ES2281175T3 - Agonistas y antagonistas selectivos de il-2. - Google Patents
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Abstract
Una muteína de IL-2 humana numerada de acuerdo con la IL-2 de tipo salvaje que tiene una sustitución de un aminoácido en una de las posiciones 20, 88, y 126, en la que la posición 20 está sustituida por un aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por: alanina, histidina, isoleucina, metionina, glutamina, serina, valina, o tirosina la posición 88 está sustituida por un aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por: alanina, arginina, ácido glutámico, histidina, lisina, leucina, fenilalanina, glicina, isoleucina, metionina, serina, treonina, tirosina o valina; la posición 126 está sustituida por un aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por: asparagina, leucina, prolina, fenilalanina, glicina, isoleucina, metionina, arginina, serina, treonina, tirosina o valina; y por lo cual dicha muteína de IL-2 activa de manera preferente las células T frente a las células Asesinas Naturales.
Description
Agonistas y antagonistas selectivos de
IL-2.
La invención se refiere de manera general a los
campos de la farmacología e inmunología. De manera más específica,
la invención se dirige a nueva composiciones de materia para activar
de manera selectiva las células T (blastos PHA), y que tienen
reducida la activación de las células Asesinas Naturales
("NK"). Las nuevas composiciones incluyen variantes de la
familia de las citoquinas, y en particular la
Interleuquina-2 humana
("IL-2").
La Interleuquina 2 (IL-2) es un
potente inmunoestimulador, que activa diversas células del sistema
inmune, que incluyen las células T, las células B, y los monocitos.
La IL-2 es también un potente y crítico factor de
crecimiento de las células T. Fue en virtud de estas actividades que
se ensayó IL-2 por su capacidad para tratar el
cáncer. La IL-2 humana es un fármaco aprobado por la
FDA para el tratamiento del carcinoma renal metastático y el
melanoma metastático. El uso de IL-2 en pacientes
elegibles es restringido debido a la grave toxicidad asociada con la
terapia de IL-2; se estima que en el mejor de los
casos, únicamente un 20% de pacientes elegibles reciben realmente la
terapia. Las toxicidades asociadas con la terapia de
IL-2 incluyen fiebre grave, náusea, vómitos, derrame
vascular e hipotensión grave. A pesar de estas toxicidades, sin
embargo, IL-2 es eficaz para sus indicaciones
aprobadas (un índice de respuesta objetivo aproximadamente del
17%).
Aunque ha sido extensivo el análisis de
estructura/función de la IL-2 de ratón (Zurawski, S.
M. y Zurawski, G. (1989) Embo J, 8:
2583-2590; Zurawski, S. M. y col., (1990)
Embo J, 9; 3899-3905; Zurawski, G. (1991).
Trends Biotechnol, 9: 250-257; Zurawski, S.
M. y Zurawski, G. (1992) Embo J, 11:
3905-3910. Zurawski, y col., EMBO J, 12,
5113-5119 (1993)), únicamente se ha producido un
análisis limitado de la IL-12 humana. La mayor
parte de los estudios con muteínas de IL-2 humanas
se han llevado a cabo sobre células murinas; sin embargo, se han
producido estudios limitados usando blastos PHA humanos, que
expresan la alta afinidad del receptor
IL-2R\alpha\beta\gamma de
IL-2. Los estudios usando blastos PHA confirmaron la
importancia de los restos Asp-20 y la hélice D de la
IL-2 humana. Se ha demostrado que las posiciones
Asp-20 y Gln-126 de la
IL-2 humana son los restos principales responsables
de la interacción con las subunidades \beta y \gamma del
receptor de IL-2, de manera respectiva (revisado en
Thèze, y col., Immunol. Today, 17,
481-486 (1996)). Aunque se ha demostrado que los
restos de la hélice C de la IL-2 de ratón están
implicados en la interacción con IL-2R\beta de
ratón (Zurawski, y col., EMBO J, 12,
5113-5119) (1993)), no se ha demostrado que los
restos equivalentes en la IL-2 humana tengan las
mismas propiedades (estos restos en la IL-2 humana
podrían ser Asp-84 y Asn-88). Debido
a que se muestra una especificidad significativa de especies entre
la IL-2 humana y la de ratón (IL-2
humana presenta aproximadamente una actividad reducida 100 veces en
los sistemas murinos), es difícil predecir si se están produciendo
el mismo tipo de interacciones dentro del límite de la especie. No
se conocen estudios que usen células que expresan únicamente el
receptor IL-2R\beta\gamma humano de afinidad
intermedia.
Se han examinado algunas muteínas de
IL-2 humanas por su actividad en los blastos PHA
humanos (Xu, y col., Eur Cytokine Netw, 6,
237-244 (1995)). Se demuestra que las muteínas que
contienen sustituciones de Asp-20 con Leucina
(D20L), así como con Arginina, Asparagina, y Lisina, tienen defectos
graves en su capacidad para inducir la proliferación de blastos PHA.
De esta manera, esta técnica enseña que la sustitución de
Asp-20 dará como resultado muteínas de actividad
comprometida. De manera adicional, Xu, y col afirman que
hasta la fecha (1995) no se han identificado muteínas
IL-12 útiles para las aplicaciones químicas o de
investigación.
La muteína Q126D de IL-2 humana
generada por Buchli y Ciardelli, Arch. Biochem. Biophys,
307(2): 411-415, (1993) mostró una actividad
significativamente comprometida en la potencia y el agonismo; en
ensayos de células T humanas, presentó aproximadamente 1.000 veces
menos actividad que la IL-2 y se comportó como un
agonista parcial. En los ensayos de células T murinas, la muteína
fue casi inactiva. Ambas líneas celulares ensayadas expresaron la
forma de alta afinidad del receptor IL-2. En ambos
tipos de células, Q126D desarrolló la capacidad de antagonizar la
actividad mediada por IL-2, aunque sólo parcialmente
en el ensayo de células T humanas.
Zhi-Yong, W., y col., Acta
Biochimica et Biophysica Sinica, 25(5):
558-560 (Sept. 1993) llevaron a cabo experimentos de
sustitución en las posiciones 62, 69, 99 y 126 de
IL-2 demostrando una reducción en la actividad de 20
veces y 30 veces en comparación con la IL-2 de tipo
salvaje, con
62-Leu-IL-2 y
126-Asp-IL-2, de
manera respectiva, en un ensayo de células T de ratón
(CTLL-2). Sin embargo, no existe enseñanza o
sugerencia de que las sustituciones en la posición 126 puedan
conferir actividad selectiva de las células T sobre las células NK,
o indicar si dichos cambios podrían tener un efecto similar en las
células T humanas.
Collins, L., y col., PNAS USA, 85:
7709-7713 (1988) informaron que la sustitución de
Asp en la posición 20 con cualquiera de Asn (D20N) o Lys (D20K) dio
como resultado una pérdida de enlace aproximadamente de 100 a 1000
veces en relación con la IL-2 humana para el
receptor de afinidad alta
(IL-2R\alpha\beta\gamma, denominado p55/p70 en
Collins y col) e intermedia (IL-2R\beta\gamma,
denominado "p70" en Collins, y col). La unión con
IL-2R\alpha pareció no afectar a ambas proteínas
mutantes. Este trabajo enseña que la interrupción de la unión con el
receptor IL-2 de afinidad intermedia
(IL-2R\beta\gamma) conduciría también a la
interrupción de la unión con el receptor IL-2 de
alta afinidad (IL-2R\alpha\beta\gamma),
sugiriendo que la unión o la activación diferencial entre
IL-2R\beta\gamma o
IL-2R\alpha\beta\gamma no es conseguible
mediante la sustitución de Asp en la posición 20.
Berndt, W. G. y col., Biochemistry,
33(21): 6571-6577 (1994) usaron la
mutagénesis de módulos combinatorios para mutar de manera simultánea
las posiciones 17-21 en la IL-2
nativa, que son sospechosas de interaccionar con el receptor
IL-2 de afinidad intermedia. De los 2610 clones
seleccionados, únicamente 42 fueron activos. Encontraron que las
posiciones 20 y 21 fueron de importancia principal para la actividad
biológica. No existen sugerencia o enseñanza de sustituciones
individuales excepto para L21V.
La Patente de los Estados Unidos Nº 5.229.109
(Grimm, y col) describe según se afirma la baja toxicidad de los
análogos de IL-2 para el uso en el tratamiento de
inmunoterapia y del cáncer. Se analizaron las propiedades de dos
análogos de IL-2 con sustituciones en las posiciones
Arg38 (por Alanina) y Phe42 (por Lisina) y se compararon aquellas
con la IL-2 nativa. Se encontró que los análogos
eran capaces de mantener su capacidad para unirse al receptor
IL-2 intermedio, mientras que se unían sólo
minimamente con el así denominado receptor de "alta afinidad".
En este momento se pensó que el receptor de afinidad intermedia
estaba constituido únicamente por p75
(IL-2R\beta), y se pensó que el receptor de alta
afinidad estaba constituido únicamente por el complejo receptor p55
+ p75 (IL-2R\alpha\beta). Los análogos también
mantuvieron su capacidad para estimular las células mononucleares de
la sangre periférica para generar una muerte activada por linfoquina
(LAK). Los restos aminoácidos descritos en esta patente son aquellos
que podrían interaccionar de manera específica con
IL-2R\alpha (p55); la eliminación de las
interacciones con IL-2R\alpha podría dar como
resultado una actividad reducida en las células que portan el
receptor IL-2 de alta afinidad, y podrían no afectar
la actividad de las células que portan el receptor
IL-2 de afinidad intermedia. De esta manera, debería
mantenerse la generación de células LAK (que se piensa que derivan
de las células NK). Las muteínas descritas en el presente documento
se dirigen a los restos aminoácidos en la posiciones 20, 88, y 126;
se piensa que estas posiciones interaccionan de manera específica
con IL-2R\beta (p75; posiciones 20 y 88), e
IL-2R\gamma (no conocido en el momento de
registrar la patente de Grimm, y col; posiciones 126). Como
consecuencia, permanecen sin cambiar las interacciones con
IL-2R\alpha. Mecánicamente, la muteínas descritas
por Grimm, y col, tendrán interacciones diminuidas con el receptor
IL-2 de alta afinidad, pero no tendrán efecto sobre
el receptor IL-2 de afinidad intermedia; las
muteínas descritas en el presente documento tienen las
características opuestas, poseyendo un pronunciado defecto en su
capacidad para interactuar con el receptor IL-2 de
afinidad intermedia IL-2R\beta\gamma, y muestran
un pequeño o no muestran defecto en las interacciones funcionales
con el receptor IL-2 de alta afinidad,
IL-2R\alpha\beta\gamma.
La Patente de los Estados Unidos Nº 5.206.344,
(Goodson y col.) describe muteínas de IL-2 en las
que uno de los aminoácidos de la secuencia nativa madura de
IL-2 se sustituye por un resto cisteína, que
entonces se preparan y conjugan a través del resto cisteína
sustituido en un polímero seleccionado entre los homopolímeros de
polietilenglicol o los polioles polioxietilados, en los que los
homopolímeros son no sustituidos o sustituidos en un extremo con un
grupo alquilo. Se fabrican estas muteínas mediante la expresión en
el huésped de los genes mutantes que codifican las muteínas que se
han cambiado a partir de los genes para las proteínas de origen
mediante la mutagénesis dirigida a sitio. De manera adicional, se
pueden conjugar otras especies de IL-2 mediante el
resto cisteína en la posición 125 de la proteína
IL-2 madura que no es necesario para la actividad
biológica de IL-2. No existe descripción de
mutaciones que confieran toxicidad reducida.
La Patente de los Estados Unidos nº 4.959.314
(Lin y col.) describe muteínas de proteínas biológicamente activas
tales como IFN-\beta cuyos restos cisteína que no
son esenciales para la actividad biológica se han delecionado o
sustituido con otros aminoácidos para eliminar los sitios para el
entrecruzamiento intermolecular o la formación de puentes de
disulfuro intramoleculares incorrectos. Se fabrican estas muteínas
mediante la expresión bacteriana de los genes mutantes que codifican
las muteínas que se han sintetizado a partir de los genes para las
proteínas de origen mediante la mutagénesis dirigida a
oligonucleótido. No existe descripción de mutaciones que confieran
toxicidad reducida.
La Patente de los Estados Unidos nº 5.116.943
(Halenbeck y col.) describe que una proteína terapéutica de
referencia biológicamente activa se protege frente a la oxidación
mediante un procedimiento que implica sustituir un aminoácido
conservador por cada resto metionilo susceptible de oxidación por
cloramina T o peróxido, en la que los restos metionilo no
susceptibles adicionales, no se sustituyen de esta manera. La
muteína resistente a la oxidación producida de esta manera es de
manera preferible una muteína humana de interleuquina 2 o
interferón-\beta, y el aminoácido conservador más
preferible es la alanina. No existe descripción de mutaciones que
confieran toxicidad
reducida.
reducida.
La Patente de los Estados Unidos Nº 4.853.332
(Mark y col.) se dirige a las muteínas IFN-\gamma
e IL-2 cuyos restos cisteína que no son esenciales
para la actividad biológica se han delecionado o sustituido por
otros aminoácidos para eliminar los sitios para el entrecruzamiento
intermolecular o la formación de puentes de disulfuro
intramoleculares incorrectos. La patente describe que una
sustitución en IL-2 en la cisteína 125 por serina da
como resultado una muteína con actividad comparable a la de la
IL-2 nativa.
La Patente de los Estados Unidos Nº 5.696.234
(Zurawski y col.) se dirige a las muteínas de las citoquinas de
mamíferos, y a los procedimientos para seleccionar los antagonistas
y antagonistas de las citoquinas de mamíferos. De manera concreta,
se demuestra que la doble muteína P82A/Q126D de IL-2
humana tiene actividad antagonista sobre las células Baf3 murinas
cotransfectadas con subunidades \alpha y \beta de
IL-2R. Se demuestra poca actividad agonista.
También, se demuestra que las muteínas de IL-2
murina presentan actividad agonista y antagonista parcial sobre las
células HT2, de manera concreta Q141D, Q141K, Q141V, y Q141L. No se
describen actividades de la muteína que muestren o sugieran un
efecto agonista selectivo para las mutaciones en las posiciones 20,
88 y 126.
Zurawski, y col, describen muteínas de
IL-2 murinas que tienen las propiedades de ser
activas en células que expresan
IL-2R\alpha\beta\gamma pero inactivas en
células que expresan IL-2R\beta\gamma (Zurawski,
G., Trends Biotecnol., 9:250-257 (1991);
Zurawski, S. M. y Zurawski, G. Embo. J., 11:
3905-3910 (1992)). Las muteínas de
IL-2 murinas que presentan estas propiedades tenían
las sustituciones Asp-34 por Ser o The, y
Gln-141 por Lys. Asp-34 y
Gln-141 de IL-2 de ratón parecen
equivalentes a Asp-20 y Gln-141 de
IL-2 humana, de manera respectiva. Aunque estas
referencias se refieren a las muteínas de IL-2
"agonistas selectivas", no describen su potencial como menos
tóxico, sino más bien como antagonistas potenciales de
IL-2 endógenas.
El Documento EP 0267 795 A2 (Zurawski y
col.) describe una variedad de muteínas de IL-2
de ratón, desde el principio hasta el fin de la secuencia, que
incluyen algunas que contienen deleciones y/o sustituciones en el
interior de los primeros treinta restos aminoácidos
N-terminales que con biológicamente competentes,
pero esto no incluye, describir o sugerir las sustituciones de
aminoácidos descritas aquí en los restos equivalentes de
IL-2 de ratón. Existe una necesidad de una molécula
de IL-2 mejorada que tenga toxicidad reducida y se
tolere de manera más general.
Taniguchi y col., Documento US 4.738.927 se
dirigen a un ADN recombinante que comprende un ADN recombinante que
codifica un polipéptido que posee una actividad biológica de
IL-2, en el que dicha actividad es la estimulación
del crecimiento de la línea celular de linfocitos T citotóxicos, y
un vector de ADN capaz de propagarse en una célula procariota o
eucariota, localizándose la secuencia de codificación de dicho gen
en una posición cadena abajo de una secuencia del promotor, en la
que dicho polipéptido tiene 132 a 134 aminoácidos en total en la
secuencia de aminoácidos del polipéptido. Se describe también un
gen, los vectores de ADN recombinante, las células huésped, y los
procedimientos para producir de manera recombinante
IL-2 nativa. Taniguchi y col., no describen ningún
variante o las muteínas, y no enseñan qué posiciones en la proteína
son responsables de la actividad de señalización o
enlace.
enlace.
Eckenberg, R. y col describen Analysis of Human
IL-2/IL-2 receptor beta Chain
interactions: monoclonal antibody H2-8 and new
IL-2 mutants define the critical role of alpha
helix-A of IL-2, Cytokine, vol 9, nº
7, Julio 1997 (1997-07), páginas
488-498;
El Documento WO 96 04306 A (Schering Corporation
(US); Zurawski S. M.: Zurawski G.) se refiere a las Muteínas de las
Citoquinas de Mamíferos;
JU G. y col.: describen el
Structure-function analysis of human
Interleukin-2 Journal of Biological Chemistry, vol
262, nº 12, 25 de Abril 1987
(1987-04-25), páginas
5723-5731 y
Ernst J. F. y col. se refieren a Screening of
muteins secreted by yeast: random mutagenesis of human
Interleukin-2 Bio/Technology, vol. 7, nº. 7, 1 de
Julio de 1989 (1989-07-01), páginas
716-720.
Resulta claro que las muteínas de
IL-2 que no presentan toxicidad limitada por la
dosis de las muteínas de IL-2 recombinantes de la
técnica anterior se necesitan para tener la ventaja terapéutica del
potencial de esta citoquina.
La invención se dirige a un polipéptido que
comprende una muteína de IL-2 humana numerada de
acuerdo con la IL-2 de tipo salvaje en la que dicha
IL-2 humana está sustituida en al menos una de las
posiciones 2, 88 ó 126, en la que dicha muteína activa de manera
preferente las células T sobre las células NK. Esta invención crea
una muteína de IL-2 menos tóxica que permite un
mayor uso terapéutico de esta interleuquina.
De manera adicional, la invención se dirige a
las muteínas de IL-2 que tienen una única mutación
en las posiciones del Aspartato 20, Asparagina 88, y Glutamina 126.
Se representan las muteínas específicas mediante los designadores
D20X, N88X, y Q126X, en los que "X" es un aminoácido específico
que cuando se sustituye en la IL-2 humana, confiere
actividad selectiva a las células que expresan el receptor
IL-2R\alpha\beta\gamma (por ejemplo, las
células T) con preferencia frente a las células que expresan el
receptor IL-2R\beta\gamma (por ejemplo, las
células NK). Las muteínas que presentan selectividad mayor de 1000
veces incluyen D20H, D20I, N88G, N88I, N88R, y Q126L. De manera
concreta, estas muteínas presentan también esencialmente actividad
de IL-2 de tipo salvaje en las células T. Se
identifican también otras mutaciones que proporcionan selectividad
de menos de 1000 veces pero mayor de 10 veces. La invención incluye
también polinucleótidos que codifican la muteína de la invención,
los vectores que contienen los polinucleótidos, las células huésped
transformadas, las composiciones farmacéuticas que comprenden las
muteínas, y los procedimientos terapéuticos de tratamiento que usan
las muteínas.
La invención se dirige también a un
procedimiento para seleccionar las muteínas de IL-2
mediante la evaluación en ensayos que utilizan
IL-2R\alpha\beta\gamma, en comparación con
IL-2R\beta\gamma, en el que la actividad de una
muteína de IL-2 se aumenta en relación con la
IL-2 de tipo salvaje en un ensayo preferente con
respecto al otro. IL-2R\alpha\beta\gamma e
IL-2R\beta\gamma son los ectodominios de la
subunidad del receptor individual en combinación apropiada, y se
usan para medir directamente la unión de las muteínas de
IL-2 con cada complejo de receptor. El ensayo
IL-2ab utiliza una respuesta de un tipo de célula
que porta IL-2\alpha\beta\gamma, y el ensayo
IL-2\beta\gamma utiliza una respuesta de un tipo
de célula que porta IL-2\beta\gamma. La célula
que porta IL-2\alpha\beta\gamma es un blasto
PHA, y la célula que porta IL-2\beta\gamma es
una célula NK. El ensayo es de proliferación para el tipo de célula
que porta IL-2R\alpha\beta\gamma y el tipo de
célula que porta IL-2\beta\gamma.
La invención se dirige también a un vector que
comprende el polinucleótido que codifica una muteína de esta
invención, el vector que dirige la expresión de una muteína de
IL-2 humana que tiene la actividad que activa
células blasto PHA pero que tiene una actividad que activa células
NK reducidas, siendo capaz el vector de permitir la transfección de
un organismo diana y la posterior expresión in vivo de dicha
muteína de IL-2 humana codificada por dicho
polinucleótido.
La presente solicitud describe también un
procedimiento para tratar un paciente afligido por una dolencia
tratable con IL-2 administrando una cantidad
terapéuticamente eficaz de una muteína de IL-2
humana numerada de acuerdo con la IL-2 de tipo
salvaje que tiene la actividad que activa blastos PHA pero que tiene
reducida la actividad que activa células NK. Este procedimiento es
aplicable cuando la enfermedad tratable con IL-2 es
VIH, Cáncer, enfermedad autoinmune, enfermedad infecciosa, adyuvante
de la vacuna en la terapia de vacuna del cáncer y vacuna
convencional, para estimulación inmune en los ancianos u otros
inmunocomprometidos, así como en pacientes con SCID humanos, u otras
aplicaciones terapéuticas que requieren la estimulación del sistema
inmune.
Las Figuras 1 a 7 muestran las curvas de
dosis-respuesta de la IL-2 humana de
tipo salvaje (IL-2) y D20H (Fig. 1),
IL-2 y D20I (Fig.2), IL-2 y N88G
(Fig. 3); IL-2 y N88I (Fig. 4), IL-2
y N88R (Fig. 5), IL-2 y Q126E, (Fig. 6), e
IL-2 y Q126L (Fig. 7). A: Dosis respuesta individual
de IL-2 (círculos negros) y muteína (círculos
blancos) en el ensayo de proliferación de células T humanas
primarias (blastos PHA). B: Dosis respuesta individual de
IL-2 (triángulos negros) y muteína (triángulos
blancos en el ensayo de proliferación de células NH humanas
primarias.
Figuras 8A-8D. Se evaluó la
toxicidad de PROLEUKIN^{TM} en chimpancé en dos animales
(X-159, triángulos, y X-124,
cuadrados), en comparación con el vehículo control
(X-126, diamantes). Se evaluó la toxicidad mediante
los parámetros renales (Nitrógeno de Urea en Sangre (BUN), A;
Creatinina, B) y la función hepática (bilirrubina total, C; ALT,
D).
Figura 9. Gráfico del cambio de porcentaje de
peso corporal a lo largo de 30 días. Se midió el peso corporal para
los animales tratados con IL-2/N88R (triángulos),
PROLEUKIN (cuadrados) o vehículo (diamantes) en los días
indicados.
Figuras 10A-10D. Se evaluaron
los linfocitos (A), las glóbulos blancos totales, los neutrófilos
(C), y las plaquetas (D) para los animales tratados con
IL-2/N88R (triángulos), PROLEUKIN (cuadrados) o
vehículo (diamantes) en los días indicados.
Figuras 11A-11D. Se evaluaron el
nitrógeno de urea en sangre (A, BUN), la creatinina (B), el fósforo
(C), y el vacío de aniones (D) para los animales tratados con
IL-2/N88R (triángulos), PROLEUKIN (cuadrados) o
vehículo (diamantes), en los días indicados.
Figuras 12A-12D. Se evaluaron la
bilirrubina total (A), ALT (B), el fibrinógeno (C), y el tiempo de
protombina activado (D) para los animales tratados con
IL-2/N88R (triángulos), PROLEUKIN (cuadrados) o
vehículo (diamantes), en los días indicados.
Figuras 13A-13D. Se evaluaron
los niveles de sodio en sangre (A), el ión cloruro (B), el calcio
(C), y el potasio (D) para los animales tratados con
IL-2/N88R (triángulos), PROLEUKIN (cuadrados) o
vehículo (diamantes), en los días indicados.
Figuras 14A-14C. Se evaluaron
los niveles de albúmina en sangre (A), el hematocrito (B), y la
hemoglobina (C) para los animales tratados con
IL-2/N88R (triángulos), PROLEUKIN (cuadrados) o
vehículo (diamantes), en los días indicados.
Figuras 15A-15C. Se indicó el
efecto de IL-2/N88R (cuadrados), PROLEUKIN
(diamantes), y vehículo (triángulos) para la población total de
células T (A, células CD3+), población de células T CD4+ (B), y la
población de células T CD8+ (C).
Figuras 16A-16C. Se indicó el
efecto de IL-2/N88R (cuadrados), PROLEUKIN
(diamantes), y vehículo (triángulos) para la población total de
células T (A, células CD3+), población de células T CD4+ (B), y la
población de células T CD8+.
Figura 17. Efecto de IL-2/N88R y
PROLEUKIN sobre la activación de las células T con respecto a la
media de la fluorescencia de las células CD25 positivas. Se indicó
el efecto de IL-2/N88R (cuadrados), PROLEUKIN
(diamantes), y el vehículo (triángulos) para la población de células
T CD3+CD4+. Se obtuvieron cantidades insuficientes de células
CD3+CD8+ para evaluar la media de la fluorescencia en esta
población.
\newpage
Figuras 18A-18D. Se indicó el
efecto de IL-2/N88R (cuadrados), PROLEUKIN
(diamantes) y vehículo (triángulos) para la población de células T
CD4+ (A, células CD3+/CD4+), la población de células T CD8+ (B,
células CD3+/CD8+), la población total de células T (C, células
CD3+) y la población de células NK (D, células CD3-/
CD16+).
CD16+).
Figura 19. Gráfico de la metástasis en pulmón
frente a la dosis en ratones tratados con PROLEUKIN (círculos
blancos) o IL-2/N88R (círculos negros). Se contó la
metástasis del pulmón en la conclusión del estudio.
Figura 20. Mapa del plásmido del vector
pBC1IL2SA de IL2N88R.
La acción de IL-2 en las células
T está mediada por la unión con las proteínas del receptor
IL-2. Hay proteínas diferenciadas en la superficie
celular que se unen con IL-2. La primera que se
identificó fue un polipéptido sencillo, denominado
IL-2R\alpha, que es un polipéptido de 55 kD (p55)
que aparece tras la activación de las células T y se denominó
originalmente antígeno Tac (por la activación T).
IL-2R\alpha se une a IL-2 con una
K_{d} de aproximadamente 10^{-8} M, y se conoce también como
receptor IL-2 de "baja afinidad". La unión de
IL-2 con las células que expresan únicamente
IL-2R\alpha, no conduce a ninguna respuesta
biológica detectable.
El segundo receptor IL-2 es un
complejo de unión compuesto por IL-2R\beta e
IL-2R\gamma; IL-2R\gamma, un
polipéptido de 64 kD, se conoce también como la cadena común
\gamma (\gamma_{c}) debido a que ésta se comparte entre
numerosos receptores de citoquinas. IL-2R\beta es
aproximadamente de 70 a 75 kD (denominada de manera diversa p70 o
p75) y es un miembro de la familia del receptor de citoquinas de
tipo I caracterizado por las dos motivos de cisteína/WSXWS.
IL-2R\beta se expresa de manera coordinada con
\gamma_{c}. La afinidad de unión de IL-2 con
IL-2R\beta\gamma_{c} es más alta que con
IL-2R\alpha, con una K_{d} de aproximadamente
10^{-9} M; se conoce también como el receptor IL-2
de "afinidad intermedia". IL-2 provoca
crecimiento de las células que expresan
IL-2R\beta\gamma_{c} produciéndose la
estimulación del crecimiento semimáxima a la misma concentración de
IL-2 que produce la unión semimáxima (es decir, 1 x
10^{-9} M). IL-2R\beta\gamma_{c} es el mismo
complejo receptor de señalización que puede unirse a
IL-15.
El tercer complejo de receptor
IL-2 conocido es el complejo
IL-2R\alpha\beta\gamma_{c}. Las células que
expresan IL-2R\alpha y
IL-2R\beta\gamma_{c} pueden unirse a
IL-2 mucho más estrechamente, con una K_{d} de
aproximadamente 10^{-11} M, y de esta manera se conoce también
como complejo de "alta afinidad". La estimulación del
crecimiento de dichas células se produce a una concentración
similarmente baja de IL-2. Se pueden bloquear la
unión y la estimulación del crecimiento de IL-2
mediante anticuerpos contra IL-2R\alpha,
IL-2R\beta, o \gamma_{c} y de manera más
eficiente, mediante una combinación de anticuerpos contra múltiples
subunidades del receptor. Estas observaciones sugieren que
IL-2R\alpha forma un complejo con
IL-2R\beta\gamma_{c} que aumenta la afinidad
del receptor de señalización por IL-2 y permite por
tanto una señal de crecimiento que se va a liberar a concentraciones
significativamente más bajas de IL-2. Se cree que
IL-2 se une rápidamente en primer lugar con
IL-2R\alpha, y esto facilita la asociación con
IL-2R\beta\gamma_{c}. Las células T en reposo
expresan IL-2R\beta\gamma_{c} pero únicamente
cantidades bajas de IL-2R\alpha; se puede
estimular el incremento de IL-2R\alpha expresado
en la superficie mediante IL-2. Tras la activación
de las células T mediada por el receptor del antígeno,
IL-2R\alpha se expresa rápidamente, reduciendo por
tanto la concentración de IL-2 necesaria para la
estimulación del crecimiento. La unión de IL-2 con
el complejo IL-2R\alpha\beta\gamma_{c} da
como resultado una señal de transducción a través de la vía de
señalización Jak/STAT.
Los inventores han descubierto muteínas de la
IL-2 humana que activan de manera preferente las
células T (blastos PHA; células que expresan el receptor
IL-2R\alpha\beta\gamma de IL-2
de alta afinidad) en relación con las células Asesinas Naturales
(NK) (células que expresan el receptor IL-2R\gamma
del IL-2 de afinidad intermedia). Las muteínas que
sustituyen Asp-20 con Histidina (D20H) o isoleucina
(D20I), Asn-88 con Arginina (N88R), Glicina (N88G),
o Isoleucina (N88I), o Gln-126 con Leucina (Q126L),
o Glutamato (Q126E) presentan de manera inesperada actividad
completa de IL-2 en los blastos PHA, y poca (si
alguna) actividad en las células NK. Los estudios previos de las
muteínas IL-2 humanas se han basado en los sistemas
de análisis célulares murinos, y cuando se han usado células
humanas, no se han utilizado células que expresan únicamente
IL-2R\beta\gamma (tal como las células NK). De
manera adicional, aquellos estudios que utilizan blastos PHA humanos
han demostrado que la sustitución de Asp-20 (con
Leu, Arg, Asp, o Lys; Xu, y col., Eur. Cytokine Netw,
6, 237-244 (1995)) o Gln-126
(con Asp; Buchli y Ciardelli, Arch. Biochem. Biophys,
307(2): 411-415, (1993)) dan como
resultado muteínas de IL-2 humanas que tienen la
actividad gravemente comprometida. Los estudios previos usando
IL-2 murina identificaron muteínas de
IL-2 de ratón con actividades diferentes (Zurawski,
y col., EMBO J, 12, 5113-5119 (1993)), pero ninguna
mutación que diera estos resultados sugiere aquellos identificados
en el trabajo descrito en el presente documento. Las muteínas
IL-2 humanas que contienen mutaciones idénticas en
posiciones sinónimas con las muteínas IL-2 murinas
no presentan actividades similares, y sugieren, por tanto, que los
ejemplos de murina no son predictivos de la funcionalidad humana.
Los inventores no conocen estudios de las muteínas de
IL-2 humanas que comparen las actividades relativas
en células humanas que expresan el receptor
IL-2R\alpha\beta\gamma de IL-2
(por ejemplo, blastos PHA) en relación con las que expresan el
receptor IL-2R\beta\gamma de
IL-2 (por ejemplo, células NK). Se espera que el
análisis in vivo confirme que las muteínas descritas tendrán
un índice terapéutico mejorado sobre IL-2 humana de
tipo salvaje mediante la reducción de la toxicidad, proporcionando
de esta manera compuestos terapéuticamente útiles para el
tratamiento de los trastornos que requieren la estimulación del
sistema
inmune.
inmune.
\newpage
La interleuquina 2 (IL-2) está
actualmente en uso clínico para el tratamiento del cáncer renal
metastático. Sin embargo, su grave toxicidad ha limitado su uso a
únicamente un subconjunto de los pacientes más sanos, y se supone
que la toxicidad que limita la dosis compromete su eficacia global.
Se ha propuesto que la toxicidad aguda de IL-2 está
mediada a través de la activación de las células NK, mientras que la
eficacia está mediada a través de la activación directa de las
células T (Jacobson, y col., Proc Natl Acad Sci USA (Estados
Unidos), Sep 17, 1996, 93(19), p.
10405-10410; Smith KA, Blood, 1993,
81(6), p. 1414-1423; Kaplan, y col.,
Biotechnology, 10(2), p. 157-162). Las
células T expresan un receptor diferente para IL-2
del de las células NK (células T:
IL-2R\alpha\beta\gamma, el receptor
IL-2 de alta afinidad; células NK:
IL-2R\beta\gamma, el receptor
IL-2 de afinidad intermedia). Las muteínas de
IL-2 humanas descritas en el presente documento
activan de manera selectiva el receptor IL-2 de las
células T y no el receptor IL-2 de las células
NK.
Se ha utilizado la terapia de dosis baja con
IL-2 para evitar la activación de las células NK con
cierto éxito (Jacobson, y col. (1996). Proc Natl Acad Sci USA
A 93: 10405-10410). Esta estrategia incorpora
el concepto de que a dosis bajas de IL-2, únicamente
se activará el receptor IL-2 de alta afinidad con la
exclusión del receptor IL-2 de afinidad intermedia.
La forma del receptor IL-2 de afinidad intermedia,
IL-2R\beta\gamma, se expresa en las células NK,
mientras que las células T expresan la forma de alta afinidad,
IL-2R\alpha\beta\gamma.
Sin embargo, los inventores solucionaron el
problema de la toxicidad desde un ángulo diferente. Se teorizó la
interrupción de las interacciones de IL-2 con
IL-2R\beta y/o IL-2R\gamma,
mediante la modificación apropiada de los restos de unión específica
en la superficie de unión de IL-2 para evitar la
unión eficaz (y de esta manera la activación) con las células que
expresan únicamente IL-2R\beta\gamma. Sin
embargo, en las células que expresan
IL-2R\alpha\beta\gamma, se producirá la unión
inicial con IL-2R\alpha, y de esta manera, la
unión con la célula, y de tal manera, la terapia de dosis baja
sugerida por Jacobs y col., puede manifestar todavía efectos
secundarios tóxicos. En virtud de la unión con
IL-2R\alpha, se puede producir el reclutamiento
eficaz de IL-2R\beta e
IL-2R\gamma en la superficie de las células a
pesar de las interacciones desequilibradas de la
IL-2 modificada con IL-2R\beta y/o
IL-2R\gamma. Se puede formar de esta manera un
complejo IL-2/
IL-2R\alpha\beta\gamma de señalización
competente. Se cree que un variante de IL-2 capaz de
activar de manera selectiva los receptores IL-2 de
alta afinidad en las células T con preferencia, frente a los
receptores IL-2 de afinidad intermedia en las
células NK puede tener un índice terapéutico aumentado sobre
IL-2 de tipo salvaje debido a un perfil de toxicidad
reducido. Un variante IL-2 con un índice terapéutico
aumentado podría tener un intervalo de uso significativamente
expandido en el tratamiento del cáncer (como terapia directa y/o
adjunta) y la inmunodeficiencia (por ejemplo, VIH y tuberculosis).
Otros usos potenciales de IL-2 se derivan de su
actividad inmunoestimuladora, e incluyen además el tratamiento
directo del cáncer, la inmunodeficiencia, tal como pacientes VIH o
SCID humano; enfermedad infecciosa, tal como tuberculosis; como un
adyuvante en estrategias de "vacuna del cáncer"; y para las
indicaciones de estimulación del sistema inmune, tales como la
mejora de los protocolos de vacunación convencionales o para el
tratamiento de los ancianos.
La sustitución apropiada en
Asp-20, Asn-88, o
Gln-126 redujo las interacciones de unión para
IL-2R\beta (Asp-20 y
Asn-88) o IL-2R\gamma
(Gln-126). El efecto neto de dichas sustituciones
dio como resultado muteínas de IL-2 que mantuvieron
la actividad en células T humanas, y tienen actividad reducida en
células NK humanas.
Como no fue posible predecir el resultado de una
sustitución dada antes de la evaluación en los ensayos de células T
y NK, todas las sustituciones posibles de aminoácidos naturales
(excepto Cys) se hicieron en las posiciones Asp-20,
Asn-88 y Gln-126, y un limitado pero
diverso conjunto de mutaciones se hicieron en la posición
Asp-84 para ensayar si interaccionaban por tanto con
IL-2R\beta. Podrían ensayarse mutaciones
adicionales en la posición Asp-84 si se observaron
efectos sobre las interacciones IL-2R\beta
aparentes. Se presentan en la Tabla 1, más abajo, los datos para
cuarenta y seis sustituciones distintas en aquellas posiciones.
Se introdujeron las mutaciones usando
mutagénesis dirigida a sitio en el ADNc de IL-2
humana de tipo salvaje. Se subclonaron los clones correctos en un
vector de expresión adecuado para la expresión en un sistema
heterólogo (por ejemplo, E. coli, baculovirus, células de
levadura o mamífero tales como, por ejemplo, células de Ovario de
Hámster Chino (CHO)). Se ensayaron las proteínas purificadas en
ensayos de proliferación de células T (Blasto PHA) y proliferación
de células NK. Las diferentes respuestas generadas entre estos
ensayos por las muteínas individuales, es decir, DE_{50}, indican
mutaciones que efectúan estas actividades. De manera específica, las
muteínas que estimulan una respuesta relativamente fuerte en el
ensayo de los blastos PHA (células T) (frente a la
IL-2 de tipo salvaje) en comparación con la
respuesta en el ensayo de células NK (frente a la
IL-2 de tipo salvaje) sugerirán sustituciones que
proporcionen especificidad celular basada en la capacidad de las
muteínas específicas para unirse y activar el
IL-2R\alpha\beta\gamma expresado en estas
células, pero incapaces de unirse, y de esta manera no activar, las
células que expresan únicamente
IL-2R\beta\gamma. Las muteínas de
IL-2 que presentan esta propiedad poseerán de esta
manera las propiedades inmunoestimuladoras in vivo de
IL-2 con la toxicidades asociadas a la terapia de
IL-2 de pérdida vascular e hipotensión
reducidas.
Tal como se usa en el presente documento,
"IL-2 de tipo salvaje" significa
IL-2, ya sea nativa o recombinante, que tienen la
secuencia de 133 aminoácidos que se producen normalmente en la
IL-2 humana nativa (menos el péptido señal,
constituido por 20 aminoácidos N-terminales
adicionales), cuya secuencia de aminoácidos se describe en Fujita,
y col., PNAS USA, 80, 7437-7441
(1983), con o sin una Metionina N-terminal
adicional, que se incluye de manera necesaria cuando se expresa la
proteína como una fracción intracelular en E. coli.
Tal como se usa en el presente documento,
"muteína de IL-2" significa un polipéptido en
el que se han hecho las sustituciones específicas en la proteína de
interleuquina-2 madura humana. La Tabla 1, más
abajo, describe las 46 sustituciones individuales de muteínas de
IL-2 hechas, y sus correspondientes datos de
actividad relativa. Las formas de realización preferidas incluyen
aquellas muteínas que tienen al menos 100 veces de actividad
relativa. Las formas de realización particularmente preferidas
incluyen las siguientes, que presentan una actividad relativa mayor
de 100 veces: resto (D) aspartato (Asp) en la posición 20
("D20"), cuando se nombra de acuerdo con IL-2
de tipo salvaje, está sustituida por isoleucina, ("D20I") o
Histidina ("D20H"); el resto asparagina (Asn) en la posición 88
(N88), ha sido sustituido por Isoleucina (N88I), Glicina (N88G), o
Arginina (N88R); y el resto glutamina (Gln) en la posición 126
(Q126) ha sido sustituido por Leucina (Q126L) o Glutamato (Q126E) o
aspartato (Q126D). Las muteínas de IL-2 preferidas
tienen una secuencia de aminoácidos idéntica a la de la
IL-2 de tipo salvaje, en los otros restos no
sustituidos. Sin embargo, las muteínas de IL-2 de
esta invención se caracterizan también por inserciones, deleciones,
sustituciones y modificaciones de aminoácidos en uno o más sitios en
o en los otros restos de la cadena del polipéptido
IL-2 nativo. De acuerdo con esta invención,
cualquiera de dichas inserciones, deleciones, sustituciones y
modificaciones pueden dar como resultado una muteína de
IL-2 que retiene una actividad selectiva de los
blastos PHA a la vez que tiene una capacidad reducida para activar
las células NK, y entra dentro del alcance de esta patente.
Combinar las sustituciones preferidas o
particularmente preferidas descritas anteriormente en una única
molécula IL-2 recombinante puede dar como resultado
combinaciones mutantes que tienen actividad similar a la descrita en
el presente documento para los mutantes únicos. Por ejemplo, se
puede esperar que una molécula de IL-2 que tiene una
combinación de dos o más mutaciones seleccionadas de la Tabla 1
puede dar como resultado un agonista de IL-2
selectivo de Células T con actividad relativa similar a la actividad
relativa de las sustituciones únicas descritas en el presente
documento. Las combinaciones mutantes entran dentro del espíritu y
el alcance de la presente invención.
Se prefieren las modificaciones y sustituciones
conservadoras y otras posiciones de IL-2 (es decir,
aquellas que tienen un efecto mínimo sobre la estructura secundaria
o terciaria de la muteína). Dichas sustituciones conservadoras
incluyen aquellas descritas por Dayhoff en The Atlas of Protein
Sequence and Structure 5 (1978), y por Argos en EMBO J,.
8:779-785 (1989). Por ejemplo, los
aminoácidos que comienzan con uno de los siguientes grupos
representan cambios conservadores:
- -
- ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr;
- -
- cys, ser, tyr, thr;
- -
- val, ile, leu, met, ala, phe;
- -
- lys, arg, his;
- -
- phe, tyr, trp, his; y
- -
- asp, glu.
Se prefieren también las modificaciones o
sustituciones que no introducen sitios para entrecruzamientos
intermoleculares adicionales o formación de enlaces disulfuro
incorrectos. Por ejemplo, se sabe que IL-2 tiene
tres restos cys, en las posiciones 58, 105 y 125 de la secuencia
madura de tipo salvaje.
De esta manera la presente invención se refiere
a
Una muteína de IL-2 humana
numerada de acuerdo con la IL-2 de tipo salvaje que
tiene una sustitución de aminoácido en una de las posiciones 20, 88,
y 126 en la que la sustitución en la posición 20 no incluye
arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico,
glicina, leucina, lisina, fenilalanina, prolina, treonina, o
triptófano; la sustitución en la posición 88 no incluye asparagina,
ácido aspártico, cisteína, glutamina, triptófano, o prolina; la
sustitución en la posición 126, no incluye ácido aspártico, alanina,
histidina, triptófano, cisteína, glutamina, ácido glutámico, o
lisina; y por tanto, dicha muteína de IL-2 activa de
manera preferente las células T frente a las células Asesinas
Naturales.
Se prefiere una muteína de IL-2,
en la que la posición 20 está sustituida por un aminoácido
seleccionado entre el grupo constituido por: alanina, histidina,
isoleucina, metionina, glutamina, serina, valina, y tirosina, y por
tanto, dicha muteína activa de manera preferente las células T
frente a las células Asesinas Naturales.
También se prefiere una muteína de
IL-2, en la que la posición 88 está sustituida por
un aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por: alanina,
arginina, ácido glutámico, histidina, lisina, leucina, fenilalanina,
glicina, isoleucina, metionina, serina, treonina, tirosina, y
valina, por tanto, dicha muteína activa de manera preferente las
células T frente a las células Asesinas Naturales.
Más preferida es una muteína de
IL-2, en la que la posición 88 está sustituida por
arginina. También se prefiere una muteína de IL-2,
en la que la posición 126 está sustituida por un aminoácido
seleccionado entre el grupo constituido por: asparagina, leucina,
prolina, fenilalanina, glicina, isoleucina, metionina, arginina,
serina, treonina, tirosina, y valina, por tanto, dicha muteína
activa de manera preferente las células T frente a las células
Asesinas Naturales.
La invención también se refiere a una
composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéutico y la
muteína de IL-2 humana tal como se ha definido
anteriormente, por la que, dicha composición activa de manera
preferente las células T frente a las células Asesinas
Naturales.
La invención se refiere de manera adicional a la
muteína de IL-2 humana numerada de acuerdo con la
IL-2 de tipo salvaje que tiene sustituciones en dos
de las posiciones 20, 88, y 126, en la que dicha sustitución en la
posición 20 no incluye arginina, asparagina, ácido aspártico,
cisteína, ácido glutámico, glicina, leucina, lisina, fenilalanina,
prolina, treonina, o triptófano; dicha sustitución en la posición 88
no incluye asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina,
triptófano, o prolina; y dicha sustitución en la posición 126 no
incluye ácido aspártico, alanina, histidina, triptófano, cisteína,
glutamina, ácido glutámico, o lisina; y por tanto, dicha muteína de
IL-2 activa de manera preferente las células T
frente a las células Asesinas Naturales.
La invención incluye de manera adicional un
polinucleótido que comprende una secuencia de ADN que codifica la
muteína de IL-2 tal como se ha definido
anteriormente, un vector que comprende el polinucleótido y una
célula eucariota aislada transformada con dicho polinucleótido y
también una célula procariota transformada con dicho
polinucleótido.
"Numerada de acuerdo con la
IL-2 de tipo salvaje" significa identificar un
aminoácido escogido con referencia a la posición en la que se
produce normalmente el aminoácido en la secuencia madura de la
IL-2 de tipo salvaje. Cuando se hacen inserciones o
deleciones en la muteína de IL-2, una persona
experta en la técnica apreciará que la Asp que se produce
normalmente en la posición 20 puede cambiarse de posición en la
muteína. Sin embargo, puede determinarse fácilmente la localización
de la Asp cambiada mediante inspección y correlación de los
aminoácidos flanqueantes con aquellos flanqueantes de Asp en la
IL-2 de tipo salvaje.
La expresión "tipos de células que tienen el
receptor IL-2R\alpha\beta\gamma" significa
las células conocidas por tener este tipo de receptor, es decir, las
células T, las células T activadas, las células B, los monocitos
activados, y las células NK activadas. La expresión "tipos de
células que tienen el receptor
IL-2R\beta\gamma" significa las células
conocidas que tienen este tipo de receptor, es decir, las células B,
los monocitos restantes, y las células NK restantes.
Se pueden producir las muteínas de
IL-2 de la presente invención mediante cualquier
procedimiento adecuado conocido en la técnica. Dichos procedimientos
incluyen construir una secuencia de ADN que codifica las muteínas de
IL-2 de esta invención y expresar aquellas
secuencias en un huésped transformado adecuado. El procedimiento
producirá las muteínas recombinantes de esta invención. Sin embargo,
se pueden producir también las muteínas de esta invención, no
obstante de forma menos preferible, mediante síntesis química o una
combinación de síntesis química y tecnología de ADN recombinante.
Los procedimientos de producción discontinua o producción mediante
perfusión están generalmente comprendidos entre las habilidades de
la técnica. Véase Freshey, R. I (ed), ``Animal Cell Culture:
A Practical Approach 2ª ed., 1992, IRL Press, Oxford, Inglaterra;
Mather, J. P. "Laboratory Scale up of Cell Cultures
(0,5-50 liters)", Methods Cell Biology,
57:219-527 (1998); Hu, W. S., y Aunins, J.
G., "Large-scale Mammalian Cell Culture",
Curr Opin Biotechnol, 8:148-153
(1997); Konstantinov, K. B., Tsai, Y., Moles, D., Matanguihan, R.,
"Control of long-term perfusion Chinese hamster
ovary cell culture by glucose auxostat", Biotechnol Prog,
12:100-109 (1996).
En una forma de realización de un procedimiento
recombinante para producir una muteína de esta invención se
construyó una secuencia de ADN aislando o sintetizando una secuencia
de ADN que codifica la IL-2 de tipo salvaje y
cambiando a continuación el codón para Asp20 por un codón para
isoleucina (I) mediante mutagénesis dirigida a sitio. Esta técnica
es bien conocida. Véase, por ejemplo, Mark y col.,
"Site-specific Mutagénesis Of The Human Fibroblast
Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,
pp. 5662-66 (1984); y la Patente de los Estados
Unidos Nº 4.588.585, incorporada en el presente documento por
referencia.
Otro procedimiento para construir una secuencia
de ADN que codifique las muteínas IL-12 de esta
invención podría ser la síntesis química. Esta incluye por ejemplo
la síntesis directa de un péptido, mediante medios químicos, de la
secuencia de proteína que codifica una muteína de
IL-2 que presenta las propiedades descritas en la
invención. Este procedimiento puede incorporar aminoácidos naturales
y no naturales en las posiciones que afectan las interacciones de
IL-2 con IL-2R\beta e
IL-2R\gamma. De manera alternativa, se puede
sintetizar un gen que codifica la muteína de IL-2
deseada mediante medios químicos usando un sintetizador de
oligonucleótidos. Dichos oligonucleótidos se diseñan en función de
la secuencia de aminoácidos de la proteína IL-2
deseada, y de manera preferible, seleccionando aquellos codones que
están favorecidos en la célula huésped en la que se producirá la
muteína recombinante. A este respecto, es bien reconocido que el
código genético está degenerado - que un aminoácido puede estar
codificado por más de un codón. Por ejemplo, Phe (F) es codificado
por dos codones, TTC o TTT, Tyr (Y) es codificado por TAC o TAT e
his (H) es codificado por CAC o CAT. Trp (W) es codificado por un
codón único, TGG. De acuerdo con esto, se apreciará que para una
secuencia de ADN dada que codifica una muteína de
IL-2 concreta, existirán muchas secuencias
degeneradas de ADN que codificarán esta muteína de
IL-2. Por ejemplo, se apreciará que de manera
adicional a la secuencia de ADN preferida para la muteína D20I que
se muestra en la SEC DE ID N: 1, existirán muchas secuencias de ADN
degenerado que codifiquen la muteína de IL-2 que se
muestra. Estas secuencias de ADN degenerado se consideran dentro del
alcance de esta invención. Por tanto, "variantes degeneradas de la
misma" en el contexto de esta invención significa todas las
secuencias de ADN que codifican y por tanto permiten la expresión de
una muteína concreta.
\newpage
La secuencia de ADN que codifica la muteína de
IL-2 de esta invención, ya se prepare mediante
mutagénesis dirigida a sitio, síntesis química u otros
procedimientos, puede o no puede incluir también secuencias de ADN
que codifican una secuencia señal. Dicha secuencia señal, si está
presente, deberá ser una reconocida por la célula escogida para la
expresión de la muteína de IL-2. Puede ser
procariota, eucariota, o una combinación de las dos. Puede ser
también la secuencia señal de la IL-2 nativa. La
inclusión de una secuencia señal depende de cómo se desea segregar
la muteína de IL-2 a partir de las células
recombinantes en las que se fabrica. Si las células que se escogen
son procariotas, se prefiere generalmente que la secuencia de ADN no
codifique una secuencia señal. Si las células escogidas son
eucariotas, se prefiere generalmente que se codifique una secuencia
señal y de manera más preferible que la que se use sea la secuencia
señal de la IL-2 de tipo salvaje.
Se pueden aplicar procedimientos convencionales
para sintetizar un gen que codifica una muteína de
IL-2 de acuerdo con esta invención. Por ejemplo, se
puede usar la secuencia completa de aminoácidos para construir un
gen retrotraducido. Se puede sintetizar un oligómero de ADN que
contenga una secuencia de nucleótidos que codifique la muteína de
IL-2. Por ejemplo, se pueden sintetizar diversos
oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido
deseado y a continuación ligarse. Los oligonucleótidos individuales
contienen normalmente proyecciones 5' o 3' para un ensamblaje
complementario.
Una vez ensamblado (mediante síntesis,
mutagénesis dirigida a sitio u otro procedimiento), las secuencias
de ADN que codifican una muteína de IL-2 de esta
invención se insertarán en un vector de expresión y se conectarán de
manera operativa con una secuencia control de la expresión apropiada
para la expresión de la muteína de IL-2 en el
huésped transformado deseado. El ensamblaje apropiado puede ser
confirmado por la secuenciación de nucleótidos, el cartografiado de
restricción, y la expresión de un polipéptido biológicamente activo
en un huésped adecuado. Como es bien conocido en la técnica, con el
fin de obtener altos niveles de expresión de un gen transfectado en
un huésped, el gen deberá conectarse de manera operativa a las
secuencias de control de la expresión transcripcionales y
traduccionales que son funcionales en el huésped de expresión
escogido.
La elección de la secuencia control de la
expresión y el vector de expresión dependerán de la elección del
huésped. Se puede emplear una amplia variedad de combinaciones
huésped/vector de expresión. Los vectores de expresión útiles para
los huéspedes eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que
comprenden las secuencias control de la expresión de SV40, el virus
del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de
expresión útiles para los huéspedes bacterianos incluyen plásmidos
bacterianos conocidos, tales como plásmidos de E. coli, que
incluyen col EI, pCR1, pER32z, pMB9 y sus derivados, plásmidos con
una gama de huéspedes más amplia, tales como RP4, ADN de fagos, los
numerosos derivados del fago lambda, por ejemplo, NM989, y otros ADN
de fagos, tales como M13 y ADN de fagos filamentosos de cadena
sencilla. Los vectores de expresión útiles para las células de
levadura incluyen el plásmido 2 \mu y los derivados del mismo. Los
vectores útiles para las células de insecto incluyen pVL 941. Se
prefiere pFastBac^{TM} 1(GibcoBRL, Gaithersburg, MD): Cate
y col., "Isolation OF The Bovine And Human Genes For
Mullerian Inhibiting Substance And Expression OF The Human Gene In
Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-98
(1986).
De manera adicional, se puede usar cualquiera de
una amplia variedad de secuencias control de la expresión en estos
vectores. Dichas secuencias control de la expresión útiles incluyen
las secuencias control de la expresión asociadas con genes
estructurales de los vectores de expresión anteriores. Los ejemplos
de las secuencias control de la expresión útiles incluyen, por
ejemplo, los promotores temprano y tardío del SV40 o el adenovirus,
el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el operador
principal y las regiones del promotor del fago lambda, por ejemplo,
PL, las regiones control de la proteína de la envuelta fd, el
promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa u otros
enzimas glicolíticos, los promotores de la fosfatasa ácida, por
ejemplo, PhoA, los promotores del sistema
\alpha-apareado de la levadura, el promotor
poliédrico de Baculovirus, y otras secuencias conocidas por
controlar la expresión de los genes de las células procariotas o
eucariotas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos.
Se puede usar cualquier huésped adecuado para
producir las muteínas de IL-2 de esta invención, que
incluyen bacterias, hongos (incluyendo levaduras), plantas,
insectos, mamíferos, u otras células o líneas celulares animales
apropiadas, así como animales no humanos o plantas transgénicas. De
manera más particular, estos huéspedes pueden incluir huéspedes
eucariotas y procariotas bien conocidos, tales como cepas de E.
coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hogos, levaduras,
células de insectos tales como Spodoptera frugiperda (Sf9),
células animales tales como células de ovario de hámster Chino (CHO)
y células de ratón tales como NS/O, células de mono verde Africano
tales como COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 y BNT 10, y células humanas,
así como células de plantas en cultivo de tejidos. Para la expresión
celular animal, se prefieren las células CHO y células COS 7 en
cultivos y particularmente la línea celular de CHO, CHO (DHFR-) o la
línea HKB.
Se deberá entender por supuesto que no todos los
vectores y las secuencias de control de la expresión funcionarán
igualmente bien para expresar las secuencias de ADN descritas en el
presente documento. Tampoco todos los huéspedes funcionaran
igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, una
persona experta en la técnica puede llevar a cabo una selección
entre estos vectores, las secuencias control de la expresión y los
huéspedes sin experimentación indebida. Por ejemplo, al seleccionar
un vector, deberá considerarse el huésped debido a que el vector
debe replicarse en él. Deberán considerarse también el número de
copias del vector, la capacidad de controlar el número de copias, y
la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector,
tal como los marcadores de antibióticos. Por ejemplo, los vectores
preferidos para uso en esta invención incluyen aquellos que permiten
que el ADN codifique las muteínas de IL-2 que se van
a amplificar en un número de copias. Se conocen bien en la técnica
dichos vectores amplificables. Incluyen, por ejemplo, los vectores
capaces de ser amplificados mediante amplificación DHFR (véase,
Kaufman, Patente de los Estados Unidos 4.470.461, Kaufman y Sharp,
"Construction Of A Modular Dihidrafolate Reductase cDNA Gene:
Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol.
Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)) o amplificación
de la glutamina sintetasa ("GS") (véase, por ejemplo, la
Patente de los Estados Unidos 5.122.464, y la Solicitud Europea
publicada 338.841).
Al seleccionar una secuencia control de la
expresión, deberán considerarse también una variedad de factores.
Estos incluyen, por ejemplo, la fuerza relativa de la secuencia, su
controlabilidad, y su compatibilidad con la secuencia de ADN real
que codifica la muteína de IL-2 de esta invención,
de manera particular con respecto a las estructuras secundarias
potenciales. Deberán seleccionarse los huéspedes considerando a su
compatibilidad con el vector escogido, la toxicidad del producto
codificado por las secuencias de ADN de esta invención, sus
características de secreción, su capacidad para plegar los péptidos
de manera correcta, sus necesidades de fermentación o cultivo, y la
facilidad de purificación de los productos codificados por las
secuencias de ADN.
Dentro de estos parámetros, una persona experta
en la técnica puede seleccionar diversas combinaciones de
vector/secuencia control de la expresión/huésped que expresarán las
secuencias de ADN deseado en la fermentación o en cultivos animales
a gran escala, usando, por ejemplo, células CHO o COS 7.
Las muteínas de IL-2 obtenidas
de acuerdo con la presente invención pueden ser glicosiladas o no
glicosiladas dependiendo del organismo huésped usado para producir
la muteína. Si se eligen bacterias elegidas como huésped, entonces,
la muteína de IL-2 producida no se glicosilará. Las
células eucariotas, por otra parte, glicosilarán las muteínas de
IL-2, aunque quizás no de la misma forma en la que
se glicosila la IL-2 nativa. Se puede purificar la
muteína de IL-2 producida por el huésped
transformado de acuerdo con cualquier procedimiento adecuado. Se
conocen diversos procedimientos para purificar IL-2.
Véase, por ejemplo, Current Protocols in Protein Science, Vol
2. Eds: John E. Coligan, Ben M. Duna, Hidde L. Ploehg, David W.
Speicher, Paul T. Wingfield, Unidad 6,5 (Copyright 1997, John Wiley
and Sons, Inc). Se prefiere volver a plegar a partir de los cuerpos
de inclusión generados en E. coli, o a partir del medio
condicionado de cultivos de mamífero o levadura que producen una
muteína dada usando intercambio catiónico, filtración en gel, y o
cromatografía líquida en fase inversa. Véase los Ejemplos 1 (E.
coli) y 10 (perfusión de células CHO) a continuación.
Se puede evaluar la actividad biológica de las
muteínas de IL-2 de esta invención por cualquier
procedimiento adecuado conocido en la técnica. Dichos ensayos
incluyen proliferación de blastos PHA y proliferación de células NK.
Se confirmarán las muteínas de actividad apropiada, es decir,
completamente activas en
IL-2R\alpha\beta\gamma, con actividad reducida
en células que portan IL-2R\beta\gamma, usando
los dos ensayos. La "actividad relativa" de una muteína se mide
con respecto a la IL-2 de tipo salvaje, y como se
describe de manera adicional en los ejemplos, es la relación de la
actividad de proliferación de los blastos PHA a la proliferación de
las células NK.
La muteína de IL-2 de esta
invención se administrará a una dosis aproximadamente paralela que o
mayor que la empleada en terapia con la IL-2 nativa
de tipo salvaje o recombinante. Se administra de manera preferible
una cantidad eficaz de la muteína de IL-2. Una
"cantidad eficaz" significa una cantidad capaz de prevenir o
disminuir la gravedad o propagación de la dolencia o indicación que
está siendo tratada. Será evidente para aquellas personas expertas
en la técnica que la cantidad eficaz de muteína de
IL-2 dependerá, inter alia, de la enfermedad,
la dosis, el calendario de administración de la muteína de
IL-2, si la muteína de IL-2 se
administra sola o en conjunción con otros agentes terapéuticos, la
semivida en suero de la composición, y la salud general del
paciente.
La muteína de IL-2 se administra
de manera preferible en una composición que incluye un vehículo
farmacéuticamente aceptable. "Vehículo farmacéuticamente
aceptable" significa un vehículo que no produce ningún efecto
desfavorable en los pacientes a los que se administra. Se conocen
bien en la técnica dichos vehículos farmacéuticamente aceptables. Se
prefiere HSA al 2%/PBS a pH 7,0.
Se pueden formular las muteínas de
IL-2 de la presente invención en composiciones
farmacéuticas mediante procedimientos bien conocidos. Véase, por
ejemplo, Remington's pharmaceutical Science por E. W. Martin,
incorporada en el presente documento por referencia, que describe
las formulaciones adecuadas. Se puede formular la composición
farmacéutica de la muteína de IL-2 en una variedad
de formas, que incluyen la líquida, en gel, liofilizada, o cualquier
otra forma adecuada. La forma preferida dependerá de la indicación
concreta que está siendo tratada y será evidente para una persona
experta en la técnica.
Se puede administrar la composición farmacéutica
de la muteína de IL-2 por vía oral, por aerosol, por
vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, o
subcutánea o en cualquier otra manera aceptable. La vía de
administración preferida dependerá de la indicación concreta que
está siendo tratada y será evidente para una persona experta en la
técnica. Se puede administrar la composición farmacéutica de la
muteína de IL-2 en conjunción con otros agentes
terapéuticos. Se pueden incorporar estos agentes como parte de la
misma composición farmacéutica o se pueden administrar de manera
separada de la muteína de IL-2, bien de manera
concurrente o de acuerdo con cualquier otro calendario de
tratamiento aceptable. De manera adicional, se puede usar la
composición farmacéutica de la muteína de IL-2 como
un adjunto a otras terapias.
De acuerdo con esto, esta invención proporciona
composiciones y procedimientos para el tratamiento del VIH, Cáncer,
enfermedad autoinmune, enfermedad infecciosa, adyuvante de la vacuna
en la vacuna del Cáncer y terapia de vacuna convencional, para la
estimulación inmune en los ancianos u otros individuos
inmunocomprometidos, así como en pacientes con SCID humanos, u otra
aplicación terapéutica que requiera la estimulación general del
sistema inmune en cualquier animal adecuada, de manera preferible un
mamífero, de manera más preferible un ser humano. Como se ha
señalado anteriormente en la sección de Antecedentes,
IL-2 tiene muchos efectos. Algunos de estos son la
estimulación de los blastos PHA, las células T latentes, las células
B, los monocitos, y las células NK, etc.; las muteínas descritas en
el presente documento tendrán actividades en los tipos de células
que expresan únicamente el receptor IL-2 de alta
afinidad, tal como las células T latentes, pero no el receptor
IL-2 de afinidad intermedia, tales como células NK o
monocitos.
También se contempla el uso de las secuencias de
ADN que codifican las muteínas de IL-2 de esta
invención en aplicaciones de terapia génica. Las aplicaciones de
terapia génica contempladas incluyen el tratamiento de aquellas
enfermedades en las que se espera que IL-2
proporcione una terapia eficaz debido a su actividad de células T,
por ejemplo, HIV, Cáncer, enfermedad autoinmune, enfermedad
infecciosa, adyuvante de la vacuna en la vacuna del cáncer y terapia
de vacuna convencional, para la inmunoestimulación en los ancianos o
inmunocomprometidos de cualquier otra manera, así como en pacientes
con SCID humanos, y en enfermedades que responden de cualquier otra
forma a IL-2 o los agentes infecciosos sensibles a
la respuesta inmune mediada por IL-2.
La liberación local de muteínas de
IL-2 usando terapia génica puede proporcionar el
agente terapéutico al área diana. Se contemplan metodologías de
terapia génica in vitro e in vivo. Se conocen diversos
procedimientos para transferir genes potencialmente terapéuticos a
poblaciones celulares definidas. Véase, por ejemplo,
Mulligan, "The Basic Science Of Gene Therapy",
Science, 260:926-31 (1993): Estos
procedimientos incluyen:
1) Transferencia directa del gen. Véase, por
ejemplo, Wolff y col., "Direct Gene transfer Into Mouse
Muscle In Vivo", Science, 247;
1465-68 (1990);
2) Transferencia de ADN mediada por liposomas.
Véase, por ejemplo, Caplen y col.,
"Liposome-mediated CFTR Gene Transfer To The Nasal
Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis", Nature Med.,
3: 39-46 (1995); Crystal, "The Gene
As A Drug", Nature Med., 1: 25-17
(1995); Gao y Huang; "A Novel Cationic Liposome Reagent For
Efficient Transfection OF Mammalian Cells", Biochem. Biophys.
Res. Comm., 179:280-85 (1991);
3) Transferencia de ADN mediada por retrovirus.
Véase, por ejemplo, Kay y col., "In Vivo Gene
Therapy Of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor
IX-Deficient Dogs", Science, 262:
117-119 (1993); Anderson, "Human Gene Therapy",
Science, 256:808-813 (1992)
4) Transferencia de ADN mediada por virus.
Dichos virus de ADN incluyen adenovirus (de manera preferible,
vectores basados en Ad-2 o Ad-5),
herpes virus (de manera preferible, vectores basados en el virus del
herpes simplex), y parvovirus (de manera preferible, vectores
basados en parvovirus "defectuosos" o no autónomos, de manera
más preferible, vectores basados en virus
adeno-asociados, lo más preferible, vectores basados
en AAV-2). Véase, por ejemplo, Ali y col., "The
USE OF DNA Virases As Vectors For Gene Therapy", Gene
Therapy, 1: 367-84 (1994); Patente de los
Estados Unidos 4.797.368 incorporada en el presente documento como
referencia, y patente de los Estados Unidos 5.139.941, incorporada
en el presente documento como referencia.
La elección de un sistema vector particular para
transferir el gen de interés dependerá de una variedad de factores.
Un factor importante es la naturaleza de la población de células
diana. Aunque se han estudiado y usado de manera extensiva los
vectores retrovíricos en numerosas aplicaciones de terapia génica,
estos vectores son generalmente inadecuados para infectar las
células que no se dividen. De manera adicional, los retrovirus
tienen el potencial de la oncogenicidad.
Los adenovirus tienen la ventaja de que tienen
un amplio intervalo de huéspedes, puede infectar células inactivas o
terminalmente diferenciadas, tales como neuronas o hepatocitos, y
parecen esencialmente no oncogénicos. Véase, por ejemplo, Ali y
col., más arriba, p. 367. Los adenovirus no parecen integrarse
en el genoma huésped. Debido a que existen extracromosómicamente, el
riesgo de mutagénesis insercional está muy reducido. Ali y
col., más arriba, p.373.
Los virus adeno-asociados
presentan ventajas similares a los vectores basados en adenovirus.
Sin embargo, los AAV presentan integración específica de sitio en el
cromosoma humano 19. Ali y col., más arriba, p. 377.
Puede usarse el ADN que codifica la muteína de
IL-2 de esta invención en terapia génica para
enfermedades de inmunodeficiencia tales como VIH; enfermedades
infecciosas tales como tuberculosis; y cánceres, tales como
carcinoma renal.
De acuerdo con esto, se proporciona la terapia
génica con ADN que codifica las muteínas de IL-2 de
esta invención a un paciente en necesidad de la misma, concurrente
con, o de manera inmediata tras el diagóstico.
Esta solución tiene la ventaja de la actividad
selectiva de las muteínas de IL-2 de esta invención
para prevenir la toxicidad indeseada y los acontecimientos adversos.
El técnico experto apreciará que se puede usar cualquier vector de
terapia génica adecuado que contenga el ADN de la muteína de
IL-2 de acuerdo con esta forma de realización. Se
conocen las técnicas para construir dicho vector. Véase, por
ejemplo, Anderson, W. F., Human Gene Therapy, Nature,
392, 25-30 (1998); Verma, I. M., y Somia, N.,
Gene Therapy - Promises, Problems, and Prospects, Nature,
389, 239-242 1998). Se puede llevar a cabo la
introducción del vector que contiene el ADN de la muteína de
IL-2 en el sitio diana usando técnicas
conocidas.
Se generaron las muteínas mediante mutagénesis
dirigida a sitio usando cebadores que contenían los codones
correspondientes a la mutación deseada esencialmente tal como se
describe por KunkeI TA, Roberts JD, y Zakour RA, "Rapid and
efficient site-specific mutagenesis without
phenotypic selection" (1987), Methods Enzymol 154:
367-382. De manera breve, se subclonó el ADNc de la
IL-2 humana que contiene los sitios de los enzimas
de restricción Bam HI y Xba I en el vector M13 mp19 del fago M13
(New Englands Biolabs, Beverly, MA) usando los mismos sitios. Se
obtuvo el ADNc de la IL-2 de tipo salvaje usando la
Reacción en Cadena de la Polimerasa ("PCR") a partir de una
agrupación de ADNc generada a partir del ARNm aislado de linfocitos
de sangre periférica humana inducidos 24 horas con
12-miristato 13-acetato de forbol
(10 ng/ml): Los cebadores PCR usados fueron, para el extremo 5' del
marco de lectura abierto de IL-2,
| 5'-CCT CAA CTC CTG AAT TCA TGT ACA GGA TGC-3' | (SEC DE ID Nº: 3); |
Y para el extremo 3' del marco de lectura
abierto de IL-2
| 5'-GGA AGC GGA TCC TTA TCA AGT CAG TGT TGA G-3' | (SEC DE ID Nº: 4). |
Se incorporaron los sitios de los enzimas de
restricción Eco RI (extremo 5') y Bam HI (extremo 3')
en cada oligonucleótido y se indicaron por cursiva. Las condiciones
PCR usadas fueron 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 58,7ºC, y 1 minuto a
72ºC durante 25 ciclos. Se confirmo la secuencia de ADNc de
IL-2 obtenida de esta manera mediante secuenciación
usando el kit de secuenciación Sequenase ® (Amersham Life Sciences,
Arlington Heights, IL) tal como describe el fabricante. Se obtuvo
una cadena de ADN sencilla que contenía uracilo
(U-ADN) transformando la cepa de E. coli
CJ236 (Bio-Rad Laboratorios, Hercules, CA) con ADNc
de IL-2 que contenía M13 mp19. Se utilizó la
mutagénesis dirigida a sitio en los cebadores generales que
contenían 15 nucleótidos homólogos al molde de U-ADN
5' en el(los) codón(es) diana para la mutagénesis, los
nucleótidos que incorporan el cambio deseado, y 10 nucleótidos
adicionales homólogos al molde de
U-ADN-3' del último nucleótido
alterado. En primer lugar, se usó la mutagénesis dirigida a sitio
para introducir un sitio de restricción Nco I en el inicio de
la secuencia madura de la IL-2 humana. El uso de
este sitio de restricción incorpora un resto metionina
N-terminal que dirigirá la expresión en el espacio
citoplásmico de E. coli usando por ejemplo, el vector de
expresión pET3d. El cebador usado para este objetivo fue:
| 5'-GCA CTT GTC ACA AAC ACC ATG GCA CCT ACT TCA AGT-3' | (SEC DE ID Nº: 5) |
Los cebadores específicos usados para incorporar
las mutaciones en las posiciones D20, N88, y Q126 fueron:
| D20X: | 5'-GGA GCA TTT ACT GCT GNN NTT ACA GAT G-3' | (SEC DE ID Nº: 6) |
| N88X: | 5'-GGG ACT TAA TCA GCN NNA TCA ACG TAA TAG-3' | (SEC DE ID Nº: 7) |
| Q126X: | 5'-GGA TTA CCT TTT GTN NNA GCA TCA TCT C-3' | (SEC DE ID Nº: 8) |
en los que NNN se sustituyó por un
codón apropiado para la Histidina (CAC) o Isoleucina (ATC) (en la
posición D20), arginina (CTG), glicina (GGY), o isoleucina (ATC) (en
la posición N88), o leucina (CTG) (en la posición Q126). Otras
mutaciones utilizaron una estrategia similar y un codón apropiado
para una mutación dada. Se fosforilaron los cebadores usando T4
polinucleótido quinasa (New England Biolabs, Beverly, MA) usando el
protocolo del fabricante. Tras reasociar el cebador al molde de
U-ADN y extender la T7 ADN polimerasa
(Bio-Rad laboratorios, Hercules, CA), se
transformaron las células de la cepa DH5\alpha^{TM} de E.
coli (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) con 5 \mul de la mezcla de
reacción y se colocaron en placas en medio LB que contenía agar al
0,7%. Tras la incubación a 37ºC, se expandieron las placas
escogiendo una placa única y trasladándola a 2 ml de medio LB y se
cultivaron durante la noche a 37ºC. Se aisló el ADN de cadena
sencilla usando un kit de purificación M13 (Quiagen, Inc.,
Chatsworth, CA) según el protocolo del fabricante, y se
identificaron los clones que contenían la mutación deseada
secuenciando el ADN de cadena sencilla usando el kit de
secuenciación Sequenase ® (Amersham Life Sciences, Arlington
Heights, IL) según el protocolo del fabricante. Se aisló el ADN de
la Forma Replicativa del ADNc de la muteína de IL-2
que correspondía a las placas que contenían la secuencia mutada
correcta usando NcoI y Xba I, y se subclonaron en el
vector plásmido pET3a (Stratagene, San Diego, CA) (Strat). Se
transformó la cepa BL21 de E. coli con el vector pET3a que
contenía la muteína, y se hizo crecer hasta un ABS_{280} de entre
0,60 y 1,0, en cuyo momento se añadió IPTG 0,4 mM para inducir la
producción de muteína de
IL-2.
Se cosecharon las células tres horas después de
la inducción mediante centrifugación a 10.000 X g. Se
renaturalizaron y purificaron las muteínas de IL-2
recombinantes dispersando en primer lugar las células en 10
volúmenes (vol./masa húmeda) de tampón de sacarosa/Tris/EDTA
sacarosa 0,375 M, Tris/HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM). Se sonicaron
las células dispersadas 3 veces a 300 w con intervalos de descanso
de 30 segundos en un baño de hielo, usando un sonicador Missonix
modelo XL2020 equipado con una sonda convencional de 1 pulgada
(2,54 cm). A continuación se centrifugó el material sonicado a
17.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Se lavó el sedimento, que
debería ser de color blanco en este punto, mediante resuspensión y
centrifugación una vez en tampón de sacarosa/Tris/EDTA, dos veces
con tampón Tris/EDTA (Tris/HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM), y
finalmente se resuspendió en 10 volúmenes de Tampón Tris/HCl 0, 1 M,
pH 8,0 (se toma la muestra en este punto para el análisis del gel) y
se centrifugó durante 20 minutos a 17.000 x g.
Se disolvió el sedimento añadiendo 3 volúmenes
de cloruro de guanidinio 8 M en Tris 01 M/HCl (pH 8,0) y
2-mercaptoetanol al 0,1% (vol/vol). Tras la
incubación durante 2 horas a temperatura ambiente, se centrifugó la
muestra durante 20 minutos a 17.000 x g. Se dializó la solución
resultante durante aproximadamente 20 horas frente a 20 volúmenes de
Tris/CCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM a 4ºC. Se centrifugó la solución a
17.000 x g durante 20 minutos, se ajustó con ácido trifluoroacético
al 0,1%, y se filtró en una unidad de filtrado de 0,22 micrómetros.
Se transfirió la solución de manera inmediata a una botella
siliconizada y se cargó sobre una columna C8 (Vydac 208TP54). Se
purificaron las muteínas de IL-2 usando un gradiente
lineal de 20 minutos usando acetonitrilo al 40-85%
en TFA al 0,1%. Se determinó la concentración de la proteína eluida
mediante A280 y análisis de aminoácidos. A continuación se
introdujeron partes alícuotas de proteína en tubos siliconizados
(100 mL) y se almacenó a -20º . La muteína purificada de esta manera
fue típicamente una banda única tal como se observó mediante
SDS-PAGE (tinción de plata), y se cuantificó
mediante el análisis de aminoácidos (precisión típica > 90%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) a partir de aproximadamente 100 mL de sangre
humana normal (Irwin Memorial Blood Bank, San Francisco, CA), se
diluyeron en 1:2 de solución salina tamponada con sulfato de
Dulbecco fría (libre de Ca^{2+} y Mg^{2+}; DPBS). Se colocó una
capa inferior de Ficoll - Paque (Pharmacia) y se centrifugó la
muestra para aislar las PBMC, seguido por lavados a fondo en DPBS
frío. Se generaron los blastos PHA (células T activadas) volviendo a
suspender la células en RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al
10% (Hyclone), al cual se añadió un 1% (p/v) de cada uno de los
siguientes: L-glutamina; aminoácidos no esenciales;
piruvato de sodio, y antibiótico-antimicótico (medio
RPMI) en una densidad de 1 x 10^{6} células/ml. Se añadió
fitohemaglutanina (PHA-P; Sigma) a una concentración
final de 10 \mug/ml, y se incubaron las células a 37ºC, CO_{2}
al 5% durante 3 días. Se cosecharon las células y se lavaron dos
veces en DPBS, se volvieron a suspender en medio RPMI y se colocaron
en placas de fondo plano de 96 pocillos a una densidad de 1 X
10^{5} células/pocillo en 200 \mul con concentraciones variables
de IL-2 o muteína en medio RPMI. Se incubaron las
placas durante 48 h a 37ºC, se pulsaron con 1 \muCi de
^{3}H-timidina (DuPont NEN ®, Boston, MA)/pocillo
durante 6 h, se cosecharon, y se midió la radiactividad tras
cosechar las células sobre filtros de fibra de cristal.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron células mononuclerares de sangre
periférica (PBMC) a partir de aproximadamente 100 mL de sangre
humana normal (Irwin Memorial Blood Bank, San Francisco, Ca)
diluidas 1:2 de solución salina tamponada con sulfato de Dulbecco
fría (libre de Ca^{2+} y Mg^{2+}; DPBS). Se colocó una capa
inferior de Ficoll - Paque (Pharmacia) y se centrifugó la muestra
para aislar las PBMC, seguido por lavados a fondo en DPBS frío. Se
separaron las células NK de las otras células. El kit de aislamiento
de células NK Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania; cat nº
465-01) es el preferido para este objetivo. El kit
está constituido por dos reactivos, columnas de separación y un
soporte de columna magnética muy poderoso. El primer reactivo es un
cóctel de anticuerpos monoclonales CD3, CD4, CD19, CD33 conjugados
con hapteno del isotipo IgG1 de ratón. Esto es para separar las PBMC
de las células T, las células B y las células mieloides. Se prevé
que se pueda usar cualquier conjunto adecuado de anticuerpos que
reconozca estos tipos de células. El segundo reactivo está
constituido por microperlas MAC súper-paramagnéticas
coloidales conjugadas con un anticuerpo
anti-hapteno. se volvieron a suspender las células
en PBS con albúmina de suero bovino al 0,5% y EDTA 2 mM (PBS/EDTA).
El volumen de la suspensión es dependiente del número de células
usadas y se proporciona en una tabla por Miltenyi Biotec.
Normalmente, con un número de células de 2 a 5 x 10^{8} PBMC, se
vuelven a suspender las células en 800 \muL del tampón y a
continuación se usan 200 \muL de cada reactivo. Tras la incubación
con los reactivos, se añadieron las células a la columna (se
volvieron a suspender en 2 mL de tampón): Las células
no-NK se adhieren al imán (se separaron) y se
aislaron y recogieron las células NK en el flujo que atraviesa la
columna. Se lavaron las células, se volvieron a suspender en medio
RPMI (contiene: RPMI 1640, al cual se añadió un 1% de cada uno de
los siguientes: L-glutamina; aminoácidos no
esenciales, piruvato de sodio;
antibiótico-antimicótico (todos de Gibco/BRL,
Gaithersburg, MD), suero bovino fetal al 10% (Hyclone)), y se
colocaron en placas de fondo plano de 96 pocillos a una densidad de
1 X 10^{5} células/pocillo en 200 \mul. Se cosecharon las
células y se lavaron dos veces en DPBS, se volvieron a suspender en
medio RPMI y se colocaron en placas de fondo plano de 96 pocillos a
una densidad de 1 X 10^{5} células/pocillo en 200 \mul con
concentraciones variables de IL-2 o muteína en medio
RPMI. Se incubaron las placas durante 48 h a 37ºC, se pulsaron con 1
\muCi de ^{3}H-timidina (DuPont NEN ®, Boston,
MA)/pocillo durante 6 h, se cosecharon y se midió la radiactividad
tras cosechar las células sobre filtros de fibra de vidrio.
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Se generaron las muteínas usando la mutagénesis
dirigida a sitio (Kunkel y col (1987), Methods Enzymol, 154:
367-382) en las posiciones Asp-20,
Asp-84, Asn-88, y
Gln-126, y se expresaron en E. coli usando el
sistema de expresión pET-3A tal como se describe por
el fabricante (Stratagene). Se purificaron las muteínas mediante la
recuperación de los cuerpos de inclusión en
guanidina-HCl, se volvieron a plegar, y se
cromatografiaron usando HPLC, tal como se ha descrito anteriormente.
La proteína resultante apareció con > de un 95% de pureza
mediante la SDS-PAGE teñida con plata, y se analizó
para la concentración y pureza mediante el análisis de aminoácidos
(precisiones de AAA normalmente > del 90%). Se confirmaron las
muteínas que tenían actividad apropiada en la secuencia usando un
análisis de espectrometría de masas. Se evaluaron las muteínas
purificadas de esta manera en los ensayos de células T y NK
anteriormente descritos. Se indican en la Tabla 1 las actividades
relativas de las muteínas de IL-2 en los ensayos de
células T y NK.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se describen las actividades de las muteínas en
términos de concentración relativa de muteína necesaria para
proporcionar una respuesta máxima del 50% (DE_{50}) en comparación
con la DE_{50} de la IL-2 de tipo salvaje en el
mismo ensayo; en el caso de ensayos múltiples sobre la misma
muteína, se relaciona la media geométrica de los valores. Los
valores DE_{50} para la IL-2 de tipo salvaje
oscilan entre aproximadamente 10 pM y 150 pM en el ensayo de células
T, y aproximadamente 50 pM y aproximadamente 200 pM en el ensayo de
células NK. La relación de la actividad de las muteínas de las
células T frente a las células NK se expresa como actividad relativa
de la muteína en las células T dividida entre la actividad relativa
de la muteína sobre las células NK. Se determina esta relación para
cada muteína usando únicamente la actividad determinada a partir de
ensayos dados de células T y NK usando células a partir de un
donante único.
Se pueden clasificar las actividades de las
muteínas en 6 amplias categorías: 1) selectividad de 1000 veces de
las células T; 2) selectividad entre 100 pero < de 1000 veces de
las células T; 3) selectividad entre 10 pero < de 100 veces de
las células T; 4) actividad mejorada en relación con
IL-2 en las células T; 5) selectividad de las
células NK; 6) selectividad de 10 veces para cualquiera de las
células T o NK.
Clase 1: D20H, I e Y; N88G, I, y R.
Clase 2: D20K, L, M, N, Q, y S; N88M y T; Q126D,
E, G, L, y V.
Clase 3: D20R; N88A, E, F, S, y V; Q126F, I, N,
R y S.
Clase 4: D20I; N88G; Q126E, L, M, N, y R.
Clase 5: Q126A, H.
Clase 6: D20A, T, y V; N88H, K, L, W e Y; Q126K,
P, T, W, e Y.
Dentro de las clases 1-3, las
muteínas preferidas son aquellas que presentan actividad casi
IL-2 de tipo salvaje o mejor en las células T. En la
Clase 1, éstas incluyen D20H e I; N88G, I, y R; en la Clase 2,
estas incluyen N88M y T, Q126D, E, G, L, y V; en la Clase 3, estas
incluyen N88A, Q126F y G. Se predice que las muteínas de la Clase 4
tienen mayor potencia que la IL-2 de tipo salvaje
in vivo.
Se puede ver a partir de la Tabla 1 que ninguna
mutación única produjo una muteína de IL-2 inactiva
en ambos ensayos. Sin embargo, se puede derivar que una combinación
de mutaciones que produce una actividad gravemente comprometida a
partir de dos posiciones diferentes podría potencialmente dar como
resultado un antagonista de la actividad de IL-2 en
las células T, u otros tipos celulares que portan receptores
IL-2 de alta afinidad que porta los tipos de
células. Se predijo dicho antagonista a partir de estos datos, ya
que se han diseñado las mutaciones para alterar únicamente las
interacciones con IL-2R\beta e ILR2\gamma. Uno
de dichos ejemplos podría ser la muteína doble D20R/Q126T. Se
predijo que la combinación de mutaciones débilmente activas en una
molécula, es combinatoria en la naturaleza, esto es, D20R tiene una
actividad de 0,00018 en las células T, Q126T tiene una actividad de
0,0001 en las células T, y podría esperarse que la muteína doble
D20R/Q126T tenga la actividad de 0,000000018 de la
IL-2 de tipo salvaje en las células T. Se pueden
derivar otras combinaciones a partir de los datos
proporcionados.
Las Figuras 1 a 7 muestran la curvas de
dosis-respuesta de la IL-2 de tipo
salvaje humana (IL-2) y D20H (Fig. 1),
IL-2 y D20I (Fig. 2), IL-2 y N88G
(Fig. 3), IL-2 y N88I (Fig. 4), IL-2
y N88R (Fig. 5), IL-2 y Q126E (Fig. 6), e
IL-2 y Q126L (Fig. 7). A: dosis respuesta individual
de IL-2 (círculos negros) y muteína (círculos
blancos) en el ensayo de proliferación de células T humanas
primarias (blastos PHA). B: Dosis respuesta individual de
IL-2 (triángulos cerrados) y muteína (triángulos
blancos) en el ensayo de proliferación de células NK humanas
primarias.
De manera particular con respecto a la Fig. 1,
para el experimento que se muestra, la dosis de IL-2
de tipo salvaje proporciona un 50% de proliferación máxima
(DE_{50}) es aproximadamente 1,5 X 10^{-10} M para el ensayo de
las células T (A) y aproximadamente 1 X 10^{-10} M para las
células NK (B). La DE_{50} para D20H fue aproximadamente 2 X
10^{-10} M en este ensayo de células T, pero se estimó que era
> 1 x 10^{-5} M en este ensayo de células NK. La mejora neta en
la actividad de las células T de D20H sobre la actividad de las
células NK es de esta manera > de 50.000 veces tal como se
determinó para este ensayo. Se obtuvieron resultados similares con
sangre de donantes adicionales (no se muestran los datos).
De manera particular con respecto a la Fig. 2,
para el experimento que se muestra, la dosis de IL-2
de tipo salvaje proporciona un 50% de proliferación máxima
(DE_{50}) es aproximadamente 1,5 X 10^{-10} M para las células T
(A) y aproximadamente 3 X 10^{-10} para el ensayo de células NK
(B). La DE_{50} para D20I fue también aproximadamente de 1,5 X
10^{-10} M en este ensayo de células T, pero se estimó en sólo
aproximadamente 5 X 10^{-6} M en este ensayo de células NK. La
mejora neta en la actividad de las células T de D20I sobre la
actividad de las células NK es de esta manera aproximadamente 16,000
veces tal como se determinó para este ensayo. Se obtuvieron
resultados similares con sangre de donantes adicionales (no se
muestran los datos).
De manera particular con respecto a la Fig. 3,
para el experimento que se muestra, la dosis de IL-2
de tipo salvaje proporciona un 50% de proliferación máxima
(DE_{50}) es aproximadamente 4 X 10^{-11} M para las células T
(A) y aproximadamente 2 X 10^{-10} M para el ensayo de las células
NK (B). La DE_{50} para N88G fue aproximadamente 5 X 10^{-12} M
en este ensayo de células T, pero se estimó en sólo aproximadamente
3 X 10^{-8} M en este ensayo de células NK. La mejora neta en la
actividad de las células T de N88G sobre la actividad de las células
NK es de esta manera aproximadamente 1.200 veces tal como se
determinó por este ensayo. Se obtuvieron resultados similares con
sangre de donantes adicionales (no se muestran los datos).
De manera particular con respecto a la Fig. 4,
para el experimento que se muestra, la dosis de IL-2
de tipo salvaje proporciona un 50% de proliferación máxima
(DE_{50}) es aproximadamente 1,5 X 10^{-10} M para las células T
(A) y aproximadamente 1 X 10^{-10} M para el ensayo de células NK
(B). La DE_{50} para N88I fue aproximadamente 10^{-10} M en este
ensayo de células T, pero se estimó en sólo aproximadamente 5 X
10^{-6} en este ensayo de células NK. La mejora neta en la
actividad de las células T de N88I sobre la actividad de las células
NK es de esta manera aproximadamente 18.00 veces tal como se
determinó por este ensayo. Se obtuvieron resultados similares con
sangre de donantes adicionales (no se muestran los datos).
De manera particular con respecto a la Fig. 5,
para el experimento que se muestra, la dosis de IL-2
de tipo salvaje proporciona un 50% de proliferación máxima
(DE_{50}) es aproximadamente 1,5 X 10^{-10} M para las células T
(A) y aproximadamente 1 X 10-10 para el ensayo de
células NK (B). La DE_{50} para N88R fue aproximadamente 9 X
10^{-11} M en este ensayo de células T, pero se estimó en sólo
aproximadamente 3 X 10^{-7} M en este ensayo de células NK. La
mejora neta en la actividad de las células T de N88R sobre la
actividad de las células NH es de esta manera aproximadamente 500
veces tal como se determinó para este ensayo. Se obtuvieron
resultados similares con sangre de donantes adicionales (no se
muestran los datos).
De manera particular con respecto a la Fig. 6,
para el experimento que se muestra, la dosis de IL-2
de tipo salvaje proporciona un 50% de proliferación máxima
(DE_{50}) es aproximadamente 8 X 10^{-12} M para las células T
(A) y aproximadamente 5 X 10^{-11} M para el ensayo de células NK
(B). La DE_{50} para Q126E fue aproximadamente 8 X 10^{-13} M en
este ensayo de células T, pero se estimó en sólo aproximadamente 2 X
10^{-9} en este ensayo de células NK. La mejora neta en la
actividad de las células T de Q126E sobre la actividad de las
células NK es de esta manera aproximadamente 400 veces tal como se
determinó para este ensayo. Se obtuvieron resultados similares con
sangre de donantes adicionales (no se muestran los datos).
De manera particular con respecto a la Fig. 7,
para el experimento que se muestra, la dosis de IL-2
de tipo salvaje proporciona un 50% de proliferación máxima
(DE_{50}) es aproximadamente 5 X 10^{-11} M para las células T
(A) y aproximadamente 8 X 10^{-11} para el ensayo de células NK
(B). La DE_{50} para Q126L fue aproximadamente 2 X 10^{-11} M en
este ensayo de células T, pero se estimó en sólo aproximadamente 2 X
10^{-8} M en este ensayo de células NK. La mejora neta en la
actividad de las células T de Q126L sobre la actividad de las
células K es de esta manera aproximadamente 625 veces tal como se
determinó para este ensayo. Se obtuvieron resultados similares con
sangre de donantes adicionales (no se muestran los datos).
Se seleccionó IL-2/N88R a partir
de las proteínas mutantes de IL-2 de la Tabla I
debido a su actividad agonista selectiva de las células T demostrada
en ensayos de células T y NK humanas primarias. En relación con la
IL-2 de tipo salvaje, es aproximadamente 6000 veces
mas activa en las células T que en las células NK, y presenta
actividad esencialmente equivalente a la de la IL-2
de tipo salvaje en las células T. Se produjo
IL-2/N88R en células CHO, se purificó, y se evaluó
en un modelo de chimpancé de actividad y toxicidad de
IL-2. En este modelo in vivo, se presentó una
actividad en las células T comparable a la de un variante
recombinante de IL-2 comercialmente disponible
(PROLEUKIN^{TM}), Chiron Corporation, Emeryville, CA), aunque, en
comparación, indujo sólo unos efectos secundarios suaves (ambas en
términos de parámetros objetivos y clínicos)
La porción in vivo del estudio tuvo lugar
en el New Iberia Research Center (New Iberia, LA, Sponsor Bayer
Corporation, Berkeley, CA) e implicó dos fases de estudios y 11
chimpancés machos de jóvenes adultos a adultos con pesos corporales
que oscilaban entre aproximadamente 45 y 70 kg.
La fase I del estudio fue una fase de
determinación de la dosis e implicó liberar una dosis subcutánea de
un vehículo o una dosis subcutánea de PROLEUKIN a 1,2 mg/m^{2},
dos veces diarias (BID) durante 5 días. La Fase II del estudio es
una comparación del vehículo, PROLEUKIN, e IL/N88R proporcionados
por vía subcutánea, cada 12 horas (q12h) durante 5 días. Se
seleccionó la dosis de IL-2/N88R para proporcionar
una exposición comparable a PROLEUKIN basándose en el análisis
farmacocinético. Se tomaron muestras de sangre para los análisis de
la química de la sangre, CBC, hematología/coagulación, y análisis
FACS de las poblaciones de células T y NK tal como se detalla en las
Secciones 5 y 6.
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\vskip1.000000\baselineskip
En los días de estudio en los que se obtuvo la
sangre, los animales se anestesiaron completamente usando ketamina
IM a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg antes de la
administración del artículo de ensayo o vehículo. En los días de
estudio en los que no se requirió muestreo de sangre, se contuvo
físicamente a los animales usando una jaula de contención antes de
la administración del artículo de ensayo o vehículo. Se administró
la dosis mediante inyección subcutánea cada 12 horas durante 5 días,
y se cortó el pelo del lugar de la inyección en el Día 1 del
estudio. Se registró para cada dosis el lugar y el momento de la
dosificación.
\vskip1.000000\baselineskip
(a) Observaciones diarias y consumo de
alimentos. Se observó cada animal dos veces diarias y se informó
de cualquier observación anormal al Director del Estudio. Se informó
al Director del Estudio, el Veterinario del Proyecto y el
Representante del Patrocinador de los animales que parecían
enfermos. Se confirmó el consumo de alimento y se registró dos veces
diarias mediante observación visual.
(b) Pesos corporales. Se tomaron los
pesos corporales antes del estudio, antes de dosificar en el día 1,
y cada vez que se sedaron los animales para la recogida de
sangre.
(c) Observación de los lugares de la
inyección. Se observaron diariamente los lugares de la
inyección. Se registró cualquier apariencia anormal tal como
enrojecimiento o hinchazón.
\vskip1.000000\baselineskip
(a) Químicas del suero. Se recogieron
muestras de aproximadamente 2 ml de sangre de cada animal en tubos
sin anticoagulante en los momentos puntuales especificados
anteriormente. Se documentaron los tiempos de recogida de muestras y
se dejó coagular la sangre a temperatura ambiente. A continuación se
centrifugaron las muestras, se separó el suero y se envió al NIRC
Clinical Pathology Laboratory. Se incluye en la Tabla 4 el panel de
química del suero estándar del NIRC:
(b) Hematología. Se recogieron muestras
de aproximadamente 2 ml de sangre de cada animal en tubos con EDTA
en los momentos puntuales anteriormente especificados y se mandaron
al NIRC Clinical Pathology laboratory. Se llevó a cabo el panel de
hematología estándar del NIRC, incluyendo el recuento completo de la
sangre, el diferencial, y el recuento de plaquetas, sobre todas las
muestras.
(d) Ensayos del patrocinador. Se
recogieron muestras de aproximadamente 6 ml de sangre con EDTA como
anticoagulante en los momentos especificados anteriormente. Se
documentaron los momentos de la recogida de sangre. Se centrifugaron
las muestras, se separó y se introdujeron partes alícuotas del
plasma en tres tubos separados. Se almacenó congelado el plasma
(-60ºC o por debajo) y se envió por correo a la Bayer Corporation,
Berkeley, CA, tan pronto como el estudio estuvo completo.
(a) Procedimiento. Se recogió una muestra
de aproximadamente 5 ml de sangre en anticoagulante de heparina de
sodio en los momentos especificados por el análisis FACS.
Se obtuvo un espécimen de sangre completa en
EDTA, ACD o heparina. Se ajustaron los números de células para estar
en el intervalo de 2 a 20000 por mm^{3}.
Se marcaron de manera apropiada tubos de
plástico o vidrio de 12 x 75 para el panel de anticuerpos que se
está llevando a cabo. Se añadieron el anticuerpo o el cóctel de
anticuerpos a los tubos siguiendo los volúmenes sugeridos por el
fabricante.
Se añadieron 100 \mul por tubo de espécimen de
sangre mezclada y se incubó la mezcla durante 30 min a temperatura
ambiente, protegida de la luz.
Tras la incubación, se añadieron 2 ml de
solución de lisado (solución de lisado FACS de marca Becton
Dickinson, BDnº 92-0002), se agitó en vórtice
suavemente la mezcla y se dejó en reposo durante 10 minutos a
temperatura ambiente. A continuación se centrifugaron los tubos a
temperatura ambiente durante 5 minutos a 300 x g. Se decantaron los
sobrenadantes, se hizo desaparecer el exceso de líquido y se añadió
1 ml de tampón PBS (GIBCO 14190-144) a cada
sedimento celular. Después de agitar en vórtice suave, se
centrifugaron los tubos a temperatura ambiente durante 5 min a 300 X
g. Se decantaron los sobrenadantes y se hizo desaparecer el exceso
de líquido antes de añadir 1 ml de solución fijadora (solución de
formaldehído al 0,5%, preparada diluyendo 1:20 de formaldehído al
10% (Polyscience, Inc. Nº 0418) con tampón PBS) sobre el sedimento
celular y agitando en vórtice suavemente para la resuspensión. A
continuación se analizaron las muestras en un Coulter EPICS SL Flor
Cytometer.
Anticuerpos usados para el estudio: MIgG1/MIgG1
isotipo control (Becton Dickinson, Cat. Nº 349526),
CD45-PerCP (Becton Dickinson, Cat. Nº 347464),
CD8-FITC (Becton Dickinson, Cat. Nº 347313),
CD25-PE (Becton Dickinson, Cat. Nº 30795X),
CD4-FITC (Becton Dickinson, Cat. Nº 340133),
CD16-PE (Pharmingen, Cat. Nº 347617),
CD3-PerCP (Becton Dickinson, Cat, Nº 347344).
Se recogió una muestra de sangre completa de
aproximadamente 2 ml en tubos en los que se añadió citrato de sodio
como anticoagulante en los momentos puntuales especificados
anteriormente. El perfil de coagulación estuvo constituido por el
Tiempo de Protrombina (PT), el Tiempo de Tromboplastina Parcial
Activada (APTT) y el Fibrinógeno.
El objeto primario de esta fase fue identificar
una dosis óptima de PROLEUKIN por comparación con
IL-2/N88R. Se pretendió que esta dosis óptima de
PROLEUKIN fuera una dosis tolerable (inferior que la dosis máxima
tolerada) que tuviera idealmente una significación clínica, pero con
una toxicidad moderada y reversible. Se determinó la BID, una dosis
de PROLEUKIN de 1,2 mg/m^{2}, como la dosis inicial basada en la
extrapolación de especies cruzadas basada en regímenes de dosis
clínicas de PROLEUKIN, sus toxicidades correspondientes, y los
resultados de dosis-respuesta de PROLEUKIN en mono
cynomolgus estabulado.
Se trataron dos chimpancés de esta manera con
PROLEUKIN. Estos animales cada vez fueron menos activos, estaban
cada vez más agotados y deshidratados durante el curo de la
dosificación. Ambos animales desarrollaron síntomas
gastrointestinales graves que comenzaron en los días 3 ó 4,
incluyendo apetito reducido, diarrea y vómitos. Se interrumpió la
dosificación de un animal (número X-159) después de
3 días de dosificación debido a disfunción renal grave (Figura
8A&B) y hepática moderada (Figura 8C&D) reflejada en las
químicas de la química de la sangre. Éstas incluyen elevaciones del
nitrógeno de la urea en sangre (BUN), creatinina, y bilirrubina
total, ALT (SGPT). Se administró solución de Ringer lactada por vía
intravenosa a ambos animales tratados con PROLEUKIN en los días 3 y
4 (animal X-159) y únicamente en el día 4 (animal
X-124) como resucitación o para evitar la
deshidratación adicional. Se retiró el animal número
X-159 del estudio en el día 8 debido a la disfunción
renal y a un posible trombo en la pierna derecha tal como se indicó
por un pulso muy mínimo (femoral), y la pantorrilla completa estuvo
fría e hinchada. Aunque se observó toxicidad significativa en un
animal, el otro animal experimentó acontecimientos menos graves y el
perfil de acontecimientos adversos para ambos animales fue
reversible. Basándose en esto, se determinó que una q12h de 1,2
mg/m^{2} de PROLEUKIN y la dosis equivalente (en función de la
exposición) de IL-2/N88R era un régimen de dosis
apropiado para comparar estos dos compuestos.
Observaciones clínicas. La Tabla 5
relaciona las observaciones clínicas hechas durante el estudio. Se
informan los valores en una escala de 0 a 5, en la que 5 es grave.
Todos los animales tratados con PROLEUKIN estuvieron gravemente
enfermos; hubo un tratamiento con PROLEUKIN asociado con muerte. Los
valores informados después del día 6 para el grupo del PROLEUKIN
reflejan los datos de los dos animales restantes. El efecto
secundario más obvio del tratamiento con IL-2/N88R
parece ser la perturbación GI suave (emesis) aunque el tratamiento
indujo toxicidad nominal en los términos de los parámetros indicados
en la Tabla 4. El peso corporal del grupo de PROLEUKIN disminuyó en
un 6% en el día 6 y cayó tan bajo como un 10% en el día 10 y se
recuperó lentamente posteriormente (véase la Figura 9). Por
contraste, IL-2/N88R y los grupos vehículo tienen
meramente un 1-3% de pérdida de peso como
máximo.
(a) Hematología. IL2-N88R
indujo efectos celulares coherentes con la activación de PROLEUKIN,
de manera concreta linfocitosis (Figura 10A), y se observaron
también aumento en las glóbulos blancos de la sangre (Figura 10B) y
neutrófilos (Figura 10C). IL2-N88R indujo únicamente
una trombocitopenia marginal (nadir de aproximadamente 50%) durante
la porción de tratamiento del estudio (Figura 10D)
(b) Función renal. Los niveles de BUN
fueron marcadamente más altos en los animales tratados con Proleukin
en los días 6 y 8 (Figura 11A). Los niveles de BUN fueron más de 130
mg/dL en dos de estos animales; los niveles de creatinina aumentaron
también espectacularmente en los dos animales en los días 6 y 8
(Figura 11B) indicando una desaparición completa de la función
renal. De manera adicional, el fósforo del suero y el vacío de
aniones también aumentaron en el grupo tratado con PROLEUKIN en los
días 6 y 8. Por contraste, en todos los animales con
IL2-N88R, estos parámetros renales permanecieron
básicamente normales a lo largo del estudio (Figura 11C&D).
(c) Función hepática. La bilirrubina
total llegó a más del triple en el grupo del PROLEUKIN en el día 6 y
permaneció alta hasta el día 10 (Figura 12A). En contraste,
únicamente un animal en el grupo de IL2-N88R tuvo un
incremento menor transitorio en los días 3 y 6. El nivel de SGPT del
suero se elevó espectacularmente y alcanzó sobre 100 U/L en todos
los animales con PROLEUKIN en el día 6 (Figura 12B). El nivel de
SGPT en el animal número A199 alcanzó 651 U/L, y el SGOT 2789 U/L
(Lab Note Book: NIRC nº 8754-9852 - Fase II, Valores
Químicos Medios Individuales y de Grupo, página 17 de 21 de la
tabla) indicando una insuficiencia hepática grave.
(d) Coagulación. El nivel de Fibrinógeno
alcanzó más del doble en los grupos de PROLEUKIN e
IL2-N88R y alcanzó el pico en el día 6 (Figura 12C).
El incremento parece suceder más pronto en el grupo de PROLEUKIN que
en los animales de IL2-N88R. Esto se reflejó por un
incremento del 51% frente al 5% en el día 3. Los cambios en el
fibrinógeno pueden ser un resultado de la respuesta aguda de la
proteína, en lugar de un defecto en la coagulación, ya que no hubo
cambios significativos en APTT o PT de acuerdo con esto durante el
mismo período de tiempo (Figura 12D). Sin embargo, al inicio del día
10, el nivel de APTT en los animales con PROLEUKIN mostró una
tendencia al alza obvia aunque el valor absoluto permaneció dentro
del intervalo normal. La misma tendencia, aunque en una extensión
inferior, se observó también en el grupo con
IL2-N88R. De manera interesante, sin embargo, el
nivel de fibrinógeno pareció caer durante el mismo período de tiempo
de acuerdo con esto en ambos grupos.
(e) Homeostasis. Los niveles de sodio en
suero disminuyeron hasta por debajo de 135 MEQ/L en dos de los tres
animales con PROLEUKIN en el día 8, pero permanecieron normales en
el resto de animales (Figura 13A). Los niveles de cloruro en el
grupo de PROLEUKIN se redujeron también hasta por debajo de 95 MEQ/L
comenzando en el día 3 y permaneciendo bajos hasta el día 15 (Figura
13B). El nivel de calcio fue inferior en dos de los tres animales
con PROLEUKIN en los días 6 y 8, y alcanzó un nivel tan bajo como
4,9 y 3,2 mg/dL en el animal A199 (Figura 13C). El nivel de potasio
disminuyó hasta por debajo de 2MEQ/L entre los días 3 y 12 en todos
los animales tratados con PROLEUKIN excepto en el animal A199 cuyo
nivel de potasio aumentó de hecho hasta un nivel tóxico de 7,2 MEQ/L
antes de ser retirado del estudio (Figura 13D).
(f) Signos de pérdida vascular. El nivel
de albúmina en suero disminuyó en los grupos tratados con PROLEUKIN
(37%) e IL2-N88R (19%) (Figura 14A). Se observó un
aumento en el nivel del hematocrito en el grupo tratado con
PROLEUKIN en los días 3 y 6 (Figura 14B). Por contraste, los niveles
del hematocrito en los grupos de vehículo control e
IL2-N88R disminuyeron durante el mismo período de
tiempo y permanecieron bajos indicando anemia suave tal como se
esperaba debido a múltiples recogidas de muestras de sangre (Figura
14B&C). La elevación del hematocrito en el grupo tratado con
PROLEUKIN, cuando se acopla con una disminución en la albúmina, que
es coherente con el desarrollo del síndrome de pérdida de
capilares.
Se siguió la eficacia PROLEUKIN e
IL2-N88R mediante la variación del porcentaje de
linfocitos CD25 positivos (tráfico + proliferación) y la media de la
fluorescencia para CD25 o el número de antígenos de CD25 expresados
en la superficie de una célula T dada (CD25 = IL-2R
de baja afinidad). Se siguió la expresión de CD25 en la población
total de células T (células CD3+) así como en las poblaciones
CD3+CD4+ y en las CD3+CD8+.
Se siguió la actividad de IL-2
en las células Asesinas Naturales (NK) mediante un análisis del
tráfico de células CD3-CD16+ y
CD3-CD25+CD16+NK. Se determinaron los números
absolutos de células CD3+, CD4+, CD8+ y NK multiplicando el
porcentaje de células por el número de linfocitos por mm^{3}, y se
obtuvieron los datos durante el análisis de hematología.
Se sobrerreguló el porcentaje de células T
activadas, tal como se indica por las células CD25 positivas el día
6 del estudio, la mayor parte en la subpoblación de células CD3+CD4+
T. PROLEUKIN parece inducir la expresión de CD25 en un porcentaje
más alto de las subpoblaciones totales de CD3+, CD3+CD4+, y CD3+CD8+
de células T en el día 6. Sin embargo, en el día 8 el porcentaje de
células que expresan el antígeno CD25 fue idéntico en los linfocitos
de los chimpancés tratados con PROLEUKIN o los chimpancés tratados
con IL2-N88R (Figura 15A, B y C). No se observó
tinción para CD25 en la superficie de la población de células
Asesinas Naturales (NK) en los chimpancés tratados con PROLEUKIN o
IL2-N88R. La ausencia de expresión de
IL-2R\alpha (el antígeno diana para la tinción de
la superficie de la célula por CD25) en la superficie de la
población de células NK seleccionadas (CD3-/CD16+) es sospechosa de
ser responsable de estos resultados.
El número absoluto de células CD3+CD25+ T siguió
un modelo similar al del porcentaje de células CD3+CD25+ T,
apareciendo PROLEUKIN más activa que IL2-N88R (Fig.
16A). IL2-N88R presentó un potencial de activación
de las células T similar al de PROLEUKIN sobre la población de
células CD3+CD4+ T, ya que la sobrerregulación del número absoluto
de linfocitos CD3+CD4+CD25+ inducida por IL2-N88R
fue idéntica a la sobrerregulación observada con PROLEUKIN (Fig.
16B). PROLEUKIN pareció aumentar el número de células CD3+CD8+CD25+
T en una extensión mayor que IL2-N88R (Fig.
16C).
El número de moléculas de CD25 (media de la
fluorescencia) expresadas en la subpoblación de células CD3+CD4+ T
siguió cinéticas idénticas con el tratamiento con PROLEUKIN o
IL2-N88R (Fig. 17).
Se determinaron las actividades de PROLEUKIN e
IL2-N88R en las poblaciones de células T y NK
mediante el análisis de la variación en el número absoluto de
linfocitos en circulación, antes, durante y después del tratamiento
(Fig. 18). IL2-N88R pareció tener una actividad
mayor que PROLEUKIN en el incremento del número absoluto de
linfocitos CD3+CD4+ en circulación (Fig. 18A), y una actividad
ligeramente reducida en comparación con PROLEUKIN en el incremento
del número absoluto de linfocitos CD3+CD8+ en circulación (Fig.
18B). Ambos compuestos tienen un efecto comparable, aunque modesto,
sobre el aumento del número total de linfocitos CD3+ (Fig. 18C). Ni
PROLEUKIN ni IL2-N88R afectaron el tráfico de las
células NK (Fig. 18D).
IL2-N88R fue generado mediante
una selección de las proteínas IL-2 mutantes en
ensayos de células T y NK primarias en seres humanos. Este presentó
una selectividad in vitro para las células T sobre la células
NK de aproximadamente 6000 veces. Basándose en este perfil celular,
se postuló que podría inducir únicamente efectos secundarios suaves
cuando se administra a dosis que podrían estimular la activación
significativa de las células T. Los experimentos en chimpancé,
comparando PROLEUKIN con IL2-N88R, confirmaron que
IL2-N88R tuvo un significativo mejor perfil de
seguridad que PROLEUKIN, reteniendo a la vez una capacidad
comparable para inducir la activación de las células T.
Protocolo. Se inyectaron ratones (Balb/c
hembras, 6-8 semanas de edad) por vía intravenosa
(IV) con 1 X 10^{5} de células CT-26 (carcinoma de
colon murino) en 0,2 ml de PBS en la vena lateral de la cola en el
día 0. El tratamiento fue con PROLEUKIN o IL2-N88R a
dosis diferentes (diluyente: dextrosa al 5% en agua /D5W)), o D5W,
dosificado IV, una vez diaria durante 8 días (QD x 8) comenzando el
día 1 después del implante. Se preparó IL2-N88R a
temperatura ambiente mediante dilución en D5W usando viales
siliconizados usando una jeringa de tuberculina y dosificando a los
animales antes de las 2 horas desde la preparación. Se preparó
PROLEUKIN añadiendo 0,7 ml de agua estéril para inyección (SWFI) a
cada vial (concentración final, 1,86 mg/ml). Se llevaron a cabo las
diluciones tal como se ha descrito para IL2-N88R en
D5W (Tabla 6). Se sacrificaron los animales en el Día 11. Se
retiraron los pulmones y se pesaron, se enjuagaron en PBS, y se
transfirió el tejido a solución de Bouin. 24 horas más tarde, se
transfirió el tejido a formalina al 10%. Se contó el número de
colonias metastásticas en los pulmones bajo un microscopio de
disección.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 7 muestra el número de metástasis
contadas en ratones individuales. Se observó una eficacia comparable
para IL2-N88R y PROLEUKIN. A dosis altas de
IL2-N88R (grupo 8, 60 mg/kg), todos los ratones
menos uno tuvieron 12 metástasis o menos; 3 de los ratones no
presentaron metástasis. Esto contrasta con la dosis más alta de
PROLEUKIN ensayada, en la que todos los ratones supervivientes
tuvieron 12 metástasis o más.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se observó reducción significativa (P< 0,05)
en la metástasis en ratones tratados con IL2-N88R a
dosis de 10, 30, y 60 mg/kg (grupos 6, 7, y 8, de manera
respectiva), y en un grupo tratado con 10 mg/kg de PROLEUKIN (grupo
3). Se muestran gráficamente estos resultados en la Fig. 19. Se
representan gráficamente los datos usando el logaritmo de la dosis:
para PROLEUKIN las dosis fueron a 3 y 10 mg/kg, para
IL2-N88R, las dosis fueron a 1, 3, 10, 30, y 60
mg/kg. El ajuste de la curva usando una ecuación no lineal (ajuste
de 4 parámetros) dio como resultado valores CI_{50} de 5,2 mg/kg
para PROLEUKIN, y 10,9 mg/kg para IL2-N88R.
A partir de los datos de este experimento, se
calculó que la CI_{50} con respecto a la reducción en el número de
metástasis para IL2-N88R era 10,9 mg/kg
(8,6-13,9 mg/kg al 95% de confianza), y para
PROLEUKIN era 5,2 mg/kg (3,5-7,7 mg/kg al 95% de
confianza).
Se muestra en la Tabla 8 la supervivencia de los
ratones. En el grupo de 10 mg/kg de PROLEUKIN, murió un (1) ratón en
el Día 7, y murieron 5 (5) más en el Día 8. Murió un (1) ratón en el
día 8 en cada uno de los grupos tratados con 3 ó 10 mg/kg de
IL2-N88R, y no se observó muerte en 1, 30, ó 60
mg/kg de IL2-N88R. De manera adicional, la mayor
parte de los ratones tratados con 3 mg/kg de PROLEUKIN y todos los
ratones tratados con 10 mg/kg de PROLEUKIN estuvieron moribundos; no
se observó morbilidad en los ratones tratados con
IL2-N88R.
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales tratados con PROLEUKIN en ambos
grupos estuvieron moribundos. No se observó morbilidad en ninguno de
los animales tratados con IL2-N88R.
En resumen, estos estudios indican que
IL2-N88R es tan eficaz como PROLEUKIN para reducir
la carga tumoral (tal como se midió por el recuento de metástasis
del pulmón en el modelo CT26). De manera adicional, se demuestra que
IL2-N88R es sustancialmente menos tóxica que
PROLEUKIN.
Se desarrolló la producción estable de líneas de
células que segregan altas cantidades de muteína
IL2-N88R transfectando células CHO(dhfr-) con
el vector de expresión que se muestra en la Figura 20. Se muestran
los elementos individuales del vector de expresión
IL2-N88R en el mapa del plásmido (Fig. 20). Éste
muestra CMVe/p = promotor temprano del citomegalovirus; PA =
secuencia señal de poliadenilación de SV40; y DHFR = módulo de
expresión de la dihidrofolato reductasa.
Se construyó el vector usando técnicas de ADN
recombinante convencionales. Véase generalmente Sambrook y col.,
Molecular Cloning, 2ª ed., 1989, Cold Spring Harbor Press; Short
Protocols in Molecular Biology, 2ª ed., 1992, John Wiley & Sons;
Methods in Enzimology vol. 185, Rd. Goeddel y col., Academic Press,
Inc., Londres, 1991. El vector de expresión contiene los módulos de
expresión discreta para el gen IL2N88R y el gen amplificable y
seleccionable DHFR (dihidrofolato reductasa). Se transfectaron
aproximadamente 1 x 10^{6} células CHO (ovario de hámster chino)
con 10 \mug de pBC1IL2SA usando reactivos de Lipofectina (Life
Technology Inc., Bethesda, Maryland) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. A continuación se seleccionaron las
células en presencia de metotrexato 50 nM y se cultivaron en medio
DME/F12 (Life Technology Inc.) deficiente en timidina e hipoxantina
más suero bovino fetal dializado al 5%. Se seleccionaron las
poblaciones de células para la producción de IL2N88R con un kit
ELISA comercial (R & D Systems). Se volvieron a seleccionar las
poblaciones de alta producción en medio que contenía concentraciones
aumentadas de metotrexato (metotrexato 100 a 400 nM) y se
seleccionaron para la producción de IL2N88R. A continuación se
aplicó la clonación mediante dilución limitante para derivar los
clones con productividad elevada y estable. Se llevó a cabo la
clonación en ausencia de metotrexato usando técnicas convencionales
de cultivo de tejidos.
Se llevó a cabo la producción continua de
IL2N88R mediante fermentación con perfusión continua. Se inoculó un
fermentador Wheaton de 19 litros con la línea de células CHO estable
del Ejemplo 9 a 2 x 10^{6} células/ml y se prefusionó a una
velocidad de intercambio de medio de 5 litros/día. El medio de
producción fue medio basado en DME/F12 (Life Technologies, Inc.,
Rockville, MD) suplementado con insulina humana recombinante (10
\mug/ml) (HUMULIN^{TM} Eli Lilly, Inc., Indianápolis, IN) y
FeSO4.EDTA (50 \muM). Se mantuvo la densidad celular a 4 x
10^{6} células/ml. El resultado diario promedio del fermentador
fue aproximadamente 200 mg/día. La producción de IL2N88R fue
mantenida de manera estable durante 30 días.
Se aplicó el siguiente procedimiento al eluato
de la perfusión descrito anteriormente. Se cosechó el medio de
perfusión y se aplicó a una columna de S-sefarosa.
Se equilibró la columna con Tampón Fosfato 20 milimolar con NaCl 5
milimolar a pH 7,0. Se ajustó el alimento ("TCF") a una
conductividad de 4 milisiemens con la adición de agua y se ajustó al
mismo pH con ácido fosfórico.
Después de que se cargó el TCF se lavó la
columna en el mismo tampón de equilibrio. Se llevó a cabo la elución
mediante un cambio de pH. Se eluyeron las muteínas con etanolamina
20 mM, pH 10,5, para lavar las muteínas fuera de la columna para
producir el S-eluato.
Se llevó a cabo el intercambio aniónico pasando
el S eluato a través de una columna de QAE Fast Flow^{TM}
(Pharmacia) equilibrada con tampón Bicarbonato 10 mM a pH 10,5. Se
mantuvo el caudal a 250 cm/h. Después del lavado hasta la línea
base, se eluyó la IL-2SA con fosfato 20 mM, pH
4,0.
Se llevó a cabo la cromatografía de
hidroxiapatito (HAP) pasando el eluato QAE diluido (1:1 con WFI) a
lo largo de una columna cargada con hidroxiapatito cerámico (Tipo
II, BioRad, Hercules, CA) equilibrada con Fosfato 0,10 mM a pH 7,0.
Se mantuvo el caudal a 250 cm h^{-1}. Después del lavado hasta la
línea de base, se eluyó la IL2SA con Fosfato 100 mM a pH 7,0.
Se ultrafiltró el eluato de hidroxiapatito hasta
300 ml volúmenes con una unidad Millipore Pelicon-2
equipada con tres cartuchos PES 5K (Millipore Corporation, Bedford,
MA).
El eluato HAP ultrafiltrado se purificó de
manera adicional mediante el paso a lo largo de una columna de
exclusión molecular S100HR (Pharmacia) a 35 cm/h. Se equilibró la
columna con Fosfato 10 mM y NaCl 150 mM, pH 7,0.
Se diluyó la agrupación de la Filtración del Gel
para conseguir una conductividad de 4,0 mMhos/cm y se volvió a
aplicar a la S-Sefarosa bajo las condiciones
anteriormente descritas. Se eluyó IL2SA con tampón Fosfato 10 mM con
NaCl 1 Molar a pH 7,0
Se dializó la agrupación del intercambio
catiónico final frente a la Solución Salina Tamponada con Fosfato
(PBS) durante la noche y se diluyó con PBS estéril hasta una
concentración de 6 mg/ml. La agrupación diluida final se esterilizó
mediante filtración, se dividió en partes alícuotas, y a
continuación se congeló a -70ºC. La recuperación total fue del
65%.
Otras formas de realización de la invención
llegarán a ser aparentes para una persona experta en la técnica.
Esta invención enseña cómo obtener muteínas no específicamente
descritas en el presente documento, pero que producen la activación
de las células T tal como se evidencia por la proliferación de
blastos PHA, y una proliferación reducida de células NK, y por
tanto, aquellas muteínas entran dentro del espíritu y alcance de la
invención. El concepto y la solución experimental descritos en el
presente documento, deberán ser aplicables a otras citoquinas que
utilizan sistemas de receptores multiméricos heterólogos, de manera
particular las citoquinas relacionadas IL-7,
IL-9 e IL-15, interferón \alpha, e
interferón \gamma.
Esta solicitud contiene las siguientes
secuencias:
SEC DE ID Nº: 1: hiL-2
(aminoácido)
SEC DE ID Nº: 2: hIL-2
(ADNc)
SEC DE ID Nº: 3: Cebador 5' PCR,
IL-2
SEC DE ID Nº: 4: Cebador 3' PCR,
IL-2
SEC DE ID Nº: 5: Cebador de la mutagénesis para
el vector de expresión IL-2
SEC DE ID Nº: 6: Cebador de la mutagénesis para
las mutaciones D20X
SEC DE ID Nº: 7: Cebador de la mutagénesis para
las mutaciones N88X
SEC DE ID Nº: 8: Cebador de la mutagénesis para
las mutaciones Q126X
<110> Shanafelt, Armen B
\hskip1cmGreve, Jeffrey M.
\hskip1cmLembach, Kenneth J.
\hskip1cmWetzel, Gayle D.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Agonistas y antagonistas
selectivos de la IL-2
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Secuencias ID 1-8
de la IL-2
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/080.080
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
15-05-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatetIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 465
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctcaactcc tgaattcatg tacaggatgc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaagcggat ccttatcaag tcagtgttga g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcacttgtca caaacaccat ggcacctact tcaagt
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagcattta ctgctgnnnt tacagatg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggacttaat cagcnnnatc aacgtaatag
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggattacctt ttgtnnnagc atcatctc
\hfill28
Claims (8)
1. Una muteína de IL-2
humana numerada de acuerdo con la IL-2 de tipo
salvaje que tiene una sustitución de un aminoácido en una de las
posiciones 20, 88, y 126, en la que
- la posición 20 está sustituida por un aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por: alanina, histidina, isoleucina, metionina, glutamina, serina, valina, o tirosina
- la posición 88 está sustituida por un aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por: alanina, arginina, ácido glutámico, histidina, lisina, leucina, fenilalanina, glicina, isoleucina, metionina, serina, treonina, tirosina o valina;
- la posición 126 está sustituida por un aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por: asparagina, leucina, prolina, fenilalanina, glicina, isoleucina, metionina, arginina, serina, treonina, tirosina o valina;
- y por lo cual dicha muteína de IL-2 activa de manera preferente las células T frente a las células Asesinas Naturales.
2. La muteína de IL-2 de
la Reivindicación 1, en la que la posición 88 está sustituida por
arginina.
3. Una composición farmacéutica que
comprende un vehículo farmacéutico y la muteína de
IL-2 humana de cualquiera de las Reivindicaciones 1
ó 2, por la cual dicha composición activa de manera preferente las
células T frente a las células Asesinas Naturales.
4. Una muteína de IL-2
humana numerada de acuerdo con la IL-2 de tipo
salvaje que tiene sustituciones en dos de las posiciones 20, 88, y
126, en la que
- la posición 20 está sustituida por un aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por: alanina, histidina, isoleucina, metionina, glutamina, serina, valina, o tirosina
- la posición 88 está sustituida por un aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por: alanina, arginina, ácido glutámico, histidina, lisina, leucina, fenilalanina, glicina, isoleucina, metionina, serina, treonina, tirosina o valina;
- la posición 126 está sustituida por un aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por: asparagina, leucina, prolina, fenilalanina, glicina, isoleucina, metionina, arginina, serina, treonina, tirosina o valina; y por lo cual dicha muteína de IL-2 activa de manera preferente las células T frente a las células Asesinas Naturales.
5. Un polinucleótido que comprende una
secuencia de ADN que codifica la muteína de IL-2 de
cualquiera de las Reivindicaciones 1, 2 y 4.
6. Un vector que comprende el
polinucleótido de la Reivindicación 5.
7. Una célula eucariota aislada
transformada con el vector de la Reivindicación 6.
8. Una célula procariota transformada
con el vector de la Reivindicación 6.
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