母α因子（例え
ば第５図の点描ボックス部分）、そのあとに続＜ＢＳＦ
’−１コード領域の配列（開放ボックス部分）全含む。

α因子遺伝子の構造はカージャン（Ｋｕｒｊａｎ）およ
びハースコビッ７　（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）のＣ８１
１３０：　９３３〜９４３（１９８２）に論じられてい
る。

当な菌株を形質転換する。好適な菌株には酵母菌株７９
、Ｘ２１８１−　ＩＢ、　ＤＢＹ７４６、ＹＮＮ２８２
．２０Ｂ−１２が含まれるが、これらに限定されない。

これらの菌株はすべてα因子プロモーターとの適合性の
ために、およびＴｒｐ＋形質転換細胞の選択のためにα
、Ｔｒｐ　ｌである。これらの菌株はすべて広く入手可
能であり、例えば菌株７９はカリフォルニア州９４７０
２　、バークレー、カリフォルニア大学、生物物理・医
学物理部、イースト・ジェネテテイノク・ストック・セ
ンター（Ｙｓａｓｔ　ＧθｎｅｔｉＣ８ｔｏｃｋ　Ｃｅ
ｎｔｅｒ）から入手しうる。

ＢＳＦ’−１遺伝子を含む組換え発現プラスミドによる
酵母宿主の形質転換は公知方法（スフェロプラストヲ形
成し、その後プラスミドの取込みに先立って洗浄する）
に従って実施される。この方法のだめの標準的な実験手
段は確立されている。べ（１９７８）およびヒネ７　（
ＨＬｎｎｅｎ）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　５ｃｉ（ＵＳＡ）　　７５　：　１９２９
（１９７８）ｋ参照されたい。

組換えＢＳＦ−１は先に論じたものと同じＨＰＬＣ法を
用いて酵母培養上清から精製され、次いで精製された組
換え産物は活性化ネズミＢ細胞の増殖を支持するその能
力により生物学的活性について検定される。ＢＳＦ−１
活性検定の詳細は実施例Ａで説明する。この検定におい
て、酵母上清は比較的高レイルのＢＳＦ’−１活性を示
すことがわかった。

対照として、その発現プラスミドと同じ構成であるがＢ
ＳＦ’−１配列を欠くプラスミドヲ用いて酵母宿主を形
質転換した。検定の際に、この対照プラスミドから誘導
された上清からは生物学的活性が全く検出されなかった
。

本発明はまたＢＳＦ−１の野生型遺伝子をコドンの付加
、コドンの置換またはコトゝンの欠失によって変更する
ことによるＢＳＦ−１類似体の作製全包含する。ＢＳＦ
−１遺伝子類似体を作製する１つの理由は、成熟ＢＳＦ
−１の発現を天然型遺伝子金側って得られるレベルより
も増大させることである。

例えば、本発明者ならびに共同研究者は、いくつかの酵
母発現系において産生されるタンパク質産物のレベルが
２つの塩基性アミノ酸残基、すなわちタンパク質産物の
アミノ酸配列に沿って位置づけられた２個の隣接塩基性
アミノ酸残基、の存在によって制限されるということ全
発見した。この場合に、タンパク質の発現レベルの増加
は、塩基性アミノ酸をコードするコドンを取り換えて多
重塩基性アミノ酸を排除するか、あるいは塩基性アミノ
酸をコードするコト９ンを欠失させて多重塩基性アミノ
酸の存在を排除することにより、野生型遺伝子を変換す
ることによって達成される。コドンの付加、置換または
欠失方法は米国特許出願第７６３１３０号に記載されて
おり、この特許出願は参照によりここに引用される。

ＢＳＦ’−１類似体は上で説明した同じ酵母発現系を使
用することにより変換ＢＳＦ’−１遺伝子から発現され
る。得られたタンパク質産物は野生型遺伝子に関して先
に述べた同じ方法で精製される。また、精製されたタン
・ξり質産物は野生型遺伝子に関して先に説明し且つ以
下の実施例Ａで詳述するようにＢＳＦ−１活性について
検定して、ＢＳＦ’−１類似体の活性が野生型ＢＳＦ−
１遺伝子によって発現された組換え産物と同じであるこ
とを確かめる。

本発明の方法および産物はさらに、本発明で使用される
・特定方法のアルファベットで表示した実施例および番
号を付した実施例によってホされる。

以下の実施例は単に代表例であり、それらは本発明を例
示するために、あるいは本発明の利用に際して当業者を
助けるために提供される。これらの実施例はいずれにし
ても本発明の範囲または特許証によって許可される保泗
の範囲を制限するものではない。

（実施例） 実施例Ａ この検定では、サブマイトジェン濃度の抗免疫グロブリ
ンの存在下でＢ細胞の増殖全刺激する本発明のＢＳＦ−
１の能力をＷかめた。この検定は自然界でＢＳＦ’−１
を産生ずる細胞型および組換えＢＳＦ’−１を発現する
形質転換宿主細胞の培養上清中のＢＳＦ−１の存在につ
いて試験するために使用された。この検定はまた本発明
のＢＳＦ−１精製法を監視するために使用された。

この検定では、生後８〜１２週目の雌Ｃ５７Ｂ１／６　
Ｊ　マウ、ｔ、　（Ｍ　Ｅ　、バーハーバ−、ジャクタ
ンラボラトリー）に、腹水調製物としての３０　Ｈ１２
ラツト抗マウスＴｈｙＩモノクロ一ナル抗体０．２ｍｇ
　ｋ腹腔内注射することによって、精製Ｂ細胞を調製し
た。このモノクローナル抗体を産生ずる細胞株はＡＴＣ
Ｃから寄託番号Ｔ　Ｉ　Ｂ　１０７のもとに入手可能で
ある。３日後、マウスの牌＠を摘出し、３０　Ｈ１２モ
ノクロ一ナル抗体（腹水の１　：　１０００希釈物）、
ＧＫＩ、５　ラット抗マウスＬ３Ｔ４モノクローナル抗
体（ＡＴＣＣ寄託番号ＴｌＢ２０７）（腹水のに５００
希釈物）、ウサギ抗マウス胸腺細胞血清（肝臓および骨
髄により吸収されたもの）　（１：　１０００希釈物）
およびウサギ補体（１：　１０希釈物、アガロースによ
シ吸収されたもの）（ＡＲ，ロガース、はル・フリーズ
・バイオメデカルズ）の？見合ｉでｉｎ　ｖｉｔｒｏに
処理し２．それによりｆｌｌ　ＨＢ胞からＴ細胞を除い
た。その後、Ｔ細胞欠除牌細ヴはゲル濾過クロマトグラ
フィー（セファデックスＧ−１０分離樹脂、ファーマシ
ア・ファイン・ケミカルズ）で処理して付着細胞を除い
た。Ｂ細胞はヤギ抗マウスＩｇＭ　（Ｐ　Ａ、　　メル
バーン、クーパー・バイオメディカル）を被覆しだベト
リ皿上でパンニングすることにより選別した。

得られた精製Ｂ細胞は検出レベル以下のＴ細胞と９８％
以上のＢ細胞を含むことがわかった。これは３Ｏ−Ｈ１
２および抗Ｌ３Ｔ４ラノトモノクローナル抗体を使用し
次いでＦＩＴＣ結合ウ結合ウサギトラット免疫グロブリ
ンｇＭ、　工ｔａ　ＧおよびＩｇＡ）（ＣＡ、マウンテ
ンビュー、反りトンーディソキンタン）を使用してＴ細
拘ヲ検出し、さらにＦ’ＩＴＣ結合ウサギ抗つウスエｇ
Ｍ　（ＰＡ、ウェストセスタ−１力にノドラボラトリー
ズ）全使用してＢ細胞を検出するフローサイトメーター
分析（エピノクスーＣフローサイトメーター；ＦＬ、ヒ
アリー、クールターコープ）により確かめた。また、上
記のようにして調製したＢ細胞集団は、Ｔ細胞マイトジ
ェンのＣｏｎ、　Ａ　（Ｍ　Ｏ、セントルイス、シグマ
ケミカル）に全く応答しないが、Ｂ細胞マイトジェンの
ＬＰＳに完全に応答することが見出された。

この検定法では、推定上のＢＳＦ’−１含有被検試料の
段階的希釈物が平底９６−ウェルマイクロタイタープレ
ート（３５９６；　ＭＡ、ケンブリッジ、データパッケ
ージング、コスタ−）中のアフィニティー精製ヤギ抗マ
ウスＩ９Ｍ（クーパー・バイオメゾイカＡ′）３〜５μ
９／ｍｌ　ｋ含む培地２００μｇ中で、先に調製した１
０５個のＢ細つとの培養下に置かれる。この培地は１０
％　Ｆ’Ｃ８、ペニシリン（１５μｇ／ｍｌり、　スト
レプトづイン７　（５０ｐｇ／ｍｅ）　、ゲンタマイン
７　（＋００　ｔｔ　ｇ／ｍｌ）、　Ｌ−グルタミン（
２ｍＭ）および２−メルカプトエタノール（５Ｘ　１０
−５Ｍ）全補足したＲＰＭ工１６４０　（Ｎ、Ｙｏ、ク
ランドアイランド、ギブコ・ラボラトリーズ）から成っ
ていた。培養物は７．５％ＣＯ□／空気を含む湿潤雰囲
気中３７℃でインキ−Ｒ−ジョンした。７２時間後、培
養物は２．０μＣ１のトリチウム化チミジン（３Ｈ−Ｔ
ｄｒ）（ＭＡ、ボストン、ニューイングランド９・ヌク
レアー；比活性７５Ｃ１／ｍＭ）　′！ｉ″６時間（７
）　間受’ｒｊ　取す、その後例えば多重自動試料収穫
機を使ってガラス繊維濾過枠上に収穫した。３Ｈ−Ｔｄ
ｒの取込みは液体シンチレーションカウンターで測定し
た。

この方法によると、ＢＳＦ−１の存在下で培養したＢ細
胞のみが用量に依存して３Ｈ−Ｔｄｒ’ｉ取込むことが
わかった。ＢＳＦ’−１の不在下で培養したＢ細胞はパ
ックグラウンドレベルの３Ｈ−Ｔａｒのみを取込んだ。

活性の単位は最大チミジン取込みの５０％を誘発するＢ
ＳＦ−１の号として計算した。従って、１００μａの試
料が１：２０の希釈で最大チミジン取込みの１／！ヲも
たらしたとすると、１単位は１００μｅの１７／！ｏ、
すなわち５μｅに含まれるとみなされた。

こうして、この試料は１０００を５で割った値、すなわ
ち２００単位／ミリリットル（Ｕ／ａｅ）の活性を含む
であろう。

実施例Ｂ ＩＬ−２増殖検定 ＢＳＩ’−１試料はＩＬ−２依存性細胞の増殖を誘発す
る能力について検定し、それにより本発明のＢＳＦ−１
精製工程中のＢＳＦ’−１の均質性全監視し、またひと
たび均質に精製されたＢＳＦ’−１がＩＬ−２依存性細
１泡株の活性を刺激する能力をもつかどうかについて調
べだ。

ＩＬ−２増殖検定はＣＴＬＬ　ＩＬ−２依存性ネズミＴ
細胞１株を用いて行った。この細胞株はＡＴＣＣから寄
託番号Ｔ　Ｉ　Ｂ　２１４のもとに入手可能である。

この＠０味は１０％Ｆ’Ｃ８、ベニシリア（５０Ｕ／ｍ
／）、ストレプトマイシン（５０ｔｉｇ／ｍｅ）および
１００　Ｕ　／　ｒｕｇのＩＬ−２ｉ含むクリック培地
（ＷＩ、リバーフオールズ、アトリック・アン７エーツ
）中で培養下に保持し、２〜４日おきに継代培養する。

この検定法では２×１０３個のＣＴＬＬ細胞がＢＳＦ’
−１含有被検試料の段階的希釈物と共にＦ′Ｃ３（１０
％）、ハニシリン（５０μｅ／ｒｎｌ）、ストレフトマ
イシン（５０μｇ／ｍ／）’に含むクリック培地１Ｏ（
１μｇ中で培養される。培養物は７．５％ＣＯ２／空気
の湿潤雰囲気中３７℃でインキュベーションした。２４
時間後。

コノ培養物は２．０　μＣｉの３Ｈ−Ｔｄｒ　（７５Ｃ
１／ｍｌりにューイングラントゝ・ヌクレアー）を６時
間の間受は取った。その後培養物を、例えば多重自動試
料収穫機を使って、ガラス繊維濾過枠上に収穫した。３
Ｈ−Ｔｄｒ　　の取込みは液体シンチレーションカウン
ターで測定した。

この方法によると、本発明のＥＳＦ’−１の存在下また
はＩＬ−２の存在下で培養したＣ　Ｔ　Ｌ　Ｌ　４４旧
泡のみが用量に依存して３Ｈ−Ｔｄｒｉ取込むことがわ
かった。この因子の不在下で培養したＣＴＬＬ細やはバ
ックグラウンド゛レベルの３Ｈ−Ｔｄｒ　　のみを取込
んだ。活性の単位は実Ｓ例Ａで詳述したようにして計算
した。

実施例に の検定では、本発明に従って生産および精製されたＢＳ
Ｆ−１が長期骨髄培養物から誘導されたネズミＦ’ＤＣ
−Ｐ２　細胞株の増殖を誘発する能力をもつかどうかに
ついて調べた。この細胞株は連続増殖のためにコロニー
刺激因子（工Ｌ−３）　　の存在を必要とする細胞株と
して同定された。デクスタ（Ｄｅｘｔθｒ）らの上記文
献参照。Ｆ’ＤＣ−Ｐ２　細胞株は研究者の間に広く行
き渡っており、種々の源から入手可能である。

ＦＯＣ−Ｐ２細ｆ泡株はウマ血清（２０Ｖ／Ｖ％）、−
”ニジリン（５０Ｕ／ｍｅ）、ストレプトマイシン（５
０μｇ／ｍ／）、　２−メルカプトエタノール（５０μ
Ｍ）および１０％　ＷＥＨＩ−３細胞株調整培地を補足
したＲＰＭＩ　−１６４０培地中で培養する。この調整
培地はＷＥＨＩ　−３細砲（培地１　ｎｔｌ当たり１〜
５×１０６細皓）をウマ血清（５〜２０ｖ／ｖ％）、は
ニジリン（５０Ｕ　／　ｍｌ　）、ストレプトマイシン
（５０μｇ／ｍｇ）、新鮮Ｌ−グルタミン（３００μｇ
／ｒｎｅ’）　　および２−メルカプトエタノール（２
５×１０−５Ｍ）を補足したＲＰＭニー１６４０培地中
で４８時間培養することによシ得られる。ＦＤＣ−Ｐ２
　細胞は２〜４日ごとに継代培養する。これに関しては
細胞全計数して、組織培養フラスコ中の培地２５〜５０
　ｍｌに０．１〜１×１０５細胞／ｍｅの密度で細胞を
まく。細申１は１〜２日ごとに数が倍増するであろう。

増殖検定は実施４／ｌｌＢに記載の方法と同じようにし
てＢＳＦ’−１の被検試料に関して行った。捷だ。

活性の単位は実施例Ａのようにして計算した。

実施例り 先に述べたように、この検定では工Ｌ−３依存性細胞で
ある３２Ｄの増殖を誘発する本発明ＢＳＦ’　−１の能
力について調べる。この細胞株はレトロウィルスに感染
したＣ３Ｈ−ＨｅＪ　マウス骨髄培養物から誘導された
。グリーンバーガー（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ）らの上
記文献参照。これらの細胞は１０％Ｆ’Ｃ８（ＩＱｖ　
／　ｖ％）、ＷＥＨＩ　−３細胞株調整培地（１０ｖ／
ｖ％）、ペニシリン（５０Ｕ　／　ｍ／　）　、ストレ
プトマイノン（５０μ鍾／耐）およびゲンタマイシン（
１００μ９／ｍ１）ｋ含むクリック培地中に保持する。

３２　Ｄ　、１＋ＢＩ胞は２〜４日おきに継代培養する
。これに関しては、Ｙａｌ　１泡を計数して、組織培養
フラスコ中に１〜４×１０４細口／　ＷＬｌの密度で細
胞をまく。この細胞は１２〜２４時間おきに数が倍増す
るであろう。３２Ｄ細胞は研究者の間に広く行き渡って
おり、多くの源から人手可能である。

３２　Ｄ細胞およびＢＳＦ’−１の被検試料を使用する
検定は実施例Ｂに記載の方法を用いて実施した。

また、活性の単位は実施例Ａのようにして計算した。

実施例Ｅ ゲル電気泳動 培養上清および本発明精製法からの分画は５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥによって分析して、本発明精製法を監視した。この
検定はレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）のＮａｔｕｒｅ（Ｌｏ
ｎｄｏｎ）　２２７　：　６８０（１９７０）にｔｉ己
載のゲル法に従って行った。この検定は１０〜２０％勾
配のポリアクリルアミド９を使用する０、７ｍｍ　　Ｓ
ＤＳ　　スラブゲルを用いた。ゲルは２０　ｍ　Ａの定
常電流で泳動させた。得られたゲル試料はオークレー（
Ｏａｋｌｅｙ）らのＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１
０５　：　３６１（１９８０）　　に記載の方法によっ
て銀染色した。

高濃度の塩を含む特定の検定試料は初め０．１ｍＭＮＨ
４ＨＣＯ３中ノＯ９１％ＳＤＳニ対シテ透析し、その後
真空下で乾燥させた。この乾燥残留物は、５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ　法に先立って、還元緩衝液（２％　５ＤＳ）、　
１％２−メルカプトエタノール中に溶解した。

実施例Ｆ 列決定 ＭｕｅＩＬ−４クローンを含めたＤＮＡフラグメントは
、以下で説明する変法テともなう上記のアマ−ジャム・
ハンドブックに記載の標準テエインーターミネーンヨン
法を用いて、その塩基配列全決定した。

ＤＮＡフラグメントはＰｓｄおよび／またばＲｓｔ工で
踏ｆヒし、その後Ｍ１３１本鎖線維状ファージベクター
のｍｐ１８およヒｍｐ１９（工Ｌ、アーリントンハイソ
、アマ−ジャム）にサブクローニングした。フラング−
（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）　　らの上記文献に記載される
ように、ｍｐ１８およびｍｐ１９　　ファージベクター
は次の唯一のクローニング部位：　Ｈｌｎｄ　ｌ［；　
５ｐｈＩ；　ＰｓｔＩ；５ａＩＩ；　ＡｃｃＩ；　Ｈ１
ｎｃ旧ＸｂａＩ；　ＢａｍＨＩ；　ＸｍａＩ；ＳｍａＩ
；　Ｋｐｎ工；　５ｓｔＩ；およびＥｃｏＲＩ　　を含
む。

ｍｐ　１ｓ　ベクターおよびｍｐ１９ベクターの組成は
、ｃＤＮＡ挿入物の両鎖が上記２つのベクターにより有
利に塩基配列決定されるように上記の制限部位の順序が
ｍｐ１９　　ベクターでは逆になっているということを
除いて、同一である。ｃＤＮＡの対応する鎖全含むｍｐ
１８およびｍｐ１９ベクターを用いて大腸菌株に１２の
５Ｍ１０７　（ＭＤ、ベセスダ、ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ）を形質転換し、それによりセンス鎖お
よびアンチセンス鎖の一本鎖挿入物を含む多数の１本鎖
ＤＮＡテンプレートを得た。

共通の合成プライマー：　５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧ
ＡＣＧＴＴ−３Ｉ（Ｗ工、ミルウォーキー、　Ｐ−Ｌ　
　バイオケミカルズ）は１２ｔＪＩＩＤＮＡテンプレー
トにアニーリングして、上記のようにＤＮＡ合成全開始
させるために使用した。その後、鎖伸長フラグメンＩｆ
ゲル電気泳動で大きさに基づいて分離し、オートラジオ
グラフィーにかけてフラグメントのヌクレオチド配列を
推定した。

ジデオキシ塩基配列決定反応では、デオキシアデノシ７
５′（α−〔３５Ｓ〕チオ）三リン酸（以後”ａＡＴＰ
　　［α−３５Ｓ〕“と略す）を放射性標識として使用
した。また、アマ−ジャム・ノ・ンドズツク３６頁に記
載のゲルを使用せずに、６％ホリアクリルアミビゲル（
厚み０．４咽；７Ｍ尿素、ｌｏｏｍＭ）リスホウ酸（ｐ
Ｈ８，１）および２ｍＭ　　ＥＩ）ＴＡＧ含む）を使用
した。

実施例Ｉ ＢＳＦ−１はネズミＥＬ４胸腺腫細胞（ＡＴＣＣ寄託番
号Ｔ　Ｉ　Ｂ　１８１）から生産した。これらの細つは
Ｆｅ２（５ｖ／ｖ％）、ハニシリｙ（５０Ｕ／ｍｅ）、
ストレプトマイシン（５０μｇ／ｎ１ｔ＞およびグルタ
ミン（２ｍＭ）を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地中に
培養下で保持する。これらの細胞は２〜４日おきに継代
培養する。リンフ才力インの生産全誘発するために、Ｅ
Ｌ４細％’、　（１０６／ｍ／）はｌｖ／ｖ％　ＰＨＡ
（Ｍｌ、デトロイト、ジフコ・ラボラトリーズ）および
１０ｎｇ／ｍｅの４β−ホルボール１２β−ミリステー
ト１２α−アセテート（ＮＯ、セントルイス、シグマ・
ケミカル・カンパニー）　と共にはニジリン（５０Ｕ／
１Ｉｌｌ）、ストレプ１−−ｒ　インン（５０、ｕｇ／
ｒｒｔｅ）およびグルタミン（２ｍＭ）ｚ−補充したＲ
ＰＭニー１６４０の存在する多数の３０　ｍｌ培地中で
培養する。

この培養物は１０％ＣＯ２／空気の湿潤雰囲気中３７℃
で２．１時間インキュベーションした。次いで、培養上
清を収穫し、遠心し、そして濾過滅菌した。

その後培地はすぐに使用するか、あるいは将来の分画化
のために凍結した。

実施例、２ ＢＳＦ−１の初期精へ Ａ、吸着 実施例１のようにして調製した粗上清は初めにＴＭＳ−
シリカ（Ｃ−１セプラライト；ＣＡ、バーバージティー
、アナリティケム・インターナショナル）への吸着によ
って濃縮した。この吸着法では、粗上清ヲ０．１％ＴＦ
’Ａで酸性化し、その後ＴＭＳ−シリカを上清（Ｔ１ｉ
’Ａの使用により達成された上清のＩ）Ｈｅ定める）１
リツトル当た。９１０９のＴＭＳ−シリカ量で加えた。

１１／！時間攪拌後。

上清をデカントした。次いで、ＴＭＳ−シリカをカラム
（５０ｒｔｒｍ　Ｘ　２００　ｍｍ　）　　の中に注入
し、初めに加％アセトニトリルで洗い、その後０１％　
Ｔ　Ｆ’Ａで洗った。ＢＳＦ’−１は７５％アセトニト
リルおよび０．１％ＴＦＡの溶液でカラムから溶出した
。溶出液から回転蒸発によりアセトニトリルを除去した
。

粗ＢＳＦ’−１上清７１．５１は２１．４　Ｘ　１Ｏ−
６Ｕの総括性および３Ｕ／μ９の比活性（Ｂ細胞増殖検
定）全もつことがわかった。吸着法の後のＢＳＦ−１は
。

同じ検定を使用して、１９．７　Ｘ　１Ｏ−６Ｕ　　の
総括性および約Ｉｏｎ　Ｕ　／μ９の比活性をもつこと
が判明した。

また、ブラッドフォードタンパク質検定を使用しテ、総
タンパク質収率は約９２％　であった。このことは吸着
法がＢＳＦ−１の精製において約３３倍の増加をもたら
したことを示している。

実施例＋２Ａからの部分精製ＢＳＦ’−ｔは逐次カチオ
ンおよびアニオン交換クロマトグラフィーによりさらに
精製した。これらのクロマトグラフィー法は４℃で行わ
れ、ここで使用した樹脂は０．１％トリトン−Ｘおよび
Ｆｅ２（１０ｖ／ｖ％）で予備処理して、樹脂へのＢｓ
Ｆ−１活性の非特異的吸着を減少させた。

カチオン交換クロマトグラフィー法では、吸着法から得
られる水相のイオン強度１５ｍＭクエン酸ナトリウムお
よび５０ｍＭ　ＮａＣｇ　（ｐＨ５，５）に調整した。

このように調整した水相は、予め同じ紗衝液で平衡化し
ておいた２、５Ｘ２ｔ）ｃｍのカルボキシメチルセルロ
ースカラム（０Ｍ５２；ＮＪ、　り＋）フトン、ワット
マン・ケミカル・セパレーション）に６０ｍｅ／時間の
速度で装填した。

装填完了後、２００ｍＪの５ｍＭクエン酸ナトリウム、
５０　ｍＭ　　ＮａＣｇ　　（ｐＨ５，５）でカラＡ４
−洗って未結合タンパク質を除いた。結合タン・ξり質
は６０ｍ１／時間の速度でカラムに加えられる線状Ｎａ
Ｃｌ勾配（５０ｍＭ〜５００　ｍ　Ｍ　）　２開いてカ
ラムから溶出した。カラム分画を集めて上記のように検
定した。

本発明者らは、約２００　ｍ　Ｍ　でカチオン交換カラ
ムから溶出されたＢＳＦ−１が約１３．７Ｘ１０−６Ｕ
の総活性および約２．５　Ｘ　１０３Ｕ／μ９の比活性
（Ｂ細胞増殖検定）を示し、それによって初期ＢＳＦ’
−１タンノぐり質の約６４％を保持しつつ吸着法からの
ｆ３８Ｆ’−１活性を約５倍増加しうろこと全見出した
。

カチオン交換カラムからのプールした活性分画Ｕ、第４
アミノエチルセルロース（ＱＡ５２；ワットマン・ケミ
カル・七／８レーション）の１．６　Ｘ　１０ｃｍカダ
ムによるアニオン交換クロマトグラフィーを用いてさら
に精製した。カラムは使用前に２０ｍＭトリス−ＨＣｅ
　（ｐＨ９，０）で平衡化した。アニオン交換カラムに
装填する前に、カチオン交換カラムからの分画は２０ｍ
Ｍ）’Ｊス（ｐＨ９，０）に対して透析し、その後ｉ５
ｍＡ’／時間の速度でカラムに装填した。

装填完了後、カラムを３倍のカラム容量の同じ平衡化緩
衝液で洗い、次いで２０ｍＭ　トリス−ＨＣｇ（＋）Ｈ
９，０）中の０〜５００ｍＭＮａＣｅの直巌状勾配で溶
出した。

本発明者らは、　ＢＳＦ’−１活性カ０．５０〜１．０
０　ＭＮａＣ／！で鋭いピークとして溶出すること全見
出した。カラム溶出液の分析は５．６　Ｘ　１Ｏ−６Ｕ
の総活性および２．６　Ｘ　Ｉ　Ｏ’　Ｕ／μ９　の比
活性（Ｂ細胞増殖検定）ならびに約２６％のタンパク質
収率を示した。

実施例３ 実施例２のイオン交換クロマトグラフィー法から得られ
る生物学的に活性な分画は、ＨＰＬＣ法の出発物質とし
て使用するためにプールする。プールした分画は、ベッ
クマンモデル３４４溶剤送出装ｅ（ＣＡ、マウンテンビ
ュー、ベクトンーディッキンタン）を使用して４，６　
Ｘ　２５０　ｒｒａｎバイダックＣ１８カラム（２１８
ＴＰ、　　サ・セパレーションズ・グループ）に注入す
る＠Ｋ、０．１％ＴＦＡでｐＨ２，０に調整した。カラ
ムは使用に先立って約０．８ｒｎｌ１分の流速で０．１
％ＴＦＡ　　水溶液により平衡化した。

装填したカラムは初めに０．１％ＴＦＡで１０分間洗っ
て未結合成分を除き、次にそのカラムラ１０％アセトニ
トリル（０，１％ＴＦＡ含有）へ２分間にわたって至ら
しめ、その後１０％アセトニトリルでさらに８分間平衡
化した。結合タンパク質の溶離は、０．１　ｖ／ｖ％Ｔ
ＦＡ中の１０〜７０％アセトニトリルの直線状勾配を１
分画たり１％の割合で６０ｆ＋間にわたって加えること
により達成された。ＢＳＦ−１タンパク質は４２％アセ
トニトリル分画中にカラムから溶出されることがわかっ
た。

１分の分画（０，８ｍｅ　）を集め、各分画から２０〜
５０μｅアリコーＩｆバイオアツセイおよび５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥその後の銀染色による分析のために取り出した。

第１図に示すように、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色に
よって１８．４キロダルトンに強いバント９が検出され
た（レー／ｌ（ＳＭ）を参照）。Ｂ細胞増殖検定法から
、このバンドは５．Ｉ　Ｘ　１０６Ｕの総生物学的活性
および約１２．７　Ｘ　１０’　Ｕ／μ９　の比活性お
よび約２４％のタンパク質収率を示した。

高純度のＢＳＦ’−１が第１のＨＰＬＣ法で得られたが
、ＢＳＦ−１タンパク質の真の均質性を達成するために
第２のＨＰＬＣ法を使用した。この目的のために、第１
のＨＰＬＣ法から得られたＢＳＦ−１活性を含む分画（
分画番号５９〜６４）をプールして。

２５０μｅ　の濃度に真空濃縮した。この濃縮物を上で
使用したカラムと同じカラム（０，７ｍＪ／分の流速で
ＤＩＥＡ−ＡｃでｐＨ４，５に調整した５０ｍＭ酢酸を
用いて平衡化したもの）に注入した。装填カラムは初め
に５分間ＤＩＥＡ−Ａｃで洗って未結合成ｅ’ｉ除き１
次にカラムを２分間にわたって５％Ｎ−プロパツールへ
至らしめ、その後５％Ｎ−プロパツールでさらに８分間
平衡化した。結合タンパク質の溶離は、Ｄ工Ｅへ−Ａｃ
中の５〜４０％Ｎ−プロパツールの直線状勾配を１分画
たり０．５％の割合で７０分間にわたり加えることによ
り達成された。

１分ごとの分画（０，７ｍ／）ｅ集め、各分画から２０
〜５０μｅアリコーｉｆバイオアツセイおよび５ＤＳ−
ＰＡＧＥ、その後の銀染色による分析のために取り出し
た。第１図に示すように、約１８４キロダルトンの分子
量をもつＢＳＦ−１生物活性の鋭いピークが３２％Ｎ−
プロパツールで溶出された。Ｂ細胞増殖検定法から、こ
のＢＳＦ−１は１．６　Ｘ　１０６Ｕの総生物学的活性
および約３．２８　Ｘ　１０　Ｕ／μ９　の比活性およ
び約８％の収率を示した。第２図に示す銀染色５ＤＳ−
ＰＡＧＥおよび対応する比活性レベルから明らかなよう
に、第２ＨＰＬＣ法によって回収され）たＢＳＦ’−１
は真に均質であった。この事実はこのタンパク質産物の
アミノ酸配列を確かめる本発明者らの能力によって確認
された。

第２ＨＰＬＣ法からの分画６１および６２はＣＴＬＬお
よびＦＤＣ−Ｐ２　増殖検定で試験した。第２図に示す
ように、　ＢＳＦ’−１はこれらの検定においてＢ細胞
増殖検定で監視された生物学的活性の鋭いピークに対応
する鋭いピークを示した。

第３図に示すように、Ｂ細胞および因子依存性細胞株の
増殖を刺激する本発明の均質ＢＳＦ−１の能力、ならび
にＩＬ−２およびＩＬ−３の能力が試験された。ＢＳＦ
”−１（ロ）、　ＩＬ−２（△）およびＩＬ−３（○）
の３倍希釈物が５００Ｕ／ｍｌから出発して試験された
。試験結果はｃｐｍ　Ｘ　１０−３　　で示す。

３種類の均ηリンフォカインのＢ細胞を刺激する能力は
第３図の・ξネルＡに示され、ＦＤＣ−Ｐ２細胞全刺激
する能力はパネルＢに示され、３２Ｄ細胞を刺激する能
力はパネルＣに示され、そしてＣＴＬＬ細Ｉｌｌ刺激す
る能力はパネルＤに示される。

第３図のパネルＡは、均質ＢＳＦ−１が精製Ｂ＃Ｉ胞全
高度に刺激する。■Ｌ−２および工Ｌ−３はこれらの細
胞に対して全く影響を及ぼさないことを示している。予
期されたように、ＩＬ−３はＦ’ＤＣ−Ｐ２および３２
Ｄ細胞の高レベル刺激を誘発した（第３図のパネルＢお
よびＣ）。しかしながら、ＢＳＦ’−１もまたＦ’ＤＣ
−Ｐ２　および３２Ｄ細胞を有意に刺激する能力を示し
た。・２ネルＤに示されまた予期されたように、ＩＬ−
２はＣＴＬＬ細賂の著しい刺激全誘発した。それより劣
るが、本発明の均質ＢＳＦ−１もまたＣＴＬＬ細胞の増
殖を刺激した。しかしＩＬ−３はこれらの細胞に対して
ほとんど影響を及ぼさなかった。

Ｂ細胞増殖を刺激するＢＳＦ−１の前記能力は、それが
Ｂａ胞の増殖因子であることを示している。

他方、■Ｌ−２およびＩＬ−３依存性細胞株の増殖を刺
激する均質ＢＳＦ−１の能力は、それがまた多数の細胞
系列に作用する能力を兼ね備えた因子であることを示し
ている。今までＢＳＦ’−１のこの性質は証明されてい
なかった。

実施例４ 第２　ＨＰＬＣ法から回収した分画番号６１および６２
からの均質ＢＳＦ−１を真空濃縮して最終容量刃μｇと
し、次いで調整シークエンサーフイルター上においた。

フィルター上のＢＳＦ’−１のアミノ酸組成は、アプラ
イド・バイオシステムズ　モデル４７０Ａタンパク質シ
ークエンサーを用いて分析した。

配列決定サイクルからの分画はサバント・スピード９−
バック（Ｓａｖａｎｔ　Ｓｐｅｅｄ−Ｍａｃ、　Ｎ、Ｙ
、　、　ヒックスビル）で蒸発乾固し、その後アミノ酸
残基の同定のためにＨＰＬＣカラムに注入する前にＤＩ
ＥＡ−ＡＣおよびアセトニトリル（５０：　５０　）中
に再懸濁した。

多くのアミノ酔配列決定実験が行われたが、上記精製法
によりほぼ均質になるまで精製されたＢＳＦ−１と一致
するただ１つのＢＳＦ’−１配列が得られた。ＢＳＦ−
１分子のＮ末端部分の最初の加残基は次の配列：　Ｈｉ
ｓ−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−１１ｅ−
１１ｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｖ
ａｌ　、から成ることが決定された。このアミノ酸配列
はナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファウン
デーションの、’２７　Ａ　り’ＪＪ　７’　−タヘ−
ス’　Ｓ　Ｅ　Ａ　ＲＣＨ’　（１９８５年１１月）中
に含まれる既知タンパク質配列と比較したが、このデー
タベースに含まれるどのタンパク質配列とも有意に均等
でなかった。上記配列の第５番目の残基は、自動アミノ
酸配列決定法の第５サイクルにおいて他の残基がなにも
高収率で得られなかったという点で、Ｃｙｓであると推
定された。

さらに、アミノ酸組成分析からグルコサミンまたはガラ
クトサミンが観察されなかったので、ＢＳＦ−１の第５
残基はＣｙｓであるという結論に到達した。

実施例５ ＥＬ４胸腺種細胞全実施例１に記載したように１　ｖ／
ｖ％　ＰＨＡ、５ｖ／ｖ％　ＦＣ８および１０ｎｇ／　
ｍｅ　Ｐ　Ｍ　Ａの存在下で１８時間培養した。全ＲＮ
へは一般にチャーウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）らの上記
文献に記載される方法を用いて、活性化　ＥＬ４細１泡
から抽出した。この方法では、グアニジニウムチオシア
ネートを用いて、ＲＮａｓｓ　　によるＲＮＡ加水分解
速度を超える速度でＲＮａｓｓ　　を含めた細胞タンパ
ク質を変性した。ｍＲＮＡはエタノール沈殿、続いて８
ＭグアニジンＨＣＩ％２５　ｍ　Ｍ酢酸ナトリウムによ
る再懸濁（抽出）によって細胞タンパク質から分離した
。グアニジンＨＣｅ　抽出されたＲＮＡはその後等容量
のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（
２５：２４：１の容量比）で再抽出した。このような抽
出法から得られるＲＮＡ含有水相ｆ　５０　ｍ　Ｍ酢酸
ナトリウムとなし。

０．６　容量のエタノール全添加して沈殿させた。

ＲＮＡは一加℃で凍結し、その後遠心することによって
回収した。

その後、ポ’）Ａ＋ｍＲＮＡ　はマニアチスらの上記文
献１９７に記載の方法を使ってオリゴ（ａＴ）セルロー
スクロマトグラフィーにより抽出タンパク質から分離し
た。簡単に説明すると、カラムはΔ）ｍＭ）　ＩＪス−
Ｈｃｇ　（ｐＨ７，６）、　　０．５　Ｍ　　ＮａＣｇ
、　　１　ｍＭ　　エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ
）　　および０．１％トゞテシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）から成る装填緩衝液で調整した。タンパク質にレッ
トに水および装填緩衝液に溶解し、カラムに加えた。非
吸着物質：ま装填緩衝液による籾量洗浄、その後の０．
ＩＭＮａＣｊ？ｅ含む装填緩衝液による追加洗浄によっ
てカラムから溶出した。保持されたポリＡ＋ｍＲＮＡは
１０ｍＭ　　トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　
　ｆ２ＤＴＡおよび０６０５％ＳＤＳ　から成るイオン
強度の低下した緩衝液で溶出した。溶出したポｌＪＡ＋
ｍＲＮＡは１／１ｏ容量の酢酸ナトリウム（３Ｍ、　ｐ
Ｈ５，２）　オヨび２．２容量のエタノールを用いて一
２０℃で沈殿させた。ポリＡ＋ｍＲＮＡ　ｆオリゴ（ａ
’ｒ）セルロースカラムから溶出した後、ポリＡ＋ｍＲ
ＮＡの完全性全マニアチスらの上記文献１９９に詳述さ
れるアガロースゲルによる電気泳動によって確かめた。

ポリＡ　　ｍＲＮＡはメチル水銀アガロースによる電気
泳動によって大きさにより分画化した。その後、異なる
大きさのｍＲＮ八に対応するダル分画は、先に記載した
ウサギ網状赤血球溶解液法またはアフリカッメガエル卵
母細胞中への微量注射のいずれかを使用することによっ
てｉｎ　ｖｉｔｒｏで翻訳させた。網状赤血球翻訳また
はｍＲＮＡ注射卯母細胞によって遊離された液体は、上
記の検定法を用いてＢＳＦ’−１活性の存在について試
験した。１ｎｖｉｔｒｏで翻訳させたときにＢＳＦ”−
１活性を生じたｍＲＮＡゲル分画をｃＤＮＡ作製のため
のｍＲＮＡ源として選択した。

実施例６ ｍＲＮＡに対応する２本領ｃＤＮＡのライブラリーは、
ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）およびホフ−ｖ　７　（Ｈｏ
ｆｆｍａｎ）の上記文献によって変更されたマニアチス
らの上記文献２２９に記載の標準方法を用いて、実施例
５の精製ｍＲＮＡ　　から作製した。オリゴ−ｄＴは第
１のｃＤＮＡ鎖の逆転写用プライマーとして使用するた
めに、ｍＲＮＡのポリＡから成る尾部にハイブリダイズ
させた。トリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）の逆転写酵
素を用いて、ｍＲＮＡ全テンプレート（鋳型）として第
１のｃＤＮＡ鎖を合成した。簡単に述べると、第１ｃＤ
ＮＡ鎖の合成は５０ｍＭ１ス・ＨＣＥ（ｐＨ８，３）、
　ｌｏｍＭ　　Ｍ９Ｃ１２，１０ｍＭ　ジチオトレイト
ー／Ｌ、（ＤＴＴ）、　　４　ｍＭピロリン酸Ｎａ。

１．２５ｍＭ　ａＧＴＰ、　１．２５ｍＭ　　ａＡＴＰ
、１．２５ｍＭＴＴＰ、０．５ｍＭ　ａＣＴＰ、１５〜
２０μＣ１の〔α−３２Ｐ〕ａＣＴＰ　（３０００Ｃ１
／　　ＩＪ　モル）　、１００１１ｇ／ｍｌのオリゴ（
ｄＴ１２−１８）、１５０　ｐ９／ｍｌ　ｍＲＮＡ　　
（実ｍ　例５から）、３０００単位／　ｍｅ　　Ａ　Ｍ
　Ｖ　　逆転写酵素ｆ含む反応容量２０〜４０μβ中で
実施した。この反応を４３℃で３０分間行い、その後Ｅ
ＤＴＡを２０ｍＭまで加えて反応を停止させた。反応生
成物をフェノールで抽出し、岡山およびベルブ（Ｂｅ　
ｒｇ）のＭｏｌ。

ＣｏＩ２．１３ｉｏ１．２　：　１６１〜１７０（１９
８２）に記載されるように、反応生成物をフェノールで
抽出し、２Ｍ酢酸アンモニウムを加えてエタノール沈殿
させた。

第２のｃＤＮＡ鎖は２０ｍＭ　トリス・ＨＣＩＩ　（ｐ
Ｈ７，５）、５ｍＭ　　ＭｇＣ１１，ｔｏｍＭ（ＮＨ４
）２Ｓｏ４．　ｌｏＯｍＭＫＣｌ、０．１５　ｍ　Ｍ　
　β−ＮＡＤ、５０μｇ／ｍ／　ＢＳＡ、４゜μｍ　　
ａＮＴＰ％８．５単位／　ｍｌの大腸菌ＲＮａｓｅ　Ｈ
１２３２単位／ｍｅのＤＮＡポリメラーゼエ、１０単位
／耐の大腸菌Ｄ　Ｎ　Ａ　リガーゼを含む反応容３ｊ　
１００μｌ中で合成した。この混合物は１２℃で１時間
、次いで２２℃でさらに１時間インキエバーションした
。

その後、ＥＥＤＴＡｉ２０ｍＭまで加えて反応ケ停止さ
せた。得られた２本鎖ｃＤＮＡは上記のようにフェノー
ルで抽出した。

２本鎖ｃＤＮＡはセファクリル５−４００（ファーマシ
ア・ファイン・ケミカルズ）カラムクロマトグラフィー
により大きさに基づいて分画化し、そして分子量マーカ
ーとしてｐＢＲ３２２ＤＮＡの末端標識フラグメントラ
使用して、アルカリ性アガロース電気泳動による分析に
よって監視した。鎖長が５００　ｂｐ　よシ小さいＤＮ
Ａ鎖は、これらの短鎖ｃＤＮＡ分１面の不必要なりロー
ニングを避けるために選別して除去した。

上記のようにして作製した２本鎖ｃＤＮＡ分画は、マニ
アチスらの上記文献２３９に記載の方法によっテＰＢＲ
３２２プラスミドＳ（ファーマシア・ファイン・ケミカ
ルズ）のＰｓ　を工部位に挿入した。この方法で２本鎖
ｃＤＮＡの３′末端にポＩＪ（ｄＣ）全付加した。

プラスミドｐＢＲ３２２はＰｓｔエエントゝヌクレアー
ゼで消化した後、その３′末端にポＩＪ（ｄＧ）ｔ−付
加した。ポリ（ａＧ）付加プラスミドとポＩＪ（ｄＣ）
付加ＣＤＮＡとはアニーリング緩衝液（０，Ｉ　Ｍ　Ｎ
ａＣｅ。

１０ｍＭトリス−ＨＣｅ（ｐＨ７，８）および１０　ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ）を用いてアニーリングさせて新規な組
換えプラスミドゝを作製した。ここに記載のすべての制
限酵素はマサチューセンツ州ベバリー、ニューイングラ
ンド・バイオラズズ社から市販されている。

この組換えプラスミドゝはハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）
の上記文献記載の方法により大腸菌株ＭＭ２９４（この
大腸菌側０は高濃厩のＭｇ２＋中で増殖させることによ
シ調興した）を形質転換するために使用した。形質転換
宿主は平板培養し、その後表現型同定剤としてテトラサ
イクリンを用いて同定した。この手法によって１本発明
者らは約１．２Ｘ１０４個の独立形質転換細胞を得た。

実施例７ の作製 合成オリゴヌクレオチドは実施例６のようにして作製し
たｃＤＮＡライノラリーをスクリーニングする際のプロ
ーブとして使用した。このプローブの組成は実施例４で
決定したＢＳＦ−１分子のアミノ酸配列の一部に対応す
る。プローブ（ＢＳＦ−１分子のＮ末端の第１アミノ酸
全コート８するアンチセンス鎖の第１核酸から第９アミ
ノ酸をコードする第２核酸まで伸長する）は次の組成＝
３°−ＧＴＧＴＡＧ　ＧＴＣＣＣＧ　ＡＣＧ　ＣＴＧ　
ＴＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴ−５’から成っていた。オリゴヌ
クレオチビプローズはンートゝ（Ｓｏｏｄ）らの上記文
献およびヒロセ（Ｈ１ｒｏθｅ）らの上記文献に詳述さ
れるトリエステル法により化学的に合成された。

化学合成の完了後、オリゴヌクレオチドプローブの５′
末端は３２ｐで標識した。標識化を促進するために、オ
リゴヌクレオチドの５′末端はＯＨ末端をもつように合
成され、それによってＤＮＡフラグメン［１−標識する
ときに一般に必要とされるホスファターゼ処理を省く。

標識方法は合成オリゴヌクレオチドｌａｌを１６μｌの
３２Ｐ　−ＡＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍＭ）、ｌ１１／
（ＩＯＵ）のＴ４ポリヌクレオチドゞキナーゼおよび２
μｅの１０　Ｘキナーゼ緩衝液工に添加することを含む
。ＩＯＸ　　キナーゼ緩衝液工は０．５　Ｍ　　トリス
−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，６）、０．１　Ｍ　　ＭｇＣ６
２，５０ｍ　Ｍジチオトレイトール、１ｍＭスペルミジ
ンおよび１　ｍＭ　ＥＤＴＡから成っていた。この反応
を３７℃で加分間実施し、その後合成されたオリゴヌク
レオチドヲフェノール／クロロホルムで抽出した。標識
プローブはセファデックスＧ−５０カラム（ファーマン
ア・ファイン・ケミカルズ）によるクロマトグラフィー
または遠心により未標識オリゴヌクレオチド９から分離
した。

実施例８ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング実施例６のよう
にして作製したｃＤＮＡライブラリーの初期スクリーニ
ングを促進するために、形質転換細菌培養物を約１０ｏ
ｏ　個の異なるクローンから成るグループにプールした
。プラスミドＤＮＡはインーホロビッツ（１日ｈ−Ｈｏ
ｒｏｗｉｃｚ）およびパーク（Ｂｕｒｋ１３）のＮｕｃ
ｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９　：　２９８９（１９
８１）に詳述される標準アルカリ溶菌法によって宿主細
菌の試料から分離した。分離したプラスミｌ−”ｔ−２
つのフラグメントに切断した。これはプラスミＭｔＰｖ
ｕｌＩおよびＨｌｎｄ［１で完全消化することによって
達成された。この目的のために、プラスミド９は加μｅ
のｌ　ＸＨｌｎｄ　Ｉｌｌ緩衝液（７ｍＭ　トリス（ｐ
Ｈ７，４）、７ｍＭ塩化マグネシウム、５Ｑ　ｍ　ＭＮ
ａＣｌ）中に再溶解し１次にｌμｌのＰｖｕｌｌおよび
１μｇのＨ１ｎｄｌｌｌ制限エンド９ヌクレアーゼ金加
えた。

この混合物ヲ３７℃で２時間インキュば一ンヨンした。

次に、プラスミビ消化物は適当なサイズのマーカー金柑
いて０．８％アガロースゲルによる電気泳動によって分
画化した。アガロースダルはサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
）の上記文献に記載の標準方法全便ってニトロセルロー
スフィルターに移行させた。移行後、フィルターを自然
乾燥させ、真空下に約８０℃で２時間焼き付けし、ＤＮ
Ａフラグメントｔニトロセルロースに固定させた。

ニトロセルロースフィルターに固定したＤＮＡは次に標
準オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた
。簡単に述べると、暁き付けしたニトロセルロース’ｋ
　１０〜５０Ｂｇの６×ク工ン酸ナトリウム食嘴水（Ｓ
ＳＣ）（２０ｘＳＳＣはＨ２Ｏ８００ｍ／中のＮａ１Ｊ
　１７５．３９およびクエン酸ナトリウム８８．２９　
　から成り、１ｏＮ　ＮａＯＨでｐＨ７，ｏｆｃ調整す
る）中に予備浸漬し、その後６ｘＳＳＣ，０，５％ＮＰ
・ＩＯ界面活性剤、０１％サルコシル、　５　Ｘ　Ｄｅ
ｎ−ｈａｒｄｔ’ａ溶１．（ＩＸ＝０．０２％フィコー
ル、０．０２％ポリビニルピロリビン、００２％ＢＳＡ
）および１００μ９／ｍｅ変性サケ精子ＤＮＡ（シグマ
ｉＩＩ型、ナトリウム塩）から成る１０〜５０μｅのプ
レハイブリダイゼーション緩衝液中で２〜４時間５０’
Ｃでインキユバーノヨンした。その後、フィルター全上
記のハイプリダイゼー７ヨ／溶液中で３２ｐ−標識オリ
ゴヌクレオチドプローブ（１１０６ｃｐ／μｇ）　　（
実施例７から）と５０’Ｃで一晩インキユイーションし
た。−晩のハイズリダイゼーショ／後、フィルターを６
ｘ　ＳＳＣで室温にて十分に洗い、さらに６ｘＳＳＣで
５０℃にて５分間洗浄した。自然乾燥後、フィルタター
全一７０℃でオートラジオグラフィーにかけた。

強いバンドを含む形質転換細胞のプール（オリゴヌクレ
オチド８とハイブリダイズする多数のｃＤＮＡの存在を
示す）は直接細菌コロニーハイノリダイゼーションによ
りスクリーニングした。プラスミドＤＮＡ１含む数個の
単一コロニー（そのうちの１つはＭｕｓ工Ｌ−４と名づ
けられた）が同定された。

さらに、初期スクリーニングプールからの形質転換細胞
の約１０％のコロニー全敗り出して、テトラサイクリン
（２５〜７５μｇ／ｒｎｌ）ｋ補足したルリアズロス（
１０９／ｌトリプトン、５９７１酵母エキス、５９　／
　ｅ　Ｎａ（Ｊ？　）から成る液体培地中で９６ウエル
プレートにて増殖させた。取り出したコロニーのうち、
それぞれ１００個のクローンから成る１ｏのプールをス
クリーニングのために選択した。プラスミ）’ＤＮＡは
インーホロビッツおよびパークの上記文献に詳述される
標準アルカリ溶菌法、その後の七フアクリルＳ　−４０
０カラム（ファーマシアｌファイン・ケミカルズ）によ
るゲル濾過クロマトグラフィーによって宿主細菌試料か
ら分離した。

そのプラスミドはＢａｍＨ工　　制限酵素で完全消化す
ることにより線状化した。この目的のために、プラスミ
ド″′を５〜１００μｌ　（理想的には約５０μｅ）の
緩衝液（７ｍＭトリス（ｐＨ７，４）、７ｍＭ塩化マグ
ネシウム、５　ｍ　Ｍ　　ＮａＣ１）中に再溶解し、次
いで約１〜１０μｅ（理想的には約５７ｉｇ）　　のＢ
ａｍＨＩ制限エン制限エンドアヌクレアーゼ。この混合
物ヲ３７℃で１時間インキュベーションした。

次に、５μ９のプラスミドＤＮＡは約１００〜１５００
μｅ　（理想的には約７５０μｌ）の２０ｍＭトリス−
ＨＣｅ、１　ｍ　Ｍ　　ＥＤＴＡ　　（ｐＨ７，５）　
　を加えて約１０分間沸騰させることによって、パンセ
ス（Ｐａｎｓｅθ）２２５３　（１９８１）に記載の方
法に従ってニトロセルロースブロッティングのために調
製した。プラスミドＤＮＡはさらに０．２〜２．０μ７
１！（理想的には約０．７５ｔｉｌｌンのＩ　Ｎ　　Ｎ
ａＯＨ’！ｒ室温で１０〜４０分間（理想的には約加分
間）添加することによって変性した。

この混合物をその後約１〜１０ｒｎ／（理想的には約４
、！１ｙｘｌりの緩衝に！Ｌ（２５０ｍＭ　　１−リス
−ＨＣｇ（ｐＨ８，０）、１５０　ｍ　Ｍ　クエン酸ナ
トリウム、１．５　Ｍ　　ＮａＣｇ、０．２５Ｍ　　Ｈ
Ｏ２）中に再懸濁した。

その後、プラスミド消化物はシーレイチャー（Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ）およびシ：Ｌ　ｘ　ル（Ｓｃｈｕｅｌｌ
）のマニホールド・ドツト・プロット装置を使ってニト
ロセルロースフィルターへ移した。、ｔｌ［、フィルタ
ー１１乾し、約８０℃で約２時間焼き付けてＤＮＡフラ
グメントをニトロセルロースへ固定シた。次に、個々の
クローンプールに対応するニトロセルロースのそれぞれ
の円形ディスク（約ｏ、ｓ　ｃｍ　）をニトロセルロー
スシートから切り取り、約５〜１５分（好ましくは約１
０分）２ｍｇのＨ２Ｃの中で沸騰させた。そのニトロセ
ルローススポラトラ８０℃で２時間乾かした。

ニトロセルロースディスクに固定したＤＮＡは次に、予
めエタノール沈殿させてハイブリダイゼーション溶液中
に再懸濁しておいた全ＢＳＦ−を活性ｍＲＮＡとハイブ
リダイズさせた。この目的のために、約１〜１００μｇ
　（好ましくは約５μ９）の全ｍＲＮＡ　ｆ約１〜５μ
７１！（好ましくは約２．５μｊ）のＨ２Ｃ、約２〜ｌ
Ｏμｇ（好ましくは約５μｅ）のホルムアミドおよび約
１〜１０μｌ（好ましくは約２５μｌ）の４×ハイブリ
ダイゼーシヨン塩（４００ｍＭ　　ＰＩＰＥＳ　　緩衝
液（ｐＩ（６，４）　、１．６　ｍＭ　　ＮａＣｄおよ
び４０ｍＭ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）　）中に懸濁し
た。ハイブリダイゼーション法において１円形ニトロセ
ルロースシートソトはマイクロタイタープレートの個々
のウェル中へ約５〜２５μｅ　（好ましくは約１０μｅ
）の上記ｍＲＮＡ　　と共に加え、その後約加〜１５０
μｅ（好ましくは約１００μｇ）の滅菌パラフィン油で
覆った。このマイクロタイタープレートラ約５０℃の水
浴上に一晩浮かべた。−晩のノ・イブリダイゼーション
後、フィルター全敗り出して個々のポＩＪ　フロピレン
管の中に入れ、次いで１ｘＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ
で約５０〜６５℃（好ましくは約６５℃）にて１０回（
１分／洗浄）洗った。その後、フィルターを０．２ＸＳ
ＳＣで１〜１０回（好ましくは約５回）洗った。

その後、ハイブリダイズしたｍＲＮＡはフィルターディ
スクに約１〜１５μ９／ｍｌ　　（好ましくは約６．６
　ｐ　ｇ　／ｒｎｌ　）　　の酵母ｔＲＮＡ　（Ｍ　Ｏ
，セントルイス。

シグマケミカル社）を含むＨ２Ｃから成る約（資）〜４
００μｅ（好ましくは約２００μ／りの溶離溶液を加え
、沸ｌ（水浴中で約１〜１０分（好ましくは約３分）イ
ンキュベーションし、次いで管を水中に浸漬して冷却す
ることによりＤＮＡ結合フィルターから溶出した。この
溶液を滅菌１．５　ｍｌ遠心管に移した。約２０〜２５
０μｌ（好ましくは約１００μｅ）の追加量の溶離ｉｔ
Ｌ’ｅフィルターに加え、インキュベーションおよび冷
却を繰り返した。これを前記の溶離液でプールした。次
いで、この溶出液（総容量３００μｅ）にＮａＣ／を加
えて約０，３　Ｍ　ＮａＣｅ　とした。その後、２倍容
量のエタノールを加え、この混合物を−７０℃に凍結し
、遠心によりＲＮＡを回収した。

ハイブリッド選択、エタノール沈殿させたｍＲＮＡは上
述のアフリカッメガエル卵母細胞の使用によりｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏで翻訳させた。卵母細胞の翻訳によって遊離さ
れた液体は、上記のバイオアッセイを用いてＢＳＦ−１
活性の存在について試験した。

上記方法により陽性の信号を与えたクローンのプールは
それぞれ１０個のコロニーから成るプールにさらに分割
し、そして上記ノ・イブリダイゼー７ヨン選択方法を繰
り返した。この方法により本発明者らは３つの陽性プー
ルを発見した。陽性信号を与えたクローンのプールを単
一コロニーに分け゛て、上記ノ・イブリダイゼーション
法を繰り返した。

この方法により本発明者らは単一の陽性コロニーを発見
した。ＭｕｓＩＬ−４と名づけたプラスミドＤＮＡは上
記の標準アルカリ溶菌法によってこの特定陽性コロニー
から得られた。

実施例９ ＭｕｓＩＬ−４クローンは上記の実施例Ｆに記載される
ジデオキシチェインーターミネーシ−ａノ法によってそ
の塩基配列を決定した。ＭｕＦ３工Ｌ−４クローンのヌ
クレオチド９配列は第４図に示され、これはＢＳＦ−１
遺伝子のＤＮＡ組成のほかにこの遺伝子の５′および３
′隣接領域を含む。第４図において、ヌクレオチドはＤ
ＮＡ配列の最初から番号が付いている。ＢＳＦｌ−１遺
伝子のコード領域はヌクレオチド番号１７　（Ｍｅｔ残
基）からヌクレオチド番号４３６（ｓｅｒ残基）まで伸
長しており、成熟タンノξり質はアミノ酸残基Ｈｉｓ（
ヌクレオチド番号７７）から始まる。ヌクレオチド９配
列から決定された対応するアミノ酸は適切なコドンの下
に示される。

実施例１０ 酵母宿主による成熟ＢＳＦ−１の発現 酵母宿主細麹によるＢＳＦ−１の高しイル発現金導くた
めに、ＢＳＦ−１遺伝子のコートゝ領域および３′隣接
領域の部分全第４図のＢＳＦ−１ｃＤＮＡ　　クローン
から取り出し、リンキングオリゴヌクレオチド″ヲ用い
てシラスミド″′ｐα３に挿入して組換え発現プラスミ
ド″（ｐＹαＢＳＦ’−１と命名）を作製した。出発プ
ラスミドｐα３はＡＴＣＣに寄託番号５３２２０として
寄託されている。第５図に示すように、ｐα３はプラス
ミ）”ｐＢＲ３２２由来の複製起点およびＡｍｐｒ　　
耐性遺伝子（太線部分）を含む。

ｐα３プラスミドはまた２μサ一クル複製起点および形
質転換酵母宿主（Ｔｒｐ栄養要求株）選択用のＴｒｐＩ
遺伝子（細線部分）を含む。ＢＳＦ−１配列（開放ボッ
クス部分）は以下でより詳しく論するように、合成オリ
ゴヌクレオチドの使用によりα因子配列の下流（３′）
末端に融合される。

ｐα３プラスミビはまた。第５図に示すように、Ｋｐｎ
Ｉ　　５’および３′接着末端および種々の制限酵素切
断部位（意図するｃＤＮＡクローニングフラグメントに
都合よく連結するためのＰｓｔＩ、　Ａｖｒ■およびＮ
ｅｏ工部位を含む）を有するリンキングオリゴヌクレオ
チビ（斜線ボックス部分）を含む。

この発現ベクターを制限酵素ＮｃｏＩで消化した。

ＮｃｏＩにより生成した５′突出部分を過剰のデオキシ
ヌクレオチド９三リン酸の存在下にＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて修復して平滑末端を作った。

その後ベクターを酵素ＫｐｎＩで消化し、そしてＫｐｎ
　工から平滑末端までの大きいベクターフラグメントを
精製した。

Ｓａｕ　３　Ａ　（ヌクレオチド番号１１１）からＳｅ
ｐ工制限酵素部位（ヌクレオチド番号５０１）−１での
ＢＳＦ−１遺伝子の５′コード領域の大部分および３′
隣接領域の一部は１例えばマニアチスらの上記文献に記
載される標準方法を用いて、５ａｕ３ＡおよびＳ日ｐ工
制限酵素の使用によりＭｕｓＩＬ−４クローンから分離
した。

次に、　ｃＤＮＡフラグメントの５′末端ヲｐα３クロ
ーニングはフタ−に連結するためにリンキングオリゴヌ
クレオチｌ−″金製造した。オリゴヌクレオチド９の組
成は、以下の表１および第５図に示すように、Ｋｐｎ工
接着５′末端とそれに続くα因子プロセッシング領域（
ＡＡＡ−ＡＧＮ）　　を含む。Ｈｉｓをコードするコド
ンＣＡＴ　　はα因子プロセッシング部位の３′側に位
置して、成熟ＢＳＦ’−１遺伝子の第１コドンとして役
立つ。

表１ に瑛Ｉ ＣＴＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＣＡＴ　ＡＴｃ
ＣＡＣＧＧＡ　ＴＧｃＧＡＧ　ＡＡＡ　ＡＡＴＣＡＴ　
ＧＧＡ　ＡＡＣＣＴＡ　ＴＴＴ　ＴＣ；Ｔ　ＧＴＡ　Ｔ
ＡＧ　ＧＴＧ　ｃｃｒ　ＡＣｒ！ｃ’ｒｃ　ＴＴＴ　Ｔ
ＴＡＣＡＣＴＴＧ　ＡＧＡ　ＧＡ ０％　ＡＡＣＴＧＴ　ＣＴＣＴＡＧ ｐｙαｆＢｓＦ−１−！ラスミド″ヲ作判するために、
マニアラスらの上記文献に記載されるような標準方法全
使用して、　ＮｃｏＩ平渭−Ｋｐｎ　Ｉ消化プラスミド
、　ＫｐｎＩ−８ａｕ３Ａリンキングオリゴヌクレオチ
ドおよび５ａｕ３Ａ−８ｓｐＩ　ＭｕｓＩＬ−４ｃＤＮ
Ａ　７ラグメントヲ連結する。得られたｐＹαｆＢｓＦ
’−１プラスミドはＡＴＣＣに冨託番号５３２２０とし
て寄託された。

その他の標準組換えＤＮＡ技術が同じ発現ベクターを作
製するために使用でき、また上記の詳細な作製方法はｐ
ＹαｆＢｓＦ−１ベクターへの挿入のためのＢＳＦ−１
ｃＤＮＡＤＮＡフラグメントラめに使用しうる種々の技
法の例証的かつ非限定的な一例であることを理解すべき
である。さらに、ＭｕｓＩＬ−４ｃＤＮＡ　　フラグメ
ントは酵母宿主にょるＢＳＦ−１の高レベル発現のため
に他の適当なベクター内に挿入されるだろう。

ｐｙαｆＢｓＦ−１発現プラスミド８は標準方法によル
Ｔｒｐ＋形質転換細胞の選択のためにＳ、セレビシェの
酵母菌株７９（α、シ上１−１、垣２−１）を形質転換
すべく使用された。形質転換に先立って、菌株７９はＹ
ＥＰＤ培地（１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％ペプト
ン、２Ｗ／Ｖ％グルコース）中で２×１０７細胞／ａｔ
の密度へ増殖させた。細胞ｉ　１０００Ｘ９．２２℃で
５分間遠心することにより収穫し、得られた沈殿物を滅
菌蒸留水で洗った。

その後酵母細胞はｌ／１ｏ容量のＳＥＤ　（Ｉ　Ｍ　ソ
ルビトール、２５　ｍＭ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）　
、および５９ｍＭジチオトレイトール）中に再懸濁して
３０’Ｃで１０分間インキュベートすることにより濃縮
した。この細胞−緩衝液混合物’ｉ　３００　Ｘ　９で
５分間遠心した。

沈殿物’ｔ　”／’ｔｏ容量の１Ｍソルビトールで１回
洗い、１／１ｏ容量の５ＣＥ（ＩＭツルピトー／Ｉｚ、
０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５，８）、０．ＯＩ
Ｍ　　ＥＤＴＡ）　中に再懸濁した。この溶液に細胞壁
を破壊するために１０　　　害毒のグルスラーゼを加え
、その後この溶　　く液を時々穏やかに攪拌しなから３
０’Ｃで（９）分間インキエバーションした。スフェロ
プラストの存在は、　　（顕微鋼スライド゛上の５ｗ／
ｖ％　ＳＤＳ　　１筒中ＫＩＯ”μｅの酵母細胞を希釈
して、４００×位相差で１ゴー　　（スト“を観察する
ことによって検定した。その後、　　〕細胞混合物全３
００　Ｘ　９　　で３分間遠心した。得られた沈殿物は
１／１ｏ容量の１Ｍソルビトールで２回洗い、次いでＣ
ａＳ（１Ｍソルビトール、１０ｍＭＣａＣｅ２）で１回
洗った。

その後、酵母スフェロプラストはペックス（Ｂｅｇｇｓ
）の上記文献に記載の方法にょシ発現イクターで形質転
換した。沈殿スフェロプラストｉ１／２ｏｏ　容量のＣ
ａＳ中に懸濁し、　　１．５ｍＡ’−ｒ−ッペ／ド１ル
ア管中に１００μｅアリコートずつ分割した。その後、
各アリコートに１〜１０μ６　（０，５〜５μ９）のプ
　　。

ラスミド”ＤＮＡ１加えた。この混合物を室温で１５１
分間インキュイージョンし、次に１ｍ／のＰＥＧ（２０
％ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ　　Ｃａ（Ｊ２．１０ｍＭ
トリス−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）　）を各アリコートに
加えてＤＮＡ）取込み全便した。室温で１５分後、混合
物を３５０く９で５分間遠心した。得られた沈殿物’ｋ
　１５０μｅりＳＯ３（ｌｏｚ／　　０２Ｍソルビトー
ル、６．７　ｔｒｔｌ　（７）１’ＥＰＤ培地、０．１
３ｍＡ！のＩ　Ｍ　ＣａＣｌ２．２７１１１（７）■乙
トリプトファンおよび３．７　ｍｌの水）中に再懸濁し
し。この混合物をＩ℃で２０分間インキ二は−ショ／し
た。その後細胞全平板培養した。

プロトプラス）／ＤＮＡ混合物の平板培養に先ｔって、
選択平板ヲ３７℃でプレインキュバーショ／した。１８
．２　ｒｔｒｌのソルビトール、２ｇ寒天、０．６憂ジ
フコ酵母窒素塩基（アミノ酸不含）、２ｇグレコース、
０．１　ｍｌ！の１％アデニン、０．４　ｍｅ（Ｄ　１
％ウラ／ルおよび必要に応じてアミノ酸類から成る溶融
７た上部寒天（４５℃）３ｍ／ｉ形淘転換細胞の各アノ
コートに加え、管内害物を選択平板上に注いだ。

二の平板ｆｔ３０℃で２〜４日間インキュベーバーン７
た。Ｔｒｐマイナス培地中に発生したコロニーは？ｒｐ
ｌ遺伝子をもつプラスミド、すなわち形質転換されたも
のを含んでいた。

バイオアッセイの前に、形質転換細胞を加〜閣ｗ、ｌの
ＹＥＰＤ中３０’Ｃで定常期になるまで増殖させた。

収穫時に、プロテアーゼ阻害剤のフェニルメチルスルホ
ニル（ＰＭＳＦ）　　およびペプスタチンＡを加えて、
それぞれ最終濃度全１ｍＭおよび１０μＭとした。その
後４００　Ｘ　９　　で遠心して細胞を除き、培地ｆ　
０．４５ミクロンのセルロースアセテートフィルターに
ューヨーク、コーニング、コーニング・グラス・ワーク
ス）全通して濾過した。滅菌上清を４℃で保存した。Ｂ
ＳＩＩ’−１は実施例２および３に記載の方法と同じ精
製法を用いて上清から精製した。精製したタンパク質産
物はＢ細胞増殖検定（実施例Ａ）により検定し、約Ｉ　
Ｘ　１０’単位／ミリリットルのＢＳＦ’−１活性を示
すことが判明した。

実施例１１ ヌクレオチド番号６７のＲａａ工制限酵素部位からヌク
レオチド番号４４０のＲｓａ工部位までのＭｕ日工Ｌ−
４クローンの部分が、ＢＳＦ−１遺伝子についてヒトｃ
ＤＮＡライブラリー全スクリーニングするためのプロー
ブとして使用された。第４図に示すようにこのプローブ
は成熟ネズミＢＳＦ’−１遺伝子の全コード領域を含む
。こうして、それは他の動物種の相同ＢＳＦ’−１遺伝
子とハイブリダイズするであろう。

ネズミｃＤＮＡヌクレオチドプローブは、マニアテスら
の上記文献１０８に記載される上記の標準方法を使用し
て二ックトランスレーンヨンにより放射性標識した。こ
の方法により、プローブは約５Ｘ　１１０８Ｃｐ／μｇ
　ＤＮＡの比活性に標識された。スクリーニング法で使
用する前に、標識クローンは１００℃の水中で１０分間
沸騰させ、その後氷上で冷却することにより変性した。

ヒトｃＤＮＡライブラリーはマイトジェン刺激ヒトＴ細
胞から抽出したポ’Ｊ　Ａ＋ｍＲＮＡ　　から作製され
る。ヒト末梢血白血球は１０ｖ／ｖ％ＦＯ８，５０Ｕ／
ＩＩ！ｊペニシリン、５０μｇ／ａｔ　ストレプトマイ
シン、３００　／Ｊ　ｇ／ｍｌ新鮮Ｌ新鮮用タミン、１
％ＰＨＡ（容量基準）およびＩＯμｇ　／ｍｌ　Ｐ　Ｍ
　Ｄ　Ａを補足したＲＰＭニー　１６４０　　で刺激す
る。培養の加時間後ｍＲＮＡ　ｆヒトＴｍａから抽出し
、その後実施例５に記載の方法によりポリＡ　ｍＲＮＡ
　　ｆ抽出タンパク質から分離する。ｍＲＮＡに対応す
る２本領ｃＤＮＡのライブラリーは実施例６に記載の方
法を使用して作製される。その後、ヒトｃＤＮＡライブ
ラリーは実施例８に記載のサザンブロッテインダスクリ
ーニング法の使用により放射性標識ネズミｃＤＮＡプロ
ーブでスクリーニングし１次いでスクリーニングされた
クローンを実施例Ｆに記載の核酸配列決定法の使用によ
り同定す名〇 当分針で習熟した者には明らかであるように。

本発明はその精神または本質から逸脱することなく上記
の実施態様以外の他の形態で具体化されうる。従って、
本発明の上記の実施態様はすべての点において例証的で
あるとみなされ、限定的であると考えられるべきでない
。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に説明される通
りであり、前述の実施例に限定されない。

【図面の簡単な説明】

本発明の実施態様の細部は添付の図面を参考にして説明
されるであろう。 第１図は高性能液体クロマトグラフィーでＢＳＦ’−１
を均質に精製した最終結果を示し、第１パネルは均質Ｂ
ＳＦ−１のＢｍ胞バイオアッセイの結果であり、そして
第２パネルは均質ＢＳＦ−１の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の
結果である。（第２パネルにおいて、レーン１の出発物
質Ｃ３Ｍ）　　は前のＨＰＬＣ法からの活性分画のプー
ルから成る。）第２図はＩＬ−２依存性ＣＴＬＬ細胞お
よび因子依存性Ｆ’ＤＣ−Ｐ２細胞の増殖を刺激する精
？！！　ＢＳＦ’−１の能力を試験する増殖検定の結果
を示す。 第３図は本発明によって生産された均質ＢＳＦ−１（ロ
）、組換えＩＬ−２（Δ）および組換えＩＬ−３（○）
が精製Ｂ細胞（・ξネルＡ）、因子依存性ＦＤＣ−ｐ２
　　細胞（・ξネルＢ）、工Ｌ−３依存性３２Ｄ細胞（
・ξネルＣ）および工Ｌ−２依存性ＣＴＬＬ細胞（・ξ
ネルＤ）の増殖全刺激するそれらの能力について試験さ
れた増殖検定の結果を示す。 第４図は本発明によって単離された成熟ＢＳＦ−１遺伝
子を含むＭｕｓ工Ｌ−４ｃＤＮＡ　ｐ　ｏ−７ノヌクレ
オチト９配列および対応するアミノ酸配列を示し、ヌク
レオチドはクローン配列の最初から番号が付けられてお
り、アミノ酸はタン／ξり質の成熟ＮＨ２末端（すなわ
ち矢印で示したＨｉｓ残基）からアミノ酸番号１４０の
Ｓｅｒ残基まで番号が付けられている。 第５図は酵母宿主細胞を形質転換して機能的ＢＳＦ’−
１を発現させるべく使用されるｐＹαｆＢｓＦ−ｌ　（
ＢＳＦ−を遺伝子のコード領域が挿入されている）の作
製方法を示す模式図である。 第３図 図面の糸孔 第１図 今画番Ｊ （内容に変更なし） 第２図 ５８、！５９　６０６１　６２　６３６４　　＆５６６
　６７今画 トド　　Φ〜 零の　）　ツｎ　！ｎ　酩　５８ ？漬　本＃！　　？＝Ｂ　ｔＬ　　ｂ　％　　冒豆ｅ＞
　　　ｇｚ　　　←−（５（＜ｌｔｎ　　　←ト５ラ　
ピ　貼　目互　紅　Ｅｆ ９：　皺、＝　８ご　零−Ｆ　　５Ｆ　　５−！ＬＩＪ
　　　ｔＪ：Ｊ：　　　Ｌ）Ｃり　　　のの　　＜ト＜
−’ｃ　　ＬＩＩ＋Ｌ）＊　　（５，（Ｊ、　　０゜３
石　　宜エ　　１二　　實＝　　璽＝８５訂　沓５鴎：
　荘ｅ　菖３５３ ←、　　くコ　　のコ　　０為　　く・　　Ｑ−唾　　
　　む　５６　　にｊ　８３８ミ　Ｓこ；　ド：　と、
＝　ミ２　♂二　し２（：Ｅ　　　ｕ−ｕ工　　０（５
く←　　Φくｏ　　ト・　ｈ　ｅ　　＜　）ｌ　　’−
〇ＣＩＩＩト　　←Ｊ：＜ｎｅｌ−ｈ＠　　Φ− ←　　　←Ｌ　　　４ｇ＜　　　（５の　　。−＜＜く
　　リ・　（ｓ　　（ｈ　　ｔＪ＋　　）ＩＩｌｂ　　
ロｆ、　　２　、＞　　尽：　　Ｂ　　ｇｕＬ）（Ｊコ
　　ｕｇ、ｕ−ｕｃｕ− く　　　　ヒ・　　く勢　　ト“Ｏ（ＩＩＩ　　　ｓ−
。 Ｌ）　　　　ＬＩ−（５（Φ〉＜り　　　の〉く　　　
のり　　Ｕｗ＊　　　Ｌ）３　　　＜ｏ　　　ｕコＱ　
　ト・　（５’ｋ　　（−（Ｊ　ｂ−−・く　　　υ−
）ｕ　　　（５の　　ｕＬ　　　ｕ−ＬＪ　　　ｕｅ　
　４＞　　ｕｅ　　Ｌｌ−（５：ＩＱ　　　トー　ロー
　く納　　←ロ　く−（５（１−１（！ＩＬ）　　　（
（の）の（５’ｉＸ　　”ａ呑　龜對　ｉ多　料　溢苓
　式　静ｈ　ｂ　　　Ｌ）　＃Ｉ　　　Ｌ）　１−　　
　Ｑ−←コ　　トー　　く杭くの　　ｌ−ｕ　　　Ｉ＋
＋ψ　　く工　　０」トド　　く」巨茨　３５　　Ｅ　
Ｂ　　どニ　ミご　しニ　ョ５（＃　　　Ｉ−”　　　
ｕ　’　　　（５＠ｌ　　　Ｈ＠　　　’；ｉ　’＞　
　　３　？（＜　　　）（Ｌ　　　ｌ＋の　　くの　　
υ−←ト＜＜滅３　壽　蕾と　３５　便’Ｅ、　　Ｅ？
　　５　ｉ３ご　し二　−二　＝；　？Ｓ　ぽζ　；δ
：　ｅ　　３　Ｇ　　と：Ａ　詳ご　ごζ　９品　；；
；”５’Ｚ　　目Ｎ　　Ｑ　１７１　　’ｅＪ　３　　
聰（Ｅ　２　９１ａＪ　　２−１ヨ５　肥　菖Ｓ　ご五
　■　ｉｉ　市　ＵＥ３　５＞　　Ｅｊ　　蓼３；３　
　目；：　　３；　　ｂ手続補正書（方力 昭和６３年　１月ＩｃＩ日 特許庁長官　　　小　川　邦　夫　　殿昭和６２年特許
願第１２２３９６号 ２、発明の名称 Ｂ細助諌り激因子 ３、補正をする者 事件との関係　　　出　願　人

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）サブマイドジェン濃度の抗免疫グロブリンＭの存
   在下でＴ細胞不含精製Ｂ細胞の増殖を刺激する能力につ
   いて検定したとき約３．２８×１０＾５Ｕ／μｇタンパ
   ク質の比活性を示し、インターロイキン２依存性細胞の
   増殖を促進する能力を有し、コロニー刺激因子依存性細
   胞の増殖を促進する能力を有し、そしてまた約１８．４
   キロダルトンの分子量および次のアミノ末端アミノ酸配
   列：Ｈｉｓ−Ｉｉｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ
   −Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌをもつこと
   によって特徴づけられるネズミＢ細胞刺激因子。
2. （２）水性培地中に懸濁されたタンパク質混合物からＢ
   細胞刺激因子を精製する方法であって、（ａ）シリカゲ
   ルに共有結合された有機リガンドを含む第１の逆相液体
   クロマトグラフィーカラムにタンパク質混合物を装填し
   、それによってＢ細胞刺激因子を第１カラムに保持させ
   、その第１カラムをアセトニトリル勾配で溶離し、そし
   てＢ細胞刺激因子活性を示す分画をプールすること；お
   よび （ｂ）第１の液体クロマトグラフィーカラムから溶離さ
   れてプールされた分画を、シリカゲルに共有結合された
   有機リガンドを含む第２の逆相液体クロマトグラフィー
   カラムに通し、それによってＢ細胞刺激因子を第２カラ
   ムに保持させ、その第２カラムを緩衝化Ｎ−プロパノー
   ル勾配で溶離し、そしてＢ細胞刺激因子活性を示す分画
   をプールすること； から成るＢ細胞刺激因子の精製方法。
3. （３）ネズミＢ細胞刺激因子をコードする実質的に純粋
   なＤＮＡ。
4. （４）第４図に示すヌクレオチド番号７７からヌクレオ
   チド番号４３６までの核酸配列から成る、特許請求の範
   囲第３項記載の実質的に純粋なＤＮＡ。
5. （５）その発現を生じさせ得る第２ＤＮＡ配列に遺伝子
   操作的に連結された、特許請求の範囲第３項記載のＤＮ
   Ａ配列。
6. （６）特許請求の範囲第４項記載の核酸配列によってコ
   ードされたポリペプチド。
7. （７）Ｂ細胞刺激因子の生物学的活性に実質的に影響を
   及ぼすことなく、１個またはそれ以上のアミノ酸が付加
   、置換または欠失された、特許請求の範囲第６項記載の
   ポリペプチド。
8. （８）第４図に示す核酸配列のヌクレオチド７７〜４３
   ６から成るＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし得る
   実質的に純粋なＤＮＡ。
9. （９）ネズミ以外の動物種から誘導される、特許請求の
   範囲第８項記載の実質的に純粋なＤＮＡ。
10. （１０）特許請求の範囲第９項記載のＤＮＡ配列を含む
    組換えＤＮＡ発現ベクター。
11. （１１）特許請求の範囲第１０項記載の発現ベクターに
    よって形質転換された宿主。