UA73719C2 - Human interleukin-2 mutant which activates preferably t-cells as compared with natural killer cells, pharmaceutical composition, polynucleotide, vector, procariotic cell, a method for the stimulation of immune system - Google Patents

Description

Опис винаходу

Ця заявка є частковим продовженням заявки США з реєстраційним номером 09/080,080, що була подана 15 2 травня 1998.

Винахід відноситься до областей фармакології та іммунології. Більш конкретно, винахід спрямований на нові композиції для селективної активації Т-клітин (РНА-бластів) і зменшення активації природних кілерних клітин (ПК-клітин). Нові композиції включають варіанти групи цитокінів, зокрема, людського інтерлейкіну-2 ("7-2").

Інтерлейкін 2 (1-2) - потужний імунний стимулятор, що активує різноманітні клітини імунної системи, 70 включаючи Т-клітини, В-клітини і моноцити. І/-2 також є потужним і вирішальним чинником фактору росту

Т-клітин. Саме на підставі цих ефектів ІІЇ-2 був перевірений на його здатність лікувати рак. Людський 1-2 був схвалений ЕБА як препарат для лікування метастазів ниркової карциноми та метастазів меланоми.

Використання 1-2 у прийнятних пацієнтів є обмеженим через серйозну токсичність, пов'язану з ІІ -2 терапією; було показано, що в кращому випадку тільки 20 95 прийнятних пацієнтів фактично одержує терапію. Токсичність, 72 пов'язана з 1-2 терапією, включає сильну лихоманку, нудоту, блювоту, судинний витік та гіпотензію.

Незважаючи на токсичність, Ї-2 є ефективним з огляду на підтверджені показання (значення об'єктивної відповіді в межах приблизно 17 90).

Хоча здійснювали досить грунтовний структурно - функціональний аналіз мишачого 1-2 (7игамузкі, 5. М. і 7игамувкі, 0. (1989) Етбро .) 8:2583-90; 7цгамувзКкі, 5. М., та ін. (1990) Етбро у 9: 3899-905; 2игамувкі, 0. (1991).

Тгепав Віоїеснппої! 9: 250-7; йигамуеКкі, 5. М. і 2йгамувКкі, с. (1992) Етбро 9 11: 3905-10. 7цгамувКі, та ін, ЕМВО

У. 12 5113-5119 (1993)), проте аналіз людського І/-2 був обмеженим. Більшість досліджень людських 1-2 мутеїнів були виконані на мишачих клітинах; однак, обмежено проводилися дослідження з використанням людських РНА-бластів, які експресують І/-2 рецептор І/-2Карм високої спорідненості. Дослідження з використанням РНА-бластів підтвердили важливість залишків Авр-20 і О-спіралі людського ІІ -2. Було показано, с 29 що положення Агр-20 і біп -126 людського ІЇ-2 Е первинними залишками, що відповідають за взаємодію з В- та Ге)

Г-субодиницями рецептора 1-2, відповідно (розглянуте в ТПеге, та ін., Іттипої. Тодау, 17, 481-486 (1996)).

Хоча і було показано, що залишки в С-спіралі мишачого ІІ -2 залучені до взаємодії з мишачим 1І-2КР (7игаму»кі, та ін., ЕМВО ., 12 5113-5119 (1993)), однак не було показано, що еквівалентні людські залишки 1-2 мають ті ж самі властивості (такими залишками в людському І/-2 будуть Азр-84 і Авзп-88). Оскільки розкрита істотна о специфіка різновидностей людських і мишачих 1-2 (людський ІЇ/-2 проявляє приблизно в 100 разів меншу «- активність в мишачих системах), то важко передбачити, чи буде виникати той самий тип взаємодій в межах границь виду. Крім того, невідомі дослідження, які б застосовували клітини, що експресують тільки людський - рецептор ІІЇ-2КРу проміжної спорідненості. со

Деякі людські ІЇ/-2 мутеїни були досліджені щодо їх активності на людські РНА-бласти (Хи, та ін., Еишг. 3о СуюкКкіпе Мей, 6. 237-244 (1995)). Було показано, що мутеїни, які мають заміу Азр-20 на лейцин (0201), а в також аргінін, аспарагін та лізин, мають серйозні дефекти щодо їх здатності до індукції проліферації

РНА-бластів. Таким чином, дослід показує, що заміна Азр-20 призведе до утворення мутеїнів компромісної діїї.

Додатково, Хи, та ін. заявляє, що до цих пір (1995) не було знайдено жодних 1-2 мутеїнів, придатних для « дослідження або клінічного застосування. З

Людський 1-2 01260 мутеїн, одержаний Виспії і Сіагаей, Агсй. Віоспет. Віорпуз, 307 (2): 411-415, с (1993), показав значну компромісність стосовно як ефективності, так і агонізму; при випробуванні людських

Із» Т-клітин він виявив приблизно в 1 000 разів меншу активність, ніж 1/-2, і поводився як частковий агоніст. У випробуванні мишачих Т-клітин, мутеїн був майже неактивним. Обидві клітинні лінії що перевірялися, експресували 1-2 рецептор високої спорідненості. На обох типах кліуин 01260 показав здатність антагонізувати опосередковану ІІ -2 активність, проте це проявлялося тільки частково в аналізі Т-клітин. і 2пі-Мопд, МУ., та інші., Асіа Віоспітіса і Віорпузіса Зіпіса 25 (5): 558-560 (вересень 1993) провели оз експерименти по замінам 1-2 в положеннях 62, 69, 99 і 126, демонструючи 30- та 20-кратне послаблення дії в порівнянні з 1Ї-2 дикого типу, з 62-Іецш-ІЇ-2 та 126-Авр-І/-2, відповідно, при аналізі мишачих Т-клітин і (СТІ -2). Однак, не існує наукових тлумачень або припущень того, що заміна в положенні 126 дає можливість - 20 надати Т-клітинам селективної активності у порівнянні з природними кілерними клітинами або що такі зміни мали б подібну активність на людських Т-клітинах. с Соїпв, І. та інші, РМАБ США 85:7709-7713 (1988) повідомили, що заміна Авгр в положенні 20 на Авп (020ОМ) або Гуз (020К) призводила до втрати здатності до зв'язування приблизно в 100-1000 разів у порівнянні з людським 1/-2 як для рецепторів з високою (І./-2КаРУ, названими ,робБ/р/0" у Сопв, та ін.), так і з 29 проміжною спорідненістю (ІЇ-2КаРу, названими "р70" у СоїІпв, та ін.). Виявилося, що зв'язування з ІІЇ-2Ка не

ГФ) зазнало впливу заміни для обох білків мутеїну. Ця робота показує, що руйнування зв'язування з рецептором 1! -2 проміжної спорідненості (/-2Кру) також призведе до руйнування зв'язування з рецептором 1/-2 високої о спорідненості (І -2ВАВГ), наводячи на думку, що диференційне зв'язування з або активація ІЇ-2Крм або

І/-2КаРу не може бути досягнуте заміною Азр у положенні 20. 60 Ветаб МУ.б., та ін. Віоспетівігу 33 (21): 6571-6577 (1994) використовували комбінаторний касетний мутагенез, щоб одночасно видозмінити положення 17-21 у нативному ІІ -2, який, як припускається, взаємодіє з рецептором 1-2 проміжної спорідненості. З 2610 досліджених клонів тільки 42 були активними. Вони виявили, що положення 20 і 21 мали надзвичайну важливість для біологічної активності. Не існує тлумачень або припущень щодо індивідуальних замін за винятком 1 21М. бо Патент США Мо 5,229,109 (Сгітт та інші) описує низькотоксичі аналоги 1-2 для використання при лікуванні раку і імунотерапії. Властивості двох аналогів ІЇ-2 із замінами в положеннях Аго38 (на аланін) і Рпе42 (на лізин) були проаналізовані у порівнянні з нативним 1-2. Було встановлено, що аналоги можуть підтримувати свою здатність зв'язуватися з рецептором 1/-2 проміжної спорідненості і лише мінімально зв'язуватись з так званим рецептором "високої спорідненості". В той самий час вважалося, що рецептор проміжної спорідненості складається лише з р75 (ІІ -2Кр), а рецептор високої спорідненості складається лише з р55 ї р/5 рецепторного комплексу (І/-2Ксср). Аналоги також зберігали здатність стимулювати мононуклеарні клітини периферичної крові, щоб генерувати активовану лімфокіном загибель клітин (ГАК). Зокрема, ІІ -18 та ТМРа секреція була суттєво знижена у відповідь на аналоги у порівнянні з нативною молекулою І -2. Амінокислотні залишки, 7/0 описані в цьому патенті, були такими, що взаємодіяли специфічно виключно з ІІ -2Ка (р55); усунення взаємодій із І -2Ка призвело б до послаблення активності на клітинах, що несуть рецептор 1-2 високої спорідненості, і не вплинуло б на активність стосовно клітин, які несуть рецептор 1-2 проміжної спорідненості. Таким чином, генерування ГАК клітин (які, як вважається, одержані з природних кілерних клітин) повинно підтримуватися.

Мутеїни, описані а даній заявці, спрямовані на положення амінокислотних залишків 20, 88, і 126; ці положення, /5 як думають, специфічно взаємодіють виключно з ІІ-2Кр (р/5; положення 20 ії 88), і ІІ-2Ку (невідоме на час подачі заявки на патент Огітт та ін. положення 126). Як наслідок, взаємодії з ІЇ-2Ка залишаються незмінними.

Механістично, мутеїни, описані Огітт та ін., матимуть зменшену взаємодію з рецептором 1/-2 високої спорідненості, але не впливатимуть на рецептор 1І/-2 проміжної спорідненості; мутеїни, описані тут, мають протилежну характеристику, маючи явний дефект щодо здатності взаємодіяти з рецептором 1-2 проміжної 2о спорідненості ІІ-2Кру, і проявляють слабкий дефект або взагалі не проявляють ніякого дефекту у функціональних взаємодіях із рецептором ІІ -2 високої спорідненості ІІ -2Каргу.

Патент США Мо 5,206,344, (Соодзоп та інші.) описує мутеїни 1І-2, в яких одна з амінокислот зрілої нативної послідовності І/-2 замінена цистеїновим залишком, і які потім готують та кон'югують Через замінений цистеїновий залишок з полімером, вибраним з гомополімерів поліетиленгліколю або поліоксіетільованих сч об поліолів, де гомополімери є незаміщеними або заміщеними на одному кінці алкільною групою. Ці мутеїни одержують шляхом експресії хазяйських генів, що кодують мутеїни, які були змінені з використанням генів для і) батьківських білків шляхом сайт-направленого мутагенезу. Крім того, інші види ІЇ-2 можуть бути кон'юговані через цистеїновий залишок в положенні 125 зрілого ІЇ-2 білка, що не є необхідним для біологічної активності

І/-2. Не описані мутації, які забезпечували б знижену токсичність. Ге! зо Патент США Мо 4,959,314 (І іп та інші) описує мутеїни біологічно активних білків типу ІЕМ-В і 1/-2, в яких цистеїнові залишки, що не є необхідними для біологічної активності, були видалені або замінені іншими - амінокислотами, щоб усунути ділянки для внутрішьомолекулярного перехресного зв'язування або ї- неправильного формування інтрамолекулярного дисульфідного містка. Ці мутеїни одержані шляхом бактеріальної експресії генів, які кодують мутеїни, що синтезувалися при використанні генів для батьківських ме) білків олігонуклеотид-спрямованим мутагенезом. Не описані мутації, які забезпечують знижену токсичність. ї-

Патент США Мо 5,116,943 (НаІепреск та інші) описує, що біологічно активний терапевтичний білок може бути захищеним від окислення способом, який передбачає заміни консервативної амінокислоти для кожного метіонілового залишку, чутливого до хлораміну Т або пероксидного окислення, де додаткові, нечутливі метіонілові залишки не замінюються. Одержаний таким способом, стійкий до окислення мутеїн, є переважно « людським мутеїном інтерлейкіну-2 або інтерферону-В, а консервативна амінокислота є переважно аланіном. Не пл») с описані мутації, які дають зменшену токсичність

Патент США Мо 4,853,332 (Магк та ін.) спрямований на мутеїни ІЕМ-Г і 1-2, в яких, цистеїнові залишки, які з не є необхідними для біологічної активності, були видалені або замінені іншими амінокислотами, щоб усунути ділянки для внутрішньомолекулярного перехресного зв'язування або неправильного формування

Внутрішньомолекулярного дисульфідного містка. Патент описує, що заміна в 1-2 цистеїну у положенні 125 на -І серин призводить до утворення мутеїну з активністю, яку можна порівняти з дією нативного ЇЇ -2.

Патент США Мо 5,696,234 (7 |йгамузкі та інші) спрямований на мутеїни цитокінів ссавців і способи селекції для о агоністів і антагоністів цитокінів ссавців. Зокрема, демонструється, що людський 1/-2 подвійний мутеїн -І РВ2А/01260О має антагоністичну активність на мишачі ВаїЗ клітини, сумісно трансфіковані людськими А та В субодиницями І/-2К. Показана незначна агоністична активність. Також показано, що мишачі 1І/-2 мутеїни - виявляють часткову агоністичну та антагоністичну активність на НТ2 клітинах, особливо 01410, 0141К, О141М, Її (Че) О1411, Не описані активності мутеїну, які б показували або передбачали селективний агоністичний ефект для мутеїнів у положеннях 20, 88 і 126. 2игамувкі та ін. описують мишачі ІЇ/-2 мутеїни, що мають властивості діяти на клітини, що експресують

І/-2КеохРу, але не діють на клітини, що експресують 1І-2І-ІВГ (2игамувКкі, б., Тепав. Віоїесппої. 9: 250-257 (1991); 2игамувкі, 5. М. і 2цгамувКкі, б. Етбро. У. 11: 3905-3910 (1992)). Мишачі І/-2 мутеїни, що проявляли ці (Ф) властивості, мали заміни Авзр-34 на Зегабо Тпг, та Сіп -141 на Гуз. Авр-34 та біп -141 мишачого 1-2, є ка еквівалентними Авр-20 і бІп-141 людського 1-2, відповідно. Хоча ці посилання відносяться до "селективного агоніста" І/-2 мутеїнів, однак вони не описують їх як потенційно менш токсичні, а скоріше описують їх як во потенційні антагоністи ендогенного ІІ -2.

ЕР 0267 795 А? (лигамузКі та інші) описує різноманітні мишачі І/-2 мутеїни по всій послідовності, включаючи деякі з тих, що містять делеції та/або заміни у межах перших тридцяти М-термінальних амінокислотних залишків, які є біологічно достатніми, але патент не включає, не обговорює і не пропонує амінокислотні заміни, описані в даній заявці, стосовно еквівалентних залишків мишачого ІІ-2. Існує потреба в 65 поліпшенній ІІ -2 молекулі, яка була б менш токсичною і більш переносимою.

Робота Тапідиспі та ін. США 4,738,927 спрямована на рекомбінантну ДНК, що включає рекомбінантну ДНК,

яка кодує поліпептид, що має біологічну активність ІІ-2, де згадана активність являє собою сприянням росту цитотоксичної клітинної лінії Т-лімфоцитів, а векторна ДНК здатна до розмноження в прокаріотичній або еукаріотичній клітині, причому кодуюча послідовність згаданого гена розташовується нижче послідовності промотора, де згаданий поліпептид містить загалом від 132 до 134 амінокислот в амінокислотній послідовності поліпептида. Ця робота також описує ген, вектори на основі рекомбінантної ДНК, хазяйські клітини і способи рекомбінантного одержання нативного ІІ-2. Тапідиспі та інші не описують варіанти або мутеїни, і не вказують, які положенні в білку є відповідальними за передачу сигналів або процеси зв'язування.

Ясно, що 1/-2 мутеїни, які не проявляють обмеженої дозою токсичності, характерної для попередніх 70 рекомбінантних ІІ -2 мутеїнів, необхідні, щоб скористатися терапевтичною перевагою цитокіну.

Винахід спрямований на поліпептид, що містить людський 1-2 мутеїн, пронумерований відповідно до дикого типу 1-2, де згаданий людський ІІ -2 замінюється, принаймні, в одному з положень 20, 88 або 126, за допомогою чого згаданий мутеїн переважно активує Т-клітини у порівнянні з природними кілерними клітинами. Цей винахід реалізує менш токсичний 1-2 мутеїн, що дозволяє проводити більш широке терапевтичне використання цього /5 інтерлейкіну.

Далі, винахід спрямований на 1-2 мутеїни, що мають одиничні мутації у положеннях аспартат 20, аспарагін 88, і глутамін 126. Певні мутеїни представлені позначеннями 020Х, М88Х, і 0126Х, де "Х" -специфічна амінокислота, яка при заміні в людському 1-2 надає селективну активність клітинам, що експресують Ії -2-РАВГ рецептор (наприклад, Т-клітинам) у порівнянні з клітинами, що експресують ІІ -2РВГ рецептор (наприклад, 20 МК-клітини). Мутеїни, що проявляють більш, ніж 1000-кратну, селективність, включають Ю2ОН, 0201, М880, М881,

МК, і 01261. Зокрема, ці мутеїни також проявляють суттєву активність ІЇ-2 дикого типу на Т-клітинах.

Ідентифіковані також інші мутації, що забезпечують селективність, меншу, ніж в 1000 разів, але більшу, ніж у разів. Винахід також включає полінуклеотиди, що кодують мутеїни згідно з винаходом, вектори, що містять полінуклеотиди, трансформовані хазяйські клітини, фармацевтичні композиції, що включають мутеїни, і сч об Терапевтичні способи лікування із застосуванням мутеїнів.

Винахід також спрямований на спосіб селекції ІЇ-2 мутеїнів через оцінку в аналізах, в яких застосовується і)

Ії -2І-АВГ у порівнянні з ІІ -2І-ІВГ, де дія І/-2 мутеїну збільшена у порівннянні з ІЇ-2 дикого типу в одному випробуванні переважно до іншого. ІІ -2Кару і І -2РВГ є індивідуальними ектодоменами підодиниці рецептора у відповідній комбінації, і використовуються для вимірювання безпосереднього зв'язування ІІ -2 мутеїнів з кожним Ге! зо рецепторним комплексом. В аналізі ІІ-2гАВГ застосовується відповідь, яку одержують від типу клітин, що несуть

І--2АВГ, а в аналізі Ії -28Г застосовується відповідь від типу клітин, що несуть ІІ/-2ру. Клітина, що містить --

І -2АВГ, є РНА-бластом, а клітина, що містить ІЇ/-2ВГ, є природною кілерною клітиною. Дослідження М представляють собою проліферацію як типу клітин, що містять ІІ -2АВГ, так і типу клітин, що містять ІІ -28Г.

Винахід також спрямований на вектор, що включає полінуклеотид, який кодує мутеїн цього винаходу, вектор, о

Зз5 що направляє експресію людського ІЇ/-2 мутеїну, який має активуючу дію на клітини РНА-бластів, але має ї- послаблену активність стосовно активації природних кілерних клітин, вектор, здатний надавати можливість трансфекції організму, що представляє інтерес, з подальшою іп мімо експресією згаданого людського І1/-2 мутеїну, що кодується згаданим полінуклеотидом.

Винахід також спрямований на спосіб лікування пацієнта, що має стан, який лікується 1-2, шляхом прийому « терапевтично ефективної кількості людського 1-2 мутеїну, пронумерованого відповідно до дикого типу ІЇ-2, що Ше) с має дію, яка активує РНА-бласти, але має послаблену дію стосовно активації природних кілерних клітин. Цей спосіб застосовується тоді, коли стан, що лікується 1-2, є ВІЛ, раком, аутоїмунною хворобою, інфекційною ;» хворобою, вакцинним ад'ювантом у вакцині проти раку та при традиційній вакцинотерапії для імуностимуляції в похилому віці або при інших формах пошкодження імунітету, а також серед 5СІО пацієнтів, або для іншого терапевтичного застосування, що вимагає стимуляції імунної системи. -І Фігури 1 - 7, показують криві залежності відповіді від дози для дикого типу людського 1-2 (ІІ/-2) ії Ю2ОоНн (фіг.1), 11-2 ї 0201 (фіг.2). 1-2 їі М880 (фіг.3), 1/-2 1 М88І (фіг.4), 1-2 і Мак (фіг.5), 1/-2 і О126Е, о (фіг.б), і 1-2 ії 01261 (фіг.7). А: індивідуальна відповідь на дозу для І/-2 (заштриховані кола) і мутеїн -І (незаштриховані кола) у первинному аналізі проліферації людських Т-клітин (РНА-бласти). В: індивідуальна 5о Відповідь на 1-2 (заштриховані трикутники) і мутеїн (незаштриховані трикутники) у первинному аналізі - проліферації людських природних кілерних клітин.

Ге) Фігури ВА-80. Токсичність ПРОЛЕЙКІНУ:м у шимпанзе була оцінена на двох тваринах (Х-159, трикутники, і

Х-124, квадрати), у порівнянні з контролем розчинника (Х-І26, ромби). Токсичність була оцінена нирковими параметрами (азот сечовини крові (АСК), А; креатин, В) і функціонуванням печінки (загальна кількість білірубіну, С; АГ Т, 0).

Фігура 9. Графік зміни ваги тіла у відсотках протягом ЗО днів. Вага тіла тварин, яким вводили ІІ -2/М88К іФ) (трикутники), ПРОЛЕЙКІН (квадрати), або розчинник (ромби), було виміряно у вказані дні. ко Фігури 10ОА-100. Лімфоціти (А), загальна кількість білих клітин крові (В), нейтрофіли (С), і тромбоцити (р) для тварин, яким вводили ІІ-2/М88Е. (трикутники), ПРОЛЕЙКІН (квадрати) або розчинник (ромби), були бо виміряні у вказані дні.

Фігури 11А-110. Азот сечовини крові (А, АСК), креатин (В), фосфор (С), та аніонний проміжок (0) для тварин, яким вводили ІІ -2/М88Е. (трикутники), ПРОЛЕЙКІН (квадрати) або розчинник (ромби), були оцінені у визначені дні.

Фігури 12А-120. Загальна кількість білірубіну (А), АТ (В), фіброногену (С), і час активованого б5 протромбіну (0) для тварин, яким вводили 1І-2/М88К (трикутники), ПРОЛЕЙКІН (квадрати) або розчинник (ромби), були оцінені у визначені дні.

Фігури 13А-130О0. Рівні натрію в крові (А), іонів хлориду (В), кальцію (С). і калію (0) для тварин, яким вводили ІЇ -2/М88Е. (трикутники), ПРОЛЕЙКІН (квадрати) або розчинник (ромби), були оцінені у визначені дні.

Фігури 14А-14С. Рівні альбуміну в крові (А), гематокріт (В), і гемоглобін (С) для тварин, яким вводили

І. -2/кІ88К (трикутники), ПРОЛЕЙКІН (квадрати) або розчинник (ромби), були оцінені у визначені дні.

Фігури 15А-15С. Ефект ІІ -2/М88Е. (квадрати), ПРОЛЕЙКІН (ромби), і розчинника (трикутники), позначений для загальної популяції Т-клітин (А, СОЮЗ клітини), СО4-- популяції Т-клітин (В), і СО8 т популяції Т-клітин (С).

Фігури 16А-16С. Ефект ІІ -2/М88Е. (квадрати), ПРОЛЕЙКІНУ (ромби), і розчинника (трикутники), позначений 7/0 для загальної популяції Т-клітин (А, СОЗЖ клітини), бра популяції Т-клітин (В), і СО8 ж популяції Т-клітин (С).

Фігура 17. Ефект ІІ/-2/188К та ПРОЛЕЙКІНУ на активацію Т-клітин, визначений за середнім значенням флуоресценції СО25 позитивних клітин. Ефект ІІ/-2/М88Е (квадрати), ПРОЛЕЙКІНУ (ромби), і розчинника (трикутники), позначений для СЮОЗ-СОЯ4 ж популяції Т-клітин. Була отримана недостатня кількість СОЗ/СОв клітин, щоб оцінити значення флуоресценції у цій популяції.

Фігури 18А-180. Ефект ІІ -2/М88Е. (квадрати), ПРОЛЕЙКІНУ (ромби), і розчинника (трикутники), позначений для СОдж популяції Т-клітин (А, СОЗ/СО4- клітини), СЮО8 ж- популяції Т-клітин (В, СОЗ ї/СО8 ж клітини), загальної кількості популяції Т-клітин (С, СОЗ-- клітини), і популяції природних кілерних клітин (0, СО3-/С016 п клітини).

Фігура 19. Графік метастазів легеней проти дози для мишей, яким вводили ПРОЛЕЙКІН (незаштриховані

Кола) або ІІ -2/М88Кк (заштриховані кола). Метастази легені були підраховані наприкінці дослідження.

Фігура 20. Плазмідна карта І 2М88К вектора рВвсНніІ 25А.

Опис сполук, яким надається перевага

А. Передумови

Дія 1-2 на Т-клітини опосередковується зв'язуванням з білками рецептора 1-2. Певні білки на поверхні сч

Т-клітин зв'язують ІІ -2. Першим слід ідентифікувати один поліпептид, називаний ІІ -2Ко, який являє собою 55кДа поліпептид (роб), що з'являється при активації Т-клітини і спочатку називався Тас (від Т-активація) о антигеном. І -2КорДу зв'язує І/-2 зі значенням К у приблизно 108 М., він також відомий як рецептор 1-2 "низької спорідненості". Зв'язування ІЇ-2 з клітинами, що експресують тільки І/-2К у, не веде до виявлення будь-якої біологічної відповіді. Ге)

Другим рецептором 1-2 є зв'язувальний комплекс, що складається з ІЇ-К о і І -2Ко; І/-2Ко, поліпептид з - молекулярною масою б4кДа, що також відомий як звичайний (Г о) ланцюг, тому, оскільки він є спільним для ряду цитокінових рецепторів. І/-2К у має масу приблизно від 70 до 75 кДа (називається по-різному, р70 або - р75) і є членом сім'ї цитокінових рецепторів типу І, що характеризується двома цистеїнЛ/УЗХМуУ5 мотивами. ІІ -2К3 со експресується відповідно до Го. Спорідненість зв'язування 1І--2 з ІЇ-2Кору є вищою, ніж з І.-2Ко, зКц приблизно 193 М. він також відомий як рецептор 1/-2 "проміжної спорідненості". І/-2 викликає ріст клітин, що - експресують ІІ-2КРу, з половинним значенням максимальної стимуляції росту, що відбувається при тій самій концентрації І/-2, що має половинне значення максимального зв'язування (тобто, 1 х 10 77 М). І--2кру; є тим самим сигнальним рецепторним комплексом, що може зв'язуватися з І! -15. « 20 Третім відомим 1-2 рецепторним комплексом є ІІ-2Корур комплекс. Клітини, що експресують як /-2Ко, так 73 с і 1 -2кРу,; можуть зв'язувати 1-2 набагато сильніше, із Ку приблизно 10-71 М, він також відомий як комплекс ц "високої спорідненості". Стимуляція росту таких клітин відбувається при однаково низькій концентрації І! -2. "» Як 1-2 зв'язування, так і стимуляція росту можуть бути блоковані антитілами до І/-2К о, ІІ/-2К3З, або у; а найбільш ефективно комбінацією антитіл до чисельних підодиниць рецептора. Ці спостереження говорять про те, що І-2Ко формує комплекс з ІІ-2КоарВус; збільшуючи спорідненість рецептора передачі сигналів для 1І-2 і в -і такий спосіб, даючи можливість сигналу росту передаватися при значно нижчих концентраціях ІІ -2. Вважається, сю що 1-2 спочатку швидко зв'язується з ІІЇ-2Ка. Це полегшує зв'язування з ІЇ/-2КЗу с. Т-клітини, що спочивають, експресують ІІ-2Крур; і тільки незначну кількість І/-2КДу; збільшення поверхні експресованого ІЇ-2К о може - стимулюватися 1/-2. Після антигенної опосередкованої рецептором активації Т-клітин І/-2Ка швидко -кл 70 експресується, у такий спосіб зменшуючи концентрацію 1-2, необхідну для стимуляції росту. Зв'язування 1-2 з

І--2РАВГ»о комплексом призводить до сигнальної трансдукції через Чак/зТАТ сигнальний канал.

Ме, Ми виявили мутеїни людського ІЇ-2, що преференційно активізують Т-клітини (РНА-бласти; клітини, що експресують високоспоріднений рецептор ІІ-2, І-2Кофру) по відношенню до природних кілерних клітин (МК), які експресують рецептор 1-2 І -2КРу проміжної спорідненості. Мутанти, що мають заміни Авр-20 на гістидин 22 (О20Н) або ізолейцин (0201), Азп-88 на аргінін (М88К), гліцин (М880) або ізолейцін (М881), або СіІп-126 на

ГФ! лейцин (01261) або глутамін (20126Е) несподівано проявляли повну активність ІЇ-2 на РНА-бласти, і невелику (якщо взагалі якусь) активність стосовно природних кілерних клітин. Попередні дослідження людських 1Ї-2 о мутеїнів базувалися на мишачих клітинних системах аналізу, і коли застосовувалися людські клітини, то при цьому дослідженні не використовували клітини, що експресують тільки І/-2КДу (тип природних кілерних 6о клітин). Крім того, ті дослідження, де використовувалися людські РНА-бласти, показали, що заміни Азр-20 (на

Ге, Агоу, Авзр, або уз; Хи, та ін. Еиг. Суїокіпе Мейу, 6, 237-244 (1995)) або СіІп-126 (на Авр; Виснії і

Сіагаеїйї, Агсп. Віоспет. Віорпуз, 307 (2): 411-415, (1993)) призводять до утворення людських 1-2 мутеїнів, що мають жорстко компромісну дію. Попередні дослідження, що використовували мишачий І! -2, ідентифікували мишачі І/-2 мутеїни з різними активностями (7игамвКі, та ін, ЕМВОУ, 125113-5119 (1993)), але жодна з бо мутацій, що дала ці результати, не наводила на думку про мутеїни, описані в даній роботі. Людські 1/-2 мутеїни, що містять ідентичні мутації в синонімічних положеннях з мишачими 1-2 мутеїнами, не проявляють подібної активності, що свідчить про те, що мишачі приклади не можна передбачити з людських функціональних можливостей. Винахідникам не відомі дослідження людських ІЇ/-2 мутеїнів, де б порівнювалися відносні активності на людські клітини, що експресують 1-2 рецептор ІІ -2Косру (наприклад, РНА-бласти) по відношенню до експресії І/-2 рецептора ІЇ/-2КЗу (наприклад, природні кілерні клітини). Очікується, що аналіз іп мімо підтвердить, що описані мутеїни будуть мати поліпшений терапевтичний індекс в порівняні з людським 1-2 дикого типу завдяки зниженню токсичності, що забезпечить терапевтично корисні сполуки для лікування порушень, які вимагають стимулювання імунної системи. 70 Інтерлейкін-2 (1-2) використовується в даний час у клініці для лікування метастатичного ниркового раку.

Однак, його сильна токсичність обмежує його використання тільки колом найбільш здорових пацієнтів, а обмеженість доз через токсичність знижує його повну ефективність. Була висунута ідея, що гостра токсичність

І--2 опосередковується активацією природних кілерних клітин, тоді як ефективність опосередковується прямою активацією Т-клітин. (Часорзгоп, та ін., Ргос Майї! Асай сі ОБА, 17 вересня 1996, 93 (19) стор. 0405-10; Зтйй 7/5 КА, Вісой 1993, 81 (6) стор.414-23; Каріап, та ін. Віоїесппоіоду, 10 (2) стор. 57-62). Т-клітини експресують рецептор для 1-2, відмінний від природних кілерних клітин (Т-клітини: І/-2КссРу, І/-2 рецептор високої спорідненісті; природні кілерні клітини: І/-2кДу, рецептор 1-2 проміжної спорідненісті). Людські 1-2 мутеїни, описані тут, вибірково активують ІІ -2 рецептор Т-клітини, а не ІІ -2 рецептор природних кілерних клітин.

З деяким успіхом застосовувалася низькодозова терапія ІЇ/-2, щоб обминути безпосередню активацію природних кілерних клітин (Часорзоп та ін. (1996). Ргос Май Асай Зсі ОЗА 93: 10405-10). Ця стратегія включала концепцію, що при низьких дозах ІІ -2 тільки ІІ -2 рецептор високої спорідненості буде активованим, на відміну від І/-2 рецептора проміжної спорідненості. Форма проміжної спорідненості І/-2 рецептора, ІІ-2КРу, експресується на природних кілерних клітинах, у той час як Т-клітини експресують форму високої спорідненості,

І.-2Коадру. с

Однак, винахідники підійшли до проблеми токсичності з іншого боку. Була висунута гіпотеза, що руйнування о взаємодії І/-2 з І/-2КР та/або ІЇ/-2Ку шляхом відповідної модифікації специфічних зв'язуючих залишків на зв'язувальній поверхні ІЇ/-2, мабуть, запобігає ефективному зв'язуванню (і в такий спосіб активації) з клітинами, що експресують тільки І--2КРу. Проте на клітинах, які експресують ІІ-2КодДу, початкове зв'язування з 1/-2Ка, і в такий спосіб зв'язування з клітиною, буде усе-таки відбуватися і, таким чином, низькодозова Ге) терапія, запропонована .асорзе та ін., може все ще виявляти токсичні побічні ефекти. Шляхом зв'язування з -

І/-2Ка на поверхні клітини може відбуватися ефективне залучення ІІ-2КР ІІ/-2Ку, незважаючи на зруйновані взаємодії І/-2 з І/-2КД8 та/або І/-2Ку. В такий спосіб може бути сформований здатний до передачі сигналів їм.

І--2ЛІ-2Кору комплекс. І/-2 варіант, здатний вибірково активувати ІЇ/-2 рецептори високої спорідненості на со

Т-клітинах, на противагу до 1/-2 рецепторів проміжної спорідненості на природних кіперних клітинах, як ми

Зо сподіваємося, може мати більший терапевтичний індекс у порівнянні з І/-2 дикого типу завдяки зменшеній о токсичності. І/-2 варіант із збільшеним терапевтичним індексом мав би значно розширений діапазон використання як при лікуванні раку (як безпосередня та/або додаткова терапія), так і імунної недостатності (наприклад, ВІЛ і туберкульозу). Інші потенційні застосування 1/-2 витікають з його імуностимулюючої дії і « включають, крім безпосереднього лікування раку, імунної недостатності, такої, як ВІЛ, або ЗСІЮ пацієнтів; інфекційних хвороб, таких, як туберкульоз; застосування його як допоміжного засобу у стратегії "вакцинації о) с проти раку" та при показаннях стимуляції імунної системи, таких як прописи, призначені для поліпшення "» стандартної вакцинації, або для лікування людей похилого віку. " Відповідно заміна в Азр-20, Азп-88, або біп -126 зменшувала зв'язувальні взаємодії або ІІЇ-2Кр (Авр-20 і

Азвзп-88) або 1І-2КУ (СбіІп-126). Результуючий вплив таких замін призводить до утворення 1-2 мутеїнів, які зберігають активність стосовно людських Т-клітин та мають послаблену дію на людські природні кілерні клітини. - Оскільки не було можливості передбачити результат такого" заміни ще до оцінки в аналізах Т-клітин і со природних кілерних клітин, то всі можливі природні амінокислотні заміни (за винятком Сувз) робилися в положеннях Азр-20, Авзп-88 і біп-126, а обмежений, але різноманітний набір мутацій був одержаний в положенні - Авр-84, щоб перевірити, чи вони дійсно взаємодіяли з ІЇ/-2К Д. Додаткові мутації можуть бути перевірені в - 20 положенні Авр-84, якщо вони приводять до очевидних ІІ-2КР взаємодій. Дані стосовно сорока шести окремих замін в цих положеннях наведені в Таблиці 1. с Мутації були одержані при використанні сайт-спрямованого мутагенезу на людській кДНК 1-2 дикого типу.

Правильні клони були субклоновані у вектор експресії, який є придатним для експресії в гетерологічній системі (наприклад, Е. соїї, бакуловірус, дріжджі або клітини 2о ссавців, такі як, наприклад, клітини яєчника китайського хом'яка (СНО)). Очищені білки були перевірені в

ГФ) аналізі проліферації Т-клітин (РНА-бласти) та аналізі проліферації природних кілерних клітин. Одержані різні відповіді, що генерувалися індивідуальними мутеїнами у цих аналізах, тобто занчення ЕС 5), визначають ді мутації, які спричинили активності. Конкретніше, мутеїни, що стимулюють відносно більш сильну відповідь в аналізі РНА-бласту (Т-клітина) (проти 1І/-2 дикого типу) у порівнянні з відповіддю природних кілерних клітини 60 (проти І/-2 дикого типу), вказують на заміни, що забезпечують клітинну специфічність, що базується на здатності певного мутеїну зв'язуватися та активувати 1І-2РІАВГ, експресований на цих клітинах, але при цьому він не здатний зв'язуватися, і тому не активує клітини, що експресують тільки ІЇ/-2КРУу. 1І/-2 мутеїни, що проявляють цю властивість, будуть, таким чином, володіти іп мімо імуностимулюючими властивостями І! -2 із зменшеною токсичністю, пов'язаною з ІІ -2 терапією, що викликає судинні витоки і гіпотензію. бо В. Визначення

Депонування клітиних ліній СНО, що застосовувалися для одержання описаного тут рекомбінантного білка, був здійснене в АТСС, 12301 РагкІамп Огіме, Коскмійе, МО, 20852, США, 5 травня, 1999, Депозитний номер.

Оскільки згаданий штам підтримується у відповідності з Будапештською Угодою, то він буде доступним патентному відомству, що приєдналося до Будапештської Угоди.

Як використовується в даній заявці "дикий тип 1-2" означає 1-2, природний або рекомбінантний, що має 133 амінокислоти послідовності нативного людського 1-2 (мінус сигнальний пептид, що містить додатково 20

М-термінальних амінокислот), амінокислотна послідовність якого описана в Еційа та ін.,, РМАБ ИОЗА, 80, 7437-7441 (1983), з або без додаткового М-термінального метіоніну, який обов'язково включається, коли білок /о експресується як внутрішньоклітинна фракція в Е. сої.

Як використовується в даній заявці, "ІЇ-2 мутеїн" означає поліпептид, в якому були проведені певні заміни людського зрілого білка інтерлейкіну-2 . Таблиця 1 описує сорок шість індивідуальних замін 1-2 мутеїнів та відповідні відносні дані стосовно їх активності. Сполуки, яким надається перевага, включають ті мутеїни, що мають, принаймні, 100-кратну відносну активність. Сполуки, яким надається особлива перевага, включають ті, 7/5 що проявляють більше, ніж 1000-кратне підвищення відносної активності: аспартатний (Азр) залишок (0) у положенні 20 ("020"), коли нумерується відповідно до дикого типу 1-2, замінюється на ізолейцин ("0201") або гістидин ("020Н"); аспарагіновий залишок (Азп) у положенні 88 (М88) замінюється на ізолейцин (М881), гліцин (М88С) або аргінін (М88К); а глутаміновий залишок (іп) в положенні 126 (0126) замінюється на лейцин (01261) або глутамат (0126Е) або аспартат (01260). І/-2 мутеїни, яким надається перевага, мають амінокислотну послідовність, ідентичну ІЇ-2 дикого типу в інших незамінених залишках. Однак, ІЇ/-2 мутеїни цього винаходу можуть також характеризуватися амінокислотними інсерціями, делеціями, замінами і модифікаціями в одному або більше сайтах або в інших залишках нативного 1-2 поліпептидного ланцюга. Відповідно до цього винаходу будь-які такі інсерції, делеції, заміни і модифікації можуть призводити до утворення І/-2 мутеїну, що зберігає селективну активність стосовно РНА-бласту і разом з тим має зменшену здатність активувати природні сч

Кілерні клітини, та входять в рамки цього патенту.

Об'єднання описаних вище замін, яким надається перевага або особлива перевага, в рекомбінантній 1І-2 (8) молекулі може призвести до утворення комбінаційних мутеїнів, що мають активність, подібну до такої одиничних мутантів. Наприклад, можна очікувати, що ІІ -2 молекула, яка має комбінацію двох або більше мутацій, вибраних із Таблиці 17, може призвести до утворення Т-клітини селективного ІЇ/-2 агоніста з відносною активністю, Ге! зо подібною до такої для одиничних замін, описаних тут. Комбінаційні мутанти входять в рамки даного винаходу.

Ми віддаємо перевагу консервативним модифікаціям і замінам в інших положеннях ІІ -2 (тобто, таким, що -- мають мінімальний ефект на вторинну або третинну структуру мутеїну). Такі консервативні заміни включають М такі, що описані Юаупоїй в Атласі послідовностей і структур білка (1978), і Агдоз у ЕМВО .., 8:779-785 (1989). Наприклад, амінокислоти, що належать до однієї з наступних груп, представляють собою консервативні ме) заміни: ї- - аіа, рго, ду, діп, азп, зег, Ійг; - сув, вег, Туг, (НГ; - ма), Пе, Іеч, теї, аїа, ре; - Іув, ага, пів; « - рпе, їуг, ігр, Пів; і -о с - азр, дім. . Ми також віддаємо перевагу модифікаціям або замінам, які не вводять сайти для додаткового и?» міжмолекулярного перехресного зв'язування або неправильного формування дисульфідного зв'язку. Наприклад, відомо, що 1-2 має три суз залишки у положеннях дикого типу 58,105 та 125 зрілої послідовності.

Під "пронумерований відповідно до дикого типу ІЇ/-2" ми розуміємо ідентифікацію вибраної амінокислоти з -І посиланням на положення, в яких ця амінокислота звичайно зустрічається в зрілій послідовності ІЇ-2 дикого типу. Якщо здійснюють інсерції або делеції ІЇ-2 мутеїну, то фахівці звичайно ж оцінять той факт, що Агр, який і звичайно знаходиться в положенні 20, може змінювати своє положення в мутеїні. Однак місцезнаходження -І переміщеного Азр може бути легко визначено шляхом дослідження та співставлення сусідніх амінокислот з 5р амінокислотами, що межують з Авр в 1І--2 дикого типу. - Термін "типи клітин, які мають ІЇ/-2КоДу рецептор" означає клітини, які включають даний тип рецептора,

Ге) тобто Т-клітини, В-клітини, активовані моноцити та активовані природні кілерні клітини. Термін "типи клітин, які мають ІЇ/-2КРу рецептор" означає клітини які мають даний тип рецептора, тобто В-клітини, спочиваючі моноцити та спочиваючі природні кілерні клітини.

І/-2 мутеїни даного винаходу можна одержати будь-яким придатним способом. Такі способи включають конструювання ДНК-послідовності, що кодує І/-2 мутеїни даного винаходу і експресують такі послідовності у іФ) відповідним чином трансформованому хазяїні. Однак мутеїни даного винаходу можна одержувати шляхом ко хімічного синтезу або комбінацією хімічного синтезу і рекомбінантної ДНК-технології. Також застосовуються серійне одержання або перфузійне одержання. Див ЕгезПпеу, К | (ред.) "Апіта! сеїЇ сиМиге: А ргасіїса 6о арргоасп, 274 ед, 1992 БІ Ргевв, Охіога, Епдіапа: Маїйег, УР. " Іарогайогу всає пр ої сеї сийигев (0,5-50 ІШеге)" Меїйодз сеї Біоюду 57; 219-527 (1998): Ни, МУ.5., та Айцпіпв, ).0./|агде- зсае таттаїап сеї! сийиге, Сип Оріп Віоїесппо! 8;148-153(1997); Копвіапіпом К.В., Тваї, М., Моїез, О0., Маїйападиінап,

К., "СопігоЇ ої Іопуд (егпт репивіоп Спіпезе Натвіег омагу сеї сийиге Бу діисозе ацйховіаї., Віобесппої.

Ргод 12: 100-109 (1996) 65 В одному з втілень рекомбінантного способу одержання мутеїну даного винаходу ДНК- послідовність одержують шляхом ізоляції або синтезу ДНК-послідовності, що кодує дикий тип 1-2, а потім замінюють кодон для Авр20 на кодон для ізолейцину (І) шляхом сайт-специфічного мутагенезу. Даний спосіб добре відомий. Див, наприклад Маск та ін., "Зйе - вресійс тиадепевзів ої (Ше Питап їргоріаві іпіебегоп депе", Ргос. Май.

Асад. сі. ОБА 81, стор. 5662-66 (1984); і 05 4,588,585, що включені в дану заявку як посилання.

Іншим способом конструювання ДНК-послідовності, яка кодує ІІ -2 мутеїни цього винаходу, є хімічний синтез.

Він, наприклад, включає прямий синтез хімічними способами пептидів послідовності білка, що кодує 1І-2 мутеїн, які проявляють властивості, описані у винаході. Цей спосіб може включати як природні, так і неприродні амінокислоти в положеннях, які викликають взаємодії ІЇ/-2 з І/-2КР або ІІ-2Ку. Альтернативно ген, що кодує бажаний 1/-2 мутеїн, може синтезуватися хімічними способами, які використовують олігонуклеотидний 7/0 бинтезатор. Такі олігонуклеотиди розроблені на основі амінокислотної послідовності бажаного ІІ -2 мутеїну, при цьому переважно вибирають ті кодони, які є сприятливими для хазяйської клітини, в якій продукується рекомбінантний мутеїн. У зв'язку з цим визнається, що генетичний код є виродженим, тобто, що амінокислота може кодуватися більше, ніж одним кодоном. Наприклад, РНе (ГЕ) кодується двома кодонами, ТС або ТТТ, Туг (У) кодується ТАС або ТАТ, а Нів (Н) кодується САС або САТ. Тгр (МУ) кодується єдиним кодон, ТО. Відповідно, знайде свою оцінку і той факт, що для даної ДНК-послідовності, що кодує певний І/-2 мутеїн, буде багато вироджених послідовностей ДНК, які будуть кодувати цей ІІ -2 мутеїн. Наприклад, буде оцінено той факт, що крім

ДНК-послідовності для мутеїну 020І, представленого в 5ЕО ОО МОЛ, буде багато вироджених

ДНК-послідовностей, які кодуватимуть представлений 1/-2 мутеїн. Ці вироджені ДНК-послідовності розглядаються в межах цього винаходу. Таким чином "його вироджені варіанти" в контексті даного винаходу означатимуть усі ДНК-послідовності, які кодують, і в такий спосіб роблять можливою експресію певного мутеїну.

ДН"-послідовність, що кодує 1-2 мутеїн згідно з, даним винаходом, одержують шляхом сайт-направленого мутагенезу, хімічного синтезу або іншими способами, при цьому вона може включати або не включати

ДНЕК-послідовності, що кодують сигнальну послідовність. Така сигнальна послідовність, якщо вона присутня, повинна бути такою, що впізнається клітиною, вибраною для експресії І/-2 мутеїну. Вона може мати сч 2г5 прокаріотичне, еукаріотичне походження або бути комбінацією обох. Це може також бути сигнальна послідовність нативного ІЇ/-2. Включення сигнальної послідовності залежить від того, чи є бажаним виділяти (8)

І/-2 мутеїн від рекомбінантних клітин, в яких він одержаний. Якщо вибрані клітини є прокаріотичними, то в основному бажаним є, щоб ДНК-послідовність не кодувала сигнальну послідовність. Якщо вибрані клітини є еукаріотичними, то бажаним є, щоб сигнальна послідовність кодувалася, а найбільш бажаним є, щоб б зо Використовувалась сигнальна послідовність 1І--2 дикого типу.

Стандартні способи можуть застосовуватися для того, щоб синтезувати ген, який кодує 1//-2 мутеїн -- відповідно до даного винаходу. Наприклад, повна амінокислотна послідовність може використовуватися, щоб ї- одержати зворотно трансльований ген. Може бути синтезований олігомер ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує ІЇ-2 мутеїн. Наприклад, можуть бути синтезовані, а потім ліговані декілька невеликих і) олігонуклеотидів, що кодують частини бажаного поліпептиду. Індивідуальні олігонуклеотиди в основному містять ї- 5-, або 3'-виступи для комплементарного зв'язування.

Після зв'язування (шляхом синтезу, сайт-направленого мутагенезу або іншого способу) ДНК-послідовностей, що кодують 1-2 мутеїн згідно з даним винаходом, будуть вбудовані у вектор експресії та оперативно зв'язані з контрольною послідовністю експресії, придатною для експресії І/-2 мутеїну у бажаному трансформованому « хазяїні. Належна зборка може бути підтверджена нуклеотидним секвенуванням, рестрикційним аналізом та з с експресією біологічно активного поліпептиду у прийнятному хазяїні. Як відомо в галузі техніки, щоб одержати високий рівень експресії трансфікованого гена в хазяїні ген повинен бути оперативно зв'язаний з ;» експресійними транскрипційними та трансляційними послідовностями, які є функціональними у вибраному експресійному хазяїні.

Вибір експресійної контрольною послідовності і вектора експресії буде залежати від вибору хазяїна. Може -І використовуватися широка різноманітність комбінацій експресійний хазяїн / вектор експресії. Корисні вектори експресії для еукаріотичних хазяїв включають, наприклад, вектори, що містять експресійні контрольні о послідовності з 5М40, бичачого папіломавірусу, аденовірусу і цитомегаловірусу. Корисні вектори експресії для -І бактеріальних хазяїв включають відомі бактеріальні плазміди, типу плазмід, одержаних від Е.соїї, включаючи

СОЇЕ1, рСКк, рЕКЗ227, рМВе та їх похідні, плазміди для широкого спектру хазяїв, такі як КР4, фагову ДНК, - наприклад, численні похідні фага лямбда, наприклад, ММ9О89, та інші ДНК фагів, таких як М13 та ниткоподібні

Ге) фаги з одноланцюговою ДНК. Корисні експресійні вектори для клітин дріжджів включають 2М плазміду та її похідні. Корисні вектори для клітин комах включають рм! 941. Переважним Е рЕавіВас тм 1 (бірсовкі..

Саїйегезриго, МО). Сайе та інш., " ІвоЇїабоп ої (Ше роміпе апа питап депез їТог тиегіап іппібйіпуд з!ИБ8іапсе апа ехргезвіоп ої (Пе питап депе апа апітаї) сеїІв", Сеї|, 45, стор.685-98 (1986).

Крім того, в даних векторах може використовуватись будь-яка з великої кількості контрольних іФ) послідовностей експресії. Такі корисні контрольні експресійні послідовності включають послідовності контролю ко експресії, асоційовані зі структурними генами наведених векторів експресії. Приклади корисних експресійних контрольних послідовностей включають, ранні і пізні промотори 5М40 або аденовірусів, Іас системи, ігр бо системи, ТАС або ТКС системи, основні операторні і промоторні ділянки фага лямбда, наприклад, РІ, контрольні ділянки білка Та оболонки, промотор для 3-фосфогліцераткінази або інших гліколітичних ферментів, промотори кислої фосфатази, наприклад, РіоА, промотори системи дріжджового А-спарювання, поліедровий промотр бакуловірусів, та інші послідовності, відомі як такі що контролюють експресію генів прокаріотичних або еукаріотичних клітин або їх вірусів, та їх різні комбінації. 65 Будь-який придатний хазяїн може використовуватись для одержання І/-2 мутеїнів даного винаходу, включаючи бактерії, гриби (включаючи дріжджі), рослини, комах, ссавців, або інші відповідні тваринні клітини або лінії клітин, а також трансгенних тварини або рослини. Зокрема, такими хазяйськими організмами можуть бути добре відомі еукарітичні та прокаріотичні хазяї, такі як штами Ес.соїї, Рзепдотопаз, Васішв,

Зігеріотусез, гриби, дріжджі, клітини комах типу Зродоріега їШидірегда (519), тваринні клітини типу клітин яєчника китайського хом'яка (СНО) та клітин миші, такі як М5/О, клітини африканської зеленої мавпи такі, як

Со5 1, СО5 7, 85502 1, В502 40 і ВМТ 10, а також людські клітини, рослинні клітини у культурі тканини. Для експресі тваринних клітин ми віддаємо перевагу СНО клітинам і СО5 7 клітинам в культурах і особливо СНО клітинним лініям СНО (ОНЕК-) або НКВ лініям.

Звичайно слід розуміти, що не всі вектори і послідовності контролю експресії будуть функціонувати 7/0 однаково добре для експресії ДНК-послідовності, описаної в даній заявці. Також не всі хазяйські організми будуть однаково добре функціонувати з тією же самою системою експресії. Однак фахівець в даній галузі може зробити вибір серед цих векторів, послідовностей контролю експресії та хазяїв без невиправданого експериментування. Наприклад, при виборі вектора слід вивчити хазяїна, тому, що вектор буде копіюватися в ньому. Слід також прийняти до уваги кількість копій вектора, здатність управляти цією кількістю копій та /5 експресію будь-яких інших білків, що кодуються вектором, таких як антибіотичні маркери. Наприклад, вектори, яким надається перевага, та які застосовуються в даному винаході, включають ті, що дозволяють ампліфікувати

ДНК, яка кодує 1І-2 мутеїни, у деякій кількості копій. Такі вектори добре відомі. Вони включають, наприклад, вектори, здатні до ампліфікації за допомогою ЮОНЕК ампліфікації (див., наприклад, Кашйтап, Патент США Мо 4,470,461, Кацйтап і Зпагр, Сопвігисіоп ої а Моадшіаг Біпуагагоіаїе Кедисіазе СОМА Сепе: Апаїувів ої відпав 2о ЧчНївей ог епісіепі ехргезвіоп", Мої. Сеї. Віо, 2, стор. 1304-19 (1982) або глутамінсинтетази ("55") ампліфікації (див., наприклад, Патент США Мо5,122,464 та європейську опубліковану заявку Мо 338,841).

У виборі послідовності контролю експресії слід також брати до уваги різноманітні чинники. Вони включають, наприклад, відносну силу послідовності, її контрольованість та її сумісність з фактичною ДНК послідовністю, що кодує 1/-2 мутеїн даного винаходу, особливо, що стосується потенційних вторинних структур. Хазяйські сч ов Організми повинні піддаватися селекції з огляду на їх сумісність з вибраним вектором, токсичність продукту, що кодується ДНК послідовностями даного винаходу, характеристики їх секреції, їх здатність до правильного (8) згортання поліпептидів, їх вимоги, щодо ферментації та культивування і легкість очищення продуктів, що кодуються ДНК послідовностями.

У межах цих параметрів фахівець може вибирати різні комбінації вектор / контрольна експресійна Ге!

Зо послідовність / хазяїн, які будуть експресувати бажані ДНК послідовності при ферментації або в тваринній культурі у серійному масштабі, наприклад, використовуючи СНО клітини або СО5 7 клітини. --

І/-2 мутеїни, отримані відповідно до винаходу, можуть бути глікозильовані, або неглікозильовані в М залежності від організму-хазяїна, що застосовується для одержання мутеїну. Якщо бактерії вибрані як хазяїн, тоді одержаний 1-2 мутеїн буде неглікозильованим. Еукаріотичні клітини, з іншого боку, будуть глікозилювати ме)

Ї/-2 мутеїни, хоча можливо не таким способом, як глікозилюється нативний 1/-2. І/-2 мутеїн, утворений ї- трансформованим хазяїном, мутеїн може бути очищений будь-яким відповідним способом. Відомі різні способи очищення 1/-2. Див., наприклад Сшитепі ргоїосоїв іп ргоївіп зсіепсе, МоЇ 2. Едв: доп Е.Соїїдап, Веп М. Юипп,

Нідде І. Ріоенпо, Оамій МУ. Зреїспег, Раці Т. МУіпойейа, Опії 6.5 (Соругідні 1997, Уойп УУПеу апа 5опв, Іпс).

Ми віддаємо перевагу повторній зборці з тілець включення, генерованих в Е.соїї або з кондиційного середовища « Культур дріжджів або ссавців, що продукують даний мутеїн, застосовуючи катіонний обмін, гель-фільтрацію, ств) с та/або рідинну хромотографію зі зворотною фазою . Див. Приклади 1 (Е. соїї) і 10 (перфузійна культура клітин

СНО), що приведені нижче. з Біологічна активність ІЇ/-2 мутеїнів цього винаходу може бути досліджена будь-яким відповідним способом.

Такі дослідження включають проліферацію РНА-бласту і природних кілерних клітин. Мутанти, що мають прийнятну активність, тобто є цілком активними на ІІ -2КазЗу, з послабленою активністю на клітинах, що несуть -І І/-2КРУ, будуть підтверджені при застосуванні двох аналізів. "Відносна активність" мутеїну вимірюється в порівнянні з ІЇ-2 дикого типу, і як описано далі в прикладах, є співідношенням активності проліферації о РНА-бласту до проліферації природних кілерних клітин. -І І/-2 мутеїн даного винаходу буде вживатися в дозі, що приблизно дорівнює або більша, ніж використовувана 5р в терапії за допомогою нативного 1-2 дикого типу або рекомбінантного типу. Вводиться переважно ефективна - кількість ІЇ/-2 мутеїну. "Ефективна кількість" означає кількість, здатну запобігати або зменшувати тяжкість

Ге) або поширення стану або ознаки, що лікується. Для фахівців буде очевидним, що ефективна кількість 1-2 мутеїну буде залежати від хвороби, дози, графіку введення 1-2 мутеїну, від того, чи вживається 1-2 мутеїн окремо, чи у поєднанні з іншими терапевтичними агентами, від значення сивороткового напіврозпаду сполуки і

Загального стану здоров'я пацієнта.

Ї/-2 мутеіїн переважно вводиться у складі сполуки, яка включає фармацевтично прийнятний носій.

Ф) "Фармацевтично прийнятний носій" означає носій, який не проявляє несприятливих ефектів у пацієнтів, яким ка його вводять. Такі фармацевтично прийнятні носії добре відомі. Ми переважно використовували 2 95 НЗА/РВ5 при рН 7,0. во І/-2 мутеїни даного винаходу можуть бути сформульовані у фармацевтичні композиції добре відомими способами. Див., наприклад, Кетіпдіоп'є Рпаппасашііса! Зсіепсез ру Е.МУ.Мапйіп, де описуються відповідні формулювання та які введені у дану заявку як посилання. Фармацевтична сполука ІЇ-2 мутеїну може бути сформульована в різних формах, включаючи рідинну, гелеву, ліофілізовану або будь-яку іншу відповідну форму.

Форма, якій надається перевага, буде залежати від ознаки ознаки, що лікується. 65 Фармацевтичні сполуки 1/-2 мутеїну можуть вводитися орально, як азрозоль, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інтрадермально або підшкірно або будь-яким іншим прийнятним способом. Спосіб введення,

якому надається перевага, буде залежати від певного симптому, який лікується, і буде очевидним для фахівця.

Фармацевтична сполука ІЇ-2 мутеїну може вживатись в разом з іншими терапевтичними агентами. Ці агенти можуть бути частиною однієї фармацевтичної сполуки або можуть вживатись окремо від ІІ -2 мутеїну, одночасно або відповідно до будь-якого іншого прийнятного графіку лікування. Крім того, фармацевтична сполука 1-2 мутеїну може використовуватися як доповнення до інших терапій.

Відповідно, цей винахід забезпечує сполуки і способи лікування ВІЛ, раку, аутоїммунної хвороби, інфекційної хвороби, вакцини як допоміжного засобу при раковій та звичайній вакцинотерапії для імуностимуляції в похилому віці або у індивідуумів, що мають іншим чином порушений імунітет, а також серед 7/0 ЗСІО пацієнтів або для іншого терапевтичного застосування, що вимагає стимулювання імунної системи у будь-якої відповідної тварини, бажано ссавця, бажано людини. Як вже зазначалося, ІІ-2 має багато ефектів.

Деякі з них включають стимулювання РНА-бластів, спочиваючих Т-клітин, В-клітин, моноцитів, і природних кілерних клітин і т.д.; мутеїни, описані в даній заявці, будуть впливати на типи клітин, що експресують тільки рецептори 1-2 високої спорідненості, такі, як спочиваючі Т-клітини, але не рецептори І/- 2 проміжної /5 бпорідненісті, такі, як природні кілерні клітини або моноцити.

Розглядається також використання ДНК послідовностей, що кодують 1-2 мутеїни даного винаходу в генній терапії. Розглянуті випадки застосування в генній терапії включають лікування тих хвороб, при яких 1-2, як очікується, забезпечить ефективну терапію завдяки його активності стосовно Т-клітин, наприклад, ВІЛ, раку, аутоїммунної хвороби, інфекційної хвороби, вакцини як допоміжного засобу при раковій та звичайній 2о вакцинотерапії для імуностимуляції в похилому віці або при порушенні імунітету, а також серед ЗСІЮ пацієнтів, та хвороб, що бажано піддаються дії ІЇ-2 або інфекційних агентів, чутливих до опосередкованого реагування імунної системи на І! -2.

Локальна доставка 1/-2 мутеїнів при застосуванні генної терапії може забезпечити присутність терапевтичного агента в місці призначення. Розглядаються як іп міо, так і іп мімо способи генної терапії. сч

Відомі декілька способів доставки потенційного терапевтичного гена до визначеної клітини. Див., наприклад,

Миїїдап, " Тне Бразіс зсіепсе ої депе ІПегару ", Зсіепсе. 260: 926-31 (1993). Ці способи включають: і) 1) прямий перенос гена. Див., наприклад, УМО та ін., " Оігесі депе ігапеїег іп тоцве тивзсіе іп мімо"

Зсіепсе. 247:1465-68 (1990); 2) перенос ДНК, опосередкований ліпосомами. Див., наприклад, Саріеп та ін., "Орозоте-тевдіаеай СЕТК депе Ге! зо їапетег о (Ше паза! ерййеїйнст ої райепів м/й сівіс Прговів" Майте Мей. З; 39-46 (1995); Стівіа), "Те депе аз а агод" Маїшге Мей. 1:15-17 (1995); Сбао і Ниапуд, " А поме! Сайопіс Піровоте Кеадепі Бог ї-7

ЕпПісіепі Тгапетесіоп ОЇ Маттаїап СеїІв", Віоспет. Віорпувз. Кев. Сотт . 179: 280-85 (1991); М

З) перенос ДНК, опосередкований ретровірусом. Див., наприклад, Кау та ін.," п Мімо депе (Пегару ої

Петорпіїйаі В: Зибвіаіпейд рапіа! сопгесіоп іп Тасіог ІХ-ЮОеїсіепі додв" Зсіепсе. 262:117-19 (993); ме)

Ападегвзоп," Нитап депе (Пегару", Зсіепсе. 256: 808-13 (1992). ї- 4) перенос ДНК, опосередкований ДНК-вірусом. Такі ДНК-віруси включають аденовіруси (переважно вектори на основі Ад-2 або Ада-5), віруси герпесу (переважно вектори на основі вірусу звичайного герпесу) і парвовіруси (переважно вектори на основі "дефектних" або неавтономних парвовірусів, більш бажано вектори на основі аденоасоційованих вірусів, найбільш бажано на основі ААМ-2 вірусів). Див., наприклад, АЇЇ та ін., " «

Те изе ої ОМА мігивев аз месіоге ог депе (пегару, Сепе Тпегару 1: 367-84 (1994); Патент США Мо4,797.368, З) с включений тут як посилання, та Патент США Мо5,139,941, включений тут як посилання.

Вибір певної векторної системи для доставки буде залежати від різних чинників. Важливим чинником Е ;» природа цільової популяції клітин. Хоча ретровірусні вектори ретельно вивчилися і застосовувалися в ряді випадків генної терапії, ці вектори в основному не придатні для інфікування клітин, що не діляться. Крім того, ретровіруси є потенціально онкогенними. -І Аденовіруси мають ту перевагу, що вони мають широкий діапазон хазяїв, можуть інфікувати спочиваючі або заключно диференційовані клітини, такі як нейрони або гепатоцити, і Е суттєво неонкогенними. Див., наприклад, о АЇїі та ін., вище, стор. 367. Аденовіруси не виявлені як такі, що інтегрують у хазяйський геном. Оскільки вони -І існують поза хромосомою, то ризик інсерційного мутагенезу значно зменшується (АЇЇ і інші, вище, стор. 373).

Аденоасоційовані віруси проявляють такі ж переваги, як і вектори, що базуються на аденовірусах. Однак, - ААУ» проявляє сайт-специфічну інтеграцію у людську хромосому 19. АЇЇі та ін., стор. 377.

Ге) У втіленні, якому надається перевага, ДНК, що кодує 1-2 мутеїн цього винаходу, використовується в генній терапії для лікування хвороб імунної недостатності, таких, як ВІЛ; інфекційних хвороб, таких, як туберкульоз; і раку, такого, як ниркова карцинома.

Відповідно до цього втілення генна терапія із застосуванням ДНК, що кодує ІЇ/-2 мутеїни цього винаходу, проводиться серед пацієнтів одночасно або зразу ж після діагностики.

Ф) При такому підході застосовується перевага селективної активності ІЇ/-2 мутеїнів даного винаходу, щоб ка запобігти небажаній токсичності і шкідливим ефектам. Кваліфікований фахівець оцінить той факт, що будь-який прийнятний вектор для геної терапії, що містить ДНК мутеїну 1-2, може використовуватись відповідно до цього во втілення. Способи для конструювання такого вектора відомі. Див., наприклад, Апдегзоп, МУ.Г., Нитап депе

Іпегару, Майте. 392 25-30 (1998); Мепта, І.М., і Бботіа, М., Сепе (Пегару - рготівевз, ргобіетв, апа ргозресів, Майшге, 389 239-242 (1998). Введення вектора, що містить ДНК мутеїну 1-2, у цільовий сайт може бути здійснене при використанні відомих способів.

Наступні приклади представлені для кращого розуміння винаходу. Ці приклади наводяться тільки для 65 ілюстрації і не обмежують можливості винаходу в будь-який спосіб. Усі публікації, згадані тут, включені як посилання в своїй повноті.

С Приклади

Приклад 1. Одержання мутеїнів в Е. сої.

Мутанти були одержані за допомогою сайт-направленого мутагенезу при застосуванні праймерів, що містять

КодОНИ, які відповідають бажаній мутації, як це описано Кипке! ТА, Кобегіз 90, та 7аКоиг КА, "Каріа апа еПісіепі зіе-зресіїс тиадепевзів м йпоці рпепоїуріс зеіесіоп" (1987), Меїйодв Еплутої!" 154: 367-382. Якщо коротко, то КДНК 1-2 людини, що містить сайти рестрикції Ватні та Храї, субклонували в М13 фаговий вектор

М13 тр19 (Мем Еподіапа Віоіарз, Вемепу, МА) застосовуючи ті ж самі сайти. кКДНК 1-2 дикого типу одержували, використовуючи полімеразну ланцюгову реакцію ("ПЛР") з пулу кКДНК, одержаної з мРНК, ізольованої від 7/0 людських периферійних лімфоцитів крові, індуковану за допомогою 24 годин обробки форбол 12-мірістат 13-ацетатом (10 нг/мл). Використовувані ПЛР праймери представляли собою для 5'-кінця 1-2 відкритої рамки зчитування,

БІ -ССТ САА СТО СТО ААТ ТСА ТОТ АСА ОА ТОС -3' (ЗЕО І МО: 3); для З '"-кінця ІІ--2 відкритої рамки зчитування 5-СбА ДОС ОА ТСС ТТА ТСА АСТ САС ТОТ ТОА ОО -3 (ЗЕ ІЮО МО: 4).

Рестрикційні ферментативні сайти ЕсоК! (5-кінець) та Ватні (З3'-кінець) були включені в кожний олігонуклеотид і позначені курсивом. Використовувані умови ПЛР були 1 хвилина при 94 С, і 1 хвилина при 58,72С, і 1 хвилина при 722С для 25 циклів. Одержана таким способом правильна кДНК послідовність ІІ -2 була підтверджена секвенуванням послідовності при використанні Зедцепазе Я комплекту для секвенування (Атегепат І Ге Зсіепсе, Агпіпдіоп Ніднів, І), як описано виробником. Зокрема, одналанцюгова ДНК, що містить урацил (Ш-ДНК) була одержана шляхом трансформації штама Е. соїї СО236 (Віо-Кай І арогайогієев, Негсціев, СА) з

М13 тр19, що містить кКДНК 1-2. Сайт-направлений мутагенез застосовувався на праймерах, які містили 15 нуклеотидів, гомологічних матриці О-ДНК 5 до кодону(ів), націленого(их) для мутагенезу, нуклеотиди, які вводили бажану зміну, і додаткові 10 нуклеотидів, гомологічних матриці О-ДНК 3 до кодона(ів) останнього СМ зміненого нуклеотиду. Спочатку сайт-напрвлений мутагенез використовувався для введення Мсо | о рестрикційного сайту на початку зрілої послідовності людського ІЇ/-2. Використання цього рестрикційного сайту включає М-термінальний метіоніновий залишок, що спрямовуватиме експресію в цитоплазмі Е. сої, при застосуванні, наприклад, вектора експресії рРЕТЗсіІ. Праймер, що використовувався для цієї мети, представляв собою: (22) 5-ОСА СТТ ОТО АСА ААС АСС АТО ОСА ССТ АСТ ТСА АСТ-3 (ЗЕО ІЮ МО:5) Специфічними праймерами - для включення мутації в положеннях Ю20, М88 і 0126 були:

О20Х: 5-СбБА ОСА ТТ АСТ ОСТ ММ МТ АСА САТ 0-3 (5ЕО ІО МО:6) М88Х: 5-50 АСТ ТАА ТС ОСМ че

ММА ТСА АСО ТАА ТАС -3! (5ЕО ІЮМО:7) О126Х: 5-СОА ТТА ССТ ТТТ ОТМ ММА ОСА ТСА ТСТ С-3' (ЗЕО І со

МО:8) Де МММ був замінений прийнятним кодоном для гістидина (САС) або ізолейцина (АТС) (у положенні О20), аргініна (ССТ), гліцина (ОСТ), або ізолейцина (АТС) (у положенні М88), або лейцина (СТО) (у положенні 0126). /ї-

Інші мутації використовували подібну стратегію і прийнятний кодон для даної мутації. Праймери були фосфорильовані при застосуванні Т4 полінуклеотидкінази (Мем Епдіапа Віоіарв, Вемегіу, МА) при використанні пропису виробника. Після відпалювання праймерів до 0О-ДНК матриці та подовження за допомогою «

ДНК-полімерази 17 (Віо-Кай І арогайгієв, Негсціез, СА) клітини Е. соїї штама ОНбатм (бірсоВвкі, Сайпегзрига,

МО) були трансформовані при використанні 5 мкл реакційної суміші і нанесені на І В середовище, що містить 0,7 в) с Фо агар. Після інкубації при 3723 бляшки розмножували шляхом відбору одиничної бляшки, перенесення Її в 2 мл "» ЇВ середовища і вирощування при 372. Один ланцюг ДНК був ізольований при використанні М13 набору для " очистки (Оіадеп, Іпс., Спаївжогій, СА) згідно з прописом виробника, а клони, що містять бажану мутацію були ідентифіковані шляхом секвенування послідовності одноланцюгової ДНК, застосовуючи Зедцепазе ЄЮ комплект для секвенування (Атегзпат, ІПе Зсіепсе Апіпдіоп Ніднів, І) згідно з прописом виробника. кКДНК 11/-2 і мутеїну, одержана від реплікативної форми ДНК, що відповідає бляшкам, які містять правильну мутовану оз послідовність, була ізольована при застосуванні Мсо! та Хра! і субклонована до плазмідного вектора рЕТЗа (Зігаїадепе, Зап Оіедо, СА) (бігад. Штам ВІ21 Е. соїї був трансформований у плазмідний вектор рЕТЗа, що

Ше кодує мутеїн, і вирощений до значення АВ5З280 від 0,60 до 1,0, і в цей час додавали 0,4 мМ ІРТО для стимуляції -к 70 утворення 1-2 мутеїну.

Приклад 2. Екстракція та очистка ІІ -2 мутеїнів в Е. сої. с Через три години після індукції клітини були зібрані центрифугуванням при 10,000 Х д. Рекомбінантні 1/-2 мутеїни були ренатуровані та очищені першим розведенням клітин в 10 об'ємах (об./сира маса) цукрозаЯрис/ЕДТА буфера (0.375М цукрози, 10 мМ Трис/НСІ рН 8,0, 1 мМ ЕДТА). Розведені клітини були оброблені ультразвуком З рази при 300 Му з переривами у ЗО секунд на крижаній бані, використовуючи пристрій

ГФ) для обробки ультразвуком Міззопіх моделі ХІ 2020, обладнаний 1 дюймовим стандартним зондом. Оброблений кю ультразвуком матеріал потім центрифугували при 17,000 х д протягом 20 хвилин при 420. Осад, який повинен бути білим на цій стадії один раз промивали шляхом ресуспендування і центрифугуванням в буфері цукрозаЯрис/ЕДТА, двічі у буфері Трис/ЕДТА (50 мм Трис/НСІ рН 8,0, 1 мм ЕДТА), і нарешті ресуспендували в 60 10 об'ємах буфера 0,1 М Трис/НСІ, рН 8,0 (на цій стадії зразок береться для аналізу на гелі) і центрифугували протягом 20 хвилин при 17,000 х 9.

Осад розчиняли доданням З об'ємів 8 М хлориду гуанідіну в 0,1 мМ, Трис/НСІ (рН 8,0) та 0,1 об. 2-меркаптоетанолу. Після інкубації протягом 2 годин при кімнатній температурі зразок центрифугували протягом 20 хвилин при 17,000 х 9. Одержаний в результаті розчин діалізували протягом приблизно 20 годин проти 20 65 об'ємів 10 ММ Трис/НСЇІ, рН 8,0, 1 мм ЕДТА при 42С. Розчин центрифугували при 17,000 Х д протягом 20 хвилин,

доводили до 0,1 95 трифтороцтової кислоти і фільтрували через 0,22 мікронний фільтр. Розчин негайно переносили в сіліконізовану пляшку і завантажували в С8 колонку (Мудас 208ТРБАІ). ІІ -2 мутеїни були очищені при застосованні 20-хвилинного лінійного градієнту, використовуючи 45-85 90 ацетонітрил в 0,195 ТФО.

Концентрація елюйованого білка була визначена при застосуванні А280 та амінокислотного аналізу. Потім білок еліквотували (10О0мл) в сіліконізованих пробірках та зберігали при -20 градусах Цельсія. Мутеїн, очищений таким способом, типово представляв собою окрему смугу, як це спостерігали при 5О5-РАСЕ (забарвлення сріблом) і був кількісно визначений амінокислотним аналізом (точність типово складає » 9096).

Приклад 3. Аналіз проліферації Т-клітин 70 Мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМС) були ізольовані з приблизно 100 мл нормальної людської крові (Ігміп Метогіаї Віососд Вапк, Зап Ргапсізсо, СА), розведені 1:22 в холодному Дюльбекко фізіологічному розчині, забуференому фосфатом (вільні Са?" і Ма?"; ОРВ8). Нашаровували РісоїІ-Радце (Рнагтасіа) і зразок центрифугували для відокремлення РВМС, після чого здійснювали тривале промивання в холодному ОРВ5.

РНА-бласти (активовані Т-клітини) одержували ресуспендуванням клітин в середовищі КРМІ 1640, що містить 75.10 9о ембріональної бичачої сироватки (Нусіопе), до якого додавали по 1 95 (мас/об.) кожної з наступних речовин: І-глутамін; неесенціальні амінокислоти; піруват натрію і антибіотик - протигрибковий засіб (КРМІ середовище) при концентрації 1 Х 1092 клітин/мл. Фітогемаглютинін (РНА-Р; бідта) додавали при заключній концентрації 10 мкг/мл, і клітини інкубували при 372С, 5 95 СОг протягом З днів. Клітини збирали і промивали два рази в ОРВ5, ресуспендували в КРМІ середовищі і поміщали у планшет на 96 комірок з плоским дном при щільності 1 Х 105 клітини / комірка в 200 мкл із змінними концентраціями ІІ-2 або мутеїну в ЕРМІ середовищі.

Планшети інкубували протягом 48 годин при 372С, піддавали обробці імпульсами 1 мкКі ЗН-тімідіну (ОРопі МЕМ

Ф, Бостон, МА) / комірка протягом 6 годин, збирали, після чого вимірювали радіоактивність на скловолоконних фільтрах.

Приклад 4. Аналіз проліферації природних кілерних клітин. с

Мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМС) ізолювали з приблизно 100 мл нормальної людської крові (3 (Ігліп Метогіа! Віоса Вапк, Зап Егапсізсо, СА), розводили 1:2 в в холодному Дюльбекко фізіологічному розчині, забуференому фосфатом (вільні Са?" і Ма"; ОРВ8). Нашаровували ГРісоП-Радцие (РНапгтасіа) і зразок центрифугували для відокремлення РВМС, після чого здійснювали тривале промивання в холодному ОРВ5.

Природні кілерні клітини відокремлювали від інших клітин. Для цього перевага надається комплекту для ізоляції Ф природних кілерних клітин Мікепуі Віоїесз (Вегдізсп СіІадраси, Сегпгтапу; Сай 465-01) . Комплект складається - з двох реактивів, роздільних колонок і дуже потужної магнітної підтримки колонок. Перший реактив являв собою суміш кон'югованих з гаптеном моноклональних антитіл СЮОЗ, СО4, СО19, СОЗ33 мишачого ізотипу ІдДС1. Це - здійснювали для виснаження РМВС стосовно Т-клітин, В-клітин і мієлоїдних клітин. Передбачено, що можна со застосовувати будь-який відповідний набір антитіл, що розпізнає ці типи клітин. Другий реактив складався з

Зо колоїдних супер-парамагнітних МАС мікрокульок, кон'югованих з антигаптеновим антитілом. Клітини - ресуспендували в РВ5 з 0,5 96 ембріональної бичачої сироватки і 2 мМ ЕДТА (РВБЗ/ЕДТА). Об'єм суспензії залежав від кількості використовуваних клітин і забезпечували у вигляді діаграми Мікепуї Віоїес. Як правило, при кількості клітин від 2 до 5 х 109 РВМС клітини ресуспендували в 800 мкл буфера, а потім застосовували « 20 20О0мкл кожного реактиву. Після інкубації з реактивами клітини вносили у колонку (ресуспендовані в 2мл -в буфера). Клітини, відмінні від природних кілерних клітин, прилипали до магніту (виснажували по цих клітинам), с а природні кілерні клітини відокремлювали і збирали у потоці, що пройшов через колонку. Клітини промивали, :з» ресуспендували в КРМІ середовищі (містить: КРМІ 1640, до якого додавали по 195 (мас/об.) кожної з наступних речовин: І-глутамін; неесенціальні амінокислоти; піруват натрію; і антибіотик - протигрибковий засіб (усі від сСірсо/ВКІ, Сайпегзриго, МО); 10 906 ембріональної бичаої сироватки (Нусіопе)), переносили у планшет на 96 -І комірок з плоским дном при щільності 1 Х 109 клітини / комірка в 200 мкл. Потім клітини збирали і промивали два рази в ОРВ5, ресуспендували в КРМІ середовищі і поміщали на планшет на 96 комірок з плоским дном при о щільності 1 Х 105 клітини / комірка в 200 мкл із змінною концентрацією ІЇ-2 або мутеїну в ЕРМІ середовищі. - І Чашки інкубували протягом 48 годин при 372С, піддавалми обробці імпульсами 1 мкКі ЗН-тімідіну (ОРопі МЕМ шу 20 Ф, Бостон, МА) / комірка протягом 6 годин, збирали, після чого вимірювали радіоактивність на скловолоконних фільтрах. (Че) Приклад 5. Мутеїни, що вибірково активували Т-клітини у порівнянні з природними кілерними клітинами.

Мутеїни одержували, застосовуючи сайт-направлений мутагенез (Кипкеї! та ін. (1987), Меїййодз Епгутої! 154: 367-382) в положеннях Авр-20, Авзр-84, Азп-88 і Сіпе -126 і експресію в Е. соїї при застосуванні рЕТ-За системи експресії, як описано виробником (Зігаїадепе). Мутеїни були очищені відновленням тілець включення в гуанідин-НСЇІ, їх піддавали повторній зборці, після чого їх піддавали ВЕРХ, як описувалося раніше. Одержаний в о результаті білок показав » 95 95, чистоти при застосуванні забарвленого сріблом 5О5 електрофорезу в ко поліакриламідному гелі, потім його аналізували на концентрацію та чистоту за допомогою амінокислотного аналізу (ААА точність типово складала » 90 95). Мутеїни, що мають прийнятну активність, були підтверджені 60 щодо послідовності при застосуванні масового спектрометричного аналізу. Мутеїни, очищені таким способом, були оцінені в аналізах Т-клітин та природних кілерних клітин, як описувалося раніше. Відносні активності для

І/-2 мутеїнів в аналізах Т-клітин і природних кілерних клітин приведені в Таблиці 1. вв

Мутеїн відносна активність відносна активність

7 евітина проти мкотиви г хптина коклтина бом! 11111111 о і мввмуєн| 011011 20 см 5 о мвв 10000080 о0ожю ово Ф зо - т му 177118 |ооовю о о з двмуні 11100101 щ « ю З с

І» - о - я. - с

Активності мутеїнів описані з точки зору відносної концентрації мутеїну, необхідної для забезпечення максимальної 5095 відповіді (ЕСво) у порівнянні з ЕС 5о дикого типу І/-2 у тому ж самому випробуванні; у іФ) випадку багатократних випробувань на тому ж самому мутеїні наводяться середньогеометричні значення. ЕСво ко значення для дикого типу 1-2 були в межах від -10 пМ до 150 П М в аналізі Т-клітин, і -50 пМ до «200 пМ в аналізі природних кілерних клітини. Співвідношення активності мутеїнів щодо природних кілерних клітин проти бо Т-клітин виражене як відносна активність мутеїну на Т-клітинах, розділена на відносну активність мутеїну на природних кілерних клітинах. Це відношення визначене для кожного мутеїну при застосуванні тільки активності, визначеної з даних аналізів Т-клітин та ПК-клітин, застосовуючи клітини одержані від одного донора.

Активність мутеїну може бути класифікована на 6 широких категорій: 1) 1000-кратна селективність Т-клітин 2) більша 100, але менша 1000-кратної селективність Т-клітини; З) більша 10, але менша 100-кратної 65 селективність Т-клітин; 4) поліпшена активність відносно І/-2 на Т-клітинах; 5) селективність стосовно

ПК-клітин; 6) 10-кратна селективність або для Т- або для ПК-клітин.

Клас 1: Ю2ОН, І та У; М885.1І. і Кк.

Клас2:020ОК,І, М., М, о і 5; М88М і 7; 91260, Е, б, М.

Клас 3: 02ОК; М884А, Е, Р, 5 і М; О126Е, І, М, К і 5.

Клас 4: 0201; М88О0; О126Е, І М, Мі Кк.

Класб5:СПа2бА, Н.

Клас 6: О20А, Ті М; М88Н,К, І, МУ і М; О126К, Р, Т, М і М.

У межах класів 1-3, мутеїни, яким надається перевага, є такими, що проявляють активність, близьку до дикого типу ІЇ-2 або кращу на Т-клітинах. У класі 1 такі включають О2ОН і І; М880, | і К; в класі 2 такі /р0 Включають М88М і т, 01260, Е, б, І ї М; в класі 3, такі включають М88А, 0126Е і б. Мутеїни в класі 4, як передбачається, матимуть більшу ефективність, ніж 1-2 дикого типу іп мімо.

Як видно з Таблиці 1, жодна окрема мутація не призвела до мутеїну ІЇ/-2 неактивного в обох аналізах.

Однак, можна зрозуміти, що комбінація мутацій, яка призводить до пошкодженої активності в двох різних положеннях, можливо буде потенціально забезпечувати антагоністичну активність І -2 на Т-клітинах, або інших /5 типах клітин, що несуть рецептор 1-2 високої спорідненості. Такий антагоніст передбачається на основі цих даних, оскільки мутації були розроблені так, щоб змінити тільки взаємодію з І -2КР 11 -2Р1у. Прикладом був би подвійний мутеїн 020К/0126Т. Передбачають, що комбінація слабко активних мутацій в одній молекулі буде комбінаторною по природі, тобто Ю2ОК має 0,00018 активність на Т-клітинах, 0126Т має 0,0001 активність на

Т-клітинах, подвійний мутеїн 020ОРУ/О126Т, як очікується, буде мати 0,000000018 активність 1-2 дикого типу на

Т-клітинах. Інші комбінації можуть бути отримані на основі наведених даних.

Приклад 6. Біологічна активність ІІ -2 і 1-2 мутеїнів дикого типу.

Фігури від 1 до 7 показують криві залежних від дози відповідей людського 1І/-2 дикого типу (1/-2) ії 02ОН (фіг.1), 11-2 ї 0201 (фіг.2), 1-2 їі М880 (фіг.3), 1-2 і М88І (фіг.4), 1-2 і Мак (фіг.5), 1/-2 і О126Е, (фіг.б), і 1-2 ї 01261 (фіг.7). А: Індивідуальні залежні від дози 1-2 (заштриховапні кола) і мутеїну сч об (незаштриховані кола) відповіді в первинному аналізі проліферації людських Т-клітин (РНА-бласти). В:

Індивідуальні відповіді на дозу І/-2 (заштриховані трикутники) і мутеїну (незаштриховані трикутники) у і) первинному аналізі проліферації людських ПК-клітин.

Зокрема, що стосується Фіг. 1, для наведеного експерименту, доза І/-2 дикого типу, що дає 50 905 максимальну проліферацію (ЕСьо) 71,5 Х 1079 М при аналізі Т-клітини (А) ї 51 Х 1079М при аналізі ПК-клітин Фу (В). ЕСво для О2ОН складало «2 Х 1079М у цьому аналізі Т-клітин, але оцінювалося як » 1 Х 102М в аналізі

ПК-клітин. Чисте поліпшення активності Т-клітин О2ОН у порівнянні з ПК-клітинами складало » 50,000 разів як -- визначено у цьому аналізі. Подібні результати були отримані при використанні крові, одержаної від додаткових /їче донорів (дані не показані).

Зокрема, що стосується Фіг. 2 для наведеного експерименту, то доза ІЇ/-2 дикого тип о дає 50 95 со р Щ У Дд д р у, Д д У Що д максимальну проліферацію (ЕСво) «1,5 Х 1079 для аналізу Т-клітин (А) і 1 Х 1079М для аналізу ПК-клітин (В). ї-

ЕСво для О20ОН складала також 2 Х 10779М у цьому аналізі Т-клітин, але, як оцінювалося складала тільки 5 Х 10-6М) у цьому аналізі ПК-клітин. Чисте поліпшення активності Т-клітин О2ОН у порівнянні з ПК-клітинами складало « 16,000 разів, як визначено для цього аналізу. Подібні результати були отримані при використанні « крові, одержаної від додаткових доноров (дані не показані). З7З 70 Зокрема, що стосується Фіг.3, для наведеного експерименту, доза ІІ -2 дикого типу, що дає 50 96 максимальну с проліферацію (ЕСво) 74 Х 107! для аналізу Т-клітин (А) і 52 Х 1079М для аналізу ПК-клітин (В). ЕСво для. М880 :з» становило «5 Х 1072М у цьому аналізі Т-клітин, але як оцінювалось, складало тільки «3 Х 10М у цьому аналізі

ПК-клітин. Чисте поліпшення активності Т-клітин О2ОН у порівнянні з ПК-клітинами становило -1,200 разів, як

Визначено для цього аналізу. Подібні результати були отримані при використанні крові, одержаної від -1 додаткових доноров (дані не показані).

Зокрема, що стосується Фіг. 4, для наведеного експерименту, доза І/-2 дикого типу, що дає 50 905 о максимальну проліферацію (ЕСво) складала «1,5 Х 1079 для аналізу Т-клітин (А) і 51 Х 1079М для аналізу -І ПК-клітини (В). ЕСьо для М88І складало 7-4 Х 10 779М у цьому аналізі Т-клітин, але, як оцінювалось, складало -л 20 тільки 75 Х 109 М у цьому аналізі ПК-клітин. Чисте поліпшення активності Т-клітин М88І у порівнянні з активністю ПК-клітин становило -18,000 разів, як визначено для цього аналізу. Подібні результати були іЧе) отримані при використанні крові, одержаної від додаткових доноров (дані не показані).

Зокрема, що стосується Фіг.5, для наведеного експерименту, доза 1-2 дикого типу, що дає 5096 максимальну проліферацію (ЕСьо), становила -1,5 Х 10 79 для аналізу Т-клітин (А) і 41 Х 1079М для аналізу ПК-клітин (В). ЕСво 22 для М88В. складало «9 Х 10-7М у цьому аналізі Т-клітин, але як оцінювалось, складало тільки -3 Х 1077М. у цьому

Ф! аналізі ПК-клітин. Чисте поліпшення активності Т-клітин Ю2ОК у порівнянні з активністю ПК-клітин становило -5,000 разів, як визначено для цього аналізу. Подібні результати були отримані при використанні крові, о одержаної від додаткових донорів (дані не показані).

Зокрема, що стосується Фіг.б, для наведеного експерименту доза 1-2 дикого типу, що дає 5095 максимальну 60 проліферацію (ЕС»о), становила 8 Х 10721для аналізу Т-клітин (А) і - 5 Х 10771 М для аналізу ПК-клітин (В). ЕСво для О126Е складало 59 Х 1077 М у цьому аналізі Т-клітин, але як оцінювалось, складало тільки 52 Х 109 М у цьому аналізі ПК-клітин. Чисте поліпшення активності Т-клітин О126Е у порівнянні з активністю ПК-клітин становило -400 разів, як визначено для цього аналізу. Подібні результати були отримані при використанні б крові, одержаної від додаткових донорів (дані не показані).

Зокрема, що стосується Фіг. 7, для наведеного експерименту, доза 1-2 дикого типу, що дає 50956 максимальну проліферацію (ЕСво), становила « 5 Х 1077! М для аналізу Т-клітин (А) і «8 Х 1071 М для аналізу ПК-клітин (В).

ЕСьо для 0126. складало -2 Х 1077М у цьому аналізі Т-клітин, але як оцінювалось, складало тільки 52 Х 109М у цьому аналізі ПК-клітин. Чисте поліпшення активності Т-клітин Ю2ОК у порівнянні з активністю ПК-клітин становило -625 разів, як визначено для цього аналізу. Подібні результати були отримані при використанні крові, одержаної від додаткових доноров (дані не показані).

Приклад 7. Дослідження токсичності на шимпанзе.

І/-2/ч188К був відібраний з 1/-2 білків мутеїнів Таблиці 1, оскільки він продемонстрував селективну агоністичну активність стосовно Т-клітин в первинному аналізі Т-клітин і ПК-клітин. У порівнянні з 1/-2 70 дикого типу він був у -6,000 разів більш активним на Т-клітинах, ніж на ПК-клітинах, і демонструє по суті еквівалентну ІЇ/-2 дикого типу на Т-клітинах. ІІЇ-2/М188К був одержаний з СНО клітин, очищений і оцінений на шимпанзе стосовно активності та токсичності ІЇ/-2. На цій іп мімо моделі він виявив активність стосовно

Т-клітин, порівняну з дією комерційно доступного рекомбінантного варіанту І/-2 (РКОГЕШКІМ тм, СВігоп

Согрогайоп, Етегуміе, СА), і викликала тільки помірні побічні ефекти (з точки зору як об'єктивних, так і 75 клінічних параметрів).

А. Експериментальна модель 1. Матеріали і способи

Практична частина дослідження, що пройшла в Мем Ірегіа Кезеагсп Сепіег (Мем/ Ірегіа, ГА, Зропзог Вауег

Согрогайоп, Вегкіеу, СА), включала дві фази досліджень і передбачала 11 молодих дорослих шимпанзе чоловічої статі з вагою тіла від 45 до 70 кг.

Фаза | дослідження була фазою визначення дози, вона передбачала введення підшкірної дози носія або підшкірної дози ПРОЛЕЙКІНУ 1,2 мг/м, двічі на день (ВІС) протягом 5 днів. Фаза Ії дослідження була порівнянням, носія, ПРОЛЕЙКІНУ та ІІ -2/М888, що вводилися підшкірно кожні 12 годин протягом 5 днів. Доза

І/-2//І88 була вибрана, щоб забезпечити порівняні результати активності ПРОЛЕЙКІНУ, базуючись на с 259 фармакокінетичному аналізі. Зразки крові були взяті для дослідження хімії крові, СВС, гематології/коагуляції, Ге) та ЕАС5 аналізу популяцій Т-клітин та ПК-клітин, як детально вказано у Розділах 5 і 6.

Ф зо - з со зв м « з З с "» аномальні прояви такі, як покрасніння або опухлість негайно реєструвалися. п

В нини с

В

-о 50 Денетабхвил ///11111х с Денезиїбхвил //11111х ою х ххх ххх

Ф. ою х ххх з хі ххх хх бо 4. Обробка зразків (а) Хімія сироватки. Збирали приблизно З мл зразка крові від кожної тварини в пробірки без антикоагулянта у визначений вище час. Кількість разів забору крові реєстрували і кров залишали зсідатися при кімнатній температурі. Потім зразки центрифугували, видаляли сироватку і доставляли в МІКС клінічну патологічну лабораторію. Стандартний список показників хімії сироватки МІКС наводиться в Таблиці 4 бо Таблиця 4: показники хімії крові (Б) Гематологія. Збирали приблизно 2 мл зразків крові від кожної тварини в пробірки з ЕДТА у визначений вище час і доставляли в МІКС клінічну патологічну лабораторію. Стандартний список гематологічних показників

МІКС, включаючи загальну кількість крові, кількість окремих елементів крові, кількість тромбоцитів, здійснювали для кожного зразка. (с) Спонсорські аналізи

Збирали приблизно 2 мл зразків крові від кожної тварини в пробірки з ЕДТА як антикоагулянтом у визначений вище час. Час забору крові реєстрували. Зразки центрифугували, відокремлювали плазму і аліквотували в три окремі пробірки. Плазма зберігалася замороженою (-602С або нижче) і відправлялась до Вауег Согрогайоп,

Вегкеїеу, СА, як тільки закінчували дослідження. 70 5. ЕАС5 (А) Процедура. Приблизно 5 мл зразок крові був зібраний в гепарин-натрієвому антикоагулянті в час, визначений для ГАСЗ аналізу.

Повний зразок крові був отриманий в ЕДТА, АСО або гепарині. Кількість клітин була відрегульована так, щоб бути в межах від 2 до 20 тисяч в мм. 12 Х 75 скляні або пластмасові пробірки були відповідно позначені для того, щоб вести список антитіл.

Антитіло або суміш антитіла поміщали в пробірки, дотримуючись інструкцій виробника щодо об'ємів. 100 мл добре перемішаного зразка крові поміщали в кожну пробірку, і суміш інкубували протягом ЗОхв. при кімнатній температурі у захищеному від світла вигляді.

Після інкубації додавли 2 мл лізуючого розчину (Весіоп Ріскіпвоп ЕАСЗ лізуючий розчин, ВОЖ 92-0002), суміш обережно перемішували і відстоювали протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Потім пробірки центрифугували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин при 300 Х д. Супернатанти декантували, надлишок рідини видаляли і до кожного клітинного осаду додавали 1 мл РВ5 буферу (СІВСО 14190-144). Після обережного перемішування пробірки центрифугували при кімнатній температурі протягом 5 хв при З00 Х д.

Супернатанти декантували, надлишок рідини видаляли перед тим, як додати 1 мл фіксуючого розчину (0,590 сі формальдегідний розчин, приготовлений шляхом розчинення 10 95 формальдегіду (Роїузсіепсе, Іпс. 20418) 1:20 о з РВЗ буфером) до клітинного осаду і обережно перемішували для ресуспендування. Зразки потім аналізували на проточному цитометрі Сошег ЕРІСЗ БІ. Ріо.

Антитіла, використовувані для дослідження: Мідое1/Міде1 ізотопний контроль (Весіоп Біскіпвоп, Саї. Ж 349526), СО45-РегсР (Весіоп РіскКіпзоп, Саї. 2 347464), СО8-РІТС Ге») (Весюп бісКіпзоп, Саї. 5347313), СО25-РЕ (Весіоп ОісКіпзоп, Саї. й 30795Х), СО4-РІТС (Весіюоп ОіскКіпзоп,

Саї. 5340133), СО16-РЕ (Ріаппіпдеп, Саї. Ж 347617), СОЗ-РегСР (Весюп Оіскіпвоп, Саї. 2 347344). - 6. Профіль коагуляції їч-

Приблизно 2мл повного зразка крові збирали у пробірки з цитратом натрія, який додавали як антикоагулянт у визначений вище час. Коагуляційний профіль складався з часу протромбіна (ЧП), часу частково активованого о тромбопластину (АРТТ) і фібріногену. -

В. Результати і Обговорення 1. Визначення дози ПРОЛЕЙКІНУ

Початкова мета цієї фази полягала в тому, щоб визначити оптимальну дозу ПРОЛЕЙКІНУ для порівняння з «

І/-2/ч88кК. Ця оптимальна доза ПРОЛЕЙКІНУ мала бути толерантною дозою (нижча, ніж максимальна толерантна доза), яка буде в ідеалі клінічно суттєвою, але мати помірну токсичність або усунену токсичність. - с Дозу ПРОЛЕЙКІНУ 1,2мг/м2, ВІО визначали як початкову дозу, яка базується на перехресно-видовій и екстраполяції режимів клінічної дози ПРОЛЕЙКІНУ, їх відповідних токсичностях і результатах оцінення відповіді -» на дозу ПРОЛЕЙКІНУ у мавп в лабораторних умовах.

Двох шимпанзе в такий спосіб лікували ПРОЛЕЙКІНОМ. Ці тварини стали значно менш активними, мали хворобливий вигляд, потерпали від зневоднення протягом курсу лікування. В обох тварин з'явилися гострі -і шлунково-кишкові симптоми, що починалися на З або 4 день, включаючи зменшений апетит, діарею, блювоту. сю Дозування однієї з тварин (номер Х-159) було припинене після З днів дозування через гострі ниркові (Фігури ВА та В) і помірні печінкові (Фігури 8С та Ю) дисфункції, які виявилися при хімічному аналізі крові. Вони -і включали підвищення азоту сечовини крові (АСК), креатинину, і загальної кількості білірубіну. Обом тваринам, -8У 20 що вживали ПРОЛЕЙКІН, давали розчин Зінгера з доданням лактату внутрішньовенно на З і 4 (тварині Х-159) та тільки на 4 день (тварині Х-124) як реанімаційний засіб або для запобігання подальшому збезводнюванню. і3е) Тварина номер Х-159 була виключена з дослідження на 8 день через ниркової дисфункції і можливий тромбоз на правій нозі, про що свідчив мінімальний пульс, при цьому уся ікра ноги була холодною і розпухлою. Хоча істотну токсичність спостерігали в одній тварині, однак інші тварини мали менш гострі симптоми, і профіль 29 несприятливих смптомів для обох тварин був зворотним. Виходячи з цього, було визначено, що 1,2 мг/м 2 о ПРОЛЕЙКІНУ і еквівалентна доза (на основі відповідної дії) ІІ -2/М88К, д12Нг є відповідними режимами дози для порівняння цих двох сполук. ко 2. Порівняння ТІ -2/М1882. з ПРОЛЕЙКІНОМ

Клінічні Спостереження. У Таблиці 5 наведено клінічні спостереження, зроблені протягом дослідження. 60 Значення розміщували на шкалі від 0 до 5, де 5 є гострим симптом. Усі тварини, яким вводили ПРОЛЕЙКІН, були сильно хворі; спостерігали одну, пов'язану з вживанням ПРОЛЕЙКІНУ, смерть. Значення зареєстровані після 6 дня для групи з ПРОЛЕЙКІНОМ відображають дані від двох тваринні, що залишилися. Виявилося, що найбільш очевидний побічний ефект від вживання ІІ-2/ч88К представляв собою помірний кишково-шлунковий розлад (блювоту), хоча лікування передбачає номінальну токсичність в межах параметрів, вказаних у Таблиці 4. Вага 65 тіла групи ПРОЛЕЙКІНУ знижувалася на 695 на б день та до 1095 на 10 день і після цього повільно відновлювалась (див. Фігуру 9). На противагу до цього, групи з І/-2/М88К і носіями мали втрату ваги щонайбільше 1-395. ; носій | нормальний 07100010 то "Значення від 0 до 5, де 5 є найбільш тяжким проявом (А) Гематологія. Спостерігали також індуковані ІІ -2/М88К клітинні ефекти, що є послідовними з активацією

ПРОЛЕЙКІНОМ, зокрема, лімфоцитоз (Фігура 10А), збільшення кількості білих клітин крові (Фігура 108) і нейтрофілію (Фігура ЮС.) ІЇ/-2/ч188К викликав лише маргінальну тромбоцитопенію (нижчий рівень -15 905) 75 порівняно з ПРОЛЕЙКІНОМ (нижчий рівень -50 95) під час лікувальної фази дослідження (Фігура 1 00). (В) Ниркова Функція. Рівні АСК були помітно вищими в усіх тварин, що вживали ПРОЛЕЙКІН на 6 і 8 дні (Фігура 11А). Рівні АСК були більшими, ніж 130 мг/дл у двох з цих тварин; рівні креатину також суттєво збільшилися у цих двох тварин на 6 і 8 дні (Фігура 118), вказуючи на повне припинення ниркової функції. Крім того, як фосфор сироватки, так і аніонний гап також збільшились в групі ПРОЛЕЙКІНУ на б і 8 дні. На противагу 20 до цього, у всіх ІЇ/-2/М88К тварин ці ниркові параметри залишилися в основному нормальними протягом дослідження (Фігури 11С та 0). (С) Функція Печінки. Загальна кількість білірубіну, підвищена більше, ніж у три рази, у групі ПРОЛЕЙКІНУ на день 6 залишалась високою через 10 днів (ДФігура 12А). На противагу до цього, тільки одна тварина в

І/-2/І88К групі мала перехідне, незначне збільшення на З і 6 дні. Рівень БОРТ сироватки, суттєво підвищувався ря і досягав 100 од./л у всіх тварин групи ПРОЛЕЙКІНУ на день 6 (Фігура 128). Рівень ЗОРТ у тварини під номером см

А199 досягав 651 од./л, а 50ОТ 2789 од./л (Лабораторний щоденник: БІЛЯСЯВ8754-9852-Фаза ІІ, Таблиця 1 о індивідуальні та групові середні показники хімічного аналізу, сторінка 17 - 21 таблиці), що вказувало на порушення функції печінки. (р) Коагуляція. Рівень фібріногену збільшувався більше, ніж в два рази, як в групі ПРОЛЕЙКІНУ, так і в 30 І -2/мв8К групах і досяг максимуму 6 на день (Фігура 12С). Виявилося, що підвищення відбувалося раніше в групі ПРОЛЕЙКІНУ, ніж у 1--2/М88К тварин. Про це свідчить збільшення на 51 95 проти 5 95 на день 3. Зміни рівня же фібріногену можуть бути скоріше результатом гострої відповіді на білок, ніж дефектами коагуляції, оскільки не було ніяких значних змін рівня АРТТ або РТ протягом того ж самого періоду часу (Фігура 120). Проте, починаючи з 10 дня рівень АРТТ у групі тварин ПРОЛЕЙКІНУ виявив очевидну тенденцію до підвищення, хоча абсолютне (зе) 35 значення залишилось в межах нормального діапазону. Та ж сама тенденція, хоча і в менших масштабах, м спостерігалась також і в ІІ -2/Мч88К групі. Цікаво зазначити, що рівень фібріногену, знизився протягом того ж самого періоду часу відповідно в обох групах. (Е) Гомеостаз. Рівні натрію сироватки знизились до значення, нижче 135 МЕО/л у двох з трьох тварин, яким вводили ПРОЛЕЙКІН на день 8, але залишалися нормальними в інших тварин (Фігура 13А). Рівні хлориду в групі « 20 ПРОЛЕЙКІНУ також знизилися до рівня, нижче 95 МЕО/л, починаючи з З дня і залишалися низькими до 15 дня з (Фігура 138). Рівень кальцію був нижчий у двох з трьох тварин групи ПРОЛЕЙКІНУ і досяг значення 4,9 і 3,1 с мг/дл у тварини А199 (Фігура 13С). Рівень калію знижувався нижче значення З МЕОС/л з З по 12 день у всіх :з» тварин, яким вводили ПРОЛЕЙКІН, крім тварини А199, рівень калію для якої фактично підвищувався до токсичного рівня 7,2 МЕО/л перед тим, як тварина була виключена з дослідження (Фігура 130). (Р) Ознаки судинного витоку. Рівень альбуміну сироватки знижувався як в групі ПРОЛЕЙКІНУ (37 Фо), такі в -1 групі 1І/-2/М88К (19 90) (Фігура 14А). Збільшення рівня гематокріту спостерігали в групі ПРОЛЕЙКІНУ на дні З і 6 (Фігура 148). На противагу до цього, рівень гематокріту як в контрольній фупі, якій вводили носій, так і в (95) І--2/МІ88К групі знижувався протягом того ж самого періоду часу і залишався низьким, що свідчило про помірну -1 анемію, як і очікувалось, через багатократний забір зразків крові (Фігури 148 та С). Підвищення гематокріту в групі ПРОЛЕЙКІНУ разом із зменшенням рівня альбуміну сумісне з розвитком капілярного синдрому витоку. - З. Клітинна активація. с Ефективність ПРОЛЕЙКІНУ і ІІЇ-2/М882 спостерігаласи за зміною відсотка СО25 позитивних лімфоцитів (переміщення ж проліферація) і середнє значення рівня флюоресценції для СО25 або ряду СО25 антигенів, експресованих на поверхні даних Т-клітини (СО25 - ІІ -2К низької спорідненості). Експресія СЮО25 спостерігалась на загальній популяції Т-клітин (СОЗ «ж клітини) також на СОЗ-СОЯ4 я і СОЗз-СОвВ популяціях.

Активність ІЇ/-2 щодо природних кілерних клітин спостерігали шляхом аналізу переміщення СОЗ3-СО16 і

ГФ) сор3-с025-2016- ПК-клітини. Абсолютні кількості СОЗю, СО4ж, Сов, ПК-клітин були визначені множенням ко відсотоку клітин на кількість лімфоцитів на мм? (дані, отримані під час гематологічного аналізу). (ад) СО25 регулювання експресії на поверхні Т-клітин. Відсоток активованих Т-клітин про що свідчать во позитивні СО25 клітини, мав знижувальну регуляцію до б дня дослідження, головним чином на підпопуляціях сознораз Т-клітин. Виявилося, що ПРОЛЕЙКІН індукує експресію СО25 на більший відсоток на відміну від загальної субпопуляції СОЗю, СОЗ-СО4-- та СЮОЗ-АСОВ я Т-клітин на 6 день. Проте до 8 дня відсоток клітин, що експресують СО25 антиген, був ідентичним на лімфоцитах шимпанзе, яким вводили ПРОЛЕЙКІН, і шимпанзе, яким вводили ІІ -2/М88К (Фігури 15А, В і С). Не спостерігали ніякого забарвлення СО25 на поверхні популяції дб природних кілерних клітин ні в групі ПРОЛЕЙКІНУ, ні в групі ІЇ-2/14882 шимпанзе. Нестача експресії ІІ -2Ба (антиген, націлений на забарвлення поверхні клітин СО25) на поверхні відібраної популяції ПК-клітин

(сС03-/С0165), як передбачається, призводить до такого результату.

Абсолютна кількість СОЗ-СО25- Т-клітин повторювала подібну модель як відсоток СОЗАСО25 Т-клітин, причому ПРОЛЕЙКІН був більш активним, ніж ІІ -2/М88Е. (Фігура 16А). ІІ -2/М882. виявив такий самий потенціал активації Т-клітин, що і ПРОЛЕЙКІН на популяції СОЗАСО4- Т-клітини, оскільки знижувальна регуляція абсолютної кількості СОЗ-СО4-25025- лімфоцитів, індукована 1І/-2/М88К, була ідентичною знижувальній регуляції, що спостерігалася на групі ПРОЛЕЙКІНУ (Фігура 168). Виявилося, що ПРОЛЕЙКІН збільшував кількість СОЗ-СО8-С025- Т-клітин до більшого значення у порівнянні ІІ -2/М88К (Фігура 16С).

Кількість СО25 молекул (середнє значення флюоресценції), експресованих на підпопуляції СОЗАСОдч 7/0 Т-клітин мала ідентичну кінетику, що й лікування ПРОЛЕЙКІНОМ або ІІ -2/МІ88К (Фігура 17). (Б) Переміщення лімфоцитів: ефект лікування ПРОЛЕЙКІНОМ і 1І-2/ч88К.

Активність ПРОЛЕЙКІНУ і ІІ -2/М882. на популяції Т-клітин і ПК-клітин були визначені шляхом аналізу зміни абсолютної кількості циркулюючих лімфоцитів до, протягом і після лікування (Фігура 18). Виявилося, що

І/-2/188К мав більшу активність, ніж ПРОЛЕЙКІН щодо збільшенню абсолютної кількості СОЗ-СОа 7/5 циркулюючих (Фігура 18А), і трохи слабшу дію, порівняно з ПРОЛЕЙКІНОМ щодо збільшення абсолютної кількості СОЗ-СОви циркулюючих лімфоцитів (Фігура 188). Обидві сполуки мали порівняний, хоча і незначний, ефект на збільшення загальної кількості СОЗ-- лімфоцитів (Фігура 18С). Ні ПРОЛЕЙКІН, ні ІІ -2/М882. не впливали на переміщення ПК-клітин (Фігура 180).

С. Висновок

І/-2/ч88К одержували шляхом просіювання білків мутеїну ІІ -2 у первинному випробуванні людських Т- клітин і ПК-клітин. Він демонструє іп мйго- б О00-кратну селективність стосовно Т-клітин у порівнянні з

ПК-клітинами. Базуючись на цьому профілі клітин, було постульовано, що він викликатиме тільки помірні побічні ефекти, якщо буде вживатися в дозі, яка виявляє істотну активацію Т-клітин. Експерименти з шимпанзе, порівнювання ПРОЛЕЙКІНУ з І/-2/188К підтвердили, що ІІ/-2/М88К має суттєво кращий профіль безпеки у сч ов Порівнянні з ПРОЛЕЙКІНОМ, при збереженні порівняної здатності стимулювати активацію Т-клітин.

Приклад 8: Ефективність І/-2 селективного агоніста М88К на мишачій СТ-26 моделі метастазу пухлини і) легені.

Пропис: Мишам (ВаїБ/с, самки, у віці 6-8 тижнів) були введені внутрішньовенно (ВВ) 1 Х 109 СТ-26 клітин (мишача карцинома товстої кишки) в 0,2 мл РВЗ5 у бічну вену хвоста у день 0. Лікування проводили Ге»!

ПРОЛЕЙКІНОМ або ІІ -2/М88Е2. у різних дозах (розчин: 5 95 декстрози у воді (О5МУ)), або ОБМУ, який вводили ВВ один раз на день протягом 8 днів (920 Х 8) початковий день 1 після імплантації. ІІ-2/М88К був приготовлений -- при кімнатній температурі розчиненням у ЮБМУ при застосуванні сіліконізованих флаконів та туберкулінового рч- шприца, розчин вводили тваринам через 2 годин після приготування. ПРОЛЕЙКІН готували шляхом додання 0,7 мл стерильної води для ін'єкції (ЗМУРІ) до кожного флакона (заключна концентрація, 1,86 мг/мл). Розчини о готували так, як описано для ІІ -2/М88К в ЮО5МУ (Таблиця 6). Тварин забивали на день 11. Легені були видалені і - зважені, промивали в РВ5 і тканини переносили в розчин Боуїна. Через 24 години тканини переносили в 1090 формалін. Кількість метастазних колонійї в легенях була підрахована під світлорозсіювальним мікроскопом. « 4 З с ни п ПО ПО г» 2010000 пРОЛЕИКНО зм -

Шо 61712 | лев | лому - а тю в 1717 льоакввя о бомук

Ге) Таблиця 7 показує кількість метастазів, підрахованих в окремій миші. Порівняну ефективність спостерігали як для І/-2/М882 так і для ПРОЛЕЙКІНУ. При високій дозі ІЇ-2/М88Е (група 8, бОмг/кг), усі тварини, крім однієї миші мали 12 метастазів або менше; З миші не виявили жодних метастазів. Це відрізнялося від найвищої перевіреної дози ПРОЛЕЙКІНУ, при якій усі миші, що вижили, мали 12 метастазів або більше. о ю

Група Метастази легенів наведено |ількост для кожної миши! 0 Серед знач |БЕМ Р знач (охевостов), во ВИ ПИ ПИ ПИ ОО ПО ПОН ПОН НО ПНЯ НО НАННЯ ПА НАННЯ НАННЯ НОЯ КОН КО 11012 зва іо оБ 165 200 152 146 158 20 194 16526 1541342 с 2 меле ти мів пло пу я зва за, 00000024 я46100 оо з лаз тв лаз 11711111 1111234 оооююз 5 М стьСЯ 4 |169 173|18902000 120 ) 117 |136 |122 |200 | 163 110 154 10.41 0.97029 во ря птереє рве (те пт ооревроврех | 1101 80 (933, ою во |в момеуня юю виоввоят вв ю 2.100087 (вл оо 7 5 оввово|л вв в в 48 2000060ввгі ооо ев т|о)з 24 ет о |в|о| | реалі бою

Виходячи з даних цього експерименту значення ІС 50 стосовно зниження кількості метастазів було розраховано для 1І/-2/М88К, воно складало 10,9 мг/кг (8,6-13,9 мг/кг при 95 90 достовірності), і для

ПРОЛЕЙКІНУ- 5,2 мг/кг (3,5-7,7 мг/кг у при 95 95 достовірності). 70 Виживання мишей показане в Таблиці 8. В групі ПРОЛЕЙКІНУ 10 мг/кг, одна (1) миша померла у день 7, і ще п'ять (5) померли у день 8. По одній (1) миші померло в день 8 у кожній з груп, при введенні З або 10 мг/кг

І/-2/М88К, і жодних випадків смертні не спостерігалось при введенні 1, ЗО або 60 мг/кг ІІ -2/М88К. Крім того, більшість мишей, якмим вводили З мг/кг ПРОЛЕЙКІНУ, і усі миші, яким вводили 10 мг/кг ПРОЛЕЙКІНУ, помирали, не спостерігали смертності серед мишей, яким вводили ІЇ -2/М88К. 5 отв нини нини сч з о

Ф

«- тп - 14 мишей/група м 2п е 11 мишей/група

Зп - 12 мишей/група і.

ЗНе спостергігали жодної смерті до 7 дня -

Тварини, яким вводили ПРОЛЕЙКІН в обох групах помирали. Не спостерігали смертності у будь-якій групі тварин, яким ІІ -2/М88К.

Таким чином, ці дослідження показують, що ІІ -2/М88Е. має таку ж саму ефективність, що й ПРОЛЕЙКІН при « зниженні пухлинного навантаження (як видно з підрахунку метастазів легені на моделі СТ26). Крім того, було показано, що ІІ -2/М88Е є істотно менш токсичним, ніж ПРОЛЕЙКІН. - с Приклад 9. Одержання стабільних, високо продуктивних клітиних ліній СНО, що експресують ІІ 288. ц Стабільні продуктивні клітинні лінії що секретують велику кількість І/2М888К мутеїнів, були одержані ,» трансфекцією СНО (апіт-), клітин вектором експресі, показаним на Фігурі 20 (АТСС Депозитний номер |).

Індивідуальні елементи ІІ 2М88К вектора експресії показані на карті плазміди (Фігура 20). Він показує СММе/р - цитомегаловірус раннього промотора; РА - ЗМ40 послідовність сигналу поліаденілування; а ОНЕК - касету - | експресії дигідрофолат редуктази. сю Вектор був сконструйований при використанні стандартних способів рекомбінантної ДНК. Див. в загальних рисах Затргоок та ін.. МоіІесціаг Сіопіпд. 27 вид., 1989, Со Зргіпд Нагрог Ргевв; Зпогі Ргоїосоїв іп Моіесшаг - Віоїоду 2"вид., 1992 допйп УмпеуйЗопе; Мейоз іп Епгітоіоду мої. 185, ред. Соедає! та ін., Асадетіс Ргевв, --о/у 20 Іпс Гопаоп, 1991. Вектор експресії містить дискретні касети експресії для ІІ 2М88К гена і гена ОНЕК, здатного до ампліфікації та селекції (дігідрофолат редуктаза). Приблизно 1 х 109 СНО (яєчника китайського хом'яка) с клітин були трансфіковані 1Омкг рВС11/25А при застосуванні ліпофектинових реактивів (І їе Тесппоіоду Іпс.,

Веїпезада, Магуїапа) згідно з інструкцями виробника. Потім клітини піддавали селекції в присутності 50 НМ метотрексату і вирощувались в ЮОМЕ/Р12 середовищі (Ійе Тесппоіоду Іпс.) при відсутності тимідіну і 22 гіпоксантину плюс 5 95 діалізованої фетальної бичачої сироватки. Високоефективні популяції клітин піддавали

Ф! скринінгу на продукцію І 2М88К за допомогою комерційного набору ЕГІЗА (К 5 О бувіетв). Високопродуктивні популяції відбирали в середовищі, яке містило концентрації метотрексату, що підвищувалися (від 100 до 400 нм о метотрексату) і піддавали скринінгу для одержання І/2М88К. Потім застосовували клонування лімітуючого розведення для одержання клонів з високою та стабільною продуктивністю. Колнування проводили при 60 відсутності метотрексату, використовуючи стандартний спосіб культур тканин.

Приклад 10. Одержання ІІ 2М88К у вільному від сироватки середовищі в перфузійному біореакторі.

Безперервне виробництво ІІ 2М88К здійснювали безперервною перфузійною ферментацією. 19-літровий ферментатор У/пеаіоп інокулювали стабільною лінією СНО клітин з прикладу

Приклад 9 у кількості 2 х 105 клітин/мл і перфузували при частоті зміни середовища 5 літрів/день. Середовищем бо для одержання було середовище на основі ОМЕ/Р12 (Ійе Тесппоіоду Іпс., КосКмШе, МО) з додаванням рекомбінантного людського інсуліну (10 мкг/мл) (НОМИС ІМтм, Еїї Шу, Іпс. Іпаіапороїїв, ІМ) і РезО,. ЕДТА (50

МКМ). Щільність клітин підтримували на рівні 4 х 1059 клітин/мл. Середній добовий вихід ферментації становив 200 мг/день. Виробництво ІІ 2М88К стабільно підтримувалася протягом 30 днів.

Приклад 11. Очистка ІІ -2/М88К, одержаного у клітинах СНО.

Наступну процедуру застосовували до описаного вище перфузійного елюату. Перфузійне середовище збирали і поміщали у З-сефарозну колонку. Колонка була врівноважена 20 мілімолярним фосфатним буфером з 5 мілімолярним МасСі при рН 7,0. Підживлення ("ТСЕ") встановлювали на рівні 4 мілісіменси провідності доданням води і доведенням до того ж самого значення рН фосфорною кислотою. 70 Після того, як ТСЕ завантажували колонка промивали в тому ж самому буфері для урівноважування.

Елюювання завершували зміною рН. Мутеїни елюювали 20 мМ метаноламіном, рН 10,5, щоб вимити мутеїни з колонки та одержання 5-елюату.

Аніонний обмін здійснювали, пропускаючи З-елюат через колонку ОАЕ, Базі Ріомутм (РНаптасіа), врівноважену 10 мМ бікарбонатного буферу при рН 10,5. Швидкість проходження підтримували на рівні 250 75 см/год. Після промиваня до базової лінії І-25А елюювали за допомогою 20 мМ фосфату рН 4,0.

Гідроксіапатитна (НАР) хроматографія здійснювали шляхом пропускання розведеного ОАЕ елюату (1:21 із

МУР) через колонку, наповнену керамічним гідроксіапатитом (тип Ії ВІО-Кай, Негсціез, СА) врівноважений 0,10

ММ фосфату з рН 7,0. швидкість проходження підтримували на рівні 250см/год. Після промиваня до базової лінії

І--25А елюювали за допомогою 100 мМ фосфату рН 4,0.

Гідроксіапатитний елюат піддавали ультрафільтрації до З0Омл об'єму, застосовуючи пристрій МіПіроге

Реїїсоп-2, оснащений трьома РЕЗ картриджами ЗК (Міїїроге Согрогайоп, Весатога, МА).

Ультрафільтрований НАР елюат потім очищали пропусканням через ЗІООНК (РНагтасіа) колонку для ивключення за розмірами при 35 см/год. Колонку врівноважували 10 мМ фосфату та 150 мм Масі рН 7,0. Ге

Гель-фільтраційний пул розводили М/РІ, щоб досягти електропровідності 4,0 ММпов/см і повторно наносили (5) на З-сефарозну колонку при умовах, описаних раніше. І 25А елюювали 10 мМ фосфатного буфера з 1 молярним Масі з рН 7,0.

Заключний катіонообмінний пул діалізували проти забуфероного фосфатом фізіологічного розчину (РВ5) а потім розводили стерильним РВ5 до "концентрації" б мг/мл. Заключний розведений пул потім стерильно Ф)3 відфільтровували, аліквотували і потім заморожували при -702С. Повне відновлення становило 65 9б. -

Інші втілення винаходу стануть очевидними для фахівців. Цей винахід показує як одержати мутеїни, що спеціально не описані в даній заявці, але які викликають активацію Т-клітин, про що свідчить проліферація -

РНА-бластів і знижена проліферація ПК-клітини, і, таким чином, ці мутеїни входять в рамки даного винаходу. с

Концепцію й експериментальний підхід, описані в даній заявці, слід застосовувати до інших цитокінів викоористовуючи гетерологічні мультимерні системи рецептора, зокрема, зв'язані цитокіни 1-7, 1/-9 ї 11-15, -

І--10, інтерферон А і інтерферон Г.

Claims (6)

1. Формула винаходу « -

   с 1. Мутант людського інтерлейкіну-2, пронумерований у відповідності з диким типом інтерлейкіну-2, що має а амінокислотну заміну в одному або двох положеннях 20, 88 та 126, який відрізняється тим, що амінокислотна ,» заміна у положенні 20 містить амінокислоту з групи, що включає аланін, гістидин, ізолейцин, метіонін, глутамін, серин, валін та тирозин; амінокислотна заміна у положенні 88 містить амінокислоту з групи, що включає аланін, аргінін, глутамінову -| кислоту, гістидин, лізин, лейцин, фенілаланін, гліцин, ізолейцин, метіонін, серин, треонін, триптофан, валін о та тирозин; амінокислотна заміна у положенні 126 містить амінокислоту з групи, яка включає аланін, аспарагін, -| гістидин, лейцин, пролін, фенілаланін, гліцин, ізолейцин, метіонін, аргінін, серин, треонін, триптофан, валін шу 50 татирозин; причому вказаний мутант людського інтерлейкіну-2 активує переважно Т-клітини у порівнянні з природними іЧе) кілерними клітинами.
2. 2. Фармацевтична композиція, що активує переважно Т-клітини у порівнянні з природними кілерними клітинами, яка містить мутант людського інтерлейкіну-2 за п. 1 та фармацевтично прийнятний носій.
3. З. Полінуклеотид, що містить послідовність ДНК, яка кодує мутант людського інтерлейкіну-2 за п.1.
4. 4. Вектор, що включає полінуклеотид за п.3.

   о
5. 5. Прокаріотична клітина, трансформована вектором за п.4. іме)
6. 6. Спосіб стимуляції імунної системи, що включає введення в організм ссавця терапевтично ефективної кількості мутанта людського інтерлейкіну-2 за п.1. 60 б5