CZ289498A3 - Rekombinantní bílkovina GM-CSF lidí a farmaceutický prostředek, který ji obsahuje - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález-se týká rekombinantní bílkoviny GM-CSF primátů, konkrétně lidí, a farmaceutického prostředku, konkrétně injikovatelného farmaceutického prostředku, který tuto bílkovinu obsahuje.

Dosavadní stav techniky

Různé typy buněk, které se nacházejí v krvi, je možno všechny odvodit od základních buněk, které se mohou dále diferencovat. Tyto základní buňky mají dvě funkce: /1/ reprodukují samy sebe, takže udržují populaci základních buněk v těle a /2/ vytvářejí další buňky, které se diferencují do různých zralých typů krevních buněk. Buňka, která se diferencuje určitým způsobem, se názývá progenitor. Progenitor pro lymfocyty T, lymfocyty B, granulocyty,

♦

- 3 červené krvinky, destičky a eosinofilní buňky, jakož i nezralé progenitory, které mohou dávat vznik různým typům zralých bunék byly pokusně studovány jak in vivo, tak in vitro, jak je popsáno například v publikaci Dexter, T.M. 1983 J. Pathology 141 415 - 433. In vitro bylo možno prokázat, že prolyferace a/nebo diferenciace každého typu progenitoru závisí na spécifických faktorech, které je možno odvodit z různých zdrojů. Například progenitory pro Červené krvinky vyžadují přítomnost faktorů, který byl nazván erythropoietin. Faktory, kterých je zapotřebí pro přežitípf, prolýferaci a diferenciaci myeloidních progenitorů pro tvorbu zralých neutrofilních granulocytů, monocytů a zralých makrofágů se nazývají faktory, které podporují tvorbu kolonií (CSF).

Účinnost těchto faktorů byla velmi důkladně studována u myší. Většina orgánů dospělých myší produkuje látku s účinností CSF. Sloučeniny, které mají určitou účinnost tohoto typu byly získány z různých tkání a různými způsoby, tyto látky se však od sebe poněkud liší svými biochemickými vlastnostmi.

Z tohoto důvodu zůstává strukturní příbuz/fost různých faktorů zatím neznáma. Mimoto se zdá, že CSF působí pravděpodobně ve více než jednom stupni vývoje gra- 4 i nulocytů a makrofágů, přičemž opět není známo, zda je jediný faktor zodpovědný za všechny typy účinnosti nebo zda je zapotřebí, aby v každém stupni působil jiný faktor, jak je podrobněji popsáno v publikaci Burgess, A. a Metcalf, L. 1980 Blood 56 |

I

947 - 957 . í z

Látka s účinností lidského CSF byla získána z placenty, některých taní plodu, makrofágů a ze stimulovaných T-buněk. Linie T-buněk (Ho), která vytváří jednu nebo vetší počet látek s účinností CSF byla získána z nemocného s leukémií,]' při níž byly zmnoženy určité varianty buněk T (Leukemická retikuloendothelliosa),.jak bylo popsáno v publikaci Golde..a další 1978 Blood 52 1068 - 1072..

Schopnost CSF stimulovat granulocyty a makrofágy znamená, že farmaceutické prostředky , , Λ* s touto účinností by byť možno klinicky použít v těch situacích, kdyby bylo zapotřebí zvýšit produkci buněk myeloidního typu. Někteří nemocní s velmi vysokými hladinami normálních granulocytů měli ve skutečnosti nádory, které produkovaly příliš veliké mnpžství CSF. V jednom případě došlo po chirurgickém odstranění nádoru k rychlému poklesu počtu granulocytů na normální hladinu, což by vedlo k názoru,

- 5 ί

I ι* že tímto způsobem by bylo možno regulovat počet obíhajících granulocytů. Tento názor byl vysloven také v publikaci Hocking, V., Goodman, J., a Golde D,, Blood 61 600 (1983). Farmaceutické prostředky s obsahem CSF je možno užít klinicky při léčbě potlačení dřeně, která je způsobena po ozáření nádorů nebo při chemické léčbě těchto nádorů, Mimo to farmaceutické prostředky s obsahem CSF by mohly být užitečné při léčbě těžkých infekcí, protože CSF může zvýšit počet granulocytů a/nebo monocytů a/nebo může tyto elementy aktivovat.

Existují různé typy známé účinnosti

Z z

CSF, včetně granulocytární účinnosti (G-CSF), učiňz nosti na makrofágy (M-CSF), účinnosti na. granulocyty i makrofágy (GM-CSF) a účinnosti na větší počet těchto buněk. Vynález se zvláště zabývá otázkou výroby GM-C3F. Bílkoviny tohoto typu již byly izolovány z různých živočišných zdrojů, vynález se však zvláště týká výroby CSF ^savců, zvláště člověka a opic.

Biologické a biochemické studie látek s účinností CSF byly až dosud brzděny skutečností, že jednak bylo těchto látek k dispozici velmi milé množství, zvláště pokud jde o CSF lidí a/nebo dalších primátů, jednak byly tyto látky nečisté. Je zřejmé,

- 6 že by bylo žádoucí přesně identifikovat bílkovinu *

/ / ^z v nebo bílkoviny, které jsou nositely účinnosti C3F.

Bále by bylo žádoucí získat stálý zdroj CS?, s výhodou primátů a zvláště člověka, tak, aby bylo možno

b.

I snadno získat tyto bílkoviny-ve větším množství a i s čistotou, která je dostatečná pro zjištění biolo- * gických a biochemických vlastností těchto látek, . aby Jíje pak bylo možno použít k léčbě.

.mu Afc. a . .. * ·— ' -UJ- * _*·—« ... ._ x + ·’ . Λ . -Λ- · ’

V poslední době byla vyvinuta technika molekulárního klonování, která dovoluje klonovat sled nukleotidů, který je kódem pro bílkoviny a tak získat bílkovinu ve větším množství při vhodné volbě hostitele a vektoru, jak bylo popsáno v hnis publikaci Maniatis, T. Molecular Cloning - A Laboratory Manuál Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν.Ϊ. 1982. Bílkovinu je možno izolovat a Čistit běžnými způsoby. Způsoby klonování, kter£ by·? ly až dosud použity je možno obecně rozdělit na tři skupiny: (1) způsoby, které jsou založeny na znalosti struktury bílkoviny, například na znalosti sledu ami- * nokyselin, (2) způsoby, založené na identifikaci bílk kořiny, jejíž expresi došlo při použití klonovaného genu použitím protilátky, specifické pro tuto bílkovinu a (3) apůsoby, založené na identifikaci RKA,

- 7 kterou je pák možno podrobit translaci za získání bílkoviny, pro niž je kódem uvedený gen.

Všechny tyto způsoby jsou velmi, nesnadné v případě, še bílkovina, například CSF je k disposici ve velmi malém množství. Znamená to, še v případě, še je nesnadné získat dostatečné mnoýství čištěné bílkoviny, je také nesnadné stanovit sled , v

aminokyselin této bílkoviny nebo alespoň část to/hoto sledu. Identifikace bílkoviny expresi vazbou na protilátku se s výhodou provádí při použití monospecifického polyklonálního antisera s vysokým titrem. Toto antiserum však rovněž nelze získat bez většího množství čisté bílkoviny, ktea se užije jako angigen. Monoklonální protilátka poskytuje alternativní' přístup, avšak požadovaná protilátka se také velmi nesnadno získává bez vhodného antígenu a mimo to monoklonální protilátka nemusí reagovat s bílkovinou ve formě, v níž u této bílkoviny došlo k expresi při dostupném systému hostitele a vektoru. Mimo to k translaci RKA za získání identifikovatelné bílkoviny je zapotřebí, aby požadovaná RNA byla přítomna ve zdroji RNA v dostatečném množství, aby ji bylo z

možno oddělit. Relativní dostatek RNA, která je kódem pro určitou bílkovinu, jde obvykle ruku v ruce dostatkem bílkoviny, takže je mumu říci, že oíiKovina vyskytující se v malém množství je obvykle kódována mRNA, která se vyskytuje rovněž v malém množství.

Buněčná linie Mo byla užita jako výchozí materiál pro čištění lidského CSF a také pro identifikaci odpovídajících typů mRNA. Avšak i při použití tohoto poměrně dobrého zdroje CSF’je nesmírně nesnadné izolovat dostatečné množství uvedené bílkoviny pro strukturální studie.

Podstata vynálezu

Nyní. byly. .připraveny _nové„ rekombinantní_ .bílkoviny^.* . GM-CSF lidí.

V souladu s tím se vynález týká rekombinantní bílkoviny GM-CSF lidí, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1 za šipkou pro CSF-Thr nebo CSF-Ile, jejích alelických variací a bílkovin odpovídajících aminokyselinovou sekvencí přirozeně se vyskytující bílkovině GM-CSF lidí, s tím, že v nich byla alespoň jedna aminokyselina přidána, nahrazena nebo odstraněna bez' podstatného ovlivnění aktivity (účinností) GM-CSF lidí v testu na lidské kostní dřeni, získatelné expresí v prokaryotických buňkách nebo kvasinkách, buňkách COS nebo CHO, a vykazující v testu na lidské kostní dřeni specifickou aktivitu (účinnost) alespoň zhruba 1 χ 10⁷ jednotek na mg, . výhodně alespoň 2 . χ 10⁷ jednotek na mg a ještě výhodněji alespoň zhruba 4 χ 10⁷ jednotek na mg.

V případě., že se bílkovina podle vynálezu získává rekombinantní expresí v prokaryotických buňkách, je výhodně získatelná rekombinantní expresí v Escherichia coli. Výhodně lze bílkovinu podle vynálezu získat rovněž z buněčné linie Mo.

Účelně je bílkovinou GM-CSF lidí CSF-Thr obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1 za šipkou pro

CSF-Thr nebo její variace, kde jedna, dvě, tři, čtyři nebo pět aminokyselin bylo nahrazeno jinou aminokyselinou, nebo jinými . aminokyselinami, . bez podstatného ovlivnění aktivity GM-CSF v testu na lidské kostní dřeni, výhodně bílkovina, která aminokyselinovou sekvencí odpovídá aminokyselinové sekvenci CSF-Thr,' uvedené na obr. 1 za. šipkou pro CSF-Thr, či CSF-Ile obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1 za šipkou pro CSF-Ile nebo její variace, kde jedna, dvě, tři, čtyři nebo pět aminokyselin bylo nahrazeno jinou aminokyselinou, nebo jinými aminokyselinami, bez podstatného ovlivnění aktivity GM-CSF lidí v testu na lidské kostní dřeni, výhodně bílkovina, která aminokyselinovou sekvencí odpovídá aminokyselinové sekvenci CSF-Ile, uvedené na obr. 1 za šipkou pro CSF-Ile.

Rekombinantní bílkoviny GM-CSF lidí podle vynálezu jsou růstové a diferenciační hormony pro buňky myeloidního systému. Jsou určeny například pro klinické použití pro léčení rayelosuprese, zejména v případě (symptomatické)

Λ granulocytopenie po chemické léčbě nádorů nebo léčbě nádorů ozařováním. Bílkovinu podle vynálezu lze tedy spolu s vhodným nosičem zpracovat do formy farmaceutického prostředku, výhodně injikovatelného farmaceutického prostředku, který je dalším provedením vynálezu.

Pro klonování cDNA kódující bílkovinu s aktivitou CSF, tedy přípravu rekombinantního zdroje bílkoviny, lze použít způsob klonování, pro který je hutný pouze test aktivity CSF. Vhodné metody pro měření CSF jsou popsány dále v příkladu 2. Níže je popsán rovněž způsob čištění rekombinantní bílkoviny GM-CSF lidí.

Bílkovinu podle vynálezu lze získat za použití genového inženýrství pěstováním hostitelské buňky (mikroorganismu nebo buněčné linie), transformované vektorem obsahujícím cDNA kódující výše uvedenou bílkovinu s aktivitou CSF (tedy

CSF/cDNA). Vektor pro transformaci obsahující CSF/cDNA lze

připravit a izolovat následujícím způsobem, při kterém se:

připraví RNA z buňky, která produkuje CSF; z uvedené RNA se připraví polyadenylovaná mRNA; z uvedené mRNA se připraví cDNA s jednoduchým řetězcem; tato cDNA s jednoduchým řetězcem se převede na cDNA s dvojitým řetězcem;

tato cDNA s dvojitým řetězcem se včlení do vektoru pro » transformaci a tímto vektorem se transformují bakterie za vzniku kolonií; * spojí se vždy 200 až 500 kolonií a z každé skupiny kolonií se izoluje plasmidová DNA;

.. plasmidovou DNA .se transfektuji-vhodné- hostitelské buňky pro— - ---expresi bílkoviny CSF;

transfektované buňky se kultivují a u supernatantu se testuje aktivita CSF; a vyberou se vzorky pozitivní na CSF a kolonie použité pro vytvoření pozitivních vzorků se zkoumají pro zjištění, která kolonie-vy-kazu-je-aktivitu CSF. ......

Popis obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje sled (sekvenci) DNA, který je kódem pro bílkovinu CSF. Úplná sekvence DNA kóduje lidský CSF. Změny uvedené u lidského sledu jsou rozdíly, které odlišují tento sled od sledu gibbona. Znázorněn je »

rovněž sled aminokyselin, který vzniká při použití uvedeného sledu DNA.

Na obr..2 je sb znázorněn způsob výroby plasmidu pTPL z plasmidu pAdD2 6SVpA(3) .

Obr. 3 je schematickým pokračováním obrázku 2 a znázorňuje způsob výroby plasmidů p91023 z plasmidu pTPL.

Obr. 4 je schematickým pokračováním obrázku 3 a znázorňuje plasmid p91023(B).

Na obr. 5 je znázorněna analýza Čištěné bílkoviny CSF (pomocí SDS-PAGE, tedy elektroforesy v SDS-polyakrylamidovém gelu).

Na obrázku 6 je znázorněn pTALC-185R a na obrázku 7 plasmid CSF Plasmid AJ-14.

Dále budou vysvětleny některé zde používané termíny, pro snadnější porozumění vynálezu. Pokud by se rozsah definice odlišoval od běžného rozsahu v oboru, bude to dále uvedeno, a pro interpretaci pojmu je rozhodující definice uvedená v tomto textu.

Amplifikace (nebo pomnožení) znamená pochod, při němž buňka produkuje opakování genu ve vlastní chromosomální DNA.

Výraz CSF Se používá k označení biologické účinnosti (aktivity), která je dále definována metodami stanovení.

Bílkovina CSF je bílkovina z primátů, která má účinnost CSF. Pro potřeby vynálezu je pojem bílkovina CSF užíván i pro modifikované bílkoviny CSF, alelické variace bílkoviny CSF a pro tuto bílkovinu i v případě, že je před její řetězec zařazen zbytek ΜΞΤ.

Směrem dolů znamená směrem ke 3 -zakončení nukleotidového sledu.

Sled, podporující reakci je nukleotidový sled, který může způsobit potenciaci transkripce genu nezávisle na své poloze vzhledem k to-»·“ U — * UI - -< * H· muto genu nebo na orientaci sledu.

Gen je sled deoxyribonukleotidů, z z který je kódem pro danou bílkovinu. Pro účely vynálezu gen nemá obsahovat oblasti, které jsou pro translači zbytečné, například signální sledy, póly adenylové řetězce, promotory nebo podpůrné sledy.

Vazba je způsob, při němž dochází z

ke tvorbě íosfodiesterové vazby mezi 5 -zakončením z

a 3 -zakončením dvou řetězců DNA. Vazbu je možno provést několika známými způsoby při použití enzymů včetně T4 ligázy.

Orientace je pořadí nukleotidů vé sledu LNA. Převrácená orientace sledu LNA je takoz z vá orientace, při níž je pořadí 5 - a 3 -zakončení jednoho sledu obráceno vzhledem k tomuto pořadí ve druhém sledu. Toto uložení je důležité pro transkripci dalšího sledu DNA ve zdroji DNA nebo pro replikaci vektorů, které obsahují uvedený sled.

• — Transkripce je syntéza RNA z původní

DNA.

Transformace znamená změnu genotypu buňky tím, že buňka přijme cizorodou DNA. V některých případech je možno transformaci prokázat změnou

V» v fenotypu buňky. Transformované buňky se nazývají transv v formanty, buňky před transformací jsou původní buňky.

Translace je syntéza polypeptidů z mRNA.

z

Účinnost CSF je možno získat z velkého poctu buněčných zdrojů včetně prostředí, v němž v

se nacházejí mononukleární buňky periferní krve, z plicní a placentární tkáně, z kostní dřeně, z moči nemocných, který trpí chudokrevností, z krevního sera a z normálních a neoplastických linií T-lymfocytů a mono)řnukleárních fagocytů. Jednou buněčnou linií, která produkuje CSF je linie Mo. SSF, produkované touto buněčnou linií je znám jako CSF pro granulocyty a makrofágy (GM-CSF), jde o lidský CSF.

Jeden zdroj CSF opice Gibbon je linie T-buněk, která je označena jako UCD híLA-144. Tato buněčná linie byla uložena ve sbírce ATCC, odkud je možno ji získat pod číslem uložení.

Aby bylo možno izolovat klon CSF podle vynálezu, bylo nutno použít nového způsobu, který vyžaduje zejména stanovení účinnosti CSF.

v

Nejprve je nutno identifikovat buňku, která produv kuje CSF, například T-lymfocyty nebo jiné buňky_r jak-bylo uvedeno'svrchu.'Pak se izoluje mRNA této^- v

buňky. S výhodou se užívá T-lymfocytů. V tomto případě s mRNA, která je vázána na membránu a obsahuje m-RNA pro lymfokiny/oddělí od volné mRNA v buňkách. Tímto oddělením se obohatí izolovaná mRNA 5 až lOlcrát o sled, který je nutný pro výrobu lymfokinů a tím se snižuje námaha, vynalezená na identifikaci příslušného klonu. Pak se připraví chromatografií na oligo dT celulos^X polyadenylová mRNA.

Z mRNA se připraví skupina cDNA při použití vektoru, vhodného pro přenesení do hostitele

Z k expresi požadované bílkoviny s účinností CSF.

Pak se připraví cDNA‘použitím standardních způsobů ze svrchu získané mRNA. Hybridní RNA/cDNA se pak převede na cDNA s dvojitým řetězcem a tento materiál je pak možno včlenit do vhodného vektoru .

Vhodný systém hostitele a vektoru pro isolaci klonu CSP je založen na expresi cDNA ve vhodném vektoru pro transformaci. Vhpdným vektorem pro transformaci může být vektor, získaný přechodným včleněním DNA do buněk ssavců způsobem podle líublikace Mellon, Ρ., V. Parker, Y. Gluzman, T. Maniatis 1981 Cell 27 279 - 288. Aby bylo možno isolovat požadované transfofmanty CSiff, není nutné, v

aby všechny buňky populace stabilně obsahovaly exogenní geny, které by bylo možno využít k expresi požadovaného CSP jako produktu. Je možné přechodně včlenit exogenní geny do subpopulace buněk tak, aby tato subpopulace produkovala požadovanou bílkovinu alespoň několik dnů. Protože nem zapotřebí užít další látky k označení podle vynálezu, může dojít k tomu, že exogenní DNA se ztratí při buněčném růstu v průběhu jednoho až dvou týdnů. Avšak dva až tři dny pro přenesení do vhodných buněkyásavců je možno produkty nalézt a prokázat.

Systém hostitel a vektor, který je vhodný pro toto použití je buněčná linie opic CV-1, transformovaná působením defektíáfrní molekuly DNA SV40 jak bylo popsáno v publikaci Gluzman, Y., Cell 23 175 - 182, 1981. Transformované opičí buňky CV-1,

- 16 které obsahují defektivní SV-40 DNA jsou označovány COS (CV-1, defektívní, SY40), tyto buňky neobsahují uplnou kopii genomu SV-40, avšak produkují vysokou urovea velkého antigenu T a dochází u nich k repliv kaci SV40 DNA. Tyto buňky také podporují replikaci *

SV40, které chybí na začátku některé části a bakteriálního plasmidu,. který obsahuje SV40 podle publikace -Myers,'R.M.-a Tjian, R.-19SO»PNAS 77 '6491 —'64-95· · Tento systém tedy představuje prostředek pro amplifikace přenesené exogenní DNA přes SV40 za zvýšení hladiny mRNA a bílkoviny ,^fejíž expresi dochází za přítomnosti exogenní DNA. Je však možno užít i podobné systémy.

Vekt/<^\ užité k expresi CSR-typicky obsahují další pomocné části jako pedpůrn-é^l-edy-, ' / f promotory, introny, polyadenylovaná místa, 3 -nekodffis-é^oblasti a aktivátory translace, jak bude dále podrobněji vysvětleno. , .

_t Vektory mphou obsahovat -podpůrné s.l.ar

-dy. Eedplu.jué_sledy se odlisují od promotoru, avšak z

mají s ním podobný účinek. Jejich funkce na buněčné / úrovni není ještě dobře známa, avšak jejich jedinečnou vlastností je schopnost aktivace nebo potenciace transkripce bez závislosti na jejich poloze nebo

- 17 orientaci. Promotory musí hýt uloženy směrem vzhůru, kdežto jctndpŮTfte-fllody- mohou být uloženy směrem vzhůz ru od 5 -zakončení promotoru, uvnitř genu jako intrnn nebo směrem dolů mezi genem a pólyadenylováným místem z

nebo 3 -zakončením polyadenylovaného místa. Promotory s převráceným sledem nejsou funkční, avšak převráce_f Že?·, né podpůrné sledy jsou účinné. -rPodpůrné-sled-y- mají vliv na promotory pouze v tom případě, še jsou příz tomny na tomtéž řetězci DNA. Jejich úloha je podrobněji vysvětlena v publikaci Khoury a další, Cell 33, 313 - 314 (1983).

^''•nevýhodné podpůrné—s-Ledy- pro použití z

v buňkách/ ssavců je možno získat z živočišných viiů, například z opičího viru 40, z viru polyomu, z viru papillomu skotu, z retroviru nebo adenovifu. Ideální

S '/ -·· ¹ / , '•'—y·. <χ·« *« f je, aby pedpůríý~sTpřkby1 odvozen od viru, pro který v

je buňka hostitele propustná, tj, z viru, který norv málne infikuje buňky tohoto hostitele.

-dy- z virů / je možno snadno získat z virů běžně dostupných ze sbírek. Oblasti podpurných^sLed^^z některých virů, například z viru Rousova sarkomu a opičího vitu 40 jsou dobře známy, jak bylo popsáno v publikaci See Lučiv a další, Cell 33., 705 - 716 (1983). Je rutinním postupem molekulární biologie vyjmout .0HUF « tyto oblasti podle známých map pro působení restrikč-. nich enzymů pro jednotlivé viry a v případe potřeby modifikovat tyto oblasti, aby bylo možno včlenit podpůmý sled do vektoru požadovaným způsoben. Tyto postupy jsou popsány například v publikacích Kaufman a další, J. Mol. Ebl., 159, 601 - 621 (1982) a Mol. Cell Biol. 2 (11), 1304 - 1319 (1982). Je také možno postupovát tak, že se podpůr-nýi-sl-ed syntetizuje z udaju, které jsou o sledu známy. Ded-půrné_alňd.y z viiů obsahují obvykle méné než 150 párů baží a ^ou dostatečně malé,, aby je bylo možné syntetizovat.

Další součástí vektoru by měl být polyadenylovaný sled. Jde o sled DNA, který je uložen směrem dolů od přenášené oblasti genu, obvykle těsně pod místem, v němž,, se zastavuje transkripce. BřidáváÁ^ _v, _v , se obvykle adeniy ribonukleotidy^čímž vzniká polyadenin. nukleotidové zakončení na 3 -zakončení mkrlA. Polyadenylace je důležitá pro stabilizaci mRNA proti degradaci v buňce, která může snížit množství mBNA a tím také množství výsledné bílkoviny.

Eukary$ticltá po lyad/n^ ová zakončení jsou dobře známa. Eexanukleotid 5 -AAUAAA-3 se nachází ií až 30 nukleotidů od místa, v němž polyadenylace už začíná. Sledy DNA, které obsahují polyadenylo- 19 váný sled, je možno získat z virů podle hn publikovaných zpráv. Polyadenylovaný sled je možno získat —'/ například zo beta-globinu a z opičího viru 40, avšak pólyadenylováná místa, izolovaná z virů jsou výhodnější. Protože tyto sledy jsou známé, je možno je syntetizovat in vitro a navázat na vektory běžným způsobem.

Sled, který odděluje polyadenylovaný sled od kodonu, v němž,se zastavuje translace, je s výhodou ne přenášený například eukaryatický gen bez promotoru. Protože promotor není přítomen, k expresi sledu nedojde. Tento sled by měl být do·]

V statečně dlouhý, rádu až přibližně 1000 baží od kodonu pro ukončení translace k polyadenylovanému sledu. Tento 3 - nepřenášený sled⁷má obvykle za následek zvýšení výtěžku výsledného produktu. Vektor může končit přibližně 30 párů baží směrem dolů od póly adenyl ováného sledu, je však výhodnější zachovat

Z . '

-sledy, které se nachází směrem dolů od polyadenylováného sledu v jejich původní formě. Jde o sletí dy, které mají obvykle 20D až 600 párii, baží smetem dolů od polyadenylovaného sledu.

Přítomnosti intronů v nepřenášený-------části vektoru může rovněž zvýšit výtěžky výsledného

- 20 produktu. Tyto introny je možno získat i jiných zdrojů než z buňky hostitele nebo z gen/0c'Je například možno užít hybridní intron, který se izoluje z adenoviru nebo z genu pro imunoglobulin, včleněného směrem dolů od místa pro počátek transkripce v adenoviru, čímž -je možno zvýšit výtěžek výsledného produktu.

. „Při. výhodném provedení způsobu pro ^R i. ·· klonování CSP a pro konstrukci vektoru pro expresi je možno užít aktivačního genu pro translaci, Akti✓ vátory translace jsou geny, které jsou kódem pro -bilv kovinu nebo pro RNA, které ovlivňují translaci požadované mRNA. Nejlepším příkladem je gen, který je spojený s xxxek adenovirem (VAVAI), u tohoto genu dochází k transkripci a interakci se sledem v 5 -nepře ná&amL—. oblasti mRNA adenovitu, jak bylo popsáno v publikaci Thimmappaya a další, 1982 Cell 3 543. Potřebné sledy pro aktivaci ttanslave působením VA RNA leží v oblasti vedoucího sledu mRNA adenoviru. Tento sled pochází z genomu adenoviru a nachází se po transkripci v blízkosti 5 -zakončení. VA RKA může aktivovat translaci mRNA. Vektory pro klonování a expresi cDNA tedy s výhodou obsahují tuto formu genů z genu adenoviru VA.

Tyto vektory mohou být syntetizovány známým způsobem. Složky vektorů, například ^r, promotory a podobně je možno získat z přírodních zdrojů nebo syntetizovat, jak bylo uvedeno svTchu. Zásadné v případě, že tyto složky je

Λ _t možno nal/ ézt v DNA, kterou je možno získat ve velν' rf—· kém množství, například jako složku virů nebo je~li možné tyto složky snadno syntetizovat, pak je možno tyto složky snadno získat při péužití restrikčních enzymů a tím získat i velká množství vektorů tak, že se pěstuje organismus, který je zdrojem DNA, DNA yse rozštěpí příslušnou endonukleásou, fragmenty se oddělí, fragment s obsahem hledaného sledu se identifikuje a izoluje. Obvykle se vektor pro transformaci získá v malém množství a pak se naváže na vhodný vektor pro syntézu, u něhož dochází k autonomní replikaci, například na prokaryotický plasmid nebo na fág. Ve většině případů je možno užít plasn^pB322, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Kaufmana a dalších.

Vektory pro syntézu jsou užity ke klonování vektorů pro transformaci běžným způsobem, například přenesením do prokaryotického organismu, replikací vektoru pro syntézu za získání vysokého počtu kopií s následnou izolací tohoto vektoru rozštěpením buněk a izolací tohoto vektoru z buněčné drti.

Vekt/ory s obsahem cDNA, připravené z buněk, které produkují látky s účinností CSF se pak přenesou do E. coli a pěstují na plotnách v Petriho miskách v množství přibližně 20ΌΟ kolonií v misce. Pak se kolonie přenesou na nitro celulozový filtr a filtr se přenese na novou plot nu, která se uchovává jako vzorek. Po vypěstování ko^ílonií se tyto kolonie pomnoží a srovnávají se / s-původními koloniemi tak, aby úseky filtrů bylo možno identifikovat s odpovídající částí plotny, užité jako vzorek.

Každý filtr se rozřeže na úseky, které obsahují předem stanovené pocty Jí kolonií,

Λ s výhodou přibližně 200 až 500 kolonií na usek. Kolonie z každého useku se přenesou do živného prostředí, například do L-bujonu, Jí bakterie se oddělí odstředěním a izoluje se plasraidová DNA. Plasmidová DNA z každého useku filtračního papíru se přenese do vhodného hostitele k dosažení exprese bílkoviny. Výhodným vektorem pro syntézu je

mutanta p^smidu pBR322 z E. soli, v němž byly vyv nechány sledy, které poškozují eukaryotické bunkv, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené citaci Kaufmana a dalších. Při pouští této mutanty odpadá* potřeba zničit zbytek plasmidu před pxaae-sení-m. Po vypěsto-r vání buněk po transfekci se prostředí zkoumá na pří-

.tiafeost látek s účinností ESP. Positivní výsledek z

ukazuje na to, že ve zkoumaném useku filtru se nachází kolonie, která obsahuje CSF/cLNA.

Aby byli možno stanovit, který z klonu useku filtru obsahuje CSF/cLNA, je zapotřebí z

vypěstovat každý klon z useku filtru. Kultury se pak uloží do matrice a připraví se směs každé horizontál ní řady a každého vertikálního sloupce matrice. Z těchto směsí se připraví vzorky LNA a provede se transfekce do hostitelských buněk k dosažení exprese. Supernatanty, získané tímto způsobem se znovu zkoumají na účinnost CSF. V obvyklém případě má tuz to účinnost jedna směs' vertikálního sloupce a jedna směs horizontální řady. Společný klon pak obsahuje CSF/cLNA. V případě, že matrice obsahuje více než jeden pozitivní klon, je pozitivní více než jeden sloupec a více než jedna rada. V tomto případě je zapotřebí dále roztřídit malé množství klonů, u nichž by přítomnost CSF/cDNA padala v úvahu.

CSF/cDNA se z- klonu izoluje pomocí restrikčních enzymů a známým způsobem je možno zjistit sled. Je zřejmé, že popsaný postup je možno použít k získání CSF/cDNA z jakéhokoliv zdroje. Úplný sled je znázorněn na obr. 1 současně s předpokládaným sledem aminokyselin bílkoviny, která je produktem po translaci.

Sled DNA, který je kódem pro bílkovinu s účinností CSF, tak, jak je znázorněn na obr. 1, může být modifikován běžným ^způsobem, čímž je možno získat pozměněný výsledný protein CSF, 'který stále má požadovanou účinnost při testech. 'Je’“ například možno jednu, dvě, tři, čtyři nebo pět aminokyselin nahradit jinými aminokyselinami. V belgickém patentovém spisu č. 898 016 se popisuje' typický způsob náhrady cysteinu například serinem.

CSF/cDNA získaná ~zde'· popsaným- způsobem obsahuje úplný., gen, kterému předchází kodon ATG a CSF/cDNA, který je kódem pro alelické variace bílkoviny CSF. Jedna alela je znázorněna na obr. 1. Další alela, která byla nalezena při práci na vynálezu má thymidinový zbytek v poloze 365 místo cytosinového zbytku,, který je znázorněn na obr. 1. Bílkovina CSF podle vynálezu zahrnuje také 1-methioninový derivát {Met-CSF) a alelické variace bílkoviny CSF. Úplná bílkovina CSF, tak, jak je znázorněna sledem na obr. 1, začíná sledem Ala-Pro-Ala-Arg..., jehož začátek je označen šipkou po nukleotidu v poloze 66 na obr. 1. V případě Met-CSF začíná tato látka sledem Met-Ala-Pro-Ala-Arg. . . . Alelická variace, znázorněná na obr. 1, obsahuje Thr v poloze 100 (zbytek začíná u Ala za šipkou) a je možno ji označit jako CSF (Thr). Jiná variace má zbytek Ile v poloze 100 a je možné ji označit jako CSF (Ile) . Pro úplnost zde uvádíme, že zde používaná zkratka CSF-G označuje GM-CSF gibbona.

Čištěná bílkovina CSF má’ specifickou účinnost (aktivitu) alespoň zhruba lxlO⁷, s výhodou alespoň 2xl0⁷ a ještě výhodněji alespoň 4xl0⁷ jednotek na mg bílkoviny, při provádění testu účinnosti ná buňkách lidské kostní dřeně.

Systémy hostitel-vektor pro expresi CSF mohou být prokaryotické nebo eukaryotické,-' avšak vzhledem ke komplexnosti CSF je výhodnějším systémem pro expresi systém ze savce. Exprese se snadno dosáhne transformací prokaryotických nebo eukaryotických buněk vhodným vektorem pro CSF. Sled DNA, získaný výše uvedeným způsobem, může být exprimován přímo v buňkách savce za řízení vhodným promotorem. Je možno užít heterologní promotory, které jsou v oboru dobře známy. Aby bylo možno dosáhnout exprese CSF v prokaryotických buňkách nebo buňkách kvasinek, je nutno odstranit vedoucí sled (sled pro sekreci). Poloha kodonu pro N-zakončení úplného proteinu CSF je znázorněna na obr. 1. Jakmile se získá požadovaný klon CSF/cDNA, je možno užít příslušné známé prostředky k dosažení exprese bílkoviny CSF, například včlenění do příslušného vektoru, přenesení vektoru clo příslušné buňky hostitele, selekce a transformace buněk’¹ a pěstování transformovaných buněk k dosažení exprese CSF. Takto získaná bílkovina CSF může mít methioninový zbytek na N-konci bílkoviny (jde tedy o Met-CSF). Úplné maturované (zralé) bílkoviny, produkované prokaryotickými a eukaryotickými buňkami budou mít sled aminokyselin popřípadě totožný, avšak eukaryotické buňky mohou produkovat produkt, který bude do určité míry jinak glykosylovaný než původní přírodní produkt. Pokud se exprese provádí v prokaryotických buňkách, výhodně se provádí v Escherichia coli. Výhodně lze expresi provádět rovněž v kvasinkách, buňkách COS nebo CHO.

Bílkovina CSF, k jejíž expresi došlo v příslušných prokaryotických nebo eukaryotických buňkách může být izolována a čištěna způsoby, které jsou v oboru známy. Dále je popsán nový způsob čištění, který umožňuje získat

- 28 bílkovinu CSF z rekombinantních Čistotě a s vysokou aktivitou.

i přírodních zdrojů ve vysoké

Tento způsob odstraňuje problémy, dříve spojené . s izolací a čištěním bílkoviny s účinností CSF. Bílkovina CSF, získaná tímto způsobem, má specifickou aktivitu alespoň lxlO¹ jednotek na mg bíloviny, s výhodou alespoň 2xl0⁷ jednotek na mg* bíloviny, zvláště 4xl0⁷ jednotek na mg bíloviny, při testování na buňkách lidské kostní dřeně.

Pří práci uvedeným způsobem se bílkovina CSF čistí následovně: bílkovina se vysráží síranem amonným, přidávaným do vysycení' na 80 %, čímž se získá peleta bílkoviny CSF, která se znovu suspenduje v roztoku“ pufru^při ρΗ~6'až- 8' a takto získaný roztok se nanese na vrchol chromátografického sloupce, sloupec se promývá pufrem s obsahem chloridu sodného a odebírají se frakce s aktivitou CSF. Účinné frakce se slijí, nanesou se na sloupec C4 v reverzní fázi.a sloupec se vyjím_á postupně zvyšovaným množstvím acetonitrilu v koncentraci 0 až 90 % k získání účinné frakce.

Popis čištění v souvislosti s vyobrazením

Na obr. 5 je znázorněna analýza čištěné bílkoviny CSF (SDS-PAGE).

Bílkovinu CSF, která má být čištěna výše uvedeným způsobem, lze získat z libovolného z přírodních zdrojů výše popsaných- jako výchozí zdroje pro genové inženýrství. Jedná se o řadu buněčných zdrojů včetně kondicionovaného média, jako buněčná linie Mo nebo buněčná linie UCD MLA-144 gibona.

Bílkovina CSF může být produkována za použití genového inženýrství, jak je popsáno výše.

Výše uvedeným způsobem lze tedy čistit bílkovinu CSF z jakéhokoliv zdroje, postupuje se tak, že se prostředí s výhodou zahustí ultrafiltrací na koncentraci bílkoviny alespoň 0,1 mg bílko- 29 viny/ml. Bílkovina se pak vysráží přidáním síranu amonného do nasycení 80 Výsledná peleta se znovu uvede v suspenzi ve vodném roztoku pufru o, pH 6 až

8. Příkladem vhodných pufrů mohou být Tris-HCl,

HEPES, citronan sodný a podobně.

Roztok v pufru se podrobí dělení chromatografií na sloupci. Vhodným materiálem pro..

použití v tomto sloupci je například oktyli^harosa, (

DEAE-ultrogel, AcA44-ultrogel, AcA-54 ultrogél, a podobně. Je možno užít jeden nebo větší počet těchto materiálů po sobě k získání větší čistoty. ' výsledné látky-r ^;

Z každého sloupce se odebírají z

frakce a tyto frakce se zkoumají na účinnost CSP. Účinné frakce se slijí a zředí se kyselinou trifluoroctovou (TFA), kyselinou heptafluormáselnou (HFBA) a podobně, a materiál se nanese na sloupec z

C4 v reverzní fázi. Sloučenina s účinností CSF se pak vymývá při použití stoupajícího množství acetonjíitrilu od 0 do 90 Jú v TFA nebo HFBA, s výhodou v koncentraci 0,10 % až 0,15 % objemových, v závislosti na použité kyselině.

- 30 tr

Frakce účinností CSF se analyzují na SDS polyakrylaraidovém gelu elektroforézou, užije se gel o koncentraci 13,5 £>, jak bylo popsáno v publikaci Lanmli, U. Nátuře 227, 680 (1970). Je možno užít ještě další postupy k dosažení homogennější bílkoviny CSF. Čištěná bílkovina CSF po frakcionaci elektroforénou na SDS-polyakrylamidovém gelu poskytla heterogenní bílkovinu CSF s molekulovou hmotností v rozmezí 15 000 až 26 000 jednotek. Tato zjevná heterogenita je následkem veliké glykosylace bílkoviny a je běžnou vlastností glykoproteinu. Při frakcionaci méně čistého vzorku z buněk Mo stejným způsobem s analýzou -bílkoviny prokázala, přítomnost, další bílko-. .

viny s účinností CSF, jejíž molekulová hmotnost byla 28 000 až 30 000 jednotek.

z

Látky s účinností CSF se váží a znovu uvolňují z oktylseyŠrožy, DEAE ultrogelu a sloupz ce C4 v reverzní fázi. Přibližně 60 účinnosti CSF se váze na Con-A . sepliarosu (40 prochází bez zachyť cení) a je možno tuto'látku pak vymýt methy Imann o sidem.

Analýza molekulové hmotnosti rekombinantní CSF gelovou filtrací v prostředí s nízkým z

obsahem solí prokazuje, že přibližně 30 účinnosti _r

i.·' tvořené sloučeninou s molekulovou hmotností 19 000 je homogenní, avšak 70 ^Qp materiálu se chová jako dimer, takže se vymývá v poloze, která odpovídá molekulové hmotnosti přibližně 38 000, V případě, že se do sloupce přidá chlorid sodný v koncentraci IM, vymývá se veškerá účinnost v širokém vrcholu, který odpovídá sloučenině s molekulovou hmotností přibližně 19 000 jednotek.

Čištěná bílkovina CS? je stálá ale^V v O spon 16 hodin při teplotě 4 C a pH 7,4 v 4M guanidin hydrochloridu, v 10 mM ESTA, lCmM 2-raerkaptoethanolu a v 30^ (objemová procenta) ethanolu}*. Látka s účinností CS? je stálá také v Ο,Ι^ό kyselině trifluoroctové při pH 2,0 a 0,1^ kyselině trifluoroctové s objemovými acetonitrilu.

&

Jak jiř bylo uvedeno, bílkovina CSF, získaná způsobem podle vynálezu je určena pro pouz žití k léčbě utlumu dřeně, například, při (sympromatické) ^iranulocytophenii, která může být způsobena léčbou nádorů chemicky nebo ozářením. Mimo to je možno bílkoviny CS? , vyrobené způsobem podle vynálezu použít k léčbě těživých infekcí. K tomuto použití se užije dávka 200 až 1000 mikrogramů denně. Bílkovina

- 32 CSF se s výhodou podává niirožilně spolu s vhodným farsakologickým nosičem. Příkladem vhodného nosiče může být roztok chloridu sodného a lidský sérový albumin v roztoku chloridu sodného.

Mimo to má bílkovina CSF, vyrobená z

způsobem podle vynálezu ještě další účinky a další použití. Bylo například prokázáno, že CSF myší aktivuje neutrofily. Bylo by možno očekávat, že CSF ’ — Λ. . ^U. ..._{e m B} _ 'W’ “ · . — L·, ---- _ ., primátů, získaný způsobem podle vynálezu bude rovně aktivovat neutráfily. Fyziologické funkce této bílkoviny j.sou tedy mnohotvárné. V kostní dřeni může tato látka podporovat vývoj a diferenciaci buněk,

- ** které zajištují obranu, na-periferii pak aktivuje ..

nové i existující buňky

Při místní imunologické reakci může CSF způsobit nahromadění nebo nepřítomnost neutrofilů v zanícené oblasti. Nevhodná lokalizace a/nebo aktivace neutrofilů může být jednou z příčin patofyziologie různých poruch imunologického systému, například reumatoidních arthritid.

Vynález bude dále osvětlen v souvislosti s příklady, které jsou určený pouze k osvětlení, nikoliv však k omezení způsobu podle vynálezu v

a znázorňují, jak je možno prakticky provádět způsob poďfe vynálezu.

- 33 ⁿy ⁿy

Pokud není uvedeno jinak, jsou všech

Λ teplotní údaje v příkladové části přihlášky uvedeve stupních Celsia.*

Restrikční endonukleázy jsou užívány za podmínek a způsoben, který je doporučen jejich výrobcem. Reakce, při nichž dochází k vazbě, jsou prováděny podle svrchu uvedené publikace Maniatise a dalších na str. 245 až 6 při použití pufru, který je popsán na str. 246 uvedené publikace a koncentrace RNA v rozmezí 1 až ICO/ng/ml při teplotě 23 °C nro DNA se sleoýni konci a 16 °C pro DNA s konci, které se na sebjř snadno váží.. Elektroforéza se provádí na 0,5 až 1,5^ agarozovém gelu s obsahem 90 mM Tris-boritanu a 10 ηίϊΊ EDTA. Všechna RNA, značená radioaktivně je značena 32P.

Pod pojmem rapid prep se rozumí rychlá produkce PNA bakteriofágu nebo plasmidu v malém měřítku, tak, jak je popsána například ve svrchu uvedené publikaci Maniatise a dalších na str. 365 až 373.

- 34 Příklad A v

Stupen 1 Linie buněk Ho

Buňky Mo (ATCC CRL 8066) se běžně pěstují na prostředí alfa se 6 oxidu uhličitého něho prostředí podle Iscova s 10 oxidu uhličitého a s obsahem 20 fetálního telecího sera (PCS), mM glutaminu, 100 jednotek/ml streptomycinu a v

100 jUg/ml penicilinu. Šunky je nutno přeočkovávat

IS každé 4 až 5 dnů. Buňky se spočítají a pak se jimi očkují Palconovy T-175 lahve s obsahem 100 až 150 ml živného prostředí při hustotě 3 až 4 x 10^ buněk/ml.

Počet buněk sq zdvojnásobí za přítomnosti 20 PCS· za 4 až 7 dnů. Rychlost růstu není stálá a někdy mo-?

v hou buňky zcela zastavit růst, načež se náhle v

rozrůstají. Buňky Mo je možno pěstovat také v středí, které je prosté s^ra. Přežívání buněk v

mnohem lepší v případě, že se buňky při přene: z PCS do prostředí, které je sera prosté^nepromývají. Optimální hustota v prostředí, které je prosté sera (SP), je 5x10 buněk/ml. Buňky mírně rostou, nebo alespoň si zachovávají stejný počet buněk po tři dny v prostředí, které je prosté sera, pak je v

nutno přidat 20 >s PCS po dobu alespoň 4 dnů. Toto rychle proje

- 35 růstové schéma (3 dny SF), 4 dny 2P% FCS), je možno opakovat každý týden, je-li požadováno prostředí bez séra, a to po několik měsíců bez jakékokol/iv zjevného poškození buněk.

▼ v r

Stupen 2 Zjišťování účinnosti CSF *

A. Stanovení s použitím kostní dřeně

Získá se čerstvá kostní dřen a od/ v straní se kostní úlomky, načež se dřen zředí v poměru 1 : 1 sterilním chloridem sodným s obsahem fosfátového pufru (PBS) při teplotě místnosti a pak se v

dřen převrství Ficoll-Paoue, přibližně 30 ml BM-PBS v

a 6 ml Ficollu. Pak se směs odstředuje při 1500 otáč kách za minutu 40 minut při teplotě místnosti. Tuk a vrstva PBS se isoluje a odloží. Pak se pipetou ode bere zakalená vrstva, která se dvakrát promyje PBS a v

pak se spočítají buňky, kťer$ se pak nanesou do prostředí RPMI (GIBCO, RFMI 1640) s 10% FCS, Zaktivovaného tepla, (HIFCS) na 3 hodiny k odstranění lnoucích buněk.

Živné prostředí, které musí být čerstvé, se připraví následujícím způsobem:

- 36 20 Ji PCS

0,3 Ji agaru, rozpuštěného ve vodě, zchladí se na 40 °C,

2x Iscoves (objemový poměr 1 : 1 v agaru)

Ji P/S konečné koncentrace 100/Ug/ml streptomycinu a 100 jednotek/gil penicilinu _4 , ,

M othioglycerolu ve 2x Iscoves ze- zásobního roztoku o koncentraci 10 agař^se zchladí ňa 40'j'í a přidají se“ další¹ složky , ve vodní lázni se výsledná směs zchladí na 37 - 38 ⁰ a na této teplotě se,udržuje.

*

Po 3 hodinách se buňky, které nelnou v

oddělí -pipetou a materiál se odstředí a buňky se znovu spočítají. Přidá se 2 x 10^ buněk/ml a prostředí se udržuje na vodní lázni při teplotě 37 - 38 °.

Pak se přidá vzorek, například prostředí z buněk po transfekci v množství obvykle 10 mikrolitrů do první řady vyhloubení mikrotitrační desky ve dvojím provedení. Pak se do každého vyhloubení přidá 100 mikrolitrů buněčné suspenze a pak ještě dalších 50 mikrolitrů buněčné suspenze dó každého vyhloubení první řady. Materiál ve vyhloubeních se důkladně promísí a 50 mikrolitrů roztoku z první řady se přenese do následující řady a pak se dále postupuje po celé

- 37 ulotně, čímž se získá nostuoné ředění vždy 1:3.

Plotna za zabalí jí do parafilmu a inkubuje 10 Ꭰ15 dnů v 10 ti oxidu uhličitého při teplotě 37 °C ve vlhkém prostředí, načež se počítají kolony'.

Spočítá se celé množství kolonií v každém vyhloubení. V každém pokusu se užije několik vyhloubení bez vzorku, Čímž se-získá základní počet kolonií. Tento počet se odečte od počtu kolonií, 'které se nacházejí v každém vyhloubení s obsahem vzorku. Jedna jednotka CS? je to množství, které vyvolá tvorbu jedné kolonie nad základní počet kolonií na 10 buněk z lidské kostní dřeně v případě, že se užije;

buněk v jednom mililitru, a to v případě, že koncentrace CS? je pod stupněm sycení. Tato koncentrace sé” stanoví zředěním a srovnáním poetu kolonií při různém ředění tak, aby bylo možno určit koncentraci těsně před hladinou nasycení.

Při tomto stanovení se počítají kolonie, které obsahují granulocyty, monocyty nebo oba kolonií. Typ buněk v koloniích se stanoví odebráním kolonie a barvením buněk.

- 38 B. Stanovení při použití buněk KG-1

Buňky KG—1, popsané v publikaci Blood, sv. 56, č. 3 (1980) se pěstují v prostředí v

podle Iscova s 10 jo FCS, buňky se přeočkovávají 2x 5 týdně, při každé pasáži se užije 2x 10 buněk/ml.

v

Buňky se užijí ke stanovení pouze s pasáží 30 až 35.

Stanovení je stejné jako dřeně s tím rozdílen, že při použití buněk kostní v

bunlíyKG-l se' pěstují’v aga rove směsi při použití 4 x 10^-3 buněk/ml.

Počet jí kolonií, které rostou v každém vyhloubení se stanoví po odečtení základního počtu kolonií- stejným způsobem jako při použití buněk -z

V» kostní dřeně. Jedna jednotka/ml pro tyto buňky při použití CSF je tají koncentrace CSF, která stimuluje polovinu maximálního množství kolonií buněk KG-1 k růstu (nasycení). Maximálního počtu kolonií je možno dosáhnout tak, že se do několika whloubení přidá CSF až do nat v

Z syceni.

- 39 Stupen 3 Konstrukce vektoru n91023(3)

Vektorem, použitým pro transforma ci, byl vektor pAdD26SVpA(3), který byl popsán v

1304 - 1319 (1582). Tento vektor má strukturu, která d?*A je znázorněna na obr. 2. Tento plasmid obsahuje^/gen pro dihydrofolát reduktásy^myši (DHPR), který je*pod transkripcním řízením hlavního promotoru adenovirů 2 (Ad2). Do adenovirů se přiřadí sled z genu pro imunoglobulin, který je přítomen mezi promotorem Ad2 a sledem DHPR a mění zakončení 5 a 3 . Místo pro polyadenylaci SV40 se nachází směrem dolů od sledu, který je kódem pro LHPR. Sled tohoto vektoru, který je odvozen od prokaryotických buněk, je vzat z pSVOd (Mellon, P., Parker, V,, Gluzman, X, a Maniatis, T,, 1981, Cell 27, -279 - 288) a neobsahuje sledy z pBR322, které způsobují inhibici replikace v buňkách ssavců, jak bylo popsáno v publikaci Lusky, Μ., a Botchan, M, 1981, Nátuře (London) 293, 79 - 81.

Svrchu uvedený jlasraid se převede na plasmid pCVSVL2 způsobem, znázorněným na obr. 2 a na plasmid pAdD26SVpA(3) (d) tak, že se vypustí jedno ze dvou míst pro působení restrikční endonukleásy

Pstl v původním plasmidu. Tento způsob se uskuteční částečným rozštěpením uvedeným enaymem, čímž je možno získat subpopulaci linerizoraných plasmidu, v nichž je rozštěpeno pouze jedno místo pro působení enzymu Pstl, načež se působí Klenovovým fragmentem, který- se naváže k recirkulisaci plasmidů, který se pak použije k transformaci Ξ. coli a hledají se kolonie, kterp mají rozštěpeno místo pro působení Pstl, které je uloženo poblíž zakončení¹!' polyadenylovaného sledu SV40.

která se otevírá se tří elementů, rozštěpí nlasmid.

Vedoucí sled adenavitu a geny, získané z virů (VA-geny) se včlení do plasmidu pAdD26SVpA(3) (d) způsobemznázorněným na obr. 2. Postupuje- se tak, že se uvedený vektor rozštěpí enzymem PvuPI za získání otevřené lineární molekuly, v blízkosti zakončení 3 prvního které tvoří vedoucí sled. Pak se pJAW 43, popsaný v publikaci Zain a další, 1979, Cell 16 851, působením enzymu Xhol, naváže se Klenovův fragment, materiál se rozštěpí enzymem PvuII a fragment o 140 párech baží, který obsahuje druhý element a část třetího elementu vedoucího sledu se izoluje elektrofořežou na akrylamidovém gelu (6 % v trisborátovén pufru podle svrchu uvedené publikace Maniatise a dalších (1982),

Fragment o 140 párech baží se pak naváže na plasmid pAdD26SVpA(3) (d) po štěpení enzymem PvuII. Produkt této vazby se užije k transformaci E. coli za vzniku odolnosti tohoto mikroorganismu proti tetracyklinu, kolonie se sledují způsobem podle Grunsteina a Hognesse při použití 32p-značeného vzorku hybridisací na fragment o 140 párech baží. S kolonií s pozitivní hybritizací se připraví DNA, aby bylo možno zjistit, . zda rekonstruované místo pro působení jí PvuII se naZ z chází na zakončení 5 nebo 3 včleněného fragmentu o

140 párech baží, čímž je možno prokázat, zda hybridizace je specifická pro druhý nebo třetí element vedoucího sledu z adenovitu. Správná orientace místa

I z

pro působení uvedeného enzymu se nachází na 5 -zakončení včleněného sledu o 140 párech baží. Takto vytvořený plasmid se označuje pTPL a je znázorněn na obr. 2.

Fragment Ava II D SV40 s obsahem podpůrného sledu SV40 se získá tak, že se DNA SV40 štěpí enzymem Ava II, na zakončení sé naváže Klenovův fragment po Štěpení Pol I, na tyto fragmenty se ještě

ného místa a čtyři nejdelší fragmenty (D) se izolují elektroforézou na gelu. Takto získané fragmenty se

- 42 naváží na plasmid pTPL po štěpení enzymem Xho 1, čímž se získá plasmid pCVSVL2-TPL. Orientace fragmentu SV40 D v tomto plasmidu je taková, že promotor SV40 má stejnou orientaci jako hlavní promotor adenovitu.

Aby bylo možno zavést geny, spojené s virem adenoviru (VA) do plasmidu pCVSVL2-TPL, zkonstruuje se nejprve plasmid pBR322, který obsahuje fragment adenoviru typ 2 Hind III B. DNA adenoviru typu 2 se rozštěpí enzymem Hind III a fragment B se izoluje elektroforézou na gelu. Takto získaný fragment se pak/člení do plasmidu pBR322, který byl předem rozštěpen enzymem Hind III. Po transformaci Ξ. coli za získání odolnosti proti ampicilinu se rekombinantní kmeny vyhledávají tak, aby byl zjištěn kmen s fragmentem Hind III B a orientace tohoto fragmentu se stanový štěpením restrikčními enzymy. Plasmid pBR322 - Ad Hind III B obsahuje fragment adenoviru typ -2 Hind III B v orientaci, která je znázorněna na obr. 3.

Jak je zřejmé z obr. 3, geny VA je možno získat z plasmidu pBR322-Ad Hind III B štěpením pomocí enzymu Hpa I, po přidání sledů, napomáhajících k vazbě EcoRI s následným štěpením enzymem Eco Rl s isolací fragmentu o 1,4 kb. Fragment, který má zakončení po štěpení enzymem EcoRl se pak naváže na místo v plasmidu pT3?L, ktere bylo předtím rozštěpeno tímtéž enzymem. Po transformaci

E. coli HB1O1 a po selekci klonů odolných protitetracyklicnu se kolonie podrobí zkoušce na hybridizaci na filtru při použití vzorku DNA, specifické pro geny VA. Pák se připraví DNA z klonů's pozitivní hybridizací a tento materiál se podrobí charakterizaci násobením restrikčních endonukleáz. Produktem je plasmid, který se označuje p91023. ...

Obě místa pro štěpení enzymem E60RI v plasmidu p91023 se odstraní, takže še tento plasmid úplně rozštěpí enzymem EcoRl, Čímž vzniknou dva fragmenty DNA, z nichž jeden obsahuje přibližně 7Ko a druhý přibližně 1,3 Kb s obsahem jifgenů VA. Zakončení obou fragmentů se vyplní při použití Klenovova,fragmentu a enzymu Poli, a pak se oba fragmenty, tj. fragment o 1,3 Kb a o Kb znovu spojí. Plasmid p91O23 (A), který obsahuje děny VA je podobný plasmidu p91023, avšak do místa pro působení enzymu EcoRl jsou v obou případech včleněny|í geny VA, jak je možno prokázat Grundsteinax-Hognessovou analýzou a působením restrikčních enzymů.

Jediné místo pro působení enzymu Pstl v plasmidu p91O23(A) se.odstraní a nahradí se místem pro působení enzymu EcoEl. Pak se plasmid z

p91O23(A) úplně rozštěpí enzymem Pstl, a pak se naváže Klenovův fragment při použití Poli a na zakončení se naváží pomocné sledy tak, aby místo místa pro působení enzymu Pstl vzniklo místo pro půsoj&ení « enzymu EcoEl v plasmidu p91023(A). Lineární plasmid p91O23(A) s pomocnými sledy k vytvoření místa pro z

působení enzymu EcoEl se oddělí a úplně se rozštěpí enzymem EcoEl, načež se takto získané fragmenty

B znovu naváží. Izoluje se plasmid p91O23(X), jeho struktura se identifikuje a je možno prokázat, že běží o strukturu, podobnou plasmidu p91O22(A) až na to, že tento plasmid obsahuje místo pro působení enzymu EcoEl místo místa pro působení enzymu Pstl. Stupen 4 Příprava -^upř^-^cBNA

Buňky Mo se pěstují 16 aŽ 20 hodin * při použití PHA a PMA ke stimulaci produkce lymphov kinů. Buňky se pak nanesou na plotny v množství 5 x 10 buněk/ml v prostředí podle Iscova s 20

FCS, 0,3 Ji objemovými PHA a 5 ng/ml TPA. Buňky se v

oddělí odstředěním. Takto oddělení? buňky se znovu uvedou do suspenze ve -20 m3i hypotonického pufru pro rozrušení buněk, chlazeného ledem (RSB pufr: 0,0111 Tris-HCl, pH 7,4, 0,0114 KC1, 0,001511 MgCl₉, 1 ,ug/ral cykloheximidu, 50 jednotek/ml PJlAsín a 5mll dithiov threitolu). Buňky se nechají nabobtnat na ledu 5 minutý, načež se mechanicky rozruší ve skleněném homogenizátoru deseti zdvihy těsně lnoucího pístu. Homogenát se pak odstředí při 2000 otáčkách za minutu (odstředivka Beckman J6) k odstranění jader a nerozrušených buněk. Supernatant se uloží v ledu a jádra se znovu uvedou do suspenze v 10 ml RSB a pak se tento materiál znovu odstředí při malé rychlosti. Tento druhý supernatant se spojí s prvním supernatantem a získaný materiál se znovu odstředí při malé rychlosti k odstranění zbyjých jader a nerozrušených buněk. Supernatant v tomto případě se smísí přidáváním 211 KC1 až na koncentraci 0,1511 KC1 a pak se znovu odstředí 30 minut při 25 000 otáčkách za minutu (rotor Beckman Sv 28), Čímž se jako segment získají buněčné membrány. Sediment buněčných membrán se opatrně promyje chladným RSB a pak se znovu uvede do suspenze ve 12 ml RSB s obsahem 211 sacharosy a 0,1511 chloridu draselného.

- 46 otáčkách za minutu (Beckman, °C. Vrstva membrány, která • ... «- -u. v » . _Λ mezi koncentrací 2,011 a 1,311 straní se strany při použití č. 18. Frakce membrány z obou zředí jedním objemem deštilov dá do koncentrace 0.5Trito

Pak se ve zkumavkách, do odstředivky (Beckman/ SV41) jí připraví diskontinuální gradient, tak, že se převrství 6 ml roztoku membrány ve 2M sacharose na 2 ml RSB s 2,5M sacharosy a 0,1511 KC1. Zkumavky se doplní ΐ

2,5 ml RS3 s obsahem 1,3M sacharosy a 0,l'5M KC1.

Tyto gradienty se pak odstředí 4 hodiny při 27 000 » rotor S1Í41) při teplotě se nachází na rozhraní *· * *- 1 · · » VUJ' sacharosy se opatrně odijekcní stříkačky a jehly . gradientů se slijí a ané vody, načež se přin-K-100 a do koncentrát ce 0,5 % deoxycholá£, sodný, načdž se materiál extrahuje stejným objemem fenolu. Vodná vrstva se pak znovu extrahuje směsí fenolu a chloroformu v poměru 1 : 1 a nakonec stejným objemem chloroformy. Pak se RNA, vázaná na membránu vysráží přidáním chloridu sodného do koncentrací? 0,2511 a 2,5 objemů chladného ethanolu, načež se směs inkubuje přes noc při teplotě _ť

-20 °C. Vysrážená RBA se oddělí odstředěním 10 minut otáčkách za minutu (odstředivka Beckman J-6) materiál znovu uvede do suspenze v 1 ml desvody. Z množství 2 x 10’ buněk se získá přimg RNA. Pak se izoluje s celkového množství při 4000 a pak se tilovSné bližně 1

- 47 RNA příslušné množství mRNA chromatografiř na sloupci s obsahem 0,5 ml oligo dT-celulozy. Pak se RNA zahřeje na 5 minut na teplotu 70 °C, rychle se zchladí v ledu a pak se 5x ředí při teplotě místnosti·*, pufrem pro vazbu, který obsahge 0,5M LiCl, 0,01M Tris-HCl, o pH 7,4, 0,002í-í EDTA a 0,1 > SDS. v tomto pufru se pak nechá projít sloupcem oligo dT-celulozy v rov« novážném stavu ve stejném pufru při teplotě místnosti, Sloupec se promyje 5 ml pufru pro vazbu a pak 5/Ul 0,15M LiCl,0,011-1 Tris-HCl o pH 7,4, 0,002M EDTA, a OT-l^/ÍÍ-gDS-T^-Nnkon.-.e.Cj.^g·.mRNA .vymývá, při použití 2 ml 0,01M Tris-HCl o pH 7,4, 0,002M EDTA a 0,1 SDS. Pak se mRNA vysráží přidáním chloridu sodného do koncentrace O,25M a 2,5 objem^u ethanolu a směs se jí inkuo ^z buje přes noc při teplotě -20 C. Vysrážen^?mRNA se oddělí odstředěním 30 minut při 30 000 otáčkách za minutu (rotor Seckman SV55). Supernatant se opatrně slije a peleta mRNA a znovu uvede v suspenzi v 50 ml vody. Tato suspenze se pak upraví na koncentraci O,25M chloridu sodného a pak se extrahuje směsí fenolu a chloroformu v poměru 1:1a pak třikrát chloroformem. Pak se mRNA vysráží přidáním 2,5 objemu ethanolu.

Směs se několikrát zmrazí a nechá roztát v lázni se suchým ledem a ethanolem a pak se 15 minut odstře- 48 duje v Eppendorfově odstředivce. Supernatant se opatrně slije a peleta mRNA se znovu uvede do suspenze

První řetězec cDNA se připraví při použití standardních metod. Postupuje se tak, že se

ně při průměrném rozměru 12 - 18), déle 150 /uCi 32P dCTP (400 Ci/mmol) a 20 jednotek inhibitoru ribonukleázy RNAsin. Reakce se spustí přidáním 100 jednotek reversní transkriptázy při inkubaci 30 minut při teplotě 42 °C. Pak se reakce zastaví přidáním

EDTA ý do koncentrace 40 mmol a pak se RNA rozloží inkubací 2Ό minut v 65 °C v 0,2M hydroxidu dosného. ,

Pak se baze neutralizuje přidáním 20/ul 2ΙΊ Tris o pH > 7,4. Reakční směs se pak extrahuje směsí fenolu a chloroformu a pak se provádí zpětná extrakce při použití 50 /Ul 10 mmol Tris o pH 7,5, 1 mmol EDTA (ΤΞ) a vodné fáze se slijí. Pak se cDNA s jednoduchým řetězcem převede na cDNA s dvojitým řetězcem tak, že se směs inkubuje 12 hodin při teplotě 16 °C spolu se

- 49 40 jednotkami Klenovova fragmentu za přítomnosti DNA-polymerázy I ve I00/^ul reakčního prostředí, které obsahuje roztok 50 mmol fosforečnanu draselného o pH 7,4, 2,3 mmol DTT, 2-raerkaptoethanol, 10 mmol

MgCl^, vždy 150 yumol jednoho ze čtyř deoxynukleo32 tidtrifosfátů a 25 yuCi P dCTP. Reakce se pak zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a nevčleněné trifosfáty se odstraní průchodem vodné jí fáze přes sloupec prostředku Sepliadex-G-50 o objemu 1 ml. Vyloučené frakce sě slijí a vysráží se ethanolem.

_ 7 .... ' ——ρθΐ~θta^cDKA^'se přbmýj é^Hiadhým'’' ethanolem a pak se znovu uvede do suspenze v 200 _/Ul

20mmol ±x£s Tris o pH 8,0, 1 mmol EDTA, 80/umol S-adenosylmethioninu a 300 jednotek ScoRl-methylasy na 60 minut při teplotě 37 °C. Reakce se zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a methylovaná cDNA se isoluje vysrážením ethanolem.

Peleta cDNA se promyje 70/ ethanolem a pak se znovu uvede do suspenze ve 200 /Ul pufru SI (Maniatis a další) a materiál se inkubuje s 200 jednotkami Sl-nukleásy při teplotě 30 °C celkem 30 minut. Pak se reakce zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a cDNA se isoluje vysrážením ethanolem.

- 50 Zakončení cDNA s dvojitým řetězcem se vyplní inkubací ve 100 yul 20 mmol Triš o pH 7,4, 50 mmol chloridu sodného, 10 mmol 2-markaptoethanolu

500/tunol všech čtyř deoxynňkleotidtrifosfátu s jednotkami Klenovova fragmentu při teplotě místnosti 30 minut. Reakce se zastaví extrakcí směsí fe- *' nolu a chloroformu a cDNA se isoluje vysrážením etha<

nolem. _:

Takto získa.né cDNA se podrobí vazbě v 50 /Ul pufru s obsahem T4-ligásy (Maniatis a další) za přítomnosti 500 pí-íol vazných řetězců Rl se sledem pCGGAATTCCG (New England Biolabs) při použití 2000 jednotek T4-ligásy přes noc při teplotě 16 °C. Reakce se zastaví inkubací při teplotě 70 °C po dobu 20 minut, pak se reakčni směs zředí na 300 mikrolitrů, takže konečná koncentrace solí je 0,1 mol NACI, 10 mmol MgCl₉, 50 mmol Tris-HCl o pH 7,4. Pak se cDNA štěpí 2 minuty při teplotě 37 °C působením 7B0 jednotek enzymu EcoRl, Reakce se zastaví extrakcí, směsí fenolu a chloroformu a cDNA se isoluje vysrážením ethanolem. Získaná peleta se znovu uvede do suspense v 50 /Ul TE a pak se nechá projít sloupcem s obsahem 5 ml C1—4B. Získané frakce se slijí a vysrází se ethanolem. Vysrážená cDNA se podrobí elektroforéze na lý agarosovém gelu v Tris-acetátovém pufru za přítomnosti 1/Ug/ml ethidiumbromidu. Pak se cDNA o rozmetu 500 až 4000 párů baží. isoluje z gelu při použití standardního postupu. Vyloučená cDNA se extrahuje směsí fenolu a chloroformu, vysráží se ethanolem a peleta (po opláchnutí ethanolem) se znovu uvede do suspenze v 50 /Ul TE, Konečný výtěžek byl 10 až 500 ng cDNA.

Dále bude popsána příprava vektoru pro expresi p91023(B). 500ng vektoru, rozštepeiféiro^énžymem^EČOÍti a ” zpřár ovánb ho působený^ fffgf átázy se podrobí vazbě se 100 ng cDNA ve 100/ul reakč í,· ního prostředí (standardní prostředí pro působení T4-ligásy) přes noc při teplotě 16 °C. Reakce se zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a pak se navázaná cDNA oddělí vysrážením ethanolem po přidání 5 /Ug / tRNA jako nosiče.

DNA, vysrážená ethanolem se promyje 70£ϊϊ ethanolem a pak se znovu uvede do suspenze ve 100/Ul TE. Tato DNA se pak užije v podílech o objemu 4 yUl k transformaci E. coli MU1061 (4;Ul pro transjčťfrmaci v objemu 100/Ul. Každá z 25 transformovaných zkoušek se rozetře na Petriho misku o průměru 150 mm s obsahem 1 Ja agaru, v L-prostředí

- 52 s lOyg/ral tetracyklinu (Tet-plotna) a plotny se inkubují přeš noc při teplotě 37 °C. Na každé plotně se vyvine přibližně 2000 kolonií, výsledkem je tedy celkem přibližně 50 000 kolonií. Každá z těchto kolonií má průměr přibližně 0,5 mm. Každá z těchto kolonií se přenese na mikrocelulozový kotouč o průměru 137 mm tak, že se na, povrch agaru opatrně uloží suchý filtr, který se pak opatrně sejme. Všechny kolonie zůstanou na filtru, který se pak uloží koloniemi směrem vzhůru na čerstvou Tet-plotnu. Kolonie se nechají, růst několik hodin a pak se znovu rozdělí tak, že se přesně na původní filtr uloží čerstvý^ zvlhčený-filtr·, filtry, se k sobě. přitlačí, pak se oddělí a každý filtr se uloží na čerstvou Tet-plotnu a plotny se inkubují přes noc při teplotě 37 °C. Každá kopie se pečlivě označí, aby bylo možno uložení kolonií přesně srovnat s jejich uložením na původním filtru.

Stupen 5 Příprava směsi plasmidové DNA

Každá z 25 kopií filtrů se opatrně rozřeže skalpelem na osminy, přičemž se zaznamená orientace každé z těchto osmi ve srovnání s původním z

filtrem. Z každého useku se kolonie sejmou do 10 ml L-bujonu. Bakterie se oddělí odstředěním 10 minut při 3000 otáčkách za minutu (odstředivka Beckman J-6) a pak se znovu uvedou do suspenze v 0,6 ml 25^c/ sacharozy s 50 M Tris-HCl o pH 8,5 a znění se na protoplasty přidáním 0,2 ml lysozymu o koncentraci 5 mg/ral / s následnou inkubací v ledu na dohu 5 až 10 minut.

*

Protoplasty se pak inkubují při teplotě místnosti 10 minut, přidá se 0,125 ml SDTA o koncentraci 0,5 molů v

a pak se buňky rozruší přidáním 0,12 ml lCý. SDS v . 5.0. mmol.^.Tr.i.STj).Cl _ o^nH... 8., CL _Ro.zr uš env_ mater ^opatrně promíchá, inkubuje se 15 minut při teplotě místnosti a pak se DNA. bílkovin a chromosomů vysráží. přidáním 0,3 /ml 5M NaCl. Po inkubaci v ledu na dobu 15 minut se materiál odstředí na Eppendoffově odstředivce 30 minut za chlazení. Supernatant se opatrně odstraz ní, ěíipž se získá viskozní peleta DNA a bílkoviny, která se zředí přidáním 2,5 ml vody. Směs se extrahuje 1 ml fenolu, vrstvy se oddělí odstředěním (10K po dobu 10 minut, rotor Sorvall SS-34) a vodná vrstva se oddělí do nové zkumavky. DNA sc vysráží přidáním 0,5 ml 5H xAfii NaCl a 7,5 ml chladného ethanolu a směs se několikrát zmrazí v lázni ethanolu a suchého ledu. Vysrážený /materiál se oddělí odstředěním (10K, £

minut, Sorvall SS-34), znovu se uvede do suspenze

- 54 v 0,3 ml 0,3M octanu sodného a znovu se vy sráží (v Eppendorfově zkumavce) přidáním 1 ml ethanolu.

Po 10 az 15 minutách v lázni se suchým ledem a ethanolem se vysražená DNA oddělí odstředěním {5 minut v Eppendorfově odstředivce)^ výsledná peleta se znovu uvede do suspenze ve 100/Ul sterilního prostředí

TE (10 mmol Tris o pH 8, 1 mmol EDTA). Z typické /^ug zkoušky se získá 5 až 10 ag phsmidové DNA. Každý '···** .IIP vzorek obsahuje DNA z 200 až 500 kolonii 'původního“ filtru. Z 25 filtrů se připraví celkem 200 vzorků DNA.

Stupeň 6' Isolace klonů CSF ...

Každý ze vzorků LNA ze stupně 5 se odděleně přenese do opicích buněk,M6 tak, jak bude dále popsáno.

Buňky M6 se běžně pěstuji na modifikovaném Eaglóvě prostředí (Lulbecco, DbíE je možno získat od Gibco) s obsahem 10 Ji fetálního telecí/ V ho sera, inaktivovaného teplem (HIECS), buňky se dvakrát týdně přeockovávají při ředění 1 : 6. 24 hov din po dělení v poměru 1 : 6 jsou buňky M6 připravené pro transfekci. 24 hodin před transfekci se

- 55 g

1,2 χ 10 buněk M6 naočkuje na plotnu (Cell Factory, Kunc) v 1,5 1 prostředí DME + 10 Ji HIFCS. Těsně před transfekcí se plotny 2x promyjí 7 ml DME bez sera.(SF). DNA se rozpustí v 0,1 M Tris o pH 7,3 a přidá se k prostředí DME, které obsahuje 2mmol glutarainu, 100/Ug/ml strepromycinu, 100 jednotk/ml penicilinu a 0,20 mg/ml DEAE-dextranu, doplněno na 4 ml Tris-DNA roztokem.

« v

ml prostředí s obsahem rozpuštěné DNA se přidají k plotně s obsahem buněk M6 COS a buňky se 12 hodin inkubují.

Po inkubaci^1-se buňky 'jeďnuu nebo dvakrát promyjí 7 ml SF DME. Falz se 5 ml DME s 10 Jo HIFCS, ΐ

100 jednotek/ml penicilinu, lOOyUg/ml strepromycinu, mmol glutaminu a 0,1 mmol chlorochinu přidá ke směv si a buňky se pak inkubují po dobu 2 1/2 hodiny.

v

Po inkubaci se buňky promyjí SF DME a přidá se 10 ml DME + 10 Ji? HIFCS na plotny. Po 30 hodinách se prostředí odsaje a přidá se 4 ml DME + 10 jo v

HIFCS na plotnu. Buňky se izolují odstraněním prostředí po 24 až 26 / hodinách další inkubace.

Prostředí z každého vzorku se zkoumá na účinnost CS? při použití zkoušky KG-1. dý vzorek, jehož účinnost CSF je positivní,

Pro lzažje nutno

- 56 vyhledat klon na původním filtru, který je příčinou této účinnosti. Například.v případě positivní transfekce účinnosti CSF se odeberou všechny kolonie půz / vodního useku filtru, na němž byla nalezena tato účinnost. Jde obvykle o přibližně 320 kolonií, které se odeberou do 3 ml L-prostředí s 10 /Ug/ml tetracyklinu. Kultury se pěstují přes noc. 320 kolonií se uloží do matrice 18 x 18. 2 horizontálních řad a vertikálních sloupců matrice se připraví směsi (36 směsí, poslední horizontální řada měla pouze 14 klonů). Vzorky DNA se připraví z každé směsi a užijí se k jítensfekci buněk $ , (CDS). Supernatanty z takto získaného materiálu se zkouší na účinnost. Byly získány dvě.positivní zkoušky, jedna ve vertikálním sloupci, druhá v horizontální řadě. Kultury, spoleňná oběma směsím obsahovala klon s účinností CSF.

Z kultury bylo isolováno cel/kem dvanáct jednotlivých klonu a miniprep DNA pak byla

I * připravena z kultur o objemu 10 ml v L-prostředí, tak, jak bylo popsáno svrchu. Pak byly rozštěpeny ₄ vzorky 10 /Ul DNA z těchto zkoušek enzymem EcoRl a yýsledné fragmenty DNA byly analyzovány elektroforézou na agarozovém gelu. Devět z dvanácti klonů mělo společný včleněný sled o přibližně 750 párů baží. DUA ze čtyř z těchto klonů a ze zbývajících tří klonů byla přenesena do bune/ k M6 COS svrchu uvedeným způsobem, Supernatanty z takto provedených transfekci byly zkoumány zkouškou KG-1 stejně jako zkouškou s použitím imxk buněk z kostní dřeně na z * účinnost CSF. Čtyři klony mely 750 párů baží jako společný fragment, včleněný ve správném sledu, takže v

docházelo k expresi buňkami H6 COS ve vysokém stupni,

Z jak bylo možno prokázat účinností CSF v obou uvedených zkouškách na rozdíl od zbývajících tří klonů. Znamená z

__,™_to._Že_kodová..oblast nr o _ CSF_ musí .bvt _ ulo ž e na„va vč 1 a něném sledu o 750 párech baží.

Sled DNA, který je kódem pro CSF byl odstraněn z vektoru pro transformaci v positivním klonu rozštěpením enzymem EcoRI a jeho sled byl stanoven při použití standardní metody po podrobení fragmentů klonování / ve vektorech M13, čímž byl prokázán sled, znázorněný na obr. 1. Plasmid p91023(B) li

- CSF, o němž bylo poprvé prokázáno, že řídí expresí CSF v buňkách COS byl pak označen pCSF-1. Tento plasmid byl pak uložen ve sbírce American Type Culture Collection. ixxxxxixsxjixjaf v kmenu E. coli MC1061 pod číslem ATCC 39754 2. července 1984.

- 5S v

Stupen 7 Exprese bílkoviny CSF v

Opičí buňky M6 COS, transformované vektorem p91O23(B) s obsahem CSF/cDNA, tak, jak byl tento materiál isolován ve stupni 6, se pěstují způsobem popsaným ve stupni 6, čímž dochází k produkci bílkoviny CSP, která se pak nachází v živném prostře dí.

Postupuje se tak, že se js 1 mg této DNA (pCSF-l) rozpustí v 1 ml 0,1 M Tris o pH

7,3 a přidá se k 600 ml DME s obsahem 2 mmol glutaminu, 100 jednotek/ml strep^omycinu, 100 yuyml penicilinů' (P/S) 'a 0,25 mg/ml DEAE Dextranu s molekulovou hmotností 500 000 (Pharmacia), 600 ml roztoku DNA DEAE dextranu se přidá k buňkám M6 COS a směs se inkubuje 12 hodin při teplotě 37 °C. Po inkubaci v

se buňky promyjí 900 ml SP DME a pak se inkubují

2,5 hodin v 600 ml DNA s obsahem 0,1 mmol chlorochinu, 10 EIPCS, 2 mmol glutarainu a P/S. Prostředí s obsahem chlo^hinu se odstraní odsáváním, buňky se promyjí SP DME a pak se přidá 1500 ml DME s 10 fS HIPCS. Po 30 hodinách se buňky promyjí SP DME, prostředí se nahradí 800 ml čerstvého prostředí SF DME v

pak se buňky pro transfekci inkubují 24 hodin při teplotě 37 °C. Prostředí se pak odsaje a nahradí 800 ml čerstvého prostředí 3P DME. Buňky se pak inkubují v tomto prostředí 24 hodin, načež se prostředí odstraní. Jakmile je to možné, zahustí se vzorky prostředí 20x ultrafiltrací pod tlakem při použití komory Amicon o objemu 2,5 1 s membránou

7M5, která odděluje sloučeniny do molekulové hmot* nosti 5 000.

v V

Stupen 8 Čistění rekombinantního CS?

200 ml koncentrovaného prostředí ze 4 1 výchozího materiálu ze stupně 7 se na 30 nasytí síranem amonným přidáním pevného síranu amonného a vysrážená bílkovina se oddělí odstředěním. Supernatant se na 80 nasytí síranem amonným přidáním dalšího pevného síranu amonného a vysrážená bílkovina se opět oddělí odstředěním. Peleta se znovu uvede do suspenze v 5 ml 20 mmol citronanu sodného o pH 6,1 s obsahem 1 H NaCl. Rozpuštěná bílkovina se nanese na sloupec o rozměrech 1,6 x 100 cm s náplní Ultrogel AcA54 v rovnovážném stavu ve stejném z

pufru. Učinnoit CSP se vymývá ze sloupce při molekulové hmotnosti 19 k jednotek nebo přibližně po 90 ml

- 60 počátečního eluáiu. Bylo pozorováno, že v případě, že se filtrace na gelu provádí při malé iontové síle, z

vymývá se látka s účinností CS? ze sloupce ve dvou polohách s molekulovou hmotností 19 a 38 k jednotek, z

což patrně znamená tvorbu dimerů. UČinné frakce se spojí a přidává se 10/ TPA do koncentrace 0,15 ti a pak se materiál nanese na sloupec prostředku Vydac C4 rozměru 0,46 x 25 cm v rovnovážném stavu v 0,1/· ' ^,1ίΓ '' ' -.-.+1.- i .-i- . .1

TPA. Sloupec se vyvíjí lineárním gradientem acetonitrilu od 0. do 90 ti ^v 0_}l/ TPA rychlostí 1 ml za z

minutu při celkovém množství 340 ml. Účinnost CS? se vymývá mezi 39 a 43 / acetonitrilu, frakce 16 až

20. Vzorek frakce 19 o objemu 20 yul byl analyzován elektroforézou na SDS polyakrylamidovém gelu (13,5/ gel podle publikace Lammli, Nátuře 227, 680 (1970)). 3ylo možno pozorovat jediný široký pás pro bílkovinu s molekulovou hmotností 18 až 26 k jednotek. Poněkud širší rozmezí pro molekulovou hmotnost CS? je běžnou vlastností gíykoproteinů a patrně odráží velké, avšak měnící se množství uhlohydrátu. Bílkovina z frakce 19 byla podrobena Edmanově degradaci při použití zařízení pro stanovení sledu.Z přibližně 20 yUg bílkoviny bylo možno určit sled prvních Šestnácti aminokyselin jako A-P-A-R-S-P-S-P-S-T-Q-P-W -E-H. Vysoký výtěžek tohoto jediného sledu napovídá,

- 61 že bílkovina CSF z frakce 19 byla vyčištěna až do homogenity. Biologická zkouška prokázala, že frakce .

obsahovala 3 x 10· jednotek na jednotku absorbance Protože typické bílkoviny ve vodném roztoku mají extinkční koeficient 0,8 až 1,2 jednotek absorbance Na 1 mg bílkoviny, specifická učinnost čištěného CSF je v rozmezí 1 x 10 až 4 x 10* jednotek/mg v případě, že se užije zkoušky s buňkami z lidské kostní dřeně.

Příklad B

Klonování CSF Gibbona

Stupen 1 Příprava aRIiA z g-buněk Gibbona

Vzorek linie T-buněk Gibbona, označený UCD-MLA 144 se pěstuje několik týdnů v prostředí RPi-íI 1640 (Gibco) a- 20ý«- fetálním telecím seru (FCS) až do získání počtu 1 x 10 buněk. Tyto buňky byly zpracovávány tak, že byla indukována produkce vysoké hladiny CSF aktivací po 24 hodiny působením 10 ng/^ml 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetátu (TPA v HPNI 1640

- 62 v s 1 ‘p FCS. Pak byly buňky isolovány odstředěním 5 minut při 1-000 otáčkách za minutu, byly promyty chloridem sodným s fosfátovým pufrem (PBS) a pak byly opět isolovány odstředěním.

Z těchto buněk byla připravena mRNA polysomů, vázaných na membránu (MBP) způsobem, popsa- * ným v příkladu A pro přípravu RNA z buněk Mo.

-Stupen 2 Reakce s cDNA prvního řetězce /Ug MB? mRNA ze stupně 1 se zředí v reakční směsi pro přípravu cDNA v množstyí 50yUl, stejně jako bylo -popsáno ve stupni 4'příkladu A a reakce se započne přidáním reversní transkriptázy. Směs se inkubuje 30 minut při teplotě 42 °C, pak se reakce zastaví ořidáním 3DTA do koncentrace 50 mmol

-X a směs se zředí vodou na 100 yul. Pak se směs extrahuje nejprve směsí fenolu a chloroformu a pak chloroformem. Hybridy cDNA/RNA se oddělí od nevčlenených trifosfátů chromatografií na sloupci s obsahem 2 ml Sepharose CL-4B. Vyloučená frakce se slijí a hybridy se vysráží ethanolem, výtěžek je 570 ng.

- 63 Stupen 3 Reakce s cDNA druhého řetězce

Peleta cDNA prvního řetězce ze stupně 2 se znovu uvede v suspenzi v 50 nl vody a provádí se syntéza druhého řetězce ve standardními reakční směsi při použití polymerázy I Ξ. coli, ligázy E. col a rihonukleázy li. Reakční směs se inkubuje přes noc při teplotě 16°C a pak hodinu při.teplotě 37 °C. Reakce se zastaví přidá/ním EDTA a směs se extrahuje směsí fenolu a chloroformu. Pak se cDNA oddělí od nevcleněných trifosfátů chromatografií na sloupci prostředku Sepharosa CL-43,získané frakce se slijí a cDNA se isoluje vysrázením etanolera.

Stupen 4 Příprava rekombinantní cDNA znovu ao suspenze v o yux voay. raK se konce cDNA homopolymerní zakončení tak, 10 ,ul roztoku cDNA k 25 ,ul standardní

Peleta cDNA ze stupně 3 se uvede přidají na že se přidá reakční směsi s obsahem terminální transferézý a výsledná směs se o inkubuje 5 minut při teplotě 30 C. Reakce se zastaví přidáním EDTA do koncentrace 40 mmol a pak se směs inaktivuje teplem 10 minut při teplotě 68 °C.

ύ 64 Pak se 10 ng cDNA s takto upraveným zakončením spojí s 50 ng plasmidu pBR322 se zakončeními G (NEii) v 10 /Ul 10 mmol Tris o pH 7,5, 1 mmol EDTA a 100 mmol chloridu sodného. Výsledná reakční směs se inkubuje 10 minut při teplotě 68 °C a pak ještě 2 hodiny.při teplotě 57 °C.

Stupen 5 Transformace bakterií

Kmen Ξ. coli KC1061 se pěstuje v v

L-bujonu, pak se zchladí v ledu, buňky se pnkyhii^x oddělí odstředěním a přidá se chlorid vápenatý k přípravě “buněk pro tiansf ormaci.. Pak se 5_/Ul roztoku ze stupně 4 inkubuje s 200 ^ul takto připravených bakterií. Tato transformace se opakuje 15x při použití veškerého množství cDNA z předchozího stupně a materiál se nanese na plotny o průměru 15 cm s 1% agarem v. L-bujonu s obsahem 10 /Ug/ml tetracyklinu. Na každé plotně vyrostlo přibližně. 1000 kolonií. ’ v'

Stupen 6 Pěstování konií_

000 kolonií z transformací se jednotlivě vyjmou, přenesou se na čerstvé plotny

- 65 v množství 500 kolonií na plotnu v mřížce a kolonie se pěstují přes noc při teplotě 37 °C. / Pak se kolonie oddělí od nloten přitlačením filtru ze suché «b J?

míkrocelulozy na povrch plotny. Z každého základního filtru se připraví dvě kopie. Původní filtg- se skladují při teplotě 4 °C a na kopie se působí zásadou a pak se za tepla suší, aby byly připraveny pro hybridisaci.

t v

Stupen 7 Průprava hybridi sadních vzorků, značených

Včleněný sled cDNA z pCSF-1 byl isolován rozštěpením restrikčním enzymem ScoPl s následnou elektroforézou na agarozovém gelu při použití Tris acetátového pufru a ethidiumbromidu. Pás, obsahující fragment cDNA byl z gelu vyříznut a čištěn obvyklým způsobem.

300 ng fragmentu cUTA bylo pak přidáno k 1 yul 10 x Jí pufru pro působení T4 DNA polymerázy (0,33 M Trisacetát o pH 7,9, 0,66 M octan draselný, 0,1 N octan horečnatý a 10 mmol dithiothreitolu) s 3 jednotkami T4 DNA polymeráty (Nev England Biolabs) a směs se zředí vodou na 10 ml. Po inkubaci 5 až 10

- 66 minut při teplotě 37 °C se směs smísí s 1^ul 10 χ T4 pufru s DNA polymerazou, přidá se ještě 1 yul 2 mmol roztoku dCTP, dTTP, dGTP a 10 ,ul ^j2P dATP (lO/UCi/Jul,

3000 Ci/mmol) a 3 jednotky Tr DNA polymerázy, Pak se reakčni směs inkubuje 20 minut při teplotě 37 °C, přidá se l^ul 2 mmol dATP a reakčni směs se inkubuje ještě 10 minut při teplotě 37 °C.

'..... ‘ Nevčleněné-trif osfáty-se oddělí-od značené cDNA chromatografií na sloupci prostředím Sephadex GIGO. Pak se připraví druhy· vzorek ze syntetického oligonuklootidu se sledem

......... . ATC TGG.CTG CAC AG který je komplementární k zakončení oblasti, která je kódem pro CS? na té části, na níž se nachází aminoskupina. Tento oligonukleotid byl označen 32p dATP na 5 -zakončení při použití standardní reakce s polynukleotidkinásou.

Stupen 3 Isolace klonů CS{/ cDNA

Při zkouškách na standardní hybridizaci bylo možno prokázat tuto hybridizaci u 45 klonů při použití pCSF-l cDNA, označené T4. Z tě’/chto klonů

- 67 hybridizovalo přibližně 20 klonů se vzorkem, který obsahoval značený olígonukleotid. Rodová oblast jednoho z těchto klonů byla podrobena analýze sledu, přičemž bylo zjištěno, že došlo k substituci většího počtu baží, některé tyto substituce vedly k rozdílným aminokyselinám v bílkovině, k jejíž expresi došlo. Prokázané rozdíly jsou znázorněny na obr. 1 nad sledem DNA pro gen lidského CSF, tak, jak byl klonován v příkladu A.

Příklad C

Klonování CS? z mRNA lymfocytů z periferní krve , v

Stupen 1 Příprava mRNA z lymfocytů z periferní krve

Lymfocyty z periferní krve byly připraveny z vedlejších, produktů při výrobě plasmy v

(poskytl Červený kř£ž) frakcionací při použití gradientu Ficoll-IIypaque. Bylo získáno při pěstování v prostředí RFMI-1640 za přítomnosti 5 Jt fetálního telecího sera, 0,17 fytohemmagluti^inu a 10 ng/ml PbíA hustoty 2 x 10^ buněk/ml celkem bylo získáno 6 x 10 buněk. Buňky byly odděleny odstředěním 5 mi- 68 nut při 1000 otáčkách za minutu, pak byly promyty chloridem sodným s obsahem fosfátového pufru £#£55S (PBS) a nakonec byly buňky odděleny odstředěním.

Pak byla připravena cytoplasmatická PNA opatrným rozrušením buněk tak, že buňky byly uvedeny do suspenze v 50 ml chladného pufru pro rozrušení buněk s obsahem Tritonu (pufr sestával ze 140 mmol NaCl,

1,5 mmol MgC^, mol Tris o plí 8,6 a 0,5 ý Triton N-100) s .10 nmol dithiothreitolu (DTT) a 50 jodr.otk-mi/ml SNA sin (Bitec). Materiál byl rozdělen-na dvě stejné části a každá z těchto částí byla navrstvena na 10 ml toho pufru s obsahem 20 ý sacharosy. Buněčná jádra byla odstraněna-odstředěním při teplo-, tě 4 °C po dobu 5 minut při 400 otáčkách za mihutu. Horní vrstva, kterou tvořil cytoplasmatický extrakt byla opatrně odstraněna a byl přidán ďodecylsulfát sodný- (SDS) do konečné koncentrace 1 ý. Pak byl roztok 2x extrahován týmž objemem směsi fenolu a chloroformu v poměru 1 : 1 a RNA byla vysrážena přidáním 2,5 objemu chladného ethanolu. Vysrážená KRA byla oddělena odstředxxýením 15 minut při 4000 otáčkách za minutu a pak bylo znovu uvedeno do suspenze ve směsi 0,01 1-í Tris o plí 7,5, 1 mmol EDTA, 0,25 M NaCl (pufr TE s 0,25 ϊ-í NaCl) a materiál byl znovu vysrážen přidáním 2,5 objemu chladného ethanolu. Nakonec bylo RNA oddělena odstředěním a znovu uvedena do suspenze v 5 ml vody. Celkový výtěžek byl

7,5 mg.

celkové cytoplasmatické RNA byla izolována mRNA selekcí na dT celulóze. Rak se

2,5 mg veškeré RNA zahřeje na 5 minut na teplotu’ °C. Přidá se chlorid sodný do koncentrace 0,5 H a RNA se nechá zchladnout na teplotu místnosti a. . pak se nechá projít sloupcem s obsahem 1 ml oligo

Z ___,..,.-™· · _________ ··· .· __ sd-^c-řjTKro^^V^řbWbváznéď'stavů '' v ' TSOý 5 M‘ chloridu sodného (pufr pro vazbu). Nenavázaná RNA se oddělí důkladným promýtím. sloupce tímtéž pufremv Vázaná mRNA se pak vymývá 3 ml vody a vvsráží se přidáním 0,2 ml 4 M chloridu sodného a 2,5 objemu chladného ethanolu. Vysrážená mRNA se oddělí odstředěním 30 minut při 25 000 otáčkách za minutu. Výsledná usazenina v množství přibližně 100yug se znovu uvede do suspenze v 50 yl vody, v

Stupen 2 Reakce s prvním řetězcem cDNA

20/ug RBL mRNA se zředí v reakční směsi s obsahem 50 yum cDNA, která obsahuje 100 mmo)

- 70 Tris o pH 8φ4, 140 mmol KC1, 10 mmol NgCl^, 10 mmol

2-merkaptoethanolu, 400/Umol dATP, dC-TP, dCTP a dTTP, 5 /ti£ oligo-dT s průměrnou velikostí 12 - 18 a 25/uCi

P dCTP (400 /uCi/mmol) a 20 jednotek inhibitoru ribonukleásy HNAsin. Reakce byla spuštěna přidáním 60 jednotek reversní transkriptázy při teplotě 37 °C s následnou inkubací 30 minut pří teplotě 42 °C.

«

Reakce pak byla zastavena přidáním ETDA do končen'·* ^T · · Λ· —L. Mrf. -V . i - B - . .

t —i „Fl* 4 .--^.lu* .« IhWWm traco 40 mmol s následnou extrakcí stejným objemem fenolu, nasyceného vodou. Penolová fáze byla podrobena zpětné extrakci. 50 yummol .pufru TE. Vodné fáze byly slity a hybridy cDNA/RNA byly izolovány od t

nevčleněnýchtrifosfátů taky že- slité-vodné fáze-—prošly sloupcem -s obsahem 5 ml prostředku Sepharose CL-43 (Sigma) v rovnovážném stavu s TE. Prakce, které prošly sloupcem, byly slity , doplněn;? na obsah 250 mmol chloridu sodného a nukleové kyseliny byly vy sráženy přidáním 2,5 objemů chladného ethanolu. Hybridy byly odstředěny 30 minut.při 40 000 otáčkách sx minutu. Výsledná usazenina 2,5 yUg cDNA byla znovu uvedena do suspenze v 50yul vody.

- 71 Z

Stupen 3 Reakce s druhým řetězcem cDNA

Druhý řetězec cDNA byl syntetizován současným půsoebním enzymu DMA polymerázy I,

DMA ligázy a RHAázy Η z E. coli. 50 yul takto získané reakční směsi obsahovalo 20 mmol Tris o pH 8,0, mmol chlorido horečnatého, 1,2 mmol EDTA, 25 /umol

NAD, vždy 100/Umol dATP,.dGTP, dCTP a dTTP a 50/uCi 32

P dCTP o 3000 Ci/nmol. Reakce se spustí přidáním 3 jednotek DMA polymerázy I, 0,5 jednotky DMA ligázy, a 0,75 jednotek ribonukleázy H s následnou inkubací hodin při teplotě 16 ^JC a pak hodinu při teplotě 37 °C, načež se reakce zastaví přidáním EDTA do¹ koncentrace 40 mmol a pak se extrahuje stejným objemem fenolu. Fenolová fáze se zpětně extrahuje 50yul TE, vodné fáze se slijí a cDMA se oddělí od nevčleněných trifosfátů chromatografií na sloupci prostředku Sepharose Cb-43, tak, jak bylo popsáno svrchu v přípádě prvního řetězce. V závislosti na včlenění . P se první řetězec CDMA kvantitativné převedl do formy s dvojitým řetězcem.

- 72 v

Stupen 4 Příprava rekombinantní cDNA

Na zakončení cDNA byly navázány homopolymerní C-sledy opatrným zahřátím 400 ng cDNA v 50 yul reakční směsi, která obsahovala 1 mmol

2-merkaptoethanolu, 1 mmol chloridu kobaltnatého a 9 jednotek terminální deoxynukleotidiltrasferásy minut při teplotě 30 °C. Pak byla reakce zasta , “ ··' — L X. · .Π 'L.. 1 _ véna přidáním EDTA do koncentrace 40 mmol s následným zahřátím na 10 minut na teplotu 68 °C. Pak bylo 200 ng získáno cDNA navázáno-na 500 ng pAT153 se zakončeními 0 (Amersham) v 100/ul 10 mmol Tris o pH 7,5, 1 mmol ETDA a100 mmol· chloridu-sodného.—Vazba byla pxxx prováděna 2 hodiny při teplotě 57 °C při 5 minutách předběžné inkubace při teplotě 68 °C.

Stupen 5 Transformace bakterií

PrcLukt, získaný vazbou cDNA byl přímo užit k transformaci kmene E. coli MC1061.

v

Čerstvá kolonie bakterií byla užita k naočkování ml L-bujonu a-byla pěstována několik hodin tak dlouho, až optická hustota při ýř 550 nm byla 0,25. *

Punky byly zchlazeny v ledu a pak byly odděleny odstředěním 10 minut pří 2000 otáčkách za minutu. Získaná usazenina byla znovu uvedena do suspenze v 10 ml chladného 0,1 ϊ-í chloridu vápenatého a pák byla ponechána v ledu po dobu 10 minut. Pak byly buňky odstředěny 5 minutý při 2000 otáčkách za minutu. načež byly znovu uvedeny do suspanze v 2,5 ml 0,1 M chloridu vápenatého. Pak bylo 10/_Ul reakční směsi pro vazbu cDNA inkubováno s 200/Ul bakterií, na něž bylo působeno chloridem vápenatým nejprve 30 minut v ledu a pak 2 minuty při teplotě 37 °C, nače.ž-bvlo_r.př.idáno_0 ,.8_ml..L-buj onu a buňky byly inkubovánv ještě 30 minut nři tenlotě 37 C.

Bylo provedeno celkem 20 transformačních reakcí při využití veškerého množství navázané cDNA. Každá z transformačních směsí byla nanesena na plotny o průměru 15 cm, které obsahovaly L-bujon s obsahem 1 agaru a 10 /Ug/nl tetra· cyklinu. Z 20 provedených transformací bylo připraveno 20 takto upravených ploten a tyto plotny byly inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Na každé plotně vyrostlo přibližně 1500 kolonií bakterií, což znamená celkem 30 000 kn± klonů.

- 74 v

5tupéη 6 Výroba kopií

Původní kolonie, rostoucí na každé plotně byly přeneseny na nitrocelulosové filtry o průměru 137 mm tak, že suchý filtr byl přitlačen na horní stranu plotny s koloniemi a pak byl opět sejmut. Z každého originálního filtru byly pak připraveny dvě totožné kopie běžným způsobem tak, / aby bylo možno přesně označit Části, které si odpovídají. Každý původní filtr byl opatrně uložen koloniemi, vzhůru, na. sterilní filtrační papír.

(Thaimp-n 3 KM), nacházející se na skleněné desce.

Pak byl na-tento~ filtr uložen~předen zvlhčený nitrocclulosový filtr, tento filtr byl přikryt druhým z

'já větším úsekem filtračního papíru a filtry pak byly k sobě přitlačeny druhou skleněnou deskou.

Filtry byly očíslovány a byly na třech nesymetrických místech propíchnuty špendlíkem tak, aby bylo možno je v budoucnosti znovu přesně přiložit. Pak byla kopie oddělena od původního filtru a byla uložena koloniemi vzhůru na novou plotnu s L-bujonem, agarem a tetracykl.inem, Okamžitě bylo pak stejným způsobem přiložen další Čistý filtr, Čímž byla získána další kopie. Pak byl původní filtr navrácen

- 75 na agarovou plotnu a všechny plotny byly několik hodin inkubovány při teplotě 37 °C, po této době měly kolonie bakterií průměr přibližně 1 mm. Původíi ní filtry byly skladovány při teplotě 4 °C k přípravě kopií, sloužících k hybridizací svrchu uvedeným ii!

způsobem.

M Z

Stupen 7 Unrava filtrů nro hybridizací

Každá kopie původního filtru,

a. ; ůc,:íi r’ UiHiř

- — _Z-í.slcanájt.ve^.sAu.pni»-ifi—byXa.^nl.n.aftna._kftln.niftni...gmě.riaw vzhůru na filtračním papíře (Vhatman 3 MM), který ·*·'·» byl zvlhčen 0,5 II hydroxidem sodným a 1,5 M chlori ' 'Wť dem sodným na 7 minut.· Filtry pak byly neutralizovány, zvlhčeny na 2 minuty pí 1 íí Tris o pří 7,5 s

1,5 M chloridem sodným, načež byly znovu neutralizovány 5 až 10 minut a pak byly uložen;/ na filtry, zvlhčené pufrem SSC na 5 minut (0,015 M citrát sodný, 0,15 íí chlorid sodný, pil 7,4), pak se filtry usuší na vzduchu, načež se zahřívají 1 až 2 hodiny ve vakuu na tenlotu SO °C.

- 76 Stupen S Isoíace klonů cDNA CSF

Kopie filtrů byly ve dvojím provedení uvedeny do styku s včleněnou cDNA pCSF-1 po radioaktivním označení, plasmid byl připraven způsobem podle příkladu B. S cDNA hybridizovalo 20 kolonií. 12 z těc^o kolonií bylo odděleno a pěstováno ⁽ _v , á/ ' přes noc v L-bujonu pro další analýzu, haterij, který byl získán rozštěpením restrikčním enzymem rst 1 z těcht o klonů byl poněkud nesourodý, avšak tři z těchto klonů měly téměř plnou délku požadovaného sledu. U jednoho z těchto sledů byl proveden ' z podrobný rozbor—celého—sledu. - Sled, který-byl--kódem --pro CSF v tomto klonu byl totožný s odpovídajícím sledem plasmidu, pCSF-1. což znamená, že obsahoval

T v poloze 365-CSF(Ile).

Příklad D

Čištění CSF z buněčné linie Ho

1 prostředí z pěstování buněčné linie Mo.se inkubuje 30 minut při teplotě 55 °C

- 77 k inaktivaci viru HTLV-II, spojeného s touto buněčnou linií. Pak se prostředí zahustí ultrafiltrací pod tlakem při použití zařízení Pellicon Casette s membránou PTGCÍl/6 m~)_t se schopností oddělit ±á látku do molekulové hmotnosti 10 000. Bílkovina se pak čtsxá dále koncentruje vysráženám síranem amonným do nasycení na 80 800 mg výsledné hílko* ' viny se znovu uvede do suspenze ve 100 ml 20 mmol tris(hydroxyraethyl)aminomethanhydrochloridu (Tris-KCl) o pH 4 7,4 a materiál se pak dialyzuje proti témuž pufru celkem _3x„yždy ...při použití / 1 pufru... D i al v zovaná bílkovina se pak nanese na sloupec o rozměrech 2,5? x 10 cm s obsahem Β2ΑΞ (diethylaminoethyl)-ultrogelu, v rovnovážném stavu v tomtéž pufru’. Sloupec se pak promývá 800 ml 20 mmol tris-KCl o pil 4 a pak'SOO ml 20 mmol tris-KCl o pH 7,4 s obsahem 0)2 M chloridu sodného, čímž se počne vymývat látka s účinností CSP. Odebere se řada frakcí po 10 ml, účinné frakce se slijí. Jde celkem o tři frakce, které se zahustí na 1/6 svého objemu, tj. na 5 ml ultrafiltrací pod tlakem při použití membrány Amicon ΪΤ·ί5, která odděluje sloučeninu do molekulové hmotnosti 5000). Koncentrovaný vzorek z DEAE-sloupce se nanese na sloupec o rozměru 1,6 x 100 cm s obsahem

-/8AcA44 ultrogelu (akrylamidagarosový ultrogel s frakcionací do 10 až 130 k jednotek molekulové hmotnosti) sloupec je v rovnovážném stavu ve 20 mmol kyseliny N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonové (HEPES), o pH 7,4 s 50 mmol chloridu sodného a 0,01 ý polyethylenglykolu (PEG-SOOO). Látka s účinností CSF, která byla vymývána ze sloupce mela molekulovou hmotZ nost 30 k jednotek. Účinné frakce byly slity a byla j_ . vj* . <.· .... ___| k nim přidána kyselina trifluoroctová (TFA) do koncentrace . 0,15 objemových procent přidáváním 10;'.- roztoku této. kyseliny, načež byla získaná směs nanesena na sloupec o rozměrech 1 x 25 cm s obsahem prostředku Vydac C 7'v reversní' fázi. Sloupec byl vyvíjen-lineárním gradientem Ό. až 90 J.· acetonitrilu v 0,1 ý objemovýhh TFA rychlostí 4 ml/min, bylo získáno celkem 1000 ml eluátu. Látka s účinností CSF se vymývá při koncentraci acetonitrilu přibližně 47 % objemových. Účinné frakce se slijí a upraví se na koncentraci 0,05 Jí objemových kyseliny heptafluormáselné (HFEA) přidáním 0,15>; HFBA a získaný materiál se pak nanese na sloupec o rozměrech 0,46 x 25 cm s obsahem prostředku Vydac C^ v rovnovážném stavu ve HFBA o koncentraci 0,15 % objemových. Sloupec se vyvíjí lineárním gradientem 0 až 90 % objemových acetonitrilu

- 79 v 0,15 Ji objemových KFBA rychlostí 1 ml/min, získá se celívem 340 ml eluátu, Látka s účinností CSF se vymývá oři koncentraci acetonitrilu přibližně 53 Ji objemových. Účinné jsou frakce 37 až 44, každá z nich měla objem 1 pl. 0,15 ml frakce 40 hylo zahuštěno na 1/4 objemu při použití koncentračního zařízení SAVANT Speed Vac a pak bylo přidáno 40/Ul 2x SDS pufru (0,125 M Tris-HCl o pH 6,8, 4 Ji SDS,

Ji glycerolu a 0,004 Ji bromfenolové modři).. Tyto vzorky byly povařeny 2 minuty a pak byly naneseny na 13,5Ji SDS gel způsobem podle / publikace Lammli,

U. Nátuře 227, 6S0 (1970), jak je znázorněno na obr. 2. Frakce 40 měla účinnost 110 000 jediiotek/ml při použití buněk kostní dřeně. To odpovídá přibližr ně 3,0 x 10^ jednotek na jednu jednotku absorbance

Protože tvpické bílkoviny mají extinkční koeíicienty v rozmezí 0,8 až 1,2 jednotek ^2gQ'^V ✓ ligramu, má čištěný CSF specifickou účinnost v rosmezí 1 x 10 aŽ 4 x 10 jednotek/mg. Vzorek l^ug čištěného GM-CSF byl podroben Sdmanově degradaci při použití zařízení, Applied Biosystems Gas Phase líicroseauenator. Sled mezi zbytky 3 až 5 byl Ala Arg Ser.

- 80 Příklad ϊ

. Kotřansformací a amplifikaci sledu CSF v buňkách CKO byl včleněn plasmid p91023(B)-CSF do buněk DUEZ-Bll, které neobsahují DHFR CHO, jak bylo popsáno v publikaci Chasin a TJrlaub ..FNAS z

77, 4216 (1980), a to fúzí protoplastu, popsanou v publikaci Sandri-Ooldin a další, Mol. Cell. Bio.

1, 743 - 752, 1981. Růst a udržování buněk CHO bylo popsáno v publikaci Kaufman a Sharp, J. Mol-r Bio. 150, 601 - 621, 1981. Při provádění fuze protoplastů byl plasmid p91023(B)-CSF-1 včleněn do kmene

.. _a baktenie^byly-pě-stovány-v -50-ml prostředí m9 s obsahem solí a 0,5 aminokyselin kaseinu,. 0,4 glukosy, 0,012 Ja síranu horečnatého, 5/Ug/ml thiaminu a 10/Ug/ml tetracyklinu do adsorbance 0,6 při 600 nm. Chlorarafenicol byl přidán do koncentrace 250yUg/ml a kultura byla inkubo/vána při teplotě 37 °C k pomnožení kopií plasmidu. Pak v

byly buňky odstředěny při 3000 otáčkách/min po dobu 10 minut při teplotě 4 °C a pak byly uvedeny do suspenze ve 2,5 ml chlazené 2O.'í sacharosy v 50 mmol Tris-KCl o pH 8,0. Pak byl přidán lysozym, a to 0,5 ml roztoku o koncentraci 5 m£/ml v 0,25 M

Ο Ί

- ul Tris-HCl o pH 8,0 a směs se pak uloží do ledu.ua 5 minut. Pak so přidá 1 ml 0,25 M 3DTA o pH 8,0 a směs se uloží do ledu na dalších 5 minut a pak sc přidá 1,0 ml 0,05 M Trie-HCl o pH 8,0 a suspenze se inkubuje 15 minut při teplotě 37 °C, po této době se bakterie přemění na protoplasty. Pak se suspenze pomalu zředí 20 ml předehřátého prostředí, které obsahuje 10 Jj sacharosy a 10 mmol chloridu iiořecnatého, načež se směs nechá stát 15 iainutjí při teplotě 37 °C. Pak se přidá roztok protoplastu ,(nřibližně^l.cj/ml j^I-^bužiám.DUKNyBl1, bez. 3IIPR CHO v plotnách o šesti vyhloubeních v množství přibližZ ně 1 >: 10 buněk/vyhloubení v poměru přibližné 1 až 2 x 10 protoplastů/bunka a protoplasty se peletuv jí spolu s buňkami odstředěním o minut při 2000 ot/min při použití odstředivky I3C model K. Po odstředění se supernatant odsaje a přidají se 2 ml roztoku polyethylenglykolu (50 g P30-1450, Baker Chem.. Co. v 50 ml prostředí) do každého vyhloubení v

svrchu uvedené plotjáiy. Pak se buňky znovu odstředí 90 sekund při 2000 ot/min, roztok polyethylenglykolu se odstraní a plotny se opláchnou 3x vždy 4 ml prostředí/vyhloubení, Pak se buňky zpracují působením trypsinu, uvedou sc do suspenze v 10 ml prostředís obsahem 10 Jj fetálního'telecího sera a pak se odstředí ve zkumavce (konické) při 500 ot/nin v v

běžné odstředivce. Peletované buňky ze tří vyhloubení se spojí a nanesou na plotnu o průměru 10 cm, ke každé plotně se přidá čerstvé prostředí, které obsahuje lOOyUg/ml kanamycinu, thymidinu, adenosinu, deo.xyadenosinu, penicilinu a streptomycinu a,

--TO^-dialyzovaného fetálního-telecího séra. Kanamýcin se přidává' k $ zamezení růstu- jakýchkoliv bakterií, které by přetrvával;? při přeměně na protoplasty.'

Po dvou dnech byly buňky přeneseny v poměru'1 : 15 do' prostředí- a- s 10 dialyzovaného fetálního tělecího sera, penicilinu a streptomyv činu, avšak bez nukleosidů. Pak bylo k bunltám přidáno totéž selektivní prostředí bez nukleosidů ještě po 4 až 5 dnech.

Kolonie se objevily po 10 až 12 dnech pěstování v selektiirním prostředí. Pak byly prováděn;? dva pokusy na selekci působením methotraxatu (NTa) a pokus na amplifikaci. V první sérii pokusů byly izolovány jednotlivě nezávisle klonované tr.ansformanty podle exprese DHPR a každý klon byl. pěstován za podmínek, při nichž dochází k amplifikaci počtu kopií cizorodé DNA, t j . při pouúŽití stoupajícího množství methotrexátu. Fři druhé sérii pokusů byla izolována směs nezávislých transformantů podle exprese DH?R a tato směs byla dále pěstována za podmínek, pří nichž dochází k amplifikaci cizorodé DNA, tj. při stoupající koncentraci methotrexátu. Pak byly izolovány jednotlivé klony a analyzovány na expresi GM-CSP. Klony, které vykazovaly / W nejvyšší úroveň exprese GM-CSF byly dále pěstovány 'z ε’ρ oamrueKj^p r r-nrcnz^aocna ζτ^κ - amp i π xxa c i—c i z o-., rodé DNA, tj. při stoupající koncentraci nethotrexátu v živném urostředí.

Při jednom z pokusů bylo spojeno +

sedm transform/ntů DHFR v prostředí ct bea nukleov sidů. Tyto buňky pak byly pěstovány při stoupající koncentraci MTX od 0,02/umol přes 0,1 a 0,5 až do

2,0yumol. Při zkoumání na účinnost GM-CSF při použití buněk KG-1 bylo možno prokázat 3000 až 12 000 jednotek/ml. Tyto buňky pak byly klonovány v .0,5 &2,0 yumol MTX. Klony, které bjíly získány v 0,5 /umol MTX (klony 010, D2 a B6) byly postupně podrobeny selekci na růst v 2,0yumol MTX. Při zkouškách na účinnost v

GM-CSF při pokusu s buňkami KG-1 produkovaly klono- 84 ve.né buněčné linie 15 000 až 300 000 jednotek/ml, / v této účinnosti, jí GM-CSF, produkovaný buňkami při provádění způsobu podle tohoto příkladu má sled aminokyselin, uvedený pto CSF-Thr na obr. 1,

Příklad P

Sxorese GM-CSF v 2. coli

Exprese GK-CS? bylo dosaženo v

3. coli při použití vektoru pTALC-195R, jde o materiál , který je znázorněn na obr. 6. Sled, který

Z , .

'je~kodem pro“ GM-CSF' začíná 'syntetickým ' sledem ATG CCA CCA CCT CCT TCT CCA TCT CCA TCT ACT, který určuje počátečních jedenáct zbytků aminokyselin z z úplného GM-CSP. Zbytek sledu, který je kódem pro GIÍ-CSP v pTÁLC-l85R je totožný se sledem v pCSP-1, nukleotidy 97 - 447, načež přichází sled TAE TAR TAG. Pak ihned následuje terminační sled, sestávající ze tří částí a z navázaného sledu p-UC-lS. Do genu pro CSF byl včleněn gen pro odolnost proti tetracyklinu. z plasmidu p3R322 s orientací opačnou než je orientace genu pro CSP 100 baží směrem dolů od sledu pUC-18. Gen pro odolnost proti tetracyklinu nese svůj vlastní promotor. Pak se ve směru opačném než je směr hodinových ručiček nachází geň pro β-laktamásu a pak sled z-pUC-18 . (CoLEl) pro počátek replikace.

Konečnou strukturou plasmidu před návratem ke sledu pro CS? je promotor PL. Tento promotor je v nodstatě popsán v publikaci A. Skatzman ” * a M. Rosenberg (v Molecular cloning, a laboratory manual (1932), Cold Spring Harbor Laboratory, str. 419). Exprese CSF je řízena promotorem PL po tepelné ři-n^-du-kc:its?reít!‘P‘ie.čLn.é!n-jk’2£juj£dí - ~ c o.l i_„,i ako ..ho s ti to I i.

Kmenem, použitým pro všechny tyto 0 , , konstrukce byl kmen 13110 láci LS, popsaný v publikaci R. Brent a II. Ptaslme PNAs 78 (1981) 4204 - 420S.

Fragment AdKA ( /\ -nukleotidy 34499 θ az 33214) byl integrován do chromosomu 1.3110 láci LS v místě lacZ. Integrace byla provedena při použití integračního vektoru, složeného ze sledů p2R325, nesoucích geny pro odolnost proti chloramfenikolu a ampicilinu a také počátek pro replikaci z pBR322, jak bylo popsáno v publikaci 3?. Bolivar Gene 4 (1978) 121 - 136. Fragment Λ PNA se včlení do genu lacZ, který je sám v plasmidu přítomen jako fragment, který zasahuje od místa BstSil v Láci k místu TthillI

- £6 směrem dolů od lacZ.]

Integrace -A DNA do o chromosomální kopie $ lácZ bylo dosaženo homologní rekombinací a byly získány lac⁺, na ampicilin citlivé a proti čhloramfenikolu odolné kolonie. K další rekombinaci, která vedle k odstranění všech přídatných sledů plasmidů při ponechání integrovaného fragmentu . DMA -došlo -na ~pl o tná c h.lía c Co nkeyho _ s - obs ahem - lak·®·—

J. g ρ tosy..Počáteční f-enotyp lac. , amp car??' se změnil - S S no druhé i-ekombinaci ha fenotvn lac , amo , cam .

Λ w z. J J

Výsledný kmen byl nazván GL400 a měl vlastnosti -n při teplotě 30 °C a Λ při teplotě 42 °C. Tento fehotyp prokazuje existenci' funkční 'chromosomální koule kůeůx alelv. ΟΙθ^..

X. Uf

Kmen GL400 byl proveden na Ion transdukcí PL z lysátu kmene SG20252 (lae /1 u!69, ara & 139 rnsl

Ion & 100;:Tnl0). TnlO byl nalezen] S při testech na Tet na selektivních prostředích,.jak _t bylo popsáno v publikaci S. Maloy, V. Nunn, J. Bacteriol. 145 (1981) 1110 - 1112. ’

Výsledný hostitelský kmen byl nazván GI413 (lacl°L8, LacZ 4 . (Λ Cl, REK, N), Ion Δ 100) pTALC-185R byl transformován na GI413. Kultura tohoto kmene, která vyrostla přes noc,

- 87 byla pěstována při teplotě 30 °C v 5 ml indukčního prostředí s obsahem 7/Ug/ml tetracyklinu. Indukční prostředí obsahuje v'l litru g aminokyselin kaseinu 6 g i\a₂HP0₄.7H₂0 3 g XH₂?0₄

0,5g NaCI 1 s hi-i₄ci ji glycerolu mg vitaminu 3₁

n.________ r — -----— Q------Q '--1

0,2 g MgCl₂.6H₂0 ml tohoto prostředí s obsahem 7/Ug/ml tetracyklinu se naočkuje 125 /ul svrchu uvedené kultury a kultura se dále pěstuje na vodní lázni při teptotě 30 °C za třepání tak dlouho, as živné prostředí dosáhne optické hustoty 0,5 při Pak se prostředí rychle přenese do vodní lázně o teplotě 40 Ca protřepává se další 2 hodiny k dosav žení syntézy Gtí-CS?. Buňky se oddělí a prokazuje se v¹ obsah CS? v těchto buňkách elektroforézou na SDE-polyakrylamidovém gelu. Za těchto podmínek se Gíí-CS? nahromadí tak, že tvoří přibližně 5 y buněčných bílkovin.

xprese GM-CSF v ga,cháromyces cerevisiae — Ον

P ř í k 1 ad

A. Konstrukce vektoru sa

LV <«.

OJ

Byl zkonstruován plasmid, který obkoval gen pro enzym oři biosyntéze uracilu (UBA „ A -rt. ·** «. * ” *—· ” ..... ... · jako selekční gen při počátku replikace 2u. Plasmid byl odvozen od Ylp5, který byl popsán v publikaci Botstein a další, Gene 8, str. 17 - 24 (1979) při přidání fragmentu, obsahujícího počátek repl ikace z Plasmidu kvasinek.

B. Isolace crenu pro glyceraldehydfosfát

Behvdrogenása (GPDH)

Dva geny pro 3BS3 GFLH byly isolovány z kvasnic, jak bylo popsáno v publikaci Kolland a Kolland, Journal of Biological Chemistry 255, str. 2596 - 2605 (1980). Vzorek oligonukleotidu, syntetizovaný z uveřejněného sledu byl užit k isolaci genu pro GPDH ze sestavy plasmidu DNA genomu kvasnis oři použití standardních způsobů, Plasmid,

- 89 který obsahuje celý gen GAP491 byl již do sbírky uložen dříve pod č. ATCC o. 39777.

C. Přínrava promotoru glvceraldehvdfosfátdehydroge-_ názv. pro expresi heterologního genu

Byl zkonstruován plasmid, v němž se udržuje přirozený odstup promotoru GPDH od začátku požadovaného heterologního strukturálního genu.‘Tohoto cíle bylo dosaženo tak, že bylo včleněno místo pro pAs ο.ΐιΡ.η.Ύ—ρρ.τ.νιη.ι.ι-ΐ\ρηΤ^.Βρ.·τ;ρρη gtřnd n ě _ k e -knr! OHUΡΓ.Ρ_: methionin na počátku strukturálního genu pro GPDH. Tato oblast byla pak včleněna do vektoru pro expresi YOpl kvasnic.

D, Isolace genů pro faktor a

Gen pro faktor a (fenomon) byl rovněž isolován z kvasnic a byl popsán v publikaci Kurjan a Herskovitz Cell, sv. 30, str. 933 - 943 (1982). Vzorek oligonukleotidu, syntetizovaného z tohoto sledu byl užit k isolaci genu ze sestavy plasmidů DNA genomu kvasíce, znaným způsobem.

- 90 Ξ. Příprava plasmidu ργο expresi C-SF

Ze 'svrchu uvedených součástí a z lidského genu pro CS truován vektor pro exp 1. V tomto vektoru byl

F byl běsným způsobem zkonsrcsi AJ14, znázorněný na obr. odstraněn přírodní vedoucí sl eo.;

CSF a byl včleněn sled, který je kódem pro úplný CSF v bezprostřední blízkosti sledu pro faktor a. Spojení mezi promotorem GFDE, pre-pro sledem pro faktor a a sledem pro úplný CSF je znázorněno dále a bylo potvrzeno tak, že byl analyzován sled dideoxynukleotidu.

A AATA AA CAAAATG. CC-TTTT CCTTCA

GCT.GCA CCC GCC CGC TCG ...

íA AGA

GAG GCG C-AA ?i/W -W Si

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantní bílkovina. GM-CSF lidí, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1 za šipkou pro CSF-Thr nebo CSF-Ile, její alelické variace nebo bílkoviny odpovídající aminokyselinovou sekvencí přirozeně se vyskytující bílkovině GM-CSF lidí, s tím, že v nich byla alespoň jedna aminokyselina přidána, nahrazena, nebo odstraněna bez podstatného ovlivnění aktivity GM-CSF lidí v testu na lidské kostní dřeni, získatelná expresí.v prokaryotických buňkách nebo kvasinkách, buňkách COS nebo CHO, a vykazující v testu na lidské kostní dřeni specifickou aktivitu alespoň 1 xlO¹ jednotek na mg.

   2. Bílkovina podle nároku 1, vykazující v uvedeném hactn, Qp<ac.Lf.í ť?..k.o.n».a.kt i.vi.t.u ~ a 1 e s.p o ň „ 2 „ x „ 10 j e dno t ek na mg.

   . - -T- — ť -TF—7’ - ·« 3. Bílkovina podle nároku 1 nebo 2, vykazující v uvedeném testu specifickou aktivitu alespoň 4 x 10⁷ jednotek na mg. —

   4. Bílkovina podle nároku 1, získatelná rekombinantní expresí v prokaryotických buňkách.

   5. Bílkovina podle nároku 4, získatelná rekombinantní expresí v Escherichia coli.·

   6. Bílkovina podle libovolného z nároků 1 až 3, získatelná rekombinantní , expresí v buňkách COS nebo CHO.· 7. Bílkovina podle libovolného ž nároků 1 až 3,

   získatelná rekombinantní expresí v kvasinkách.

   8. Bílkovina podle libovolného z nároků 1 až 7, kde je bílkovina GM-CSF lidí odvozena z buněčné linie Mo.

   je CSF-Thr obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1 za šipkou pro CSF-Thr nebo její variace, kde jedna, dvě, tři, čtyři nebo pět aminokyselin bylo nahrazeno jinou aminokyselinou, nebo jinými aminokyselinami, bez podstatného ovlivnění aktivity GM-CSF v testu na lidské kostní dřeni.

   10. Bílkovina podle nároku 8, která aminokyselinovou sekvencí odpovídá aminokyselinové sekvenci CSF-Thr, uvedené na obr. 1 za šipkou pro CSF-Thr.

   11. Bílkovina podle libovolného z nároků 1 až 8, kde bílkovinou GM-CSF¹ lidí*je'CSF-Ile obsahující' aminokyselinovou' sekvenci uvedenou na obr. . 1 . za. šipkou·, pro CSF-Ile nebo její variace, kde jedna, dvě, tři, čtyři nebo pět aminokyselin bylo nahrazeno jinou aminokyselinou, nebo jinými aminokyselinami, bez podstatného ovlivnění aktivity GM-CSF lidí v testu na lidské kostní dřeni.

   12. Bílkovina podle nároku 11, která aminokyselinovou, sekvencí odpovídá aminokyselinové sekvenci CSF-Ile, uvedené na obr. 1 za šipkou pro CSF-Ile.

   13. Injikovatelný farmaceutický prostředek, vyznačující se tím , že obsahuje bílkovinu GM-CSF podle libovolného z nároků .1 až 12 ve vhodném farmakologickém nosiči.

   1/7

   Ger GGA6C AIS Í1FT TGG cre Irj» Leu us Gin ACC Ser CTG t«u CTff Leu CTC Leu TTG LeU CCC Gly ACT Thr gtg ccc rcc Cys Vel AU I Ser CSF-G 50 Arg CSF - G 1 T G AGC ATC TCT bCA CCC GCC CGC TCC CCC ABC CCC AGC ACC CAG CCC TGC GAP CAT CSF-thr to- ll* Ser Aid Pro AU Arg Str Pro Ser Pro Ser Thr 6ln Pro Trp Glu His

   140

   GTG Vel AAT Asn GCC Al< ATC íu CAG Gin BAG Glu GCC ₍Al 4 CGG Arg CGT Arg CTC CTG AAC Asn CTG Leu ACT Ser AGA Ary GAC flCT, GCT, Leu Leu Asp Thr AU 200 Ile CSF- G ÍM C5F- G A G CCT GAC flTG AAT GAA ACA GTA GAA GTC ATC TCA GAA ftTB TTT GAC CTC CAG GAG AU Glu fl£T Asn Biu Thr Val Clu Vil ru Ser Glu HET PU Asp LeU GU Glu 160 - 0 U - T CCC ACC TGC CTA CAG ACC CGC CTG . CAG CTG TAC AAfi CAO GGC CTG CAG GGC AGC Pro Thr Cyí Leu Gin Thr Ary Leu 01« Leu Tvr Lys Gin Gly Leu Ary Cly Ser n SiO CTC ACC AAS CTC AftS CCC CCC TTG ACC ATG ATS GCC ABC CAC TAC aaq CAC CAC Leu Thr Lys L ev Lys Cly pro Leu Thr hct HET AU Ser HU Tyr CVS Gin His Ile CSF- l U - A G T *!> ί' TGC ccr CCA ACC CCÓ G/)A ACT TCC TGT GCA ACC CAG ACT ATC ACC ΤΓΓ GAA ACT Cys Pro Pro Thr Pro Clu Thr Ser Cys AU Thr GU Thr Ile Thr Pha Glu Ser ioo 3B0 Thr CSF- G TTC AAA GAG AAC CTG AAG CAC TTT CTC CTT GTC c ftTC CCC TTT GAC TGC TGG GAG Phe Lys Glu Asn Leu Lys Ajp Phe. Leu Leu Vol IU Pro Phe Asp Cys Trp Glu * 4Jo 470 430 WO 500 Gly T. CSF- G fť CCfl GTC CAG u GAG Γ6Α CACCGGCCAG i ATfA&CCTGG CCAAGCCGGG GASCTGCTCT CTCATGAAAC

   Pro Val 61 n Clu 1Z7

   510

   A

   520

   5S0

   540

   G

   550

   560

   G

   570

   AA6A0CTGGA AACTCflGGAT

   CCTCATCTTC

   CACSCftCCAA

   CGCGTCGGCC

   ACA7CCATCG

   TGGGACTGCC

   5K>

   5fO £00

   610

   620

   630

   640

   CCCCACCTQC

   CCTCGGCCAC

   ACTCACCCTG

   ATACAOCCAT

   6GCAGAAGAA

   TGGG AAT ATT

   TTATAC1GAC eso £60

   670 <fao /90

   700

   710

   AGAAATCACT

   AtnATTWA

   ΤΛΤΠΑΤΛΤΤ

   ΤΤΓΑήΑΑΤΑΤ γΤατπατττ αγτταττταα

   GTTCATATTC

   720

   750

   JW

   730

   760

   770

   760

   CATATTTflTT

   CWWGTn

   TACCGTAATA

   ATTATTATTfl flflMTATGCT rCTflAAMAA ftfiAAAflftAAA