PL201675B1 - Polipeptyd stanowiący muteinę ludzkiej interleukiny-2, kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten polipeptyd, polinukleotyd kodujący ten polipeptyd, komórka gospodarza prokariotycznego z tym polinukleotydem oraz wektor zawierający ten polinukleotyd - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy polipeptydu stanowi acego mutein e ludzkiej IL-2, numerowan a zgodnie z IL-2 typu dzikiego, która w stosunku do typu dzikiego zawiera zast apienie w przynajmniej jednej pozycji wybranej spo sród 20,88 albo 126, przy czym zast apienie w pozycji 20 jest wybrane z izolecyny lub histydyny, zast apienie w pozycji 88 jest wybrane z argininy lub izoleucyny lub glicyny, a zast apie- nie w pozycji 126 jest leucyn a i przy czym muteina ludzkiej IL-2 w sposób uprzywilejowany aktywuje limfocyty T w stosunku do naturalnych komórek zabójców (NK). Wynalazek dotyczy równie z polinu- kleotydu koduj acego mutein e wed lug wynalazku, wektora zawieraj acego polinukleotyd, transformo- wanej komórki gospodarza, kompozycji farmaceutycznej zawieraj acej mutein e. PL PL PL PL

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 344407	(11) 201675 (13) B1
	(22) Data zgłoszenia: 13.05.1999	(51) Int.Cl. C12N 15/26 (2006.01)
	(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:	C07K 14/55 (2006.01)
	13.05.1999, PCT/US99/10643	A61K 38/20 (2006.01)
Urząd Patentowy	(87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:	G01N 33/50 (2006.01)
Rzeczypospolitej Polskiej	25.11.1999, WO99/60128 PCT Gazette nr 47/99

Polipeptyd stanowiący muteinę ludzkiej interleukiny-2, kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten polipeptyd, polinukleotyd kodujący ten polipeptyd, komórka gospodarza prokariotycznego z tym polinukleotydem oraz wektor zawierający ten polinukleotyd (73) Uprawniony z patentu:

AiCuris GmbH & Co. KG,Wuppertal,DE (30) Pierwszeństwo:

15.05.1998,US,09/080,080 (72) Twórca(y) wynalazku:

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

05.11.2001 BUP 23/01 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

Armen B. Shanafelt,Moraga,US

Jeffrey M. Greve,Berkeley,US

Gary Jesmok,Richmond,US

Kenneth J. Lembach,Danville,US Gayle D. Wetzel,Martinez,US

30.04.2009 WUP 04/09 (74) Pełnomocnik:

Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o.

⁽⁵⁷⁾ Wynalazek dotyczy polipeptydu stanowiącego muteinę ludzkiej IL-2, numerowaną zgodnie z IL-2 typu dzikiego, która w stosunku do typu dzikiego zawiera zastą pienie w przynajmniej jednej pozycji wybranej spośród 20,88 albo 126, przy czym zastąpienie w pozycji 20 jest wybrane z izolecyny lub histydyny, zastąpienie w pozycji 88 jest wybrane z argininy lub izoleucyny lub glicyny, a zastąpienie w pozycji 126 jest leucyną i przy czym muteina ludzkiej IL-2 w sposób uprzywilejowany aktywuje limfocyty T w stosunku do naturalnych komórek zabójców (NK). Wynalazek dotyczy również polinukleotydu kodującego muteinę według wynalazku, wektora zawierającego polinukleotyd, transformowanej komórki gospodarza, kompozycji farmaceutycznej zawierającej muteinę.

PL 201 675 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd stanowiący muteinę ludzkiej interleukiny-2, kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten polipeptyd, polinukleotyd kodujący ten polipeptyd, komórka gospodarza prokariotycznego z tym polinukleotydem oraz wektor zawierający ten polinukleotyd.

Wynalazek ogólnie dotyczy dziedziny farmakologii i immunologii. Szczególnie, wynalazek dotyczy nowych kompozycji substancji do wybiórczego pobudzania limfocytów T (blasty PHA) i zmniejszonej aktywacji naturalnych komórek zabójców (NK). Nowe kompozycje obejmują warianty z rodziny cytokin, zaś w szczególności interleukiny 2 (IL-2).

Interleukina 2 (IL-2) jest silnym aktywatorem, pobudzającym różne komórki układu odpornościowego, w tym limfocyty T, limfocyty B i monocyty. IL-2 jest również silnym i kluczowym czynnikiem wzrostu limfocytów T. Dzięki tej aktywności, IL-2 badano pod względem zdolności do leczenia nowotworów. Ludzka IL-2 jest zatwierdzonym przez FDA lekiem do leczenia przerzutów raka nerki i przerzutów czerniaka. Zastosowanie IL-2 u ewentualnych pacjentów jest ograniczone z powodu ciężkiej toksyczności związanej z terapią IL-2; ocenia się że w najlepszym razie faktycznie tylko 20% pacjentów otrzymuje leczenie. Toksyczność związana z leczeniem IL-2 obejmuje wysoką gorączkę, nudności, wymioty, przeciek naczyniowy i ciężkie niedociśnienie. Jednakże, mimo tej toksyczności IL-2 jest skuteczna w zatwierdzonych wskazaniach (około 17% ocen obiektywnych odpowiedzi).

Mimo intensywnego badania struktury/funkcji mysiej IL-2 (Zurawski S.M. i Zurawski G. (1989) EMBO J., 8: 2583-90; Zurawski S.M. i in., (1990) EMBO J., 9: 3899-905; Zurawski, G. (1991) Trends Biotechnol., 9: 250-7; Zurawski, S.M. i Zurawski, G. (1992) EMBO J., 11: 3905-10; Zurawski i in., EMBO J., 12: 5113-5119 (1993)) przeprowadzono tylko analizę ludzkiej IL-2 ograniczoną zakres. Większość badań z muteinami ludzkiej IL-2 przeprowadzono na komórkach mysich; jednakże, przeprowadzono ograniczone badania z wykorzystaniem ludzkich blast PHA, które wyrażają receptor IL-2 o wysokim powinowactwie, IL-2RaeY. Badania z użyciem blast PHA potwierdziły znaczenie reszty Asp-20 w helisie D ludzkiej IL-2. Wykazano, że pozycja Asp-20 i Gln-126 ludzkiej IL-2 są podstawowymi resztami odpowiedzialnymi za oddziaływanie z, odpowiednio, podjednostkami β i γ receptora IL-2 (praca przeglądowa Theze i in., Immunol. Today 17, 481-486 (1996)). Jakkolwiek wykazano, że reszty w helisie C mysiej IL-2 biorą udział w interakcji z mysią IL-2Re (Żurawski i in., EMBO J., 12, 5113 -5119 (1993)), równoważne reszty w ludzkiej IL-2 nie mają, jak wykazano, tych samych właściwości (resztami tymi w ludzkiej IL-2 byłyby Asp-84 i Asn-88). Z powodu wysokiej swoistości gatunkowej ludzkiej i mysiej IL-2 (ludzka IL-2 wykazuje niemal 100-krotnie zmniejszoną aktywność w układzie mysim), trudno przewidzieć czy ten sam rodzaj oddziaływania występuje ww granicach gatunkowych. Nieznane są badania wykorzystujące komórki wyrażające tylko ludzki receptor o pośrednim powinowactwie, IL-2ReY.

Niektóre muteiny ludzkiej IL-2 badano pod względem ich aktywności wobec ludzkich blast PHA (Xu i in., Eur. Cytokine Netw., 6, 237-244 (1995)). Wykazano, że muteiny zawierające zastąpienie Asp-20 przez leucynę (D20L), jak również argininę, asparaginę i lizynę, mają szereg defektów w zdolności indukowania proliferacji blast PHA. Zatem, w stanie techniki wskazano, że zastąpienie Asp-20 daje muteiny o pogorszonej aktywności. Dodatkowo, Xu i in., stwierdzili, że do tej pory (1995) nie zidentyfikowano żadnych mutein IL-2 przydatnych do zastosowań klinicznych bądź badawczych.

Ludzka muteina IL-2, Q126D, wytworzona przez Buchli i Ciardelli, Arch. Biochem. Biophys. 307 (2): 411-415 (1993), wykazuje istotnie upośledzoną aktywność, zarówno siły jak i agonizmu; w testach z ludzkimi limfocytami T wykazywała aktywność około 1000-krotnie niższą niż IL-2 i zachowywała się jak częściowy agonista. W testach z mysimi limfocytami T, muteina była niemal nieaktywna. Obie badane linie komórkowe wyrażały postać receptora IL-2 o wysokim powinowactwie. Na obu rodzajach komórek Q126D wykazywała zdolność do antagonizowania aktywności za pośrednictwem IL-2, jakkolwiek tylko częściowo w teście z ludzkimi limfocytami T.

Zhi-yong i in., Acta Biochim. Biophys. Sinica., 25 (5):558-560 (wrzesień 1993) przeprowadzili doświadczenia na IL-2 z zastąpieniem w pozycjach 62, 69, 99 i 126, wykazując 20- i 30-krotne zmniejszenie aktywności w porównaniu z IL-2 typu dzikiego, odpowiednio dla 62-Leu-IL-2 i 126-Asp-IL-2, w teście z mysimi limfocytami T (CTLL-2). Jednakże, nie istnieją wskazania albo sugestie, że zastąpienie w pozycji 126 może nadawać wybiórczą aktywność limfocytom T w stosunku do nie komórek NK, albo wskazania, czy takie zmiany będą miały podobny wpływ na ludzkie limfocyty T.

Collins L. i in., PNAS USA 85:7709-7713 (1988) donoszą, że zastąpienie Asp w pozycji 20 przez Asn (D20N) albo Lys (D20K) powoduje utratę wiązania około 100- do 1000-krotną w porównaniu

PL 201 675 B1 z ludzką IL-2 zarówno dla receptora o dużym powinowactwie (IL-2RaeY, określanych jako p55/p70 przez Collins i in.), jak i o pośrednim powinowactwie (IL-2RaeY, określanych jako p70 przez Collins i in.). Wiązanie IL-2Ra wydaje się być nie zmienione w obu zmutowanych białkach. Praca ta wykazuje, że zniszczenie wiązania z receptorem IL-2 o pośrednim powinowactwie (IL-2RaeY) również prowadzi do zniszczenia wiązania z receptorem IL-2 o wysokim powinowactwie (IL-2RaeY), sugerując, że zróżnicowane wiązanie albo aktywacja między IL-2ReY lub IL-2RaeY nie jest osiągalne przez zastąpienie Asp w pozycji 20.

Berndt i in., Biochemistry 33 (21):6571-6577 (1994) zastosowali kombinatoryjną mutagenezę kasetową, w celu równoczesnego mutowania pozycji 17-21 w natywnej IL-2, które są podejrzewane o oddziaływanie z receptorem IL-2 o pośrednim powinowactwie. Spośród 2610 przebadanych klonów, tylko 42 były aktywne. Stwierdzono, że pozycje 20 i 21 mają podstawowe znaczenie dla aktywności biologicznej. Nie istnieją doniesienia albo sugestie o poszczególnych zastąpieniach, z wyjątkiem L21V.

W patencie USA nr 5,229,109 (Grimm i in.) rzekomo ujawniono analogi IL-2 o słabej toksyczności, do zastosowania w immunoterapii i leczeniu nowotworów. Analizowano właściwości dwóch analogów IL-2 z zastąpieniami w pozycjach Arg38 (na alaninę) i Phe42 (na lizynę) i porównywano z właściwościami natywnej IL-2. Stwierdzono, że analogi są zdolne do wiązania się z receptorem IL-2 o pośrednim powinowactwie, podczas gdy wiążą się tylko minimalnie z tak zwanym receptorem o wysokim powinowactwie. W tym czasie uważano, że receptor o pośrednim powinowactwie składa się jedynie z p75 (IL-2Re), zaś receptor o wysokim powinowactwie składa się tylko z kompleksu p55+p75 (IL-2Rae). Analogi również zachowywały swoją zdolność do pobudzania jednojądrzastych komórek krwi obwodowej do wytwarzania aktywowanych limfokiną komórek zabójców (LAK). Co warte odnotowania, wydzielanie IL-1e i TNFa było istotnie zmniejszone w odpowiedzi na analogi w porównaniu z natywną cząsteczką IL-2. Resztami aminokwasowymi opisanymi w tym patencie są reszty, które powinny oddziaływać swoiście z IL-2Ra (p55); eliminacja oddziaływań z IL-2Ra powinna spowodować zmniejszoną aktywność komórek niosących receptor IL-2 o wysokim powinowactwie i nie powinna zakłócić aktywności komórek niosących receptor IL-2 o pośrednim powinowactwie. Tak więc, wytworzenie komórek LAK (które, jak się uważa, pochodzą z komórek NK) powinno być zachowane. Muteiny opisane tu dotyczą reszt aminokwasowych w pozycji 20, 88 i 126 które to pozycje, jak się uważa oddziałują swoiście z IL-2Re (p75; pozycja 20 i 88) oraz IL-2Ry (nieznana w momencie składania zgłoszenia Grimm i in.; pozycja 126). W konsekwencji, oddziaływanie z IL-2Ra pozostaje niezmienione. Mechanistycznie, muteiny opisane przez Grimm i in., wykazują zmniejszone oddziaływanie z receptorem IL-2 o wysokim powinowactwie, ale nie powinny mieć wpływu na receptor IL-2 o pośrednim powinowactwie; opisane muteiny wykazują przeciwną charakterystykę, mając silnie wyrażony defekt zdolności oddziaływania z receptorem IL-2 o pośrednim powinowactwie IL-2Py i wykazują niewielki defekt albo jego brak w oddziaływaniu z receptorem IL-2 o wysokim powinowactwie, IL-2RaeY.

W patencie USA nr 5,206,344 (Goodson i in.) ujawniono muteiny IL-2, w których jeden albo wiele aminokwasów natywnej dojrzałej sekwencji IL-2 zostało zastąpionych przez reszty cysteinowe, które wytworzono i sprzęgnięto przez zastąpione reszty cysteinowe z polimerem wybranym z grupy obejmującej homopolimery glikolu polietylenowego albo polioksyetylowane poliole, przy czym homopolimery są niepodstawione albo podstawione na jednym z końców przez grupę alkilową. Te muteiny wytwarzane są przez ekspresję w gospodarzu genów zmutowanych kodujących muteiny, które zmieniono w porównaniu z genami macierzystych białek przez ukierunkowaną mutagenezę. Oprócz tego, inne gatunki IL-2 można sprzęgać przez resztę cysteinową w pozycji 125 dojrzałego białka IL-2, która nie jest konieczna do aktywności biologicznej IL-2. Nie ma ujawnienia dotyczącego mutacji, które nadają zmniejszoną toksyczność.

W patencie USA nr 4,959,314 (Lin i in.) ujawniono muteiny biologicznie czynnych białek, takich jako IFN-β i IL-2, w których reszty cysteinowe, które nie są niezbędne dla aktywności biologicznej, zostały usunięte albo zastąpione innymi aminokwasami w celu wyeliminowania miejsc sieciowania międzycząsteczkowego albo nieprawidłowego tworzenia międzycząsteczkowych mostków disiarczkowych. Muteiny te wytwarza się przez ekspresję w bakteriach zmutowanych genów, które kodują muteiny, które syntetyzowano z genów dla białek rodzicielskich, przez mutagenezę kierowaną oligonukleotydem. Nie istnieje ujawnienie mutacji, które nadają zmniejszoną toksyczność.

W patencie USA nr 5,116,943 (Halenbeck i in.) ujawniono, że biologicznie czynne wzorcowe białko terapeutyczne chronione jest przed utlenieniem sposobem obejmującym zastąpienie konserwatywnym aminokwasem każdej z reszt metionylowych podatnych na utlenianie chloraminą T albo

PL 201 675 B1 nadtlenkiem, przy czym dodatkowe, niepodatne reszty metionylowe, nie są zastąpione. Tak wytworzona muteina odporna na utlenianie jest korzystnie ludzką muteiną interleukiny-2 albo interferonu β, zaś konserwatywny aminokwas najkorzystniej jest alaniną. Nie istnieje ujawnienie mutacji nadających mniejszą toksyczność.

Patent USA nr 4,853,332 (Mark i in.) dotyczy mutein IFNy i IL-2, w których reszty cysteinowe, które nie są istotne dla aktywności biologicznej, zostały usunięte albo zastąpione innymi aminokwasami w celu wyeliminowania miejsc międzycząsteczkowego sieciowania albo nieprawidłowego tworzenia wewnątrzcząsteczkowych mostków disiarczkowych. W patencie ujawniono, że zastąpienie w IL-2 cysteiny 125 przez serynę daje muteinę o aktywności porównywalnej z natywną IL-2.

Patent USA nr 5,696,234 (Zurawski i in.) dotyczy mutein ssaczych cytokin oraz sposobów badania przesiewowego w kierunku agonistów i antagonistów ssaczych cytokin. W szczególności wykazano, że podwójna muteina ludzkiej IL-2, P82A/Q126D, wykazuje działanie antagonistyczne w mysich komórkach Baf3, kotransfekowanych ludzkimi podjednostkami α i β IL-2R. Wykazano niewielką aktywność agonistyczną. Wykazano również, że muteiny mysiej IL-2 wykazują częściową aktywność agonistyczną i antagonistyczną w komórkach HT2, w szczególności Q141D, Q141K, Q141V i Q141L. Nie opisano mutein wykazujących albo sugerujących wybiórcze działanie agonistyczne dla mutacji w pozycjach 20, 88 i 126.

Zurawski i in. opisują muteiny mysiej IL-2, które wykazują właściwości aktywności na komórkach wyrażających IL-2RaeY, ale braku aktywności na komórkach wyrażających IL-2ReY (Zurawski, G. Trends Biotechnol., 9: 250-257 (1991); Zurawski, S.M. i Zurawski, G., EMBO J. 11:3905-3910 (1992)). Muteiny mysiej IL-2, które wykazują te właściwości, mają zastąpienia Asp-34 do Ser albo Thr, i Gln-141 do Lys. Asp-34 i Gln-141 mysiej IL-2 wydają się być równoważne z, odpowiednio, Asp-20 i Gln-141 ludzkiej IL-2. Jakkolwiek odnośniki te dotyczą wybiórczego agonisty mutein IL-2, nie opisano w nich działania jako mniej toksycznego, ale raczej jako potencjalnych antagonistów endogennej IL-2.

W EP 0267 759 A2 (Zurawski i in.) ujawniono różne muteiny mysiej IL-2 w całej sekwencji, w tym niektóre obejmujące delecje i/lub zastąpienia w pierwszych 30 resztach aminokwasowych N-końca, które są kompetentne biologicznie, ale nie zawarto, przedyskutowano, ani nie zasugerowano podstawień aminokwasowych tu ujawnionych jako równoważnych z resztami mysiej IL-2. Istnieje zapotrzebowanie na ulepszoną cząsteczkę IL-2, wykazującą mniejszą toksyczność i lepiej tolerowaną.

Taniguchi i in., US 4,738,927 dotyczy rekombinowanego DNA, który obejmuje rekombinowany DNA kodujący polipeptyd mający aktywność biologiczną IL-2, przy czym aktywność ta promuje wzrost linii komórkowej cytotoksycznych limfocytów T, oraz wektora DNA zdolnego do powielania się w komórkach prokariotycznych albo eukariotycznych, sekwencji kodującej tego genu położonej poniżej sekwencji promotora, przy czym polipeptyd ma w sumie 132 do 134 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej polipeptydu. Opisany jest również gen, wektory rekombinowanego DNA, komórki gospodarza i sposoby rekombinacyjnego wytwarzania natywnej IL-2. Taniguchi i in., nie opisują wariantów ani mutein i nie podają, które pozycje w białku są odpowiedzialne za sygnalizację i aktywność wiązania.

Jest oczywiste, że muteiny IL-2, które nie wykazują toksyczności ograniczającej dawkowanie rekombinowanych mutein IL-2 ze stanu techniki, są niezbędne dla czerpania korzyści terapeutycznych z potencjału tej cytokiny.

Wynalazek dotyczy polipeptydu stanowiącego muteinę ludzkiej interleukiny 2 (IL-2), numerowaną zgodnie z IL-2 typu dzikiego, która w stosunku do typu dzikiego zawiera zastąpienie w przynajmniej jednej pozycji wybranej spośród 20, 88 i 126, przy czym zastąpienie w pozycji 20 jest wybrane z izoleucyny lub histydyny, zastąpienie w pozycji 88 jest wybrane z argininy lub izoleucyny lub glicyny, a zastąpienie w pozycji 126 jest leucyną, a muteina ludzkiej IL-2 w sposób uprzywilejowany aktywuje limfocyty T w stosunku do naturalnych komórek zabójców (NK).

Muteina IL-2 według wynalazku jest mniej toksyczna, co umożliwia lepsze terapeutyczne zastosowanie tej interleukiny.

Dalej, wynalazek dotyczy mutein IL-2 o pojedynczej mutacji w pozycji asparaginianu 20, asparaginy 88 i glutaminy 126. Konkretne muteiny są reprezentowane przez D20X, N88X i Q126X, w których X oznacza konkretny aminokwas, który zastąpiony w ludzkiej IL-2, nadaje wybiórczą aktywność komórkom wyrażającym receptor IL-2RaeY (np. limfocyty T) w porównaniu z komórkami wyrażającymi receptor IL-2ReY (np. komórki NK). Muteiny wykazujące ponad 1000-krotną wybiórczość obejmują D20H, D20I, N88G, N88I, N88R i Q126L. W szczególności, muteiny te wykazują również istotną aktywność IL-2 typu dzikiego wobec limfocytów T. Zidentyfikowano również inne mutacje zapewniające wybiórczość mniejszą niż 1000-krotna, ale większą niż 10-krotna.

PL 201 675 B1

Wynalazek ponadto dotyczy kompozycji farmaceutycznej, która zawiera polipeptyd według wynalazku w kombinacji z nośnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie.

W zakres wynalazku wchodzi również polinukleotyd obejmujący sekwencję DNA kodującą polipeptyd według wynalazku i jej warianty wynikające z degeneracji kodu genetycznego.

Wynalazek dotyczy również prokariotycznej komórki gospodarza, która jest transformowana polinukleotydem według wynalazku.

W zakres wynalazku wchodzi również wektor, który obejmuje polinukleotyd według wynalazku. Wektor kieruje ekspresją mutein ludzkich IL-2 wykazujących aktywność pobudzania ludzkich blastów PHA ale zmniejszoną aktywność wobec komórek NK. Wektor umożliwia transfekcję organizmu docelowego i następnie wyrażanie in vivo muteiny ludzkiej IL-2, kodowanej przez polinukleotyd.

Sposób selekcjonowania mutein IL-2, przeprowadza się przez badanie w testach wykorzystujących IL-2RaeY w porównaniu z IL-2ReY, przy czym aktywność muteiny IL-2 jest zwiększona w porównaniu z IL-2 typu dzikiego w jednym z testów w porównaniu z drugim. IL-2RaeY i IL-2ReY są indywidualnymi ektodomenami podjednostek receptora w odpowiedniej kombinacji i są stosowane do pomiaru bezpośrednio wiązania mutein IL-2 każdym z kompleksem receptorowym. Test IL-2aeY wykorzystuje odpowiedź z typu komórek niosących IL-2aeY, a test ^-2βγ wykorzystuje odpowiedź z typu komórek niosących !1-2βγ. Komórkami niosącymi IL-2aeY są blasty PHA, zaś komórkami niosącymi IL-2ReY są komórki NK. Test stanowi proliferacja obu rodzajów komórek niosących ^-2αβγ i !1-2βγ.

Metody leczenia wykorzystujące rozwiązania według wynalazku można zastosować u pacjentów ze stanem możliwym do leczenia za pomocą IL-2, którym jest HIV, nowotwór, choroba z autoagresji, choroba zakaźna, lub gdy IL-2 jest adiuwantem szczepionki w szczepionce przeciwnowotworowej i konwencjonalnej terapii szczepionkowej, do pobudzania układu odpornościowego u osób starszych albo z odpornością ograniczoną w inny sposób, jak również u pacjentów ze SCID i innych zastosowaniach wymagających pobudzenia układu odpornościowego.

Krótki opis rysunków

Figury 1 do 7 pokazują krzywe odpowiedź - dawka dla ludzkiej dzikiej IL-2 (IL-2) i D20H (Fig. 1), IL-2 i D20I (Fig. 2), IL-2 i N88G (Fig. 3), IL-2 i N88I (Fig. 4), IL-2 i N88R (Fig. 5), IL-2 i Q126E (Fig. 6) oraz IL-2 i Q126L (Fig. 7). A: poszczególne wyniki odpowiedzi na dawkę IL-2 (wypełnione kółka) i muteina (puste kółka), w teście proliferacji pierwotnych ludzkich limfocytów T (blasty PHA). B: poszczególne wyniki odpowiedzi na dawkę IL-2 (wypełnione trójkąty) i muteina (puste trójkąty) w teście proliferacji pierwotnych ludzkich komórek NK.

Figury 8A-8D. Toksyczność Proleukin™ u szympansów oceniano na dwóch zwierzętach (X-159, trójkąty i X-124, kwadraty) w porównaniu z kontrolą nośnikową (X-126, romby). Toksyczność oceniano przy pomocy parametrów nerkowych (azot mocznika we krwi (BUN), A; kreatynina, B) oraz funkcji wątroby (bilirubina całkowita, C; ALT, D).

Figura 9. Wykres procentowej zmiany masy ciała w ciągu 30 dni. Masa ciała zwierząt leczonych IL-2/N88R (trójkąty, Proleukin™ (kwadraty) lub nośnikiem (romby) mierzono we wskazanych dniach.

Figury 10A-10D. Limfocyty (A), całkowita liczba białych krwinek (B), neutrofile (C) i płytki (D) u zwierząt leczonych IL-2/N88R (trójkąty), Proleukin™ (kwadraty) lub nośnikiem (romby) oceniono we wskazanych dniach.

Figury 11A-11D. Azot mocznika we krwi (A, BUN), kreatynina (B), fosfor (C) i przerwę anionową (D) u zwierząt leczonych IL-2/N88R (trójkąty), Proleukin™ (kwadraty) i nośnikiem (romby) oceniano we wskazanych dniach.

Figury 12A-12D. Bilirubinę całkowitą (A), ALT (B), fibrynogen (C) i czas protrombinowy (D) u zwierząt leczonych IL-2/N88R (trójkąty), Proleukin™ (kwadraty) i nośnikiem (romby) oceniano we wskazanych dniach.

Figury 13A-13D. Poziomy we krwi sodu (A), jonu chlorkowego (B), wapnia (C) i potasu (D) u zwierząt leczonych IL-2/N88R (trójkąty), Proleukin™ (kwadraty) i nośnikiem (romby) oceniano we wskazanych dniach.

Figury 14A-14C. Poziom albuminy we krwi (A), hematokryt (B) i hemoglobinę (C) u zwierząt leczonych IL-2/N88R (trójkąty, Proleukin™ (kwadraty) i nośnikiem (romby) oceniano we wskazanych dniach.

Figury 15A -15C. Wpływ IL-2/N88R (kwadraty), Proleukin™ (romby) i nośnika (trójkąty) oznaczono w całej populacji limfocytów T (A, limfocyty CD3+), populacji limfocytów T CD4+ (B) i populacji limfocytów CD8+ (C).

PL 201 675 B1

Figury 16A-16C. Wpływ IL-2/N88R (kwadraty), Proleukin™ (romby) i nośnika (trójkąty) oznaczono w całkowitej populacji limfocytów T (A, limfocyty CD3+), populacji limfocytów T CD4+ (B) i populacji CD8+ (C).

Figura 17. Wpływ IL-2/N88R i Proleukin™ na aktywację limfocytów T w odniesieniu do średniej fluorescencji komórek CD25-dodatnich. Wpływ IL-2/N88R (kwadraty), Proleukin™ (romby) i nośnika (trójkąty) oznaczono w populacji limfocytów T CD3+CD4+. Otrzymano niewystarczającą liczbę komórek CD3+CD8+ do zbadania fluorescencji tej populacji.

Figury 18A-18D. Wpływ IL-2/N88R (kwadraty), Proleukin™ (romby) i nośnika (trójkąty) wskazano w populacji limfocytów T CD4+ (A, limfocyty CD3+/CD4+), populacji limfocytów T CD8+ (B, CD3+/CD8+), całkowitej populacji limfocytów T (C, CD3+) i populacji komórek NK (D, CD3-/CD16+).

Figura 19. Wykres przerzutów w płucach w funkcji do dawki u myszy traktowanej Proleukin™ (puste kółka) albo IL-2/N88R (wypełnione kółka). Przerzuty do płuc zliczono na zakończenie badania.

Figura 20. Mapa plazmidowa wektora IL2N88R, pBC1IL2SA.

Opis korzystnych wykonań

A. Podstawa

Działanie IL-2 na limfocyty T zachodzi przez wiązanie z białkami receptora IL-2. Różne białka powierzchniowe na limfocytach T wiążą IL-2. Pierwszym zidentyfikowanym jest pojedynczy polipeptyd, zwany IL-2Ra, którego ciężar wynosi 55 kDa (p55), który pojawia się na powierzchni limfocytów T po aktywacji i został pierwotnie nazwany antygenem Tac (do aktywacji T). IL-2Ra wiąże się z IL-2 z K_d około 10^-8 M, i jest znany jako receptor IL-2 o słabym powinowactwie. Wiązanie IL-2 z komórkami wyrażającymi tylko IL-2Ra nie prowadzi do żadnej wykrywalnej odpowiedzi biologicznej. Drugi receptor IL-2 stanowi kompleks wiążący zbudowany z IL-2Re i IL-2Ry; IL2Ry, polipeptyd 64 kDa, również znany jako wspólny łańcuch y (yc), ponieważ wchodzi w skład wielu innych receptorów cytokin. IL-2Re ma około 70-75 kDa (zwany rozmaicie p70 albo p75) jest członkiem rodziny receptorów cytokin typu 1, charakteryzujących się obecnością motywu dwóch cystein/ WSXWS. IL-2Re jest wyrażany wraz z yc. Powinowactwo wiązania IL-2 z IL-2Reyc jest wyższe niż IL-2Ra, z Kd równą około 10^-9 M; i jest on znany jako receptor IL-2 o pośrednim powinowactwie. IL-2 powoduje wzrost komórek wyrażających IL-2Reyc, przy połowie maksymalnego pobudzenia wzrostu w tym samym stężeniu IL-2, która wytwarza połowę maksymalnego wiązania (tj. 1x10^-9 M). IL-2Rey_c jest tym samym kompleksem receptora przekazującym sygnał, który może wiązać IL-15.

Trzecim znanym kompleksem receptora IL-2 jest kompleks IL-2Raey_c. Komórki wyrażające zarówno IL-2Ra jak i IL-2ReY mogą wiązać IL-2 znacznie silniej, z K_d około 10^-11 M, i znane są jako kompleks o „silnym powinowactwie”. Pobudzenie wzrostu takich komórek występuje przy podobnie niskim stężeniu IL-2. Zarówno wiązanie IL-2, jak i pobudzenie wzrostu może być zablokowane przez przeciwciała przeciwko IL-2Ra, IL-2Re albo y_c, zaś najwydajniej przez kombinację przeciwciał z wielokrotnymi podjednostkami receptora. Te obserwacje wskazują, że IL-2Ra tworzy kompleks z IL-2Rey_c, zwiększający powinowactwo sygnalizującego receptora dla IL-2, a tym samym umożliwiając przekazanie sygnału wzrostu przy znacznie niższych stężeniach IL-2. Uważa się, że IL-2 najpierw gwałtownie wiąże się z IL-2Ra, co ułatwia związanie się z IL-2Rey_c. Spoczynkowe limfocyty T wyrażają IL-2Rey_c, ale tylko w małych ilościach IL-2Ra; wzrost stężenia powierzchniowego IL-2Ra może być pobudzony przez IL-2. Po aktywacji limfocytów T za pośrednictwem receptora antygenu IL-2Ra jest gwałtowniej wyrażany, zmniejszając tym samym ilość IL-2 konieczną do pobudzenia wzrostu. Wiązanie IL-2 z kompleksem IL-2Raey_c powoduje przewodzenie sygnału przez szlak Jak/STAT.

Opracowaliśmy niniejszym muteiny ludzkiej IL-2, które preferencyjnie pobudzają limfocyty T (blasty PHA; komórki, które wyrażają receptor IL-2 o silnym powinowactwie, IL-2Raey) w porównaniu z komórkami naturalnych zabójców (NK) (komórkami, które wyrażają receptor IL-2 o pośrednim powinowactwie, IL-2Rey). Muteiny, w których zastąpiono Asp-20 histydyną (D20H) albo izoleucyną (D20I), Asn-88 argininą (N88R), glicyną (N88G) albo izoleucyną (N88I) albo Gln126 leucyną (Q126L) wykazują nieoczekiwanie pełną aktywność IL-2 wobec blastów PHA i niewielką (jeżeli jakąkolwiek) aktywność wobec komórek NK. Uprzednie badania mutein ludzkiej IL-2 polegały na analizach mysich układów komórkowych, zaś gdy zastosowano komórki ludzkie, nie korzystano z komórek wyrażających tylko IL-2Rey (takich jak komórki NK). Oprócz tego, te badania wykorzystujące ludzkie blasty PHA wykazały, że zastąpienie Asp-20 (przez Leu, Arg, Asp albo Lys; Xu i in., Eur. Cytokine. Netw., 6, 237-244 (1995)) albo Gln-126 (przez Asp: Buchli i Ciardelli, Arch. Biochem. Biophys., 307 (2):411-415 (1993)) daje muteiny ludzkiej IL-2 o poważnie upośledzonej aktywności. Uprzednie badania z użyciem mysiej IL-2 dały muteiny mysiej IL-2 o różnorodnej aktywności (Zurawski i in., EMBO J., 12, 5113-5119

PL 201 675 B1 (1993)) ale żadna z mutacji, które uzyskiwały te wyniki, nie sugerowała mutacji zidentyfikowanych w opisanej tu pracy Muteiny ludzkiej IL-2 zawierają ce identyczne mutacje w synonimicznych pozycjach jak w muteinach mysiej IL-2, nie wykazują podobnej aktywności, co sugeruje, że mysie przykłady nie przewidują działania u ludzi. Wynalazcom nie znane są badania nad muteinami ludzkiej IL-2, porównujące aktywności względne na ludzkich komórkach wyrażających receptor IL-2, IL-2RaeY (np. blasty PHA) w stosunku do komórek wyrażających receptor IL-2, IL-2ReY (np. komórek NK). Oczekuje się, że analizy in vivo potwierdzą, że opisane muteiny będą miały poprawiony wskaźnik terapeutyczny w porównaniu z ludzką IL-2 typu dzikiego, przez zmniejszenie toksyczności, zatem dostarczą w ten sposób terapeutycznie przydatnych związków do leczenia zaburzeń wymagających pobudzenia układu odpornościowego.

Interleukina 2 (IL-2) jest obecnie stosowana w klinice do leczenia przerzutowego raka nerki. Jednakże, jej ciężka toksyczność ogranicza jej zastosowanie tylko do podgrupy najzdrowszych pacjentów, zaś przypuszcza się, że toksyczność ograniczająca dawkę zaburza jej skuteczność ogólną. Ostra toksyczność IL-2 zachodzi, jak się uważa, przez aktywację komórek NK, podczas gdy jej skuteczność zachodzi za pośrednictwem bezpośredniej aktywności limfocytów T (Jacobson i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (Stany Zjednoczone) wrz. 17 1996, 93 (19), str. 10405-10; Smith, K.A. Blood 1993, 81 (6), str. 1414-23; Kaplan i in., Biotechnology, 10 (2), str. 157-62). Limfocyty T wyrażają inne receptory IL-2 niż komórki NK (limfocyty T: IL-2RaeY, receptor IL-2 o wysokim powinowactwie; komórki NK: IL-2ReY, receptor IL-2 o pośrednim powinowactwie). Opisane tu muteiny ludzkiej IL-2 wybiórczo aktywują receptor IL-2 limfocytów T, a nie receptor IL-2 komórek NK.

Terapię niską dawką IL-2 wykorzystano do ominięcia aktywacji komórek NK z pewnym powodzeniem (Jacobson i in., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10405-10). Strategia ta obejmowała pomysł, że przy niskich dawkach IL-2, aktywacji ulegnie jedynie receptor IL-2 o wysokim powinowactwie, z wykluczeniem receptora IL-2 o pośrednim powinowactwie.

Jednakże, wynalazcy podeszli do problemu toksyczności pod innym kątem. Przerwanie oddziaływania IL-2 z IL-2Re i/lub IL-2Ry przez odpowiednią modyfikację reszt swoiście oddziałujących na powierzchni wiążącej IL-2 hipotetycznie powinno zapobiec skutecznemu wiązaniu (a więc aktywacji) komórek wyrażających jedynie IL-2ReY. Jednakże, na komórkach wyrażających IL-2RaeY, wciąż może zachodzić początkowe związanie z IL-2Ra, a więc wciąż zachodzi wiązanie z komórką, a zatem terapia niską dawką sugerowana przez Jacobs i in., wciąż może wywołać toksyczne efekty uboczne. Dzięki wiązaniu z IL-2Ra, może zajść skuteczna rekrutacja IL-2Re i IL-2Ry na powierzchni komórkowej, mimo zaburzonego oddziaływania zmodyfikowanej IL-2 z IL-2Re i/lub IL-2Ry. Może więc powstać zdolny do sygnalizacji kompleks IL-2/IL-2RaeY. Uważamy, że wariant IL-2 zdolny do wybiórczej aktywacji receptorów IL-2 o wysokim powinowactwie na limfocytach T wybiórczo w porównaniu z receptorem IL-2 o pośrednim powinowactwie na komórkach NK, może mieć większy wskaźnik terapeutyczny w porównaniu z IL-2 typu dzikiego z powodu obniżonego profilu toksyczności. Wariant IL-2 o zwiększonym wskaźniku terapeutycznym miałby znacznie zwiększony zakres zastosowań w leczeniu nowotworów (jako terapia główna i/lub wspomagająca) i zaburzeń odporności (np. HIV i gruźlica). Inne potencjalne zastosowania IL-2 pochodzą od jej aktywności immunostymulującej i obejmują, oprócz bezpośredniego leczenia nowotworów, niedobory odporności, takie jak HIV albo SCID, choroby zakaźne, takie jak gruźlica; zastosowanie jako adiuwant w strategiach szczepionek przeciwnowotworowych; oraz we wskazaniach dotyczących pobudzenia układu odpornościowego, jak wzmocnienie standardowych protokołów szczepienia albo w leczeniu osób starszych.

Odpowiednie zastąpienie Asp-20, Asn-88 albo Gln-126, zmniejsza wiązanie z IL-2Re (Asp-20 i Asn-88) albo IL-2Ry (Gln-126). Wypadkowe działanie takich zastąpień daje luteiny IL-2, które zachowują aktywność wobec ludzkich limfocytów T i mają zmniejszoną aktywność wobec komórek NK.

Ponieważ niemożliwe było przewidzenie wyniku danego zastąpienia przed zbadaniem w testach z limfocytami T i komórkami NK, wykonano wszystkie możliwe zastąpienia aminokwasowe (z wyjątkiem Cys) w pozycjach Asp-20, Asn-88 i Gln-126, oraz ograniczony ale różnorodny zestaw mutacji w pozycji Asp-84, w celu zbadania czy rzeczywiście oddziałują one z IL-2Re. Dodatkowe mutacje powinny zostać sprawdzone w pozycji Asp84, jeżeli zostanie zaobserwowane działanie na widoczne oddziaływanie z IL-2Re. Dane dla czterdziestu sześciu oddzielnych zastąpień w tych pozycjach przedstawiono w Tablicy 1, poniżej.

Mutacje wprowadzono stosując ukierunkowaną mutagenezę na cDNA ludzkiej IL-2 typu dzikiego. Prawidłowe klony subklonowano do wektora ekspresyjnego odpowiedniego do ekspresji w układzie heterologicznym (np. E. coli, baculowirusie, drożdżach albo komórkach ssaków, takich jak np. komórki

PL 201 675 B1 jajnika chomika chińskiego CHO). Oczyszczone białka badano w testach proliferacji limfocytów T (blasty PHA) i komórek NK. Różne odpowiedzi wytworzone przez poszczególne muteiny w testach, tj. EC50, wskazują na mutacje wykazujące takie aktywności. Konkretnie, muteiny, które pobudzają stosunkowo silniejszą odpowiedź w teście z blastami PHA (limfocytami T) (w porównaniu z IL-2 typu dzikiego) w porównaniu z reakcją w teście z komórkami NK (w porównaniu z IL-2 typu dzikiego) sugerują, zastąpienia, które zapewniają swoistość komórkową opartą na zdolności konkretnych mutein do wiązania i aktywacji IL-2RaeY wyrażanej na tych komórkach, które jednak nie mają zdolności do wiązania do, oraz aktywacji komórek wyrażających tylko IL-2ReY. Muteiny IL-2 wykazujące tę właściwość, wykazują in vivo działanie immunostymulujące IL-2 ze zmniejszoną toksycznością związaną z terapią IL-2, taką jak wyciek naczyniowy i niedociśnienie.

B. Definicje

Depozyt linii komórkowej CHO zastosowanej do wytwarzania opisanego tu białka rekombinowanego zdeponowano w ATCC, Manassas, VA 20110-2209, USA w dniu 5 maja, 1999, Nr depozytu PTA-8. Ponieważ dany szczep jest utrzymywany w oparciu o postanowienia Traktatu Budapeszteńskiego, będzie on dostępny dla sygnatariuszy tego Traktatu.

W znaczeniu tu zastosowanym, „IL-2 typu dzikiego” oznacza IL-2, natywną albo rekombinowaną, mającą sekwencję aminokwasową 133 normalnie występujących aminokwasów natywnej ludzkiej IL-2 (bez peptydu sygnałowego składającego się z dodatkowych 20 aminokwasów na końcu N), której sekwencja aminokwasowa jest opisana w Fujita i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7437-7441 (1983), z albo bez dodatkowej metioniny na końcu N, która jest konieczna, gdy białko jest wyrażane jako frakcja wewnątrzkomórkowa w E. coli.

W znaczeniu tu zastosowanym, „muteina IL-2” oznacza polipeptyd, w którym dokonano konkretnych zastąpień w białku ludzkiej, dojrzałej IL-2. Tablica 1, niżej, ujawnia 46 poszczególnych mutein IL-2 wytworzonych przez zastąpienia, oraz odpowiadające dane ich względnej aktywności. Korzystne wykonania obejmują takie muteiny o przynajmniej 100-krotnej względnej aktywności. Szczególnie korzystne wykonania obejmują muteiny, które wykazują ponad 1000-krotną aktywność względną: reszta asparaginianu (Asp) (D) w pozycji 20 (D20), numerowane zgodnie z IL-2 typu dzikiego, jest zastąpiona przez izoleucynę (D20I) albo histydynę (D20H); reszta asparaginy (Asn) w pozycji 88 (N88) jest zastąpiona przez izoleucynę (N88I), glicynę (N88G) albo argininę (N88R); oraz reszta glutaminy (Gln) w pozycji 126 (Q126) jest zastąpiona przez leucynę (Q126L). Korzystne muteiny IL-2 mają sekwencję aminokwasową identyczną z IL-2 typu dzikiego w innych, niezastąpionych resztach. Jednakże, muteiny IL-2 według wynalazku mogą się również charakteryzować wstawkami aminokwasowymi, delecjami, zastąpieniami i modyfikacjami w jednym albo w wielu miejscach albo resztach natywnego łańcucha polipeptydowego IL-2. Korzystne są zastąpienia, które nie wprowadzają miejsc dla dodatkowego sieciowania międzycząsteczkowego albo tworzenia nieprawidłowych mostków disiarczkowych. Przykładowo, wiadomo, że IL-2 zawiera trzy reszty cys, w pozycjach 58, 105 i 125 dojrzałej sekwencji typu dzikiego.

W znaczeniu tu zastosowanym, określenie „numerowane zgodnie z IL-2 typu dzikiego” oznacza, że identyfikuje się dany aminokwas w odniesieniu do pozycji, w której występuje on normalnie w dojrzałej sekwencji IL-2 typu dzikiego. W przypadku dokonania insercji albo delecji w muteinie IL-2, oczywiste jest dla specjalisty w dziedzinie, że reszta Asp normalnie występująca w pozycji 20 ulegnie przesunięciu w muteinie. Jednakże, położenie przesuniętej reszty Asp można łatwo określić przez zbadanie i korelację flankujących aminokwasów z aminokwasami flankującymi Asp w IL-2 typu dzikiego.

Określenie „rodzaje komórek mających receptor IL-2RaeY” oznacza komórki, o których wiadomo, że mają ten rodzaj receptora, tj. limfocyty T, aktywowane limfocyty T, limfocyty B, aktywowane monocyty i aktywowane komórki NK. Określenie „rodzaje komórek mające receptor IL-2ReY” oznacza komórki, o których wiadomo, że mają ten rodzaj receptora, tj. limfocyty B, spoczynkowe monocyty i spoczynkowe komórki NK.

Muteiny IL-2 według wynalazku można wytworzyć dowolnym sposobem znanym w stanie techniki. Takie sposoby obejmują konstruowanie sekwencji DNA kodującej muteiny IL-2 według wynalazku i wyrażanie tych sekwencji w odpowiednio transformowanym gospodarzu. Sposobem tym wytwarzane są muteiny według wynalazku. Jednakże, muteiny według wynalazku można również wytworzyć, jakkolwiek mniej korzystnie, przez syntezę chemiczną albo połączenie syntezy chemicznej i technologii rekombinacji DNA. Sposoby wytwarzania partiami albo metody perfuzyjne są ogólnie znane specjalistom w dziedzinie, patrz, Freshey, R.I. (wyd.) Animal Cell Culture: A Practical Approach, wyd. 2, 1992, IRL Press, Oxford, Anglia; Mather J.P. „Laboratory Scaleup of Cell Cultures (0,5-50 liters), Methods

PL 201 675 B1

Cell Biol. 57:219-527 (1998); Hu, W.S. i Aunis, J.G. Large-scale Mammalian Cell Culture, Curr. Opin. Biotechnol., 8:148-153 (1997); Konstantinov, K.B., Tsai, Y., Moles, D. Matanguihan, R., Control for long-term perfusion Chinese hamster ovary cell culture by glucose auxostat, Biotechnol. Prog. 12:100 -109 (1996).

W jednym wykonaniu rekombinacyjnego sposobu wytwarzania muteiny według wynalazku, konstruuje się sekwencję DNA przez izolowanie albo syntetyzowanie sekwencji DNA kodującej IL-2 typu dzikiego, a następnie zmianę kodonu dla Asp-20 na kodon dla izoleucyny (I) przez ukierunkowaną mutagenezę. Technika ta jest dobrze znana, patrz, Mark i in., „Site - specific Mutagenesis Of The Human Fibroblast Interferon Gene” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, str. 5662-66 (1984) i patent USA nr 4,588,585.

Innym sposobem konstruowania sekwencji DNA kodującej muteinę IL-2 według wynalazku może być synteza chemiczna. Obejmuje to, np. bezpośrednią syntezę peptydu sposobem chemicznym syntezy sekwencji białka kodującej muteinę IL-2 wykazującą właściwości opisane w wynalazku. Sposób ten może obejmować zarówno naturalne, jak i nienaturalne aminokwasy w pozycjach zaburzających oddziaływanie IL-2 z IL-2Re albo IL-2Ry. Alternatywnie, gen, który koduje żądaną muteinę IL-2 można zsyntetyzować metodą chemiczną, stosując syntezator oligonukleotydów. Takie oligonukleotydy są zaprojektowane w oparciu o sekwencję aminokwasową żądanej muteiny IL-2 i korzystnie wybór kodonów, faworyzowanych w komórce gospodarza, w którym będzie wytwarzana rekombinowana muteina. W tym względzie powszechnie wiadomo, że kod genetyczny jest zdegenerowany - oznacza to, że aminokwas może być kodowany przez więcej niż jeden kodon. Przykładowo, Phe (F) kodowana jest przez dwa kodony TTC albo TTT, Tyr (Y) jest kodowana przez TAC albo TAT, zaś His (H) jest kodowana przez CAC albo CAT. Trp (W) jest kodowana przez pojedynczy kodon TGG. Tak więc, dla konkretnej sekwencji DNA kodującej konkretną muteinę IL-2, istnieje wiele zdegenerowanych sekwencji DNA, które kodują tę muteinę IL-2. Przykładowo, będzie oczywiste, że oprócz korzystnej sekwencji DNA dla muteiny D20I pokazanej na Id. Sekw. nr 1, istnieje wiele zdegenerowanych sekwencji DNA, które kodują pokazaną muteinę IL-2. Te zdegenerowane sekwencje DNA są też w zakresie wynalazku. Stąd, określenie „jej zdegenerowane warianty” w kontekście wynalazku oznacza wszystkie sekwencje DNA, które kodują i umożliwiają ekspresję konkretnej muteiny.

Sekwencja DNA kodująca muteinę IL-2 według wynalazku, wytworzona przez ukierunkowaną mutagenezę, syntezę chemiczną czy innymi sposobami, może ale nie musi obejmować sekwencji DNA, które kodują sekwencję sygnałową. Taka sekwencja sygnałowa, jeżeli występuje, powinna być rozpoznawaną przez komórkę wybraną do ekspresji muteiny IL-2. Może ona być prokariotyczna, eukariotyczna albo stanowić ich kombinację. Może również występować sekwencja sygnałowa natywnej IL-2. Włączenie sekwencji sygnałowej zależy od tego, czy pożądane jest wydzielenie muteiny IL-2 z rekombinowanej komórki, w której jest wytwarzana. Jeżeli wybrane komórki są prokariotyczne, na ogół korzystne jest, aby sekwencja DNA nie kodowała sekwencji sygnałowej. Jeżeli wybrane komórki są eukariotyczne, na ogół korzystne jest, aby sekwencja sygnałowa była kodowana, a szczególnie by była to sekwencja sygnałowa IL-2 typu dzikiego.

W celu syntetyzowania genu kodującego muteinę IL-2 według wynalazku można zastosować standardowe sposoby. Przykładowo, kompletną sekwencję aminokwasową można zastosować do konstruowania genu metodą odwrotnej translacji. Można syntetyzować oligomer DNA zawierający sekwencję nukleotydową kodującą muteinę IL-2. Przykładowo, można syntetyzować kilka małych oligonukleotydów kodujących części żądanego polipeptydu, a następnie podać je ligacji. Poszczególne oligonukleotydy typowo zawierają zasady na końcach 5' i 3'dla komplementarnego łączenia.

Po połączeniu (przez syntezę, ukierunkowaną mutagenezę albo innym sposobem) sekwencje DNA kodujące muteinę IL-2 objętą przez polipeptyd według wynalazku wprowadza się do wektora ekspresyjnego i łączy się funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję odpowiednią dla ekspresji muteiny IL-2 w żądanym transformowanym gospodarzu. Prawidłowe połączenie można potwierdzić przez sekwencjonowanie nukleotydów, mapowanie restrykcyjne i ekspresję biologicznie czynnego polipeptydu w odpowiednim gospodarzu. Jak dobrze wiadomo w dziedzinie, w celu otrzymania wysokich poziomów ekspresji transfekowanego genu w gospodarzu, gen musi być połączony funkcjonalnie z sekwencjami kontrolującymi transkrypcję i translację, które są funkcjonalne w wybranym gospodarzu.

Wybór sekwencji kontrolujących ekspresję i wektora ekspresyjnego zależeć będzie od wyboru gospodarza. Można zastosować różne kombinacje wektora ekspresyjnego/gospodarza. Przydatne wektory ekspresyjne dla gospodarzy eukariotycznych obejmują, przykładowo, wektory obejmujące

PL 201 675 B1 sekwencje kontrolujące ekspresję z SV40, bydlęcego papillomawirusa, adenowirusa i cytomegalowirusa. Przydatne wektory ekspresyjne dla gospodarzy bakteryjnych obejmują znane bakteryjne plazmidy, takie jak plazmidy E. coli, w tym, col E1, pCR1, pER32z, pMB9 i ich pochodne, plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy, takie jak RP4, fagi DNA, np. liczne pochodne faga lambda, np. NM989 i inne fagi DNA, takie jak M13 i jednoniciowe fagi nitkowate DNA. Przydatne wektory ekspresyjne dla komórek drożdży obejmują plazmid 2μ i jego pochodne. Przydatne wektory ekspresyjne dla komórek owadów obejmują pVL 941. Korzystny jest pFastBac™ 1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), patrz, Cate i in., „Isolation of the Bovine and Human Genes For Mullerian Inhibiting Substance And Expression Of the Human Gene In Animal Cells”, Cell, 45, str. 685-98 (1986).

Oprócz tego, w tych wektorach można zastosować szeroki wachlarz sekwencji kontrolujących ekspresję. Takie przydatne sekwencje kontrolujące ekspresję towarzyszą sekwencjom związanym z genami strukturalnymi powyż szych wektorów ekspresyjnych. Przykł ady przydatnych sekwencji obejmują, przykładowo, promotory wczesne i późne SV40 albo adenowirusa, układ lac, układ trp, układ TAC albo TRC, główne regiony operatorowe i promotorowe faga lambda, przykładowo PL, regiony kontrolujące białka płaszcza fd, promotor kinazy 3-fosfoglicerynianowa albo innych enzymów glikolitycznych, promotory fosfatazy kwaśnej, np. PhoA, promotory układu kopulacyjnego α drożdży, promotor polihedronowy Bakulowirusa, i inne sekwencje znane z kontrolowania ekspresji genów komórek prokariotycznych i eukariotycznych oraz ich wirusów, oraz ich różne kombinacje.

Do wytwarzania mutein IL-2 według wynalazku można zastosować dowolnego przydatnego gospodarza, w tym komórki bakterii, grzybów (w tym drożdży), roślin, owadów, ssaków albo inne odpowiednie zwierzęce komórki albo linie komórkowe, jak również zwierzęta i rośliny transgeniczne. Konkretniej, gospodarze ci mogą obejmować dobrze znanych gospodarzy eukariotycznych i prokariotycznych, takich jak np. szczepy E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, grzyby, drożdże, komórki owadów, takich jak Spodoptera frugiperda (Sf9), komórki ssaków, jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) i komórki mysie, jak NS/O, komórki afrykańskiej małpy zielonej, jak COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 i BNT 10 oraz komórki ludzkie, jak również roślinne komórki w hodowli komórkowej. Do ekspresji w komórkach zwierzęcych, korzystne są komórki CHO i COS 7 w hodowli, a zwłaszcza komórki CHO linii CHO (DHFR^-) albo linia HKB.

Należy oczywiście zaznaczyć, że nie wszystkie wektory i sekwencje kontrolujące ekspresję będą działać równie dobrze wyrażając opisane tu sekwencje DNA. Również, nie każdy gospodarz będzie działał równie dobrze w danym układzie ekspresyjnym. Jednakże, specjalista w dziedzinie może dokonać selekcji wektorów, sekwencji kontrolujących ekspresję i gospodarzy bez nadmiernego eksperymentowania. Przykładowo, przy selekcji wektora należy uwzględnić gospodarza, ponieważ wektor musi być zdolny do replikacji w gospodarzu. Należy również uwzględnić takie elementy jak liczba kopii wektora, zdolność do kontrolowania liczby kopii oraz ekspresja dowolnego innego białka kodowanego przez wektor, takiego jak znaczniki oporności na antybiotyki. Przykładowo, korzystne wektory do zastosowania w wynalazku obejmują takie, które umożliwiają amplifikację w wielu kopiach DNA kodującego IL-2. Takie wektory zdolne do amplifikacji są dobrze znane w stanie techniki. Obejmują one, przykładowo, wektory zdolne do amplifikacji przez DHFR (patrz, Kaufman, patent USA nr 4,470,461, Kaufman i Sharp, „Construction of a molecular dihydrafolate reductase cDNA gene: analysis of signals Utlilized for Efficient Expression” Mol. Cell. Biol., 2, str. 1304-19 (1982)) albo amplifikację przez syntetazę glutaminową (GS) (patrz, np. patent USA nr 5,122,464 i opublikowane zgłoszenie europejskie 338,841).

Przy wyborze sekwencji kontrolującej ekspresję należy również rozważyć szereg czynników. Obejmują one, przykładowo, względną siłę sekwencji, możliwość jej kontrolowania i jej zgodność z sekwencją DNA, kodując ą muteinę IL-2 wedł ug wynalazku, szczególnie w odniesieniu do potencjalnych struktur drugorzędowych. Gospodarzy należy wybrać uwzględniając ich zgodność z wybranym wektorem, toksyczność produktu kodowanego przez sekwencję DNA według wynalazku, ich charakterystyki wydzielania, zdolność do prawidłowego fałdowania białka, wymogi dotyczące fermentacji albo hodowli, oraz łatwość oczyszczania produktu kodowanego przez sekwencje DNA.

Kierując się tymi parametrami, specjalista w dziedzinie może wybrać różne kombinacje wektora/sekwencji kontrolującej ekspresję/gospodarza, które umożliwią wyrażenie żądanych sekwencji DNA podczas fermentacji albo hodowli zwierzęcej na wielką skalę, przykładowo stosując komórki CHO albo COS 7.

Muteiny IL-2 według wynalazku tak otrzymane mogą być glikozylowane albo nieglikozylowane, w zależności od organizmu gospodarza zastosowanego do wytwarzania muteiny. Jeżeli jako gospodarza do wytwarzania muteiny IL-2 zostanie wybrana bakteria, muteina będzie nie-glikozylowana. Z drugiej strony, komórki eukariotyczne b ę d ą glikozylował y muteiny IL-2, jakkolwiek niekoniecznie

PL 201 675 B1 w ten sam sposób jak natywną IL-2. Muteinę IL-2 wytworzoną przez stransformowanego gospodarza można oczyszczać dowolnym przydatnym sposobem. Znane są różne sposoby oczyszczania IL-2, patrz. np. Current Protocols in Protein Science, tom 2, Wyd. John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploehg, David W. Speicher, Paul T. Wingfield, część 6.5 (1997, John Willey and Sons, Inc.). Korzystne jest ponowne fałdowanie z ciałek wtrętowych wytworzonych w E. coli albo z pożywki kondycjonowanej z hodowli albo komórek ssaczych albo drożdżowych wytwarzających daną muteinę, przy użyciu wymiany kationowej, filtracji żelowej albo ciekłej chromatografii z odwróconymi fazami. Patrz, Przykład 1 (E. coli) i 10 (perfuzja komórek CHO).

Aktywność biologiczną mutein IL-2 według wynalazku można badać dowolną przydatną metodą znaną w stanie techniki. Testy takie obejmują proliferację blastów PHA i komórek NK. Muteiny o odpowiedniej aktywności, tj. w pełni aktywne wobec IL-2RaeY, o zmniejszonej aktywności wobec komórek niosących IL-2ReY, można potwierdzić stosując dwa testy. Aktywność względną muteiny mierzy się w odniesieniu do IL-2 typu dzikiego oraz jak dalej opisano w Przykładach, i jest to stosunek aktywności proliferacji blastów PHA do proliferacji komórek NK.

Muteinę IL-2 według wynalazku podaje się w dawce w przybliżeniu podobnej albo większej niż stosowana w terapii natywną typu dzikiego albo rekombinowaną IL-2. Korzystnie, podaje się skuteczną ilość muteiny IL-2. Określenie „ilość skuteczna” oznacza ilość zdolną do zapobiegania albo osłabienia ciężkości albo rozszerzenia się leczonego stanu albo wskazania. Specjalista rozumie, że skuteczna ilość muteiny IL-2 będzie zależeć, m.in., od choroby, dawki, schematu podawania muteiny IL-2, zależnie od tego czy jest podawana samodzielnie czy w połączeniu z innymi środkami terapeutycznymi, od okresu półtrwania kompozycji w surowicy oraz ogólnego stanu pacjenta.

Muteinę IL-2 korzystnie podaje się w kompozycji obejmującej nośnik dopuszczalny farmaceutycznie. Określenie „nośnik dopuszczalny farmaceutycznie” oznacza nośnik, który nie powoduje żadnych działań niepożądanych u pacjentów, którym jest podawany. Takie dopuszczalne farmaceutycznie nośniki są dobrze znane w stanie techniki. Korzystny jest roztwór 2% HSA/PBS, pH 7,0.

Muteiny IL-2 według wynalazku można formułować w kompozycje farmaceutyczne dobrze znanymi sposobami, patrz, np. w Remington's Pharmaceutical Science, Martin, E.W., opisano przydatne formulacje. Kompozycję farmaceutyczną muteiny IL-2 można formułować w różnych postaciach, w tym w postaci ciekłej, żelu, liofilizowanej albo innej przydatnej. Korzystna postać zależeć będzie od konkretnego leczonego wskazania i jest oczywista dla specjalisty w dziedzinie.

Kompozycję farmaceutyczną muteiny IL-2 można podawać doustnie, w aerozolu, dożylnie, domięśniowo, dootrzewnowo, śródskórnie albo podskórnie, albo w inny dopuszczalny sposób. Korzystny sposób podawania zależeć będzie od konkretnego wskazania i jest oczywisty dla specjalisty w dziedzinie. Kompozycja farmaceutyczna muteiny IL-2 może być podawana w połączeniu z innym środkami terapeutycznymi. Środki te mogą być włączone jako część tej samej kompozycji farmaceutycznej, albo mogą być podawane osobno, równocześnie albo zgodnie z dowolnym dopuszczalnym schematem leczenia. Oprócz tego, kompozycja farmaceutyczna muteiny IL-2 może być zastosowana jako leczenie wspomagające inne rodzaje leczenia.

Tak więc, wynalazek dostarcza kompozycji i rozwiązań do stosowania w leczeniu HIV, nowotworów, chorób z autoagresji, chorób zakaźnych, jako adiuwantu szczepionki w szczepionkach nowotworowych albo w konwencjonalnym leczeniu szczepionką, w celu pobudzania odporności u osób starszych albo w inny sposób poddanych immunosupresji, jak również u pacjentów ze SCID albo do innych zastosowań terapeutycznych wymagających ogólnego pobudzenia układu odpornościowego u dowolnego zwierzęcia, korzystnie ssaka, najkorzystniej człowieka. Jak uprzednio odnotowano, IL-2 ma wiele różnych działań. Niektóre z nich to pobudzanie blastów PHA, spoczynkowych limfocytów T, limfocytów B, monocytów i komórek NK, itd.; opisane tu muteiny wykazują aktywność wobec różnych komórek wyrażających tylko receptor IL-2 o wysokim powinowactwie, takich jak spoczynkowe limfocyty T, ale nie komórek wyrażających receptor IL-2 o pośrednim powinowactwie, takich jak komórki NK i monocyty.

Rozważa się, również zastosowanie sekwencji DNA kodujących muteiny IL-2 objęte polipeptydem według wynalazku w terapii genowej. Rozważana tu terapia genowa obejmuje leczenie takich chorób, w których oczekuje się, że IL-2 dostarcza skutecznej terapii dzięki aktywności wobec limfocytów T, np. HIV, nowotworu, choroby z autoagresji, choroby zakaźnej, jako adiuwant szczepionki nowotworowej albo konwencjonalnej, w celu pobudzenia odporności u osób starych albo z zaburzeniami odporności, jak również pacjentów ze SCID i chorobami, które reagują na IL-2 albo czynniki zakaźne wrażliwe na reakcję odpornościową za pośrednictwem IL-2.

PL 201 675 B1

Miejscowe dostarczanie mutein IL-2 przy użyciu terapii genowej może zaopatrywać miejsce docelowe w środek terapeutyczny. Rozważa się metodykę terapii genowej in vitro i in vivo. Znanych jest kilka sposobów przenoszenia potencjalnie terapeutycznych genów do określonych populacji komórkowych, patrz, Mulligan, „The basie Science of Gene Therapy” Science 260:926-31 (1993). Sposoby te obejmują:

1) bezpośredni transfer genów, patrz Wolff i in., „Direct Gene transfer Into Mouse Muscle In

Vivo” Science 247:1465-68 (1990);

2) transfer DNA za pośrednictwem liposomów, patrz Caplen i in. „Liposome - mediated CFTR Gene Transfer To The Nasal Epithelium Of Patients with Cystic Fibrosis”, Nature Med., 3:39-46; Cristal, „The Gene As A Drug” Nature Med., 1:15-17 (1995); Gao i Huang, „A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection Of Mammalian Cells” Biochem. Biophys. Res. Comm., 179:280-85 (1991);

3) transfer DNA za pośrednictwem retrowirusów, patrz, Kay i in., „In Vivo Gene Therapy Of Hemophillia B: Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs”, Science 262:117-19 (1993); Andersen, „Human Gene Therapy”, Science 256:808-13 (1992);

4) transfer DNA za pośrednictwem wirusa DNA. Takie wirusy DNA obejmują adenowirusy (korzystnie wektory oparte na Ad-2 albo Ad-5), wirusy herpes (korzystnie wektory oparte na wirusie opryszczki pospolitej), oraz parwowirusy (korzystnie wektory oparte na defektywnych albo nieautonomicznych parwowirusach, bardziej korzystnie wektory oparte na wirusach towarzyszących adenowirusom, najkorzystniej wektory oparte na AAV-2), patrz, Ali i in., „The Use Of DNA Viruses As Vectors For Gene Therapy”, Gene Therapy 1:367-84 (1994); patent USA nr 4,797,368 i patent USA 5,139,941.

Wybór konkretnego układu wektora do przeniesienia interesującego genu zależeć będzie od wielu czynników. Jednym z ważniejszych jest natura docelowej populacji komórkowej. Jakkolwiek wektory retrowirusowe były szeroko badane i stosowane w licznych zastosowaniach terapii genowej, wektory te nie nadają się ogólnie do zakażania komórek niedzielących się. Oprócz tego, retrowirusy mają zdolność onkogenezy.

Adenowirusy wykazują taką zaletę, że mają szeroki zakres gospodarzy, mogą zakażać komórki spoczynkowe albo końcowo zróżnicowane, takie jak neurony albo hepatocyty oraz wydaje się że są, zasadniczo nieonkogenne, patrz, Ali i in., wyżej str. 367. Nie wydaje się, żeby adenowirusy integrowały się z genomem gospodarza. Ponieważ istnieją pozachromosomalnie, ryzyko mutagenezy insercyjnej jest znacznie zmniejszone Ali i in. wyżej, str. 373.

Wirusy towarzyszące adenowirusom cechują się podobnymi zaletami, co wektory oparte na adenowirusie. Jednakże AAVs wykazuje swoiste miejsce integracji na ludzkim chromosomie 19 (Ali i in., wyżej. Str.377).

W korzystnym wykonaniu, DNA kodujący muteinę IL-2 według wynalazku stosuje się do terapii genowej chorób z niedoborem odporności, takich jak HIV; konkretnie chorób zakaźnych, takich jak gruźlica i nowotworów, takich jak rak nerki.

Według tego wykonania, terapia genowa przy użyciu DNA kodującego muteinę IL-2 według wynalazku jest dostarczana potrzebującemu tego pacjentowi równocześnie albo bezpośrednio po zdiagnozowaniu.

Podejście to korzysta z zalet wybiórczej aktywności mutein IL-2 według wynalazku zapobiegając niepożądanej toksyczności i szkodliwym działaniom ubocznym. Specjalista zauważy, że zgodnie z tym wykonaniem, można zastosować dowolny odpowiedni wektor do terapii genowej zawierający DNA muteiny IL-. Techniki konstruowania takich wektorów są znane, patrz, np. Andersen W.F. Human Gene Therapy, Nature 392, 25-30 (1998); Verma I.M. i Somia N., Gene Therapy-Promises, Problems and Prospects, Nature, 389, 239-242 (1998). Wprowadzenie wektora zawierającego DNA muteiny IL-2 do komórki docelowej można osiągnąć stosując znane techniki.

W celu lepszego zrozumienia wynalazku przedstawiono poniższe Przykłady. Przykłady mają na celu tylko zilustrowanie i nie są skonstruowane jako ograniczające zakres wynalazku. Wszystkie wspomniane publikacje są włączone w całości jako odnośniki.

C. Przykłady

P r z y k ł a d 1.

Wytwarzanie mutein w E. coli. Muteiny wytworzono przez ukierunkowaną mutagenezę z użyciem starterów zawierających kodony odpowiadające żądanej mutacji, zasadniczo jak opisano

PL 201 675 B1 w Kunkel T.A. Roberts J.D. i Zakour RA., „Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” (1987) Methods Enzymol., 154:367-382.

Pokrótce, cDNA ludzkiej IL-2 zawierający miejsca restrykcyjne BamHI i Xbal klonowano do wektora fagowego M13 mp19 (New England Biolabs, Beverly, MA) stosując te same miejsca. cDNA IL-2 typu dzikiego otrzymano stosując łańcuchową reakcję polimerazy („PCR”) z puli cDNA wytworzonej z mRNA izolowanego z limfocytów ludzkiej krwi obwodowej indukowanych 24 godziny z PMA (10 ng/ml). Zastosowane startery zaczynały się od końca 5' otwartej ramki odczytu IL-2:

5' -CCT CAA CTC CTG AAT TCA TGT ACA GGA TGC-3' (Id. Sek.Nr: 3); i dla końca 3' otwartej ramki odczytu IL-2,

5'-GGA AGC GGA TCC TTA TCA AGT CAG TGT TGA G-3' (Id. Sek.Nr: 4)

Miejsca enzymów restrykcyjnych EcoRI (koniec 5') i BamHI (koniec 3') włączono do każdego z oligonukleotydów i zaznaczono kursywą. Zastosowane warunki PCR obejmowały 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 58,7°C i 1 minutę w 72°C przez 25 cykli. Prawidłowa sekwencja cDNA IL-2 otrzymana w ten sposób została potwierdzona przez sekwencjonowanie przy użyciu zestawu Sequenase® (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) według instrukcji producenta. Pojedynczą nić DNA zawierającego uracyl (U-DNA) otrzymano przez transformowanie E. coli szczepu CJ236 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) wektorem M13 mp19 zawierającym cDNA IL-2. W ukierunkowanej mutagenezie wykorzystano ogólnie startery zawierające 15 nukleotydów homologicznych z matrycą U-DNA w kierunku 5' od kodonu(ów) będącego(ych) celem mutagenezy, nukleotydy które włączały żądaną zmianę i dodatkowe 10 nukleotydów homologicznych z matrycą U-DNA3' ostatniego zmienionego nukleotydu. Początkowo, ukierunkowaną mutagenezę zastosowano w celu wprowadzenia miejsca restrykcyjnego Ncol na początku dojrzałej sekwencji ludzkiej IL-2. Zastosowanie tego miejsca restrykcyjnego włączało N-końcową resztę metioniny, która kierowała ekspresją w przestrzeni cytoplazmatycznej E. coli, stosując przykładowo wektor pET3d. Zastosowano w tym celu starter:

5' GCA CTT GTC ACA AAC ACC ATG GCA CCT ACT TCA AGT-31 (Id. Sekw. Nr: 5)

Swoistymi starterami zastosowanymi do wprowadzenia mutacji w pozycji D20, N88 i Q126 były startery:

D20X: 5'-GGA GCA TTT ACT GCT GNN NTT ACA GAT G-3' (Id. Sekw. Nr: 6)

N88X: 5'-GGG ACT TAA TCA GCN NNA TCA ACG TAA TAG-3' (Id. Sekw. Nr: 7)

Q126X: 5'-GGA TTACCT TTT GTN NNA GCA TCA TCT C-3' (Id. Sekw. Nr:8), w których NNN zastępowano odpowiednim kodonem dla histydyny (CAC) albo izoleucyny (ATC) (w pozycji D20), argininy (CGT), glicyny (GGT) albo izoleucyny (ATC) (w pozycji N88), albo leucyny (CTG) (w pozycji Q126). Inne mutacje wykorzystano w podobnej strategii z odpowiednim kodonem dla danej mutacji. Startery fosforylowano stosując kinazę polinukleotydową T4 (New England Biolabs, Beverly, MA) według instrukcji producenta. Po przyłączeniu startera do matrycy U-DNA i wydłużeniu polimerazą DNA T7 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), komórki E. coli szczepu DH5a™ (Gibco BRL) transformowano 5 μl mieszaniny reakcyjnej i wysiewano na podłoże LB zawierające 0,7% agaru. Po inkubacji w 37°C, kolonie namnażano przez pobranie pojedynczej kolonii i przeniesienie do 2 ml pożywki LB i hodowanie przez noc w 37°C. Jednoniciowy DNA wyizolowano stosując zestaw do oczyszczania M13 (Qiagen, Inc, Chatsworth, CA) według instrukcji producenta, po czym klony zawierające żądaną mutację zidentyfikowano przez sekwencjonowanie jednoniciowego DNA stosując zestaw Sequenase® (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) według instrukcji producenta. cDNA muteiny IL-2 z replikacyjnej postaci DNA odpowiadającej koloniom zawierającym prawidłową zmutowaną sekwencję wyizolowano stosując Ncol i Xbal i wklonowano do wektora plazmidowego pET3 (Stratagene, San Diego, CA)(Strat). Szczep BL21 E. coli transformowano wektorem pET3 zawierającym muteinę i hodowano do ABS280 równej 0,60 do 1,0, po czym dodawano 0,4 mM IPTG w celu indukowania wytwarzania muteiny IL-2.

P r z y k ł a d 2.

Ekstrakcja i oczyszczanie mutein IL-2 z E. coli godziny po indukcji komórki zebrano przez odwirowanie przy 10000 x g. Rekombinowane muteiny IL-2 renaturowano i oczyszczano przez rozproszenie komórek w 10 objętościach (obj./mokrą masę) buforu sacharozy/Tris/EDTA (0,375 M sacharozy, 10 mM Tris/HCI pH 8,0, 1 mM EDTA). Zdyspergowane komórki sonikowano 3-krotnie przy 300 W z 30 sekundowymi odstępami na łaźni wodnej, stosując urządzenie do sonikacji Missonix model XL2020 wyposażony w 1-calową standardową sondę. Sonikowany materiał odwirowano przy 17000 x g przez 20 minut w 4°C. Osad, który powinien w tym momencie być biały, płukano przez zawieszanie i wirowanie w roztworze

PL 201 675 B1 sacharozy/Tris/EDTA, dwukrotnie w buforze Tris/EDTA (50 mM Tris/HCI pH 8,0,1 mM EDTA), i na koniec zawieszono w 10 objętościach buforu 0,1 M Tris/HCI, pH 8,0 (próbkę pobrano do analizy na żelu) i odwirowano przez 20 minut przy 17000 x g.

Osad rozpuszczono przez dodanie 3 objętości 8 M chlorku guanidyny w 0,1 M Tris/HCl (pH 8,0) i 0,1% (obj.) 2-merkaptoetanolu. Po inkubacji przez 2 godziny w temperaturze pokojowej próbkę odwirowano przez 20 minut przy 17000 x g. Powstały roztwór dializowano przez w przybliżeniu 20 godzin wobec 20 objętości 10 mN Tris/HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA w 4°C. Roztwór odwirowano przy 17000 x g przez 20 minut, dodano kwas trifluorooctowy do 0,1% i filtrowano przez filtr 0,22 μm. Roztwór przeniesiono natychmiast do silikonowanej butelki i załadowano na kolumnę C8 (Vydac 208TP54). Muteiny IL-2 oczyszczono stosując 20-minutowy gradient liniowy 45-85% acetonitrylu w 0,1% TFA. Stężenie eluowanego białka określono przez A280 i analizę aminokwasową. Białko porcjowano (100 ml) do silikonowanych probówek i przechowywano w -20°C. Muteina oczyszczona w ten sposób zwykle wykazywała pojedynczy prążek w SDS-PAGE (barwienie srebrem) i była oznaczana ilościowo analizą aminokwasową (dokładność >90%).

P r z y k ł a d 3.

Test proliferacji limfocytów T

Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) wyizolowano z około 100 ml normalnej ludzkiej krwi (Irwin Memorial Blood Bank, San Francisco, CA), rozcieńczonej 1:2 w zimnym roztworze soli buforowanym fosforanem Dulbecco (bez Ca²⁺ i Mg²⁺; DPBS). Nawarstwiono Ficoll-Paque (Pharmacia) i próbkę odwirowano w celu wyizolowania PBMC, a następnie intensywnie płukano w zimnym DPBS. Blasty PHA (aktywowane limfocyty T) wytworzono przez zawieszenie komórek w gęstości 1x10⁶ komórek/ml w RPMI 1640 z 10% płodową surowica bydlęcą (Hyclone), do której dodano 1% (wag./obj.) każdego z następujących: L-glutaminy, niezbędnych aminokwasów, pirogronianu sodu, antybiotyków środków przeciwgrzybiczych (pożywka RPMI). Fitohemaglutyninę (PHA-P; Sigma) dodano w stężeniu końcowym 10 μg/ml, zaś komórki inkubowano w 37°C, 5% CO₂ przez 3 dni. Komórki zebrano i płukano dwa razy w DPBS, zawieszono w pożywce RPMI i wysiano do płaskodennej płytki 96-studzienkowej w gęstości 1x10⁵ komórek/studzienkę w 200 μl różnych stężeń IL-2, albo muteiny z pożywką RPMI. Płytki inkubowano przez 48 godzin w 37°C, pulsowano 1 μ Ci ³H-tymidyny (DuPont NEN®, Boston, MA) na studzienkę przez 6 godzin, zbierano i mierzono radioaktywność po zebraniu komórek na filtr z włókna szklanego.

P r z y k ł a d 4.

Test proliferacji komórek NK

Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) wyizolowano z w około 100 ml normalnej ludzkiej krwi (Irwin Memorial Blood Bank, San Francisco, CA), rozcieńczonej 1:2 w zimnym roztworze soli bufonowanym fosforanem Dulbecco (bez Ca²⁺ i Mg²⁺; DPBS). Nawarstwiono Ficoll-Paque (Pharmacia) i próbkę odwirowano w celu wyizolowania PBMC, a następnie płukano w zimnym DPBS. Komórki NK oddzielono od innych komórek. Do tego celu korzystny jest zestaw do izolacji komórek NK Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Niemcy, nr kat. 465-01). Zestaw składa się z dwóch reagentów, kolumny do rozdziału i sinego magnesu będącego podporą dla kolumny. Pierwszy reagent stanowi mieszaninę przeciwciał monoklonalnych CD3, CD4, CD19, CD33 mysiego izotypu IgG1 sprzęgniętych z haptenem. Ma on na celu usunięcie z PBMC limfocytów T, limfocytów B i komórek szpiku. Przewiduje się, że można zastosować dowolny zestaw przeciwciał rozpoznających ten rodzaj komórek. Drugim reagentem są koloidalne superparamagnetyczne mikroperełki MAC sprzęgnięte z przeciwciałem przeciwko haptenowi. Komórki są zawieszone w PBS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej i 2 mM EDTA (PBS/EDTA). Objętość zawiesiny zależy od liczby komórek i jest dostarczona w tabeli Miltenyi Biotec. Zwykle, przy liczbie komórek 2-5x10⁸ PBMC, komórki zawiesza się w 800 ąl buforu, a następnie stosuje się 200 ąl każdego z reagentów. Po inkubacji z reagentami, komórki dodaje się do kolumny (zawieszone w 2 ml buforu). Komórki inne niż NK przylegają do magnesu (usuwanie) zaś komórki NK są izolowane i zbierane z frakcją wypływającą. Komórki płucze się i zawiesza w pożywce RPMI (zawiera RPMI 1640, do której dodaje się 1% każdego z następujących: L-glutaminy, nieniezbędnych aminokwasów, pirogronianu sodu, antybiotyki-środki przeciwgrzybicze (wszystkie z Gibco/BRL Gaithesburg, MD), 10% płodową surowicę bydlęcą (Hyclone) i wysiewa do płaskodennych 96-studzienkowych płytek przy gęstości 1x10⁵ komórek/studzienkę w 200 ąl.

Komórki zebrano i przemyto dwa razy w DPBS, zawieszono ponownie w pożywce RPMI i wysiano do płaskodennych 96-studzienkowych płytek przy gęstości 1x10⁵ komórek/studzienkę w 200 ąl z różnymi stężeniami IL-2 lub muteiny w pożywce RPMI. Płytki inkubowano przez 48 godzin w 37°C,

PL 201 675 B1 pulsowano 1 μ Ci ³H-tymidyny (DuPont NEN®, Boston, MA) na studzienkę przez 6 godzin, zbierano i mierzono radioaktywność po zebraniu komórek na filtr z włókna szklanego.

P r z y k ł a d 5.

Muteiny, które wybiórczo aktywują limfocyty T w porównaniu z komórkami NK

Muteiny wytworzono z użyciem ukierunkowanej mutagenezy (Kunkel i in., (1987) Methods Enzymol., 154:367-382) w pozycjach Asp-20, Asp-84, Asn-88 i Gln-126 i wyrażano w E. coli z użyciem układu ekspresyjnego pET-3a według instrukcji producenta (Stratagene). Muteiny oczyszczono przez odzyskanie ciał inkluzyjnych w chlorowodorku guanidyny, sfałdowano ponownie i poddano chromatografii stosując HPLC, jak opisano poprzednio. Uzyskane białko wykazało >95% czystości SDS-PAGE z barwieniem srebrem i analizowano je na stężenie i czystość przez analizę aminokwasów (AAA z dokładnością zwykle >90%). Muteiny o odpowiedniej aktywności potwierdzono przy użyciu analizy spektrometrią mas. Tak oczyszczone muteiny badano w testach z limfocytami T i komórkami NK, jak opisano poprzednio. Względne aktywności dla mutein IL-2 w testach z limfocytami T i komórkami NK są wskazane na Tablicy 1.

T a b l i c a 1

Muteiny badane na wybiórczą aktywność względem limfocytów T

	Aktywność względna	Aktywność względna
Muteina	Limfocyty T vs komórki NK	Limfocyty T	Komórki NK
Wt IL-2	1	100000	100000
Muteiny D20
D20A	5	0,00024	0,00005
D20H	3900	0,37081	0,00009
D20I	7600	4,59635	0,00061
D20K	330	0,06301	0,00019
D20L	100	0,00063	0,00001
D20M	490	0,05372	0,00011
D20N	160	0,03000	0,00019
D20Q	100	0,03180	0,00032
D20R	33	0,00018	0,00001
D20S	170	0,06640	0,00038
D20T	1	1,00000	1,00000
D20V	10	0,00093	0,00009
D20Y	1000	0,06587	0,00007
Muteiny N88
N88A	50	0,50000	0,01
N88E	10	0,01172	0,00115
N88F	33	0,02222	0,001
N88G	980	8,33333	0,00853
N88H	3	0,0010	0,001
N88I	9600	0,98074	0,00010
N88K	3	0,00010	0,00032
N88L	4	0,00400	0,001
N88M	250	0,25000	0,001
N88R	6200	0,89730	0,00015
N88S	80	0,00200	0,16000

PL 201 675 B1 cd. tablicy 1

N88T	395	0,50000	0,001266
N88V	67	0,06670	0,001
N88W	1	0,00100	0,001
N88Y	8	0,00800	0,001
Mutacje Q126
Q126A	0,30	0,01743	0,05809
Q126D	240	0,14630	0,00061
Q126E	400	10,0000	0,02500
Q126F	32	0,87358	0,02749
Q126G	100	0,55556	0,00556
Q126H	0,03	0,02216	0,73875
Q126I	33	0,00100	0,00003
Q126K	1,0	1,00000	1,00000
Q126L	680	3,061186	0,00447
Q126M	9,1	19,94092	2,19298
Q126N	10	6,57895	0,64993
Q126P	3,0	0,00032	0,00011
Q126R	11	4,02695	0,36392
Q126S	33	0,03417	0,00103
Q126T	3,3	0,00010	0,00003
Q126V	330	1,000556	0,00302
Q126W	1,0	0,20000	0,20000
Q126Y	10	0,88500	0,08850

Aktywności mutein opisano przez względne stężenie muteiny, konieczne do uzyskania 50% maksymalnej odpowiedzi (EC50) w porównaniu z EC50 IL-2 typu dzikiego w tym samym teście; w przypadku wielokrotnych testów z tą samą muteiną, podano średnią geometryczną podanych wartości. Wartości EC50 dla IL-2 typu dzikiego były w zakresie od około 10 pM do 150 pM w teście z limfocytami T i około 50 pM do około 200 pM w teście z komórkami NK. Stosunek aktywności wobec limfocytów T do aktywności wobec komórek NK dla muteiny wyrażono jako względną aktywność muteiny wobec limfocytów T podzieloną przez względną aktywność muteiny wobec komórek NK. Stosunek ten oznaczono dla każdej z mutein stosując jedynie aktywność oznaczoną w danym teście limfocytów T i komórek NK, stosując komórki od pojedynczego dawcy.

Aktywności mutein można zaklasyfikować do 6 szerokich kategorii: 1) 1000-krotna wybiórczość względem limfocytów T; 2) 100- ale <1000-krotna wybiórczość względem limfocytów T; 3) 10- ale <100-krotna wybiórczość względem limfocytów T; 4) polepszona aktywność w stosunku do IL-2 na limfocytach T; 5) wybiórczość względem komórek NK; 6) 10-krotna wybiórczość względem limfocytów T albo komórek NK.

Klasa 1: D20H I i Y; N88G, I i R;

Klasa 2: D20K, L, M, N, Q i S; N88M i T; Q126D, E, G, L i V;

Klasa 3: D20R, N88A, E, F, S i V; Q126F, I, N, R i S;

Klasa 4: D20I; N88G; Q126E, L, M, N i R;

Klasa 5: Q126A, H;

Klasa 6: D20A, T i V; N88H K, L, W i Y; Q126K, P, T, W i Y.

W obrębie klas 1-3, korzystnymi muteinami są takie, które wykazują aktywność bliską albo lepszą niż IL-2 typu dzikiego na limfocytach T. W klasie 1 są to D20H i I oraz N88G, I i R; w klasie 2

PL 201 675 B1

N88M i T; Q126D, E, G, L i V; w klasie 3 N88A, Q126F i G. Muteiny klasy 4 będą miały, jak się przewiduje, aktywność większą niż IL-2 typu dzikiego in vivo.

Jak widać z Tablicy 1, żadna z pojedynczych mutacji nie dała muteiny IL-2 nieaktywnej w obu testach. Jednakże, można wnioskować, że kombinacja mutacji, które dają silnie zaburzoną aktywność z dwóch różnych pozycji powinna potencjalnie dać antagonistę aktywności IL-2 na limfocytach T albo innym rodzaju komórek niosących receptor IL-2 o wysokim powinowactwie. Taki antagonista jest przewidywany z tych danych, ponieważ zaprojektowano mutacje w celu zmiany tylko interakcji z IL-2Re i IL-2Ry. Jednym z przykładów jest podwójna muteina D20R/Q126T. Przewiduje się, że kombinacja słabych mutacji w jednej cząsteczce powinna być kombinatoryjna z natury, tj. D20R daje 0,00018 aktywności wobec limfocytów T. Q126T daje 0,0001 aktywności wobec limfocytów T, podwójna muteina D20R/Q126T powinna wykazywać aktywność 0,000000018 aktywności IL-2 typu dzikiego wobec limfocytów T. Inne kombinacje można otrzymać z powyższych danych.

P r z y k ł a d 6.

Aktywność biologiczna IL-2 typu dzikiego i mutein IL-2

Figury 1-7 pokazują krzywe odpowiedzi na dawkę ludzkiej IL-2 typu dzikiego (IL-2) i D20H (Fig. 1), IL-2 i D20I (Fig. 2), IL-2 i N88G (Fig. 3), IL-2 i N881 (Fig. 4), IL-2 i N88R (Fig. 5), IL-2 i Q126E, (Fig. 6) i IL-2 i Q126L (Fig. 7). A: poszczególne odpowiedzi na dawkę IL-2 (wypełnione kółka) i muteiny (puste kółka) w teście proliferacji pierwotnych ludzkich limfocytów T (blasty PHA). B: Poszczególne odpowiedzi na dawkę IL-2 (wypełnione trójkąty) i muteiny (puste trójkąty) w teście proliferacji pierwotnych ludzkich komórek NK.

W szczególności, w odniesieniu do Fig. 1, dla przedstawionego doświadczenia, dawka IL-2 typu dzikiego dająca 50% maksymalnej proliferacji (EC50) wynosi około 1,5x10^-10 M dla limfocytów T (A) i około 1x10^-10 M dla komórek NK (B). EC50 dla D20H wynosiło około 2x10^-10 M w teście z limfocytami T, i >1x10^-5 M w teście z NK. Aktywności D20H wobec limfocytów T w stosunku do aktywności wobec komórek NK jest >50000-krotna jak określono w tym teście. Podobne wyniki uzyskano z krwi od dodatkowych dawców (wyniki niepokazane).

W szczególności, w odniesieniu do Fig. 2, dla przedstawionego doświadczenia, dawka IL-2 typu dzikiego dająca 50% maksymalnej proliferacji (EC50) wynosi około 1,5x10^-10 M dla limfocytów T (A) i około 3x10^-10 M dla komórek NK (B). EC50 dla D20I wynosiło około 1,5x10^-10 M w teście z limfocytami T, i około 5x10^-6 M w teście z NK. Aktywność D20I wobec limfocytów T w porównaniu z komórkami NK w przypadku poprawiła się około 16000 razy, jak określono w tym teście. Podobne wyniki otrzymano z krwią od dodatkowych dawców (dane niepokazane).

W szczególności, w odniesieniu do Fig. 3, dla przedstawionego doświadczenia, dawka IL-2 typu dzikiego dająca 50% maksymalnej proliferacji (EC50) wynosi około 4x10^-11 M dla limfocytów T (A) i około 2x10^-10 M dla komórek NK (B). EC50 dla N88G wynosiło około 5x10^-12 M w teście z limfocytami T, ale oszacowano tylko na około 3x10^-8 M w teście z NK. Polepszenie aktywności N88G wobec limfocytów T w porównaniu z komórkami NK było około 1200 krotne, jak określono w tym teście. Podobne wyniki otrzymano z krwią od dodatkowych dawców (dane niepokazane).

W szczególności, w odniesieniu do Fig. 4, dla przedstawionego doświadczenia, dawka IL-2 typu dzikiego dająca 50% maksymalnej proliferacji (EC50) wynosi około 1,5x10^-10 M dla limfocytów T (A) i około 1x10^-10 M dla komórek NK (B). EC50 dla N88I wynosiło około 4x10^-10 M w teście z limfocytami T i tylko około 5x10^-6 M w teście z NK. Polepszenie aktywności N88I wobec limfocytów T w porównaniu z komórkami NK było około 18000-krotne, jak określono w tym teście. Podobne wyniki otrzymano z krwią dodatkowych dawców (dane niepokazane).

W szczególności, w odniesieniu do Fig. 5, dla przedstawionego doświadczenia, dawka IL-2 typu dzikiego dająca 50% maksymalnej proliferacji (EC50) wynosi około 1,5x10^-11 M dla limfocytów T (A) i około 1x10^-11 M dla komórek NK (B). EC50 dla N88R wynosiło około 9x10^-11 M w teście z limfocytami T, i około 3x10^-7 M w teście z NK. Polepszenie aktywności N88R wobec limfocytów T w porównaniu z komórkami NK było około 5000-krotne, jak określono w tym teście z NK. Podobne wyniki otrzymano z krwią dodatkowych dawców (dane niepokazane).

W szczególności, w odniesieniu do Fig. 6, dla przedstawionego doświadczenia, dawka IL-2 typu dzikiego dająca 50% maksymalnej proliferacji (EC50) wynosi około 8x10^-12 M dla limfocytów T (A) i około 5x10^-11 M dla komórek NK (B). EC50 dla Q126E wynosiło około 8x10^-13 M w teście z limfocytami T, ale tylko około 2x10^-9 M w tym teście z NK. Polepszenie aktywności Q126E wobec limfocytów T w porównaniu z komórkami NK było około 400-krotne, jak określono w tym teście. Podobne wyniki otrzymano z krwią dodatkowych dawców (dane niepokazane).

PL 201 675 B1

W szczególności, w odniesieniu do Fig. 7, dla przedstawionego doświadczenia, dawka IL-2 typu dzikiego dająca 50% maksymalnej proliferacji (EC50) wynosi około 5x10^-11 M dla limfocytów T (A) i około 8x10^-11 M dla komórek NK (B). EC50 dla Q126L wynosiło około 2x10^-11 M w teście z limfocytami T ale tylko około 2x10^-8 M w teście z NK. Polepszenie aktywności Q126L wobec limfocytów T w porównaniu z komórkami NK było około 625-krotny, jak określono w tym teście. Podobne wyniki otrzymano z krwią innych dawców (dane niepokazane).

P r z y k ł a d 7.

Badanie toksyczności na szympansach

Z tablicy 1 wybrano z białek muteiny IL-2 IL-2/N88R z powodu wykazywanej w testach z pierwotnymi ludzkimi limfocytami T i komórkami NK wybiórczej aktywności agonistycznej wobec limfocytów T. W stosunku do IL-2 typu dzikiego, jest ona około 6000-razy bardziej aktywna wobec limfocytów T niż komórek NK i wykazuje aktywność zasadniczo równoważną aktywności IL-2 typu dzikiego wobec limfocytów T. IL-2/N88R wytworzono w komórkach CHO, oczyszczono i zbadano w modelu szympansim aktywności i toksyczności IL-2. W tym modelu in vivo, wykazuje ona aktywność wobec limfocytów T porównywalną z aktywnością dostępnej w handlu rekombinowanej odmiany IL-2 (PROLEUKIN™, Chiron Corporation Emeryville, CA) wykazując tylko niewielkie objawy uboczne w tym porównaniu (w odniesieniu do parametrów obiektywnych i klinicznych).

A. Układ doświadczalny

1. Materiały i metody

Część in vivo badania przeprowadzono w New Iberia Research Center (New Iberia, LA, Sponsor: Bayer Corporation, Berkeley, CA) i obejmowała ona dwie fazy badań i 11 młodych i dorosłych samców szympansów o masie ciała w zakresie od 45 do 70 kg.

Faza I badania dotyczyła określenia dawki i obejmowała podawanie podskórne dawki nośnika albo PROLEUKIN™ w ilości 1,2 mg/m^{2 3} dwa razy dziennie (BID) przez 5 dni. Faza II badania polegała na porównaniu nośnika, PROLEUKIN i IL-2/N88R podawanych podskórnie, co 12 godzin przez 5 dni. Dawkę IL-2/N88R wybrano w celu zapewnienia porównywalnej ekspozycji na PROLEUKIN w oparciu o analizę farmakokinetyczną. Próbki krwi pobrano do analizy składu chemicznego, CBC, hematologii/krzepnięcia i analizy FACS na populacje komórek NK i limfocytów T, jak podano w sekcji 5 i 6.

T a b l i c a 2A Protokół fazy I

Numer grupy	Liczba zwierząt	Substancja testowana	Dawka	Częstość
1	1	Nośnik	NA	BID przez 5 dni
2	2	PROLEUKIN	1,2 mg/m2	BID przez 5 dni

T a b l i c a 2B Protokół fazy II

Numer grupy	Liczba zwierząt	Substancja testowana	Dawka	Częstość
1	2	Nośnik	2,4 ml/m2	Co 12 godz. przez 5 dni
2	3	PROLEUKIN	1,2 mg/m2	Co 12 godz. przez 5 dni
3	3	IL-2/N88R	1,2 mg/m2	Co 12 godz. przez 5 dni

2. Procedura dawkowania

W dniu badania, w którym pobierano krew, zwierzęta znieczulano ogólnie stosując ketaminę

i.m. w dawce około 10 mg/kg przed podaniem badanej substancji albo nośnika. W dniach, kiedy nie pobierano krwi, zwierzęta fizycznie unieruchamiano stosując specjalną klatkę przed podaniem substancji albo nośnika. Dawkę podawano podskórnie co 12 godzin przez 5 dni, a miejsce wstrzyknięcia wygolono w 1 dniu badania. Miejsce i czas dawkowania rejestrowano dla każdej dawki.

3. Obserwacje kliniczne (a) Codzienna obserwacja i spożycie pożywienia. Każde ze zwierząt obserwowano dwa razy dziennie i nieprawidłowe zachowania raportowano kierownikowi badania. Zwrócono uwagę kierownika badań, weterynarza projektu i przedstawiciela sponsora na zwierzęta wyglądające na chore. Spożycie rejestrowano dwa razy dziennie.

PL 201 675 B1 (b) Masa ciała. Masę ciała mierzono przed badaniem, przed podaniem dawki w dniu 1 i za każdym razem, gdy zwierzę znieczulano do pobrania krwi.

(c) Obserwacje miejsc wstrzyknięcia. Obserwacje prowadzono codziennie. Rejestrowano jakikolwiek nieprawidłowy wygląd jak zaczerwienienie czy obrzęk.

T a b l i c a 3A

Schemat pobierania próbek dla fazy II

Czas	CBC	CHEM	COAG	FACS	Test Sponsora
Przed badaniem	X	X	X	X	X
Dzień 1 przed dawką	X	X	X	X	X
Dzień 1, 15 minut					X
Dzień 3 15 minut przed dawką	X	X	X	X	X
Dzień 3, 15 minut					X
Dzień 6	X	X	X	X	X
Dzień 8	X	X	X	X	X
Dzień 10	X	X	X	X	X
Dzień 12	X	X	X	X	X
Dzień 15	X	X	X	X	X
Dzień 30	X	X	X	X	X

4. Obróbka próbek (a) Skład chemiczny surowicy. Od każdego ze zwierząt do probówek bez antykoagulanta zbierano w około 2 ml próbek krwi w powyżej określonych punktach czasowych. Dokumentowano czasy pobrania próbek a krew pozostawiano do skrzepnięcia w temperaturze pokojowej. Próbki następnie wirowano, oddzielano surowicę i przesyłano do NIRC Clinical Pathology Laboratory. Standardowy panel NIRC badania składu chemicznego krwi obejmował:

T a b l i c a 4

Panel składu chemicznego krwi

Sód	Fosfor
Potas	Azot mocznikowy
Chlor	Kreatynina
Bilirubina całkowita	Białko całkowite
Fosfataza alkaliczna	Albumina
Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)	Stosunek Albumina/Globulina
Aminotransferaza asparaginianowa (AST)	Glukoza
Aminotransferaza alaninowa (ALT)	Wapń
Dwutlenek węgla (CO2)	Transferaza gamma-glutamylowa (GGT)

(b) Hematologia. Od każdego ze zwierząt do probówek z EDTA zbierano w około 2 ml próbek krwi w powyżej określonych punktach czasowych i przesyłano do NIRC Clinical Pathology Laboratory. Standardowy panel hematologiczny NIRC obejmujący pełną morfologię krwi z rozmazem oraz liczbę płytek, przeprowadzono dla wszystkich próbek (c) Testy Sponsora. W około 6 ml próbkę krwi pobierano do probówek z EDTA jako antykoagulantem w powyżej określonych punktach czasowych. Czas pobrania próbek dokumentowano. Próbki wirowano i oddzielano osocze do trzech oddzielnych probówek. Osocze przechowywano zamrożone (60°C lub poniżej) i przesyłano do Bayer Corporation, Berkeley, CA, zaraz po zakończeniu badania.

PL 201 675 B1

5. FACS (a) Procedura. W około 5 ml krwi pobrano na sól sodową heparyny jako antykoagulant w czasie określonym do analizy FACS. Próbki krwi pełnej otrzymano na EDTA, ACD lub heparynie. Liczbę komórek doprowadzono do zakresu 2 do 20 tysięcy na mm³.

12x75 plastikowe albo szklane probówki oznaczono odpowiednio dla badanego panelu przeciwciał. Przeciwciało albo mieszaninę przeciwciał dodano do probówek w objętościach sugerowanych przez producenta.

100 μl dobrze wymieszanej próbki krwi dodano do probówki i inkubowano mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc od światła.

Po inkubacji, dodano 2 ml roztworu do lizy (Becton Dickinson, FACS brand lysing solution, BD#92-0002) i wytrząsano mieszaninę łagodnie w mieszalniku typu vortex i pozostawiano na 10 minut w temperaturze pokojowej. Probówki wirowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 300 X g. Supernatanty zlewano, nadmiar cieczy osuszano bibułą i do każdego z osadów komórkowych dodawano 1 ml PBS (Gibco 14190-144). Po łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu vortex, probówki ponownie wirowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 300 X g. Usuwano supernatanty, nadmiar cieczy osuszano bibułą, po czym dodawano 1 ml roztworu utrwalającego (0,5% formaliny wytworzonej przez rozcieńczenie 10% formaldehydu (Polyscience, Inc. #0418) 1:20 z buforem PBS) na osad komórkowy i wytrząsano łagodnie w celu ponownego zawieszenia. Próbki analizowano na cytometrze przepływowym Coulter EPICS SL Flow Cytometer.

Przeciwciałami stosowanymi do badania były: kontrola izotypu MIgG1/MIgG1 (Becton Dickinson, numer katalogowy #349526), CD45-PerCP (Becton Dickinson, numer katalogowy #347464), CD8-FITC (Becton Dickinson, numer katalogowy #347313), CD25-PE (Becton Dickinson, numer katalogowy #30795X), CD4-FITC (Becton Dickinson, numer katalogowy #340133), CD16-PE (Pharmingen, numer katalogowy #347617), CD3-PerCP (Becton Dickinson, numer katalogowy #347344).

6. Profil krzepnięcia

W określonych powyżej punktach czasowych w probówkach zbierano po około 2 ml krwi z cytrynianem sodu jako antykoagulantem. Profil krzepnięcia obejmował czas protrombinowy (PT), czas częściowo aktywowanej tromboplastyny (APTT) i fibrynogen.

B. Wyniki i dyskusja

1. Określanie dawki PROLEUKIN

Głównym celem tej fazy było zidentyfikowanie optymalnej dawki PROLEUKIN dla porównania z IL-2/N88R. Tę optymalną dawkę PROLEUKIN tak ustalono, aby była dawką tolerowalną (niższą niż maksymalna dawka tolerowana), która będzie idealnie wywoływała znaczącą klinicznie ale umiarkowaną i odwracalną toksyczność. Dawkę PROLEUKIN 1,2 mg/m², BID określono jako początkową dawkę bazującą na krzyżowo-specyficznej ekstrapolacji danych klinicznych reżimów dawkowania PROLEUKIN, ich odpowiadających toksyczności i wynikach zależnej od dawki odpowiedzi na PROLEUKIN u domowego Makaka jawajskiego

Dwa szympanse traktowano w ten sposób PROLEUKIN. W czasie dawkowania zwierzęta te stawały się co raz mniej aktywne, wyczerpane i odwodnione. U obu zwierząt rozwinęły się ciężkie objawy ze strony przewodu żołądkowo-jelitowego począwszy od 3 lub 4 dnia, obejmujące zmniejszenie apetytu, biegunkę, wymioty. Jednemu zwierzęciu (numer X-159) dawkowanie przerwano po 3 dniach z powodu ciężkich zaburzeń nerkowych (Figura 8A i B) i umiarkowanych wątrobowych (Figura 8C i D) co odbijało się w składzie chemicznym krwi. Obejmuje to podniesienie azotu mocznikowego we krwi (BUN), kreatyniny i bilirubiny całkowitej, ALT (SGPT).

Podano płyn Ringera buforowany mleczanem i.v. obu zwierzętom traktowanym PROLEUKIN w dniu 3 i 4 (zwierzę X-159) i dnia 4 tylko (zwierzę X-124) do reanimacji lub do zapobiegania dalszemu odwodnieniu. Zwierzę numer X-159 usunięto z badania w dniu 8 z powodu zaburzenia nerek i możliwego skrzepu na prawej nodze, co wskazywał bardzo niewielki puls (tętnica udowa), a cała łydka była zimna i powiększona. Chociaż u jednego zwierzęcia obserwowano znaczącą toksyczność, inne zwierzę doświadczyło mniej ciężkich przypadków, a profil niekorzystnych zmian dla obu zwierząt był odwracalny. Opierając się na tym określono, że 1,2 mg/m² PROLEUKIN i dawki ekwiwalentnej (opartej na ekspozycji) IL-2/N88R co 12 godzin jest właściwym reżimem dawkowania do porównania tych dwóch związków.

2. Porównanie IL-2/N88R z PROLEUKIN

Obserwacje kliniczne. Tablica 5 zawiera wykaz obserwacji klinicznych sporządzonych w trakcie badania. Wartości odnotowano według skali 0 do 5, gdzie 5 oznacza ciężkie zmiany. Wszystkie zwiePL 201 675 B1 rzęta leczone PROLEUKIN były ciężko chore; jedna śmierć była związana z leczeniem PROLEUKIN. Wartości odnotowane po 6 dniu dla grupy PROLEUKIN odzwierciedlają dane od pozostałych dwóch zwierząt. Najbardziej oczywiste efekty uboczne leczenia IL-2/N88R wydawały się być łagodnymi G1 zaburzeniami (wymioty) chociaż leczenie indukowało nominalną toksyczność w zakresie parametrów wskazanych w Tablicy 4. Masa ciała grupy PROLEUKIN spadła 6% w dniu 6 i obniżyła się aż do 10% dnia 10 i później powoli była odzyskiwana (patrz Figura 9). Przeciwnie, grupy IL-2/N88R i podłoża miały jedynie najwyżej 1-3% utraty masy.

T a b l i c a 5 Obserwacje kliniczne*

Traktowanie	Stan ogólny	Utrata apetytu	Letarg	GI	Złe samopoczucie
IL-2/N88R	dobry	1	1	2	1
PROLEUKIN	ciężko chorzy	5	4/5	5	4/5
Podłoże	prawidłowy	0	0	0	0

* Skala od 0 do 5, gdzie 5 jest najcięższym stanem (a) Hematologia. IL-2/N88R indukuje efekty komórkowe zgodne z aktywacją PROLEUKIN, szczególnie limfocytozę (Figura 10A), obserwowano również wzrost białych krwinek (Figura 10B) i neutrofili (Figura 10C). IL-2/N88R indukowała tylko marginalną trombocytopenię (nadir ~ 15%) w porównaniu z PROLEUKIN (nadir ~ 50%) w czasie części badania obejmującej traktowanie (figura 10D).

(b) Czynność nerek. Poziomy BUN były znacząco wyższe u wszystkich zwierząt leczonych PROLEUKIN w dniu 6 i 8 (Figura 11A). Poziomy BUN wynosiły ponad 130 mg/dl u dwojga zwierząt; poziomy kreatyniny także wzrastały dramatycznie u dwojga zwierząt zarówno w dniu 6 jak i 8 (Figura 11B) wskazując całkowite zatrzymanie funkcji nerek. Ponadto zarówno fosfor surowiczy jak i przerwa anionowa także wzrastają u grupy leczonej PROLEUKIN w dniu 6 i 8. Natomiast u wszystkich zwierząt leczonych IL-2/N88R te parametry nerkowe pozostawały na podstawowym prawidłowym poziomie w trakcie badania (Figura11C i D) (c) Funkcje wątrobowe. Bilirubina całkowita wzrosła bardziej niż trzykrotnie w grupie PROLEUKIN w dniu 6 i pozostawała wysoka do dnia 10 (Figura 12A). Przeciwnie, tylko jedno zwierzę w grupie IL-2/N88R miało przejściowy niewielki wzrost w dniu 3 i 6. Poziom SGTP w surowicy podnosił się dramatycznie i osiągał powyżej 100 U/l u wszystkich zwierząt leczonych PROLEUKIN w 6 dniu (Figura 12B). Poziom SGTP u zwierzęcia numer A199 osiągnął 651U/l a SGOT 2789 U/l (Lab Note Book: NIRC#8754-9852-PhaseII, Table I Indyvidual and Group Mean Chemistry Values, str. 17 of 21 tabeli), wskazując na ciężkie uszkodzenie wątroby.

(d) Koagulacja. Poziom fibrynogenu był wyższy niż dwukrotny w obu grupach PROLEUKIN i IL-2/N88R i osiągnął szczyt 6 dnia (Figura 12C). Wzrost pojawił się wcześniej w grupie PROLEUKIN niż w grupie zwierząt IL-2/N88R. Ma to odzwierciedlenie we wzroście 51% vs 5% w 3 dniu. Zmiany w fibrynogenie mogą być wynikiem odpowiedzi białka ostrej fazy raczej niż defektów koagulacji, ponieważ nie było znaczących zmian w APTT lub PT, odpowiednio, w tym samym czasie (Figura 12D). Jednak, zaczynając od dnia 10 poziom APTT u zwierząt traktowanych PROLEUKIN wykazywał oczywistą tendencję zwyżkową, chociaż wartości absolutne pozostały w zakresie prawidłowym. Tę samą tendencję, chociaż w mniejszym zakresie, obserwowano również w grupie IL-2/N88R. Interesujące jest jednak, że poziom fibrynogenu obniża się w tym samym czasie odpowiednio w obu grupach.

(e) Homeostaza. Poziomy sodu w surowicy zmniejszają się do 35 MEQ/l u dwojga z trzech zwierząt w 8 dniu, ale pozostają prawidłowe u reszty zwierząt (Figura 13A). Poziomy chlorku w grupie PROLEUKIN były również zmniejszone do 95 MEQ/l począwszy od 3 dnia i pozostały niskie do dnia 15. (Figura 13B). Poziom wapnia był niższy u dwojga z trzech zwierząt traktowanych PROLEUKIN w dniach 6 i 8 i osiągnął poziom tak niski jak 4,9 i 3,1 mg/dl u zwierzęcia A199 (Figura 13C). Poziom potasu obniżył się do 3 MEQ/l od dnia 3 do 12 u wszystkich zwierząt traktowanych PROLEUKIN za wyjątkiem zwierzęcia A199, u którego poziom potasu rzeczywiście wzrósł do poziomu toksycznego 7,2 MEQ/l przed wykluczeniem go z badań (figura 13D).

(f) Oznaki przeciekania naczyń krwionośnych. Poziom albuminy surowiczej obniżył się w obu grupach PROLEUKIN (37%) i IL-2/N88R (19%) (Figura 14A). Wzrost poziomu hematokrytu obserwowano w grupie PROLEUKIN w dniach 3 i 6 (Figura 14B). Natomiast, poziom hematokrytu u obu grup

PL 201 675 B1

IL-2/N88R i grupy kontrolnej z podłożem, zmniejszył się w tym samym czasie i pozostał niski, wskazując na łagodną anemię, jak oczekiwano na podstawie kolekcji różnorodnych próbek krwi (Figura 14B i C). Wzrost hematokrytu w grupie PROLEUKIN, gdy powiąże się go ze spadkiem albuminy jest zgodny z rozwojem zespołu przeciekających włośniczek.

3. Aktywacja komórkowa

Efektywność PROLEUKIN i IL-2/N88R oceniono przez zmienność procentu CD25 dodatnich limfocytów (wędrowanie + proliferacja) i średniej fluorescencji dla CD25 lub liczby antygenów CD25 wyrażanych na powierzchni danych limfocytów T (CD25 = niskie powinowactwo IL-2R). Ekspresję CD25 oceniono na całej populacji limfocytów T (limfocyty CD3+), jak również populacji CD3+CD4+ i CD3+CD8+.

Aktywność IL-2 wobec komórek NK oceniono przez analizę wędrówki komórek NK CD3CD16+ i CD3-CD25+CD16+. Absolutną liczbę komórek NK CD3+, CD4+, CD8+ określono przez mnożenie procentu komórek przez liczbę limfocytów na mm³; dane otrzymane w czasie analizy hematologicznej.

(a) Regulacja ekspresji CD25 na powierzchni limfocytów T.

Procent aktywowanych limfocytów T, jak wskazany przez komórki CD25 dodatnie, zwiększał się do 6 dnia badania, głównie na subpopulacji CD3+CD4+ limfocytów T. Wygląda, że PROLEUKIN indukuje ekspresję CD25 w wyższym procencie na całkowitej subpopulacji limfocytów T CD3+, CD3+CD4+ i CD3+CD8+ w 6 dniu. Jednak do 8 dnia procent komórek wyrażających antygen CD25 był identyczny na limfocytach szympansów traktowanych przez PROLEUKIN i szympansów traktowanych IL-2/N88R (Figura 15A, B i C). Nie zaobserwowano zabarwienia dla CD25 na powierzchni populacji komórek NK zarówno u szympansów traktowanych PROLEUKIN jak i IL-2/N88R. Podejrzewa się, że brak ekspresji IL-2Ra (antygen kierowany do powierzchni komórek barwionych przez CD25) na powierzchni wybranej populacji komórek NK(CD3-/CD16+) jest odpowiedzialny za te wyniki.

Absolutna liczba limfocytów T CD3+CD25 ma podobny wzór jak procent limfocytów T CD3+CD25+ z PROLEUKIN wydającym się bardziej aktywnym niż IL-2/N88R (Fig. 16A). IL-2/N88R wykazuje podobny potencjał aktywacji limfocytów T jak PROLEUKIN na populacji limfocytów T CD3+CD4+, ponieważ regulacja w górę do całkowitej liczby limfocytów CD3+CD4+CD25+ indukowanych przez IL-2/N88R była identyczna z regulacją w górę obserwowaną dla PROLEUKIN (Fig. 1GB). Okazało się, że PROLEUKIN wydawał się zwiększa liczbę limfocytów T CD3+CD8+CD25+ w większym zakresie niż IL-2/N88R (Fig. 16C)

Liczba cząsteczek CD25 (średnia fluorescencja) wyrażonych na subpopulacji limfocytów T CD3+CD4+ ma identyczne kinetyki po traktowaniu albo PROLEUKIN albo IL-2/N88R (Fig.17).

(b) Wędrowanie limfocytów: efekt traktowania PROLEUKIN i IL-2/N88R

Aktywności PROLEUKIN i IL-2/N88R na populacji limfocytów T i komórek NK określono analizą zmienności absolutnej liczby krążących limfocytów przed w czasie i po traktowaniu (Fig. 18). Okazało się, że IL-2/N88R ma większą aktywność niż PROLEUKIN w zwiększaniu absolutnej liczby krążących limfocytów CD3+CD4+ (Fig. 18A) i lekko obniżoną aktywność w porównaniu z PROLEUKIN w zwiększaniu absolutnej liczby krążących limfocytów CD3+CD8+ (Fig.18B).Oba związki miały porównywalny, chociaż niewielki wpływ, na zwiększenie całkowitej liczby limfocytów CD3+ (Fig. 18C). Ani PROLEUKIN ani IL-2/N88R nie oddziaływały na wędrówkę komórek NK. (Fig. 18D).

C. Wniosek

IL-2/N88R wygenerowano przez przeszukiwanie mutantów białek IL-2 w testach ludzkich pierwotnych limfocytów T i komórek NK. IL-2/N88R wykazuje in vitro około 6000-razy większą selektywność limfocytów T niż wobec komórek NK. Opierając się na profilu komórkowym, postulowano, że indukowałyby łagodne działania uboczne, po podaniu w dawce, która wywoływałaby znaczącą aktywację limfocytów T. Eksperymenty z szympansami porównujące PROLEUKIN, z IL-2/N88R, potwierdziły, że IL-2/N88R ma istotnie lepszy profil bezpieczeństwa niż PROLEUKIN, podczas gdy zachowuje porównywalną zdolność do indukowania aktywacji limfocytów T.

P r z y k ł a d 8.

Skuteczność wybiórczego agonisty IL-2 N88R w mysim modelu CT-26 przerzutów nowotworu do płuc

Protokół: Myszom (Balb/c, samice, wiek 6-8 tygodni) podano dożylnie (iv) 1x10⁵ komórek CT-26 (mysi rak okrężnicy) w 0,2 ml PBS w boczną żyłę ogonową w dniu 0. Leczenie Proleukin albo IL-2/N88R

PL 201 675 B1 w różnych dawkach (rozcieńczalnik: 5% dekstroza w wodzie (D5W)) albo D5W, podawane iv, raz dziennie przez 8 dni (QDx8) rozpoczęto w dniu 1 po wszczepieniu. IL-2/N88R przygotowano w temperaturze pokojowej przez rozcieńczenie w D5W przy użyciu silikonowanych fiolek stosując strzykawkę tuberkulinową i dozowano zwierzętom w ciągu 2 godzin. PROLEUKIN przygotowano przez dodanie 0,7 ml sterylnej wody do wstrzyknięć (SWFI) do każdej z fiolek (stężenie końcowe, 1,86 mg/ml). Rozcieńczenia wytworzono jak to opisano dla IL-2/N88R w D5W (Tablica 6). Zwierzęta zabito w dniu 11. Płuca pobrano i zważono, płukano w PBS i przeniesiono do roztworu Bouin'a. 24 godziny później tkanki przeniesiono do 10% formaliny. Liczbę kolonii przerzutów w płucach zliczono pod mikroskopem warstwowym.

T a b l i c a 6

Dawki i grupy w badaniu mysiego modelu nowotworu CT-26

Grupy	n	Traktowanie	Dawka, mg/kg
1	4	D5W	NA
2	11	PROLEUKIN	3 mg/kg
3	11	PROLEUKIN	10 mg/kg
4	11	IL-2/N88R	1 mg/kg
5	12	IL-2/N88R	3 mg/kg
6	12	IL-2/N88R	10 mg/kg
7	12	IL-2/N88R	30 mg/kg
8	11	IL-2/N88R	60 mg/kg

Tablica 7 pokazuje liczbę przerzutów policzonych u poszczególnych myszy. Porównywalną skuteczność obserwowano dla IL-2/N88R i PROLEUKIN. W wysokiej dawce IL-2/N88R (grupa 8, 60 mg/kg) wszystkie myszy z wyjątkiem jednej miały 12 albo mniej przerzutów; 3 myszy nie miały przerzutów. Kontrastuje to z najwyższą dawką PROLEUKIN, gdzie wszystkie myszy miały 12 przerzutów lub więcej.

T a b l i c a 7

Poszczególne przerzuty i średnie

Grupa	Przerzuty do płuc (przedstawiono liczby dla poszczególnych myszy) liczba	Średnia	SEM	Wartość P (2-stronna)
1	0 129 183 179 155 165 200 152 148 158 200 194 165 125	154	13,42
2	118 126 107 111 118 110 137 114 135 158 132	124	4,61	0,07278
3	12 38 18 19 30	23	4,66	0,00003
4	169 173 189 200 120 117 136 122 200 163 110	154	10,41	0,97029
5	171 176 186 159 192 139 117 200 195 116 192	168	9,31	0,43401
6	92 11 112 114 109 84 68 47 58 49 112	87	8,16	0,00060
7	15 13 59 62 23 55 46 16 9 4 82	26	6,57	0,0
8	7 0 3 2 4 9 7 0 12 55 0	9	4,75	0,0

Istotne (P<0,05) zmniejszenie ilości przerzutów obserwowano u myszy traktowanych IL-2/N88R w dawkach 10, 30, i 60 mg/kg (odpowiednio, grupy 6, 7 i 8) oraz w grupie leczonej 10 mg/kg PROLEUKIN (grupa 3). Wyniki te są pokazane graficznie na Fig. 19. Dane wykreślono stosując logarytm dawki: dla PROLEUKIN, dawki wynosiły 3 i 10 mg/kg; dla IL-2/N88R dawki wynosiły 1, 3, 10, 30 i 60 mg/kg. Dopasowanie krzywej przy użyciu równania nieliniowego (dopasowanie 4-parametrowe) dało wartość IC50 równą 5,2 mg/kg dla PROLEUKIN i 10,9 mg/kg dla IL-2/N88R.

PL 201 675 B1

Z danych w tym doświadczeniu, wyliczono IC50 dla IL-2/N88R w odniesieniu do zmniejszenia liczby przerzutów jako wartość 10,9 mg/kg (8,6-13,9 mg/kg przy i 95% ufności), zaś dla PROLEUKIN 5,2 mg/kg (3,5-7,7 mg/kg z 95% ufności).

Przeżycie myszy pokazano w Tablicy 8. W grupie 10 mg/kg PROLEUKIN jedna mysz padła w dniu 7, zaś kolejnych 5 padło w dniu 8. W każdej grupie z leczonych 3 i 10 mg/kg IL-2/N88R padła jedna mysz w dniu 8, nie obserwowano zaś śmierci przy dawkach, 30 i 60 mg/kg. Oprócz tego, większość myszy leczonych 3 mg/kg PROLEUKIN i wszystkie myszy leczone 10 mg/kg PROLEUKIN były konające; nie obserwowano śmiertelności w grupie leczonej IL-2/N88R

T a b l i c a 8

Przeżycie myszy leczonych IL-2/N88R albo PROLEUKIN

Grupa	Dzień
	0	74	8	11
D5W1	100%	100%	100%	100%
Pro 3 mg/kg2	100%	100%	100%	100%
Pro 10 mg/kg2	100%	90,9%	45,5%	45,5%
IL-2 N88R: 1 mg/kg2	100%	100%	100%	100%
IL-2 N88R: 3 mg/kg3	100%	100%	91,7%	91,7%
IL-2 N88R: 10 mg/kg3	100%	100%	91,7%	91,7%
IL-2 N88R: 30 mg/kg3	100%	100%	100%	100%
IL-2 N88R: 60 mg/kg2	100%	100%	100%	100%

¹n = 14 myszy na grupę;

²n = 11 myszy na grupę ³n = 12 myszy na grupę ⁴nie obserwowano śmiertelności przed dniem 7

Zwierzęta leczone PROLEUKIN w obu grupach były konające; nie obserwowano śmiertelności w grupie leczonej IL-2/N88R.

Podsumowując, badanie to pokazało, że IL-2/N88R jest skuteczna jak Proleukin w zmniejszaniu wielkości nowotworu (co mierzono liczbą przerzutów do płuc w modelu CT26). Oprócz tego, IL-2/N88R jest zasadniczo mniej toksyczna niż PROLEUKIN

P r z y k ł a d 9.

Opracowanie stabilnej linii komórkowej CHO, wytwarzającej IL2N88R na wysokim poziomie

Stabilne linie produkcyjne wydzielające znaczne ilości linii CHO(dhfr-) z wektorem ekspresyjnym pokazanym na Fig. 20 (depozyt ATCC nr PTA-8). Poszczególne elementy wektora ekspresyjnego IL2/N88R pokazano na mapie plazmidowej (Fig. 20). Pokazuje ona promotor wczesny wirusa cytomegalii CMVe/p; sekwencję sygnałową poliadenylacji SV40 = PA; oraz kasetę ekspresyjną genu reduktazy dihydrofolianowej = DHFR+.

Wektor skonstruowano stosując standardowe techniki (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual 2 wyd. 1989, (Cold Spring Harbor Press, 1989) Short Protocols in Molecular Bioology, 2 wyd. 1992, John Wiley&Son; Metods in Enzymology vol. 185, Ed. Goeddel i wsp., Academic Press, Inc, London, 1991. Wektor ekspresyjny zawierał oddzielnie kasety ekspresyjnej dla genu IL-2/N88R i możliwego do amplifikacji i selekcji genu DHFR (reduktazy dihydrofolianowej). Około 1x10⁶ komórek CHO transfekowano 10 μg pBC1IL2SA przy użyciu reagentów Lipofectin (Life Technology Inc, Bethesda, MD) według instrukcji producenta. Komórki selekcjonowano w obecności 50 nM metotreksatu i hodowano na pożywce DME/F12 (Life Technologies, Inc) pozbawionej tymidyny i hipoksantyny z 5% dializowaną płodową surowicą płodową bydlęcą. Populację komórek przeszukiwano na wytwarzanie IL-2N88R stosując handlowy zestaw ELISA (RD Systems). Populacje o wysokiej produktywności selekcjonowano następnie w podłożu zawierającym wzrastające stężenia metotreksatu (100 do 400 nM metotreksatu) i przeszukiwano na wytwarzanie IL2N88R.

PL 201 675 B1

Następnie zastosowano klonowanie ograniczonych rozcieńczeń w nieobecności metotreksatu stosując standardowe techniki hodowli tkankowej w celu wyprowadzenia klonów o wysokiej i trwałej stabilności.

P r z y k ł a d 10.

Wytwarzanie IL2N88R w pożywce bezsurowiczej w Przykład 10. Wytwarzanie IL2N88R w pożywce bezsurowiczej w bioreaktorze perfuzyjnym

Ciągłe wytwarzanie IL2N88R przeprowadzono przez ciągłą fermentację perfuzyjną. 19-litrowy fermentor Wheaton zaszczepiono stabilną linią komórkową CHO z Przykładu 9 w gęstości 2x10⁶ komórek/ml i perfundowano pożywką w tempie 5 litrów/dzień. Pożywka była oparta na pożywce DME/F12 (Life Technologies, Inc., Rockville, USA) z dodatkiem rekombinowanej ludzkiej insuliny (10 μg/ml) (Humulin™ Eli Lilly, Inc., Indianapolis, IN) i FeSO₄,EDTA (50 μM). Gęstość komórek utrzymywano na poziomie 4x10⁶/ml. Średni uzysk wynosił około 200 mg/dzień.

Wytwarzanie IL2N88R było utrzymywane przez 30 dni.

P r z y k ł a d 11.

Oczyszczanie IL-2/N88R wytworzonej w komórkach CHO

Poniższą procedurę zastosowano do eluatu perfuzyjnego opisanego wyżej. Pożywkę zbierano i wprowadzano do kolumny S-sepharose. Kolumnę równoważono 20 mM buforem fosforanowym z 5 mM NaCl przy pH 7,0. Dostarczanie (TCF) ustalono na 4 milisimensy przewodności z dodatkiem wody i pH doprowadzono do takiej samej wartości kwasem fosforowym.

Po dostarczeniu TCF, kolumnę płukano buforem do równoważenia. Elucję przeprowadzono przez zmianę pH. Muteiny eluowano 20 mM etanoloaminą, pH 10,5, w celu usunięcia ich z kolumny i wytworzenia eluatu-S.

Wymianę anionową przeprowadzono przez przepuszczenie eluatu S przez kolumnę QAE Fast Flow™ Pharmacia zrównoważoną 10 mM buforu wodorowęglanu przy pH 10,5. Szybkość przepływu utrzymano przy 250 cm/godzinę. Po płukaniu do linii zerowej IL-2SA eluowano 20 mM fosforanem pH 4,0.

Chromatografię na hydroksyapatycie (HAP) przeprowadzono przez przepuszczenie eluatu rozcieńczonego QAE (1:1 z WFI) przez kolumnę zapakowaną ceramicznym hydroksyapatytem (Typ II Bio-Rad, Hercules, CA) zrównoważoną 0,1 mM fosforanem przy pH 7,0. Szybkość przepływu utrzymano na poziomie 250 cm/godzinę. Po płukaniu do linii zerowej IL2SA eluowano 100 mM fosforanem przy pH 7,0.

Eluat hydroksyapatytowy ultrafiltrowano do 300 ml objętości z filtrem Millipore Pelicon-2 dopasowanym do kasetyt PES 5K (Millipore Corporation, Bedford, MA).

Ultrafiltrowany eluat HAP następnie oczyszczono przez przepuszczenie przez kolumnę do chromatografii wykluczenia pod względem wymiarów S100HR (Pharmacia) z szybkością 35 cm/ /godzinę. Kolumnę zrównoważono 10 mM fosforanem i 150 mM NaCl, pH 7,0.

Pulę z filtracji żelowej rozcieńczono WFI do uzyskania przewodności 4,0 mMosm/cm i przepuszczono przez S-Sepharose w opisanych warunkach. IL2SA eluowano 10 mM fosforanem z 1 M NaCl przy pH 7,0.

Końcową wymianę kationową dializowano wobec solanki buforowanej fosforanem PBS przez noc, i rozcieńczono w sterylnym PBS do stężenia 6 mg/ml. Końcową pulę sterylnie filtrowano i rozdzielano na próbki i zamrażano w -70°C. Całkowity odzysk wynosił 65%.

Inne wykonania wynalazku są oczywiste dla specjalisty w dziedzinie. Wynalazek ten wskazuje jak można otrzymać muteiny, nawet nieopisane tu konkretnie, ale które wywołują aktywację limfocytów T, jak wykazano przez proliferację blastów PHA i zmniejszenie proliferacji komórek NK, a tym samym muteiny te są zgodne z duchem wynalazku i wchodzą w jego zakres.

Pomysł i podejście eksperymentalne tu opisane powinno być możliwe do zastosowania dla innych cytokin wykorzystujących układ multimerycznych receptorów, w szczególności cytokin pokrewnych IL-7, IL-9 i IL-15, IL-10, interferonu α i interferonu γ.

Sekwencje

Poniższe sekwencje dołączono ze zgłoszeniem:

Id. Sekw. nr 1: hIL-2 (aminokwasy)

Id. Sekw. nr 2: hIL-2 (cDNA)

Id. Sekw. nr 3: Starter PCR

Id. Sekw. nr 4: Starter PCR

Id. Sekw. nr 5: Starter do mutagenezy, wektor IL-2

Id. Sekw. nr 6: Starter do mutagenezy, mutacje D20X

Id. Sekw. nr 7: Starter do mutagenezy, mutacje N88X

Id. Sekw. nr 8: Starter do mutagenezy, mutacje Q126X

PL 201 675 B1

Lista Sekwencji < 110> Shanafelt, Armen B.

Greve, Jeffrey M.

Jestnok, Gary Lembach, Kenneth J.

Wetzel, Gayle D.

<I20> Wybiórczy Agoniści i Antagoniści IL-2 <I30> Id. Sekw. nr 1-8 <140>

<141>

<150> 09/080,080 <151> 1998-05-15 <160> 8 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 133 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His 15 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met He Leu Asn Gly He Asn Asn Tyr Lys 20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu He Ser Asn He Asn Val He Val Leu Glu Leu 85 90 95

Lys Gly Sei Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110

Thr He Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp He Thr Phe Cys Gin Ser He 115 120 125

He Ser Thr Leu Thr 130

PL 201 675 B1 <210>2 <211>465 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420 tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactt gataa 465 <211> 30 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cctcaactcc tgaattcatg tacaggatgc 30 <210>4 <211>31 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ggaagcggat ccttatcaag tcagtgttga g 31 <210> 5 <211>36 <212>DNA .

<213> Homo sapiens <400> 5 gcacttgtca caaacaccat ggcacctact tcaagt 36 <210>6 <211> 28 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggagcattta ctgctgnnnt tacagatg 28 <210> 7 <211> 30 <212>DNA

PL 201 675 B1 <213> Homo sapiens <400>7 gggacttaat cagcnnnatc aacgtaatag 30 <210> 8 <211>28 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ggattacctt ttgtnnnagc atcatctc 28

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Polipeptyd, który stanowi muteinę ludzkiej interleukiny-2 (IL-2), numerowaną zgodnie z IL-2 typu dzikiego, znamienny tym, że muteina ludzkiej IL-2 w stosunku do typu dzikiego zawiera zastąpienie w przynajmniej jednej pozycji wybranej spośród 20, 88 i 126, przy czym zastąpienie w pozycji 20 jest wybrane z izoleucyny lub histydyny, zastąpienie w pozycji 88 jest wybrane z argininy lub izoleucyny lub glicyny, a zastąpienie w pozycji 126 jest leucyną i przy czym muteina ludzkiej IL-2 w sposób uprzywilejowany aktywuje limfocyty T w stosunku do naturalnych komórek zabójców (NK).
2. 2. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera polipeptyd określony w zastrz. 1, w kombinacji z noś nikiem dopuszczalnym farmaceutycznie.
3. 3. Polinukleotyd obejmujący sekwencję DNA kodującą polipeptyd określony w zastrz. 1 i jej warianty wynikające z degeneracji kodu genetycznego.
4. 4. Prokariotyczna komórka gospodarza, znamienna tym, że jest transformowana polinukleotydem określonym w zastrz. 3.
5. 5. Wektor, znamienny tym, że obejmuje polinukleotyd określony w zastrz. 3.