DE69314754T2 - Vorläufer B-Zelle stimulierender Faktor - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen Faktor, Vorläufer-B-Zelle stimuijerender Faktor mit der Aktivität der Förderung der Vermehrung und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf DNA-Sequenzen, die diese Faktoren codieren, Polypeptidfragmente und Analoga hiervon und Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung von hämatöpoetischen Störungen unter Verwendungdesfaktors.
• Hämatopoetische Wachstumsfaktoren sind die bedeutendsten regulatorischen Moleküle, die die konstitutive und induzierbare Hämatopoese unterstützen (Brach et al., Acta. Haematol. 86,128 (1991). Die hämatopoetischen Wachstumsfaktoren (Kolonie-stimulierende Faktoren und Interleukine), Wachstumsfaktor-synergistische Faktoren und Wachstumsfaktor-Freisetzungsfaktoren kontrollieren die Vermehrung, Differenzierung und funktionelle Aktivierung von hämatopoetischen Stammzellen und Abstammungs-verpflichteten Vorläuferzellen. Jeder Kolonie-stimulierende Faktor hat eine bestimmte Abstammung von Knochenmarkszellen, auf die sie wirken, obgleich eine gewisse Überlappung in der Abstammungsaktivität und ein Zusammenwirken zwischen den Kolonie-stimulierenden Faktoren besteht. Es ist bekannt, daß in verschiedenen Fällen die Wachstumsfaktoren in der Reifung bestimmter hämatopoetischer Zelltypen involviert sind, genauso wie die Funktion von Erythropoetin, um Erythrozyten zu erzeugen und des Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktors, um Neutrophile zu erzeugen. Jedoch gibt es eine Anzahl von Stadien in der hämatopoetischen Zellentwicklung, wo die Identifizierung von stimulierenden Faktoren unvollständig ist oder völlig fehlt. Dies gilt insbesondere für solche Fälle, die zur Vermehrung und Entwicklung von frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen führen.
• Hämatopoetische Vorläuferzellen entwickeln sich nach und nach von pluripotenten zu unipotenten, festgelegten Vorläuferzellen, wobei sie während dieses Prozesses ihre Selbsterneuerungsfähigkeit verlieren (Olofsson, Aca. Oncol., 1991, 30, 889). Diese Entwicklung ist abhängig von den Interaktionen von spezifischen hämatopoetischen Wachstumsfaktoren, welche durch Bindung an Oberflächenrezeptoren auf Stammzellen diese stimulieren, zu dem nächsten Schritt der Differenzierung überzugehen. Interleukin 3 (IL-3) ist in erster Linie ein Vermehrungsstimulus für die undifferenzierten Vorläuferzellen (Ponting et al., Growth Factors, 1991, 4, 165). Der Granolozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor GM-CSF) spielt eine bedeutende Rolle im Überleben der multipotenten Stammzellen, der Vermehrung und Differenzierung in Stammzellen mit beschränkten Reifungsprogrammen. Die programmierten unipotenten Stammzellen benötigen Stimulierung durch Erythropoetin, Granolozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und IL-5, um sich zu vermehren und um zu ihren Endstadiumsprodukten Erythrozyten, Neutrophile, Monozyten und Eosinophile zu reifen. Andere Cytokine wie IL-1β, IL-4 und IL-6 haben bedeutende Funktionen als Kofaktoren in diesen Prozessen (Arai et al., Ann. Rev. Biochem., 1990, 59, 783).
• Der Staminzellenfaktor (SCF), auch al& der Ligand für das c-Kit bezeichnet, ist kürzlich als ein Cytokin identifiziert worden, welches die Vermehrung von Vorläuferzellen stimuliert (PCT-Anmeldung WO 91/05795). SCF hat die Fähigkeit, mit einer größeren Zahl anderer hämatopoetischer Wachstumszellen zusammenzuwirken, um die Vermehrung und Differenzierung von festgelegten Vorläuferzellen zu bewirken (Migliaccio et al., J. Cell Physiol., 1991, 148, 503). In klonalen Kulturen von normalen Knochenmarkszellen der Maus induziert die Kombination von G-CSF, GM-CSF oder IL-3 mit SCF einen bis zu 25fachen Anstieg in dem mittleren Zellgehalt und einen bis zu 6fachen Anstieg in dem mittleren Vorläuferzellgehalt (Metcalf, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88,11310).
• Vorläuferzellen, festgelegt auf die lymphoide Abstammungslinie, reifen schließlich zu Boder T-Lymphozyten. Reife B-Zellen vermitteln die humorale Antikörperantwort durch Erzeugen von Antikörpern, welche in dem Blutstrom zirkulieren und fremde Antigene binden. Die Bindung von Antigen dürch den Antikörper führt zur Antigen-Zerstörung durch Phagozytose oder durch Aktivierung des Komplementsystems. Antikörper-produzierende B-Zellen umfassen einen größeren Teil der menschlichen Immunantwort.
• Die Involvierung der Wachstumsfaktoren in der Vermehrung und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen zu reifen B-Zellen ist wesentlich für die Aufrechterhaltung des B-Zellevels. Die Identifizierung von solchen Faktoren wird bedeutend sein für die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Modellierung des B-Zellevels, insbesondere bei immunodefizienten Patienten. Ein Bereich der Forschung ist die Identifizierung von Faktoren, die früh in der B-Zellentwicklung eine Rolle spielen, um die Produktion von B-Zell- Vorläuferzellen, wie Prä-B-Zellen, zu stimulieren. Prä-B-Zellen werden charakterisiert wie die frühen Vorläuferzellen, die die µ-schweren Ketten von Immunoglobulin in ihrem Zytoplasma exprimieren, aber nicht die cytoplasmatischen leichten Ketten oder Oberflächen- Immunoglobuline exprnnieren.
• In der US-PS 4,965, 195 wird beschrieben, daß Interleukin 7 (IL-7) die Vermehrung von Prä-B-Zellen, abgeleitet von dem Knochenmark der Maus, stimuliert. McNiece et al., J. Immunol., 1991, 146, 3785, zeigte, daß SCF synergistisch mit IL-7 zusammenwirkt, um die Vermehrung von B-Abstammungszellen zu stimulieren. Jedoch haben Billips et al., Blood, 1992, 79, 1185, vorgeschlagen, daß zusätzliche Faktoren in der B-Zellbildung erforderlich sind. Die Arbeit von Billips et al. zeigt, daß Prä-B-Zellbildung von B220-, Ig- Vorläuferzellen und die Expression von µ-schweren Ketten von Immunoglobulin allein abhängig von der Gegenwart von S17-stromalen Zellen ist, und daß sie nicht mit IL-7, SCF oder durch Kostimulierung mit IL-7 und SCF erreicht werden kann.
• K.S. Landreth et al., J. of Immunology, 1988, Band 140, Nr.3, 845-852, beschreibt lösli che Faktoren von einer stromalen Zellinie 517, die Prä-B-Zellen oder Prä-B-Zellproduktion und ihre Reinigung. Diese Faktoren haben ein apparentes Molekulargewicht von etwa 10 und 50-60 kDa.
• Die WO-OS-89/06541 bezieht sich auf den stromal-abgeleiteten lymphopoetischen Faktor 1 (SDLF-1; Molekulargewicht 10-20 und 60-70 kDa), der die Differenzierung von B-Vorläuferzellen in Prä-B-Zellen stimuliert. Die cDNA, die diesen Faktor codiert, ist kloniert worden und in E.coli und COS-Zellen eingeführt worden. Die Verwendung dieses Faktors in einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist vorgeschlagen worden.
• K.S. Landreth et al., Blood, 1992, Band 80, Nr.5, 1207-1212, beschreibt einen Stromal- Zell-abgeleiteten Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 (Molekulargewicht 10 kda), der den Stimulus für die Prä-B-Zelldifferenzierung, bereitgestellt durch IL-7, potenziert.
• Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Faktoren zu identifizieren, die in der Förderung der Vermehrung und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen, insbesondere lymphoide Vorläuferzellen, in B-Abstammungs-verpflichtete Zellen, wie Prä-B-Zellen, involviert sind. Die erfindungsgemäßen Faktoren sind nätzlich als Modulatoren der humoralen Antikörperantwort. Der therapeutische Vorteil von Faktoren, die die Stimulation von B-Zell-Vorläuferzellen bewirken, macht es wünschenswert, die Gene zu identifizieren, die für diese Faktoren codieren.
• Die Erfindung stellt einen neuen Faktor bereit, der die Fähigkeit hat, die Vermehrung und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen, insbesondere Vorläufer-B-Zellen, zu stimulieren. Der Faktor wird nachstehend als Vorläufer-B-Zellen-stimulierender Faktor oder PBSF bezeichnet. PBSF kann die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.:1 haben. Die Erfindung schließt ein allele Varianten, Fragmente und Analoga von PBSF mit der Aktivität, die Vermehrung und Differenzierung von Vorläufer-B-Zellen zu stimulieren. PBSF kann von natürlichen Quellen gereinigt werden, z.B. Säuger-Zellkulturen oder Zellinien oder kann das Produkt prokaryotischer oder eukaryotischer Expression einer exogenen DNA-Sequenz, d.h. rekombinanten Ursprungs, sein.
• DNA-Sequenzen, die biologisch aktives PBSF codieren, sind von der vorliegenden Erfindung umfaßt. Diese DNA-Sequenzen schließen die Sequenz gemäß SEQ ID NO.:1 ein, genauso, wie allele Varianten, Fragmente und Analoga mit biologischer Aktivität. Weiterhin werden bereitgestellt Vektoren, die diese DNA-Sequenzen enthalten und Wirtszellen, die mit diesen Vektoren transformiert oder transfiziert sind. Weiterhin umfaßt wird ein Verfahren zur Herstellung dieser Faktoren, umfassend die Schritte des Wachstums unter geeigneten Nährstoffbedingungen, die Transformation oder Transfektion von Wirtszellen in einer Art, die die Expression der Polypeptide und die Isolierung des Faktors erlaubt.
• Es wird gezeigt, daß PBSF die Vermehrung und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen, die auf die lymphoide Abstammungslinle festgelegt sind, wie Vorläufer-B- Zellen, in der Gegenwart des Stammzellfaktors und Interleukin-7 stimuliert.
• Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Antikörper, die PBSF spezifisch binden, die ein Fusionspolypeptid, umfassend PBSF, oder die zu einem Peptidfragment, enthaltend einen Teil der Aminosäuresequenz von PBSF binden.
• Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend den Faktor, werden ebenfalls bereitgestellt. Der Faktor fur die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzung fur die Behandlung von hämatopoetischen Störungen wird zusätzlich bereitgestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
• Figur 1 zeigt die Nucleotidsequenzen, die die Signalpeptidase-Spaltstellen von GM-CSF, IL-1β, IL-2, IL-3 und IL-6 codieren. Ebenfalls gezeigt ist die Sequenz der degenerierten Oligonucleotidprobe, die aufgrund der Signalpeptidase-Spaltstellen ausgewählt wurde und verwendet wurde im Screening von Gen-Banken fur Cytokine.
• Figur 2 zeigt die Nucleotid- und abgeleitete Ariinosäuresequenz von PBSF.
• Figur 3 zeigt die Expression des Konsensus-Interferon-PBSF-Fusionsproteins in E.coli. Spur 1 Molekulargewichtsmarker, Spur 2 Konsensus-Interferon-PBSF-Fusionsgen, inseriert in falscher Orientierung, Spur 3 Konsensus-Interferon-Gen, Spuren 4, 5 und 6 Konsensus- Interferon-PBSF-Fusions-Gen in korrekter Orientierung, Spur 7 Molekulargewichtsmarker.
• Figur 4 zeigt ein SDS-PAGE von PBSF, exprimiert in PA317-Zellen und Affinitäts-gereinigt durch einen immobilisierten anti-PBSF-Antikörper.
• Figuren 5 A-C zeigen die Aktivität von PBSF in einem Prä-B-Zellen-Koloniebildungsassay. PBSF stammt ab von einem konditionierten Medium von transfizierten COS-Zellen (A), einem konditionierten Medium von transfizierten PA317-Zellen (B) oder von der Affinitätsreinigung von konditioniertem Medium von transfizierten PA317-Zellen (C).
• Figur 6 zeigt einen Northern-Blot der PBSF-Expression in peripheren Lymphozyten. Die Kontrollspur zeigt die Expressionshöhe in Abwesenheit des Inducers fur die Cytokinexpression, die mittlere Spur die Expression in Gegenwart von pokeweed-Mitogen (PWM), die rechte Spur zeigt die Expression in Gegenwart von PWM und Cycloheximid.
• Figur 7 zeigt einen Northern-Blot der PBSF-Expression während der monozytischen Differenzierung von menschlichen leuktnischen Zellinien. Spur 1 ML-1, unbehandelt, Spur 2 ML-1, behandelt mit PMA, Spur 3 ML-1, behandelt mit Tumornekrosefaktor (7RNF), Spur 4 ML-1, behandelt mit TNF und IL-6, Spur 5 HL-60, unbehandelt, Spur 6 HL-60, behandelt mit PMA, Spur 7 HL-60, behandelt mit TNF, Spur 8 HL-6, behandelt mit TNF und IL-6.
• Figur 8 zeigt das Muster der PBSF-Expression in verschiedenen Geweben, analysiert durch reverse Transkriptase, und PCR. Spuren 1 und 10 Molekulargewichtsmarker, Spur 2 Gehirn, Spur 3 HeLa-Zellen, Spur 4 Herz, Spur 5 Skelettmuskel, Spur 6 Milz, Spur 7 Pankreas, Spur 8 Thymus, Spur 9 Knochenmark, Spur 11 Niere, Spur 12 Leber, Spur 13 Lunge, Spur 14 Hoden, Spur 15 Plazenta, Spur 16 periphere Lymphozyten, Spur 17 negative Kontrolle.
• Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Faktor bereit, der ein Polypeptid ist mit der Fähigkeit, die Vermehrung und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen, festgelegt auf die lymphoide Abstammungslinie, stimuliert. Der Faktor wird bezeichnet als Vorläufer-B-Zelle stimulierender Faktor oder PBSF. Der Begriff "Vorläufer-B-Zelle" meint eine Zelle, die die Fähigkeit hat, zu B-Lymphozyten zu reifen. In einer Ausführungsform wird gezeigt, daß PBSF in Verbindung mit IL-7 und SCF die Vermehrung und Differenzierung von lymphoiden Vorläuferzellen zu Prä-B-Zellen stimuliert.
• Die biologische Aktivität von PBSF wurde in in vitro- und in vivo-Assays bestimmt, wie in Beispielen 3 und 4 beschrieben ist. Beispiel 3 zeigt einen in vitro-Kolonie-Bildungsassay, in dem die Zahl und Typen von Kolonien angegeben sind, die von 5'-Fluoruracil-behandeltem Knochenmark der Maus entstehen, nachdem sie PBSF und anderen Wachstumsfaktoren ausgesetzt wurden. Beispiel 4 beschreibt in vivo-Assays für PBSF-Aktivität, betreffend das Einfuhren und die Expression des PBSF-Gens in eine transgene Maus, die retrovirale Infektion von Babymauszellen mit dem PBSF-Gen und das Einfuhren und die Expression des PBSF-Gens durch Maus-Knochenmarkstransplantation.
• Die Ergebnisse der in vitro-Experimente (Beispiel 3) zeigen, daß PBSF die Bildung von Vorläufer-B-Zellen von Maus-Knochenmarkskulturen in der Gegenwart von SCF und IL-7 stimuliert. Wie in der Beschreibung gezeigt, scheint PBSF synergistisch mit SCF und IL-7 zu wirken, und die Vermehrung und Differenzierung von lymphoiden Vorläufterzellen zu Prä-B-Zellen zu fördern. Wie in Figur 5 gezeigt, fmdet keine Stimulierung der Vor-B-Zellkoloniebildung statt, wenn entweder die Kombination von SCF und IL-7 oder PBSF allein zu Knochenmmarkszellen der Maus gegeben wird. Jedoch wird ein 50%iger Anstieg der Zahl der Prä-B-Zellen gefunden, wenn SCF, IL-7 und PBSF zusammen zu Knochenmarkszellen in Kultur gegeben werden.
• Der Faktor der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid, das von natürlichen Quellen isoliert werden kann, z.B. Säugergeweben oder Zellinien, die bekannt sind, eine Quelle für Cytokine oder Wachstumsfaktoren zu sem. Es wurde gezeigt, daß PBSF in peripheren Lymphozyten, induziert mit PWM, und in der menschlichen Zellinie Hut 78, induziert mit PMA, (siehe Beispiel 1) exprimiert wird. Alternativ kann der Faktor isoliert werden als das Produkt von prokaryotischer oder eukaryotischer Expression einer exogenen DNA- Sequenz, d.h. abgeleitet von rekombinanten Sequenzen.
• In einer Ausführungsform hat PBSF die Aminosäuresequenz gemäß Figur 2 und SEQ ID NO.:1. Die Aminosäuresequenz kann die des reifen Polypeptids oder die des unprozessierten Polypeptids sein. Die Prozessierung des Faktors zu einem reifen Protein schließt die Spaltung der Leadersequenz ein. Diese Spaltstelle ist zwischen Aminosäurerest 14 und 15, wie in SEQ ID NO.:1 gezeigt ist, so daß das reife PBSF einen Amino-terminalen Rest an der Position Thr¹&sup5; hat. Mternativ kann die Spaltung der Leadersequenz zwischen Aminosäureresten 31 und 32, wie in SEQ ID NO.:1 gezeigt, vorkommen, so daß das reife PBSF einen Amino-terminalen Rest an der Position Lys³² hat. Andere Prozessierungsereignisse können ebenfalls vorkommen, wie die Spaltung von einer oder mehreren Aminosäuren von entweder dem reifen Aminoterminus oder dem Carboxyterminus des vorhergesagten Polypeptids. Einige dieser Prozessierungsereignisse können das Polypeptid in die biologisch aktive Form umwandeln.
• Biologisch aktive PBSF-Varianten werden ebenfalls bereitgestellt. Diese Varianten schließen ein natürlich vorkommende allele Varianten, Substitutionsanaloga, in denen eine oder mehrere Aminosäuren substituiert worden sind mit verschiedenen Aminosäuren, Deletionsanaloga, in denen eine oder mehrere Aminosäuren deletiert worden sind und Additionsanaloga, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren hinzugefugt worden sind. Deletionen und Additionen von einer oder mehreren Aminosäuren können entweder an einer internen Region des Polypeptids oder an dem Amino- oder Carboxyterminus gemacht werden. Erfindungsgemäße Polypeptide können ebenfalls einen anfänglichen Methioninrest am Aminoterminus einschließen.
• Erfindungsgemäße Polypeptide, fusioniert zu heterologen Polypeptiden, werden ebenfalls bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist die reife Aminosäuresequenz von PBSF fusioniert zu dem Carboxyterminus des menschlichen alpha-Interferons oder des Rinderwachstumshormons. Das resultierende Fusionsprotein wird in E.coli-Wirtszellen stark exprimiert. Diese Fusionspolypeptide sind nützlich fur die Herstellung von Antikörpern, die spezifisch PBSF binden, wie in Beispiel 3 beschrieben. Zusätzlich können Peptidfragmente, die chemisch synthetisiert worden sind, verwendet werden, um Antikörper zu produzieren, die spezifisch an den Faktor binden.
• Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls neue DNA-Sequenzen bereit, die biologisch aktives PBSF codieren. Vorzugsweise umfassen die Sequenzen:
• a) die DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NO.:1 und ihren komplementären Strang,
• b) DNA-Sequenzen, hybridisierend mit den Sequenzen in (a), und
• c) DNA-Sequenzen, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes mit den Sequenzen in (a) und (b) hybridisieren würden.
• Erfindungsgemäße DNA-Sequenzen schließen solche Sequenzen ein, die die reife, prozessierte Form des Polypeptids codieren, genauso, wie die Sequenzen, die die Vorläuferformen des Polypeptids codieren. DNA-Sequenzen, die die Vorläuferformen des Polypeptids codieren, enthalten z.B. für die Sekretion notwendige Signalsequenzen.
• cDNA-Sequenzen, die einen Teil oder die ganze codierende Region von PBSF codieren, wurden erhalten, wie in Beispiel 1 beschrieben. Eine Oligo-(dT)-geprimte cDNA-Bibliothek, hergestellt von peripheren Lymphozyten, wurde durch Hybridisierung mit einem Set gemischter Oligonucleotidproben mit den Sequenzen gemäß SEQ ID NO.:7 gescreent. Das Screening-Verfahren ist in Beispiel 1G beschrieben. Die Proben wurden entworfen auf der Basis der Berücksichtigung der Nucleotidsequenzhomologie im Bereich der Signalpeptidase-Spaltstellen, codiert von GM-CSF (SEQ ID NO.:2), IL-1β (SEQ ID NO.:3), IL-2 (SEQ ID NO.:4), IL-3 (SEQ ID NO.: 5) und IL-6 (SEQ ID NO.:6) mRNAs. Der Grund für diesen Screening-Ansatz war, andere Cytokine zu identifizieren unter Verwendung von Proben, die spezifisch für den sekretierten Teil der Cytokin-ähnlichen Moleküle ist. Ein cDNA-Klon, der hybridisierte, wurde ursprünglich als P64 bezeichnet. Diesem Klon fehlte aber die vollständige Codierregion. Nachfolgend wurde die vollständige Codierregion von P64 auf einem 1,78 kb cDNA-Klon, erhalten von einer Random-geprimten cDNA-Bibliothek von peripheren Lymphozyten. Es wurde gefunden, daß dieser Klon die Aktivität hatte, die Vor-B-Zellbildung zu stimulieren. Das expriinierte Protein wurde als PBSF bezeichnet. Dieses 1,78 kb Fragment, das PBSF codiert, wurde in das Plasmit V19. 12 inseriert und in den E.coli-Stamm DHS-alpha-F', hinterlegt am 25. November 1992 bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungsnummer 69133, transformiert. Aufgrund der hohen Degeneration des Probengemisches (etwa 65.000fach) wurden Klone, die positiv bei der Hybridisierung waren, gefunden, die Sequenzen hatten ähnlich zu der Signalpeptidase-Spaltstelle in anderen Bereichen des Moleküls Dies war der Fall für das Gen, das PBSF codiert.
• Erfindungsgemäße DNA-Sequenzen können cDNA- und genonüsche DNA-Sequenzen sein, isoliert vom Menschen und anderen Säugern. Auch synthetische DNA-Sequenzen, die PBSF codieren und Fragmente hiervon, die durch bekannte Gen-Synthesetechniken leicht herzustellen sind, werden umfaßt. Die beschriebenen DNA-Sequenzen, die PBSF codieren und Fragmente hiervon können verwendet werden als Proben, um genomische DNA zu isolieren, die PBSF codiert. Zusätzlich sind DNA-Sequenzen, enthaltend einen Teil oder das ganze PBSF-Gen, nützlich zum Nachweis der Gegenwart des Gens in biologischen Proben, der Bestimmung der Position des Gens auf dem menschlichen Chromosom und in Arzneistoffen, basierend auf Nucleinsäuren wie Antisense-Mittel oder Tripple-Helix- Blockierer, wenn es wunschenswert ist, die Menge von PBSF, die synthetisiert wird, zu regulieren.
• Die DNA-Sequenzen schließen ebenfalls Sequenzen ein, die biologisch aktive PBSF-Varianten codieren. Die Sequenzen schließen solche ein, die fur natürlich vorkommende allele Varianten, Substitutionsanaloga, Deletionsanaloga und Additionsanaloga, in denen Deletionen und Additionen am Amino- oder Carboxyterminus oder innerhalb der codierenden Region eingefügt sein können, codieren. Diese Analoga können durch bekannte Techniken hergestellt werden. Diese Varianten können eine Zahl von gewunschten Eigenschaften, z.B. stärkere Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau, stärkere Resistenz gegenüber Oxidation oder leichtere Rückfaltung nach Expression in mikrobiologischen Wirten bei gleichbleibender biologischer Aktivität haben.
• Die DNA-Sequenzen schließen auch solche ein, die Fusionsproteine codieren, in denen ein Teil oder die ganze DNA-Sequenz von PBSF fusioniert ist mit einem heterologen Protein. Vorzugsweise werden DNA-Sequenzen, die einen Teil des menschliches Konsensus-Interferons oder des Rinderwachstumshormons codieren, fusioniert im Leserahmen zu dem 5'- Ende der DNA-Sequenz, die PBSF codiert. Die Konstruktion von Fusionsproteinen ist in Beispiel 3A beschrieben. Wie in Beispiel 3B gezeigt, sind diese Fusionsproteine nützlich zur Herstellung von Antikörpern gegen den Faktor.
• PBSF ist dadurch charakterisiert, das Produkt prokaryotischer oder eukaryotischer Wirtsexpression zu sein (z.B. durch Bakterien-, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellkulturen) von exogenen DNA-Sequenzen, wobei die exogenen DNA-Sequenzen, cDNA, genomische DNA oder synthetische DNA sein können. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist der Faktor abgeleitet von rekombinanten Mitteln (Sequenzen). Da hämatopoetische Wachstumsfaktoren im allgemeinen durch natürliche Quellen nur in sehr geringen Mengen produziert werden, ist die Fähigkeit, den Faktor durch rekombinante Verfahren herzustellen bedeutsam, um ausreichende Mengen für therapeutische Anwendungen zu erhalten.
• Eine Vielzahl von Vektoren steht für die Expression von DNA-Sequenzen, die PBSF codieren, in Wirtszellen zur Verfügung. Vektoren wie V19. 12, pDSRα2 und mpZen sind in den Beispielen 2A-C für die Expression von PBSF in COS, Chinese Hamster Ovary (CHO) und PA317 Säugerzellinien, beschrieben. Zusätzlich kann PBSF in einer Zahl von Vektoren exprimiert werden, die für Hefe- und Bakterienstämme geeignet sind. Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde PBSF als ein Fusionsprotein mit entweder menschlichen alpha-Interferon- oder Rinderwachstumshormonsequenzen in E.coli exprimiert, unter Verwendung des Vektors PCFM 756. Abhängig davon, ob es sich um bakterielle Hefe- oder Säugerwirtszellen handelt, können die PBSF-Sequenzen für die Expression in einem bestimmten Wirtszellsystem optimiert werden. Diese Optimierung schließt die Eingliederung von bevorzugten Kodons für die Expression ein. In einer bevorzugten Ausführungsform schließen die PBSF-Sequenzen einen oder mehrere Kodons ein, die für die Expression in E.coli-Wirtszellen optimiert sind. Weiterhin werden Vektoren für die Expression von PBSF in einer transgenen Maus bereitgestellt, wie in Beispiel 4A beschrieben.
• Ebenfalls beschrieben ist ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem PBSF. Das Verfahren umfaßt das Wachstum prokaryotischer oder eukaryotischer Wirtszellen unter geeigneten Nährstoffbedingungen, die mit einer DNA-Sequenz transformiert oder transfiziert sind, die biologisch aktives PBSF codiert und die Isolierung des PBSF exprimiert durch diese DNA-Sequenz.
• Vorzugsweise ist es die Sequenz gemäß SEQ ID NO.:1 und Sequenzen, die hierzu hybridisieren.
• Abhängig von den für die Expression verwendeten Wirtszellen kann das Polypeptid glykosyslert oder nicht-glykosyliert sein. Säugerproteine werden gewöhnlich modifiziert durch das Anheften von Kohlerhydratketten an spezifischen Positionen entlang des Aminosäurerückgrats. Die Anlagerung von Kohlenhydratketten an ausgewählten Asparaginresten wird N-Glykosylierung genannt, wohingegen die Anlagerung von Kohlenhydratketten an Serin- oder Threoninresten O-Glykosylierung genannt wird. Die Gegenwart von entweder Ngebundenen oder O-gebundenen Ketten oder von beiden kann erforderlich sein für die biologische Aktivität und/oder Stabilität des Polypeptids. Das Vorkommen von N-gebundenen Glykosylierungsstellen kann durch die Sequenz ASN-X-Ser/Thr vorhergesagt werden, wobei X jede Aminosäure sein kann. Darauf basierend kann vorhergesagt werden, daß PBSF zwei N-gebundene Glykosylierungsstellen an Positionen ASN²&sup9; und ASN³&sup9;&sup6; hat.
• Das PBSF-Polypeptid kann ebenfalls durch ein wasserlösliches Polymer wie Polyethylenglykol modifiziert werden. Das kovalente Anheften von wasserlöslichen Polymeren zu Proteinen wird ausgeführt unter Verwendung bekannter Techniken und ist in der US-PS 4,179,937 beschrieben. Das modifizierte Polypeptid kann gewünschte Eigenschaften haben, wie gesteigerte Löslichkeit in wäßrigen Lösungen, gesteigerte Stabilität, längere in vivo- Halbwertzeit und gesteigerte biologische Aktivität.
• PBSF kann ebenfalls kovalent angeheftet sein an eine nachweisbare Markierung, die radioaktiv (z.B. I¹²&sup5;) oder nicht-radioaktiv (z.B. ein Fluoreszenzfarbstoff) sein kann. Das Anheften einer Reportergruppe stellt Reagenzien bereit, die nützlich. sein können für den Nachweis von PBSF in festen Geweben und flüssigen Proben. Gleichermaßen können DNA-Sequenzen, die PBSF codieren, kovalent an nachweisbare Markierungen angeheftet werden, um als Proben für PBSF-Sequenzen in biologischen Proben zu dienen, z.B. für das Mapping der Position des menschlichen PBSF-Gens in dem Genom und zum Nachweis des Vorhandenseins von PBSF-verwandten Sequenzen.
• Antikörper, die spezifisch den Faktor binden, werden ebenfalls von der Erfindung umfaßt. Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein und können spezifisch zu Polypeptidfragmenten und Fusionspolypeptiden binden, genauso wie zu dem intakten Protein. Das Herstellen von Antikörpern zu einem menschlichen Konsensus-Interferon-PBSF-Fusionsprotein und zu einem Rinderwachstumshormon-PBSF-Fusionsprotein ist in Beispiel 38 beschrieben. Antikörper sind nützlich für die Quantifizierung der Menge des Faktors in biologischen Proben (z.B. Blut oder Harn). Abnormale Konzentrationen des Faktors können ein nützlicher Indikator sein für bestimmte hämatopoetische Störungen. Ferner sind Antikörper, die PBSF spezifisch binden, nützlich für ein Verfahren zur Reinigung des Polypeptids entweder von natürlichen Quellen oder von der Expression von rekombinanten Plasmiden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
• a) Anheften eines Antikörpers an einen festen Träger,
• b) In-Kontakt-Bringen des angehefteten Antikörpers mit einer Lösung, enthaltend das Polypeptid in einer Art, die eine selektive Bindung des Polypeptids an den Antikörper erlaubt, und
• c) Eluieren des gebundenen Polypeptids.
• Die Lösung, enthaltend das Polypeptid, kann ein rohes oder partiell gereinigtes Gemisch sein. Die Reinigung von PBSF unter Verwendung einer anti-PBSF-Antikörper-Affinitätssäule ist in Beispiel 5 beschrieben.
• Die Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend therapeutisch wirksame Mengen von PBSF, zusammen mit pharmazeutischen Verdünnungsstoffen, Hilfsstoffen, Trägern, Konservierungsmitteln, Emulgatoren und/oder Löslichkeitsverbesseren.
• Eine "therapeutisch wirksame Menge", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Menge, die bei einem gegebenen Zustand und einer bestimmten Verabreichung eine therapeutische Wirkung bereitstellt. Der Fachmann ist in der Lage, eine therapeutisch wirksame Menge von PBSF zu bestimmen für eine bestimmte zu behandelnde Krankheit. Pharmazeutische Zusammensetzungen schließen ein verschiedene Puffer als Verdünnungsmittel (z.B. Trisacetat, Phosphat), Löslichkeitsverbesserer (z.B. Tween, Polysorbat), Träger wie menschliches Serumalbumin, Konservierungsmittel (Thiomersal, Benzylalkohol) und Antioxidationsmittel wie Ascorbinsäure. Der Faktor kann ebenfalls in bestimmte Zubereitungen von polymeren Verbindungen eingegliedert werden zur kontrollierten Freigabe an einen Patienten über eine festgelegte Zeit. Eine detailliertere Betrachtung von Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen findet sich in Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, A.R. Gennaro, Ed., Mack, Easton, PA, 1990.
• Die Dosierung von PBSF, die verwendet wird zur Behandlung von hämatopoetischen Störungen wird von einer Reihe von Faktoren abhängen, einschließlich der Art und Stärke der Störung, die zu behandeln ist, dem Weg der Verabreichung, der Verwendung von PBSF in Kombination mit anderen Behandlungsverfahren. Ebenfalls zu berücksichtigen ist die in vivo-Halbwertszeit des PBSF-Polypeptids oder einer modifizierten Form hiervon, wobei die Modifizierung eine mit einem wasserlöslichen Polymer wie Polyethylenglykol sein kann. Eine "therapeutisch wirksame Menge" von PBSF, wie nachstehend verwendet, kann vom Fachmann unter Berücksichtigung dieser Faktoren bestimmt werden.
• PBSF kann verabreicht werden durch Injektion, eniweder subkutan, intravenös oder intramuskulär oder durch orale oder nasale Verabreichung. Der Weg der Verabreichung hängt von dem zu behandelnden Zustand ab.
• PBSF wird alleine oder in Kombination mit anderen Behandlungsverfahren zur Behandlung einer Anzahl von hämatopoetischen Störungen verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird PBSF in Kombination mit SCF und IL-7 zur Behandlung von B-Zell-Störungen verwendet. Der Faktor kann ebenfalls mit anderen Faktoren verwendet werden, die bekannt sind, in verschiedenen Stadien der Hämatopoese involviert zu sein, wie IL-1, IL-2, IL-3, IL4, IL-5, IL-6, B-Zell-Wachstumsfaktor eines niederen Molekulargewichts (L- BCGF) oder B-Zell-Wachstumsfaktor eines hohen Molekulargewichts (H-BCGF) für die Behandlung von B-Zell-Störungen. Die Verabreichung von anderen hämatopoetischen Faktoren kann gleichzeitig, vor oder nach der Verabreichung von PBSF erfolgen.
• PBSF kann alleine oder in Verbindung mit anderen Faktoren verwendet werden zur Behandlung einer Anzahl von hämatopoetischen Störungen, die auf eine Störung oder einen Schaden des Knochenmarks zurückgehen. Diese Störungen schließen die folgenden ein: Zellmangel, aplastische Anämie, Myelodysplasia, leukämische Störung und Stammzelltransplantation. Zusätzlich können Knochenmarksschäden, die von einer radioaktiven Behandlung oder einer Chemotherapie herrühren und zur Knochenmarkssuppression führen, durch Behandlungen mit dem Faktor überwunden werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird PBSF in Verbindung mit SCF und IL-7 zur Behandlung von B-Zell-Störungen verwendet, insbesondere solche Störungen, die einen herabgesetzten Level von B- Zellen betreffen. Ein Defizit an B-Lymphozyten führt zu einer deprimierten Immunanwort und einer größeren Empfänglichkeit für Krankheiten. PBSF wird vorteilhaft an Patienten mit einem gestörten Immunsystem verabreicht.
• PBSF ist nützlich für die Zunahme von B-Vorläuferzellen im Knochenmark vor einer syngenen, allogenen oder autologen Knochenmarkstransplantation. Der Faktor kann direkt an Patienten verabreicht werden, um die Produktion von B-Vorläuferzellen im Knochenmark zu erhöhen oder kann ex vivo zu Kngchenmarkkultüren vor der Transplantation gegeben werden. Es wird erwartet, daß diese Behandlung die Zeit der deprimierten Immunität, beobachtet bei Patienten nach der Transplantation, verringert.
• Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung detaillierter, aber sind nicht einschränkend.
BEISPIEL 1 Identifizierung eines cDNA-Klons (P64), der PBSF codiert A. Isolierung der Lymphozyten
• Periphere Lymphozyten wurden von frisch hergestellten Buffy Coats, erhalten von Hemacare (Sherman Oaks, CA) isoliert. Buffy Coats wurden dreifach mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt. 30 ml des verdünnten Buffy Coats wurden in 50 ml Kulturgefaße (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) pipettiert und mit 10 ml Ficoll-Paque (Pharmacia, Piscataway, NJ) hinterlegt. Nach der Zentrifugation bei 3200 g wurden die mononucleären Zellen, die sich in der Interphase befinden, entfernt und 3mal mit 30 ml PBS gewaschen. Das Pellet wurde danach in 50 ml RPMI 1640 und 10% fötalem Rinderserum (FBS) suspendiert, Sofach verdünnt und die Zellenzahl bestimmt.
B. Induktion der Cytokinexpression
• Etwa 5 x 10&sup6; Zellen/ml wurden mit 10 µg/ml pokeweed-Mitogen, PWM, Sigma, St. Louis, MO) für 19 Stunden inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 10 µg/ml Cykloheximid (Sigma) für weitere 6 Stunden. Zum Vergleich wurde die gleiche Menge Zellen mit oder ohne PWM für die gleiche Zeitspanne inkubiert. Die Inkubation wurde bei 37ºC und 5% CO&sub2; ausgefünt.
C. Isolierung der RNA
• Total-RNA wurde von induzierten peripheren Lymphozyten unter Verwendung der Guanidinium-thiocyanat-Technik (Chirgwin et al., Biochemistry, 1979, 18, 5294) isoliert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in einer Lösung von 4M Guanidiniumthiocyanat, enthaltend 4% Mercaptoethanol lysiert. Angeheftete Zellen wurden in derselben Lösung lysiert und vereinlgt. Nach drei Passagen durch eine 18 Gauge-Nadel wurde das Lysat auf einen Schichtgradienten von 5,7M Cäsiumchlorid aufgebracht. Die Zentrifugation wurde bei 76.000 x g in einer Beckman L2 Ultrazentrifuge für 24 Stunden bei 20ºC durchgeführt. Nach der Zentrifugation wurde die abzentrifugierte RNA in 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5 und 0,1 % SDS suspendiert und durch Zugabe von 2,5 Volumen 100% Ethanol und 0,3M Natriumacetat (pH 5,0) präzipitiert.
D. Selektion von Poly(A) + RNA
• Poly(A) + RNA wurde sekktiert durch Chromatographie an oligo(dT)-Zellulose (Collaborative Research, Bedford, MA) unter Verwendung von Verfahren, die bei Maniatis et al., (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982) mit Ethanol präzipitiert und zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in destilliertem Wasser gelöst und in Aliquots in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
E. Konstruktion der cDNA-Bibliothek
• Etwa 5 µg Poly(A) + RNA in 10 µl wurden mit 10 mM Methyl-Quecksilber-Hydroxid bei Raumtemperatur für 10 Minuten denaturiert. Nachfolgend wurde β-Mercaptoethanol auf 10 mM und RNasin (Promega, Madison, WI) auf 3 u/µl zugegeben und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die folgenden Komponenten zu der angegebenen Endkonzentration hinzugegeben: 50 µg/ml Oligo-(dT), 2mm DNTP (Pharmacia), 100 µl/ml Rinderserumalbumin, Erststrangpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,6, 75 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) und 20 u/µl Superscript Reversetranskriptase (BRL). Die Erststrangsynthese wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Das Gemisch mit dem Zweitstrangpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 100 mM KCl, 50 µg/ml Rinderserumalbumin, 10 mM Dithiothreitol, BRL), 0,125 u/µl E.coli DNA-Polymerase 1 (BRL), 0,08 u/µl Rnase H (BRL), 0,1 u/µl E.coli DNA-Ligase (New England Biolabs, Beverly, MA) und 0,15 mM DADP (Sigma) verdünnt. Alle angegebenen Konzentrationen sind die im Reaktionsgemisch. Das Gemisch wurde für 1 Stunde bei 15ºC inkubiert, gefolgt von der Inkubation für 1 Stunde bei 25ºC. Nachfolgend wurde T4 DNA-Polymerase (Pharmacia) zu einer Endkonzentration von 0,01 u/µl hinzugegeben und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, um glatte Enden (blunt ends) zu erzeugen. Nicht-eingebaute dNTPs wurden durch zweimalige Ethanolfällung in der Gegenwart von 2M Ammoniumacetat entfernt.
• Die Doppelstrang-cDNA wurde dann mit EcoR I und Alu I Methylase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) entsprechend dem nachfolgenden Verfahren methyliert. Zu Doppelstrang-cDNA in Wasser wurde Methylierungspuffer, 100 uM S-Adenosyl-methionin und 1 u/µl Alu I Methylase gegeben und für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Nachfolgend wurden 0,1 m (Endkonzentration) NaCl und 10 u/µl (Endkonzentration) EcoR I Methylase hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert.
• Der Oligo-Adapter mit der Sequenz 5' GCT TGA ATT CAA GC 3' (SEQ ID NO: 8) wurde über Nacht an die cDNA ligiert. Danach wurde die cDNA auf einem 0,8% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Moleküle, die länger als 500 bps waren, wurden durch Elektroelution aus dem Gel entfernt. Die eluierte cDNA wurde mit einem 1:1 Gemisch von Phenollchloroform extrahiert, präzipitiert mit Ethanol, in Wasser suspendiert und sequenziell mit Hind III und EcoR I Restriktionsenzymen verdaut, um EcoR I kohäsive Enden am 5'-Ende des Moleküls und Hind III kohäsive Enden am 3'-Ende des Moleküls zu erzeugen.
• Ein 592 bps Aat II/Cla I-Fragment mit dem Ursprung der Replikation von dem Bakteriophagen M13 wurde in den eukaryotischen Expressionsvektor V19.8 inseriert, beschrieben in der PCT-Anmeldung WO 91/05795, um den Vektor V19. 10 zu erzeugen. V19. 10 wurde mit EcoR I und Hind III verdaut und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt. Die Ligationsreaktionen wurden mit verschiedenen Verhältnissen von cDNA zu Vektor- DNA durchgeführt. Das Verhältnis mit der höchsten Anzahl von Klonen nach der Transfektion wurde für die Ligation im großen Maßstab ausgewählt. Kompetente DHS α F' E.coli-Zellen (Gibco-BRL) wurden für die Transfektion verwendet. Die Bibliothek wurde auf 15 150 mm Platten auspiattiert. Diese wurden dann mit SOB (Okayama et al., Methods in Enzymol., 154, 3, 1987) abgespült und in 7% DMSO bei -80ºC gelagert.
• Eine zusätzliche cDNA-Bibliothek wurde mit Poly(A)-selektierter RNA, isoliert von peripheren Lymphozyten, konstruiert, in der ein zufällig ausgewählter hexamerer Primer (Pharmacia) verwendet wurde, um den ersten Strang der cDNA-Synthese zu primen. Doppelsträngige flash-ended cDNA wurde erzeugt wie vorstehend für die Oligo-(dT)-geprimte Bibliothek beschrieben. Ein Adaptor (In Vitrogen, San Diego, CA, Katalog-Nr. N408-8) mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 9:
• wurde mit der cDNA ligiert. V19. 12 wurde durch Insertion des Hind III/NotI Stuffer- Fragment von pCDM8 (In Vitrogen) zwischen den Hind III und Not I Restriktionsschnittstellen von V19. 10 konstruiert. V19. 12 wurde mit dem Restriktionsenzym Bst XI verdaut und mit der cDNA ligiert. Die Transformation von E.coli DHS α F' Wirtsszellen und die Lagerung der Zellen wurde durchgefülut wie vorstehend beschrieben.
F. Proben-Design
• Gemischte Oligonucleotid-Proben wurden auf der Basis einer gewissen Sequenzhomologie im Bereich der Signalpeptidase-Spaltstelle einiger Cytokine entworfen. Die Proben wurden, wie in Figur 1 gezeigt, gestaltet, unter Verwendung der publizierten Sequenzen von GM- CSF, IL-1, IL-2, IL-3 und IL-6, die Signalpeptidase-Spaltstellen codieren (Wong et al., Science 228, 1985, 810; Nishida et al., Biochem. Biophys., Res. Comm., 143, 1987, 345; Taniguchi et al., Nature 302, 1983, 305; Yang et al., Cell 47, 1986, 370; und May et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 1986, 8957). Die Degeneration des Probengemisches war 65,536. Aufgrund der hohen Degeneration war es möglich, Klone zu isolieren, die ähnliche Sequenzen in anderen Bereichen als der Signalpeptidase-Spaltstelle hatten.
G. Screening von cDNA-Bibliotheken
• Das Screening mit einer hohen Dichte von der Oligo-(dT)-geprimten Bibliothek von peripheren Lymphozyten in DH5 α F' E.coli wurde durchgeführt durch Ausplattieren von etwa 10.000 Kolonien pro 150 mm Platte auf einer GENE SCREEN PLUS-Membran (New England Nuclear/DuPont, Boston, MA). Eine Replica wurde auf einer zweiten gene sreen-Membran hergestellt. Die Kolonien auf der Replica-Platte wurden über Nacht auf einer LB- Platte mit 100 µg/ml Ampicillin angezogen. die Replica-Membranen wurden dann auf eine LB-Platte mit 100 µg/ml Chloramphenicol zur Amplifizierung der Plasmid-DNA aufgebracht. Nach Amplifizierung über Nacht wurde die DNA in den Kolonien mit 0,5N NaOH und 1,5M NaCl für 5 Minuten denaturiert. Danach wurde die DNA in 1M Tris-HCl, pH 7,5, renaturiert. Die Membranen wurden an der Luft getrocknet und für 2 Stunden bei 80ºC unter vermindertem Druck getrocknet. Die Filter wurden mit 2X SSC befeuchtet. Danach erfolgte die Vorwaschung für 2mal 30 Minuten in 6X SSC, 0,2% SDS. Die Vorhybridisierung erfolgt in 6X SSC, 5X Denhardt-Lösung, 0,1 % SDS für 4-5 Stunden. 20 pmoles der gemischten Oligonucleotid-Probe wurden mit γ P³²-ATP unter Verwendüng der T4-Polynucleotidkinase markiert. Die nicht-eingebauten Markierungsmoleküle wurden durch Zentrifugation durch eine Sephadex G-50-Säule entfernt. Etwa 2X 10&sup6; cpm pro ml wurden für die Hybridisierung bei 55ºC in 6X SSC, 0,1 % SDS und 5X Derhardt-Lösung verwendet. Nach 20 Stunden wurden die Filter 2mal für 30 Minuten bei 55ºC in 6X SSC und 0,1 % SDS gewaschen. Ein zusätzlicher Waschschritt wurde bei der gleichen Temperatur mit 2X SSC und 0,1 % SDS durchgefuhrt. Nach über Nacht-Exposition wurden die Bereiche der Master-Platte, die den positiven Signalbereichen entsprachen, abgekratzt und in SOB suspendiert. Eine Serienverdünnungen der Kolonien wurden für ein zweites Screening auf Ampicillin-Platten ausplattiert. Einzelne Kolonien wurden identifiziert und zur Isolierung der Plasmid-DNA angezogen. Ein letztes Screening wurde durch Hybridisierung der Oligonucleotid-Proben zur Plasmid-DNA von verschiedenen Kolonien durchgeführt. Etwa 80 positive Klone konnten auf diese Art und Weise identifiziert werden.
• Plasmid-DNA von positiven Klonen wurde beidseitig sequenziert unter Verwendung von Primern, die zu Sequenzen des 19.10-Vektors hybridisieren, die sich am 5'- und 3'-Ende zu dem cDNA-Insert befinden. Die DNA-Sequenzierung der cDNA-Klone wurde durchgeführt, wie bei Sanger et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 1977, 5463, beschrieben. Die DNA-Sequenzen wurden mit denen verglichen, die in verschiedenen Versionen der Gen- Bank-Sequenzdatenbank vorhanden waren. Nur solche Sequenzen, die nicht in der Gen- Bank enthalten waren, wurden weiter charakterisiert durch das Erhalten von Klonen voller Länge und das Analysieren der Sequenzen unter Verwendung der Genetics Computer Group (University of Wisconsin) Software Package. Einer der Klone, der weiter untersucht wurde, wurde als P64 bezeichnet.
• Dem P64-Klon, isoliert aus der Oligo.-(dT)-geprimten cDNA-Bibliothek von peripheren Lymphozyten fehlte das 5'-Ende des Gens, wie durch das Fehlen des anfänglichen Methioninrestes angezeigt wurde. Um einen Klon mit der vollen Länge von P64 zu erhalten, wurde eine PMA-aktivierte Hut 78 λ gt11 cDNA-Bibliothek von Clontech Laboratories (Palo Alto, CA, Katalognummer: HL 1068b) mit dem P64 cDNA-Klon getestet. Etwa 10.000-20.000 Plaques pro 150 mm Platte wurden auf Gene Screen-Filter Replica plattiert und mit dem P64-Klon markiert mit ³²P durch random priming Verfahren markiert, getestet. Nach einem zweiten Screening wurden einzelne positive Kolonien identifiziert. Das Insert wurde durch Abbau der positiven Lambda-cDNA-Klone mit EcoR I freigesetzt und in den Bluescript SK II Plasmid subkloniert (Stratagene, La Jolla, CA) und sequenziert. Dieser Klon enthielt stromaufwärts gelegene codierende Sequenzen, aber das anfängliche Methionin-Kodon fehlte immer noch.
• In einem weiteren Versuch, einen P64-Klon voller Länge zu erhalten, wurde eine Random- cDNA-Bibliothek von peripheren Lymphozyten in V19.12 unter Verwendung des P64 cDNA-Klons, isoliert von der Hut 78-Bibliothek als: Probe, gescreent. Eine Vielzahl von positiv hybridisierenden Klonen wurde erhalten und die DNA-Inserts wurden in M13 mp21 subkloniert und sequenziert. Mehrere Klone hatten codierende Regionen, die identisch zu dem Hut 78-Klon waren und enthielten zusätzlich die Sequenz, die für den anfänglichen Methioninrest codiert. Ein Isolat enthielt ein Insert von etwa 1780 bps mit der ganzen Codierregion von P64. Dieser Klon codiert das Polypeptid, bezeichnet als Voläufer-B-Zell- stimulierender Faktor oder PBSF.
• Dieses 1,78 kb DNA-Fragment, inseriert in dem Plasmit V19. 12 und transformiert in den E.coli-Stamm DH5 α F' ist hinterlegt bei der American Type Cultur Collection (ATTC) unter der Hinterlegungsnummer 69133 am 25. November 1992.
H. DNA-Sequenzierung und Analyse
• Genbank-, EMBL- und Swiss Prot-Datenbanken wurden durchsucht, um Sequenzen zu finden, die auf der Nucleinsäure- und Aminosäureebene identisch oder hoch homolog zu PBSF-Sequenzen waren. Die Suche wurde ausgeführt unter Verwendung der FastA- und TfastA-Programme des GCG Software Package. Die Analyse der Nucleinsäure-Struktur wurde ausgeführt unter Verwendung von Kartierungs- und Translationsprogrammen. Die Aminosäuresequenz von PBSF wurde analysiert unter Verwendung der Pepplot-, Pepstructure-, Motifs- und Isoelectric-Programme. Das Sigseq1-Programm wurde verwendet, um die Signalpeptid-Spaltstelle vorherzusagen. Das vielfache Durchsuchen der Gen- Bank und EMBL-Datenbanken wurde durchgeführt, um die PBSF-Sequenz mit den in der Datenbank vorhandene zu vergleichen. Keine der Suchen zeigte einen hohen Grad von Homologie zwischen PBSF und Sequenzen in der Datenbank.
I. Das PBSF-Gen und das von diesem codierte Protein
• Die DNA-Sequenz von P64, wie von cDNA-Klonen abgeleitet, die von der Hut 78-Bibliothek und von der Oligo-(dT)-geprimten und zufällig geprimten PBL-Bibliotheken erhalten wurden, ist in Figur 2 und SEQ ID NO: 1 gezeigt. Die Sequenz ist 2376 bps lang. Das P64-Protein, abgeleitet von der DNA-Sequenz, hat etwa 52 kda, umfassend 491 Aminosäuren einschließlich der Signalsequenz. Die Signalpeptid-Spaltstelle wird nach der Methode von von Heinje, Nuc. Acid Red. 14, 1986, 4683 vorhergesagt zwischen den Aminosäureresten Alanin an Position 14 und Threonin an Position 15 in SEQ ID NO: 1. Außerdem gibt es eine Wahrscheinlichkeit für eine Spaltung zwischen dem Serinrest an Position 31 und dem Lysinrest an Position 32. Es gibt eine lange 3'-untranslatierte Region, die mehrere TATT- und TTTT-Motive enthält, die in einer Anzahl von Cytokin-Molekülen vorhanden sind, Shaw et al., Cell, 49, 1986, 659. Das vorhergesagt Protein hat einen hydrophoben Aminoterminus. Dort sind sechs Cysteinreste. Der isoelektrische Punkt wurde mit 7,25 durch das Programm ISOELECTRIC in dem GCG Software Package bestimmt. Es gibt zwei potentielle N-Glykosylierungsstellen bei Asn²&sup9; und Asn³&sup9;&sup6;. Zusätzlich gibt es vier potentielle Proteinkmase C-Phosphorylierungsstellen und fünf Kreatinkinase II Phosphorylierungsstellen.
BEISPIEL 2 Expression des rekombinanten PBSF-Proteins A. Expression in Cos-Zellen
• Cos-Zellen wurden mit V19.12 DNA, enthaltend das 1,78 kb PBSP-cDNA-Insert, durch Elektroporation transfiziert. Etwa 3 x 10&sup6; Zellen in PBSF wurden elektroporiert unter Verwendung des electro cell manipulator 600 (BTX, San Diego, CA) bei 500 Volt/Kapazität und Widerstand, Kapazität 1000 µF, Widerstand von 48 Ohm bei einer Ladungsspannung von 150 Volt in einem Volumen von 400 µl unter Verwendung einer Cuvette mit 2 mm Lücke. Die Pulslänge war zwischen 8,3-10,5 msek. Die Cuvette wurde 5 Minuten auf Eis gehalten. Nachfolgend wurde mit DMEM, enthaltend 10% fötales Rinderserum, verdünnt und auf eine 10 cm Platte ausplattiert. Nach über Nacht-Inkubation bei 37ºC und 5% CO&sub2; wurde das Medium gewechselt, um tote Zellen zu eliminieren. Serumfreies DMEM wurde zu der Platte hinzugegeben und konditioniertes Medium (CM) wurde nach 72 Stunden für Bioassays gesammelt. Das CM-Medium wurde steril filtriert und in Aliquots bei -20ºC eingefroren. Das Vorhandensein des P64 in dem Medium wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern, die gegen ein P64- Fusionsprotein hergestellt worden waren, wie vorstehend beschrieben.
B. Expression in Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen
• CHO-Zellen, die PBSF konstitutiv produzieren, wurden folgendermaßen hergestellt. CHO (DHFR&supmin;)-Zellen wurden mit dem Vektor pDSRα2 (WO 91/05795), enthaltend die PBSF- codierende Region, transfiziert. Die folgenden Primer wurden in der PCR verwendet, um die PBSF-codierende Region zu amplifizieren:
• 5' TGTCCTCCGGCCCGAGATGA (Nucleotide 12-31 in SEQ ID NO: 1) und
• 5' GGTTTGTGTTTTATGATACATTAC (Nucleotide: 1567-1590 in SEQ ID NO: 1).
• Die amplifizierte DNA wurde mit Hind III und Sal I gespalten und in pDSRα2 kloniert. Nach der anfänglichen Selektion der transfizierten Zellen in einem Medium, enthaltend dialysiertes Serum, wurden die Zellen weiter in Gegenwart von ansteigenden Konzentrationen von Methotrexat bis zu 1 µM zur Plasmid-Amplifizierung selektiert. Die ausgewählten Kolonien wurden auf die Expression des PBSF-Gens durch Northern-Dot-Hybridisierung getestet. Konditioniertes Medium für Bioassays wurde durch die Anzucht der CHO (DHF&supmin;-Zellen in Serum-freiem DMEM für 72 Stunden hergestellt.
C. Expression in PA317-Zellen
• Das 1,78 kb Hind III-Fragment, das PBSF codiert, wurde: in den mpZen-Vektor (Johnson Dev. Biol. Stand. 69, 1988, 3) zur Expression von PBSF unter dem Myeloproliferative sarcoma virus (MPSV) Promotor inseriert. Psi 2 Zellen (Miller et al., Biotechnique 7, 1989, 980-990) wurden durch Elektroporation mit mpZen enthaltend das PBSF-Gen zusammen mit dem Plasmid SV2-Neo transfiziert. Neomyzin-resistente Kolonien wurden an G418 selektioniert. Dot-Blot der RNA und Hybridisierung wurden durchgeführt, um solche Kolonien zu identifizieren, die große Mengen PBSF produzieren. Konditioniertes Medium von einer Kolonie, die große Mengen produziert, wurde verwendet zur Infektion der amphitrophic packaging cell line PA317 (Miller et al., Mol. Cell. Biol., 6, 1986, 2895-2902) in Gegenwart von Polybren. Konditioniertes Medium wurde von transfizierten PA317-Kulturen für Bioassays erzeugt und zur Infektion von Babymauszellen wie nachstehend beschrieben verwendet. Diese Zellen wurden ebenfalls für Knochenmarks-Transplantationsexperimente verwendet.
BEISPIEL 3 Expression des PBSF-Fusionsproteins und Herstellung von Antikörpern A. E.coli-Fusionsprotein
• Der Hut 78-abgeleitete cDNA-Klon von PBSF wurde verwendet, um ein Fusionsprotein entweder mit dem menschlichen Konsensus-Interferon oder mit dem Rinderwachstumshormon herzustellen. Ein DNA-Fragment, enthaltend entweder die ersten 80 Aminosäuren des menschlichen Konsensus-Interferons oder die ersten 108 Aminosäuren des Rinderwachstumshormons wurden im Leserahmen zu der P64-codierenden Region an der Stelle, die den Asn² Rest codiert, fusioniert. Die Konsensus-Interferon-PBSF- oder Rinderwachstumshormon-PBSF-Fusionsproteine wurden Von dem PL-Promotor des Plasmids cCFM 756, eine modifizierte Version des pCFM736 (pCFM 736 ist beschrieben in der US-PS 4,710,473) exprimiert. E.coli FM5 wurde mit dem Gen, das das Fusionsprotein codiert, transfiziert und bei 28ºC bis zu einer OD600 von 0,3 bis 0,5 angezogen. Die Temperatur wurde dann für 2-3 Stunden auf 42ºC erhöht. Das Auflauchen von Inclusion-Bodies wurde durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht. E.coli-Zellen wurden danach in Laemmli-Puffer lysiert und auf einen 10%igen Gel durch SDS-PAGE analysiert. Proteinbanden wurden durch Coomassie blue-Färbung sichtbar gemacht. Die Expression des Konsensus-Interferon- PBSF-Fusionsproteins ist in Figur 3 gezeigt.
B. Antikörperproduktion
• E.coli, produzierend entweder ein Konsensus-Interferon-PBSP- oder Rinderwachstumshormon-PBSF-Fusionsprotein, wurde angezogen und in einem 500 ml Ansatz induziert wie vorstehend beschrieben. Nach der Zentrifugation wurden die abzentrifugierten Zellen in Eiswasser suspendiert und durch dreimalige Passage der French Press bei 7500 psi aufgebrochen. Nach der Zentrifugation wurden die abzentrifugierten Indusion Bodies mit 5M Harnstoff extrahiert, um die Kontamination mit E.coli Proteinen zu reduzieren. Fusionsproteine wurden aus den Polyacrylamidgelen isoliert wie beschrieben bei Hunkapiller M. et al., Methods in Enzymol. 91, 227-236. Die aus dem Gel isolierten Fusionsproteine wurden lyophylisiert und in Kaninchen injiziert, um Antikörper zu erzeugen. Alternativ wurde ein PBSF-Peptidfragment (Cys-Arg-Glu-Lys-Lys-Thr-Glu-Asn-Ser-Lys-Leu-Arg-Lys-Val-Lys- Tyr) gemäß SEQ ID NO: 10 synthetisiert, verbunden mit keyhole limpet hemocyanin (CalBiochem, La Jolla, CA, Katalognummer: 374811) und in Kaninchen injiziert, um Antikörper zu erzeugen (Liu et al., Ciochem., 18, 19279, 690-697).
BEISPIEL 4 Reinigung von PBSF A. Reinigung von Kaninchen anti-PBSF-Antikörpern und Immobilisierung an Cyanogen- Bromid-aktivierter Sepharose
• Ungereinigte Kaninchenantikörper gegen das Rinderwachstumshormon-PBSF-Fusionsprotein wurden auf einer Affi-gel Protein A-Agarosesäule (Bio-Rad, Richmond, CA, Katalognummer: 153-6153) gereinigt unter Verwendung des Verfahrens, publiziert bei dem Hersteller des Affi-gel Protein A MAPS-Kit. Die gereinigten Antikörper wurden an Cyanogen-Bromif-aktivierter Sepharose gebunden unter Verwendung des Verfahrens, publiziert als Teil des IMMUNOPURE Antigen/Antibody Immobilization Kit (Pierce, Rockford, IL, Katalognummer: 44890).
B. Reinigung von PBSF
• Konditioniertes Medium von PA317-Zellen, transfiziert mit MPZEN-PBSF war die Quelle von PBSF. Die Verfahren, die verwendet wurden, um die Probe auf die Antikörper-Säule zu bringen und die Elution von PBSF von der Säule sind diejenigen, die in dem IMMUNOPURE-Kit beschrieben sind. Nach der Elution von der Säule wurde das gereinigte PBSF gegen PBS dialysiert und durch SDS-PAGE und Silberfärbung auf einem 10%igen Gel analysiert. Die Ergebnisse sind in Figur 4 gezeigt.
BEISPIEL 5 In vitro-biologische Aktivität von PBSF Koloniebildungsassays
• Knochenmarkszellen, erhalten von normalen erwachsenen Balb/c Mäusen oder Mäusen, zuvor behandelt mit 5-Fluoruracil (5-FU), wurden als Doppelschicht-Agar-Kulturen auf 35 mm Platten ausplattiert wie vorstehend beschrieben (Bradley et al., J. Cell Physiol. 94, 1978, 507). Die α-Modifikation von Eagle's MEM (Flow Labs, McLean, VA), sublimiert mit 20% fötalem Kälberserum, wurde für alle Kulturen verwendet. Wachstumsfaktoren (SCF, IL-7 und PBSF) wurden bis zu einem Maximum von 13,2% des gesamten Kulturvolumens (1,5 ml pro Platte) in die Unterschichten eingegliedert. Die Kulturen wurden mit einem Gemisch von 5% 02:10% CO&sub2;:85% N&sub2; begast und für 10 bis 14 Tage inkubiert. Nur Kolonien, die 50 oder mehr Zellen enthalten, wurden gezählt.
• Alle Koloniebildungs-Assays wurden in Gegenwart von rekombinantem Ratten-Stammzellfaktor von 164 Aminosäuren Länge (rrSCF164) exprimiert in E.coli und gereinigt wie beschrieben bei Martin et al., Cell 63, 1990, 203, und rekombinantem menschlichen IL-7 (Biosource International, Westlake, CA) durchgeführt. rrSCF164 und rekombinantes menschliches IL-7 wurden jeweils zu einer Endkonzentration von 200 mg/ml der Kultur zugegeben. Die in Figur 5A gezeigten Assays wurden durchgeführt, um Vor-B-Zellbildung stimuliert durch konditioniertes Medium von Cos-Zellen transfiziert entweder mit dem Vektor 19.12 oder dem Vektor 19.12 enthaltend das 1,78 kb PBSF DNA-Fragment (bezeichnet 19.12-64) zu vergleichen. Die in Figur 5B gezeigten Assays wurden durchgeführt, um die Vor-B-Zellbildung durch konditioniertes Medium von PA317-Zellen, die das PBSF-Gen in einem retroviralen Vektor, PZen, tragen, zu messen. Figur 5C zeigt gereinigtes PBSF hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben und zu Knochenmarkszellen in den angegebenen Volumina hinzugefügt. Das Auftauchen von Prä-B-Zellen wurde verifiziert durch den Nachweis, daß die Kolonien, gebildet B220 Ag und cytoplasmatische µ-Kette exprimieren, aber nicht das Oberflächen Ig exprimieren.
BEISPIEL 6 In vivo-biologische Aktivität von PBSF A. Transgene Mäuse
• Das 1,78 kb Hind III-Fragment, das das PBSF-Gen trägt, wurde in V19.13 kloniert, der ähnlich ist wie V19.12, aber den Ratten-Albumin-Promotor anstelle des frühen Promotors von SV 40 enthält. Das DNA-Fragment wurde 3' zu dem Ratten-Albumin-Promotor und Enhancer inseriert. Die codierende Sequenz der PBSF cDNA enthaltend den Albumin- Promotor wurde durch CsCl dichte Gradientenzentrifugation gereinigt, gegen 1 X Injektionspuffer dialysiert (Injektionspuffer: 10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 7,5). 1-2 ng/µl DNA (entspricht etwa 500 Kopien linearer DNA-Moleküle) wurden in jede Eizelle injiziert. Die injizierten Eizellen wurden in scheinschwangere Mäuse implantiert. Die Nachkommen erschienen nach 20 Tagen. Die Gegenwart der PBSF-DNA-Sequenzen in den Gründern wurde durch PCR-Amplifizierung der DNA isoliert aus den Schwänzen, bestimmt. Blut aus dem Schwanz wurde mit Sysmex analysiert, um die Populationen an weißen Blutzellen, roten Blutzellen und Blutplättchen zu zählen.
• Die Begründer wurden dann verpaart, um die F1-Tiere zu erzeugen. Diese wurden auf das Vorhandensein des PBSF-Gens gescreent. Die aus Leber, Knochenmark, Milz und Muskel der F1-Maus isolierte RNA wurde durch reverse Transkription und PCR gescreent, um die Expression von PBSF nachzuweisen.
• Um den systemischen Effekt der PBSF-Expression zu charakterisieren, wurden verschiedene Organe der F1-Generation isoliert, fixiert und dünne Schnitte für histochemische Analysen hergestellt.
B. Retrovirale Infektion von Babymäusen
• 3 bis 4 Tage alte Baby Balb/C-Mäuse wurden intramuskulär mit 50 µl eines Gemisches von konditioniertem Medium von PA3.17-Zellen transfiziert entweder mit dem MPZEN-Vektor, dem MPZEN-Vektor enthaltend das Gen, das für G-CSF codiert oder dem MPZEN-Vektor enthaltend das PBSF-Gen und mit konditioniertem Medium von NIH 3T3-Zellen infiziert mit Wildtyp Moloney virus. PA317 konditioniertes Medium und 3T3 konditioniertes Medium war einem Verhältnis von 10:1 (v/v) vorhanden. Blut von der Schwanzvene wurde in Intervallen von 1, 2 und 3 Monaten in EDTA beschichteten Mikrofugengefaßen gesammelt. Blutpräparate für Giemsa-Färbung und differenzielles Auszählen wurden hergestellt. Sysmex-Analyse des Bluts wurde durchgeführt, um die Population an weißen Blutzellen, roten Blutzellen und Blutplättchen zu bestimmen. Nach dem Tod oder nach Euthanasie wurden ausgewählte lebenswichtige Organe entfernt für histologische Analysen.
C. Knochenmark-Gen-Transfer
• B57/J-Mäuse wurden bestrahlt, um Knochenmarkszellen zu zerstören. Diese Mäuse wurden dann mit Knochenmarkszellen von Donor-Tieren nach in vitro-Infektion durch Kokultur für 5 Tage mit PA317-Zellen, die entweder den MPZEN-Vektor allein oder den Vektor enthaltend das G-CSF oder PBSF-Gen, transplantiert. Nachdem das Überleben die erfolgreiche Transplantation bestatigte, wurde RNA aus dem Blut isoliert und für die Expression bestiminter fremder Gene analysiert. Blut wurde dann differenziell durch Sysmex analysiert.
BEISPIEL 7 Induktion und Gewebe-Spezifität der PBSF-Expression A. Induktion der PBSF-Expression
• Die PBSF-Expression wurde unter verschiedenen induzierenden Bedingungen untersucht, um zu bestimmen, ob P64-Expression unter Bedingungen induziert werden kann, die allgemein bekannt sind, die Synthese von Cytokinen zu stimulieren. RNA wurde von Lymphozyten des Kreislaufs isoliert, die nicht behandelt oder behandelt waren mit pokeweed- Mitogen (PWM) oder PWM und Cycloheximid wie in Beispiel 1B und 1C beschrieben. Die RNA wurde elektrophoretisch auf einem 1,2% Agarosegel aufgetrennt. Diese wurde getestet mit dem PBSF cDNA-Klon von der Oligo-(dT)-geprimten Bibliothek von peripheren Lymphozyten markiert mit 32p durch das Random-Priming-Verfahren. Die Ergebnisse sind in Figur 6 gezeigt.
• Die Expression von PBSF während der induzierten Differenzierung von menschlichen leukämischen Zellen wurde ebenfalls durch Northern-Blot analysiert. Drei myelomonocytische Zellinien menschlichen Ursprungs (HL-60, ATTC Nr.: CCL-240, KG-1, ATCC Nr.: CCL-246 und ML-1, Samal et al., Leuk. Res.,14, 1990, 575-580) wurden zur Differenzierung in Makrophagen induziert durch Behandlung mit entweder PMA, Tumomekrosefaktor (TNF) oder TNF und IL-6. Die RNA wurde isoliert und der Northern-Analyse unterzogen, wie für PWM- und Cycloheximid-Induktion beschrieben. Die Ergebnisse sind in Figur 7 gezeigt. Die höchste Rate der PBSF mRNA-Synthese wurde in HL-60 Zellen induziert mit PMA erhalten. Nur.: sehr geringe Raten von P64 mRNA wurden unter allen Bedingungen in KG-1- und ML-1-Zellen nachgewiesen.
B. Gewebespezifität der PBSF-Expression
• Gewebespezifische Expression von P64 wurde durch Northern-Analyse und RT/PCR bestimmt. Etwa 10 µg total RNA von menschlichem Hirn, Lunge und Plazenta (alle erhalten von Clontech Laboratories) und 10 µg von RNA von HELA- und PMA-aktivierten Jurkat-Zellen wurden durch Northern-Blots analysiert (Lehrach H. et al., Biochem., 16, 1977, 4743) unter Verwendung des ³²P-gelabelten PBSF-Klons als Probe wie in Abschnitt A beschrieben. PBSF-RNA wurde in Lungengewebe und HELA-Zellen nachgewiesen.
• Ähnliche Ergebnisse wurden durch RTIPCR-Analyse (Noonan et al., Nucleic Acid Res., 16, 1988, 10366) erhalten. Der erste Strang der cDNA wurde synthetisiert wie in Beispiel 1E beschrieben von etwa 10 µg total RNA von HELA-Zellen und von menschlichem Hirn, Herzen, Skelettmuskel, Milz, Thymus, Knochenmark, Nieren, Leber, Lungen, Hoden und Plazenta. PBSF mRNA wurde in einem automatischen Thermocycler (Perkin Eimer Cetus) amplifiziert unter Verwendung von zwei Primern mit den nachfolgenden Sequenzen:
• 5' AGGGATGGAACTACATTC 3' (Sinnprimer), und
• 5' TCATAGCTATCGCTGACC 3' (Antisenseprimer).
• Die Sinnprimersequenz entspricht den Nucleotiden 323-340 in SEQ ID NO: 1 und der Antisenseprimer ist komplementär zu den Nucleotiden 855-872 in SEQ ID NO: 1. Die Primer wurden unter stringenten Bedingungen hybridisiert für insgesamt 27 Zyklen, so daß die Annealing-Temperatur etwa 2ºC unter der Schmelztemperatur (Tm) des Primer- Template-Komplexes war. Die resultierenden Primer-Extension-Produkte wurden auf einem 1,5 %igen Agarosegel analysiert. Die Ergebnisse sind in Figur 8 gezeigt. PBSF MRNA wurde in HELA-Zellen, Knochenmark, Leber und Lungen exprimiert und war nur schwach nachweisbar in anderen getesteten Geweben außer nach 40 oder mehr Zyklen. Die Identität der amplifizierten Produkte als PBSF wurde durch Southem-Blot-Analyse verifiziert. Ein 1190 bp Hind III/Xba I Subfragment des PBSF-Klons markiert mit ³²P durch Random-Priming wurde als Probe verwendet.
• Obwohl die vorliegende Erfindung durch bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden ist, kennt der Fachmann Variationen und Modifikationen von diesen. Daher umfassen die Ansprüche solche äquivalenten Variationen, die somit in den Schutzbereich der Erfindung fallen.
SEQUENZPROTOKOLL (1) ALLGEMEINE ANGABEN:
• (i) ANMELDER:(A) NAME: Amgen, Inc.
• (B)STRASSE: 1840 Dehavilland Drive
• (C) STADT: Thousand Oaks
• (D) BUNDESLAND: Kalifornien
• (E) LAND: U.S.A.
• (F) POSTLEITZAHL: 91320-1789
• (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Vorläufer-B-Zell-stimulierender Faktor
• (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 16
• (iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
• (A) DATENTRAGER: Diskette, 3,5 in., 1,44 MB
• (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
• (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:1:
• (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
• (A) LANGE: 2376 Nucleotide
• (B) ART: Nucleinsäure
• (C) STRANGFORM: Doppelstrang
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:1:
(3) ANGABEN ZU SEQ ID NO:2:
• (i) SEQUENZ KENNZEICHEN:
• (A) LANGE: 45 Nucleotide
• (B) ART: Nucleinsäure
• (C) STRANGFORM: Einzeistrang
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:2:
(4) ANGABEN ZU SEQ ID NO:3:
• (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
• (A) LANGE: 45 Nucleotide
• (B) ART: Nucleinsäure
• (C) STRANGFORM: Einzelstrang
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:3:
(5) ANGABEN ZU SEQ ID NO:4:
• (i) SEQUENZ. KENNZEICHEN:
• (A) LANGE: 45 Nucleotide
• (B) ART: Nucleinsäure
• (C) STRANGFORM: Einzelstrang
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:4:
(6) ANGABEN ZU SEQ ID NO:5:
• (i) SEQUENZKENNZEICIIEN:
• (A) LANGE: 45 Nucleotide
• (B) ART: Nucleinsäure
• (C) STRANGFORM: Einzelstrang
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:5:
(7) ANGABEN ZU SEQ ID NO:6:
• (i) SEQUENZ. KENNZEICHEN:
• (A) LANGE: 45 Nucleotide
• (B) ART: Nucleinsäure
• (C) STRANGFORM: Einzelstrang:
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:6:
(8) ANGABEN ZU SEQ ID NO:7:
• (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
• (A) LANGE: 30 Nucleotide
• (B) ART: Nucleinsäure
• (C) STRANGFORM: Einzelstrang
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:7:
(9) ANGABEN ZU SEQ ID NO:8:
• (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
• (A) LANGE: 14 Nucleotide
• (B) ART: Nucleinsäure
• (C) STRANGFORM: Einzelstrang
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:8:
(10) ANGABEN ZU SEQ ID NO:9:
• (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
• (A) LANGE: 13 Nucleotide
• (B) ART: Nucleinsäure
• (C) STRANGFORM: Doppelstrang
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:9:
(11) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
• (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
• (A) LANGE: 16 Aminosäuren
• (B) ART: Aminosäure
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(12) ANGABEN ZU SEQ ID NO:11:
• (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
• (A) LANGE: 491 Aminosäuren
• (B) ART: Aminosäure
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:11:
(13) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
• (i) SEQUENZKENNZEICIIEN:
• (A) LANGE: 20 Nucleotide
• (B) ART: Nucleinsäure
• (C) STRANGFORM: Einzelstrang
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:12:
(14) ANGABEN ZU SEQ ID NO:13:
• (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
• (A) LANGE: 24 Nucleotide
• (B) ART: Nucleinsäure
• (C) STRANGFORM: Einzelstrang
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:13:
(15) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
• (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
• (A) LANGE: 18 Nucleotide
• (B) ART: Nucleinsäure
• (C) STRANGFORM: Einzelstrang
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
(16) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
• (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
• (A) LÄNGE: 18 Nucleotide
• (B) ART: Nucleinsäure
• (C) STRANGFORM: Einzelstrang
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
(17) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
• (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
• (A) LANGE: 8 Nucleotide
• (B) ART: Nucleinsäure
• (C) STRANGFORM: Doppelstrang
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

Claims (33)

1. Ein gereinigtes und isoliertes Polypeptid mit der Aktivität der Stimmulierung der Bildung von Vorläufer B-Zellen und mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.:1 oder ein biologisch aktives Fragment oder ein Analogon davön.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aktivität der Stimmulierung der Bildung von Vorläufer B-Zellen vorkommt in Gegenwart des Stammzellfaktors und Interleukin-7.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz von den Resten 15 bis 491 oder alternativ von den Resten 32 bis 491 gemäß SEQ ID NO.:1.

4. Polypeptid nach Anspruch 1, das dadurch charakterisiert ist, daß es das Produkt prokarygtischer oder eukaryotischer Expression einer exogenen DNA-Sequenz ist.

5. Polypeptid nach Anspruch 4, das das Produkt der CHO-Zellexpression ist.

6. Polypeptid nach Anspruch 4, wobei die exogene Sequenz eine cDNA-Sequenz ist.

7. Polypeptid nach Anspruch 4, wobei die exogene Sequenz eine genomische DNA-Sequenz ist.

8. Polypeptid nach Anspruch 4, wobei die exogene Sequenz eine synthetische DNA-Sequenz ist.

9. Polypeptid nach Anspruch 4, wobei die exogene Sequenz sich auf einem autonom replizierenden DNA-Plaslnid oder viralen -Vektor befindet.

10. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 4, ferner charakterisiert durch eine kovalente Verbindung mit einer nachweisbaren Markierung.

11. Polypeptid nach Anspruch 4, ferner charakterisiert durch eine kovalente Verbindung mit einem wasserlöslichen Polymer.

12. Polypeptid nach Anspruch 4 mit einem Methioninrest am Aminoterminus des Polypeptids.

13. Eine DNA-Sequenz kodierend ein Polypeptid mit der Aktivität der Stimmulierung der Bildung von Vorläufer B-Zellen, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

a) der DNA-Sequenz, gemäß SEQ ID NO.:1 und ihrem komplementären Strang;

b) DNA-Sequenzen, hybridisierend mit den Sequenzen in (a); und

c) DNA-Sequenzen, die aufgrund der Degeneratiön des genetischen Codes mit den Sequenzen in (a) und (b) hybridisieren würden.

14. DNA-Sequenz nach Anspruch 13, die eine cDNA ist.

15. DNA-Sequenz nach Anspruch 13, die genomische DNA ist.

16. DNA-Sequenz nach Anspruch 13, die synthetische DNA ist.

17. DNA-Sequenz nach Anspruch 13, die kovalent mit einer nachweisbaren Markierung verbunden ist.

18. DNA-Sequenz nach Anspruch 13, die ein oder mehrere Codons einschließt, bevorzugt für die Expression in E.coli Wirtszellen.

19. DNA-Sequenz nach Anspruch 13, umfassend die Sequenz SEQ ID NO.:1.

20. Ein biologisch funktionelles Plasmid oder ein viraler DNA-Vektor, der eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 13 oder 19 einschließt.

21. Prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, stabil transformiert oder transfiziert mit einem Plasmid oder einem viralen DNA-Vektor nach Anspruch 20.

22. Ein Polypeptid, Produkt der Expression einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 13 oder 19 in einer Art, die die Expression des Polypeptids, eines biologisch aktiven Fragments oder Analogons davon erlaubt.

23. Ein Verfahren zur Reinigung des Polypeptids nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Verfahren umfaßt:

a) Anheften eines Antikörpers an einen festen Träger, wobei der Antikörper spezifisch an das Polypeptid bindet;

b) In-Kontakt-Bringen des angehefteten Antikörpers mit einer Lösung enthaltend das Polypeptid in einer Art, die eine selektive Bindung des Polypeptids an den Antikörper erlaubt; und

c) Eluieren des gebundenen Polypeptids.

24. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach Anspruch 3, wobei das Verfahren umfaßt:

Wachstum prokaryotischer oder eukaryotischer Wirtszellen unter geeigneten Nährstoffbedingungen, die mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 12, 13 oder 20 in einer Art transformiert oder transfiziert sind, die die Expression des Polypeptids erlaubt; und

die Isolierung des Polypeptids.

25. Fusionsprotein, umfassend einen Teil oder die ganze Aminosäuresequenz, ausgehend vom Aminoterminus der menschlichen Interferonkonsensussequenz oder der Rinder-Wachstumshormonsequenz, fusioniert in Leserahmen zu einem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von der Position 2 bis 491 gemäß SEQ ID NO.:1.

26. Fusionsprotein nach Anspruch 25, das das Produkt der Expression in E.coli Wirtszellen ist.

27. Ein Antikörper, der das Polypeptid nach Anspruch 1 oder ein Peptidfragment davon spezifisch bindet.

28. Antikörper, spezifisch bindend das Fusionsprotein nach Anspruch 26.

29. Antikörper nach Anspruch 27 oder 28, der ein monoklonaler Antikörper ist.

30. Polypeptid nach Anspruch 1 als Arzneistoff.

31. Polypeptid nach Anspruch 30 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung eines Defekts in Vorläufer B-Zellen.

32. Polypeptid nach Anspruch 30 und 31, zusammen mit einer therapeutisch wirksamen Menge von einem oder mehreren von IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, SCF, L-BCGF oder H-BCGF.

33. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch effektive Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 12, 22 bis 26 und ein pharmazeutisch verträglicher Verdünnungsstoff, Hilfsstoff oder Träger.