TWI223663B - IL-2 selective agonists and antagonists - Google Patents

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1223663 A7 --i------ B7 五、發明説明（i ) 交互參考之相蘭申請复 本申請案是1998 + 5月15日申請之美國專利申請 案，編號09/080, 080，的部分連續申請案。 本發明之技術背景 1. 太發明之技術領域 本發明大體上係關於藥學與免疫學領域。更精確地 說，本發明關於選擇性活化τ細胞（pHA胚細胞）之新賴物 夤組成物，其對天然殺手（“服”）細胞之活化作用降低。 此新穎組成物包括細胞激素族的變種，尤其是人類間白素 -2 (“IL-2”）的變種。 2. 相關技藝之說明 間白素2 (IL-2)是強效免疫刺激劑，其活化免疫系 統中多種細胞，包括T細胞、b細胞、及單核細胞。IL-2 也是T細胞之強效且關鍵性的生長因子。藉由這些活性， IL-2被用來測試其治療癌症的能力。人類IL-2是經過FDA 認可的藥物’其係用於治療轉移性腎癌及轉移性黑色素 瘤。由於IL-2療法伴隨而來的嚴重毒性，使用IL-2於適 格病患身上有其限制；估計最多只有20%適格病患確實接 受治療。IL-2伴隨而來的毒性包括高熱、噁心、σ區吐、血 管漏裂及嚴重低血壓。不管這些毒性，IL-2對其經認可的 病徵仍然是有效的（〜17%症狀顯明反應比）。 雖然鼠IL-2之結構/功能分析已相當廣泛[Zurawski， ___________-3- ___«Χ1<ςΐ A(QRA vr〇R^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I I i II · (請先閲^|賓背面之注意事項\^^|^本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明説明（） V 2 } S· Μ· and Zurawski, G. (1989). Embo J 8:2583-90 ； Zurawski, S. M. and Zurawski, G. (1990) Embo J 9:3899-905， Zurawski, G. Trends Biotechnol 9:250-7 ；

Zurawski, S. M. and Zurawski, G. (1992). ^/ 11:3905-10 ; Zurawski 氏等人，烈欣？ 乂 12: 5113-5119(1993)]， 但至今只有少數的人類IL-2分析。人類IL-2突變蛋白 質的大多數研究是在鼠細胞上進行，少數研究使用PHA 胚細胞進行，PHA胚細胞表現高親合力的IL-2受體IL-2R α石r。這類使用PHA胚細胞之研究證實IL-2之殘基 Asp—20與D-螺旋的重要性。其顯示人類IL-2之Asp-20與 Gin-126兩位置是負責分別與IL-2受體沒-與7—次單位 乂互反應的主要殘基（參見Theze氏等人，/層^//7(9人

Tb&y，17，481-486(1996))。雖然已證實鼠 IL-2 之 C-螺 旋殘基介入與鼠IL-2RyS之交互反應（Zurawski氏等人， 烈欣^乂 12，5113-5119 (1993))，人類IL-2中相等的殘基 至今尚未顯示具有相同的特性（人類IL-2中的這些殘基是 Asp-84與Asn-88)。因為人類與鼠IL-2之間證實有明顯的 物種特異性（人類IL-2於鼠系統内呈現降低約1〇〇倍之活 性），要預測相同類型交互反應是否可發生在不同物種範 圍内有其困難。據了解，沒有任何研究係使用僅表現人類 中度親合力受體IL-2R冷7的細胞。 業已檢測一些人類IL-2突變蛋白質對人類pHA胚細 也的’舌性（Xu氏專人0^政//76 Afeir，6，237-244 (1995))。突變蛋白質，其包括Asp_2〇被取代 1223663 A7 --i--- B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（3 ) (D20L)、以及精胺酸、天冬醯胺及離胺酸，顯示其誘導 PHA胚細胞增殖的能力具有嚴重缺陷。故此技術領域教 示，取代Asp-20會造成危及活性的突變蛋白質。Xu氏等 人陳述，至今（1995)尚未鑑定出用於臨床或研究的實用 IL-2突變蛋白質。由Buchli與Ciardelli製造的人類IL-2 Q126D突變 蛋白質 ’ Arch· Biochem· Biophys， 307(2)： 411- 415(1993)，證實其強度與作用兩者的活性皆明顯減弱；τ 細胞分析法中，其比IL-2之活性低約1，〇〇〇倍。鼠Τ細胞 分析法中，突變蛋白質幾乎無活性。所測試的兩種細胞 株皆表現高親合力IL-2受體。Q126D於兩種細胞類型上皆 呈現拮抗IL-2調介活性的能力，雖然在人類τ細胞分析 法中只有部分拮抗能力。 Zhi-yong，W，等人，Acta Biochimica et Biophysica 25⑸:558-560 (1993 年 9 月）在 IL-2 第 62、69、99 及126位置上進行取代實驗，於鼠τ細胞分析法（CTLL-2) 中證實 62-Leu-IL-2 及 126-Asp-IL-2 與 wt IL-2 比較， 分別降低活性20倍及30倍。但無任何教導或建議關於 第126位置之取代作用可導致對T細胞之選擇活性大於 NK細胞，或者指出這類改變對人類τ細胞具有類似作 用。 Collins，L·，等人於 PNAS USA 85:7709-7713(1988) 報導，第20位置之Asp以Asn(D20N)或Lys(D20K)取 代，會導致對高親合力IL-2受體（il-2R α /3 7， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇'〆297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

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、τ 1223663 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（4 ) Collins氏等人命名為p55/p7〇 )及中度親合力受體（IL— 2R/5 r，Collins氏等人命名為“p70”）的結合力降低，相 對於人類IL-2，皆降低約100至woo倍。此兩種突變 蛋白質對IL-2Ra之結合力顯示皆不受影響。此項實驗教 示破壞對中度親合力IL-2受體（IL-2R/?t)之結合力也會 導致對高親合力IL-2受體（il-2Ra/Sr)之結合力破 壞，推測IL-2R/3 r或IL-2Ra /3 r之間的區分式結合或活 化不能藉由取代第20位置之ASp達成。 Berndt，W· G.等人，汾·挪/#^ 33(21): 657卜 6577 (1994)利用組合匣突變而同時突變天然il_2之第 Π-21位置，這些位置預測是與中度親合力IL-2受體交 互作用者。2610個選殖純系中，只有42個有活性。這些 純系發現第20及21位置對生物活性最重要。除了 L21V，該文獻中沒有建議或教導單一取代。 美國專利第5,229，109號（Gri腿氏等人）宣稱其揭示 了用於免疫療法與癌症治療的低毒性IL-2類似物。分析 兩種IL-2類似物的特性並與天然il-2的性質比較，該 IL-2類似物在Arg38(取代為丙胺酸）及Phe42(取代為賴胺 酸）具有取代。發現此類似物能夠保留其結合中度親合力 IL-2受體的能力，但極少結合至所謂“高度親合力’’受 體。猜測此時中度親合力受體只由p75(IL-2R/3)構成，並 猜測高度親合力受體只由p55 + p75受體複合體（IL-2Ra 卢）構成。這些類似物也保留刺激周邊血液單核細胞的能 力，藉以產生經淋巴激素活化的殺害作用（LAK)。特別的 -6- (請先閱讀背面之注意事項

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <，與天钬Ττ 輿ΤΝρ % iL〜2分子比較，對類似物反應所得的lL〜1/5 與11、2尺刀；必量明顯減少。此專利所記載的胺基酸殘基是 作用將造α(ρ55)明顯交互作用者；去除與IL-2Ra的交= 低，彳曰成對攜帶高度親合力IL-2受體之細胞的活性降 性。因此〜響對攜帶中度親合力1L—2受體之細胞的活 生而得），可維持UK細胞的世代（猜測此係由NK細胞衍 88件。本說明書所載突變蛋白質（muteins)係針對第2〇 126位置的胺基酸殘基；猜測這些位置與a—找召 利申心第加及明位置），及與7 (在Grimm氏等人專 1申請當時並不知道，第126位置）專一地交互反應。結 :與江〜2Ra之交互作用維持不變。就機械而論，Gri酿 氏等人揭示的突變蛋白質與IL-2高親合力受體的交互作 用將降低，但是對IL—2中度親合力受體應該不受影響； 本發明所揭示的突變蛋白質具有相反特性，本發明突變 蛋白質與IL-2中度親合力受體IL-2R沒γ交互作用能力 有明顯缺陷，但顯示與IL-2高度親合力受體，il-2Ra冷 y，的官能性交互作用的缺陷小或無。 美國專利第5,206,344號（6〇〇(13〇11氏等人）揭示1[一2 突變蛋白質，其中IL-2成熟天然序列的胺基酸之一被半 胱胺酸置換，隨後製備且經由置換後的半胱胺酸共軛至選 自聚乙二醇同聚物或聚氧乙基多醇之聚合物，其中該同聚 物未經取代或在其中一端有烷基取代。這些突變蛋白質係 經由宿主表現編碼該突變蛋白質之突變基因而製得，該突 變基因藉由位置決定突變生成法將來源蛋白質的基因改變

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本頁} 、11. 1223663 A7 發明説明（ 而得。再者，其他種類IL—2可經由此突變 又α〜/蛋白質第 125位置的半胱胺酸殘基加以共軛，該 、 I郅於IL-2之 生物活性是非必要的。此專利揭示的突變作用不提供減弱 的毒性。 〇 美國專利第4, 959, 314號（Lin氏等人)揭示諸如. 冷及IL-2之生物活性蛋白質的突變蛋白質，該江―2中， 對生物活性非必要的半胱胺酸殘基被刪除或被其他胺基酸 置換，藉以去除負責分子間交聯的位置或錯誤之分子内雙 硫鍵橋形成情形。這些突變蛋白質係經由細菌表現編碼該 突變蛋白質之突變基因而製得，該突變基因藉由寡核苷酸 決定突變生成法由來源蛋白質的基因合成而得。此專利揭 示的突變作用不提供減弱的毒性。 美國專利第5，116,943號（Halenbeck氏等人）揭示保 證生物活性之治療性蛋白質被保護以對抗氧化反應，其係 利用一方法以保留性胺基酸取代對氣胺T或過氧化物氧化 作用敏感的每個甲二磺醯基殘基，其中其他不敏感的甲二 石黃醯基殘基不比照取代。如此製得對氧化反應有抗性的突 變蛋白質較好是間白素-2或干擾素-冷的人類突變蛋白 質’且保留性胺基酸最好是丙胺酸。此專利揭示的突變作 用不提供減弱的毒性。 美國專利第4, 853, 332號（Mark氏等人）揭示IFN-r 及IL-2突變蛋白質，其中對生物活性非必要的半胱胺酸 殘基被刪除或被其他胺基酸置換，藉以去除負責分子間交 聯的位置或錯誤之分子内雙硫鍵橋形成情形。此專利揭示 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項本頁) -訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663

、發明説明（7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 IL-2之第125位置半胱胺酸被取代為絲胺酸，形成一具有 活性可比天然IL-2之突變蛋白質。 美國專利第5,696,234號（Zurawski氏等人）揭示哺 乳動物細胞激素的突變蛋白質，及篩選哺乳動物細胞激素 促動劑與拮抗劑的方法。尤其是，人類IL—2雙體突變蛋 白質P82A/Q126D證實具有對鼠Baf3細胞的拮抗活性，此 鼠Baf3細胞被人類α及/3IL-2R次單位共同轉染。顯示 促動活性低。同樣地，鼠IL-2突變蛋白質顯示具有對π? 細胞的部分促動及拮抗活性，尤其是Q141D、Q141K、 Q141V、及Q141L。此專利沒有說明突變蛋白質活性顯示出或建議對第20，88及126位置突變所致的選擇性促動作 用。 Zurawski氏專人揭不鼠IL-2突變蛋白質，其具有在 表現IL-2Ra万r之細胞上有活性，但在表現IL-2R/3 γ之 細胞上無活性的特性（Zurawski，G.，斤部办汾Mecr/z/w入 9:250-257 (1991) ; Zurawski, S· M·及 Zurawski， G· 及/加· /· :3905-3910(1992))。具有這些特性的鼠iL-2突 變蛋白吳之Asp-34取代為Ser或Thr，且Gin-141取代 為Lys。鼠IL-2之Asp-34及Gin-141分別顯示相當於人類 IL-2之Asp-20及Gin-141。雖然這些資料提及，，選擇性促 動劑’’ IL-2突變蛋白質，但未說明這些突變蛋白質有成為 較低毒性的潛力，反而是說明其係作為内源性IL-2之強 力拮抗劑。歐洲專利公開申請案EP0267 795 A2 (Eurawski氏等 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

本頁) 訂 A7 缝濟部智慧財產局員工消費合作社印製 '發明説明（ 揭示分布整個序列的多種鼠IL-2突變蛋白質，包括 些在刖30個N〜端胺基酸殘基内的刪除及/或取代，這些 #基酸殘基是生物學上有功能的，但該案不包括、討論或 $議本發明於均等之鼠IL-2絲所揭示的胺基酸取代。 文存有改良出降低毒性且更可普遍耐受的IL-2分子之需 要。 於Taniguchi氏等人，美國專利案第4,738,927號係關 ^ 重、且，其包括編碼具有IL-2生物活性之多肽的 長、、且DNA，其中該活性係促進胞毒性τ淋巴細胞株的生 且包括—種能夠在原核或真核細胞中增殖的載體 該基因的編碼序列位在啟動子序列的下游位置，其 鲈^亥多肽具有多肽胺基酸序列中共132至134個胺基 =。該案也說明基因、重組DNA載體、宿主細胞、及重組 =天然IL-2的方法。Taniguchi氏等人未說明任何變種 =大變蛋白質，且未教示該蛋白質中負責引導或結合活性 置。 凊楚知道的，需要獲得不具有先前技藝中重組IL—2 次隻1蛋白質受劑量限制之毒性的IL-2突變蛋白質，藉以 連到治療上利用此細胞激素的可能。 、本發明係關於一多肽，其含有根據野生型IL-2編號 的人類IL-2突變蛋白質，其中該人類il-2在第20，88或 126位置之一至少被取代，如此該突變蛋白質比胍細胞更 8 (請先閱讀背面之注意事項^^^本頁) —^1 1··— - -

、1Τ -10- 本紙張尺度適用巾國國家標準（CNS) Α4規格（21〇χ297公羡） 1223663 A7 ：--~~~------^___ 五、發明説明（9 ) " ~ 易活化T細胞。本發明揭示較低毒性的IL_2突變蛋白 貝，其使得該間白素的治療用途更大。 本發明係關於在天冬胺酸20、天冬醯胺88、及麩胺 醯胺126位置上具有單一突變的IL_2突變蛋白質。特定 突變蛋白質以指定物D20X、N88X及Q126X為代表，其中 x是特定胺基酸，其於人類IL-2中被取代時，對於表 現IL-2Ra /5 γ受體之細胞（例如T細胞）比表現IL-2R召 r文體的細胞（例如νκ細胞）更有選擇活性。呈現大於 100倍選擇性的突變蛋白質包括D20H、D20I、N88G、 N88I、N88R、及Q126L。尤其是，這些突變蛋白質在τ細 胞上基本上也呈現野生型IL-2的活性。也鑑定出其他突 變提供低於1000倍但大於10倍的選擇性。本發明也包括 編碼本發明突變蛋白質之多核苷酸、包含該多核苷酸之載 體、經轉形之宿主細胞、含有該突變蛋白質之藥學組成 物、及使用該突變蛋白質之治療方法。 本發明也關於選擇IL-2突變蛋白質的方法，其係經 由利用IL-2Rα/3ア與 IL-2R/5y比較的分析法加以評 估，其中IL-2突變蛋白質的活性相對於野生型化_2在一 分析法中增加了，但另一分析法則否。iL-2Ra 0 r與 IL-2R召r是呈現適當組合之個別受體次單位外區域，其 係用於直接測定IL-2突變蛋白質對個別受體複合物的結 合情形。IL-2Ra /3 r分析法顧IL、2Ra ^攜帶型細胞 的反應，IL-2Rh分析法 ⑼帶型細胞的反 應。IL-2Ra Θ r攜帶型細胞是PHA、胚細胞，IL—_ r (請先閱讀背面之注意事項^:||^本頁) «- tjl i_ii— VIJ1 ·

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

1223663 A7 « , B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（10) 攜帶型細胞是Μ細胞。此分析是對IL-2Ra /3 r攜帶型細 胞與IL-2Ry5r攜帶型細胞兩者的增殖方法。 本發明也關於一載體，其含有編碼本發明突變蛋白 質的多核苷酸，此載體主導具有PHA-胚細胞活化活性、 但NK細胞活化活性降低之人類IL-2突變蛋白質的表現， 且該載體能夠達成轉感標的生物且隨後在活體内經由該多 核苷酸表現該人類IL-2突變蛋白質。 本發明也關於一種治療患有IL-2可治療病症之病患 的方法，該方法係施用治療有效劑量之人類IL-2突變蛋 白質，此突變蛋白質係根據具有PHA-胚細胞活化活性、 但NK細胞活化活性降低之野生型IL-2予以編號。此方法 是實用的，其中IL-2可治療病症是HIV、癌症、自體免 疫疾病、感染性疾病、對老年人或對免疫相容者，以及人 類SCID病患免疫刺激所使用之癌症疫苗與習知疫苗療法 中的疫苗佐劑、或其他需要刺激免疫系統之治療用途。 圖示簡要說明 圖1至7顯示野生型IL-2 (IL-2)與D20H (圖1)、 IL-2 與 D20K圖 2)、IL-2 與 N88G(圖 3)、IL-2 與 N88K圖 4)、IL-2 與 N88R(圖 5)、IL-2 與 Q126E(圖 6)、及 IL-2 與Q126L(圖7)的劑量-反應曲線圖。A:初代人類T細胞增 殖分析法中（PHA-胚細胞），IL-2(實心圓）及突變蛋白質（空 心圓）的個別劑量反應。B:初代人類NK細胞增殖分析法 中，IL-2(實心三角）及突變蛋白質（空心三角）的個別劑量 -12- (請先閲讀背面之注意事項

•本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1223663 A7 • . B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（η ) 反應。 圖8A-8D表示PROLEUKIN TM對黑猩猩的毒性以兩隹 物評估（X-159，三角形；及X-124，正方形），並與栽 照組（X-126,菱形）比較。評估毒性係藉由腎參數（血^對 素氮（BUN)，A;肌酸酐；B)與肝功能（總膽紅素，c; ALt κ D)。 ’ 圖9是30天期間内之體重變化百分比圖。在指定的 天數評估經IL-2/N88RC三角形）、PROLEUKIN(正方形）或栽 劑（菱形）處理過的動物體重。 圖10A-10D表示在指定的天數，評估經IL—2/N88r( = 角形）、PROLEUKIN(正方形）或載劑（菱形）處理過的動物: 巴細胞（A)、總白血球細胞（B)、嗜中性白血球（c)、及血 小板（D)。 圖11A-11D表示在指定的天數’評估經 角形）、PROLEUKIN (正方形）或載劑（菱形）處理過的動物 血中尿素氮（A，BUN)、肌酸酐（B)、磷（〇與陰離子裂隙 (D) 〇 ' … 圖12A-12D表示在指定的天數，評估經IL—2/N88R(三 角形）、PROLEUKIN (正方形）或載劑（菱形）處理過的動物 總膽紅素（A)、ALT(B)、血纖維蛋白原（c)與經活化之凝血 酶原時間（D)。 圖13A-13D表示在指定的天數，評估經iL_2/N88R(三 角形）、PROLEUKIN(正方形）或載劑（菱形）處理過的動物血 中鈉離子（A)、氯離子（B)、辦離子（C)與鉀離子（d)含量。

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壯衣-- 本頁j -訂 圖14A-14C表不在指定的天數，評估經IL_2/N88R(三 角形）、PROLEUKIN(正方形）或载劑（菱形）處理過的動物血 中白蛋白（A)、血球容積率（B)、血紅素（c)。 圖 15A-15C 中，IL-2/N88R(正方形）、PR0LEUKIN(菱形) 及載劑（三角形）之功效以T細胞總數（A，CD3+細胞）、 CD4+ T細胞數（B)、及CD8+ T細胞數（〇表示。 圖 16A-16C 中，IL-2/N88R(正方形）、proleuKIN(菱形) 及載劑（三角形）之功效以T細胞總數（A，CD3+細胞）、 CD4+T細胞數（B)、及CD8+T細胞數（〇表示。 圖17中，IL-2/N88R與PROLEUKIN對活化T細胞的作 用以CD25陽性細胞之平均螢光量表示。IL—2/N88R(正方 形）、PROLEUKIN(菱形）及載劑（三角形）之功效以CD3+CD4 T 細胞數表示。得到數目不足之CD3+CD8+細胞，係評估此 族群之平均螢光量。 圖 18A-18D 中，IL-2/N88R (正方形）、PROLEUKIN (菱 形）及載劑（三角形）之功效以CD4+T細胞數（A，CD3+/CD4+ 細胞）、CD8+T細胞數（B，CD3+/CD8+T細胞）、總T細胞 數（C，CD3+細胞）、及NK細胞數（D，CD3-/CD16+細胞）表 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 示0 圖19中，PROLEUKIN(空心圓）或IL-2/N88R(實心圓） 處理後之小白鼠體内肺轉移酶對劑量作圖。肺轉移作用在 此實驗之結論部分加以計算。 圖20是IL2N88R載體PBC1IL2SA的質體輿圖。 發明詳細說明 __ -14-___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1223663

A.技術背景 πΛνΐΥΓ的作用係經由結合IL々受體蛋白質而 =的/胞上有不同細胞表面蛋白質結合IL-2。首先要 鑑疋的疋-種多肽，稱之為IL,a， 肽（P55)，其出現在τ細胞 二為種爾夕 T TT 0 I，古化時，原先稱之為Tac(或 T活化）抗原。IL-2Ra結合+ π 為“低親合力12受體。㈣約，咸知 L 2結合至只表現IL-2Ra之 細胞不會產生任何可測得的生物學反應。 J::11：:2受體是一種由心b與1L，構成的 多肽，咸知為共同情(卜）， 口為其在/夕細胞激素受體之閣共享。約7〇至 75KD(另％之為P7G《p75) ’其為以兩個半胱胺酸愿燃 小區為特色之I型細胞激素受體家族中的—員。il_2r点 與rc等同表現。1-2對IL-_rc的結合親合力高於對 IL-動的結合親合力，其Kd約ιηι;也知其為“中度親 合力”IL-2受體。IL-2引起表現IL_2R/3rc之細胞生 長，刺激生長最大值一半的IL-2濃度發生在產生最大結 合力一半的相同IL-2濃度（1χ 1〇 -¾)。il—2R/3 r c是可結 合IL-15之相同訊號受體複合體。 第三種習知IL-2受體複合體是il-2Ra)5rc複合 體。能表現IL_2Ra與IL-2R/5 7"。兩者的細胞更能緊密結 合IL-2，其Kd約ΗΓηΜ，也知其為“高度親合力”複合體。 這類細胞的生長刺激發生在相當低的IL-2濃度。IL-2結 合作用與生長刺激皆可被對抗IL-2Ra、IL-2R0或Tc之 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項本頁) 4H I i J— 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 A7 . , B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（14 ) 抗體阻斷，對抗多個受體次單位的抗體組合最能有效阻 斷。這些觀察結果推測’ IL-2R (2與IL-2R/3 7。形成複合 體，增加了訊號受體對IL-2之親合力，故使得生長訊號 在明顯較低的IL-2濃度下被釋出。咸信IL-2首先快速結 合至IL_2Ra，此有助於與IL-2R0 7^聯合。不活化之T 細胞表現IL-2R々rc，但只表現少量IL-2Ra ;經由il-2 刺激，可增加細胞表面表現之IL-2Ra。在經抗原受體調 節的T細胞活化作用下，IL-2Ra被快速表現，如此降低 生長刺激所需之IL-2濃度。IL-2結合至IL-2Ra /3 7。複 合體導致訊號傳導經由Jak/STAT訊號途徑。 吾等已發現人類IL-2之突變蛋白質，較傾向於活化τ 細胞（PHA-胚細胞；表現高度親和力之IL-2受體IL~2Ra /5 r的細胞），而相對不活化天然殺手（NK)細胞（表現中度 親合力IL-2受體IL-2Ry5r之細胞）。該突變蛋白質對 PHA-胚細胞具有從未預期之完全IL-2活性，但對NK細胞 活性極低（若存在），此突變蛋白質之Asp-20被組織胺酸 (D20H)或異亮胺酸（D20I)取代，Asn-88被精胺酸（N88R)、 甘胺酸（N88G)、或異亮胺酸（N88I)取代，或者Gin-126被 亮胺酸（Q126L)、或麩胺酸（Q126E)取代。人類IL-2突變蛋 白質之先前研究業已建構在鼠細胞分析系統，當使用人類 細胞時，至今尚未使用僅僅表現IL-2R沒τ的細胞（例如 NK細胞）。再者，這些利用人類PHA-胚細胞的研究已證 實，取代 Asp-20(以 Leu、Arg、Asp、或 Lys 取代；Xu 氏等人，及/r· 6，237-244(1995))或取代 __ -16- 本紙張尺度適用中關家^準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ' ' (請先閲讀背面之注意事項

本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 A7 • 、 B7 五、發明説明（15 )

Gln-126(以 Asp 取代；Buchi 與 Ciardelli，IrcA 及?’oc/ze瓜 汾〇/於^，307(2):411-415，（1993))會產生具有高度折衷 活性之人類IL-2突變蛋白質。使用鼠IL-2之先前研究鑑 定出具有不同活性之鼠IL-2突變蛋白質（Zurawski氏等 人，EMB0J，12:5113-5119(1993))，但這些突變中無任一 者所產生的結果可教示本發明所揭露的技術内容。人類 IL-2突變蛋白質含有在鼠IL-2突變蛋白質對應位置的相 同突變，卻不呈現相似活性，故推測由鼠之範例不能推測 人類之功能性。就發明人所知，無任何人類IL-2突變蛋 白質的研究中比較表現IL-2受體IL-2Ra /3 r之人類細胞 (例如，PHA-胚細胞）與表現IL-2受體IL-2R/3r之人類 細胞（例如，NK細胞）的相對活性。預期活體内分析將經 由毒性降低而證實本案揭示之突變蛋白質比野生型人類 IL-2更有增進之治療指數，故提供治療上有效化合物以 治療需要刺激免疫系統之疾病。 間白素2(IL-2)目前係於臨床上用來治療轉移性腎 癌。但其嚴重毒性限疋其只能用於一小部分最健康的病 患，且劑量限定之毒性預期不利於其整體效力。曾經預期 IL 2之急性毋性可經由活化NK細胞予以調節，然而此效 力係由直接活化T細胞予以調節（jacobson氏等人，户 你"dead 5W Z/似（美國），ι996年9月17日， 93(19):pl0405-10 ； Smith KA, Blood 1993, 81(6): pl414-23， Kaplan 氏等人，汾i〇(2):p 157-62)。T細胞更能比NK細胞表現一種對il-2的不同受 (請先閲讀背面之注意事項本頁) 、11

1223663 A7 . B7 五、發明説明（Μ ) 1 〇 體（T細胞：IL-2Ra /5 r，高度親合力IL-2受體；NK 細胞；IL-2R/3 τ，中度親合力IL-2受體）。本發明揭示 之人類IL-2突變蛋白質選擇性活化T細胞IL-2受體， 但不活化NK細胞IL-2受體。 IL-2之低劑量療法早已用於直接活化NK細胞並有些 許成功（Jacobson 氏等人（1996)，户/Όα dead 5bi·· 93:10405-10)。本發明策略中納入低劑量IL-2的概 念，只有高度親合力IL-2受體會被活化，藉以排除中度 親合力IL-2受體。IL-2受體之中度親合力形式，IL-2R /5 τ，表現在NK細胞上，而T細胞表現高度親合力形 式，IL-2Ra 冷 τ。 本發明由不同角度研究毒性問題。假設IL-2與IL-2R/3及/或IL-2Rr交互反應的爭論可經由適當修飾IL-2 結合表面上的特定結合殘基，而能防止有效結合（及後續 活化）至僅表現IL-2RyS r的細胞。但是，在表現IL-2Ra /3 τ之細胞表面上，仍會發生首先結合至IL-2Ra，然後 結合至細胞，故由Jacobs等人建議的低劑量療法依舊會 造成毒性副作用。藉由結合至IL-2Ra，IL-2Ry5與IL-2R 7可在細胞表面發生有效補充，儘管經修飾之IL-2與IL-2R厶及/或IL-2RT的交互作用受損。因此可形成充分提供 訊號的IL-2/IL-2Ra沒r複合體。吾等咸信能夠選擇性活 化T細胞上之高度親合力IL-2受體，優先於NK細胞上 中度親合力IL-2受體，的IL-2變種，因為降低毒性之 特性，可具有比野生型IL-2更高之治療指數。具有增加 __-18-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再mr本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ^3663 A7 五、發明説明（17) ^ 一 冶療指數之IL-2變種在治療癌症（直接及/或輔助治療）與 免疫缺陷（例如HIV及結核病）上有顯著可擴充的用途範 圍。IL-2之其他可能用途係由其免疫刺激活性衍生的， 除了直接治療癌症、免疫缺陷，例如HIV或人類SCID病 患，另包括感染性疾病，例如結核病；作為“癌症疫苗，，策 略中的佐劑；以及作為免疫系統刺激作用的指標，例如用 於增進標準免疫接種計劃或年長者早期治療。 對Asp-20、Asn-88、或Gin-126適當取代，可降低 對 IL-2R々（Asp-20 及 Asn-88)或 IL-2R7(Gln-126)之結合 父互反應。這類取代作用的淨作用形成IL_2突變蛋白 貝，其保留在人類T細胞上的活性，且降低在人類NK細 胞上的活性。 由於不可能在T與NK細胞分析法評估之前預測指定 取代作用的結果，在Asp-20、Asn-88、或Gln-126位置進 行所有可能之天然胺基酸取代作用（除了 CyS)，並在Asp-84位置進行有限之多組突變，藉以測試是否其確實與IL— 沈冷交互作用。若測得對IL-2R /5之明顯交互作用有影 響’則測試Asp-84位置之其他突變。這些位置上的46種 不同取代作用數據示於本說明書表1。 利用位置主導突變生成法，將突變導入野生型人類 IL-2 cDNA。將正確之純系再殖入適合在異源系統内表現 之表現載體[例如大腸桿菌、杆狀病毒、酵母菌、或哺乳 動物細胞例如中國昌鼠卵巢（CHO)細胞]。純化蛋白質以τ 細胞（PHA-胚細胞）增生及NK增生分析法加以測試。這些 ___ -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " " 一 (請先閲讀背面之注意事項^|||^本頁) ·-I tj 1

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 A7 __；________B7_ 五、發明説明（19 ) ' ^ " 本說明書所載“IL-2突變蛋白質，，表示一種多肽，其中 已完成對人類成熟間白素-2蛋白質之特異取代。本說明書 表1揭露46種不同取代之IL-2突變蛋白質，及其對應 之相對活性數據。較佳實施體系包括具有至少1⑼倍相對 活性之突變蛋白質。更佳實施體系包括下列具有大於1000 倍相對活性者：當根據野生型IL-2編號時，在第20位置 (“D20”）之天冬胺酸（Asp)殘基（D)，被取代為異亮胺酸 (“D20I”）或組織胺酸（“D20H”）；第88位置（N88)之天冬醯 胺殘基（Asn)被異亮胺酸（N88I)、甘胺酸（N88G)、或精胺酸 (N88R)取代；及第126位置（Q126)之麵胺酸胺殘基（Gin) 被亮胺酸（Q126L)、麵胺酸（Q126E)、或天冬胺酸（q126D)取 代。較佳IL-2突變蛋白質在無取代殘基部分，具有與野 生型IL-2之相同胺基酸序列。然而本發明之il—2突變蛋 白質也可在天然IL-2多肽鏈中的其他殘基上有一個或多 個位置的胺基酸插入、刪除、取代及修飾為特徵。根據本 發明，任何這類插入、刪除、取代及修飾可形成保留pHA 一 胚細胞選擇活性，但具有降低活化NK細胞能力之IL—2突 變蛋白質，其皆屬於本發明範圍内。 組合較佳或特佳上述取代於單一型重組IL—2分子可 形成組合型突變蛋白質，其具有本發明揭示之單一型突變 蛋白質的相似活性。舉例而言，預期具有組合2種以上突 變的IL-2分子可發展出τ細胞選擇性IL-2促動劑，此 促動劑具有本發明揭示之單一型取代的類似相對活性。組 合型突變蛋白質屬於本發明精神與範圍内。 __________ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（~- (請先閱讀背面之注意事項本頁) 、11 泉_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 A7 五、發明説明（ 20 經 濟 部 智 慧 財 產 局 消 費 合 作 社 印 製 本發明較好是IL-2其他位置之保守性修飾與取代（即 這些修飾與取代對突變蛋白質之二級與三級結構的影響最 小）。這類保守性取代包括Dayh〇ff於The Atlas 〇f Protein Sequence_and Structure ，及 Argos 於 EMBO J.，8··779-785(1989)所載者。例如屬於下列基團的 胺基酸代表保守性變化： -ala，pro，gly，gin, asn，ser，； -cys, ser，tyr，thr ; -val，ile，leu，met，ala，phe; -lys, arg, his ； -phe，tyr，trp，his ;及 -asp, glu。 本發明較好也是不會導入額外分子間交聯或形成不正 確雙硫鍵之位置的修飾或取代。例如，已知il_2具有三 個cys殘基，分別在成熟序列之野生型第58、1〇/及⑵ 位置。 “編號根據野生型IL-2”乙詞表示參考野生型α_2成 熟序列中正常發生的絲酸位“確認所選之胺基酸。 當IL-2突變蛋白質有插入或刪除時，熟悉該項技術者當 能理解正常發生在第20位置的Asp在突變蛋白質中可轉 換位置。轉換後的Asp位置可輕易決定，其係、由野生型 IL-2中AsP兩側的胺基酸而參照及修正兩側胺基酸。 “具有IL-2R〇r受體之細胞類型”乙詞表示習知具 有此類受體的細胞，即τ細朐、β Λ h ^ β細胞、經活化單核細 _；___ "22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（ 項 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 Α7 ' · Β7 五、發明説明（21 ) 胞、及經活化NK細胞。“具有IL-2R/5 r受體之細胞類型” 乙詞表示習知具有此類受體的細胞，即B細胞、不活化之 單核細胞、及不活化之NK細胞。 本發明之IL-2突變蛋白質可由該技術領域習知之任 何適合方法製造。這類方法包括構築編碼本發明1L-2突 變蛋白質之DNA序列，並於適合之轉形宿主中表現該序 列。此方法可生產本發明之重組型突變蛋白質。但本發明 之突變蛋白質也可藉由化學合成法或組合化學合成法與重 組DNA技術而生產，雖然這些方法非較好的。分批製造或 灌注法是該技術領域之一般技術，參見Freshey，R.I.(ed)， “Animal Cell Culture: A Practical Approach，，，2nd ed.，1992, IRL 出版，牛津，英國；Mather, J.P. “Laboratory Scaleup of Cell Cultures (0· 5-50 liters)”，Methods Cell Biology 57:219-527(1998) ; Hu, W. S., &Aunins，J.G.，“Large-scale Mammalian Cell Culture' Curr Opin Biotechnol 8:148-153(1997); Konstantinov, K.B.，Tsai, Y·，Moles， D.，Matanguihan，R·，“Control of i〇ng-term perfusion Chinese hamster ovary cell culture by glucose auxostat·”，万/Vcsg* 12:l〇〇-i〇9 (1996)。 本發明製造突變蛋白質之重組方法的實施體系之一， 其中構築DNA序列係分離或合成編碼野生型iL—2之DNA 序列’然後利用位置特異突變生成法，將編碼AsP20之密 碼改變為編碼亮胺酸（I)之密碼。此技術是熟知的，例如 參見 Mark 氏等人，Site-specific Mutagenesis Of The -23· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'乂297公釐*ΐ---- (請先閱讀背面之注意事項^||||^本頁) 、?τ 1223663 A7 五、發明説明（22 )

Human Fibroblast Interferon Gene，，，proc. Natl· Acad. 起1：_USA 81, PP· 5662-66(1984);及美國專利第 4, 588, 585號，其皆併入本發明作為參考。 本發明編碼IL-2突變蛋白質之dna序列的另一種構 築方法可以是化學合成法。舉例而言，包括以化學方法根 據呈現本發明揭示特性的IL—2突變蛋白質的蛋白質序列 直接合成。此種方法可在影響IL—2與IL—2R/5或IL-2R r交互作用的位置上併入天然或非天然的胺基酸。或者， 可使用寡核苷酸合成儀以化學方式合成編碼所欲IL—2突 變蛋白質之基因。這類募核苷酸係根據所欲IL—2突變蛋 白質之胺基酸序列設計的，較好選擇在生產重組突變蛋白 質之宿主細胞中較適宜的密碼。有鑑於此，咸知遺傳密碼 有簡併性 種胺基酸可由至少一種密碼編碼。例如， Phe (F)由兩種密碼編碼，TTC或πτ，ΤγΓ(γ)由ΤΑ(：或tat 編碼，His(H)由CAC或CAT編碼。Try(W)由單一種密碼， TGG，編碼。因此可知對於編碼特定IL_2突變蛋白質之 指定DNA序列，會有許多DNA簡併序列編碼該江-2突變 蛋白質。例如，可知除了 SEq ID N〇:1所示編碼突變蛋白 質D20的較佳DNA序列之外，會有許多編碼該江―2突變蛋 白質之簡併DNA序列。這些簡併DM序列涵括在本發明 範圍内。因此，本發明技術内容中所載‘‘其簡併變種，，X乙 詞，表示編碼且因此能夠表現特定突變蛋白質之所有 序列。 編碼本發明IL-2突變蛋白質之DNA序列，不論是由 _____-24- 本紙張尺度適财關^SiTcNS ) A4規格（210χϋ^-^----- m m (請先閲讀背面之注思事項本頁一 -訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 A7 B7 23 五、發明説明（ 位置主導突變生成法、化學合成法或其他方法製備者，也 可或也可不包括編碼訊號序列之職序列。這種訊號序列 若存在，應該可被所選用於表現IL_2突變蛋白質之細胞 辨識。其可叹職城序列、真核崎糊、或兩者之 、，且口其也可以疋天然IL-2之訊號序列。是否納入訊號 序列’由是否需要由製造突變蛋白質之重組細胞將几—2 突變蛋白質分泌出來而決定。糾選的細胞是原核細胞， 通常疆序列較好不編碼訊號序列。麵選的細胞是真核 細胞，通g較好編碼訊號序列，最好使用野生型il_2訊 號序列。 ° 可使用標準方法合成編碼本發明IL-2突變蛋白質之 基口例如可使用完整胺基酸序列來構築回溯轉譯的基 口也可a成含有編石馬IL—2突變蛋白質之核苷酸序列的 DNA募聚物。例如，可合成編碼所欲多肽不同段的數個小 段募核苷酸，然後再接合之。通常個別募核苷酸含有互補 組合所需的5’或3，端的突出處。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 旦組合了編碼本發明IL-2突變蛋白質的DM序列 (利用合成法、位置主導突變生成法或其他方法），將其插 入表現載體且操作性連結至表現控制序列，此表現控制序 列適合在所欲轉形宿主中表現IL—2突變蛋白質。適當組 合之確说可藉由核I酸定序、限制酶與圖、及生物活性多 狀於^合宿主中表現情形。該技術領域熟知，要在宿主 内獲㈣表現水準的轉感基目，該基因-定要操作性連接 在轉#及轉錄表現控制相，此序列在所選擇的表現宿主 ^23663 A7 五、發明説明（) ~- 24 内有功能。 選擇表現控制序列及表現載體將根據宿主的選擇而決 定。可使用多種表現宿主/載體組合。真核宿主適用的表 現載體包括，含有源自SV40、牛乳突瘤病毒、腺病毒及巨 細胞病毒之表現控制序列的載體等。細菌宿主適用的表現 載體包括習知之細菌質體，例如源自大腸桿菌之質體， 包括col El，pCRl、pER32z、PMB9及其衍生物；較廣宿主 範圍之質體，例如RP4 ;噬菌體DNA，例如噬菌體λ之多 種衍生物，例如ΝΜ989 ;及其他ΜΑ噬菌體，例如Μ13及 絲狀單股DNA噬菌體。酵母菌細胞適用之表現載體包括2 #質體及其衍生物。昆蟲細胞適用之載體包括pVL941。 本案發明人較喜用 pFastBacTMl(GibcoBRL，Gaithersburg， MD)。Cate 氏等人，“Isolation of the Bovine And

Human Genes For Mullerian Inhibiting Substance And

Expression Of The Human Gene In Animal Cells” ，

Cell，45，pp· 685-98(1986)。 此外’這些載體中可使用多種表現控制序列中任何一 種。這些實用的表現控制序列包括上述表現載體與結構基 因有關的表現控制序列。實用的表現控制序列之範例包 括’ SV40或腺病毒之早期與晚期啟動子、lac系統、trp 系統、TAC或TRC系統、噬菌體；I之主要操縱子區與啟動 子區，例如PL、fd外套蛋白質之控制區、3—磷酸甘油酯 激酶或其他糖酵解酶之啟動子、酸性磷酸分解酶之啟動 子，例如PhoA、酵母菌α -接合系統之啟動子、杆狀病毒 ---------26- 本紙張尺度適财國國( CNS ) Α4規格（210X297公釐) --_ ΐ Γ 衣-- (請先閱背面之注意事項再頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 、發明説明 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 多母】启欠了 表現的JL 1及控制原核細胞或真核細胞或其病毒之基因 、他習&序列’及其多種組合。 併可使用任何適合的宿主來製造本發明之IL-2突變蛋 :二’该宿主包括細菌、真菌(包括酵母菌)、植物'哺乳 、或其他適合之動物細胞或細胞株、以及轉殖基因之 動^或植物。更特別的，這些宿主可包括熟知之真核及原 核^主，例如大腸桿菌、假單胞菌、芽孢桿菌、鏈黴菌、 真菌、酵母菌之菌株、昆蟲細胞諸如处 Zn/giperi/a (5/Ρ)、動物細胞諸如中國倉鼠卵巢（CH〇)細胞 及鼠細胞諸如NS/0、非洲綠猴細胞諸如c〇sl、c〇S7、 BSa、BSC40、及BNT10，及組織培養之人類細胞與植物細 胞。使用動物細胞表現時，較佳為培養之CH0細胞與COS 7細胞，尤其是CH0細胞株CH0(DHFR-)或HKB細胞株。 當然可了解的是，並非所有載體及表現控制序列用於 表現本發明所述之DNA序列都能有同等功效。也並非所有 宿主有相同表現系統的功效。但是該技術領域之士不用繁 複實驗即可在這些載體、表現控制序列及宿主之間加以選 擇。例如，選擇載體時’必須考慮宿主’因為載體一定要 能在宿主内複製。也應考慮載體之複製套數、控制複製套 數的能力、及由載體編碼之其他蛋白質（例如抗生素標記） 的表現能力。例如’本發明所用之較佳載體包括可讓編碼 IL-2突變蛋白質之DNA擴大複製套數者。這類可擴大的 載體是該技術領域熟知的。例如包括能被DHFR擴大法（例 如參見Kaufman，美國專利案第4, 470, 461，拙d -27- 本紙張尺度it财_家_ ( CNS ) M規格（21GX297公董） (請先閲讀背面之注意事項

•本頁) 訂 1223663 A7 __；____B7 五、發明説明（％ ) Z0

Sharp, “Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis of Signals Utilized For Efficient Expression，，，Mol. Cell· Biol·，2，pp. 1304-19(1982))，或麩胺醯胺合成酶（“GS”）擴大法（例如參見美 國專利案第5,122,464號及歐洲專利公開案第338,841號） 擴大的載體。 選擇表現控制序列時，也應考慮多種因素。這些因 素’例如，包括序列之相對強度、其控制能力、及其與編 碼本發明IL-2突變蛋白質之正確DNA序列相容的能力， 尤其是考慮到可能的二級結構。選擇宿主應考慮其與所選 載體之相容能力、由本發明DNA序列編碼之產物的毒性、 其分泌特性、其正確摺疊多肽的能力、其醱酵或培養要 件、及純化該ΜΔ序列編碼之產物的容易度。 這些參數中，熟悉該項技術者可選擇多種載體/表現 控制序列/宿主之組合，此組合會以醱酵法或大規模動物 細胞培養，例如使用CH0細胞或C0S7細胞，表現所欲之 DNA序列。 根據本發明所獲得的IL-2突變蛋白質可醣化或無醣 化’此係由用來生產該突變蛋白質之宿主有機體決定。 若選擇細菌作為宿主，則將產生無醣化之IL—2突變蛋白 質。相反的，真核細胞會醣化IL-2突變蛋白質，雖然其 或許並非與天然IL-2之醣化方式相同。藉由任何適當方 法，可純化經轉形宿主所製得的IL—2突變蛋白質。已知 有夕種純化IL-2之方法。例如參見^了卻力//7 _________-28-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再mr本頁) 衣· 再ΙΡτ束

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ’__ _B7__ 五、發明説明（27 ) Protein Science, Vol. John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploehg, David W. Speicher, Paul T. Wingfield, Unit 6.5(1997 著作權，John Wiley and Sons, Inc.)。吾 等較喜歡由大腸桿菌產生的包涵體進行再摺疊，或由製造 指定突變蛋白質之哺乳動物細胞或酵母菌培養物所得之合 適培養基進行再摺疊，其使用陽離子交換法、凝膠過濾 法、及/或逆相液體層析法。參見下文之實例1(大腸桿菌） 及實例10(CH0細胞灌注）。 本發明IL-2突變蛋白質之生物活性可利用該技術領 域習知之任何適合方法加以分析。這類分析法包括PHA一胚 細胞增生法及NK細胞增生法。具有適當活性的突變蛋白 質，即在對IL-2Ra /3 r有充分活性，但對攜帶IL-2R0 γ 之細胞活性降低，將使用兩種分析法確認。突變蛋白質 之“相對活性”係相對於野生型IL-2測定，詳述於本案實 施例，其為ΡΗΑ-胚細胞增生對ΝΚ細胞增生之比值。本發 明之IL-2突變蛋白質所施用的劑量，接近或大於野生型 天然或重組IL-2在治療中使用的劑量。較好施用il—2突 變蛋白質之有效劑量。“有效劑量’’乙詞表示能夠預防或減 輕所欲治療之疾病或病徵的嚴重性或擴散的劑量。熟悉該 技術領域者可輕易了解IL-2突變蛋白質之有效量決定於 疾病本身、劑量、IL-2突變蛋白質之用藥規劃、該il—2 突變蛋白質是單獨用藥或組合其他治療藥劑、組成物之血 清半衰期、及病患的整體健康情形等等。 IL-2突變蛋白質較好於包含藥學上可接受之載劑的 -29-

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本頁) 、11

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 讀财施用。‘‘藥學上可接受之載劑，，表示-種載劑，其 '用不引触何不利作用。這類藥學上可接受之 Htc該技*領域熟知的。吾等較喜歡用〇之2% HAS/PBS。 本U IL-2突變蛋白質可利用已知方法調製成藥學 組成物，例如參見R_ngton，s Pharmacautical心膨 2 E.W· Martin說明適合配方，此文獻併入本發明作為參 IL 2大變蛋自質之藥學組成物可調製成多種劑型，包 括液體、凝膠、冷;東乾燥型、或任何其他適合之劑型。較 佳劑型由被治療之特定疾病決定，且為熟悉該技術領域者 可輕易決定的。 A有 IL 2大^蛋白質藥學組成物可經口、噴霧、靜脈 内:肌内、皮内、或經皮下、或以任何其他可接受 用樂。用樂之較佳模式由被治療之特定病症決定，且^ 悉該項技術者可輕易決定的。IL-2突變蛋白質之藥學:、 療藥劑合併施用。這些藥劑可併入成為相同 樂于組成物之-部份，或單獨於IL_2突變蛋白質之 施用，或與其同時施用，或根據任何其他可接受隻而 =施：。IL-2突變蛋白質藥學組成物也可用來作;二： 因此，本發明提供組成物及方法，用以治療Hlv、& 症自體免d病、感染性疾病、癌症疫苗及習知疫」β 法中的疫苗佐劑、及用於年長者或其他免疫受損個=療 疫刺激，以及人SCID病患之刺激免疫，或用於任何合= (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂

-30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇><297公釐）

1223663 A7 __________B7 五、發明説明（29 ) 動物，較好是哺乳動物，最好是人類，之免疫系統需要全 身刺激之其他療應用。如前述背景章節提及，IL—2突變蛋 白質具有許多功效。這些功效中有些功效是刺激pHA—胚細 胞、不活化之T細胞、β細胞、單核細胞、及服細胞 等；本發明所述突變蛋白質對於僅僅表現高度親合力IL—2 受體之細胞種類，例如不活化之τ細胞，有活性，但對表 現中度親合力IL-2受體之細胞種類，例如NK細胞或單核 細胞，無活性。 編碼本發明IL-2突變蛋白質之DNA序列在基因療法 上的用途也被考慮。被考慮之基因療法應用包括治療疾 病，這些疾病由於T細胞活性而可預期IL-2提供有效治 療，例如HIV、癌症、自體免疫疾病、感染性疾病、癌症 疫苗及習知疫苗療法中的疫苗佐劑、及用於年長者或其他 免疫受彳貝個體之免疫刺激’以及人SC ID病患之免疫刺 激，及對於IL-2或感染性物質有反應之疾病，該感染性 物質對於經由IL-2調節之免疫反應敏感。 利用基因療法局部輸送IL-2突變蛋白質可提供治療 劑至標地區。可考慮活體外與活體内基因療法兩者。將潛 在治療基因轉送至確定細胞群的一些方法是已知的。例如 參見 “The Basic Science Of Gene Therapy”，

Science，260:926-31(1993)。這些方法包括下列： 1)直接基因轉移。例如參見Wolff氏等人，“Direct Gene transfer Into Mouse Muscle In Vivo5\ Science, 247: 1495-68(1990)； _____-31- _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 A7 ' 、 B7 五、發明説明（30) 2) 微脂粒（liposome)調介之DNA轉移。例如參見 氏等人，“Liposome-mediated CFTR Gene Transfer To The Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis”， Nature Med. 3:39-46(1995) ； Crystal, “The Gene As A Drug，，，Nature Med. 1: 15-17(1995)； Gao and Huang， “A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection Of Mammalian Cells’’， Biochem. Biophvs. Res. Comm.，179:280-85(1991); 3) 逆轉錄病毒調介之DNA轉移。例如參見Jay氏等人， uIn Vivo Gene Therapy Of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs”， Science， 262: 117-19(1993); Anderson, "Human Gene Therapy”， Science, 256: 808-13(1992). 4) DNA病毒調介之DNA轉移。這類DNA病毒包括腺病毒 (較好是根據Ad-2或Ad-5之載體）、泡療病毒（較好根 據單純泡疹病毒之載體）、及小病毒（較好是根據“缺 陷”或非自主小病毒之載體，更好是根據腺病毒相關病 毒之載體，最好是根據AAV-2之載體）。例如參見 氏等人，“The Use of DNA Viruses As Vectors For Gene Therapy”， Gene Therapy, 1:367-84(1994)；美 國專利案第4,797,368號，其併入本發明作為參考， 及美國專利案第5，139,941號，其併入本發明作為參 考。 選擇特定載體系統以轉移所欲基因係由許多因素決 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項本頁)

、? 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 發明説明（）

v 31 J 個重要因素是標的細胞族群之性f。雖然逆轉錄 病=載體已被深人研究且用於許多基因療法之應用中，這 ίΓ體通常不適合感染未分化的細胞。此外，逆轉錄病毒 有致癌的可能。 腺病毒有廣泛宿主範圍的好處，可感染靜止或最終分 化細胞，例如神經元或肝細胞，且基本上似乎非致癌的。 例如參見从.氏等人，如上，第367胃。腺病毒似乎不嵌 入伤主基因體。因為其存在染色體之外，插人性突變生成 之危機大為降低。j/y氏等人，如上，第373頁。 腺病毒相關病毒具有類似好處，可作為根據腺病毒之 載體。但AAV對人類染色體19具有位置特異嵌入情形。 氏等人，如上，第377頁。 較好實施體系中，本發明編碼IL—2突變蛋白質之dm 用於基因療法，以治療免疫缺陷疾病，例如HIV ;感染性 疾病，例如結核病；及癌症，例如腎癌。 根據此實施體系，在診斷同時或診斷隨後立即提供基 因療法給有此需要的病患，該基因療法使用編碼本發明 IL-2突變蛋白質之DNA。 此研究計晝利用本發明IL-2突變蛋白質之選擇活 性，以避免不欲毒性及副作用。熟悉該項技術者可了解， 根據此實施體系可使用含有IL-2突變蛋白質DNA之任何 適合基因療法的載體。例如參見Anderson，W. F.，Huimii Gene Therapy, Nature, 392:25-30(1998) ； Verma, I. ^ 及 Somia，N·，Gene Therapy-Promises, Problems，and -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) -訂_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 A7 l 1 _____ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（32 ) Prospects,舱如re，389:239-242 (1998)。將含有 IL_2 突變蛋白質DNA之載體導引至標的位置，可利用習知技術 完成。 為使本發明更能充分理解，提供下列實施例。這些實 施例僅作為說明之用，絕不應理解為縮限本發明之範圍。 本說明書提及之所有發表文獻皆併入本發明作為參考。C.實施例實例1·於大腸桿菌產製突變蛋白質 突變蛋白質係利用位置一主導突變生成法產生，其使 用含有對應至所欲突變之密碼的引子，此基本上如Kunkel TA，Roberts JD，與 Zakour RA，“Rapid and efficient site- specific mutagenesis without phemotypic selection，， (1987)，Mothods Enzymol· 154:367-382 所載。簡言之， 人類IL-2 cDNA再選殖至M13噬菌體載體M13 mpl9(New England Biolabs，Beverly，ΜΑ)中。利用聚合酶鏈鎖反 應（“PCR”），自cDNA庫獲得野生型IL-2 cDNA，該cDNA 庫係由分離自人類周邊血液淋巴細胞之mRNA產生，而 該淋巴細胞經過弗伯（phorbol) 12-肉豆蔻酸酯13-乙酸 酯（10ng/ml)誘生24小時。適用IL-2開放譯讀架構5’ 端之PCR引子為： 5, -CCT CAA CTC CTG AAT TCA TGT ACA GGA TGC-3’ -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

•本頁) 訂

1223663 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（33 ) (SEQ ID N0:3)； 適用IL-2開放譯讀架構3’端之PCR引子為：5，-GGA AGC GGA TCC TTA TCA AGT CAG TGT TGA G-3, (SEQ ID N0:4) ° 將EcoRI(5’-端）及BamHI(3’-端）限制酶位置併入每 個寡核苷酸並以斜體字標明。所使用之PCR條件為：94 °(：歷1分鐘，58.7°C歷1分鐘，及72°C歷1分鐘，經 25次循環。所得正確之IL-2 cDNA序列予以定序確認， 其係使用 Sequenase㊣定序套組（Amersham Life Sciences，Arlington Heights, IL)，根據廠商指示操 作。含有尿喊°定之單股DNA(u-DNA)係以含有IL-2 cDNA 之M13m pl9轉形大腸桿菌CJ236菌株（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)製得。位置主導突變生成 法使用的通用引子含有對應至突變標靶密碼5’端之模 板u-DNA的15個核苷酸，併入所欲改變之核苷酸，及 對應最後一個被改變核苷酸3’端之模板u-DNA的額外 10個核苷酸。最初，位置主導突變生成法係用於導入 Nco I限制酶位置至人類IL-2成熟序列的起端。使用此 限制酶位置，將N-端甲硫胺酸殘基納入，其主導大腸 桿菌細胞質處的表現，例如使用表現載體pET3d。 此目的所用之引子為·· 5, -GCA CTT GTC ACA AAC ACC ATG GCA CCT ACT TCA AGT-3’（SEQ ID NO:5); 在D20、N88、及Q126位置納入突變所使用之特異 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0'乂297公釐） (請先閱讀背面之注意事項本頁)

訂

1223663 A7 B7 五、發明説明（34 ) 引子是： D20X: 5’-GGA GCA TTT ACT GCT G丽 NTT ACA GAT G-3, (SEQ ID NO:6) N88X: 5’-GGG ACT TAA TCA GCN 丽A TCA ACG TAA TAG-3’（SEQ ID NO:7) Q126X: 5’-GGA TTA CCT ΠΤ GTN NNA GCA TCA TCT C-3, (SEQ ID NO:8) 此時NNN被置換為編碼組織胺酸（CAC)或異亮胺酸 (ATC)(D20位置）、精胺酸（CGT)、甘胺酸（GGT)、或異亮 胺酸（ATC)(N88位置），或亮胺酸（CTG)(Q126位置）的合 適密碼。其他突變使用類似策略及針對指定突變之適合密 碼。引子經磷酸化，其係根據廠商指示使用T4多核苷酸 激酶（New England Biolabs, Beverly，MA)。將引子接合至 U-DNA 模板並以 T7 DNA 聚合酶（Bio-Rad Laboratories， Hercules，CA)延長之，然後以5//1反應混合液轉形大腸 桿菌 DH5aTM 菌株細胞（GibcoBRL，Gaithersburg，MD)，種 入含有0· 7%ί复脂之LB培養基。於37°C培養後，將嗟菌斑 展開係挑出單一噬菌斑、將其轉移至2毫升之LB培養 基，並於37°C生長一夜。分離單股DNA係根據廠商指 示使用M13純化套組（Qiagen公司，Chatsworth，CA)， 鑑疋含有所欲突變之純系係根據廢商指示使用Sequenase_ 定序套組（Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL)將單股DNA定序。使用及/加1由複製型DNA 分離IL-2突變蛋白質cDNA，該複製型DNA對應至含有正 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（21GX297公襲） " (請先閲讀背面之注意事項本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 351223663 A7 B7 五、發明説明（ 確突變序列之噬菌斑，將此cDM再轉殖至質體載體 pET3a(Stratagene，San Diego，CA) (Strat)。以含有突變 蛋白質之pET3a載體轉形大腸桿菌菌株BL21，令其生長至 ABS28。介於0.60至1.0之間，此時加入〇.4mM IPTG以誘 導IL-2突變蛋白質的生產。 實例2.自大腸桿菌萃取及純化IL-2突變蛋白質 誘發3小時後，以10, 000 X g離心回收細胞。還原 重組型IL-2突變蛋白質，藉由初次分散細胞於1〇倍體積 (體積/細胞團重量）之蔗糖/Tris/EDTA (0.375M蔗糖， 10mM Tris/HCL pH8.0，ImM EDTA)純化該蛋白質。令分散 後的細胞在冰浴中以300W，間隔休息30秒，超音波震盘 3次，其係使用配備1英吋標準探針的Missonix型號 XL2020之超音波震盪器。隨後將超音波震盪後的物質於4 。(：，以17,000 X g離心20分鐘。清洗此時應該為白色 之細胞團塊，此係於蔗糖/Tris/EDTA緩衝液中再次懸浮 且離心一次，以 Tris/EDTA 緩衝液（50mM Tris/HCL pH8.〇 1 mM EDTA)再次懸浮且離心兩次，最後再次懸浮於1〇倍 體積之0·1 m Tris/HCL，ρΗ8·0緩衝液（取出此時的樣品進 行凝膠分析），於17, 000 xg離心20分鐘。 溶解團塊係加入3倍體積於〇. 1 M Tris/HClXpHS. 0) 中之8M脈酿氣’及0.1% (體積/體積）2-嫌基乙醇。室溫 培養2小時後，令樣品於17, 〇〇〇 Xg離心20分鐘。令所 -37- ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事¾再^^本頁} H壯今 本一 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 , A7 -----— B7_ 五、發明説明（刊） '~-一~— -- 得溶液對20倍體積之1〇mM Tris/Ha，pH8 〇，隨腿 t 4°C透析約20小時。以17,〇〇〇 xg離心此溶液2〇分 鐘，权正至〇·1%三氣乙酸，於〇·22微米渡膜器中過 濾。立刻將此溶液轉移至經超音波處理的瓶子，連接至c8 管柱（Vydac 208 ΤΡ54)。使用20分鐘線性梯度純化化―2 犬隻蛋白貝，该梯度係使用45-85%乙腈於〇·ι%τΜ中。 測定溶離蛋白質的濃度係根據删與胺基酸分析。將此 蛋白質平均分裝（100 mL)於經超音波震盪處理過的試管 中，保存於攝氏-20度。如此純化之突變蛋白質通常在 SDS-PAGE(鍍銀染色）觀察到單一帶，利用胺基酸分析定量 之（通常正確性>90%)。 實例3. T細胞增生分析法 自約100mL正常人類血液（irwin Memorial Blood Bank, San Francisco, CA)分離周邊血液單核細胞 (PBMC) ’該金液以1:2稀釋於冰冷的])ulbecco’s磷:酸鹽緩 衝鹽水（不含 Ca 及 Mg2+ ; DPBS)。以 Ficoll-Pague (Pharmacia)鋪底，將樣品離心以分離pbmc，然後以冷 DPBS充分沖洗。再懸浮細胞於含有10%胎牛血清（Hyclone) 之RPMI 1640 ’加入分別為1% (w/v)之下列物質：l-麵胺醯 胺；非必須胺基酸；丙酮酸鈉；及抗生素-抗黴菌素（RPMI 培養基），密度為1X106細胞/毫升，生成PHA胚細胞（經 活化之T細胞）。加入植物血球凝集素（PHA-P，Sigma)至 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公餐) I - - (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 A7 B7 五、發明説明（ 37 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 終濃度為10 // g/mL，令細胞於37 °C，5% C02 ’培養3 天。回收細胞，以DPBS清洗兩次，再懸浮於RPMI培養 基中，置入96-井平底培養盤，密度為1X105細胞/井， 每井為200 // 1，其具有不同濃度之IL-2或突變蛋白質 於RPMI培養基中。令培養盤於37°C培養48小時，加入 l#Ci3H-胸腺核（Dupont NEN-，Boston，MA)/井，歷 6 小 時，回收，將回收細胞置於玻璃纖維濾紙上之後，測定放 射活性。 實例4· NK細胞增生分析 自約100mL正常人類血液（Irwin Memorial Blood Bank, San Francisco, CA)分離周邊血液單核細胞 (PBMC)，該血液以1:2稀釋於冰冷的Dulbecco’s磷酸鹽緩 衝鹽水（不含 Ca2+ 及 Mg2+ ; DPBS)。以 Ficol卜Pague (Pharmacia)鋪底，將樣品離心以分離pBMC，然後以冷 DPBS充分沖洗。將NK細胞與其他細胞分離。為達此目 的，較好使用Miltenyi Biotec，s NK細胞分離套組(Bergisch Gladbach，德國；Cat#465-01)。此套組由兩種 試劑、分離管柱及磁性非常強構之管柱支持物構成。第一 種試劑是經半抗原共軛之單株抗體CD3，CD4，CD19，⑶犯 混和液，該單株抗體為鼠IgG1同型抗體。可預期辨識這 些細胞類型的任何抗體組合皆可使用。第二種試劑由共軛 至抗半抗原抗體之膠體超順磁MACs微粒組成。再懸浮細 -39- 木紙張尺度適用中國國家標準（) (請先閲讀背面之注意事項再1^>本頁) · ϋϋ · 訂 1223663 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明説明（38 , 胞有0.5%胎牛血清及2mM EDTA之PBS⑽S/EDTA)。 心/于液之體積由所用之細胞數目決可ώ Miltenyi Bio'ec·製作的對照表提供。一般而言，細胞數目為2至 5X10 PBMC’則將細胞懸浮於800# 1緩衝液，然後使用各 f 200// 1之各種試劑。與試劑靜置反應後，將細胞加至 笞柱（再心浮於2mL緩衝液）。非NK細胞黏附至磁鐵（被 除盡）’分㈣K細胞且順流回收之。清洗細胞，再懸浮於 RPMI培養基（含有：麵難，對此培養基加入各為1% 之下列物質：L-麵胺醯胺；非必須胺基酸；丙酮酸鈉；抗 生素—抗徽菌素（全部購自Gibco/BRL，Gaithersburg, MD)，10°/°胎牛血清（Hyclone)，種入96-井平底培養盤， 密度為1X105細胞/井，每井為2〇〇 # 1。回收細胞，以 DPBS清洗兩次，再次懸浮於RpMI培養基並種入96_井平 底培養盤，密度為1X105細胞/井，每井為2〇〇 #丨，含 有不同濃度之IL-2或突變蛋白質於RPMI培養基中。令培 養盤於37°C培養48小時，加入l#Ci3H-胸腺核（Dupont NEN一，Boston, ΜΑ)/井，歷6小時，回收，將回收細胞置 於玻璃纖維濾紙上之後，測定放射活性。實例5·選擇活化Τ細胞，優先於ΝΚ細胞，之突變蛋 白質 突變蛋白質係利用位置主導突變生成法（Kunkel氏等 人，（1987)， Methods Enzymol 154: 367-382)在 Asp-20 、 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (請先閱讀背面之注意事項

本頁) 、\呑 1223663 A7 ' B7 五、發明説明（39 )

Asp-84、Asn-88、及Gin-126位置產生的，並根據廠商使 用說明（Stratagene)，利用pET-3a表現系統在大腸桿菌 中表現。純化突變蛋白質係如上所述將包涵體於胍-HCL 中回收、再摺疊、並利用HPLC層析之。所得蛋白質於鍍 銀SDS-PAGE顯示有>95%純度，根據胺基酸分析法（AAA精 確度通常>90%)分析濃度與純度。確認具有合適活性之突 變蛋白質的序列，其係使用質譜分析。令純化後的突變蛋 白質於上述T及NK細胞分析法中分析。IL-2突變蛋白質 於T及NK細胞分析法中的相對活性示於表1。 表1-評估突變蛋白質之T細胞選擇活性 (請先閱讀背面之注意事項 »1裝— 本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 相對活性 相對活性 :突變蛋白質 T細胞相對於NK細胞 ^ T細胞 NK細胞 野生型IL-2 •D20突變蛋白質 1 1.00000 1.00000 D20A 5 0.00024 0.00005 D20H 3900 037081 0.00009 D20I 7600 4.59635 0.00061 D20K 330 0.06301 0.00019 D20L 100 0.00063 0.00001 D20M · 490 0.05372 0.00011 D20N 160 0.03000 0.00019 D20Q 100 0.03180 0.00032 D20R 33 0.00018 0.00001 D20S 170 0.06640 0.00038 D20T 1 1.00000 1.00000 D20V ' 10 0.00093 0.00009 D20Y N88突變蛋白質 1000 0.06587 0.00007 N88A 50 0.50000 0.01 N88E 10 0.01172 0.00115 N88F 22 0.02222 0.001 N88G 980 8.33333 0.00853 -41- 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1223663 A7 B7 五、發明説明（4〇 ) Ν88Η 3 0.00100 0.001 Ν88Ι 9600 0.98074 0.00010 Ν88Κ 3 0.00010 0.00032 N88L 4 0.00400 0.001 Ν88Μ 250 0.25000 0.001 N88R 6200 0.89730 0.00015 N88S 80 0.00200 0.16000 Ν88Τ 395 0.50000 0.001266 N88V 67 0.06670 0.001 N88W 1 0.00100 0.001 Ν88Υ Q126突變蛋白質 8 0.00800 0.001 Q126A 0.30 0.01743 0.05809 Q126D 240 0.14630 0.00061 Q126E 400 10.0000 0.02500 Q126F 32 0.87358 0.02749 Q126G 100 0.55556 0.00556 Q126H 0.03 0.02216 0.73875 Q126I 33 0.00100 0.00003 Q126K 1.0 1.00000 1.00000 Q126L 680 3.06186 0.00447 Q126M 9.1 19.94092 2.19298 Q126N 10 6.57895 0.64993 Q126P 3.0 0.00032 0.00011 Q126R 11 4.02695 0.36392 Q126S 33 0.03417 0.00103 Q126T 3.3 0.00010 0.00003 Q126V 330 1.00556 0.00302 Q126W 1.0 0.20000 0.20000 Q126Y 10. 0.88500 0.08850 突變蛋白質之活性，與相同分析法中野生型IL-2之 EC5。比較，以達到50%最大反應（EG。）所需的突變蛋白質之 相對濃度表示；當相同突變蛋白質進行複數分析時，列出 數值的幾何平均值。野生型IL- EG〇值於T細胞分析法 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 Α7 Β7 五、發明説明（41) 中介於〜1 pM至150pM之間，於NK細胞分析法中介 〜50Pm〜200pM之間突變蛋白質之T細胞對NK細胞活性比， 以突變蛋白質對T細胞之相對活性除以突變蛋白質對NK 細胞之相對活性來表示。測定對對每一個突變蛋白質之活 性比，其僅利用來自單一種捐贈者之細胞於指定T及NK 細胞分析法所測得之活性。 突變蛋白質之活性可分為6大類：1)1000倍T胞選 擇性；2)大於100，但小於1000倍之T細胞選擇性；3)大 於10，但小於100倍之T細胞選擇性；4)相對於IL-2對 T細胞有改良活性；5)NK細胞選擇性；6)對T或NK細胞 有10倍以上之選擇性。 第 1 類：D20H、I 及 Y ; N88G、I 及 R。 第 2 類：D20K、L、Μ、N、Q 及 S ; Ν88Μ 及 Τ ; Q126D、W、G、L 及 V。 第 3 類：D20R ; Ν88Α、Ε、F、S 及 V ; Q126F、I、Ν、R 及S。 第 4 類：D20I ; N88G ; Q126E、L、Μ、Ν 及 R。 第 5 類：Q126A、Η。 第 6 類：D20A、Τ 及 V ; Ν88Η、Κ、L、W 及 Υ ; Q126K、 Ρ、Τ、W 及 Υ ° 第1-3類中，較佳突變蛋白質是具有接近野生型IL-2 對Τ細胞之活性或更佳活性。第1類中，包括D20H及 I ; N88G、I 及 R ;第 2 類中，包括 Ν88Μ 及 Τ，Q126D、 Ε、G、L及V ;第3類中，包括Ν88Α、Q126F及G。第4 ___-43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 衣· 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

IZZJOOJ IZZJOOJ B7 5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 發明說明 強中的大變蛋白質預期比野生型IL_2之活體内效力更 突變it/可知’ _分析法中單—突變不會造成w 不同位置二=\但可得到會導致活性嚴重減弱之兩個 度親合力 其可麟τ細胞，或對其他攜帶高 類梓二江―2受體之細胞種類，產生拮抗IL-2活性。這 之二几劑係由這些設計突變來只改變11^21^/3與IL—2Rr '、互作用之數據而推測的。這類實施例之一是雙重突變 ^質__26T。弱活性突變在同—分子的組合預期在 自然界將有組合，易言之，D20R S Τ細胞有0.00018活 性’ Q126T對Τ細胞有〇· οοο〗活性，雙重突變蛋白質 D20R/Q126T預期對τ細胞有野生型IL-2之〇.〇〇〇〇〇〇〇18 活性。其他組合可由提供的數據得知。 實例6·野生型IL-2及IL-2突變蛋白質之生物活性 圖1至7表示野生型人類il-2(IL-2)及D20H之劑量 -反應曲線圖（圖1)，IL-2及D20H(圖2)，IL-2及 N88G(圖 3)，IL-2 及 N88I (圖 4)，IL-2 及 N88R(圖 5)， IL-2 及 Q126E(圖 6)，及 IL-2 及 Q126L(圖 7)。A:初代人 類T細胞增生分析法（PHA-胚細胞）中，IL-2 (實心圓）及 突變蛋白質（空心圓）之個別劑量反應。B:初代人類NK細 胞增生分析法中，IL-2 (實心三角）及突變蛋白質（空心 三角）之個別劑量反應。 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) -訂_ 431223663 A7 五、發明説明（ 圖1實驗顯示，對τ細胞⑷分析中達到通最大增 生之野生型IL-2劑篁（EC5〇)約1·5 XIO、，#ΝΚ細胞⑻ 分析◦中達到50%最大增生之野生型IL-2劑量瓜）約！ Xl〇1(^D20H在此T細胞分析中的EC5〇約2 χι〇-1〇Μ，但 於ΝΚ細胞分析中估算為>1χι〇-5Μ。故此分析法測得了 D2〇H在T細胞活性上超過NK細胞活性的淨改良〉5〇 〇〇〇 倍，似結果可由其他壯者之錢獲得（轉未顯示）。 圖2實驗顯示，對τ細胞（A)分析中達到5〇%最大辦 生之野生型IL-2劑量⑽。）約L5 X1G,M，對NK細胞（;) 分析。中達到·最大增生之野生型IL—2劑量（I)約3 x1〇1()m°D2〇i在此τ細胞分析中的EG。約15 χΐ(Γ1()Μ， =於ΝΚ細胞分析中估算僅僅約5Χ1〇-6μ。故此分析法測 得，D20H在τ細胞活性上超過νκ細胞活性的淨改良約 16,000倍。類似結果可由其他捐血者之血液獲得（數據未 顯示）。 圖3實驗顯示，對Τ細胞（Α)分析中達到5〇%最大增 生之野生型IL—2劑量(EC,)約4納，„細胞(心 分析◦中達到5〇%最大增生之野生型IL—2劑量（叫約2 ΧΙΟ Μ。N88G在此T細胞分析中的EC5。約5 Χ1(Γ12 Μ，但 =ΝΚ細胞分析中估算僅僅約3χι〇_8 Μ。故此分析法測 得，N88G在τ細胞活性上超過ΝΚ細胞活性的淨改良約 1,200倍。類似結果可由其他捐血者之血液獲得（數據未 顯示）。 圖4貫驗顯示，對Τ細胞（a)分析中達到50%最大增 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 、1Τ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

1223663 A7 Β7 五、發明説明（1 ) v 44 7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 生之野生型IL-2劑量（EC5。）約1·5 Χ1(Γ1()Μ，對NK細胞（B) 分析中達到50%最大增生之野生型il-2劑量（EC5。）約1 Χ10 1GM。Ν88Ι在此Τ細胞分析中的EC5。約4 X10_1QM，但 於NK細胞分析中估算僅僅約5xl〇-6 μ。故此分析法測 知，N88I在T細胞活性上超過NK細胞活性的淨改良約18, 000倍。類似結果可由其他捐血者之血液獲得（數據未 顯示）。 圖5實驗顯示，對τ細胞（A)分析中達到50%最大增 生之野生型IL-2劑量（ECso)約1.5 Χ1(Γ1()Μ，對NK細胞（B) 分析中達到50%最大增生之野生型IL-2劑量（ECs。）約1 ΧΙΟ M。N88R在此T細胞分析中的ECs〇約9 X10_11M，但 於NK細胞分析中估算僅僅約3Χ1(Γ7 μ。故此分析法測 得，N88R在T細胞活性上超過NK細胞活性的淨改良約5,000倍。類似結果可由其他捐血者之血液獲得（數據未 顯示）。 圖6實驗顯示，對T細胞（A)分析中達到5〇%最大增 生之野生型IL-2劑量（EC5G)約8 Χ1〇-12Μ，對NK細胞（B) 分析中達到50%最大增生之野生型IL-2劑量（EC5〇)約5 ΧΙΟ11 Μ。Q126E此T細胞分析中的EG。約8 xi〇_13m，但於 NK細胞分析中估算僅僅約2 Χ1〇-9Μ。故此分析法測得， Q126E在T細胞活性上超過NK細胞活性的淨改良約4〇〇 倍。類似結果可由其他捐血者之血液獲得（數據未顯示）。 圖7實驗顯示，對T細胞（A)分析中達到最大增 生之野生型IL-2劑量（EG。）約5 XIO+M，對Νκ細胞（幻分 -46- 本紙張尺度適用中國國家德進，、Λ/ii目故Min Y 7Q7八签 \ (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 太 、π 1223663 五、發明説明（ 45 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 析中達到50%最大增生之野生型IL—2劑量(ec5〇)約8 Χίο-、。 Q126L在此T細胞分析中的EG。約2 Xl〇-uM，但於NK 細胞分析中估算僅僅約2Χ1(Γ8 Μ。故此分析法測得， Q126L在τ細胞活性上超過ΝΚ細胞活性的淨改良約625 倍。類似結果可由其他捐血者之血液獲得（數據未顯示）。 實例7·黑猩猩毒性試驗 自表1列出的IL-2突變蛋白質篩選出il—2/N88R，因 為在初代人類T及NK細胞分析法中證實其具有τ細胞選 擇促動活性。相對於野生型IL—2，其對τ細胞之活性大於 ΝΚ細胞約6, 000倍，其呈現基本上相當於野生型a—2對 Τ細胞的活性。IL-2/N88R係由CH0細胞生產、純化、並以 黑獲猩模式評估IL-2活性及毒性。此活體内模式中，化一 2/N88R呈現之Τ細胞活性可比擬商業上可獲得之IL—2重 組變種（PROLEUKIN TM，Chiron 公司，EmeryviHe，加 州），但比車父上只引起輕微副作用（就對象及臨床參數而 論）。 A.實驗設計 1.材料與方法 此研究之實驗部分在新伊伯利亞研究中心（New Iberia，LA，Sponsor Bayer公司，柏克萊，加州）進行， 其涉及兩階段研究及11位剛成年至成年之公黑獲猩，體 重介於約45至70公斤之間。 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 、11 1223663 A7 1___B7 五、發明説明（46 ) 第I期研究是劑量決定期，其中輸送載劑之皮下劑量 或PROLEUKIN之皮下劑量為1.2 mg/m2，每天兩次（BID)， 歷5天。第II期研究比較皮下施用載劑、PROLEUKIN，及 IL-2/N88R，每12小時一次（ql2h)，歷5天。根據藥物動 力學分析，選擇IL-2/N88R之劑量以提供與PROLEUKIN之 比較。獲取血液樣品以進行血液化學分析、CBC、出血/ 凝血，及T及NK細胞群之FACS分析，詳述於第5及6 章。 表2A.第I期計劃 (請先閲讀背面之注意事項再^本頁) 組號 動物數 測試物質 劑量 用藥頻率 1 1 載劑 NA 每天兩次，歷5天 2 2 PROLEUKIN 1. 2 mg/m2 每天兩次，歷5天

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表2B.第II期計劃 組號 動物數 測試物質 劑量 用藥頻率 1 2 載劑 2. 4 mg/m2 每12小時一次，歷5天 2 3 PROLEUKIN 1. 2 mg/m2 每12小時一次，歷5天 3 3 IL-2/N88R 1.2 mg/m2 每12小時一次，歷5天 2.劑量計劃 研究期間，在施用測試物質或載劑之前要取得血液， -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 1223663 A7 B7 五、發明説明（47 ) 利用肌内注射氯胺酮（ketamine )將動物完全麻醉，其劑量 約10 mg/kg。研究期間不需要採血，施用測試物質或載劑 之前，利用壓擠箱將動物以物理方式控制固定。劑量以每 12小持皮下注射施用，歷5天，在研究第1天將注射位置 剃毛。對每種劑量皆紀錄用藥位置與時間。 3.臨床觀察 (a) 每日觀察與食物消耗量。每天觀察各動物兩次並向研 究主持人報告異常現象。顯出病態的動物提醒研究主持 人、計劃獸醫師、及贊助者代表。每日兩次目測觀察食物 消耗量並記錄之。 (b) 體重。研究前、第1天用藥前、及每次動物進行採血 時，稱其體重。 (c) 注射位置之觀察。每天觀察注射位置。紀錄任何異常 外觀例如發紅或腫脹。 表3A.第II期樣品收集之計劃表 (請先閱讀背面之注意事項頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 時間 CBC CHEM C0AG FACS 發起物分析 研究前 X X X X X 第1天，用藥前 X X X X X 第1天，15分鐘 X 第3天，用藥前 X X X X X 第3天，15分鐘 X -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1223663 A7

7 B 五、發明説明（48 )

第6天 X X X X X 第8天 X X X X X 第10天 X X X X X 第12天 X X X X X 第15天 X X X X X 第30天 X X X X X 4.處理樣品 (a)血清化學。在上述特定時間點，自每隻動物收集約2 毫升血液樣品至沒有抗凝血劑之試管。紀錄血液收集時 間，令血液在室溫凝結成血塊。然後離心樣品，分離血清 且送至NIRC臨床病理實驗室。NIRC標準血清化學分析組 如表4所示： 表4.血液化學組 (請先閱讀背面之注意事項

本頁) 、11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 納 磷 鉀 尿素氮 氯 肌酸酐 總膽紅素 總蛋白質 驗性鱗酸 白蛋白 乳酸脫氫 （LDH) 白蛋白/球蛋白比值 天冬胺酸轉胺 （AST) 葡萄糖 丙胺酸轉胺 （ALT) 鈣 二氧化碳（C〇2) T -麩胺醯轉換 （GGT) -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1223663 , A7 _____________ B7 五、發明説明（49 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ⑹。在上述特定時間點，自每隻動物收集約2 毫升血液樣品至腿試管，送至隊臨床病理實驗室。 標準·錢學分频包括騎有樣品進行全血計數、 區分、及血小板計數。 (c)魅缝在上述特定時間點，收集約6毫升血液 樣品至具有EDTA作為抗凝血劑之試管。紀錄血液收集時 間。離心樣品，分離血漿並將其分裝至三支獨立的試管。 冷凍保存該血漿（-60°C或更低），此研究一旦完成，立刻 將血漿運送至拜爾公司，加州柏克萊。 "5. FACS (a)逢並座程。於FACS分析法特定的時間，收集約5毫升 血液樣品於肝素鈉鹽抗凝血劑中。 獲得在EDTA、ACD或肝素中的全血樣品。將細胞數調 整至每mm3為2千至2萬。 適當標示用於進行抗體分析之12χ75玻璃或塑膠試 管。根據廠商建議之體積，將抗體或抗體混合液加入試 管。 每隻試管加入100 //1充分混合之血液樣品，令此混 合液於室溫、避光、培養30分鐘。 培養後’加入2 ml溶解溶液（Becton Dickinson FACS 商標溶解溶液，BD#92-0002)，溫和震盪此混合液，室溫靜 置10分鐘。然後令試管於室溫下，以3〇〇Xg離心5分 -51- 尽，，，氏張尺度通用中國國家標準（CNS ) a4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

本頁)

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m m I- - HI 1--- I— j i I ......- 1223663 A7 ；__；_ B7 五、發明説明（5〇 ) 鐘。抽離上清液，以大量液體遮蓋且將1毫升PBS緩衝液 (GIBC0 14190-144)加至每份細胞團塊。溫和震盈後，令試 管於室溫、以300Xg離心5分鐘。抽離上清液，將1毫升 固定溶液（0.5%甲醛溶液，以1:20，利用PBS緩衝液稀釋 10%甲酸（Polyscience公司，#0418)所製備的）加至每份細 胞團塊之前，以大量液體遮蓋，溫和震盪以再次懸浮之。 然後以Coulter EPOCS SL流動細胞計數器分析樣品。 此研究所用之抗體：MIgGl/MIgGI同型對照（Becton Dickinson,產品編號#349526)、CD45-PerCP (Becton Dickinson, 產品編號 #347464)、CD8-FITC(Becton Dickinson，產品編號 #347313)、CD25-PE(Becton Dickinson,產品編號#30795X)、 CD4-FITC(Becton Dickinson,產品編號#340133)、CD16-PE (Pharmingen，產品編號#347617)、及 CD3-PerCP(Becton Dickinson,產品編號#347344)。 6.凝血試驗 在上述特定時間點，收集約2毫升全血樣品至添加檸 檬酸鈉作為抗凝血劑之試管。凝血試驗由凝血酶原時間 (PT)、部分凝血活酶時間（APTT)及纖維蛋白原組成。 B.結果與討論 1. PROLEUKIN劑量決定 此期之主要目標在於確定與IL-2/N88R比較的最佳 PROLEUKIN劑量。PROLEUKIN的最佳劑量以可耐受的劑量為 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） '' - (請先閲讀背面之注意事項頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 A7 B7 五、發明説明（ 51 經 濟 部 智 慧 財 產 局 消 費 合 作 社 印 製 目標（低於最大耐受劑量），此劑量能如所願的造成臨床上 顯著、中等且可逆的毒性。決定1· 2 mg/M'每日兩次，之 PROLEUKIN劑量作為最初劑量，此劑量係根據pR〇LEUKIN 臨床劑量計劃、其對應之毒性、及公司内部彌猴 PROLEUKIN劑量-反應結果所得的跨物種外推法。 以上述方式，使用PROLEUKIN處理兩隻黑猩猩。這些 動物在用藥過程中逐漸變得活力低、痛苦及脫水。自第3 或4天起，兩隻動物皆呈現出嚴重腸胃道病徵，包括食慾 降低、下痢、嘔吐。其中一隻動物（編號χ—159)之用藥在 用藥後二天中斷，因為血液化學之分析物數值顯示有嚴重 月功能失調（圖8Α&Β)及中度肝功能失調（圖gC&D)。該數 值包括增加血中尿素氮（BUN)、肌酸酐、及總膽紅素、 ALT(SGPT)。對兩隻PR〇lEukIN處理的動物皆予以靜脈提 供合乳酸鹽之林格氏（Ringers)溶液，（動物X—159)於第3 及4天提供，（動物χ-κρ只於第4天提供，此係作為再 次興奮或防止進一步脫水。在第8天排除對編號χ_ΐ59動 物的研究’因為腎功能失調且其右腿可能有血栓，因其呈 現非常少的脈搏（股脈搏），並且整條小腿冰冷且腫大。雖 然只在一隻動物發現明顯毒性，另一隻動物的經歷較不嚴 重且對兩隻動物之副作用皆為可逆的。據此，決定 L2mg/M2之PROLEUKIN及均等劑量（根據公開揭示者）的 IL—2/N88R，每小時一次，為比較此兩種化合物的合適 劑量計劃。

(請先閲讀背面之注意事項本頁) 丨裝· 本

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7 B 五、發明説明（52 ) L IL-2/N88R 對 PROLEUKIN 之比鮫 座床觀察。表5列出此研究過程中所得的臨床觀察結果。 所記載的數值係根據〇至5之計分，其中5是最嚴重。經 PROLEUKIN處理的動物全部病重；其中有一隻為PROLEUKIN 處理所致之死亡。PROLEUKIN處理組第6天後記載之數 值，係由剩下的兩隻動物反應出來。IL-2/N88R組的最明 顯副作用似乎是輕微的腸胃道不適（嘔吐），雖然就表4 顯示參數觀之，此處理並未引起輕微毒性。在第6天， PROLEUKIN組的體重滑落6%，第10天降至10%，然後緩慢 回復（參見圖9)。相反的，IL-2/N88R組及載劑組之體重減 少最多只有1-3 %。 (請先閱讀背面之注意事項

本頁) 訂 表5·臨床觀察* 處理 一般狀況 食慾不振 嗜眠 GI 身體不適 IL-2/N88R 良好 1 1 2 1 PROLEUKIN 病重 5 4/5 5 4/5 載劑 正常 0 0 0 0 *計分由0至5，其中5是最嚴重。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (a)血液學。IL-2/N88R誘發的細胞作用與PROLEUKIN活化 作用一致，尤其是淋巴細胞過多症（圖10A)，也觀察到 白血球（圖10B)及嗜中性白血球增加（圖10C)。此研究 處理部分之過程中（圖10D)，與PR〇LEUKIN(最壞約50%) -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） A7

1223663 五、發明説明（53 ) 比較，IL-2/N88R只誘發最底限之血小板減少症（最壞 約 15% ) 〇 (b) l^cPROLEUKIN處理的動物在第6及8天全部顯 著升高BUN值（圖11A);顯示完全喪失腎功能的兩隻動 物在第6及8天也戲劇性增加肌酸酐濃度（圖11B)。 PROLEUKIN處理組在第6及8天也增加血清磷及陰離 子濃度。相反的，所有IL-2/N88R處理的動物於研究全 程中，其腎參數基本上維持正常（圖11C&D)。 (c) jf.功能。PROLEUKIN處理組於第6天之總膽紅素增加 至少三倍，第1〇天仍維持高濃度（圖12A)。相反的， IL-2/N88R處理組中只有一隻動物於第3及6天似有似 無地輕微增加。所有PROLEUKIN處理的動物於第3及6 天顯著增加血清SGPT濃度，超過1〇〇 u/L (圖12B)。 編號A199動物的SGPT濃度達651 U/L，SG0T達2789 U/L(實驗室筆記：NIRC#8754-9852-第II期，表丨個體 及組平均化學數值，該表21頁中的第17頁），顯示有 嚴重肝衰竭。 (d”疑A反1。PROLEUKIN及IL-2/N88R處理組之纖維蛋白 原》辰度皆增加兩倍以上’第6天達到最高（圖12C)。 PROLEUKIN處理組發生增加情形似乎比L-2/N88R處理 的動物更早。此可根據第3天增加51%相對增加5%反 應出來。纖維蛋白原的變化是急性蛋白質反應的結 果，非凝血缺陷，因為相同時間内APTT或PT無重要的 變化（圖12D)。由第10天開始，PROLEUKIN處理組的 -55· 本紙張尺度適用中關家標準（CNS ) A4規格（21GX297公釐) 〜-- (請先閱讀背面之注意事項本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 A7 ______B7 五、發明説明（54 ) APTT濃度呈現明顯增加的趨勢，雖然其實際數值仍然 在正常範圍内。也在IL-2/N88R處理組觀察到相同趨 勢’雖然私度較小。但值得注意的是，根據此兩個處 理組相同時間内，纖維蛋白原濃度顯示已轉為更低。 (e)盤環境穩三隻經PROLEUKIN處理的動物中有 兩隻動物於第8天血清鈉濃度降低至135 MEQ/L以 下，但其餘動物維持正常（圖13A)。PROLEUKIN處理組 之氯濃度也於第3天開始降低至95 MEQ/L以下，並維 持降低至第15天（圖13B)。三隻經PROLEUKIN處理的 動物中有兩隻動物於第6及8天降低鈣濃度，A199動 物之鈣濃度降低至4.9及3.1mg/dL(圖13C)。所有經 PROLEUKIN處理的動物由第3至12天钟濃度降低至3 MEQ/L以下，除了 A199動物，其鉀濃度於研究中止前 確實增加至7. 2 MEQ/L之毒性濃度（圖13 D)。 (0鱼管破裂徵兆。血清白蛋白濃度在PROLEUKIN處理組 (37%)及 IL-2/N88R 處理組（19%)降低（圖 14A)。 PROLEUKIN處理組在第3及6天發現血球容積量增加 (14B)。相反的，載劑對照組與il-2/N88R處理組的血 球容積量在相同時期卻仍然低，顯示有預期的輕微貧 血’此乃因為收集多份血液樣品之故（14B&C)。 PROLEUKIN處理組之血球容積增加量加上白蛋白減少 量，與微血管破裂徵狀的發展一致。 3.細胞活化 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --- (請先閲讀背面之注意事項本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 . , A7 B7 五、發明説明（55 ) PROLEUKIN與IL-2/N88R效力由CD25陽性淋巴細胞 (移動+增生）之百分比及CD25平均螢光量或在指定的τ 細胞表面所表現的CD25抗原數目（CD25=低親合力IL-2R) 表示。CD25表現情形由總T細胞族群（CD3+細胞）及 CD3+CD4+ 與 CD3+CD8+ 族群表示。 天然殺手細胞（NK)的IL-2活性由CD3-CD16+及CD3-CD25+CD16+NK細胞之移動分析表示。測定CD3+，CD4+， CD8+，NK細胞之確實數目，係將細胞百分比乘以每刪3之 淋巴細胞數目，上述數據係由血液學分析時獲得的。 (a)QP25在T細胞表面上的表現調節：此研贫望6天之 前，以CD25陽性細胞標示的經活化T細胞百分比是向 上調節的，其主要作用在CD3+CD4+T細胞亞群。在第6 天，PROLEUKIN顯然可誘使 CD25表現在較高百分比 的CD3+，CD3+CD4+及CD3+ CD8+ T細胞總亞群。但第 8天之前，表現CD25抗原之細胞百分比相對於經過 PROLEUKIN處理的黑猩猩與經IL-2/N88R處理的黑猩猩 之淋巴細胞是相同的（圖15A，B及C)。經過PROLEUKIN 或IL-2/N88R處理的黑猩猩皆觀察到天然殺手（NK)細胞 族群表面上的CD25沒有染色。推測上述結果的原因在 於所選的NK細胞族群（CD3-/CD16+)表面上沒有表現 IL-2Ra(此抗原之標靶在於被CD25染色的細胞表面）。 CD3+CD25+T細胞之確實數目與CD3+CD25+T細胞百 分比呈現類似結果，其中PROLEUKIN顯示比IL-2/N88R 更有活性（圖 16A)。當 IL-2/N88R 誘使 CD3+CD4+CD25+ -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項\^?1||^本頁)

T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 A7 i ) ___B7 五、發明説明（56) 淋巴細胞確實數目向上調節與PROLEUKIN所見的向上調 節相同時，IL-2/N88R 有如 PROLEUKIN 對 CD3+CD4+T 細 胞族群呈現類似之T細胞活化潛力（圖16B)。 PROLEUKIN 顯示其比 IL-2/N88R 更能增加 CD3+CD8+ CD25+T細胞之數目（圖16C)。 CD3+CD4+T細胞亞群所表現的CD25分子數目（平均 螢光量）在PROLEUKIN或IL-2/N88R處理組皆呈現的相 同動力學（圖17)。 (b)淋巴細胞移動情形： PROLEUKIN與IL-2/N88R對T及NK細胞族群的活 性，係經由分析處理前、處理中及處理後之循環淋巴細 胞確實數目的變化而決定（圖18 )。IL-2/N88R顯示比 PROLEUKIN對於增加CD3+CD4+循環淋巴細胞確實數目 有更大活性（圖18A)，與PROLEUKIN比較，其增加 CD3+CD8+循環淋巴細胞確實數目的活性稍低（圖18B)。 兩種化合物皆對增加CD3+淋巴細胞總數皆有相當，雖 然中度的影響（圖18ChPR0LEUKIN及IL-2/N88R皆不 影響NK細胞的移動（圖18D)。 C.結論 IL-2/N88R係於人類初代T及NK細胞分析法中篩選 突變IL-2蛋白質所得的。其對T鈿胞之活體外選擇性高 於NK細胞約6000倍。根據此細胞分析結果，可預見施 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再ΙΡϋ本頁} 訂 άΊ. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 A7 B7 五、發明説明（ 57 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用引起明顯T細胞活化作用之劑量的1L—2/N88R時’只會 引起輕微副作用。黑猩猩實驗中，拿PR0LEUKIN與1L-2/N88R比較，可確定IL-2/N88R的安全性分析結果明顯優 於PROLEUKIN，且維持引起T細胞活化作用的相當能力。 實例8:鼠CT-26肺轉移腫瘤模型中’ IL-2選擇性拮抗 N88R的效力 操作步驟：於第0天，由尾侧靜脈將〇· 2毫升pbs中之ιχ 105 CT-26細胞（鼠大腸癌）經靜脈注射至鼠（Balb/c，母 鼠，6-8週齡）體内。治療組為使用不同濃度（稀釋度·含有 5%右旋醣之水（D5W))的 PROLEUKIN 或 IL-2/N88R，戍 D5W， 經靜脈内輸送，植入後第1天開始，每天一次，_ 8天 (QDx8)。IL-2/N88R於室溫製備’其係利用二石夕二的小 瓶，藉由結合菌素注射器將其稀釋於D5W中，並於製備2 小時内施用至動物。PROLEUKIN之製備係腌 1牟將〇·7毫升注射 用滅菌水（SWFI)加入每個小瓶（終濃度，1 ^ 96 mg/ml)。稀 釋度係如上IL-2/N88R稀釋至D5W所述（矣 b)。第u天犧 牲動物。取出肺並秤重，以PBS沖洗，极 將、、且織轉移至保因 氏（Bouin’s)溶液。24小時後，將組繙鉍 、飞轉移至10%福馬 林。在解剖顯微鏡觀察下，計算肺中轉移性的數 •59_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項^^^本頁) —裝· ^!^本

、1T -泉 1223663 A7 h 1 B7 五、發明説明（58 ) 表6鼠CT-26腫瘤模型研究之劑量與組別 組別 η 治療 劑量，mg/kg 1 14 D5W ΝΑ 2 11 PROLEUKIN 3mg/kg 3 11 PROLEUKIN lOmg/kg 4 11 IL-2/N88R 1 mg/kg 5 12 IL-2/N88R 3mg/kg 6 12 IL-2/N88R lOmg/kg 7 12 IL-2/N88R 30mg/kg 8 11 IL-2/N88R 60mg/kg (請先閱讀背面之注意事項再頁) 表7顯示個別小鼠所計算出的轉移數目。IL-2/N88R 及PROLEUKIN皆觀察到可比較的效力。IL-2/N88R於最高 劑量時（第8組，60 mg/kg)，除了一隻小鼠，其他鼠皆有 12處轉移或更少；其中有3隻小鼠沒有轉移。此結果與最 高測試劑量之PROLEUKIN的結果相反，後述結果是所有存 活的小鼠皆有12處轉移或更多。 表7個體轉移計數及平均值 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 '組別 • 肺轉移（列出個別小鼠之計數） 平均值 SEM P值(2-尾） 1 0 129 183 179 155 165 200 152 148 158 200 194 165 125 154 13.42 2 118 126 107 111 118 110 137 114 135 158 132 124 4.6i 0.07278 3 12 38 18- 19 30 23 4.66 0.00003 4 169 173 189 200 120 117 136 122 200 163 110 154 10.41 0.97029 5 171 176 186 159 192 139 117 200 195 116 192 168 9.31 0.43401 6 92 111 112 114 109 84 68 47 58 49 112 87 8.16 0.00060 7 15 13 59 62 23 55 46 16 9 4 8 2 26 6.57 0.00000 8 7 0 3 2 4 9 7 0 12 55 0 9 4.75 0.00000 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） » I1223663 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（59) 在劑量為10，30，及60 mg/kg之IL-2/N88R處理的小 鼠（分別為第6，7，及8組），以及10 mg/kg PROLEUKIN 處理的小鼠（第3組），可發現轉移之顯著減少（p<〇. 〇5)。 這些結果以圖形示於圖19。利用劑量的對數將數據作圖： PROLEUKIN之劑量為3及10 mg/kg; IL-2/N88R之劑量為 1，3，10，30及60 mg/kg。曲線校正係利用非線性方程式 (4-參數校正），得到PROLEUKIN之IQ。值為5. 2 mg/kg， IL-2/N88R 之 IC5。值為 10. 9 mg/kg。 由本實驗的數據可知，相對於轉移數目的減少，IL-2/N88R之IC5()計算為10·9mg/kg(8·6-13.9mg/kg在95% 可信區），PROLEUKIN 之 IC5〇 計算為 5.2 mg/kg (3.5-7.7 mg/kg在95%可信區）。 小鼠的存活率示於表8。10 mg/kg PROLEUKIN處理組 中，有一隻小鼠（1)在第7天死亡，另有五隻小鼠（5)在第 8天死亡。3或10 mg/kg IL-2/N88R處理組中，各有一隻 小鼠（1)在第8天死亡，1，30或60 mg/kg IL-2/N88R處理 組沒有發現死亡。此外，3 mg/kg PROLEUKIN處理的大多 數小鼠及10 mg/kg PROLEUKIN處理的所有小鼠呈彌留狀； IL-2/N88R處理的小鼠沒有發現彌留現象。 -61- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

本頁) 、11 1223663 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 _____B7 _ 五、發明説明（61 ) 感CHO (dhfr-)細胞所產生的。IL2N88R表現載體的各個組 成元件示於質體舆圖（圖20)。圖中所示CMVe/p=巨細胞病 毒早期啟動子；PA= SV40聚腺苷化訊號序列；且DHFR=二 氫葉酸還原酶表現匣。 利用標準重組DNA技術構築載體。一般而言，參見 Sambrook 氏等人，Molecular Cloning 第 2 版，1989, Cold Spring Harbor 出版；Short Protocols in Molecular iiploRy，第 2 版，1992，John Wiley & Son ; Methods in Enzymology,第185冊，Goeddel氏等人編輯，學術出版 公司’倫敦，1991。表現載體包含表現IL2N88R基因之 分散表現匣，以及可擴大且可選擇的DHFR(二氫葉酸還原 )基因。以 10 //g 之 PBC1IL2SA 轉感約 lx 106 CH0(中 國倉鼠印巢）細胞’此係根據薇商指示使用Lipofectin試 劑（Life Technology 公司，Bethesda，Maryland)。然後於 50 nM胺甲蝶呤存在下，於DME/F12培養基（Life Technologies公司）中生長而篩選細胞，該DME/F12培養基 不含胸腺核苷及次黃嘌呤，但加入5%經透析的胎牛血 清。以市售ELISA套組（R&D Systems)篩選生產IL2N88R 之細胞族群。高生產量的族群進一步於含有逐漸增加胺甲 蝶呤濃度（100至400 nM胺曱蝶呤）之培養基中選擇，並根 據IL2N88R產量篩選。然後使用限制稀釋選殖法，獲得高 產量且穩定生產的純系。於無胺甲蝶呤存在下，選殖法使 用標準組織培養技術完成。 (請先閲讀背面之注意事項

本貢) 訂 線 -63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ了97公慶) 1223663 A7 B7 五、發明説明（62 )

實例10·灌注生物反應器中無血清生產IL2N88R 持續生產IL2N88R係藉由持續灌注醱酵法達成。19 公升Wheaton醱酵槽種入實例9的安定CH〇細胞株，度 為2xl06細胞/毫升，灌注之培養基交換速率為5公升/ 天。生產用培養基是DME/F12為底的培養基（Life Technologies，Rockville，MD)，其中補充提供重組型人 類胰島素（10//g/ml)(HUMULINTM，EliLilly，Indianapolis， IN)及FeSO4.EDTA(50//M)。細胞密度維持在4χ1〇6細胞/ 毫升。此醱酵槽之平均日產量約2〇〇毫克/天。IL2N88R的 生產穩定維持30天。

實例11·純化CH0細胞所生產的IL-2/N88R 下列操作步驟係應用在上述之灌注洗出液。取出灌 注培養基，將其饋至S-sepharose管柱。平衡此管柱係 使用20毫克分子濃度之填酸鹽緩衝液，加上5毫克分 子濃度之NaCl，pH為7.0。饋入物（‘TCF”)加水並以 填酸校正其pH而調整至4毫西門子導電率。 TCF饋入後，以相同的平衡緩衝液沖洗管柱。沖 提係由改變pH而達成。以20 mM乙醇胺，pH 10.5， 沖提突變蛋白質，將該突變蛋白質自管柱洗出，得8_沖 提產物。 進行陰離子交換，其係將S-沖提產物通過QAE Fast Flow™管柱（Pharmacia)，該管柱以 pH 10.5 之 1〇 mM重碳酸鹽平衡。流速維持在250 cm/hr。沖洗至底 -64- 本紙張尺度適用中國國冢標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） C请先閱讀背面之注意事項

本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7'發明說 B7 明 63 線後，

以ρΗ4·0之20mM磷酸鹽沖提出IL_2SA 接甚進仃羥基磷灰石（HAP)層析，其係將稀釋之QAE沖 物（以 WF1 1:1 做、e·一一

II 型 稀釋）通過裝填陶瓷羥基磷灰石（第 / 〇 Bi〇-Rad，Hercules，CA)的管柱，該管柱以 pH 沖< 0·10 mM磷酸鹽平衡。流速維持在25〇 cm hr]。 先至底線後， IL2SA。 以 PH7.0之lOOmM磷酸鹽沖提出 々~基磷灰石沖提產物進行超過濾而達300毫升 j^i· 此係利用固接3支PES 5K筒之Millipore 機器（Millipore 公司，Bedford，ΜΑ) 〇 逢〜步純化經超過濾之HAP沖提產物，其係以35

Cl^/hr成 (請先閱讀背面之注意事項頁)

經^Γ、部智慧財產局員工消費合作杜印製 通過SlOOHR(Pharmacia)大小排阻管柱而達 此營柱以10 mM磷酸鹽及150 mM NaCl ， PH7 ο •Q ’平衡。 、 錢^膠過濾匯集液以WFI稀釋至達到4.0 mMhos/cm 、 辛’於上述條件下，將其再次饋至S-Sepharose。 '中提1USA係使用添加1克分子濃度NaCl之10mM 每牛駿鹽緩衝液，pH 7.0。 令最終陽離子交換匯集液於磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS) 中透柯一夜，並以滅菌PBS稀釋至濃度為6 mgs/ml。 :、、'、後將最後的稀釋匯集液過濾、滅菌，分裝並冷床在-70 C。總回收率為65%。 本發明之其他實施體系對熟悉該項技術者而言將成 為能推知的。本發明教示如何獲得本說明書未明確說明 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇X297公釐）

、1T 1223663 序列表 <110> Shanafelt/ Armen B.

Greve, Jeffrey M.

Jesmok, Gary Lembach, Kenneth J.

Wetzel, Gayle D. <120> IL-2選擇性作用劑及拮抗劑 IL-2 序列 IDs 1-8 <141> <150〉 09/080,080 <151〉 1998-05-15 <160> 8 <170> Patentln 第 2.0 版 <210〉 1 <211> 133 <212> PRT <213>人類 <400〉 1

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His 15 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met lie Leu Asn Gly 工le Asn Asn Tyr Lys 20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu 85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110

Thr lie Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Cys Gin Ser lie 115 120 125 lie Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 465 <212> DNA <213>人類 <400〉 2 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120 -70 - 1223663 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420 tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactt gataa 465 <210〉 3 <211〉 30 <212> DNA <213>人類 <400〉 3

cctcaactcc tgaattcatg tacaggatgc <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213〉人類 <400> 4 ggaagcggat ccttatcaag tcagtgttga g <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213>人類 <400> 5 gcacttgtca caaacaccat ggcacctact tcaagt 36 <210> 6 <211〉 28 <212> DNA <213>人類 <400> 6 28

30 ggagcattta ctgctgnnnt tacagatg <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213〉人類 <400> 7 gggacttaat cagcnnnatc aacgtaatag <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213>人類 <400> 8 ggattacctt ttgtnnnagc atcatctc -71 - 28

Claims (1)

1223663 ♦ a a爹正 93. 6. 2¾ 補 A 公告 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 專利申請案第88107812號 ROC Patent Appln. No. 88107812 修正之申請專利範圍中文本-附件（一） Amended Claims in Chinese - Enel. (I) (民國93年6月29日送呈） (Submitted on June 29, 2004) 1. 一種人類IL-2突變蛋白質，其依野生型IL-2編號， 其中第20位置經選自包括丙胺酸、組胺酸、異亮胺 酸、蛋胺酸、穀胺醯胺、絲胺酸、纈胺酸及酪胺酸之 胺基酸取代。 2. 如申請專利範圍第1項之人類IL-2突變蛋白質，其中 第20位置被異亮胺酸取代。 3. 如申請專利範圍第1項之人類IL-2突變蛋白質，其中 第20位置被組胺酸取代。 4. 一種人類IL-2突變蛋白質，其依野生型IL-2編號， 其中第88位置經選自包括丙胺酸、穀胺酸、組胺 酸、離胺酸、亮胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、異亮胺 酸、蛋胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪 胺酸及纈胺酸之胺基酸取代。 5. 如申請專利範圍第4項之人類IL-2突變蛋白質，其中 第88位置被精胺酸取代。 6. 如申請專利範圍第4項之人類IL-2突變蛋白質，其中 第88位置被異亮胺酸取代。 7. 如申請專利範圍第4項之人類IL-2突變蛋白質，其中 第88位置被甘胺酸取代。 8. —種人類IL-2突變蛋白質，其依野生型IL-2編號，

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 、 -JL.N 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223663 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 其中第126位置經選自包括丙胺酸、天門冬醯胺、組 胺酸、亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、異亮胺 酸、蛋胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪 胺酸及纈胺酸之胺基酸取代。 9. 如申請專利範圍第8項之人類IL-2突變蛋白質，其中 相對於野生型之第126位置被取代。 10. 如申請專利範圍第8項之人類IL-2突變蛋白質，其中 第126位置被天冬胺酸取代。 11. 如申請專利範圍第8項之人類IL-2突變蛋白質，其中 第126位置被麩胺酸取代。 12. 如申請專利範圍第8項之人類IL-2突變蛋白質，其中 第126位置被亮胺酸取代。 13. —種用於選擇性活化T細胞且具天然殺手細胞減低 之活化的醫藥組成物，其含醫藥載劑及選自包括如 申請專利範圍第1項之人類IL-2突變蛋白質、如申 請專利範圍第4項之人類IL-2突變蛋白質及如申請 專利範圍第8項之人類IL-2突變蛋白質之人類IL-2 突變蛋白質。 14. 一種人類IL-2突變蛋白質，其依野生型IL-2編號， 其在第20、88及126位置之二個或全部位置上具取 代，其中所得突變蛋白質優先活化T細胞，而非天 然殺手細胞，其中第20位置經選自包含丙胺酸、組胺 酸、異亮胺酸、蛋胺酸、穀胺醯胺、絲胺酸、纈胺酸 及酪胺酸之胺基酸取代；第88位置經選自包含丙胺 -68 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

1223663 A8 B8 C8 _D8_ 六、申請專利範圍 酸、穀胺酸、組胺酸、離胺酸、亮胺酸、苯丙胺酸、 甘胺酸、異亮胺酸、蛋胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺 酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸之胺基酸取代；及第126 位置經選自包含丙胺酸、天門冬醯胺、組胺酸、亮胺 酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、異亮胺酸、蛋胺 酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈 胺酸之胺基酸取代。 15. —種多核苷酸，其包括編碼如申請專利範圍第1項、 第4項、第8項或第14項之人類IL-2突變蛋白質的 DNA序列。 16. —種載體，其含有如申請專利範圍第15項之多核苷 酸。 17. —種原核宿主細胞，其被申請專利範圍第16項之載 體轉形。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）