SK288100B6 - Human IL-2 mutein, pharmaceutical composition containing thereof and use, vector and prokaryotic host cell - Google Patents

Abstract

t is described a human interleukin (IL-2) mutein, which preferentially activates T lymphocytes over Natural Killer cells, a pharmaceutical composition containing thereof combined with a pharmaceutical carrier, a polynucleotide comprising a DNA sequence encoding said mutein and degenerated variants thereof, a vector containing that polynucleotide, a prokaryotic host cells transformed with such vector and use of mutein for manufacture of a medicament for treating of mammal suffering from disorder curable by IL-2.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka ľudského interleukínu 2 (IL-2), ktorý prednostne aktivuje T lymfocyty vzhľadom na bunky prirodzeného zabijaka, farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje takýto muteín v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom, polynukleotidu obsahujúceho DNA sekvenciu kódujúcu uvedený muteín a jeho degenerované varianty, vektoru obsahujúceho uvedený polynukleotid, prokaryotickej hostiteľskej bunky transformovanej takýmto vektorom a použitia muteínu na výrobu lieku na liečenie cicavca postihnutého stavom liečiteľným IL-2.

Doterajší stav techniky

Interleukín 2 (IL-2) je silný imunostimulátor aktivujúci rôzne bunky imunitného systému vrátane T lymfocytov, B lymfocytov a monocytov. IL-2 je tiež účinný a zásadný rastový faktor pre T lymfocyty. Z dôvodu týchto aktivít sa IL-2 testoval na schopnosť liečenia nádorov. Ľudský IL-2 je liek na liečenie metastatického karcinómu obličiek a metastatického melanómu schválený FDA. Použitie IL-2 u pacientov je obmedzené závažnou toxicitou spojenou s terapiou IL-2; zistilo sa, že iba 20 % vhodných pacientov skutočne dostane terapiu. Medzi toxicitu spojenú s terapiou IL-2 patrí horúčka, nevoľnosť, zvracanie, zvýšená priepustnosť kapilár a závažná hypotenzia. I napriek týmto toxickým reakciám je IL-2 účinná terapia pre schválené indikácie (približne 17 % objektívnych odpovedí).

Hoci štrukturálno/fúnkčná analýza myšieho IL-2 bola rozsiahla (Zurawski, S. M. a Zurawski, G. (1989), EMBO J., 8, 2583 - 2590; Zurawski, S. M. a kol. (1990), EMBO J., 9, 3899 - 3905; Zurawski, G. (1991), Trends Biotechnol., 9, 250 - 257; Zurawski, S. M. a Zurawski, G. (1992), EMBO J., 11, 3905 - 3910; Zurawski a kol., EMBO J., 12, 5113 -5119 (1993)), prebehla iba obmedzená analýza ľudského IL-2. Väčšina štúdií s ľudskými IL-2 mutantmi sa vykonala na myších bunkách, ale prebehli obmedzené štúdie s použitím ľudských PHA-blastov, ktoré exprimujú vysoko afmitný IL-2 receptor IL-2R alfa beta gama. Štúdie na PHAblastoch potvrdili význam zvyškov Asp-20 a D-skrutkovnice ľudského IL-2. Preukázalo sa, že pozície Asp20 a Gin-126 ľudského IL-2 sú primáme zvyšky zodpovedné za interakciu s beta- a gama- podjednotkami IL-2 receptoru, v príslušnom poradí (prehľad je uvedený v Theze a kol., Immunology Today, 17, 481 - 486 (1996)). Hoci sa preukázalo, že zvyšky v C-skrutkovnici myšieho IL-2 sa zúčastňujú interakcie s myším IL2R beta (Zurawski a kol., EMBO J., 12, 5113 - 5119 (1993)), nepreukázalo sa, že by ekvivalentné zvyšky v ľudskom IL-2 mali rovnaké vlastnosti (týmito zvyškami v ľudskom IL-2 by mali byť Asp-84 a Asp-88). Vzhľadom na preukázanú významnú druhovú špecificitu medzi myším a ľudským IL-2 (ľudský IL-2 vykazuje 100-krát nižšiu aktivitu v myších systémoch), je ťažké predvídať, či rovnaký typ interakcií prebieha v inom druhu. Nie sú známe žiadne štúdie využívajúce bunky exprimujúce iba ľudský receptor so strednou afinitou IL-2R beta gama.

Niektorí ľudskí IL-2 mutanti sa skúmali na svoju aktivitu na ľudských PHA blastoch (Xu a kol., Eur. Cytokine Netw., 6, 237 - 244 (1995)). Mutanti obsahujúci substitúcie Asp-20 leukínom (D20L), rovnako ako arginínom, asparagínom a lyzínom, mali ťažké defekty vo svojej schopnosti indukovať proliferáciu PHA blastov. Tak sa v odbore prijíma, že mutácia Asp20 vedie k vzniku mutantov so zníženou aktivitou. Ďalej, Xu a kol. uvádzajú, že doteraz (1995) neboli identifikovaní žiadni použiteľní IL-2 mutanti pre klinické alebo výskumné použitie.

Ľudský IL-2 Q126D mutant vytvorený Buchli a Ciardelli, Árch. Biochem. Biophys., 307, 2, 411 - 415 (1993) vykazuje významne zníženú aktivitu tak v účinnosti, ako aj v agonizme, v testoch na ľudských T lymfocytoch vykazuje 1000-krát nižšiu aktivitu ako IL-2 a správa sa ako čiastočný agonista. V testoch na myších T lymfocytoch je tento mutant takmer inaktívny. Obe testované bunkové línie exprimovali vysoko afmitnú formu IL-2 receptoru. Na oboch typoch buniek vykazuje Q126D schopnosť antagonizovať aktivitu sprostredkovanú IL-2, hoci v teste na ľudských T lymfocytoch je táto schopnosť iba čiastočná.

Zhi-yong, W. a kol., Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 25, 5, 558 - 560 (sept. 1993) vykonali substitúcie na IL-2 v pozíciách 62, 69, 99 a 126 a preukázali 20-násobné a 30-násobné zníženie aktivity v porovnaní s prirodzeným IL-2 pre 62-Leu-IL-2 a 126-Asp-IL-2, v príslušnom poradí, v teste na myších T lymfocytoch (CTLL-2). Ale autori neuvádzajú ani nenaznačujú, že substitúcia v pozícii 126 môže spôsobiť selektívnu aktivitu T lymfocytov vzhľadom na NK bunky, ani neuvádzajú, či majú takéto zmeny podobné účinky na ľudské T-lymfocyty.

Collins, L. a kol., PNAS USA, 85, 7709 - 7713 (1988) opisujú, že substitúcia Asp v pozícii 20 Asn (D20N) alebo Lys (D20K) vedie k 100-násobnej až 1000-násobnej strate väzby vzhľadom na ľudský IL-2 tak na vysoko (1L-2R alfa beta gama, v Collins a kol. označovaný ako p55/p70), ako aj stredne (1L-2R beta gama, v Collins a kol. označovaný ako p70) afmitívnom receptore. Väzba na IL-2R alfa sa zdá byť nezmenená pre oba mutované proteíny. Táto práca uvádza, že narušenie väzby na stredne afmitný receptor pre IL-2 (IL-2 beta gama) tiež vedie k narušeniu väzby na vysoko afmitný receptor pre IL-2 (IL-2 alfa beta gama), čo na2

SK 288100 Β6 značuje, že rôzne väzby alebo aktivácie medzi IL-2 beta gama a IL-2 alfa beta gama nie sú možné dosiahnuť substitúciou Asp v pozícii 20.

Bemdt, W. G. a kol., Biochemistry, 33, 21, 6571 - 6577 (1994) použili kombinatoriálnu kazetovú mutagenézu na simultánne mutovanie pozícií 17 - 21 v prirodzenom IL-2, o ktorých sa predpokladá, že interagujú so stredne afinitným receptorom pre IL-2. Z 2610 vyšetrovaných klonov bolo iba 42 klonov aktívnych. Výskumníci zistili, že pozície 20 a 21 majú zásadný význam pre biologickú aktivitu. Nie sú uvedené ani naznačené jednotlivé substitúcie s výnimkou L21V.

U.S. patent č. 5 229 109 (Grimm a kol.) opisuje toxicitu analógov IL-2 používaných na imunoterapiu a liečenie nádorov. Vlastnosti dvoch analógov IL-2 so substitúciami v pozíciách Arg38 (na alanín) a Phe42 (na Iyzín) sa analyzovali a porovnali s vlastnosťami prirodzeného IL-2. Zistilo sa, že analógy si uchovávajú schopnosť väzby na stredne afmitný receptor pre IL-2, ale viažu sa iba minimálne na tzv. „vysoko afmitný“ receptor pre IL-2. V súčasnosti sa predpokladá, že stredne afmitný receptor sa skladá iba z p75 (IL-2R beta) a vysoko afmitný receptor sa skladá z iba p55 + p75 receptorového komplexu (IL- 2R alfa beta). Analógy si tiež uchovávajú svoju schopnosť stimulovať mononukleáme bunky periférnej krvi za vzniku lymfokínmi aktivovaných zabijakov „LAK buniek“. Je významné, že sekrécie IL-1 beta a TNFalfa sa významne znížili v reakcii na analógy v porovnaní s prirodzenou IL-2 molekulou. Aminokyselinové zvyšky opísané v tejto prihláške sú tie zvyšky, ktoré by mali špecificky interagovať s IL-2R alfa (p55); eliminácia interakciou s IL-2R alfa vedie k zníženiu aktivity na bunkách nesúcich vysoko afmitný receptor pre IL-2 a nemala by ovplyvniť aktivitu buniek nesúcich stredne afmitný receptor pre IL-2. Tak by sa mala udržať tvorba LAK buniek (o ktorých sa predpokladá, že pochádzajú z NK buniek). Tu opísaní mutanti sa týkajú aminokyselinových zvyškov 20, 88 a 126; predpokladá sa, že tieto aminokyseliny špecificky interagujú s IL-2R (p75; pozícia 20 a 88) a IL-2R gama (nebolo známe v dobe podania patentu od Grimma a kol., pozícia 126). V dôsledku toho zostávajú interakcie s IL-2R alfa nezmenené. Mechanisticky by mutanti opísaní Grimmom a kol. mali znižovať interakcie s vysoko afinitným receptorom pre IL-2, ale nemali by mať vplyv na interakcie s receptorom pre IL-2 so strednou afinitou; mutanti opísaní v predkladanom vynáleze by mali mať opačné charakteristiky - mali by mať zvýšenú schopnosť interakcie s receptorom pre IL-2 so strednou afinitou (1L-2R beta gama) a mali byť mať malý alebo žiaden defekt funkčných interakcií s receptorom pre IL-2 s vysokou afinitou (IL-2R alfa beta gama).

U.S. patent č. 5 206 344 (Goodson a kol.) opisuje mutantov IL-2, v ktorých je jeden z aminokyselinových zvyškov zrelej prirodzenej sekvencie IL-2 nahradený cysteínovým zvyškom, ktoré sú potom pripravené a konjugované prostredníctvom cysteínového zvyšku s polymérom vybraným z homopolymérov polyetylénglykolu alebo polyetoxylovaných polyolov, kde homopolyméry sú nesubstituované alebo substituované na jednom konci alkylovou skupinou. Títo mutanti sú pripravení expresiou mutantných génov v hostiteľovi, kde tieto mutantné gény boli pripravené z génov pôvodných proteínov miestne cielenou mutagenézou. Ďalej, iné druhy IL-2 môžu byť konjugované prostredníctvom cysteínového zvyšku v pozícii 125 zrelého IL-2 proteínu, ktorá nie je nutná pre biologickú aktivitu IL-2. Nie je tu uvedený opis mutácií, ktoré spôsobujú zníženú toxicitu.

U.S. patent č. 4 959 314 (Lin a kol.) opisuje mutantov biologicky aktívnych proteínov, ako je IFN-beta a IL-2, v ktorých boli cysteínové zvyšky, ktoré nie sú zásadné pre biologickú aktivitu, deletované alebo nahradené inými aminokyselinami na účely eliminácie miest pre intermolekulové zosieťovanie alebo tvorbu nesprávnych intermolekulových disulfidových mostíkov. Títo mutanti boli pripravení bakteriálnou expresiou mutantných génov kódujúcich mutantné proteíny, kde tieto mutantné gény boli pripravené z génov pôvodných proteínov oligonukleotidmi riadenou mutagenézou. Nie je tu uvedený opis mutácií, ktoré spôsobujú zníženú toxicitu.

U.S. patent č. 5 116 943 (Halenbeck a kol.) opisuje, že biologicky aktívny referenčný terapeutický proteín je chránený pred oxidáciou spôsobom obsahujúcim substitúciu konzervatívnych aminokyselín za každý metionylový zvyšok citlivý na oxidáciu chlóramínom T alebo peroxidom, kde ostatné, necitlivé metionylové zvyšky nie sú substituované. Takto pripraveným mutantom rezistentným na oxidáciu je výhodne ľudský mutant interleukínu 2 alebo interferónu beta a konzervatívnou aminokyselinou je najlepšie alanín. Nie je tu uvedený opis mutácií, ktoré spôsobujú zníženú toxicitu.

U.S. patent č. 4 853 332 (Mark a kol.) sa týka mutantov IL-2 a IFN-gama, v ktorých boli cysteínové zvyšky, ktoré nie sú zásadné pre biologickú aktivitu, deletované alebo nahradené inými aminokyselinami na účely eliminácie miest na intermolekulové zosieťovanie alebo tvorbu nesprávnych intermolekulových disulfidových mostíkov. Patent opisuje, že substitúcia cysteínu 125 serínom v IL-2 vedie k vzniku mutantu s aktivitou porovnateľnou s prirodzeným IL-2.

U.S. patent č. 5 696 234 (Zurawski a kol.) sa týka mutantov cicavčích cytokínov a spôsobov na vyhľadávanie agonistov a antagonistov cicavčích cytokínov. Presnejšie, preukázalo sa, že ľudský dvojitý mutant IL-2 P82A/Q126D má antagonistickú aktivitu na myších Baf3 bunkách súčasne transfektovaných ľudskou alfa a beta podjednotkou IL-2R. Je uvedená slabá agonistická aktivita. Tiež je uvedené, že mutanti myšieho IL-2 vykazujú čiastočne agonistickú a antagonistickú aktivitu na HT2 bunky, hlavne Q141D, Q141K, Q141V a

Q141 L. Nie sú opísané žiadne aktivity mutantov, ktoré by vykazovali alebo naznačovali selektívne agonistické účinky pre mutácie v pozíciách 20, 88 a 126.

Zurawski a kol. opisujú mutantov myšieho IL-2, ktorí sú aktívni na bunkách exprimujúcich IL-2R alfa beta gama, ale inaktívni na bunkách exprimujúcich IL-2R beta gama (Zurawski, G., Trends Biotechnol., 9, 250 - 257 (1991); Zurawski, S. M. a Zurawski, G., EMBO J., 11, 3905-3910 (1992)). Mutanti myšieho IL-2, ktorí majú tieto vlastnosti, majú substitúcie Asp-34 na Ser alebo Thr a Gin-141 na Lys. Asp-34 a Gin-141 myšieho IL-2 sa zdajú byť ekvivalentmi Asp-20 a Gin-141 ľudského IL-2, v príslušnom poradí. Hoci sa tieto práce týkajú „selektívneho agonistu“ IL-2, neopisujú, že by boli menej toxické, ale skôr ich opisujú ako potenciálnych antagonistov endogénneho, IL-2.

EP 0 267 795 A2 (Zurawski a kol.) opisuje rôznych mutantov myšieho IL-2 vrátane niektorých mutantov obsahujúcich delécie a/alebo substitúcie v prvých tridsiatich N-koncových aminokyselinových zvyškoch, ktoré sú biologicky kompetentné, ale táto práca neobsahuje, neuvádza ani nenaznačuje tu opísané aminokyselinové substitúcie v ekvivalentných zvyškoch myšieho IL-2. Existuje potreba vylepšenej IL-2 molekuly, ktorá by mala nižšiu toxicitu a ktorá by bola lepšie tolerovaná.

Taniguchi a kol., U.S. 4 738 927 opisuje rekombinantnú DNA, ktorá obsahuje rekombinantnú DNA kódujúcu polypeptid majúci biologickú aktivitu IL-2, kde uvedenou aktivitou je navodenie rastu bunkovej línie cytotoxických T- lymfocytov a DNA vektor schopný propagácie v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách, kde kódujúca sekvencia uvedeného génu je umiestnená v pozícii za promótorovou sekvenciou, kde uvedený polypeptid je tvorený celkom 132 až 134 aminokyselinami v aminokyselinovej sekvencií polypeptidu. Tiež sú opísané gény, rekombinantné DNA vektory, hostiteľské bunky a spôsoby rekombinantnej produkcie prirodzeného IL-2. Taniguchi a kol. neopisujú akékoľvek varianty alebo mutantov a neuvádzajú, ktoré pozície v proteíne sú zodpovedné za prenos signálu alebo väzobnú aktivitu.

Je jasné, že sú potrební mutanti IL-2, ktorí nevykazujú toxicitu obmedzujúcu dávku súčasných mutantov IL-2, aby bolo možné využiť terapeutický potenciál tohto cytokínu.

Podstata vynálezu

Predmetom tohto vynálezu je muteín ľudského interleukínu 2 (IL-2) očíslovaný podľa prirodzeného typu II-2, kde muteín ľudského IL-2 je substituovaný vzhľadom na prirodzený typ v aspoň jednej z pozícií 20, 88 alebo 126, kde substitúcia v pozícii 20 je vybratá z izoleucínu alebo histidínu a kde substitúcia v pozícii 88 je vybratá z arginínu alebo izoleucínu alebo glycínu a kde substitúcia v pozícii 126 je leucín a pričom muteín ľudského IL-2 prednostne aktivuje T lymfocyty vzhľadom na bunky prirodzeného zabijaka.

Predmetom tohto vynálezu je farmaceutický prostriedok, ktorého podstata spočíva v tom, že obsahuje muteín definovaný skôr v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom.

Predmetom tohto vynálezu je ďalej polynukleotid obsahujúci DNA sekvenciu kódujúcu muteín definovaný skôr a jeho degenerované varianty.

Predmetom tohto vynálezu je rovnako vektor obsahujúci polynukleotid definovaný skôr.

Predmetom tohto vynálezu je tiež prokaryotická hostiteľská bunka transformovaná už uvedeným vektorom.

Predmetom tohto vynálezu je konečne použitie muteínu definovaného skôr, na výrobu lieku na liečenie cicavca postihnutého stavom liečiteľným IL-2, pričom stav liečiteľný IL-2 je vybraný zo súboru zahrnujúceho HIV, nádory vrátane karcinómu obličiek a malígneho melanómu, autoimunitné ochorenia, infekčné ochorenia, imunodeficiencie vrátane SCID alebo iných terapeutických aplikácií vyžadujúcich celkovú stimuláciu imunitného systému.

Ďalej sa opisujú detaily predmetného vynálezu. Sú tiež uvedené údaje, ktoré majú ukázať celú šírku nájdeného riešenia a tiež porovnávacie údaje.

Vynález sa všeobecne zameriava na polypeptid obsahujúci mutant ľudského IL-2 očíslovaný podľa prirodzeného IL-2, kde uvedený ľudský IL-2 je substituovaný aspoň v pozíciách 20, 88 alebo 126, kde uvedený mutant prednostne aktivuje T lymfocyty vzhľadom na NK bunky. Vynález poskytuje menej toxický mutovaný IL-2, ktorý umožňuje väčšie terapeutické využitie tohto interleukínu.

Zo všeobecného hľadiska sa riešenie zameriava na mutantný IL-2 obsahujúci jednu mutáciu v pozíciách aspartát 20, asparagín 88 a glutamín 126. Konkrétni mutanti sú reprezentovaní skratkami D20X, N88X a Q126X, kde „X“ je špecifická aminokyselina, ktorá po substitúcii v ľudskom IL-2 spôsobuje selektívnu aktivitu pre bunky exprimujúce IL-2R alfa beta gama receptor (napríklad T lymfocyty) vzhľadom na bunky exprimujúce IL-2R beta gama receptor (napríklad NK bunkám). Medzi mutantov vykazujúcich viac ako 1 000násobnú selektivitu patria D20H, D20I, N88G, N88I, N88R a Q126L. Konkrétne, títo mutanti tiež pôsobia na T lymfocyty v podstate aktivitou prirodzeného IL-2. Sú identifikované tiež ďalšie mutácie, ktoré spôsobujú selektivitu nižšiu ako 1 000-násobnú, ale vyššiu ako 10-násobnú.

Vynález tiež obsahuje polynukleotidy kódujúce mutantov, vektory obsahujúce polynukleotidy, transfor4 mované hostiteľské bunky, farmaceutické prostriedky obsahujúce mutantov. Sú tiež opísané terapeutické spôsoby liečenia s použitím mutantov.

Vynález sa tiež týka spôsobu selekcie mutantov IL-2 pomocou testu využívajúceho IL-2 alfa beta gama v porovnaní s IL-2R beta gama, kde aktivita mutantného IL-2 je zvýšená vzhľadom na aktivitu prirodzeného IL-2 v jednom teste viac ako v druhom. IL-2R alfa beta gama a IL-2R beta gama sú vhodné kombinácie ektodomén receptorových podjednotiek a používajú sa na priame meranie väzby mutantných IL-2 pre každý receptorový komplex. IL-2R alfa beta gama test využíva odpovede buniek nesúcich IL-2 alfa beta gama a IL-2 beta gama test využíva odpovede buniek nesúcich IL-2 beta gama. Bunkou nesúcou IL-2 alfa beta gama je PHA-blast a bunkou nesúcou IL-2 beta gama je NK bunka. Testom je proliferácia buniek nesúcich IL-2 alfa beta gama a IL-2 beta gama.

Vynález sa tiež týka vektora obsahujúceho polynukleotid kódujúci mutant podľa predkladaného vynálezu, ktorý riadi expresiu mutantného ľudského IL-2 majúceho aktivačnú aktivitu pre PHA-blasty, ale zníženú aktivačnú aktivitu pre NK bunky, kde uvedený vektor sa môže transfektovať do cieľového organizmu, a potom môže in vivo exprimovať uvedený mutantný ľudský IL-2 kódovaný uvedeným polynukleotidom.

Vynález tiež umožňuje liečenie pacienta postihnutého ochorením liečiteľným IL-2, pri ktorom sa uvedenému pacientovi podá terapeuticky účinné množstvo mutantného ľudského IL-2 číslovaného podľa prirodzeného IL-2 majúceho aktivačnú aktivitu pre PHA-blasty, ale zníženú aktivačnú aktivitu pre NK bunky. Tento spôsob je použiteľný vtedy, keď je ochorením liečiteľným IL-2 HIV, nádor, autoimunitné ochorenie, infekčné ochorenie, pri vykonávaní protinádorovej vakcinácie, kde sa používa ako adjuvans a pri bežnej vakcinácii, na imunitnú stimuláciu v starobe alebo u inak imunokompromitovaných pacientov, rovnako ako u ľudských pacientov so SCID alebo pri iných terapeutických aplikáciách vyžadujúcich stimuláciu imunitného systému.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 až 7 ukazujú krivky dávka - odpoveď pre prirodzený ľudský IL-2 (IL-2) a D20H (obr. 1), IL-2 a D20I (obr. 2), IL-2 a N88G (obr. 3), IL-2 a N88I (obr. 4), IL-2 a N88R (obr. 5), IL-2 a Q126E (obr. 6), IL-2 a Q126L (obr. 7). A: jednotlivé krivky závislosti od dávky IL-2 (plné krúžky) a mutantného proteínu (prázdne krúžky) pre test proliferácie primárnych ľudských T lymfocytov (PHA blastov). B jednotlivé krivky závislosti od dávky IL-2 (plné trojuholníčky) a mutantného proteínu (prázdne trojuholníčky) pre test proliferácie primárnych ľudských N K buniek.

Obr. 8A - 8D. Toxicita Proleukínu™ u šimpanzov sa hodnotila na dvoch zvieratách (X-159, trojuholníčky a X-124, štvorčeky), v porovnaní s kontrolným vehikulom (X-126, kosoštvorce). Toxicita sa hodnotila podľa renálnych parametrov (dusíkaté metabolity v krvi (BUN). A) Kreatinín, B) a pečeňových funkcií (celkový bilirubín, C: ALT, D).

Obr. 9. Graf zmeny telesnej hmotnosti v priebehu 30 dní. Telesná hmotnosť zvierat liečených IL-2/N88R (trojuholníčky), Proleukínom (štvorčeky) alebo vehikulom (kosoštvorce) sa merala v uvedené dni.

Obr. 10A - 10D. V uvedené dni sa hodnotil počet lymfocytov (A), celkový počet leukocytov (B), neutrofilov (C) a trombocytov (D) u zvierat liečených IL- 2/N88R (trojuholníčky), Proleukínom (štvorčeky) alebo vehikulom (kosoštvorce).

Obr. 11A - 11 D. V uvedené dni sa hodnotila močovina (A, BUN), kreatinín (B), fosfor (C) a aniónová medzera (D) u zvierat liečených IL-2/N88R (trojuholníčky), Proleukínom (štvorčeky) alebo vehikulom (kosoštvorce).

Obr. 12A - 12D. V uvedené dni sa hodnotil celkový bilirubín (A), ALT (B), fibrinogén (C) a aktivovaný protrombínový čas (D) u zvierat liečených ÍL- 2/N88R (trojuholníčky), Proleukínom (štvorčeky) alebo vehikulom (kosoštvorce).

Obr. 13A - 13D. V uvedené dni sa hodnotili koncentrácie sodíka (A), chloridov (B), vápnika (C) a draslíka (D) v krvi zvierat liečených IL-2/N88R (trojuholníčky), Proleukínom (štvorčeky) alebo vehikulum (kosoštvorce).

Obr. 14A - 14C. V uvedené dni sa hodnotili koncentrácie albumínu (A), hematokrit (B) a hemoglobín (C) v krvi zvierat liečených IL-2/N88R (trojuholníčky), Proleukínom (štvorčeky) alebo vehikulom (kosoštvorce).

Obr. 15A - 15B. Sú uvedené vplyvy IL-2/N88R (štvorčeky), Proleukínu (kosoštvorce) a vehikula (trojuholníčky) na celkovú populáciu T lymfocytov (A, CD3+ bunky), populáciu CD4+ T lymfocytov (B) a na populáciu CD8+ T lymfocytov.

Obr. 16A - 16B. Sú uvedené vplyvy IL-2/N88R (štvorčeky), Proleukínu (kosoštvorce) a vehikula (trojuholníčky) na celkovú populáciu T lymfocytov (A, CD3+ bunky), populáciu CD4+ T lymfocytov (B) a na populáciu CD8+ T lymfocytov.

Obr. 17. Efekt IL-2/N88R a Proleukínu na aktiváciu T lymfocytov s ohľadom na priemer fluorescencie CD25 pozitívnych buniek. Vplyv IL-2/N88R (štvorčeky), Proleukínu (kosoštvorce) a vehikula (trojuholníčky) je uvedený pre populáciu CD3+, CD4+ T lymfocytov. Na hodnotenie priemernej fluorescencie tejto po5

SK 288100 Β6 pulácie sa nezískal dostatočný počet CD3+/CD8+ buniek.

Obr. 18A - 18B. Sú uvedené vplyvy IL-2/N88R (štvorčeky), Proleukínu (kosoštvorce) a vehikula (trojuholníčky) na populáciu CD4+ T lymfocytov (A, CD3+/CD4+ bunky), populáciu CD8+ T lymfocytov (B, CD3+/CD8+ bunky) a na populáciu všetkých T lymfocytov (C, CD3+ bunky) a na populáciu NK buniek (D, CD3-/CD16+ bunky).

Obr. 19. Graf pľúcnych metastáz vzhľadom na dávku u myší liečených Proleukínom (prázdne kolieska) alebo IL-2/N88R (plné kolieska). Pľúcne metastázy sa spočítali pri skončení štúdie.

Obr. 20. Plazmidová mapa IL-2/N88R vektoru pBClIL2SA.

Opis výhodných uskutočnení

A. Všeobecná časť

Účinok IL-2 na T lymfocyty je sprostredkovaný väzbou na IL-2 receptorové proteiny. Rôzne bunkové povrchové proteiny na T lymfocytoch viažu IL-2. Prvým identifikovaným receptorom je jeden polypeptid, označený IL-2R alfa, ktorý je 55 kD polypeptid (p55), ktorý sa objavuje po aktivácii T lymfocytov a ktorý sa pôvodne označil Tac (podľa T aktivácie) antigén. IL-2R alfa viaže IL-2 s K_d približne 10'⁸ M a je tiež známy ako „nízko afmitný“ IL-2 receptor. Väzba IL-2 na bunky exprimujúce iba IL-2R alfa nevedie k žiadnej detekovateľnej biologickej odpovedi.

Druhým IL-2 receptorom je väzobný komplex zložený z IL-2Rb a IL-2Rg, IL-2Rg, 64 kD polypeptid, je tiež známy ako spoločný gama (gama_c) reťazec, pretože je spoločný pre mnoho receptorov pre cytokíny. IL-2Rb má veľkosť približne 70 - 75 kD (preto sa označuje ako p70 alebo p75) a patrí do rodiny cytokínových receptorov typu I, ktorá je charakterizovaná motívom dva proteíny/WSXWS. IL-2R beta je exprimovaný súčasne s gama,;. Afinita väzby IL-2 na 1L-2R gama_c je vyššia ako afinita väzby na IL-2R alfa, s Kj približne 10’⁹ M; tiež sa označuje ako „stredne afmitný“ receptor pre IL-2. IL-2 spôsobuje rast buniek exprimujúcich IL-2Rbeta gamac a polovica maximálnej stimulácie rastu sa vyskytuje pri rovnakej koncentrácii IL-2, ktorá spôsobuje polovicu maximálnej väzby (t.j. 1 x 10'⁹ M). IL-2R beta gamac je signálny receptorový komplex, ktorý môže viazať IL-15.

Tretí známy IL-2 receptorový komplex je IL-2R alfa gama_c komplex. Bunky, ktoré exprimujú tak IL-2R alfa, ako aj IL-2R beta gamac, môžu viazať IL-2 oveľa pevnejšie s K_d približne 10'¹¹ M, a preto je tento komplex tiež známy ako „vysoko afmitný“ komplex. Stimulácia rastu takýchto buniek prebieha pri podobne nízkych koncentráciách IL-2. Tak väzba IL-2, ako aj stimulácia rastu môžu byť blokované protilátkami proti IL2R alfa, IL-2R beta alebo gama_c, a najúčinnejšie kombináciou protilátok k viacerým podjednotkám receptoru. Tieto pozorovania naznačujú, že IL-2R alfa tvorí komplex s IL-2R beta gamac, čo zvyšuje afinitu signálneho receptoru k IL-2, a tak umožňuje dodanie rastového signálu pri významne nižších koncentráciách IL-2. Predpokladá sa, že IL-2 sa najprv rýchlo viaže na IL-2R alfa a táto väzba uľahčuje asociáciu s IL-2R beta gama_c. Pokojné T lymfocyty exprimujú IL-2R beta gama„ ale iba malé množstvá IL-2R alfa; zvýšenie povrchovej expresie IL-2R alfa sa môže stimulovať IL-2. Pri aktivácii T lymfocytov sprostredkovanej receptorom pre antigén sa rýchlo exprimuje IL-2R alfa, čo znižuje koncentráciu IL-2 potrebnú na stimuláciu rastu. Väzba IL-2 na IL-2R beta gamac komplex vedie k prenosu signálu Jak/STAT signalizačnou dráhou.

Objavili sme mutantov ľudského IL-2, ktorí prednostne aktivujú T lymfocyty (PHA blasty; bunky, ktoré exprimujú vysoko afmitný receptor pre IL-2 - IL-2R beta gama) pred NK bunkami (bunky, ktoré exprimujú stredne afmitný receptor pre IL-2 - IL-2R beta gama). Mutanti sa substitúciou Asp-20 za histidín (D20H) alebo izoleucín (D20I), Asn-88 za arginín (N88R), glycín (N88G) alebo izoleucín (N88I) alebo Gln-126 za leucín (Q126L) alebo glutamát (G126E) vykazujú nečakane úplnú aktivitu IL-2 na PHA blastoch a slabú (ak vôbec nejakú) aktivitu na NK bunky. Predchádzajúce štúdie mutovaných ľudských IL-2 spočívali v analýze myších bunkových systémov a keď sa použili ľudské bunky, tak sa nepoužili bunky exprimujúce iba IL-2R beta gama (ako sú NK bunky). Ďalej, štúdie využívajúce ľudské PHA blasty ukázali, že substitúcia Asp-20 (Leu, Arg, Asp alebo Lys; Xu a kol., Eur. Cytokine Netw., 6, 237 - 255 (1995) alebo Gln-126 (Asp; Buchli a Ciardelli, Árch. Biochem. Biophys., 307, 2, 411 - 415 (1993)) viedli k zisku mutantných ľudských IL-2 majúcich vážne narušenú aktivitu. Predchádzajúce štúdie vykonané s použitím myšieho IL-2 identifikovali mutované myšie IL-2 majúce rôzne aktivity (Zurawski a kol., EMBO J., 12, 5113-5119 (1993)), ale žiadna z mutácií neviedla k výsledkom, ktoré by boli podobné výsledkom získaným v predkladanom vynáleze. Mutantné ľudské IL-2 obsahujúce identické mutácie v synonymných pozíciách s mutantným myším IL-2 nemali podobné aktivity, a preto sa zdá, že myšie príklady nie sú použiteľné na predpovedanie fúnkcie ľudských mutantov. Vynálezcom nie sú známe žiadne štúdie mutovaných ľudských IL-2 porovnávajúce relatívne aktivity na ľudských bunkách exprimujúcich IL-2 receptor IL-2R alfa beta gama (napríklad PHA-blastoch) a na bunkách exprimujúcich IL-2 receptor 1L-2R beta gama (napríklad NK bunkách). Predpokladá sa, že analýza in vivo potvrdí, že opísaní mutanti majú lepší terapeutický index in vivo oproti prirodzenému ľudskému IL-2 z dôvodov zníženej toxicity, čo umožňuje získať terapeuticky použiteľné prostriedky na liečenie ochorení vyžadujúcich stimuláciu imunitného systému.

SK 288100 Β6

Interleukín 2 (IL-2) sa v súčasnosti používa klinicky na liečenie metastázujúceho karcinómu ľadvín. Ale, jeho závažná toxicita obmedzuje jeho použitie iba na podskupinu najzdravších pacientov a toxicita limitujúca dávku znižuje jeho celkovú účinnosť. Predpokladá sa, že akútna toxicita IL-2 je sprostredkovaná aktiváciou NK buniek, zatiaľ čo jeho účinnosť je sprostredkovaná priamou aktiváciou T lymfocytov (Jacobson a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (United States), 17. sept., 1996, 93, 19,10405 - 10410; Smith, K. A., Blood, 1993, 81, 6, str. 1414 - 1423; Kaplan a kol., Biotechnology, 10, 2, 157 - 162). T lymfocyty exprimujú iný receptor pre IL-2 ako NK bunky (T lymfocyty: IL-2R alfa beta gama, vysoko afmitný receptor pre IL-2; NK bunky, IL-2R beta gama, stredne afmitný receptor pre IL-2). Tu opísaní mutanti ľudského IL-2 selektívne aktivujú receptor pre IL-2 T lymfocytov a nie receptor pre IL-2 NK buniek.

Terapia nízkymi dávkami IL-2 sa použila s určitým úspechom na prekonanie priamej aktivácie NK buniek (Jacobson a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 10405 - 10410). Táto stratégia využívala teóriu, že pri nízkych dávkach IL-2 sa aktivuje iba vysoko afmitný receptor pre IL-2 a nie receptor pre IL-2 so strednou afinitou. Forma receptoru pre IL-2 so strednou afinitou, IL-2R beta gama, je exprimovaná iba na NK bunkách, zatiaľ čo T lymfocyty exprimujú vysoko afinitnú formu, IL-2R alfa beta gama.

Ale vynálezcovia riešia problémy toxicity iným spôsobom. Narušenie interakcií IL-2 s IL-2R beta a/alebo IL-2R gama pomocou modifikácie špecifických väzobných zvyškov na väzobnom povrchu IL-2 by malo zabrániť účinnej väzbe (a preto aktivácii) buniek exprimujúcich iba IL-2R beta gama. Ale na bunkách exprimujúcich IL-2R alfa beta gama stále prebieha počiatočná väzba na IL-2R alfa, a tak väzba na bunky, a preto môže terapia nízkymi dávkami navrhnutá Jacobsonom a kol. stále ešte vykazovať toxické vedľajšie účinky. Z dôvodu väzby na IL-2R alfa môže na bunkovom povrchu prebehnúť účinná aktivácia IL-2R beta a IL-2R gama, i napriek narušenej interakcii modifikovaného IL-2 s IL-2R beta a/alebo IL-2R gama. Tak sa môže vytvoriť komplex IL-2/ IL-2R alfa beta gama schopný prenosu signálu. Variant IL-2 môže byť schopný selektívne aktivovať vysoko afinitné receptory pre IL-2 na T lymfocytoch prednostne pred stredne afinitnými receptormi pre IL-2 na NK bunkách, a preto môže podľa našich predpokladov mať zvýšený terapeutický index vzhľadom na prirodzený IL-2 z dôvodov zníženej toxicity. Variant IL-2 so zvýšeným terapeutickým indexom by mal mať výrazne širší rozsah použitia tak pri liečení nádorov (ako priame a/alebo pomocné liečenie), ako aj pri liečení imunodeficiencií (ako je napríklad HIV, tuberkulóza). Ďalšie potenciálne využitia IL-2 sú odvodené od jeho imunostimulačnej aktivity a zahrnujú spolu s priamym liečením nádorov, imunodeficiencií ako je HIV alebo ľudská SCID tiež liečenie infekčných ochorení, ako je tuberkulóza; použitie ako adjuvans, v „protinádorovej vakcíne“ a použitie pri stimulácii imunitného systému, ako je napríklad štandardná vakcinácia alebo liečenie starých chorých.

Vhodné substitúcie v Asp-20, Asn-88 alebo Gin-126 redukujú väzobné interakcie s IL-2R beta (Asp-20 a Asn-88) alebo IL-2R gama (Gin-126). Každá substitúcia vedie k vzniku mutantov IL-2, ktorí si zachovávajú svoju aktivitu na T lymfocyty a ktorí majú zníženú aktivitu na ľudské NK bunky.

Pretože nie je možné predvídať vplyv danej substitúcie pred hodnotením v testoch na NK a T bunkách, vykonali sa všetky možné substitúcie prirodzených aminokyselín (okrem Cys) v pozíciách Asp-20, Asn-88 a Gin-126 a obmedzená, ale rôznorodá súprava mutácií sa vykonala v pozícii Asp-84 kvôli testovania toho, či títo mutanti interagujú s IL-2R beta. Ďalšie mutácie v pozícii Asp-84 sa testovali vtedy, keď sa pozoroval ich zreteľný efekt na interakcie s IL-2R beta. Dáta pre 46 samostatných substitúcií v týchto pozíciách sú uvádzané v tabuľke 1, ďalej.

Mutácie boli pripravené s použitím miestne cielenej mutagenézy na prirodzenej ľudskej cDNA pre IL-2. Správne klony boli subklonované do expresného vektoru vhodného na expresiu v heterológnom systéme (napríklad E. coli, bakulovíruse, kvasinkách alebo cicavčích bunkách, ako sú napríklad ovariálne bunky čínskeho škrečka (CHO)). Prečistené proteiny sa testovali v teste proliferácie T-lymfocytov (PHA blastov) a teste proliferácie NK buniek. Rôzne reakcie vyvolané jednotlivými mutantmi v týchto dvoch testoch, t. j. EC₅₀, ukázali mutácie, ktoré majú tieto aktivity. Presnejšie, mutanti, ktorí stimulujú relatívne silnejšiu reakciu v teste na PHA-blastoch (T lymfocytoch) (oproti prirodzenému IL-2) v porovnaní s reakciou v teste na NK bunkách (oproti prirodzenému IL-2) budú ukazovať na substitúcie, ktoré dodávajú bunkovú špecifickú založenú na schopnosti väzby špecifických mutantov na IL-2R alfa beta gama a aktiváciu IL-2R alfa beta gama exprimovaného na týchto bunkách, ale na neschopnosť viazať sa na - a tak aktivovať - bunky exprimujúce iba IL-2R beta gama. Mutanti IL-2 vykazujúci túto vlastnosť budú preto in vivo mať imunostimulačné vlastnosti so zníženou toxicitou spojenou s terapiou IL-2 v zmysle vyššej priepustnosti kapilár a hypotenzie.

B. Definície

Uloženie CHO bunkovej línie použitej na produkciu rekombinantného proteinu podľa predkladaného vynálezu sa vykonalo v ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, 5. 5. 1999, pod prírastkovým číslom:_. Pretože uložený kmeň sa uložil za podmienok Budapeštianskej zmluvy, je dostupný patentovým úradom, ktoré sú signatármi Budapeštianskej zmluvy.

Ako je tu použitý, označuje termín „prirodzený IL-2“ IL-2, či prirodzený alebo rekombinantný, ktorý sa skladá zo 133 aminokyselinovej bežnej sekvencie prirodzeného ľudského IL-2 (bez signálneho peptidu, ktorý

SK 288100 Β6 sa skladá z ďalších 20 N-koncových aminokyselín), ktorého aminokyselinová sekvencia je opísaná vo Fujita a kol., PNAS USA, 80, 7437 - 7441 (1983), s ďalším alebo bez ďalšieho N-koncového metionínu, ktorý sa musí použiť vtedy, ak je proteín exprimovaný ako intraceluláma frakcia v E. coli.

Ako je tu použitý, označuje termín „mutantný IL-2“ polypeptid, v ktorom sa vykonali špecifické substitúcie vzhľadom na zrelý ľudský interleukín-2. Tabuľka 1 ďalej opisuje 46 jednotlivých pripravených substitúcií v IL-2 a ich príslušnú aktivitu. Výhodnými vyhotoveniami sú tí mutanti, ktorí majú aspoň 100-násobnú relatívnu aktivitu. Najviac výhodnými vyhotoveniami sú tí mutanti, ktorí majú aspoň 1 000-násobnú relatívnu aktivitu: aspartátový (Asp) zvyšok (D) v pozícii 20 („D20“), pri číslovaní podľa prirodzeného IL-2, je substituovaný izoleucínom („D20I“) alebo histidínom („D20H“); asparagínový zvyšok (Asn) v pozícii 88 (N88) je substituovaný izoleucínom (N88I), glycínom (N88G) alebo arginínom (N88R) a glutamínový zvyšok (Gin) v pozícii 126 (Q126) je substituovaný leucínom (Q126L), glutamátom (Q126E) alebo aspartátom (Q126D). Výhodní IL-2 mutanti majú v ostatných nesubstituovaných zvyškoch aminokyselinovú sekvenciu identickú s prirodzeným IL-2. Ale mutanti IL-2 podľa predkladaného vynálezu sa môžu tiež charakterizovať aminokyselinovými inzerciami, deléciami, substitúciami a modifikáciami v jednom alebo viacerých miestach v alebo na iných zvyškoch prirodzeného reťazca IL-2 polypeptidu. Podľa predkladaného vynálezu môže akákoľvek takáto inzercia, delécia, substitúcia a modifikácia viesť k vzniku mutanta IL-2, ktorý si zachováva selektívnu aktivitu pre PHA blasty a zároveň má zníženú schopnosť aktivovať NK bunky a patrí do rozsahu predkladaného vynálezu.

Kombinovanie výhodných alebo najmä výhodných substitúcií opísaných skôr v jednej rekombinantnej molekule IL-2 môže viesť ku kombinovaným mutantom majúcim aktivitu podobnú aktivite opísanej pre mutantov s jednou mutáciou. Napríklad sa môže predpokladať, že molekula IL-2 obsahujúca kombináciu dvoch alebo viacerých mutácií vybraných z tabuľky 1 môže byť agonistom IL-2 selektívnym pre T lymfocyty s relatívnou aktivitou podobnou relatívnej aktivite jednotlivých tu opísaných substitúcií. Kombinovaní mutanti patria do rozsahu predkladaného vynálezu.

Uprednostňujeme konzervatívne modifikácie a substitúcie v iných pozíciách IL-2 (t. j. také, ktoré majú minimálny vplyv na sekundárnu a terciámu štruktúru mutantu). Medzi takéto konzervatívne substitúcie patria substitúcie opísané v Dayhoff: The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978) a v Argos, EMBO J., 8, 779 - 785 (1989). Napríklad aminokyseliny patriace do jednej z nasledujúcich skupín predstavujú konzervatívne zmeny:

- ala, pro, gly, gin, asn, ser, thr,

- cys, ser, tyr, thr,

- val, ile, leu, met, ala, phe,

- lys, arg, his,

- phe, tyr, trp, his, a

- asp, glu.

Ďalej uprednostňujeme modifikácie a substitúcie, ktoré nevkladajú miesta na ďalšie intermolekulové zosieťovanie alebo nesprávnu tvorbu disulfidových väzieb. Napríklad je známe, že IL-2 obsahuje tri cys zvyšky, v pozíciách 58, 105 a 125 zrelej sekvencie.

Termín „číslovanie podľa sekvencie prirodzeného IL-2“ označuje identifikáciu vybranej aminokyselinovej sekvencie s ohľadom na pozíciu, v ktorej sa aminokyselina normálne vyskytuje v zrelej sekvencii prirodzeného IL-2. Keď sú v mutantnom IL-2 vykonané inzercie alebo delécie, tak môže byť Asp, ktorý je normálne v pozícii 20, posunutý v mutantnom proteíne, ako je odborníkom jasné. Ale umiestnenie posunutého Asp sa môže ľahko určiť prehliadnutím a porovnaním susedných aminokyselín s aminokyselinami susediacimi v Asp v prirodzenom IL-2.

Termín „bunky obsahujúce IL-2R alfa beta gama receptor“ označuje bunky, o ktorých je známe, že majú receptor tohto typu, t. j. T lymfocyty, aktivované T lymfocyty, B lymfocyty, aktivované monocyty a aktivované NK bunky. Termín „bunky obsahujúce IL-2R beta gama receptor“ označuje bunky, o ktorých je známe, že majú receptor tohto typu, t. j. B lymfocyty, pokojné monocyty a pokojné NK bunky.

IL-2 mutanti podľa predkladaného vynálezu sa môžu produkovať akoukoľvek vhodnou metódou známou v odbore. Medzi takéto metódy patria konštrukcie DNA sekvencie kódujúcej IL-2 mutantov podľa predkladaného vynálezu a expresia týchto sekvencii vo vhodne transformovanom hostiteľovi. Tento spôsob produkuje rekombinantných mutantov podľa predkladaného vynálezu. Ale mutanti podľa predkladaného vynálezu sa môžu tiež produkovať, i keď menej výhodne, chemickou syntézou alebo kombináciou chemickej syntézy a rekombinantnej DNA technológie. Spôsoby vsádzkovej produkcie alebo perfúznej produkcie sú odborníkom v odbore známe. Pozri Freshey, R. I. (ed.), „Animal Celí Culture: A Practical Approach“, 2. vyd., 1992,1RL Press, Oxford, Anglicko; Mather, J. P., „Laboratory Scaleup of Celí Cultures (0,5 - 50 liters)“, Methods Celí Biology, 57, 219 - 527 (1998); Hu, W. S. a Aunins, J. G., „Large - Scale Mammalian Celí Culture“, Curr. Opin. Biotechnol., 8, 148 - 153 (1997); Konštantínov, K. B., Tsai, Y., Moles, D., Matanguihan, R., „Control of long - term perfusin Chinese hamster ovary celí culture by glucosa auxostat“, Biotechnol. Prog., 12, 100109(1996).

V jednom vyhotovení rekombinantnej metódy na produkciu mutantov podľa predkladaného vynálezu je DNA sekvencia konštruovaná izoláciou alebo syntetizovaním DNA sekvencie kódujúcej prirodzený IL-2, a potom zmenou kodónu pre Asp20 na kodón pre izoleucín (I) miestne cielenou mutagenézou. Táto technika je dobre známa, pozri napríklad Mark a kol., „Site-specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferón Gene“., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662 - 5666 (1984) a U.S. patent č. 4 588 585, ktoré sú tu uvedené ako odkazy.

Inou metódou konštrukcie DNA sekvencie kódujúcej mutantný IL-2 podľa predkladaného vynálezu je chemická syntéza. Táto napríklad zahrnuje priamu syntézu peptidu chemickými prostriedkami s použitím sekvencie kódujúcej mutantný IL-2 majúci vlastnosti podľa predkladaného vynálezu. Tento spôsob môže vkladať prirodzené i neprirodzené aminokyseliny v pozíciách, ktoré ovplyvňujú interakcie IL-2 s IL-2R beta alebo IL-2R gama. Alternatívne môže byť chemicky syntetizovaný pomocou oligonukleotidového syntezátora gén, ktorý kóduje požadovaný mutantný IL-2. Takéto oligonukleotidy sú navrhnuté podľa aminokyselinovej sekvencie požadovaného mutovaného IL-2 a výhodne s použitím tých kodónov, ktoré sa prednostne využívajú v hostiteľskej bunke, v ktorej je rekombinantný mutant exprimovaný. V tomto smere je dobre známe, že genetický kód je degenerovaný - to znamená, že aminokyselina môže byť kódovaná viac ako jedným kodónom. Napríklad Phe(F) je kódovaný dvoma kodónmi - TTC alebo TTT, Tyr(Y) je kódovaný TAC alebo TAT a his(H) je kódovaný CAC alebo CAT, Trp(W) je kódovaný jediným kodónom, TGG. V súlade s tým je jasné, že pre danú DNA sekvenciu kódujúcu určitý mutantný IL-2 bude existovať veľa degenerovaných DNA sekvencii, ktoré budú kódovať tento mutovaný IL-2. Napríklad je jasné, že okrem výhodnej DNA sekvencie pre mutant D20I uvedenej v SEQ ID č. 1 existuje mnoho degenerovaných DNA sekvencii, ktoré tiež kódujú uvedený mutantný IL-2. Tieto degenerované DNA sekvencie spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu. Preto označuje termín „degenerované varianty“ v predkladanom vynáleze všetky DNA sekvencie, ktoré kódujú, a tak umožňujú expresiu určitého mutantu.

DNA sekvencie kódujúce mutantný IL-2 podľa predkladaného vynálezu, či pripravené miestne cielenou mutagenézou, chemickou syntézou alebo inými prostriedkami, môže a nemusí tiež obsahovať DNA sekvencie kódujúce signálnu sekvenciu. Takáto signálna sekvencia, keď je prítomná, môže byť sekvenciou rozpoznávanou bunkami vybranými na expresiu mutantného IL-2. Môže ísť o prokaryotickú alebo eukaryotickú sekvenciu alebo o ich kombináciu. Môže tiež ísť o signálnu sekvenciu prirodzeného IL-2. Obsiahnutie signálnej sekvencie závisí od toho, či je žiaduce secemovať mutantný IL-2 z rekombinantných buniek, v ktorých sa syntetizoval. Pokiaľ sú vybrané bunky prokaryotické, tak je zvyčajne výhodné, aby DNA sekvencia nekódovala signálnu sekvenciu. Pokiaľ sú vybrané bunky eukaryotické, tak je zvyčajne výhodné, aby sa signálna sekvencia kódovala a najvýhodnejšie je, aby sa použila prirodzená signálna sekvencia IL-2.

Štandardné spôsoby sa môžu použiť na syntetizovanie génu kódujúceho mutantný IL-2 podľa predkladaného vynálezu. Napríklad, kompletná aminokyselinová sekvencia sa môže použiť na konštrukciu spätne translatovaného génu. Môže sa syntetizovať DNA oligomér obsahujúci nukleotidovú sekvenciu kódujúcu mutantný IL-2. Napríklad sa môže syntetizovať niekoľko malých oligonukleotidov kódujúcich časti požadovaného polypeptidu, ktoré sa môžu potom ligovať. Jednotlivé oligonukleotidy zvyčajne obsahujú 5' alebo 3' prekrývajúce sa konce na komplementárne zostavenie.

Po zostavení (syntézou, miestne cielenou mutagenézou alebo iným spôsobom) sa môže DNA sekvencia kódujúca mutovaný IL-2 podľa predkladaného vynálezu inzertovať do expresného vektoru a operatívne naviazať na sekvenciu kontrolujúcu expresiu vhodnú na expresiu mutantného IL-2 vo vybranom transformovanom hostiteľovi. Správne zostavenie sa môže potvrdiť sekvencovaním nukleotidov, reštrikčným mapovaním a expresiou biologicky aktívneho polypeptidu vo vhodnom hostiteľovi. V odbore je dobre známe, že kvôli získaniu vysokej úrovne expresie transfektovaného génu v hostiteľovi sa musí gén operatívne naviazať na sekvencie kontrolujúce transkripciu a transláciu, ktoré sú funkčné vo vybranom hostiteľovi na expresiu.

Voľba sekvencie kontrolujúcej expresiu a expresného vektora závisí od voľby hostiteľa. Môžu sa použiť rôzne kombinácie hostiteľa/vektoru. Vhodnými expresnými vektormi pre eukaryotických hostiteľov sú napríklad vektory obsahujúce sekvenciu na kontrolu expresie zo SV40, hovädzieho papiloma vírusu, adenovírusu a cytomegalovírusu. Vhodnými expresnými vektormi pre bakteriálnych hostiteľov sú známe bakteriálne plazmidy, ako sú plazmidy z E. coli vrátane col El, pCRl, pER32z, pMB9 a ich derivátov, plazmidy s väčším počtom hostiteľov, ako je RP4, fágové DNA, napríklad rôzne deriváty fágu lambda, napríklad NM989 a iné DNA fágy, ako je MI3 a filamentózne jednoreťazcové DNA fágy. Vhodnými expresnými vektormi pre kvasinky sú 2μ plazmid a jeho deriváty. Vhodným vektorom pre hmyzie bunky je pVL941. Uprednostňujeme pFastBac™ (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Čate a kol., „Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene in Animal Cells“, Celí, 45, str. 685-698(1986).

Ďalej, v týchto vektoroch sa môže použiť akákoľvek z mnohých sekvencii na kontrolu expresie. Medzi takéto použiteľné sekvencie na kontrolu expresie patria sekvencie kontrolujúce expresiu asociované so štrukturálnymi génmi uvedených expresných vektorov. Príklady použiteľných sekvencii na kontrolu expresie zahrnujú napríklad skoré a neskoré promótory SV40 alebo adenovírusu, lac systém, trp systém, TAC alebo

SK 288100 Β6

TRC systém, hlavný operátorový a promótorový región fágu lambda, napríklad PL, kontrolné regióny fd obalového proteínu, promótor pre 3-fosfoglycerát kinázu alebo iné glykolytické enzýmy, promótory kyslej fosfatázy, napríklad PhoA, promótory kvasinkového alfa-párovacieho systému, polyhedrónový promótor bakulovírusu a iné sekvencie, o ktorých je známe, že kontrolujú expresiu génov prokaryotických alebo eukaryotických buniek alebo iných vírusov a rôzne ich kombinácie.

Akýkoľvek vhodný hostiteľ sa môže použiť na produkciu mutantných IL-2 podľa predkladaného vynálezu vrátane baktérií, húb (vrátane kvasiniek), rastlín, hmyzu alebo iných vhodných živočíšnych buniek alebo bunkových línií, rovnako ako vrátane transgénnych zvierat alebo rastlín. Presnejšie, medzi týchto hostiteľov patria dobre známi prokaryotickí a eukaryotickí hostitelia, ako sú kmene E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, huby, kvasinky, hmyzie bunky ako sú bunky Spodoptera fŕugiperda (Sf9), živočíšne bunky, ako sú ovariálne bunky čínskeho škrečka (CHO) a myšie bunky, ako sú NS/O, bunky afrických makakov ako sú COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 a BNT 10 a ľudské bunky, rovnako ako rastlinné bunky, v tkanivovej kultúre. Na expresiu v živočíšnych bunkách prednostne využívame CHO bunky a COS 7 bunky v kultúrach, hlavne CHO bunkovú líniu CHO (DHFR-) alebo HKB líniu.

Je potrebné si uvedomiť, že nie všetky vektory a sekvencie na kontrolu expresie budú účinkovať rovnako dobre pri expresii DNA sekvencii podľa predkladaného vynálezu. Ani všetci hostitelia nie sú rovnako výkonní pri použití rovnakého expresného systému. Ale odborník v odbore môže vykonať výber z týchto vektorov, sekvencii na kontrolu expresie a hostiteľov bez zbytočného experimentovania. Napríklad pri výbere vektoru sa musí brať do úvahy hostiteľ, lebo vektor sa musí replikovať v hostiteľovi. Počet kópií vektoru, schopnosť kontrolovať tento počet vektorov a expresia akýchkoľvek iných proteínov kódovaných vektorom, ako sú antibiotické markéry, sa musia tiež zobrať do úvahy. Napríklad medzi vhodné vektory na použitie v predkladanom vynáleze patria tie vektory, ktoré umožňujú amplifikáciu DNA kódujúcej mutované IL-2 v určitom počte kópií. Takéto amplifikovateľné vektory sú dobre známe v odbore. Patria medzi ne, napríklad, vektory amplifikovateľné DHFR amplifikáciou (pozri napríklad Kaufman, U.S. patent 4 470 461, Kaufman a Sharp, „Construction of a Modular Dihydrofolate Reductase cDNA Gene: Analysis of Signals Utilized for Efficient Expression“, Mol. Celí. Biol., 2, str. 1304 - 1319 (1982)) alebo glutamín syntetázovou („GS“) amplifikáciou (pozri napríklad U.S. patent 5 122 464 a Európska patentová prihláška 338 841).

Pri výbere sekvencie kontrolujúcej expresiu sa musia brať do úvahy rôzne faktory. Medzi takéto faktory patria, napríklad, relatívna účinnosť sekvencie, jej kontrolovatefnosť a jej kompatibilita s DNA sekvenciou kódujúcou mutantný IL-2 podľa predkladaného vynálezu, hlavne s ohľadom na jej sekundárne štruktúry. Hostitelia by sa mali vybrať tak, aby boli kompatibilní s vybraným vektorom, musí sa brať do úvahy toxicita produktu kódovaného DNA sekvenciou podľa predkladaného vynálezu, charakteristiky ich sekrécie, schopnosť hostiteľov správne skladať proteín, ich požiadavky na fermentáciu alebo kultiváciu a ľahkosť prečistenia produktu kódovaného DNA sekvenciami.

S použitím týchto parametrov môže odborník v odbore vybrať rôzne kombinácie vektor/sekvencia kontrolujúce expresiu/hostiteľ, ktoré budú exprimovať požadované DNA sekvencie pri fermentácii alebo vo veľkoobjemovej živočíšnej kultúre, napríklad s použitím CHO buniek alebo COS 7 buniek.

Mutantné IL-2 získané spôsobom podľa predkladaného vynálezu môžu byť glykozylované alebo neglykozylované podľa toho, ktorý hostiteľský organizmus sa použil na produkciu mutantného proteínu. Ak sú ako hostitelia vybrané baktérie, tak je produkovaný mutantný IL-2 neglykozylovaný. Eukaryotické bunky, naopak, glykozylujú mutantný IL-2, hoci zrejme nie rovnakým spôsobom, ako je glykozylovaný prirodzený IL2. Mutantný IL-2 produkovaný transformovanými hostiteľmi sa môže prečistiť akýmkoľvek vhodným spôsobom. Sú známe rôzne spôsoby na prečistenie IL-2, pozri napríklad Current Protocols in Protein Science, zv. 2, ed.: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, Dávid W. Spencer, Paul T. Wingsfield, Unit 6.5 (Copyright 1997, John Wiley and Sons, Inc.). Preferujeme opätovné zloženie z inklúznych teliesok vytvorených v E. coli alebo z kondiciovaného média buď z cicavčích, alebo z kvasinkových kultúr produkujúcich daný mutantný proteín s použitím katiónovej výmeny, gélovej filtrácie alebo kvapalinovej chromatografie s reverznou fázou, pozri príklady 1 (E. coli) a 10 (perfuzia CHO buniek) uvedené ďalej.

Biologická aktivita mutantných IL-2 podľa predkladaného vynálezu sa môže hodnotiť akýmkoľvek vhodným spôsobom známym v odbore. Medzi takéto testy patrí test proliferácie PHA blastov a proliferácie NK buniek. Mutantné proteíny s vhodnou aktivitou, t. j. plne aktívne na IL-2R alfa beta gama, ale so zníženou aktivitou na bunkách nesúcich IL-2R beta gama, sa môžu zistiť s použitím týchto dvoch testov. „Relatívna aktivita“ mutantného proteínu sa meria vzhľadom na prirodzený IL-2 a ako je tu opísané ďalej v príkladoch, je pomerom aktivity v teste proliferácie PHA blastov k aktivite v teste proliferácie NK buniek.

Mutantné IL-2 podľa predkladaného vynálezu sa podávajú v dávke približne rovnakej alebo vyššej, ako je dávka používaná pri terapii prirodzeným alebo rekombinantným IL-2. Výhodne sa podá účinné množstvo mutantného IL-2. Termín „účinné množstvo“ označuje množstvo schopné zabrániť alebo zmierniť závažnosť alebo šírenie liečeného stavu alebo ochorenia. Odborníkom v odbore bude jasné, že účinné množstvo mutantného IL-2 závisí okrem iného od ochorenia, dávky, protokolu podávania mutantného IL-2, od toho, či je mutantný IL-2 podaný samostatne alebo v kombinácii s inými terapeutickými činidlami, od sérového polčasu

SK 288100 Β6 prostriedku a od celkového zdravotného stavu pacienta.

Mutantný IL-2 sa výhodne podáva v prostriedku obsahujúcom farmaceutický prijateľný nosič. „Farmaceutický prijateľný nosič“ je nosič, ktorý nespôsobuje žiadne nežiaduce účinky u pacienta, ktorému sa podáva. Takéto farmaceutický prijateľné nosiče sú dobre známe v odbore. Prednostne využívame 2 % HSA/PBS pri pH 7,0.

Mutantné IL-2 podľa predkladaného vynálezu sa môžu pripraviť vo forme farmaceutických prostriedkov s použitím dobre známych postupov, pozri napríklad Remington's Pharmaceutical Science od E. W. Martina, ktorá je tu uvedená ako odkaz a ktorá opisuje vhodné prípravky. Farmaceutický prípravok obsahujúci mutantný IL-2 môže byť v rôznej forme vrátane kvapaliny, gélu, lyofilizovanej formy alebo inej vhodnej formy. Výhodná forma závisí od konkrétneho liečeného stavu a bude zrejmá odborníkom v odbore.

Farmaceutické prípravky obsahujúce mutantný IL-2 sa môžu podať orálne, vo forme aerosólu, intravenózne, intramuskuláme, intraperitoneálne, intradermálne alebo subkutánne alebo akýmkoľvek iným prijateľným spôsobom. Výhodný spôsob podania závisí od konkrétneho liečeného stavu a bude zrejmý odborníkom v odbore. Farmaceutické prípravky mutantného IL-2 sa môžu podať spoločne s inými terapeutickými činidlami. Tieto činidlá môžu byť súčasťou rovnakého farmaceutického prípravku alebo sa môžu podať separované od mutantného IL-2, buď súčasne, alebo podľa akéhokoľvek prijateľného protokolu liečenia. Ďalej, farmaceutický prípravok mutantného IL-2 sa môže použiť ako pomocná liečba pri inej terapii.

V súlade s tým poskytuje predkladaný vynález prostriedky a spôsoby na liečenie nádorov, HIV, autoimunitných ochorení, infekčných ochorení, na použitie ako adjuvans vo vakcínach pri protinádorovej vakcinácii a bežnej vakcinácii, na imunostimuláciu v starobe alebo u inak imunokompromitovaných jedincov, rovnako ako u ľudí so SCID alebo na iné terapeutické aplikácie vyžadujúce celkovú stimuláciu imunitného systému u akéhokoľvek vhodného živočícha, výhodne u cicavca, najlepšie u človeka. Ako bolo uvedené v časti Doterajší stav techniky, má IL-2 veľa účinkov. Niektorými z týchto účinkov je stimulácia PHA blastov, pokojných T lymfocytov, B lymfocytov, monocytov a NK buniek atď.; mutantné proteíny podľa predkladaného vynálezu sú aktívne na tých bunkách, ktoré exprimujú iba vysoko afinitný receptor pre IL-2, ako sú pokojné T lymfocyty, ale nie na bunkách exprimujúcich stredne afinitný receptor pre IL-2, ako sú NK bunky alebo monocyty.

Tiež sa predpokladá použitie DNA sekvencií kódujúcich mutantný IL-2 podľa predkladaného vynálezu v génovej terapii. Predpokladaná génová terapia zahrnuje liečenie tých ochorení, pri ktorých sa predpokladá účinok terapie IL-2 sprostredkovaný jeho aktivitou na lymfocyty, ako sú napríklad nádory, HIV, autoimunitné ochorenia, infekčné ochorenia, ďalej použitie ako adjuvans vo vakcínach pri protinádorovej vakcinácii a bežnej vakcinácii, na imunostimuláciu v starobe alebo u inak imunokompromitovaných jedincov, rovnako ako u ľudí so SCID a ochorení, ktoré inak reagujú na IL-2 alebo infekčné ochorenia spôsobené činidlami, ktoré sú citlivé na imunitnú odpoveď sprostredkovanú IL-2.

Lokálne podanie mutantného IL-2 s použitím génovej terapie môže dodať terapeutické činidlo do cieľovej oblasti. Predpokladá sa použitie in vitro a in vivo metód génovej terapie. Je známych niekoľko metód na prenos potenciálne terapeutických génov do definovaných bunkových populácií, pozri napríklad Mulligan, „The Basic Science of Gene Therapy“, Science, 260, 926 - 931 (1993). Medzi tieto metódy patria:

(1) Priamy prenos génu (pozri napríklad Wolff a kol., „Direct Gene Transfer Into Mouse Muscle in Vivo“, Science, 247, 1465 - 1468 (1990).

(2) Liposómami sprostredkovaný prenos DNA (pozri napríklad Caplan a kol., „Liposome-mediated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium of Patients with Cystic Fibrosis“, Náture Med., 3, 39 - 46 (1995), Crystal, „The Gene as a Drug“, Náture Med., 1, 15 - 17 (1995); Gao a Huang, „A Novel Cationic Liposome Reagent for Efficient Transfection of Mammaliam Cells“, Biochem. Biophys. Res. Comm., 179, 280-285(1991).

(3) Retrovírusom sprostredkovaný prenos DNA (pozri napríklad Kay a kol., „In Vivo Gene Therapy of Hemophilia B: Sustained Partial Correction in Factor IX- Deficient Dogs“, Science, 262, 177 - 19 (1993); Anderson, „Human Gene Therapy“, Science, 256, 808 - 813 (1992).

(4) DNA vírusom sprostredkovaný prenos DNA. Medzi takéto vírusy patria adenovírusy (výhodne vektory na báze Ad-2 alebo Ad-5), herpes vírusy (výhodne vektory na báze herpes simplex vírusu) a parvovírusy (výhodne vektory na báze „defektných“ alebo neautonómnych parvovírusov, lepšie vektory na báze adenoasociovaného vírusu, najlepšie vektory na báze AAV-2), pozri napríklad Ali a kol., „The Use of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy“, Gene Therapy, 1, 367 - 384 (1994), U.S. patent 4 797 368, ktorý je tu uvedený ako odkaz a U.S. patent 5 139 941, ktorý je tu uvedený ako odkaz.

Voľba konkrétneho vektorového systému na prenos vybraného génu závisí od rôznych faktorov. Jedným významným faktorom je charakter populácie cieľových buniek. Hoci sa retrovírusové vektory rozsiahlo študovali a používali v mnohých aplikáciách génovej terapie, sú tieto vektory zvyčajne nevhodné na infikovanie nedeliacich sa buniek. Okrem toho majú retrovírusy onkogénny potenciál.

Adenovírusy majú výhodu v tom, že majú široký rozsah hostiteľov, môžu infikovať pokojné alebo konečne diferencované bunky, ako sú neuróny alebo hepatocyty a zdajú sa byť v podstate neonkogénne (pozri Ali a kol., vyššie, str. 367). Adenovírusy sa neintegrujú do genómu hostiteľa. Pretože sú prítomné extrachro11

SK 288100 Β6 mozomálne, je riziko inzerčnej mutagenézy značne znížené, Ali a kol., vyššie, str. 373.

Adeno - asociované vírusy majú rovnaké výhody ako vektory na báze adenovírusov. Ale AAV vykazujú miestne cielenú integráciu do ľudského chromozómu 19, Ali a kol., vyššie, str. 377.

Vo výhodnom vyhotovení sa DNA kódujúca mutantný IL-2 podľa predkladaného vynálezu použije v génovej terapii na liečenie imunodeficitov, ako je HIV infekcia; infekčných ochorení, ako je tuberkulóza, a nádorov, ako je renálny karcinóm.

V súlade s týmto vyhotovením sa génová terapia DNA kódujúcej mutantný IL-2 podľa predkladaného vynálezu podáva pacientovi súčasne s diagnózou alebo ihneď po diagnóze ochorenia.

Tento spôsob využíva výhody selektívnej aktivity mutantných IL-2 podľa predkladaného vynálezu kvôli zabráneniu nežiaducej toxicite a nežiaducim účinkom. Odborníkom v odbore bude jasné, že v tomto vyhotovení sa môže použiť akýkoľvek vhodný vektor pre génovú terapia obsahujúci DNA pre mutantný IL-2. Techniky na prípravu takýchto vektorov sú známe, pozri napríklad Anderson, W. F., Human Gene Therapy, Náture, 392, 25 - 30 (1998); Verma, I. M. a Somia, N., Gene Therapy - Promises, Problems and Prospects, Náture, 389, 239 - 242 (1998). Dodanie vektoru obsahujúceho DNA pre mutantný IL-2 do cieľového miesta sa môže vykonať s použitím akejkoľvek známej techniky.

Kvôli lepšiemu pochopeniu predkladaného vynálezu sú uvedené nasledujúce príklady. Tieto príklady sú iba ilustratívne a nijako neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu. Všetky citované publikácie sú tu uvedené ako odkazy v plnom rozsahu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Produkcia mutantných proteínov v E. coli

Mutantné proteíny boli pripravené miestne cielenou mutagenézou s použitím primérov obsahujúcich kodóny zodpovedajúce požadovaným mutáciám, v podstate s použitím spôsobu opísaného v Kunkel, T. A., Roberts, J. D. a Zakour, R. A., „Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection“ (1987), Methods Enzymol., 154, 367 - 382. Stručne, ľudská cDNA pre IL-2 obsahujúca reštrikčné miesta BamHI a Xbal bola subklonovaná do Ml3 fágového vektoru M13 mpl9 (New England Biolabs, Beverly, MA) s použitím rovnakých miest. cDNA pre prirodzený IL-2 sa získala s použitím polymerázovej reťazovej reakcie („PCR“) zo súboru cDNA pripraveného z mRNA izolovanej z ľudských lymfocytov periférnej krvi indukovaných 24 hodín forbol-12-myristát-13-acetátom (10 ng/ml). Použité PCR priméry boli pre 5' koniec otvoreného čítacieho rámca IL-2:

5'-CCT CAA CTC CTG AA TTC A TGT ACA GGA TGC-3' (SEQ ID NO: 3) a pre 3' koniec otvoreného čítacieho rámca IL-2:

5'-GGA AGC GGA TCC TTA TCA AGT CAG TGT TGA G-3' (SEQ ID NO: 4).

Reštrikčné miesta pre EcoRI (5'-koniec) a BamHI (3'-koniec) sa vložili do každého oligonukleotidu a sú uvedené kurzívou. Použité podmienky PCR boli 1 minúta pri 94 °C, 1 minúta pri 58,7 °C a 1 minúta pri 72 °C po celkovo 25 cyklov. Správnosť takto získanej cDNA sekvencie IL-2 bola potvrdená sekvencovaním s použitím Sequenase^R sekvencovacieho gitu (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL), podľa návodu výrobcu. Jednoreťazcová DNA obsahujúca uracil (U-DNA) sa získala transformáciou E. coli kmeňa CJ236 (BioRad Laboratories, Hercules, CA) M13 mpl9 obsahujúcim IL-2 cDNA. Miestne cielená mutagenéza využívala všeobecne priméry obsahujúce 15 nukleotidov homológnych k templátovej U-DNA 5' ku kodónom určeným na mutagenézu, do ktorej nukleotidov boli vkladané požadované zmeny a ďalších 10 nukleotidov homologických k templátovej U-DNA 3' od posledného zmeneného nukleotidu. Najprv bola miestne cielená mutagenéza použitá na vloženie Ncol reštrikčného miesta na začiatok zrelej sekvencie ľudského IL-2. Použitie tohto reštrikčného miesta vkladá N-koncový metionínový zvyšok, ktorý bude riadiť expresiu v cytoplazme E. coli, s použitím napríklad expresného vektoru pET3d. Primérom použitým na tento účel bol:

5-GCA CTT GTC ACA AAC ACC ATG GCA CCT ACT TCA AGT-3' (SEQ ID NO: 5)

Konkrétnymi primérmi použitými na vloženie mutácií v pozíciách D20, N88 a Q126 boli:

D20X: 5-GGA GCA TTT ACT GCT GNN NTT ACA GAT G-3' (SEQ ID NO: 6)

N88X: 5-GGG ACT TAA TCA GCN NNA TCA ACG TAA TAG-3' (SEQ ID NO: 7)

Q126X: 5'-GGA TTA CCT TTT GTN NNA GCA TCA TCT C-3' (SEQ ID NO: 8), kde NNN bol nahradený vhodným kodónom pre histidfn (CAC) alebo izoleucín (ATC) (v pozícii D20), arginín (CGT), glycín (GGT) alebo izoleucín (ATC) (v pozícii N88) alebo leucín (CTG) (v pozícii Q126). Ďalšie mutácie sa pripravili s použitím podobnej stratégie a vhodného kodónu na danú mutáciu. Priméry boli fosforylované s použitím T4 polynukleotid kinázy (New England Biolabs, Beverly, MA), podľa návodu výrobcu. Po tepelnom naviazaní priméru na U-DNA templát a extenziou pomocou T7 DNA polymerázy (BioRad Laboratories, Hercules, USA) boli bunky E. coli kmeňa DH5 alfa™ (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) transformované 5 μΐ reakčnej zmesi a umiestnili sa na LB médium obsahujúce 0,7 % agaru. Po inkubácii pri 37 °C

SK 288100 Β6 boli plaky expandované zoškriabaním jedného plaku a jeho prenesením do 2 ml LB média a kultiváciou cez noc pri 37 °C. Jednoreťazcová DNA bola izolovaná s použitím M13 prečisťovacieho gitu (Qiagen Inc., Chatsworth, C A) podľa návodu výrobcu a klony obsahujúce požadovanú mutáciu sa identifikovali sekvencovaním jednoreťazcovej DNA s použitím Sequenase^R sekvencovacieho gitu (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) podľa návodu výrobcu. cDNA mutantného IL-2 z replikačnej formy DNA zodpovedajúcej plakom obsahujúcim správne mutovanú sekvenciu sa izolovala s použitím Ncol a Xbal a subklonovala do plazmidového vektoru pET3a (Stratagene, San Diego, CA) (Strát.). E. coli kmeňa BL21 sa transformovali vektorom pET3a obsahujúcim mutovanú sekvenciu a kultivovali sa do ABS₂₈₀ medzi 0,60 a 1,0 a v túto dobu sa pridalo 0,4 mM IPTG kvôli indukcii produkcie mutovaného IL-2.

Príklad 2

Extrakcia a prečistenie mutovaných IL-2 z E. coli hodiny po indukcii sa bunky získali odstredením pri 10 000 x g. Rekombinantné mutantné IL-2 boli renaturované a prečistené najprv dispergovaním buniek v 10 objemoch (objem/hmotnosť za vlhka) sacharózového/Tris/EDTA pufra (0,375 M sacharózy, 10 mM Tris/HCI pH 8,0, 1 mM EDTA). Dispergované bunky boli sonikované 3-krát pri 300 W s 30 sekundovými zotavovacími intervalmi v ľadovom kúpeli, s použitím Missonix model XL2020 sonikátora vybaveného 1 palcovou štandardnou sondou. Sonikovaný materiál sa potom odstredil pri 17 000 x g v priebehu 20 minút pri 4 °C. Peleta, ktorá by mala mať v túto dobu bielu farbu, sa premyla resuspendovaním a odstredením raz v sacharózovom/Tris/EDTA pufri, dvakrát v Tris/EDTA pufri (50 mM Tris/HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA) a nakoniec sa resuspendovala v 10 objemoch 0,1 M Tris/HCI, pH 8,0 pufra (v túto dobu sa odobrala vzorka na analýzu na géli) a odstredila sa v priebehu 20 minút pri 17 000 x g.

Peleta sa rozpustila pridaním 3 objemov 8 M guanidínium chloridu v 0,1 M Tris/HCI (pH 8,0) a 0,1 % (obj./obj.) 2-merkaptoetanolu. Po inkubácii počas 2 hodín pri teplote okolia sa vzorka odstredila v priebehu 20 minút pri 17 000 x g. Vzniknutý roztok sa dialyzoval počas približne 20 hodín proti 20 objemom 10 mM Tris/HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA pri 4 °C. Roztok sa potom odstredil pri 17 000 x g v priebehu 20 minút, upravil sa pomocou 0,1 % kyseliny trifluóroctovej a prefiltroval sa cez 0,22 mikrónovú filtračnú jednotku. Roztok sa preniesol hneď do silikónovej nádoby a vniesol sa do C8 kolóny (Vydac 208TP54). Mutantné IL-2 sa prečistili s použitím 20 minútového lineárneho gradientu 45 - 885 % acetonitrilu v 0,1 % TFA. Koncentrácia eluovaného proteínu sa stanovila A280 a aminokyselinovou analýzou. Proteín sa potom rozdelil (po 100 ml) do silikónových skúmaviek a uskladnil sa pri -20 °C. Takto prečistený mutovaný proteín zvyčajne vytváral jediný prúžok pri SDS-PAGE (pri farbení striebrom) a kvantifikoval sa aminokyselinovou analýzou (presnosť zvyčajne vyššia ako 90 %).

Príklad 3

Test proliferácie T lymfocytov

Mononukleáme bunky periférnej krvi (PBMC) sa izolovali z približne 100 ml normálnej ľudskej krvi (Irwin Memoriál Blood Bank, San Francisko, CA) riedenej 1 : 2 v chladnom Dulbeccovom fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (bez Ca²⁺ a Mg²⁺; DPBS). Aplikoval sa Ficol-Paque (Pharmacia) a vzorka sa odstredila kvôli izolácii PBMC, a potom sa vykonalo dôkladné premytie v chladnom DPBS. PHA blasty (aktivované T lymfocyty) sa pripravili resuspendovaním buniek v RPMI 1640 obsahujúcom 10 % fetálne hovädzie sérum (Hyclone), do ktorého sa pridalo 1 % (hmot./obj.) každej z nasledujúcich zložiek: L-glutamín; neesenciálne aminokyseliny; pyruvát sodný a antibiotikum - antimykotikum (RPMI médium) s hustotou 1 x 10⁶ buniek/ml. Pridal sa lytohemaglutinín (PHA-P, Sigma) v konečnej koncentrácii 10 pg/ml a bunky sa inkubovali pri 37 °C, 5 % CO₂ počas 3 dní. Bunky sa odobrali a premyli sa dvakrát v DPBS, resuspendovali sa v RPMI médiu a umiestnili sa na 96-jamkovú platňu s plochým dnom s hustotou 1 x 10⁵ buniek/jamka v 200 pl s rôznymi koncentráciami IL-2 alebo mutovaného IL-2 v RPMI médiu. Platne sa inkubovali počas 48 hodín pri 37 °C, pulzovali sa 1 pCi ³H-tymidínu (DuPont NEN^R, Boston, MA)/jamka počas 6 hodín, odobrali sa a merala sa ich rádioaktivita na filtroch zo sklených vláken.

Príklad 4

Test proliferácie NK buniek

Mononukleáme bunky periférnej krvi (PBMC) sa izolovali z približne 100 ml normálnej ľudskej krvi (Irwin Memoriál Blood Bank, San Francisko, CA) riedenej 1 : 2 v chladnom Dulbeccovom fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (bez Ca²⁺ a Mg²⁺, DPBS). Aplikovalo sa Ficol-Paque (Pharmacia) a vzorka sa odstredila kvôli izolácii PBMC, a potom sa vykonalo dôkladné premytie v chladnom DPBS. NK bunky sa separovali od ostatných buniek. Na tento účel sa použil Miltenyi Biotec's git na izoláciu NK buniek (Bergisch Gladbach, Nemecko, kat. č. 465-01). Git sa skladá z dvoch činidiel, separačných kolón a veľmi silne magnetického nosiča. Prvým činidlom je zmes monoklonálnych protilátok CD3, CD4, CD 19, CD33 myšieho IgGl izotypu konjugovaných s hapténom. Toto činidlo je určené na depléciu T lymfocytov, B lymfocytov a myelo13

SK 288100 Β6 idných buniek z PBMC. Predpokladá sa, že na tento účel sa môže použiť akákoľvek vhodná súprava protilátok rozpoznávajúcich tieto typy buniek. Druhým činidlom sú koloidné super-paramagnetické MAC mikrokorálky konjugované s anti-hapténovou protilátkou. Bunky sa resuspendovali v PBS s 0,5 % hovädzím sérovým albumínom a 2 mM EDTA (PBS/EDTA). Objem suspenzie závisí od počtu použitých buniek aje uvedený v návode od Miltenyi Biotec. Zvyčajne sa pri počte buniek 5 x 10⁸ PBMC bunky resuspendujú v 800 μΐ pufŕi, a potom sa použije 200 μΐ každého činidla. Po inkubácii s činidlami sa bunky pridali do kolóny (resuspendovanej v 2 ml pufra). Iné ako NK bunky adherovali na magnet a NK bunky sa izolovali a odoberali z výtokovej frakcie. Bunky sa premyjú, resuspendujú sa v RPMI médiu (ktoré obsahuje RPMI 1640, do ktorého sa pridalo 1 % hmotn./obj.) každej z nasledujúcich zložiek. L-glutamín; neesenciálne aminokyseliny; pyruvát sodný a antibiotikum - antimykotikum (všetko od Gibco, BRL, Gaithersburg, MD); 10 % fetálne hovädzie sérum (Hyclone)) a umiestnili sa na 96-jamkovú platňu s plochým dnom s hustotou 1 x 10⁵ buniek/jamka v 200 s rôznymi koncentráciami IL-2 alebo mutovaného IL-2 v RPMI médiu. Platne sa inkubovali počas 48 hodín pri 37 °C, pulzovali sa 1 pCi ³H-tymidínu (DuPont NEN^R, Boston, MA)/jamka počas 6 hodín odobrali sa a merala sa ich rádioaktivita na filtroch zo sklených vláken.

Príklad 5

Mutantné proteíny selektívne aktivujúce T lymfocyty vzhľadom na NK bunky

Mutantné proteíny boli pripravené miestne cielenou mutagenézou (Kunkel a kol., 1987, Methods Enzymol., 154, 367 - 382) v pozíciách Asp-20, Asp-84, Asn-88 a Gln-126 a boli exprimované v E. coli s použitím pET-3a expresného systému podľa návodu výrobcu (Stratagene). Mutantné proteíny sa prečistili z inklúznych teliesok v guanidíne-HCI, znova sa zložili a spracovali chromatografiou s použitím HPLC, ako bolo opísané prv. Získaný proteín mal podľa striebrom farbenej SDS-PAGE viac ako 95 % čistotu a analyzoval sa na koncentráciu a čistotu aminokyselinou analýzou (AAA presnosť zvyčajne väčšia ako.90 %). Sekvencia mutantných proteínov vykazujúcich vhodnú aktivitu bola potvrdená hmotnostnou spektrometriou. Takto prečistené mutantné proteíny sa testovali v testoch proliferácie T lymfocytov a NK buniek, ako bolo opísané skôr. Relatívne aktivity pre mutantné IL-2 v testoch na lymfocytoch a NK bunkách sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1 Mutantné proteíny hodnotené na selektívnu aktivitu pre T lymfocyty

Mutantný proteín	Relatívna aktivita
	T vs. NK bunky	T bunky	NK bunky
wt IL-2	1	1,00000	1,00000
D20 mutanti
D20A	5	0,00024	0,00005
D20H	3900	0,37081	0,00009
D20I	7600	4,59635	0,00061
D20K	330	0,06301	0,00019
D20L	100	0,00063	0,00001
D20M	490	0,05372	0,00011
D20N	160	0,03000	0,00019
D20Q	100	0,03180	0,00032
D20R	33	0,00018	0,00001
D20S	170	0,06640	0,00038
D20T	1	1,00000	1,00000
D20V	10	0,00093	0,00009
D20Y	1000	0,06587	0,00007
N88 mutanti
N88A	50	0,50000	0,01
N88E	10	0,01172	0,00115
N88F	22	0,02222	0,001
N88G	980	8,33333	0,00853
N88H	3	0,00100	0,001
N88I	9600	0,98074	0,00010
N88K	3	0,00010	0,00032
N88L	4	0,00400	0,001
N88M	250	0,25000	0,001
N88R	6200	0,89730	0,00015

SK 288100 Β6

Mutantný proteín	Relatívna aktivita
N88S	80	0,00200	0,16000
N88T	395	0,50000	0,001266
N88V	67	0,06670	0,001
N88W	1	0,00100	0,001
N88Y	8	0,00800	0,001
Q126 mutanti
Q126A	0,30	0,01743	0,05809
Q126D	240	0,14630	0,00061
Q126E	400	10,0000	0,02500
Q126F	32	0,87358	0,02749
Q126G	100	0,55556	0,00556
Q126H	0,03	0,02216	0,73875
Q126I	33	0,00100	0,00003
Q126K	1,0	1,00000	1,00000
Q126L	680	3,06186	0,00447
Q126M	9,1	19,94092	2,19298
Q126N	10	6,57895	0,64993
Q126P	3,0	0,00032	0,00011
Q126R	11	4,02695	0,36392
Q126S	33	0,03417	0,00103
Q126T	3,3	0,00010	0,00003
Q126 V	330	1,00556	0,00302
Q126W	1,0	0,20000	0,20000
Q126 Y	10	0,88500	0,08850

Aktivity mutantných proteínov sú opísané podľa relatívnej koncentrácie mutantného proteínu nutnej na dosiahnutie 50 % maximálnej odpovede (EC₅₀) v porovnaní s EC₅₀ prirodzeného IL-2 v rovnakom teste; v prípade viacerých testov pre rovnaký mutovaný proteín sú uvedené hodnoty geometrických priemerov. Hodnota EC₅o pre prirodzený IL-2 je v rozmedzí od 10 pM do 150 pM v teste na T lymfocytoch a od 50 pM do 200 pM v teste na NK bunkách. Pomer aktivity mutantných proteínov pre T lymfocyty a NK bunky je vyjadrený ako relatívna aktivita mutantného proteínu na T lymfocytoch delená relatívnou aktivitou mutantného proteínu na NK bunkách. Tento pomer je určený pre každý mutantný proteín s použitím iba aktivity získanej z testov na T lymfocytoch a NK bunkách využívajúcich bunky od jedného darcu.

Aktivity mutantných proteínov sa môžu klasifikovať do 6 všeobecných kategórií: (1) 1000-násobná selektivita pre T lymfocyty; (2) viac ako 100-, ale menej ako 1000-násobná selektivita pre T lymfocyty; (3) viac ako 10-, ale menej ako 100-násobná selektivita pre T lymfocyty; (4) zlepšená aktivita na T lymfocyty vzhľadom na IL-2; (5) selektivita pre NK bunky; (6) 10-násobná selektivita buď pre T lymfocyty alebo pre NK bunky.

Trieda 1: D20H, I a Y; N88G, I a R.

Trieda 2: D20K, L, M, N, Q a S; N88M a T; Q126D, E, G, L a V.

Trieda 3: D20R; N88A, E, F, S a V; Q126F, I, N, R a S.

Trieda 4: D20I; N88G; Q126E, L, M, N a R.

Trieda 5: Q126A, H.

Trieda 6: D20A, T a V; N88H, K, L, W a Y; Q126K, P, T, W a Y.

V triedach 1 - 3 sú výhodné mutantné proteíny tie, ktoré majú aktivitu na T lymfocytoch rovnakú ako IL2 alebo lepšiu. V triede 1 toto spĺňa D20H a I; N88G, I a R; v triede 2 N88M a T; Q126D, E, G, a V; v triede

N88A, Q126F a G. Mutantné proteíny v triede 4 by mali mať vyššiu účinnosť ako prirodzený IL-2 in vivo.

Ako je vidno z tabuľky 1, žiadna jediná mutácia neviedla k inaktivite mutantného IL-2 v oboch testoch. Ale možno predpokladať, že kombinácia mutácií, ktoré vedú k vážnemu narušeniu aktivity, bude potenciálne viesť k zisku antagonistu IL-2 na T lymfocytoch alebo na iných typoch buniek nesúcich vysoko afinitný receptor pre IL-2. Takýto antagonista je predpovedateľný z týchto dát, pretože mutácie boli navrhnuté iba kvôli zmene interakcií s IL-2R beta a 1L-2R gama. Jedným takýmto príkladom je dvojito mutovaný proteín D20R/Q126T. Kombinácia slabo aktívnych mutácií v jednej molekule by mala mať kombinatoriálny charakter, to znamená, že keď má D20R 0,00018 aktivitu na T lymfocytoch a Q126T má 0,0001 aktivitu na T lymfocytoch, mal by dvojito mutovaný proteín D20R/Q126T mať 0,000000018 aktivitu prirodzeného IL-2 na T lymfocytoch. Ďalšie kombinácie sa môžu pripraviť podľa uvedených dát.

SK 288100 Β6

Príklad 6

Biologická aktivita prirodzeného IL-2 a mutovaných IL-2

Obr. 1 až 7 ukazujú krivky dávka - odpoveď pre prirodzený ľudský IL-2 (IL-2) a D20H (obr. 1), IL-2 a D20I (obr. 2), IL-2 a N88G (obr. 3), IL-2 a N88I (obr. 4), IL-2 a N88R (obr. 5), IL-2 a Q126E (obr. 6) a IL-2 a Q126L (obr. 7). A: jednotlivé krivky závislosti od dávky IL-2 (plné krúžky) a mutantného proteínu (prázdne krúžky) pre test proliferácie primárnych ľudských T lymfocytov (PHA blastov). B. jednotlivé krivky závislosti od dávky IL-2 (plné trojuholníčky) a mutantného proteínu (prázdne trojuholníčky) pre test proliferácie primárnych ľudských NK buniek.

Pre pokus opísaný na obr. 1 je dávka prirodzeného IL-2 vedúca k 50 % maximálnej proliferácii (EC₅₀) približne 1,5 x 10'¹⁰ M pre T lymfocyty (A) a približne 1 x 10'¹⁰ M pre test na NK bunkách (B). EC₅₀ pre D20H je približne 2 x 10'¹⁰ v tomto teste na T lymfocytoch, aleje menšia ako 1 x 10'⁵ M v tomto teste na NK bunkách. Čisté zlepšenie v aktivite D20H na T lymfocyty vzhľadom na aktivitu na NK bunky je tak viac ako 50 000-násobné, ako bolo stanovené v tomto teste. Podobné výsledky sa získali z krvi od ďalších darcov (dáta nie sú uvedené).

Pre pokus opísaný na obr. 2 je dávka prirodzeného IL-2 vedúca k 50 % maximálnej proliferácii (EC₅o) približne 1,5 x 10'^1θ M pre T lymfocyty (A) a približne 3 x 1O'¹⁰ M pre test na NK bunkách (B). EC₅₀ pre D20I je tiež približne 1,5 x 10'¹⁰ v tomto teste na T lymfocytoch, aleje iba 5 x 10'⁶ M v tomto teste na NK bunkách. Čisté zlepšenie v aktivite D20I na T lymfocyty vzhľadom na aktivitu na NK bunky je tak viac ako 16 000-násobné, ako bolo stanovené v tomto teste. Podobné výsledky sa získali z krvi od ďalších darcov (dáta nie sú uvedené).

Pre pokus opísaný na obr. 3 je dávka prirodzeného IL-2 vedúca k 50 % maximálnej proliferácii (EC₅₀) približne 4 x 10'¹¹ M pre T lymfocyty (A) a približne 2 x 10'¹⁰ M pre test na NK bunkách (B). EC₅₀ pre N88G je približne 5 x 10'¹² v tomto teste na T lymfocytoch, ale je iba 3 x 10⁸ M v tomto teste na NK bunkách. Čisté zlepšenie v aktivite N88G na T lymfocyty vzhľadom na aktivitu na NK bunky je tak viac ako 1200násobné, ako bolo stanovené v tomto teste. Podobné výsledky sa získali z krvi od ďalších darcov (dáta nie sú uvedené).

Pre pokus opísaný na obr. 4 je dávka prirodzeného IL-2 vedúca k 50 % maximálnej proliferácii (EC₅₀) približne 1,5 x 10¹⁰ M pre T lymfocyty (A) a približne 1 x 10'¹⁰ M pre test na NK bunkách (B). EC₅₀ pre N88I je približne 4 x 10'¹⁰ v tomto teste na T lymfocytoch, ale je iba 5 x 10'⁶ M v tomto teste na NK bunkách. Čisté zlepšenie v aktivite N88I na T lymfocyty vzhľadom na aktivitu na NK bunky je tak viac ako 18 000-násobné, ako bolo stanovené v tomto teste. Podobné výsledky sa získali z krvi od ďalších darcov (dáta nie sú uvedené).

Pre pokus opísaný na obr. 5 je dávka prirodzeného IL-2 vedúca k 50 % maximálnej proliferácii (EC₅₀) približne 1,5 x 10'¹⁰ M pre T lymfocyty (A) a približne 1 x 10¹⁰ M pre test na NK bunkách (B). EC₅₀ pre N88R je približne 9 x 10'¹¹ v tomto teste na T lymfocytoch, ale je iba 3 x 10'⁷ M v tomto teste na NK bunkách. Čisté zlepšenie v aktivite N88R na T lymfocyty vzhľadom na aktivitu na NK bunky je tak viac ako 5000-násobné, ako bolo stanovené v tomto teste. Podobné výsledky sa získali z krvi od ďalších darcov (dáta nie sú uvedené).

Pre pokus opísaný na obr. 6 je dávka prirodzeného IL-2 vedúca k 50 % maximálnej proliferácii (EC₅₀) približne 8 x 10'¹² M pre T lymfocyty (A) a približne 5 x 10’¹¹ M pre test na NK bunkách (B). EC₅₀ pre Q126E je približne 8 x 10‘¹³ v tomto teste na T lymfocytoch, aleje iba 2 x 10'⁹ M v tomto teste na NK bunkách. Čisté zlepšenie v aktivite Q126E na T lymfocyty vzhľadom na aktivitu na NK bunky je tak viac ako 400-násobné, ako bolo stanovené v tomto teste. Podobné výsledky sa získali z krvi od ďalších darcov (dáta nie sú uvedené).

Pre pokus opísaný na obr. 7 je dávka prirodzeného IL-2 vedúca k 50 % maximálnej proliferácii (EC₅₀) približne 5 x 10’¹¹ M pre T lymfocyty (A) a približne 8 x 10'¹¹ M pre test na NK bunkách (B). EC₅₀ pre Q126L je tiež približne 2 x 10’¹¹ v tomto teste na T lymfocytoch, ale je iba 2 x 10'⁸ M v tomto teste na NK bunkách. Čisté zlepšenie v aktivite Q126L na T lymfocyty vzhľadom na aktivitu na NK bunky je tak viac ako 625-násobné, ako bolo stanovené v tomto teste. Podobné výsledky sa získali z krvi od ďalších darcov (dáta nie sú uvedené).

Príklad 7

Štúdia toxicity na šimpanzoch

IL-2/N88R bol vybraný z mutantných IL-2 proteínov uvedených v tabuľke 1 preto, že vykazoval selektívnu agonistickú aktivitu pre T lymfocyty v teste na primárnych ľudských T lymfocytoch a NK bunkách. Vzhľadom na prirodzené IL-2 je 6000-krát aktívnejší na T lymfocyty ako na NK bunky a vykazuje v podstate rovnakú aktivitu na T lymfocytoch ako prirodzený IL-2. 1L-2/N88R bol produkovaný v CHO bunkách, prečistený a hodnotený na šimpanzom modeli aktivity a toxicity IL-2. V tomto in vivo modeli sa vykazuje aktivita na T lymfocyty porovnateľná s aktivitou komerčne dostupného rekombinantného variantu IL-2 (Proleukín™, Chiron Corporation, Emeryville, CA), ale indukuje iba mierne nežiaduce účinky v porovnaní s týmto

SK 288100 Β6 prípravkom (tak v zmysle objektívnych, ako aj klinických parametrov).

A. Usporiadanie štúdie

1. Materiály a metódy

Časť štúdie prebiehajúca za života zvierat sa vykonala v New Iberia Research Center (New Iberia, LA, Sponsor Bayer Corporation, Berkeley, CA) a skladala sa z dvoch fáz, v ktorých sa použilo 11 dospelých alebo mladých šimpanzov s telesnou hmotnosťou v rozmedzí od 45 do 70 kg.

Fáza I štúdie bola fáza stanovenia dávky a pri nej sa podávala podkožná dávka vehikula alebo dávka Proleukínu (1,2 mg/m²) dvakrát denne (BID) počas 5 dní. Fáza II štúdie bolo porovnanie vehikula, Proleukínu a IL-2/N88R podávaných podkožné každých 12 hodín (q 12h) počas 5 dní. Dávka IL-2/N88R bola vybraná tak, aby sa dosiahli účinky porovnateľné s Proleukínom podľa farmakokinetickej analýzy. Vzorky krvi sa odoberali na biochemické vyšetrenie krvi, CBC, hematologické vyšetrenie/vyšetrenie koagulácie a na FACS analýzu populácie T lymfocytov a NK buniek, ako je podrobne opísané v časti 5 a 6.

Tabuľka 2A Protokol fázy I

Počet skupín	Počet zvierat	Testovaná substancia	Dávka	Frekvencia
1	1	vehikulum	NA	BID po dobu 5 dní
2	2	Proleukín	1,2 mg/m2	BID po dobu 5 dní

Počet skupín	Počet zvierat	Testovaná substancia	Dávka	Frekvencia
1	2	vehikulum	NA	ql2h po dobu 5 dní
2	3	Proleukín	1,2 mg/m2	ql2h po dobu 5 dní
3	3	IL-2/N88R	1,2 mg/m2	ql2h po dobu 5 dní

2. Dávkovanie

V deň štúdie, keď sa vykonávali odbery krvi, boli zvieratá uvedené do celkovej anestézie pomocou i.m. podania ketamínu v dávke približne 10 mg/kg pred podaním testovanej substancie alebo vehikula. V deň štúdie, kedy sa nevykonávali odbery krvi, sa zvieratá znehybnili pomocou klietky pred podaním testovanej substancie alebo vehikula. Dávka sa podávala podkožnou injekciou každých 12 hodín počas 5 dní a miesto injekcie sa oholilo v deň 1 štúdie. Pre každú dávku sa zaznamenalo miesto a doba podania dávky.

3. Klinické pozorovania (a) Denné sledovanie a príjem potravy. Každé zviera sa sledovalo dvakrát denne a akékoľvek abnormálne pozorovanie sa hlásilo riaditeľovi štúdie. Zvieratá, ktoré vyzerali ako choré, sa sledovali riaditeľom štúdie, veterinárom projektu a reprezentantom sponzora. Spotreba potravy sa sledovala a zaznamenávala dvakrát denne podľa vizuálneho sledovania.

(b) Telesná hmotnosť. Telesná hmotnosť sa zistila pred štúdiou, pred podaním dávky v deň 1 a zakaždým, keď boli zvieratá anestetizované kvôli odberu krvi.

(c) Pozorovanie miesta injekcie. Miesto injekcie sa sledovalo denne. Zaznamenával sa akýkoľvek abnormálny vzhľad, ako napríklad sčervenanie alebo opuch.

Tabuľka 3A Protokol odberu vzoriek vo fáze II

Čas	CBC	Chem.	Koag.	FACS	Sponzorov test
Pred štúdiou	x	x	x	x	x
Deň 1, pred dávkou	X	x	x	X	X
Deň 1,15 minút					x
Deň 3, pred dávkou	x	X	x	x	x
Deň 3, 15 minút					x
Deň 6	x	x	x	x	x
Deň 8	x	x	x	x	x
Deň 10	x	x	x	x	x
Deň 12	x	x	x	x	x

Čas	CBC	Chem.	Koag.	FACS	Sponzorov test
Deň 15	x	x	x	x	x
Deň 30	X	X	x	X	X

4. Spracovanie vzoriek (a) Biochemické vyšetrenia séra. Približne 2 ml krvi sa odobrali od každého zvieraťa do skúmaviek v uvedených dobách. Časy odberu krvi sa zdokumentovali a krv sa nechala zraziť pri teplote okolia. Vzorky sa potom odstredili, sérum sa separovalo a odoslalo sa do NIRC Clinical Pathology Laboratory. NIRC štandardný panel biochemického vyšetrenia séra je uvedený v tabuľke 4.

Tabuľka Panel biochemických vyšetrení séra

Sodík	Fosfor
Draslík	Močovina
Chloridy	Kreatinín
Celkový bilirubín	Celkový protein
Alkalická fosfatáza	Albumín
Laktát dehydrogenáza (LDH)	Pomer albumínu/globulínov
Aspartát aminotransferáza (AST)	Glukóza
Alanín aminotransferáza (ALT)	Vápnik
Oxid uhličitý (CO2)	Gama - glutamyl transferáza (GGT)

(b) Hematologické vyšetrenie. Približne 2 ml krvi sa odobrali od každého zvieraťa do skúmaviek s EDTA v uvedených časoch a odoslali sa do NIRC Clinical Pathology Laboratory. NIRC, štandardný hematologický panel, zahrnujúci krvný obraz, diferenciál a počet trombocytov, sa vykonal pre všetky vzorky.

(c) Sponzorský test. Približne 6 ml krvi sa odobralo do skúmaviek s EDTA v uvedených časoch. Časy odberu krvi sa zdokumentovali. Vzorky sa potom odstredili, plazma sa separovala a rozdelila sa do troch samostatných skúmaviek. Plazma sa uskladnila v zmrazenom stave (-60 °C alebo menej) a odoslala sa do Bayer Corporation, Berkeley, CA, hneď po skončení štúdie.

5. FACS (a) Postup. Približne 5 ml vzorky krvi sa odobrali do heparínu sodného ako antikoagulačného činidla v časoch uvedených pre FACS analýzu.

Vzorky plné krvi sa získali buď v EDTA, ACD alebo v heparíne. Počet buniek sa upravil tak, aby bol v rozsahu od 2 do 20 tisíc na mm³.

x 75 sklenené alebo plastové skúmavky sa vhodne označili použitým panelom protilátok. Protilátka alebo zmes protilátok sa pridala do skúmaviek v objemoch odporučených výrobcom.

100 μί dobre premiešanej vzorky krvi sa pridalo do každej skúmavky a zmes sa inkubovala počas 30 minút pri teplote okolia, chránená pred svetlom.

Po inkubácii sa pridali 2 ml roztoku pre lýziu (Becton Dickinson FACS brand lysing solution, BD č. 920002), zmes sa jemne premiešala vírením a nechala sa stáť počas 10 minút pri teplote okolia. Skúmavky sa potom odstredili pri teplote okolia v priebehu 5 minút pri 300 x g. Supematanty sa dekantovali, nadbytok kvapaliny sa odsal a ku každej bunkovej pelete sa pridal 1 ml PBS pufra (GIBCO 14190 - 144). Po jemnom premiešaní sa skúmavky odstredili pri teplote okolia v priebehu 5 minút pri 300 x g. Supematanty sa dekantovali, nadbytok kvapaliny sa odsal pred pridaním 1 ml fixačného roztoku (0,5 % roztok formaldehydu, pripravený riedením 10 % formaldehydu (Polyscience, Inc., č. 0418) 1 : 20 PBS pufrom) k bunkovej pelete a vykonalo sa jemné premiešanie vírením kvôli resuspendovaniu. Vzorky sa potom analyzovali na Coulter EPICS SL prietokovom cytometri.

Protilátky použité pre štúdiu: MlgGl/MlgGl izotopová kontrola (Becton Dickinson kat. č. 349526), CD45-PerCP (Becton Dickinson kat. č. 347464), CD8-FITC (Becton Dickinson kat. č. 347313), CD25-PE (Becton Dickinson kat. č. 30795X), CD4-FITC (Becton Dickinson kat. č. 340133), CD16-PE (Becton Dickinson kat. č. 347617), CD3-PerCP (Becton Dickinson kat. č. 347344).

SK 288100 Β6

6. Profil koagulácie

Približne 2 ml vzorky plnej krvi sa odobrali do skúmaviek s citrátom sodným ako antikoagulačným činidlom v uvedených časoch. Koagulačný profil zahrňoval protrombínový čas (PT), aktivovaný parciálny tromboplastínový čas (APTT) a fibrinogén.

B. Výsledky a diskusia

1. Stanovenie dávky Proleukínu

Primárnym cieľom tejto fázy bola identifikácia optimálnej dávky Proleukínu kvôli porovnaniu s IL-2/N88R. Táto optimálna dávka Proleukínu bola vybraná ako dávka, ktorá je tolerovateľná (nižšia ako maximálna tolerovaná dávka), ktorá ideálne spôsobuje klinicky významnú, ale strednú a reverzibilnú toxicitu. Dávka Proleukínu 1,2 mg/m², BID, bola vybraná ako počiatočná dávka podľa extrapolácie režimov klinického podávania Proleukínu, ich toxicity a vlastných výsledkov vzťahu dávka Proleukínu - odpoveď pre opice makak.

Dva šimpanzy boli liečené týmto spôsobom Proleukínom. Tieto zvieratá sa stávali menej aktívnymi, vyčerpanými a dehydratovanými počas aplikácie dávok. U oboch zvierat došlo k rozvoju závažných gastrointestinálnych príznakov v deň 3 alebo 4 vrátane zníženej chuti k jedlu, hnačiek, zvracania. Podávanie lieku sa skončilo u jedného zvieraťa (č. X-159) po 3 dňoch kvôli vážnej renálnej (obr. 8A, 8B) a stredne ťažkej hepatálnej (obr. 8C, 9D) dysfúnkcii zistenej podľa biochemického vyšetrenia krvi. V tomto vyšetrení sa zistila elevácia močoviny (BUN), kreatinínu a celkového bilirubínu, ALT (SGPT). Laktát - Ringerov roztok sa aplikoval i.v. obom zvieratám liečeným Proleukínom v deň 3 a 4 (zviera č. X-159) a v deň 4 iba (zviera X-124) buď pri resuscitácii, alebo ako prevencia dehydratácie. Zviera č. X-159 sa vylúčilo zo štúdie v deň 8 z dôvodu renálnej dysfúnkcie a možného trombu v ľavej nohe, ktorý sa prejavil veľmi slabým pulzom (femorálnym) a celá končatina bola chladná a opuchnutá. Hoci u jedného zvieraťa sa vyskytli veľmi významné toxické účinky, druhé zviera malo menej závažné toxické účinky a profil nežiaducich účinkov pre obe zvieratá bol reverzibilný. Podľa týchto výsledkov bola dávka 1,2 mg/m² Proleukínu a ekvivalentná dávka (podľa expozície) IL- 2/N88R, q 12 hodín, vybrané ako vhodný dávkový režim kvôli porovnávaniu týchto zlúčenín.

2. Porovnanie IL-2/N88R s Proleukínom

Klinické pozorovanie. Tabuľka 5 uvádza klinické pozorovania vykonané v priebehu štúdie. Hodnoty sú vyjadrené v stupnici 1 až 5, kde 5 označuje vážny stav. Všetky zvieratá liečené Proleukínom boli ťažko choré; pozorovalo sa jedno úmrtie spojené s Proleukínom. Hodnoty opísané po dni 6 pre skupinu liečenú Proleukínom odrážajú dáta pre zvyšné dve zvieratá. Najčastejším vedľajším účinkom liečenia IL-2/N88R sa zdali byť mierne GI ťažkosti (emézia), hoci liečenie neindukovalo nominálnu toxicitu v zmysle parametrov uvedených v tabuľke 4. Telesná hmotnosť v skupine liečenej Proleukínom sa znížila o 6 % v deň 6 a ďalej sa znížila až o 10 % v deň 10, a potom sa zvoľna opäť zvyšovala (pozri obr. 9). Naopak, skupiny liečené vehikulom a IL-2/N88R mali najviac 1 - 3 % úbytok hmotnosti.

Tabuľka 5 Klinické pozorovanie*

Liečenie	Celkový stav	Strata chuti k jedlu	Letargia	GI	Nepokoj
IL-2/N88R	dobrý	1	1	5	1
Proleukín	ťažko chorý	5	4/5	5	4/5
Vehikulum	normálny	0	0	0	0

* rozmedzie 1 až 5, kde 5 označuje najzávažnejší stav (a) Hematológia. IL-2/N88R indukoval bunkové účinky súhlasné s aktiváciou Proleukínom, konkrétne lymfocytózu (obr. 10A); zvýšenie počtu leukocytov (obr. 10B) a neutrofilov (obr. 10C) sa tiež zaznamenalo. IL-2/N88R indukoval iba marginálnu trombocytopéniu (nadir približne 15 %) v porovnaní s Proleukínom (nadir približne 50 %) v priebehu liečebnej časti štúdie (obr. 10D).

(b) Renálna fúnkcia. BUN hladiny boli u všetkých zvierat liečených Proleukínom badateľne vyššie v dni 6 a 8 (obr. 11 A). BUN koncentrácie boli vyššie ako 130 mg/dl u dvoch z týchto zvierat; koncentrácia kreatinínu sa tiež dramaticky zvýšila u dvoch zvierat v dni 6 a 8 (obr. 11B), čo ukazuje na celkové zníženie renálnych fúnkcií. Okrem toho sa v skupine liečenej Proleukínom tiež zvýšila v dni 6 a 8 sérová koncentrácia fosforu a aniónová medzera. Naopak, u zvierat liečených IL-2/N88R zostávali tieto parametre počas štúdie v podstate normálne (obr. 1ÍC a D).

(c) Pečeňové fúnkcie. Celkový bilirubín sa viac ako strojnásobil v skupine liečenej Proleukínom v deň 6 a zostával vo vysokých hodnotách v dni 10 (obr. 12A). Naopak, iba jedno zviera v skupine liečenej IL-2/N88R malo prechodné, mierne zvýšenie v deň 3 a deň 6. Sérové koncentrácie SGPT sa dramaticky zvýšili a dosiahli hodnoty vyššie ako 100 U/l u všetkých zvierat liečených Proleukínom v deň 6 (obr. 12B). Koncentrácia SGPT u zvieraťa č. A199 dosiahla 651 U/l a SGOT 2789 U/l (Lab Note Book: NIRC č. 8754-9852-Phase II, tabuľka 1, Individual and Group Mean Chemistry Values, str. 17 z 21 strán tabuľky), čo ukazuje na závažné pečeňové zlyhanie.

(d) Koagulácia. Koncentrácia fibrinogénu sa viac ako zdvojnásobila v skupine liečenej Proleukínom i IL-2/N88R a dosiahla vrchol v deň 6 (obr. 12C). Zdá sa, že zvýšenie prebehlo prv v skupine liečenej Proleukínom ako v skupine liečenej IL-2/N88R. Toto je zrejmé na zvýšení o 51 % vs. 5 % v deň 3. Zmeny v koncentrácii fibrinogénu môžu byť dôsledkom akútnej proteínovej reakcie, skôr ako defektov koagulácie, pretože neboli zrejmé významné zmeny v APTT alebo PT v rovnakom období (obr. 12D). Ale od dňa 10 sa hodnoty APTT začali mierne zvyšovať v skupine liečenej Proleukínom, hoci absolútne hodnoty zostávali v normálnom rozmedzí. Rovnaký trend, ale v menšom rozsahu, sa tiež pozoroval v skupine liečenej IL-2/N88R. Aleje zaujímavé, že koncentrácie fibrinogénu sa znížili v rovnakom čase v oboch skupinách.

(e) Homeostáza. Koncentrácia sodíka v sére sa znížila na 135 MEQ/I u dvoch z troch zvierat liečených Proleukínom v deň 8, ale zostala normálna u ostatných zvierat (obr. 13A). Koncentrácie chloridov sa v skupine liečenej Proleukínom tiež znížili pod 95 MEQ/I odo dňa 3 a zostávali nízke do dňa 15 (obr. 13 B). Koncentrácia vápnika bola nižšia u dvoch z troch zvierat liečených Proleukínom v dni 6 a 8 a znížila sa až na 4,9 a 3,1 mg/dl u zvieraťa A199 (obr. 13C). Koncentrácie draslíka sa znížili na 3 MEQ/I v dňoch 3 až 12 u všetkých zvierat liečených Proleukínom s výnimkou zvieraťa A199, u ktorého sa koncentrácia draslíka zvýšila na toxickú koncentráciu 7,2 MEQ/I pred vyradením zvieraťa zo štúdie (obr. 13D).

(f) Známky zvýšenej priepustnosti kapilár. Koncentrácia sérového albumínu sa znížila tak v skupine liečenej Proleukínom (37 %), ako aj v skupine liečenej IL- 2/N88R (19 %) (obr. 14A). Vyšší hematokrit sa pozoroval v skupine liečenej Proleukínom v dni 3 a 6 (obr. 14B), naopak, hematokrity sa znížili v rovnakú dobu tak v skupine liečenej vehikulom, ako i IL-2/N88R, a zostávali nízke, čo ukazuje na miernu anémiu spôsobenú mnohými odbermi krvi (obr. 14B a C). Zvýšenie hematokritu v skupine liečenej Proleukínom spoločne so znížením koncentrácie albumínu ukazuje na vznik syndrómu zvýšenej priepustnosti kapilár.

3. Aktivácia buniek

Účinnosť Proleukínu a IL-2/N88R sa sledovala podľa zmien percenta CD25 pozitívnych lymfocytov (migrácia + proliferácia) a priemernej fluorescencie pre CD25 alebo počtu CD25 antigénov exprimovaných na povrchu daných T lymfocytov (CD25 = nízko afmitné IL-2R). Expresia CD25 bola sledovaná na celkovej populácii T lymfocytov (CD3+ buniek), rovnako ako na CD3+ CD4+ a CD3+ CD8+ populáciách.

Aktivita IL-2 na NK bunky sa sledovala pomocou analýzy zmien v populácii CD3-CD16+ a CD3-CD25+CD16+ NK buniek. Absolútne počty CD3+, CD4+, CD8+, NK buniek boli vypočítané násobením percenta buniek počtom lymfocytov na mm³, kde táto hodnota sa získala počas hematologického vyšetrenia.

(a) Regulácia expresie CD25 na povrchu T lymfocytov. Percento aktivovaných T lymfocytov, ako je určené percentom CD25 pozitívnych buniek, sa zvýšilo v deň 6 štúdie, väčšinou na CD3+CD4+ subpopuláciu T lymfocytov. Zdá sa, že Proleukín indukuje expresiu CD25 na vyššom percente CD3+, CD3+CD4+ a CD3+CD8+ subpopuláciu T lymfocytov v deň 6. Avšak v deň 8 bolo percento buniek exprimujúcich CD25 antigén identické pre lymfocyty šimpanzov liečených Proleukínom a šimpanzov liečených IL-2/N88R (obr. 15A, B a C). Žiadne farbenie na CD25 na povrchu prirodzených zabijakov (NK) buniek sa nepozorovalo ani u šimpanzov liečených Proleukínom, ani IL-2/N88R. Chýbanie expresie IL-2R alfa (antigénu bunečného povrchu farbeného CD25) na povrchu vybranej populácie NK buniek (CD3-/CD16+) je pravdepodobne zodpovedné za tento výsledok.

Absolútny počet CD3+CD25+ T lymfocytov sledoval rovnaký vývoj ako percentuálne zastúpenie CD3+CD25+ T lymfocytov s tým, že Proleukín sa zdal byť aktívnejší ako IL-2/N88R (obr. 16A). IL-2/N88R vykazoval podobný aktivačný potenciál na T lymfocyty ako Proleukín pre CD3+CD4+ T lymfocyty, rovnako tak ako bolo zvýšenie absolútneho počtu CD3+CD4+CD25+ lymfocytov indukované IL-2/N88R rovnaké ako zvýšenie indukované Proleukínom (obr. 16B). Zdalo sa, že Proleukín indukoval zvýšenie počtu CD3+CD8+CD25+ T lymfocytov väčšie ako IL-2/N88R (obr. 16C).

Počet CD25 molekúl (priemer fluorescencie) exprimovaných na CD3+CD4+ subpopulácie T lymfocytov sledoval podobné kinetiky tak pri liečení Proleukínom, ako aj IL-2/N88R (obr. 17).

(b) Presuny lymfocytov: efekty liečenia Proleukínom a IL-2/N88R

Vplyv Proleukínu a IL-2/N88R na populáciu T lymfocytov a NK buniek sa stanovil pomocou analýzy zmien absolútneho počtu cirkulujúcich lymfocytov pred líčením, počas neho a po liečení (obr. 18). Zdalo sa, že IL-2/N88R má väčší vplyv ako Proleukín na zvýšenie absolútneho počtu cirkulujúcich CD3+CD4+ lymfocytov (obr. 18A) a o niečo menší vplyv ako Proleukín na zvýšenie absolútneho počtu cirkulujúcich CD3+CD8+ lymfocytov (obr. 18B). Obe zlúčeniny mali porovnateľný, aj keď slabý, vplyv na zvýšenie celkového počtu CD3+ lymfocytov (obr. 18C). Ani Proleukín, ani IL-2/N88R neovplyvňovali presun NK buniek (obr. 18D).

C. Záver

IL-2/N88R bol pripravený pomocou vyšetrovania mutantných IL-2 proteínov v testoch na primárnych

SK 288100 Β6 ľudských T lymfocytoch a NK bunkách. Vykazuje in vitro približne 6000-násobnú selektivitu pre T-lymfocyty vzhľadom na NK bunky. Vzhľadom na jeho bunkový profil sa predpokladá, že bude indikovať iba mierne vedľajšie účinky pri podaní v dávkach, ktoré budú vyvolávať významnú aktiváciu T lymfocytov. Pokusy na šimpanzoch, porovnávajúce Proleukín s IL-2/N88R potvrdili, že IL-2/N88R má poznateľné lepší profil bezpečnosti ako Proleukín a zároveň si zachováva porovnateľnú schopnosť indukovať aktiváciu T lymfocytov.

Príklad 8

Účinnosť selektívneho agonistu IL-2 N88R v myšom modeli pľúcnych metastáz nádoru CT-26

Protokol: Myšiam (Balb/c samice, vek 6-8 týždňov) bolo intravenózne podané 1 x 10⁵ CT-26 buniek (myší karcinóm hrubého čreva) v 0,2 ml PBS do laterálnej chvostovej žily v deň 0. Liečba Proleukínom alebo IL-2/N88R v rôznych dávkach (riedidlo: 5 % dextróza vo vode (D5W) alebo D5W, podávaná i.v., raz denne počas 8 dní (QD x 8) bola začatá 1 deň po implantácii. IL-2/N88R bol pripravený pri teplote okolia riedením do D5W s použitím silikonovaných skúmaviek pomocou tuberkulínovej injekčnej striekačky a dávka bola podaná zvieratám počas 2 hodín po príprave. Proleukín bol pripravený pridaním 0,7 ml sterilnej vody pre injekcie (SWFI) do každej skúmavky (konečná koncentrácia 1,86 mg/ml). Riedenia boli vykonané rovnako ako riedenia pre IL-2/N88R do D5W (tabuľka 6). Zvieratá boli utratené v deň 11. Pľúca boli odstránené a zvážené, premyli sa v PBS a tkanivo sa prenieslo do Bouinovho roztoku. O 24 hodín neskôr sa tkanivo prenieslo do 10 % formalínu. Počet metastatických kolónií v pľúcach sa spočítal pod disekčným mikroskopom.

Tabuľka 6 Dávky a skupiny v štúdii na myšom modeli CT-26 nádore

Skupina	n	Liečenie	Dávka, mg/kg
1	14	D5W	NA
2	11	Proleukín	3 mg/kg
3	11	Proleukín	10 mg/kg
4	11	IL-2/N88R	1 mg/kg
5	12	IL-2/N88R	3 mg/kg
6	12	IL-2/N88R	10 mg/kg
7	12	IL-2/N88R	30 mg/kg
8	11	IL-2/N88R	60 mg/kg

Tabuľka 7 ukazuje počet metastáz u jednotlivých myší. Porovnateľná účinnosť sa pozorovala pre IL-2/N88R i pre Proleukín. Pri vysokej dávke IL-2/N88R (skupina 8, 60 mg/kg) mali všetky okrem jednej myši 12 metastáz alebo menej; 3 myši nemali žiadne metastázy. Toto je v protiklade k najvyššej testovanej dávke Proleukínu, pri ktorej mali všetky prežívajúce myši 12 metastáz alebo viac.

Tabuľka 7 Jednotlivé počty metastáz a priemery metastáz

Skupina	Pľúcne metastázy (sú uvedené počty pre jednotlivé myši)
1	0	129	183	179	155	165	200	152	148
2	118	126	107	111	118	110	137	114	135
3	12	38	18	19	30
4	169	173	189	200	120	117	136	122	200
5	171	176	186	159	192	139	117	200	195
6	92	111	112	114	109	84	68	47	58
7	15	13	59	62	23	55	46	16	9
8	7	0	3	2	4	9	7	0	12

						Priemer	SEM	P hodnota (2-cestná)
1	158	200	194	165	125	154	13,42
2	158	132				124	4,61	0,07278
3						23	4,66	0,00003

SK 288100 Β6

						Priemer	SEM	P hodnota (2-cestná)
4	163	110				154	10,41	0,97029
5	116	192				168	9,31	0,43401
6	49	112				87	8,16	0,00060
7	4	8	2			26	6,57	0,00000
8	55	0				9	4,75	0,00000

Štatisticky významné (p < 0,05) zníženie počtu metastáz sa pozorovalo u myší liečených IL-2/N88R v dávkach 10, 30 a 60 mg/kg (skupiny 6, 7 a 8, v príslušnom poradí) a v skupine liečenej 10 mg/kg Proleukínu (skupina 3). Tieto výsledky sú znázornené graficky na obr. 19. Dáta sú v grafe ako log dávky: pre Proleukín boli dávky 3 a 10 mg/kg; pre IL-2/N88R boli dávky 1, 3, 10, 30 a 60 mg/kg. Vypracovanie krivky s použitím nelineárnej rovnice (4-parametrická zhoda) viedlo k zisku hodnôt IC₅₀ 5,2 mg/kg pre Proleukín a 10,9 mg/kg pre IL-2/N88R.

Z dát získaných v tomto pokuse bola hodnota IC₅₀ pre zníženie počtu metastáz pre IL-2/N88R vypočítaná na 10,9 mg/kg (8,6 - 13,9 mg/kg pri 95 % intervale spoľahlivosti) a pre Proleukín bola vypočítaná na 5,2 mg/kg (3,5 - 7,7 mg/kg pri 95 % intervale spoľahlivosti).

Prežívanie myší je uvedené v tabuľke 8. V skupine s 10 mg/kg Proleukínu uhynula jedna (1) myš v deň 7 a ďalších päť (5) myší uhynulo v deň 8. Jedna (1) myš uhynula v deň 8 v každej skupine liečenej 3 alebo 10 mg/kg IL-2/N88R a žiadne úmrtie sa nepozorovalo v skupinách liečených 1, 30 alebo 60 mg/kg IL-2/N88R. Okrem toho, všetky myši liečené 3 mg/kg Proleukínu a všetky myši liečené 10 mg/kg Proleukínu boli choré; žiadna morbidita sa nepozorovala u myší liečených IL-2/N88R.

Tabuľka 8 Prežívanie myší liečených IL-2/N88R alebo Proleukínom

Skupina	Deň
	0 (%)	7* (%)	8 (%)	11(%)
D5W1	100	100	100	100
Pro 3 mg/kg2	100	100	100	100
Pro 10 mg/kg2	100	90,9	45,5	45,5
IL-2/N88R 1 mg/kg2	100	100	100	100
IL-2/N88R 3 mg/kg3	100	100	91,7	91,7
IL-2/N88R 10 mg/kg3	100	100	91,7	91,7
IL-2/N88R 30 mg/kg3	100	100	100	100
IL-2/N88R 60 mg/kg2	100	100	100	100

n = 14 myší/skupina n = 11 myší/skupina n = 12 myší/skupina žiadne úmrtia sa nepozorovali pred dňom 7.

Proleukínom liečené zvieratá v oboch skupinách boli moribundné. Žiadna morbidita sa nepozorovala u akéhokoľvek zvieraťa liečeného IL- 2/N88R.

Na záver, táto štúdia naznačuje, že IL-2/N88R je rovnako účinný ako Proleukín v redukcii rastu nádoru (ako je meraný počtom pľúcnych metastáz v CT26 modeli). Ďalej IL-2/N88R je významne menej toxický ako Proleukín.

Príklad 9

Vývoj stabilnej, vysoko produktívnej CHO bunkovej línie exprimujúcej IL-2/N88R

Bunkové línie so stabilnou produkciou secemujúcou vysoké množstvá IL-2//N88R mutantného proteínu sa pripravili transfekciou CHO (dhfr-) buniek expresným vektorom uvedeným na obr. 20 (ATCC prírastkové

č._). Jednotlivé prvky IL2N88R expresného vektora sú uvedené v plazmidovej mape (obr. 20). Táto mapa ukazuje CMVe/p (cytomegalovírusový skorý promótor); PA (SV40 polyadenylačné signálne sekvencie); a DHFR (dihydrofolátreduktázovú expresnú kazetu).

Vektor bol konštruovaný s použitím štandardných techník rekombinantnej DNA. Všeobecne pozri Sambrook a kol., Molecular Cloning, 2. vyd. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Short Protocols in Molecular Biology, 2. vyd., 1992, John Wiley and Sons; Methods in Enzymology, zv. 185, ed. Goeddel a kol.,

Academic Press, Inc., Londýn, 1991. Expresný vektor obsahoval samostatné expresné kazety pre IL2N88R gén a amplifikovateľný a selektovateľný gén DHFR (dihydrofolátreduktáza). Približne 1 x 10⁶ CHO (ovariálne bunky čínskeho škrečka) buniek bolo transfektovaných 10 pg pCBlIL2SA s použitím Lipofectínového činidla (Life Technology Inc., Bethesda, Maryland) podľa návodu výrobcu. Bunky sa potom selektovali za prítomnosti 50 nM metotrexatu a kultivovali sa vDME/F12 médiu (Life Technologies, Inc.) neobsahujúcom tymidín a hypoxantín a obsahujúcom 5 % dialyzované fetálne teľacie sérum. Bunkové populácie sa vyšetrovali na produkcii IL2N88R s použitím komerčného ELISA gitu (R and D Systems). Populácie s vysokou produkciou sa selektovali v médiu obsahujúcom zvyšujúce sa koncentrácie metotrexatu (100 až 400 nM metotrexatu) a vyšetrovali sa na produkciu IL2N88R. Kvôli získaniu klonov s vysokou a stabilnou produkciou sa použilo klonovanie s limitným riedením. Klonovanie sa vykonalo za absencie metotrexatu s použitím štandardných techník tkanivovej kultivácie.

Príklad 10

Bezsérová produkcia 1L2N88R v perfiiznom bioreaktore

Kontinuálna produkcia IL2N88R sa vykonala s použitím fermentácie s kontinuálnou perfuziou. 19-litrová Wheaton fermentačná nádoba sa naočkovala stabilnou CHO bunkovou líniou z príkladu 9 v dávke 2 x 10⁶ buniek/ml a perfiizia sa vykonávala s rýchlosťou výmeny média 5 1/deň. Produkčným médiom bolo médium na báze DMEM/F12 (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) doplnené rekombinantným ľudským inzulínom (10 pg/l) (HUMULIN™, Eli Lilly, Inc., Indianapolis, IN) a FeSO₄. EDTA (50 pM). Hustota buniek sa udržiavala na 4 x 10⁶ buniek/ml. Priemerný denný výťažok bol 200 mg/deň. Produkcia IL2N88R bola stabilne udržiavaná počas 30 dní.

Príklad 11

Prečistenie IL2/N88R produkovaného v CHO bunkách

Nasledujúci postup sa použil na eluát perfuzie opísanej skôr. Perfuzne médium sa odobralo a vnieslo do S-sefarózovej kolóny. Kolóna sa uviedla do rovnováhy 2 milimolámym fosfátovým pufrom s 5 milimolárnym NaCl pri pH 7,0. Vodivosť média („TCF“) sa upravila na 4 milisiemensy pridaním vody a úpravou na rovnaké pH pomocou kyseliny fosforečnej.

Po vnesení TCF do kolóny sa kolóna premyla rovnakým pufrom kvôli uvedeniu do rovnováhy. Eluácia sa vykonala pomocou posunu pH. Mutované proteiny sa eluovali 20 mM etanolamínom, pH 10,5, za zisku S-eluátu.

Aniónová výmena sa vykonala spracovaním S-eluátu na QAE Fast Flow™ kolóne (Pharmacia) uvedenej do rovnováhy 10 mM hydrogenuhličitanovým pufrom pri pH 10,5. Prietok sa udržiaval na 250 cm/hod. Po základnom premytí sa IL-2SA eluoval 20 mM fosfátom pri pH 4,0.

Hydroxyapatitová chromatografia (HAP) sa vykonala spracovaním QAE eluátu (1 : 1 s WFI) na kolóne naplnenej keramickým hydroxyapatitom (Type II, BioRad, Hercules, CA) uvedenej do rovnováhy 0,10 mM fosfátom pri pH 7,0. Prietok sa udržiaval na 250 cm/hod. Po základnom premytí sa IL-2SA eluoval 100 mM fosfátom pri pH 7,0.

Eluát z hydroxyapatitovej kolóny sa spracoval ultrafiltráciou na objem 300 ml na Millipore Pelicon-2 jednotke vybavenej troma PES 5K náplňami (Millipore Corporation, Bedford, MA).

Ultrafiltrovaný HAP eluát sa ďalej prečistil spracovaním na S100HR (Pharmacia) kolóne s vylučovaním podľa veľkosti pri 35 cm/hod. Kolóna sa uviedla do rovnováhy 10 mM fosfátom a 150 mM NaCl pH 7,0.

Zásobný materiál pre gélovú filtráciu sa nariedil WFI kvôli dosiahnutiu vodivosti 4,0 mMhos/cm a znova sa aplikoval do S-sefarózovej kolóny za podmienok opísaných skôr. IL2SA sa eluoval 10 mM fosfátovým pufrom s 1 molámym NaCl pri pH 7,0.

Konečný materiál z katiónovej výmeny sa dialyzoval cez noc proti fosfátom pufrovanému salinickému roztoku (PBS), a potom sa riedil sterilným PBS na koncentráciu 6 mg/ml. Získaný nariedený materiál sa potom sterilné filtroval, rozdelil do podielov a zmrazil pri -70 °C. Celkový výťažok bol 65 %.

Ďalšie uskutočnenia vynálezu budú odborníkom v odbore zrejmé. Vynález opisuje spôsob na získanie mutovaných proteinov, ktoré tu nie sú výslovne opísané, ale ktoré spôsobujú aktiváciu T lymfocytov, ako je preukázaná proliferáciou PHA blastov a zníženou proliferáciou NK buniek, a preto patria takto mutované proteiny do rozsahu predkladaného vynálezu. Koncept a pokusy tu opísané možno s použitím heterológnych multimerizačných receptorových systémov použiť na iné cytokíny, hlavne na príbuzné cytokíny IL-7, IL-9 a IL15, IL-10, interferón alfa a interferón gama.

Sekvencie

Predkladaný vynález obsahuje nasledujúce sekvencie: SEQ ID NO: 1: hIL-2 (aminokyselinová sekvencia) SEQ ID NO: 2: hIL-2 (cDNA)

SEQ ID NO: 3: 5’ PCR primér, IL-2

SK 288100 Β6

SEQ ID NO: 4: 3’ PCR primér, IL-2

SEQ ID NO: 5: mutagénny primér pre IL-2 expresný vektor SEQ ID NO: 6: mutagénny primér na mutácie D20X SEQ ID NO: 7: mutagénny primér na mutácie N88X SEQ ID NO: 8: mutagénny primér na mutácie Q126X

Zoznam sekvencií <110> Shanafelt, Armén B.

Greve, Jeffŕey M.

Jesmok, Gary Lembach, Kenneth J.

Wetzel, Gayle D.

<120 agonista a antagonista selektívnych IL-2 < 130> IL-2 sekvencia č. 1-8 <140>

<141>

<150> 09/080,080 <151> 1998-05-15 <160> 8 < 170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211>133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Ala 1

Pro

Thr

Ser

Ser 5

Ser

Thr

Lys

Lys

Thr 10

Gin

Leu

Gin

Leu

Glu 15

His

Leu

Leu

Leu

Asp 20

Leu

Gin

Met

íle

Leu 25

Asn

Gly

Zle

Asn

Asn 30

Tyr

Lys

Asn

Pro

Lys 35

Leu

Thr

Arg

Met

Leu 40

Thr

Phe

Lys

Phe

Tyr 45

Met

Pro

Lys

Lys

Ala 50

Thr

Glu

Leu

Lys

His 55

Leu

Gin

Cys

Leu

Glu 60

Glu

Glu

Leu

Lys

Pro 65

Leu

Glu

Glu

val

Leu 70

Asn

Leu

Ala

Gin

Ser 75

Lys

Asn

Phe

His

Leu 80

Arg

Pro

Arg Asp

Leu 85

íle

Ser

Asn

íle

Asn 90

Val

íle

Val

Leu

Glu 95

Leu

Lys

Gly

Ser

Glu 100

Thr

Thr

Phe

Met

Cys 105

Glu

Tyr

Ala

Asp

Glu 110

Thr

Ala

Thr

Zle

Val 115

Glu

Phe

Leu

Asn

Arg 120

Trp

íle

Thr

Phe

Cys 125

Gin

Ser

íle

Xle Ser Thr Leu Thr 130 <210>2 <211>465 <212>DNA <213> Homo sapiens <400>2 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcacCaagte ttgcacttgt cacaaacagt 60 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca eagctacaae tggagcattt actgctggat 120 ttaeagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180

SK 288100 Β6 acatttaagt gaagaactca agacccaggg acaaeattca tggattacct tttacatgcc aacctctgga acttaateag tgtgtgaata tttgtcaaag eaagaaggcc acagaaetga ggaagtgcta aatttagcte caatatcaac gtaatagttc tgctgatgag acagcaacca catcatctca acactgactt aacatcttca aaageaaaaa tggaactaaa ttgtagaatt gataa gtgtctagaa ctttcactta gggatetgaa tctgaaeaga

240

300

360

420

46S <210> 3 <211> 30 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cctcaactcc tgaattcatg tacaggatgc 30 <210>4 <211> 31 <212>DNA <213> Homo sapiens <400>4 ggaagcggat ccttatcaag tcagtgttga g 31 <210> 5 <211> 36 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gcacttgtca caaacaccat ggcacctact tcaagt 36 <210>6 <211>28 <212>DNA <213> Homo sapiens <400>6 ggagcattta ctgctgnnnt tacagatg 28 <210>7 <211> 30 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gggacttaat cagcnnnatc aacgtaatag 30 <210>8 <211> 28 <212>DNA <213> Homo sapiens <400>8 ggattacctt ttgtnnnagc atcatctc 28

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Muteín ľudského interleukínu 2 (IL-2) očíslovaný podľa prirodzeného typu II-2, kde muteín ľudského IL-2 je substituovaný vzhľadom na prirodzený typ v aspoň jednej z pozícií 20, 88 alebo 126, kde substitúcia v pozícii 20 je vybratá z izoleucínu alebo histidínu a kde substitúcia v pozícii 88 je vybratá z arginínu alebo izoleucínu alebo glycínu a kde substitúcia v pozícii 126 je leucín a pričom muteín ľudského IL-2 prednostne aktivuje T lymfocyty vzhľadom na bunky prirodzeného zabijaka.
2. 2. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje muteín podľa nároku 1 v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom.
3. 3. Polynukleotid obsahujúci DNA sekvenciu kódujúcu muteín podľa nároku 1 a jeho degenerované varianty.
4. 4. Vektor obsahujúci polynukleotid podľa nároku 3.
5. 5. Prokaryotická hostiteľská bunka transformovaná vektorom podľa nároku 4.
6. 6. Použitie muteínu podľa nároku 1, na výrobu lieku na liečenie cicavca postihnutého stavom liečiteľným IL-2, pričom stav liečiteľný IL-2 je vybraný zo súboru zahrnujúceho HIV, nádory vrátane karcinómu obličiek a malígneho melanómu, autoimunitné ochorenia, infekčné ochorenia, imunodeficiencie vrátane SCID alebo

   5 iných terapeutických aplikácií vyžadujúcich celkovú stimuláciu imunitného systému.