CZ302071B6 - Polypeptid mutovaného lidského IL-2, farmaceutický prostredek s jeho obsahem, polynukleotid a jím transformovaná hostitelská bunka a vektor s obsahem takového polynukleotidu - Google Patents

Abstract

Rešení se týká polypeptidu mutovaného lidského interleukinu (IL-2), ocíslovaného podle prirozeného IL-2, kde uvedený lidský IL-2 je substituovaný v alespon jedné z pozic 20, 88 nebo 126, pricemž uvedený mutovaný protein prednostne aktivuje T lymfocyty vzhledem k NK bunkám, farmaceutického prostredku s jeho obsahem, polynukleotidu obsahujícího DNA sekvenci kódující zmínený polypeptid a jeho degenerované varianty, prokaryotické hostitelské bunky transformované takovým polynukleotidem, vektoru s obsahem takového polynukleotidu a použití uvedeného polypeptidu podáváním jeho terapeuticky úcinného množství k lécebným úcelum a/nebo pro výrobu farmaceutického prostredku.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká oblasti farmakologie a imunologie. Vynález se zvláště týká polypeptidů mutovaného lidského interleukinu (IL-2), farmaceutického prostředku sjeho obsa10 hem, polynukleotidu obsahujícího DNA sekvenci kódující zmíněný polypeptid a jeho degenerované varianty, prokaiyotické hostitelské buňky transformované takovým polynukleotidem, vektoru s obsahem takového polynukleotidu a použití uvedeného polypeptidů podáváním jeho terapeuticky účinného množství k léčebným účelům a/nebo pro výrobu farmaceutického prostředku.

Dosavadní stav techniky

Interleukin 2 (IL-2) je silným imunostimulátorem aktivujícím různé buňky imunitního systému, včetně T lymfocytů, B lymfocytů a monocytů. IL-2 je také účinný a zásadní růstový faktor pro

T lymfocyty. Z důvodu těchto aktivit byl IL-2 testován na schopnost léčby nádorů. Lidský IL-2 je lékem pro léčbu metastatického karcinomu ledvin a metastatického melanomu schváleným FD A. Použití IL-2 u pacientů je omezeno závažnou toxicitou spojenou s terapií IL-2; je zjištěno, že pouze 20 % vhodných pacientů skutečně dostane terapii. Mezi toxicitu spojenou s terapií IL-2 patří horečka, nevolnost, zvracení, zvýšená propustnost kapilár a závažná hypotenze. I přes tyto toxické reakce je IL-2 účinnou terapií pro schválené indikace (přibližně 17 % objektivních odpovědí).

Ačkoliv strukturálně/funkční analýza myšího IL-2 byla rozsáhlá (Zurawski, S. M. and Zurawski, G., (1989) EMBO J., 8: 2583-90; Zurawski, S. M. et al., (1990) EMBO J., 9: 3899-905; Zura30 wski, G. (1991), Trends Biotechnol. 9: 250-7; Zurawski, S. M. and Zurawski, G., (1992) EMBO I, 11: 3905-10; Zurawski et al., EMBO I, 12: 5113-5119 (1993)), proběhla pouze omezená analýza lidského EL-2,

Většina studií s lidskými IL-2 mutanty byla provedena na myších buňkách; nicméně, proběhly omezené studie za použití lidských PHA-blastů, které exprimují vysoce afinitní IL-2 receptor IL-2Rapgamma. Studie na PHA-blastech potvrdily význam zbytků Asp-20 a D-šroubovice lidského IL-2. Bylo prokázáno, že pozice Asp-20 a Gln-126 lidského IL-2 jsou primárními zbytky odpovědnými za interakci s β- a gamma-podjednotkami IL-2 receptoru, v příslušném pořadí (přehled je uveden v Theze et al., Immunology Today, 17: 481-486 (1996)). Ačkoliv bylo prokázáno, že zbytky v C-šroubovici myšího IL—2 se účastní interakce s myším IL-2Rp (Zurawski et al., EMBO J., 12: 5113-5119 (1993)), nebylo prokázáno, že by ekvivalentní zbytky v lidském IL-2 měly stejné vlastnosti (těmito zbytky v lidském IL-2 by měly být Asp-84 a Asn88). Vzhledem k prokázané významné druhové specificitě mezi myším a lidským IL-2 (lidský IL-2 vykazuje 100-krát nižší aktivitu v myších systémech) je obtížné předvídat, zda stejný typ interakcí probíhá v jiném druhu. Nejsou známé žádné studie využívající buněk exprimujících pouze lidský receptor se střední afinitou IL-2Rpgamma.

Některé lidské IL-2 mutanty byly vyšetřovány na svou aktivitu na lidských PHA blastech (Xu et al., Eur. Cytokine Netw. 6: 237-244(1995)). Mutanty obsahující substituce Asp-20 leucinem so (D20L), stejně jako argininem, asparaginem a lysinem, měly těžké defekty ve své schopnosti indukovat proliferaci PHA blastů. Tak je v oboru přijímáno, že mutace Asp20 vede ke vzniku mutantů se sníženou aktivitou. Dále, Xu et al. uvádějí, že dosud (1995) nebyly identifikovány žádné použitelné IL-2 mutanty pro klinické nebo výzkumné použití.

-1 CZ 30207! B6

Lidský IL-2 Q126D mutant vytvořený Buchli a Ciardelli, Arch. Biochem. Biophys 307(2): 411 — 415 (1993) vykazuje významně sníženou aktivitu jak v účinnosti, tak v agonismu; v testech na lidských T lymfocytech vykazuje 1000—krát nižší aktivitu než IL—2 a chová se jako částečný agonista. V testech na myších T lymfocytech je tento mutant téměř inaktivní. Obě testované buněčné linie exprimovaly vysoce afinitní formu IL—2 receptorů. Na obou typech buněk vykazuje Q126D schopnost antagonizovat aktivitu zprostředkovanou 1L-2, ačkoliv v testu na lidských T lymfocytech je tato schopnost pouze částečná.

Zhi-yong, W. et al., Acta Biochimica et Biophysica Sinica 25(5): 558-560 (sept. 1993) provedli substituce na IL-2 v pozicích 62, 69, 99 a 126 a prokázali 20-násobné a 30-násobné snížení aktivity ve srovnání s přirozeným IL-2 pro 62-Leu—IL-2 a 126-Asp-IL-2, v příslušném pořadí, v testu na myších T lymfocytech (CTLL-2). Nicméně, autoři neuvádějí ani nenaznačují, že substituce v pozici 126 může způsobovat selektivní aktivitu pro T lymfocyty vzhledem kNK buňkám, ani neuvádějí, zda mají takové změny podobné účinky na lidské T lymfocyty.

Collíns, L. et al., PNAS (JSA 85: 7709-7713 (1988) popisují, že substituce Asp v pozici 20 Asn (D20N) nebo Lys (D20K) vede ke 100- násobné až 1000- násobné ztrátě vazby vzhledem k lidskému IL-2 jak na vysoce (lL-2RaPgamma, v Collins et al. označovaný jako p55/p70), tak středně (IL-2Rpagamma, v Collins et al. označovaný jako p70) afinitním receptorů. Vazba na 1L2Ra se zdá být nezměněna pro oba mutované proteiny. Tato práce uvádí, že narušení vazby na středně afinitní receptor pro IL-2 (lL-2pgamma) také vede k narušení vazby na vysoce afinitní receptor pro IL-2 (lL-2ctpgamma), což naznačuje, že různé vazby nebo aktivace mezi IL2Pgamma a IL-2aPgamma není možno dosáhnout substitucí Asp v pozici 20.

Berdnt, W. G. et al., Biochemístry 33(21): 6571—6577 (1994) použili kombinatoriální kazetovou mutagenezi pro simultánní mutování pozic 17-21 v přirozeném IL-2, o kterých se předpokládá, že interagují se středně afinitním receptorem pro IL-2. Z 2610 vyšetřovaných klonů bylo pouze 42 klonů aktivních. Výzkumníci zjistili, že pozice 20 a 21 mají zásadná význam pro biologickou aktivitu. Nejsou zde uvedeny ani naznačeny jednotlivé substituce s výjimkou L21 V.

Patent US 5 229 109 (Grimm et al.) popisuje toxicitu analogů IL-2 používaných pro imunoterapii a léčbu nádorů. Vlastnosti dvou analogů IL-2 se substitucemi v pozicích Arg38 (na alanin) a Phe42 (na lysin) byly analyzovány a srovnány s vlastnostmi přirozeného IL-2. Bylo zjištěno, že analogy si uchovávají schopnost vazby na středně afinitní receptor pro IL—2, ale váží se pouze minimálně na takzvaný „vysoce afinitní“ receptor pro IL-2. V současnosti se předpokládá, že středně afinitní receptor se skládá pouze z p75 (ÍL-2Rp) a vysoce afinitní receptor se skládá z pouze p55 + p75 receptorového komplexu (IL—2Rap). Analogy si také uchovávají svou schopnost stimulovat mononukleámí buňky periferní krve za vzniku lymfokiny aktivovaných zabíječů „LAK buněk“. Je významné, že sekrece IL— l β a TNFa byly významně sníženy v reakci na analogy ve srovnání s přirozenou IL-2 molekulou. Aminokyselinové zbytky popsané v této přihlášce jsou ty zbytky, které by měly specificky interagovat s IL-2Ra (p55); eliminace interakcí s IL2Ra vede ke snížení aktivity na buňkách nesoucích vysoce afinitní receptor pro IL-2 a neměla by ovlivnit aktivitu buněk nesoucích středně afinitní receptor pro IL-2. Tak by měla být udržena tvorba LAK buněk (o kterých se předpokládá, že pocházejí zNK buněk). Zde popsané mutanty se týkají aminokyselinových zbytků 20, 88 a 126; předpokládá se, že tyto aminokyseliny specificky interagují s IL-2R(p75; pozice 20 a 88) a IL-2Rgamma (nebylo známo v době podání patentu od Grima a kol., pozice 126). V důsledku toho zůstávají interakce s lL-2Ra nezměněny. Mechanisticky by mutanty popsané Grimtnem a kol. měly snižovat interakce s vysoce afinitním receptorem pro IL-2, ale neměly by mít vliv na interakce s receptorem pro IL-2 se střední afinitou; mutanty popsané v předkládaném vynálezu by měly mít opačné charakteristiky - měly by mít zvýšenou schopnost interakce s receptorem pro IL-2 se střední afinitou (IL-2R3gamma) a měly by mít malý nebo žádný defekt funkčních interakcí s receptorem pro IL-2 s vysokou afinitou (IL-2Rapgamma).

-2CZ 302071 B6

Patent US 5 206 344 (Goodson et al.) popisuje mutanty IL-2, ve kterých je jeden z aminokyselinových zbytků zralé přirozené sekvence IL-2 nahrazen cysteinovým zbytkem, které jsou potom připraveny a konjugovány prostřednictvím cysteinového zbytku s polymerem vybraným zhomopolymerů polyethylenglykolu nebo póly ethoxy lovaných polyolů, kde homopolymery jsou nesubstituované nebo substituované na jednom konci alkylovou skupinou. Tyto mutanty jsou připraveny expresí mutantních genů v hostiteli, kde tyto mutantní geny byly připraveny z genů původních proteinů místně cílenou mutagenezí. Dále, jiné druhy IL-2 mohou být konjugovány prostřednictvím cysteinového zbytku v pozici 125 zralého IL-2 proteinu, která není nutná pro biologickou aktivitu IL-2. Není zde uveden popis mutací, které způsobují sníženou toxicitu.

Patent US 4 959 314 (Lín et al.) popisuje mutanty biologicky aktivních proteinů, jako je IFN-β a IL-2, ve kterých byly cysteinové zbytky, které nejsou zásadní pro biologickou aktivitu, deletovány nebo nahrazeny jinými aminokyselinami za účelem eliminace míst pro intermo leku lové zesítění nebo tvorbu nesprávných intermolekulových disulfidových můstků. Tyto mutanty byly připraveny bakteriální expresí mutantních genů kódujících mutantní proteiny, kde tyto mutantní geny byly připraveny z genů původních proteinů oligonukleotidy řízenou mutagenezí. Není zde uveden popis mutací, které způsobují sníženou toxicitu.

Patent US 5 116 943 (Halenbeck et al.) popisuje, že biologicky aktivní referenční terapeutický protein je chráněn před oxidací způsobem obsahujícím substituci konzervativních aminokyselin za každý methionylový zbytek citlivý na oxidaci chloram i nem T nebo peroxidem, kde ostatní, necitlivé methionylové zbytky nejsou substituované. Takto připraveným mutantem resistentním na oxidaci je výhodně lidský mutant interleukinu 2 nebo interferonu β a konzervativní aminokyselinou je nejlépe alanin. Není zde uveden popis mutací, které způsobují sníženou toxicitu.

Patent US 4 853 332 (Mark et al.) se týká mutantů IL-2 a IFN-gamma, ve kterých byly cysteinové zbytky, které nejsou zásadní pro biologickou aktivitu, deletovány nebo nahrazeny jinými aminokyselinami za účelem eliminace míst pro intermolekulové zesílení nebo tvorbu nesprávných intermolekulových disulfidových můstků. Patent popisuje, že substituce cysteinu 125 serinem v IL-2 vede ke vzniku mutantu s aktivitou srovnatelnou s přirozeným IL-2.

Patent US 5 696 234 (Zurawski et al.) se týká mutantů savčích cytokinů a způsobů pro vyhledávání agonistů a antagonistú savčích cytokinů. Přesněji, bylo prokázáno, že lidský dvojitý mutant IL-2 P82A/Q126D má antagonistickou aktivitu na myších Baf3 buňkách současně transferovaných lidskou a a β podjednotkou IL-2R. Je uvedena slabá agonistická aktivita. Také je uvedeno, že mutanty myšího IL-2 vykazují Částečně agonistickou a antagonistickou aktivitu na HT2 buňky, zejména Q141D, Q141K, QI41V a Q141L. Nejsou popsány žádné aktivity mutantů, které by vykazovaly nebo naznačovaly selektivní agonistické účinky pro mutace v pozicích 20, 88 a 126.

Zurawski et al. popisují mutanty myšího IL-2, které jsou aktivní na buňkách exprimujících 1L2RaPgamma, ale inaktivní na buňkách exprimuj ících IL-2Rαβgamma (Zurawski, G., Trends Biotechnol. 9: 250-257 (1991); Zurawski, S. M. and Zurawski, G. Embo J., II: 3905-3910 (1992)). Mutanty myšího IL-2, které mají tyto vlastnosti, mají substituce Asp-34 na Ser nebo Thr a Gin—141 na Lys. Asp-34 a Gin—141 myšího IL-2 se zdají být ekvivalenty Asp-20 a Gln141 lidského IL-2, v příslušném pořadí. Ačkoliv se tyto práce týkají „selektivního agonisty“ IL2, nepopisují, že by byly méně toxické, ale spíše je popisují jako potenciální antagonisty endogenního IL-2.

EP 0267795 A2 (Zurawski et al.) popisuje různé mutanty myšího IL-2, včetně některých mutantů obsahujících delece a/nebo substituce v prvních třiceti N-koncových aminokyselinových zbytcích, které jsou biologicky kompetentní, ale tato práce neobsahuje, neuvádí ani nenaznačuje zde popsané aminokyselinové substituce v ekvivalentních zbytcích myšího IL-2. Existuje potřeba vylepšené IL-2 molekuly, která by měla nižší toxicitu a která by byla lépe tolerována.

-3 C7 302071 B6

Taniguchi et al., US 4 738 927 popisuje rekombinantní DNA, která obsahuje rekombinantní DNA kódující polypeptid mající biologickou aktivitu IL-2, kde uvedenou aktivitou je navození růstu buněčné linie cytotoxických T-lymfocytů, a DNA vektor schopný propagace v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách, kde kódující sekvence uvedeného genu je umístěna v pozici za promotorovou sekvencí, kde uvedený polypeptid je tvořen celkem 132 až 134 aminokyselinami v aminokyselinové sekvence polypeptidu. Také jsou popsány geny, rekombinantní DNA vektory, hostitelské buňky a způsoby pro rekombinantní produkci přirozeného 1L—2. Taniguchi et al. nepopisují jakékoliv varianty nebo mutanty a neuvádějí, které pozice v proteinu jsou odpovědné za přenos signálu nebo vazebnou aktivitu.

H)

Je jasné, že jsou potřebné mutanty 1L-2, které nevykazují toxicitu omezující dávku současných mutantů IL-2, aby bylo možno využít terapeutický potenciál tohoto cytokínu.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je polypeptid mutovaného lidského interleukinu 2 (IL-2), očíslovaného podle přirozeného typu IL-2, kde uvedený mutovaný lidský IL-2 je substituován vzhledem k přirozenému typu v alespoň jedné z pozic 20, 88 nebo 126, kde substituce v pozici 20 je vybrá20 na z isoleucinu nebo histidinu, a kde substituce v pozici 88 je vybrána z argininu nebo isoleucinu nebo glycinu a kde substituce v pozici 126 je leucin, a přičemž uvedený mutovaný lidský IL-2 přednostně aktivuje T lymfocyty vzhledem k buňkám přirozeného zabíječe.

Předmětem tohoto vynálezu je také farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje polypeptid vymezený svrchu, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Předmětem tohoto vynálezu je také polynukleotid obsahující DNA sekvencí kódující svrchu vymezený polypeptid a jeho degenerované varianty. Předmětem tohoto vynálezu je rovněž prokaryotická hostitelská buňka transformovaná tímto polynukleotidem. Předmětem tohoto vynálezu

3o je dále vektor obsahující takový polynukleotid.

Předmětem tohoto vynálezu je také svrchu vymezený polypeptid pro léčení savce postiženého stavem léčitelným IL-2, podáváním terapeuticky účinného množství tohoto polypeptidu. Přitom účelně léčitelný stav IL-2 je vybrán ze souboru zahrnujícího HIV, nádory včetně karcinomu led35 vin a maligního melanomu, autoimunitní onemocnění, infekční onemocnění, imunodeficienci včetně SCID nebo jiné terapeutické aplikace vyžadující celkovou stimulaci imunitního systému.

Předmětem tohoto vynálezu je také použití svrchu vymezeného polypeptidu obsahujícího mutovaný lidský interleukin 2 (IL-2) očíslovaného podle přirozeného typu IL-2, pro výrobu farma40 ceutického prostředku pro přednostní aktivaci T lymfocytů vzhledem k buňkám přirozeného zabíječe, kde uvedený mutovaný lidský IL-2 je substituovaný vzhledem k přirozenému typu v alespoň jedné z pozic 20, 88 nebo 126, a kde substituce v pozici 20 je vybrána z isoleucinu nebo histidinu, a kde substituce v pozici 88 je vybrána z argininu nebo isoleucinu nebo glycinu, a kde substitucí v pozici 126 je leucin.

Dále se uvádějí podrobnější a doplňkové údaje, které souvisejí s předkládaným vynálezem.

Vynález umožňuje dosáhnout nové prostředky pro selektivní aktivaci T lymfocytů (PHA-blastů), které mají nízkou aktivační schopnost pro NK buňky („přirozené zabíječe). Nové prostředky obsahují varianty cytokinové rodiny, přesněji lidského interleukinu 2.

Vynález svým zaměřením na svrchu popsaný polypeptid poskytuje méně toxický mutovaný IL-2, který umožňuje větší terapeutické využití tohoto interleukinu.

-4CZ 302071 B6

Vynález je zaměřen na mutovaný ÍL-2 obsahující jednu mutaci v pozicích aspartat 20, asparagin 88 a glutamin 126. Konkrétní mutanty jsou reprezentovány zkratkami D20X, N88X a Q126X, kde „X“ je specifická aminokyselina, která po substituci v lidském IL-2 způsobuje selektivní aktivitu pro buňky exprimuj ící IL-2Rαβgamma receptor (například T lymfocyty) vzhledem k buňkám exprimuj ícím IL-2Rβgamma receptor (například NK buňkám). Mezi mutanty vykazující více než 1000-násobnou selektivitu patří D20H, D20I, N88G, N88I, N88R a Q126L. Konkrétně, tyto mutanty také působí na T lymfocyty v podstatě aktivitou přirozeného IL-2. Jsou identifikovány také další mutace, které způsobují selektivitu nižší než 1000-násobnou, ale vyšší než 10-násobnou. Vynález také obsahuje póly nukleotidy kódující mutanty podle předkládaného vynálezu, vektory obsahující polynukleotidy, transformované hostitelské buňky, farmaceutické prostředky obsahující mutanty a terapeutické způsoby léčby za použití mutantů.

Vynález také umožňuje způsob pro selekci mutantů IL-2 pomocí testu využívajícího 1Ε-2αβgamma ve srovnání s IL-2Rβgamma, kde aktivita mutovaného IL-2 je zvýšena vzhledem k aktivitě přirozeného IL-2 v jednom testu více než ve druhém. IL-2R<^gamma a lL~2Rpgamma jsou vhodné kombinace ektodomén receptorových podjednotek ajsou použity pro přímé měření vazby mutovaných IL-2 na každý receptorový komplex. IL-2c^gamma test využívá odpovědi buněk nesoucích lL-2αβgamma a IL-2pgamma test využívá odpovědi buněk nesoucích IL-2pgamma. Buňkou nesoucí IL-2apgamma je PHA-blast a buňkou nesoucí IL-2pgamma je NK buňka. Testem je proliferace buněk nesoucích IL-2apgamma a IL-2pgamma.

Vynález se také týká vektoru obsahujícího polynukleotid kódující mutant podle předkládaného vynálezu, který řídí expresi mutovaného lidského IL-2 majícího aktivační aktivitu pro PHAblasty, ale sníženou aktivační aktivitu pro NK buňky, kde uvedený vektor může být transfektován do cílového organismu a potom může in vivo exprimovat uvedený mutovaný lidský IL-2 kódovaný uvedeným polynukleotidem.

Vynález umožňuje léčbu pacienta postiženého onemocněním léčitelným IL-2, při kterém je uvedenému pacientovi podáno terapeuticky účinné množství mutovaného lidského IL-2. očíslovaného podle přirozeného IL-2, majícího aktivační aktivitu pro PHA-blasty, ale sníženou aktivační aktivitu pro NK buňky. Tento způsob je použitelný tehdy, když onemocněním léčitelným IL-2 je HIV, nádor, autoimunitní onemocnění, infekční onemocnění, pri provádění protinádorové vakcinace, kde je použit jako adjuvans a pří běžné vakcinaci, pro imunitní stimulaci ve stáří nebo u jinak imunokompromitovaných pacientů, stejně jako u lidských pacientů se SCID, nebo při jiných terapeutických aplikacích vyžadujících stimulaci imunitního systému.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 až 7 ukazují křivky dávka - odpověď pro přirozený lidský IL-2 (IL-2) a D20H (obr. 1), IL-2 a D20I (obr. 2), IL-2 a N88G (obr. 3), IL-2 a N88I (obr. 4), IL-2 a N88R (obr. 5), IL-2 a Q126E (obr. 6) a IL-2 a Q126L (obr. 7). A: jednotlivé křivky závislosti na dávce IL-2 (plné kroužky) a mutantního proteinu (prázdné kroužky) pro test proliferace primárních lidských T lymfocytů (PHA blastů). B. jednotlivé křivky závislosti na dávce IL-2 (plné trojúhelníčky) a mutantního proteinu (prázdné trojúhelníčky) pro test proliferace primárních lidských NK buněk.

Obr. 8A-8D. Toxicita Proleukinu™ u šimpanzů byla hodnocena na dvou zvířatech (X-159, trojúhelníčky, a X-124, čtverečky), ve srovnání s kontrolním vehikulem (X-126, kosočtverec ky). Toxicita byla hodnocena podle renálních parametrů (dusíkaté metabolity v krvi (BUN), A; Kreatinin, B) a jaterních funkcí (celkový bilirubin, C; ALT, D).

Obr. 9. Graf změny tělesné hmotnosti během 30 dnů. Tělesná hmotnost zvířat léčených IL2/N88R (trojúhelníčky), Proleukinem (čtverečky) nebo vehikulem (kosočtverečky) byla měřena v uvedené dny.

-5CZ 302071 B6

Obr I0A-10D. V uvedené dny byl hodnocen počet lymfocytů (A), celkový počet leukocytů (B), neutrofilů (C) a trombocytú (D) u zvířat léčených IL-2/N88R (trojúhelníčky), Proleukinem (čtverečky) nebo vehikulem (kosočtverečky).

Obr I I A-l ID. V uvedené dny byla hodnocena močovina (A, BUN), kreatinin (B), fosfor (C) a aniontová mezera (D) u zvířat léčených 1L-2/N88R (trojúhelníčky), Proleukinem (čtverečky) nebo vehikulem (kosočtverečky).

Obr 12A-12D. V uvedené dny byl hodnocen celkový bilirubin (A), ALT (B), tlbrinogen (C) a aktivovaný protrombinový čas (D) u zvířat léčených IL-2/N88R (trojúhelníčky), Proleukinem (čtverečky) nebo vehikulum (kosočtverečky).

Obr 13A-13D. V uvedené dny byly hodnoceny koncentrace sodíku (A), chloridů (B), vápníku (C) a draslíku (D) v krvi zvířat léčených IL-2/N88R (trojúhelníčky), Proleukinem (čtverečky) nebo vehikulem (kosočtverečky).

Obr I4A-14C. V uvedené dny byly hodnoceny koncentrace albuminu (A), hematokrit (B), a hemoglobin (C) v krvi zvířat léčených IL-2/N88R (trojúhelníčky), Proleukinem (čtverečky) nebo vehikulum (kosočtverečky).

Obr 15A-15B. Jsou uvedeny vlivy IL-2/N88R (čtverečky), Proleukinu (kosočtverečky) a vehikula (trojúhelníčky) na celkovou populaci T lymfocytů (A, CD3+ buňky), populaci CD4+ T lymfocytů (B), a na populaci CD8+ T lymfocytů.

Obr 16A-16B. Jsou uvedeny vlivy IL-2/N88R (čtverečky), Proleukinu (kosočtverečky) a vehikula (trojúhelníčky) na celkovou populaci T lymfocytů (A, CD3+ buňky), populaci CD4+ T lymfocytů (B), a na populaci CD8+ T lymfocytů.

Obr 17. Efekt IL-2/N88R a Proleukinu na aktivaci T lymfocytů s ohledem na průměr fluorescence CD25 pozitivních buněk. Vliv IL-2/N88R (čtverečky), Proleukinu (kosočtverečky) a vehikula (trojúhelníčky) je uveden pro populaci CD3+, CD4+ T lymfocytů. Pro hodnocení průměrné fluorescence této populace nebyl získán dostatečný počet CD3+/CD8+ buněk.

Obr. I8A-18B. Jsou uvedeny vlivy IL-2/N88R (čtverečky), Proleukinu (kosočtverečky) a vehikula (trojúhelníčky) na populaci CD4+ T lymfocytů (A, CD3+/CD4+ buňky), populaci CD8+ T lymfocytů (B, CD3+/CD8+ buňky), a na populaci všech T lymfocytů (C, CD3+ buňky) a na populaci NK buněk (D, CD3-/CD16+ buňky).

Obr 19. Graf plicních metastáz vzhledem k dávce u myší léčených Proleukinem (prázdná kolečka) nebo 1L-2/N88R (plná kolečka). Plicní metastázy byly počítány pri ukončení studie.

Obr 20. plazmidová mapa 1L2N88R vektoru pBCl IL2SA.

Popis výhodných provedení

A. Obecná část

Účinek IL—2 na T lymfocyty je zprostředkován vazbou na IL—2 receptorové proteiny. Různé buněčné povrchové proteiny na T lymfocytech váží IL-2. Prvním identifikovaným receptorem je jeden polypeptid, označený IL-2Ra, který je 55 kD polypeptid (p55), který se objevuje po aktivaci T lymfocytů a který byl původně označen Tac (podle T aktivace) antigen. lL-2Ra váže IL-2 s K_d přibližně 10 ⁸ M aje také znám jako „nízce afinitní IL-2 receptor. Vazba IL-2 na buňky exprimující pouze lL-2Ra nevede k žádné detekovatelné biologické odpovědi.

-6CZ 302071 B6

Druhým 1L-2 receptorem je vazebný komplex složený z IL-2Rb a IL-2Rg; IL-2Rg, 64 kD polypeptid, je také známý jako společný gamma (gamma^) řetězec, protože je společný pro mnoho receptorů pro cytokiny. IL-2Rb má velikost přibližně 70 až 75 kD (proto je označován jako p70 nebo p75) a patří do rodiny cytok i nových receptorů typu I, která je charakterizována motivem dva cysteiny/WSXWS. IL-2Rp je exprimován současně s gammac. Afinita vazby IL-2 na IL2Rpgammac je vyšší než afinita vazby na IL-2Ra, s K_d přibližně 10 ^y M; také se označuje jako „středně afinitní“ receptor pro IL-2. IL-2 způsobuje růst buněk exprimujících IL-2Rpgamma<; a polovina maximální stimulace růstu se vyskytuje pri stejné koncentraci IL-2, která způsobuje polovinu maximální vazby (tj. I x 10^_9M). IL-2Rpgammac je signální receptorový komplex, který může vázat IL— 15.

Třetí známý IL-2 receptorový komplex je IL-2Rotpgamma<_; komplex. Buňky, které exprimují jak IL-2Ra, tak IL^Rpgamma^, mohou vázat IL-2 mnohem pevněji, s K_d přibližně 10^-1 ’ M, a proto je tento komplex také známý jako „vysoce afinitní“ komplex. Stimulace růstu takových buněk probíhá pri podobně nízkých koncentracích IL-2. Jak vazba IL-2, tak stimulace růstu mohou být blokovány protilátkami proti IL-2Ra, IL-2Rp nebo gamma^ a nejúěinněji kombinací protilátek k více podjednotkám receptoru. Tato pozorování naznačují, že lL-2Rct tvoří komplex s IL2Rpgammac, což zvyšuje afinitu signálního receptoru k IL-2 a tak umožňuje dodání růstového signálu při významně nižších koncentracích IL-2. Předpokládá se, že IL-2 se nejprve rychle váže na IL-2Ra a tato vazba usnadňuje asociaci s IL-2Rpgammac. Klidové T lymfocyty exprimují IL-2Rpgamma_c, ale pouze malá množství IL-2Rct; zvýšení povrchové exprese IL-2Ra může být stimulováno IL-2. Při aktivaci T lymfocytů zprostředkované receptorem pro antigen se rychle exprimuje lL-2Ra, což snižuje koncentraci IL-2 potřebnou pro stimulaci růstu. Vazba IL-2 na IL-2Rβgamma_<: komplex vede k přenosu signálu Jak/STAT signalizační dráhou.

Objevili jsme mutanty lidského IL-2, které přednostně aktivují T lymfocyty (PHA blasty; buňky, které exprimují vysoce afinitní receptor pro IL-2 - IL-2Rpgamma) před NK buňkami (buňky, které exprimují středně afinitní receptor pro IL-2 - IL-2Rpgamma). Mutanty se substitucí Asp20 za histidin (D20H) nebo isoleucin (D20I), Asn-88 za arginin (N88R), glycin (N88G) nebo isoleucin (N88I) nebo Gln-126 za leucin (Q126L) nebo glutamát (Q126E) vykazují neočekávaně úplnou aktivitu IL-2 na pHA blastech a slabou (pokud nějakou) aktivitu na NK buňky. Předchozí studie mutovaných lidských IL-2 spočívaly v analýze myších buněčných systémů a když byly použity lidské buňky, tak nebyly použity buňky exprimující pouze IL-2RPgamma (jako jsou NK buňky). Dále, studie využívající lidské PHA blasty ukázaly, že substituce Asp-20 (Leu, Arg, Asp nebo Lys; Xu et al., Eur. Cytokine Netw. 6; 237-244 (1995) nebo Gln-126 (Asp; Buchli and Ciardelli, Arch. Biochem. Biophys 307(2): 411-415 (1993)) vedly k zisku mutantních lidských IL-2 mající vážně narušenou aktivitu. Předešlé studie provedené za použití myšího IL-2 identifikovali mutované myší IL-2 mající různé aktivity (Zurawski et al., EMBO J., 12: 5113-5119 (1993)), ale žádná z mutací nevedla k výsledkům, které by byly podobné výsledků získaným v předkládaném vynálezu. Mutantní lidské IL-2 obsahující identické mutace v synonymnich pozicích s mutantním myším IL-2 neměly podobné aktivity a proto se zdá, že myší příklady nejsou použitelné pro předpovězení funkce lidských mutantů. Vynálezcům nejsou známé žádné studie mutovaných lidských IL-2 srovnávající relativní aktivity na lidských buňkách exprimujících IL-2 receptor IL-2Rapgamma (například PHA-blastech) a na buňkách exprimujících IL-2 receptor IL2RPgamma (například NK buňkách). Předpokládá se, že analýza in vivo potvrdí, že popsané mutanty mají lepší terapeutický index in vivo oproti přirozenému lidskému IL-2 z důvodů snížené toxicity, což umožňuje získání terapeuticky použitelných prostředků pro léčbu onemocnění vyžadujících stimulaci imunitního systému.

Interleukin 2 (IL-2) je v současnosti používán klinicky pro léčbu metastazuj ícího karcinomu ledviny. Nicméně, jeho závažná toxicita omezuje jeho použití pouze na podskupinu nejzdravějších pacientů a toxicita limitující dávku snižuje, jeho celkovou účinnost. Předpokládá se, že akutní toxicita IL-2 je zprostředkována aktivací NK buněk, zatímco jeho účinnost je zprostřed-7 C7 302071 B6 kována přímou aktivací T lymfocytů (Jacobson et al.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA (United States), Sep 17, 1996, 93(19): 10405-10; Smith, K. A.. Blood 1993, 81(6) str. 1414-23; Kaplan et al., Biotechnology 10(2): 157-62). T lymfocyty exprimují jiný receptor pro IL—2 než NK buňky (T lymfocyty: IL-2Rapgamma, vysoce afinitní receptor pro IL—2; NK buňky, IL-2Rpgamma, středně afinitní receptor pro IL-2). Zde popsané mutanty lidského IL-2 selektivně aktivují receptor pro IL-2 T lymfocytů a nikoliv receptor pro IL-2 NK buněk.

Terapie nízkými dávkami IL-2 byla použita s určitým úspěchem pro překonání přímé aktivaci NK buněk (Jacobson et al., Proč .Nati. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 10405-10). Tato strategie vyuio žívala teorie, že při nízkých dávkách IL-2 je aktivován pouze vysoce afinitní receptor pro IL-2 a nikoliv receptor pro IL-2 se střední afinitou. Forma receptoru pro IL-2 se střední afinitou, IL2Rpgamma, je exprimována pouze na NK buňkách, zatímco T lymfocyty exprimují vysoce afinitní formu, lL-2Rctpgamma.

Nicméně vynálezci řeší problémy toxicity jiným způsobem. Narušení interakcí IL-2 s IL-2Rp a/nebo IL-2Rgamma pomocí modifikace specifických vazebných zbytků na vazebném povrchu IL-2 by mělo zabránit účinné vazbě (a proto aktivaci) buněk exprimujících pouze lL-2RPgamma.Nicméně, na buňkách exprimuj ících IL-2Rapgamma stále probíhá počáteční vazba na IL2Ra a tak vazba na buňky a proto může terapie nízkými dávkami navržená. Jacobsem a kol. stále ještě vykazovat toxické vedlejší účinky. Z důvodu vazby na lL-2Rct může na buněčném povrchu proběhnout účinná aktivace IL-2RP a IL-2Rgamma, i přes narušené interakce modifikovaného IL-2 s lL-2Rp a/nebo lL-2Rgamma. Tak. může být vytvořen komplex lL-2/lL-2Rapgamma schopný přenosu signálu. Varianta IL-2 může být schopna selektivně aktivovat vysoce afinitní receptory pro IL-2 na T lymfocytech přednostně před středně afinitními receptory pro IL-2 na

NK buňkách a proto může podle našich předpokladů mít zvýšený terapeutický index vzhledem k přirozenému IL-2 z důvodu snížené toxicity. Varianta IL—2 se zvýšeným terapeutickým indexem by měla mít výrazně širší rozsah použití jak při léčbě nádorů (jako přímá a/nebo pomocná léčba), tak. při léčbě imunodeficiencí (jako je například HIV, tuberkulosa). Další potenciální využití 1L—2 jsou odvozeny od jeho Ímunostimulační aktivity a zahrnují spolu s přímou léčbou nádorů, imunodeficiencí jako je HIV nebo lidská SCID také léčbu infekčních onemocnění, jako tuberkulóza; použití jako adjuvans v „protinádorové vakcíně“; a použití při stimulaci imunitního systému, jako je například standardní vakcinace nebo léčba starých nemocných.

Vhodné substituce v Asp-20, Asn-88 nebo Gln-126 redukují vazebné interakce s IL-2Rp (Asp35 20 a Asn-88) nebo IL-2Rgamma (Gln-126). Každá substituce vede ke vzniku mutantů IL-2, které si zachovávají svou aktivitu na T lymfocyty a které mají sníženou aktivitu na lidské NK buňky.

Protože není možné předpovídat vliv dané substituce před hodnocením v testech na NK a T buň40 kách, byly všechny možné substituce přirozených aminokyselin (kromě Cys) provedeny v pozicích Asp-20, Asn-8 a Gin 126 a omezená, ale různorodá sada mutací byla provedena v pozici Asp-84 pro testování toho, zda tyto mutanty interagují s IL-2Rp. Další mutace v pozici Asp-84 byly testovány tehdy, pokud byl pozorován jejich zřetelný efekt na interakce s IL-2Rp. Data pro 46 samostatných substitucí v těchto pozicích jsou uvedeny v tabulce 1, dále,

Mutace byly připraveny za použití místně cílené mutageneze na přirozené lidské cDNA pro IL-2. Správné klony byly subklonovány do expresního vektoru vhodného pro expresi v heterologním systému (například E. coli, bac ulov i ru, kvasinkách nebo savčích buňkách, jako jsou například ovariální buňky čínského křečka (CHO). Přečištěné proteiny byly testovány v testu proliferace

T-lymfocytů (PHA blastů) a testu proliferace NK buněk. Různé reakce vyvolané jednotlivými mutanty v těchto dvou testech, tj. EC₅₀, ukázaly mutace, které mají tyto aktivity. Přesněji, mutanty, které stimulují relativně silnější reakci v testu na PHA-blastech (T lymfocytech) (oproti přirozenému IL-2) ve srovnání s reakcí v textu na NK buňkách (oproti přirozenému IL-2) budou ukazovat na substituce, které dodávají buněčnou specificitu založenou na schopnosti vazby speci-8CZ 302071 B6 fíckých mutantů na IL-2Rapgamma a aktivace IL-2Rapgamma exprimovaného na těchto buňkách, ale na neschopnosti vázat se na - a tak aktivovat - buňky exprimující pouze IL-2Rpgamma. Mutanty IL-2 vykazující tuto vlastnost budou proto in vivo mít imunostimulační vlastnosti se sníženou toxicitou spojenou s terapií IL-2 ve smyslu vyšší propustnosti kapilár a hypotense.

B. Definice

Jak je zde použit, označuje termín „přirozený IL-2“ IL-2, ať přirozený, nebo rekombinantní, který se skládá ze 133 aminokyselinové obvyklé sekvence přirozeného lidského IL-2 (bez signálního peptidu, který se skládá z dalších 20 N-koncových aminokyselin), jehož aminokyselinová sekvence je popsána ve Fujita et aL, PNAS USA 80: 7437-7441 (1983), s nebo bez dalšího Nkoncového methioninu, který musí být použit tehdy, je-li protein exprimován jako intracelulární frakce v E. coli.

Jakje zde použit, označuje termín „mutantní IL-2“ polypeptid, ve kterém byly provedeny specifické substituce vzhledem ke zralému lidskému interleukinu-2. Tabulka 1, dále, popisuje 46 jednotlivých připravených substitucí v IL-2 a jejich příslušnou aktivitu. Výhodnými provedeními jsou ty mutanty, které mají alespoň 100-násobnou relativní aktivitu. Zejména výhodnými provedeními jsou ty mutanty, které mají alespoň 1000-násobnou relativní aktivitu: aspartatový (Asp) zbytek (D) v pozici 20 („D20“), při číslování podle přirozeného IL-2, je substituovaný isoleucinem („D201“) nebo histidinem („D20H“); asparaginový zbytek (Asn) v pozici 88 (N88) je substituovaný isoleucinem (N88I), glycinem (N88G) nebo argininem (N88R); a glutaminový zbytek (Gin) v pozici 126 (Q126) je substituovaný leucinem (Q126L), glutamatem (Q126E) nebo aspartatem (Q126D). Výhodně IL-2 mutanty mají v ostatních nesubstituovaných zbytcích aminokyselinovou sekvenci identickou s přirozeným IL-2. Nicméně, mutanty IL-2 podle předkládaného vynálezu mohou být také charakterizovány aminokyselinovými insercemi, de lečem i, substitucemi a modifikacemi v jednom nebo více místech v nebo na jiných zbytcích přirozeného řetězce IL-2 polypeptidu. Podle předkládaného vynálezu může jakákoliv taková inserce, delece, substituce a modifikace vést ke vzniku mutantu IL-2, který si zachovává selektivní aktivitu pro pHA blasty a zároveň má sníženou schopnost aktivovat NK buňky a spadá do rozsahu předkládaného vynálezu.

Kombinováním výhodných nebo zejména substitucí popsaných výše v jedné rekombinantní molekule IL-2 může vést ke kombinovaným mutantům majícím aktivitu podobnou aktivitě popsané pro mutanty s jednou mutací. Například, může se předpokládat, že molekula IL-2 obsahující kombinaci dvou nebo více mutací vybraných z tabulky 1 může být agonistou IL-2 selektivním pro T lymfocyty s relativní aktivitou podobnou relativní aktivitě jednotlivých zde popsaných substitucí. Kombinované mutanty spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Upřednostňujeme konzervativní modifikace a substituce v jiných pozicích IL-2 (tj. takové, které mají minimální vliv na sekundární a terciální strukturu mutantu). Mezi takové konzervativní substituce patří substituce popsané v Dayhoff: The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, (1978), a v Argos, EMBO J., 8: 799-785 (1989). Například, aminokyseliny náležící do jedné z následujících skupin představují konzervativní změny:

- ala, pro, gly, gin, asn, ser, thr;

- cys, ser, tyr, thr;

- val, ile, leu, met, ala, phe;

- lys, arg, his;

- phe, tyr, trp, his; a

- asp, glu.

-9CZ 30207Í B6

Dále upřednostňujeme modifikace a substituce, které nevkládají místa pro další intermolekulové zesítění nebo nesprávnou tvorbu disulfidových vazeb. Například, je známo, že IL-2 obsahuje tři cys zbytky, v pozicích 58, 105 a 125 zralé sekvence.

Termín „číslování podle sekvence přirozeného IL-2“ označuje identifikaci vybrané aminokyselinové sekvence s ohledem na pozici, ve které se aminokyselina normálně vyskytuje ve zralé sekvenci přirozeného IL-2. Když jsou v mutantním IL—2 provedeny inserce nebo delece, tak může být Asp, který je normálně v pozici 20, posunut v mutantní proteinu, jak je odborníkům jasné. Nicméně, umístění posunutého Asp může být snadno určeno prohlédnutím a srovnání sousedních aminokyselin s aminokyselinami sousedícími v Asp v přirozeném IL-2.

Termín „buňky obsahující IL-2Rapgamma receptor“ označuje buňky, o kterých je známo, že mají receptor tohoto typu, tj. T lymfocyty, aktivované T lymfocyty, B lymfocyty, aktivované monocyty a aktivované NK buňky. Termín „buňky obsahující IL-2Rpgamma receptor“ označuje buňky, o kterých je známo, že mají receptor tohoto typu, tj. B lymfocyty, klidové monocyty a klidové NK buňky.

IL-2 mutanty podle předkládaného vynálezu mohou být produkovány jakoukoliv vhodnou metodou známou v oboru. Mezi takové metody patří konstrukce DNA sekvence kódující IL-2 mutanty podle předkládaného vynálezu a exprese těchto sekvencí ve vhodně transformovaném hostiteli. Tento způsob produkuje rekombinantní mutanty podle předkládaného vynálezu. Nicméně, mutanty podle předkládaného vynálezu mohou být také produkovány, i když méně výhodně, chemickou syntézou nebo kombinací chemické syntézy a rekombinantní DNA technologie. Způsoby vsádkové produkce nebo perfuzní produkce jsou odborníkům v oboru známé. Viz Freshey, R. 1. (ed.) „Animal Cell Culture: A Practical Approach“, 2. vydání, 1992, IRL Press, Oxford, England; Mather, J. P. „Laboratory Scaleup of Cell Cultures (0,5-50 liters“), Methods Cell Biology 57; 219-527 (1998); Hu, W. S. and Aunins, J. G. „Large-Scale mammalian Cell Culture“, Curr. Opin. Biotechnol. 8: 148-153 (1997); Konstantinov, K. B„ Tsai, Y., Moles, D„ matanguihan, R„ „Control of long-term perfuzin Chinese hamster ovary cell culture by glucosa auxostat“, Biotechnol. Prog. 12: 100-109(1996).

V jednom provedení rekombinantní metody pro produkci mutantů podle předkládaného vynálezu je DNA sekvence konstruována izolací nebo syntetizováním DNA sekvence kódující přirozený IL-2 a potom změnou kodonu pro Asp20 na kodon pro isoleucin (l) místně cílenou mutagenezí. Tato technika je dobře známá. Viz například Mark et al„ „Site-specific Mutagenezis Of The Human Fibroblast Interferon Gene“, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 5662-66 (1984); a patent US4588585, které jsou zde uvedeny jako odkazy.

Jinou metodou pro konstrukci DNA sekvence kódující mutantní IL-2 podle předkládaného vynálezu je chemická syntéza. Tato například zahrnuje přímou syntézu peptidu chemickými prostředky za použití sekvence kódující mutantní IL-2 mající vlastnosti podle předkládaného vynálezu. Tento způsob může vkládat přirozené i nepřirozené aminokyseliny v pozicích, které ovlivňují interakce IL-2 s IL-2Rp nebo IL~2Rgamma. Alternativně může být chemicky syntetizován pomocí oligonukleotidového syntezátoru gen, který kóduje požadovaný mutantní IL-2. Takové oligonukleotidy jsou navrženy podle aminokyselinové sekvence požadovaného mutovaného IL-2 a výhodně za použití těch kodonů, které jsou přednostně využívány v hostitelské buňce, ve které je rekombinantní mutant exprimován.V tomto směru je dobře známo, že genetický kód je degenerovaný - to znamená, že aminokyselina může být kódována více než jedním kodonem. Například Phe(F) je kódovaný dvěma kodony - TTC nebo TTT, Tyr(Y) je kódovaný TAC nebo TAT a his(H) je kódovaný CAC nebo CAT, Trp(W) je kódovaný jediným kodonem, TGG. V souladu s tím je jasné, že pro danou DNA sekvenci kódující určitý mutantní IL-2 bude existovat mnoho degenerovaných DNA sekvencí, které budou kódovat tento mutovaný ÍL-2. Například, je jasné, že kromě výhodné DNA sekvence pro mutant D20I uvedené v SEQ ID NO: 1, existuje mnoho degenerovaných DNA sekvencí, které také kódují uvedený mutantní IL-2. Tyto degenerované DNA sekvence spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Proto označuje termín „degenerova- 10CZ 302071 B6 né varianty“ v předkládaném vynálezu všechny DNA sekvence, které kódují a tak umožňují expresi určitého mutantu.

DNA sekvence kódující mutantní IL-2 podle předkládaného vynálezu, ať připravená místně cílenou mutagenezí, chemickou syntézou nebo jinými prostředky, může a nemusí také obsahovat DNA sekvence kódující signální sekvenci. Taková signální sekvence, pokud je přítomná, může být sekvencí rozpoznávanou buňkami vybranými pro expresi mutantního IL—2. Může se jednat o prokaryotickou nebo eukaryotickou sekvenci nebo o jejich kombinaci. Může se také jednak o signální sekvenci přirozeného IL—2. Obsažení signální sekvence závisí na tom, zda je žádoucí secemovat mutantní IL-2 z rekombinantních buněk, ve kterých je syntetizován. Pokud jsou vybrané buňky prokaryotické, tak je obvykle výhodné, aby DNA sekvence nekódovala signální sekvenci. Pokud jsou vybrané buňky eukaryotické, tak je obvykle výhodné, aby byla signální sekvence kódována a nej výhodnější je, aby byla použita přirozená signální sekvence IL-2.

Standardní způsoby mohou být použity pro syntetizování genu kódujícího mutantní IL-2 podle předkládaného vynálezu. Například, kompletní aminokyselinová sekvence může být použita pro konstrukci zpětně translatovaného genu. Může být syntetizován DNA oligomer obsahující nukleotidovou sekvenci kódující mutantní IL-2. Například, může být syntetizováno několik malých oligonukleotid kódujících části požadovaného polypeptidu, které mohou být potom ligovány. Jednotlivé oligonukleotidy obvykle obsahují 5' nebo 3' překrývající se konce pro komplementární sestavení.

Po sestavení (syntézou, místně cílenou mutagenezí nebo jiným způsobem) může být DNA sekvence kódující mutovaný IL-2 podle předkládaného vynálezu insertována do expresního vektoru a operativně navázána na sekvenci kontrolující expresi vhodnou pro expresi mutantního IL-2 ve vybraném transformovaném hostiteli. Správné sestavení může být potvrzeno sekvencováním nukleotidů, restrikčním mapováním a expresí biologicky aktivního polypeptidu ve vhodném hostiteli. V oboru je dobře známo, že pro získání vysoké úrovně exprese transfektovaného genu v hostiteli musí být gen operativně navázán na sekvence kontrolující transkripci a translaci, které jsou funkční ve vybraném hostiteli pro expresi.

Volba sekvence kontrolující expresi a expresního vektoru závisí na volbě hostitele. Mohou být použiti různé kombinace hostitele/vektoru. Vhodnými expresními vektory pro eukaryotické hostitele jsou, například, vektory obsahující sekvenci pro kontrolu exprese ze SV40, hovězího papiloma viru, adenoviru a cytomegaloviru. Vhodnými expresními vektory pro bakteriální hostitele jsou známé bakteriální plazmidy, jako jsou plazmidy z E. coli, včetně col El, pCRl, pER32z, pMB9 a jejích derivátů, plazmidy s větším počtem hostitelů, jako je RP4, fágové DNA, například různé deriváty fágu lambda, například NM989, ajiné DNA fágy, jako je MI3 a filamentosní jednořetězcové DNA fágy. Vhodnými expresními vektory pro kvasinky jsou 2μ plazmid ajeho deriváty. Vhodným vektorem pro hmyzí buňky je pVL941. Upřednostňujeme pFastBac™ (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Cate et al., „Isolation Of The Bovine And Human Genez For Mullerian Inhibiting Substance and Expression Of The Human Gene in Animal Cells“, Cell 45, str. 685-98 (1986).

Dále, v těchto vektorech může být použita jakákoliv z mnoha sekvencí pro kontrolu exprese. Mezi takové použitelné sekvence pro kontrolu exprese patří sekvence kontrolující expresi asociované se strukturálními geny uvedených expresních vektorů. Příklady použitelných sekvencí pro kontrolu exprese zahrnují, například, časné a pozdní promotory SV40 nebo adenoviru, lac systém, trp systém, TAC nebo TRC systém, hlavní operátorový a promotorovy region fágu lambda, například PL, kontrolní regiony fd obalového proteinu, promotor pro 3-fosfoglycerát kinázu nebo jiné glykolytické enzymy, promotory kyselé fosfátázy, například PhoA, promotory kvasinkového α-párovacího systému, polyhedronový promotor bakuloviru a jiné sekvence, o kterých je známo, že kontrolují expresi genů prokaryotických nebo eukaryotíckých buněk nebo jejich virů, a různé jejich kombinace.

- ll CZ 302071 R6

Jakýkoliv vhodný hostitel může být použit pro produkci mutantních H-2 podle předkládaného vynálezu, včetně bakterií, hub (včetně kvasinek), rostlin, hmyzu nebo jiných vhodných živočišných buněk nebo buněčných linií, stejně jako včetně transgenních zvířat nebo rostlin. Přesněji, mezi tyto hostitele patří dobře známí prokaryotiční a eukaryotiční hostitelé, jako jsou kmeny E. coli, Pseudomonas, baciílus, Streptomyces, houbi, kvasinky, hmyzí buňky jako jsou buňky Spodoptera frugiperda (St9), živočišné buňky jakojsou ovariální buňky čínského křečka (CHO) a myší buňky, jako jsou NS/O, buňky afrických makakůjako jsou COSI, COS7, BSC 1, BSC 40 a BNT 10 a lidské buňky, stejně jako rostlinné buňky, ve tkáňové kultuře. Pro expresi v živočišných buňkách přednostně využíváme CHO buňky a COS 7 buňky v kulturách, zejména CHO buněčnou linii CHO (DHFR-) nebo HKB linii.

Je třeba si uvědomit, že ne všechny vektory a sekvence pro kontrolu exprese budou účinkovat stejně dobře při expresi DNA sekvencí podle předkládaného vynálezu. Ani všichni hostitelé nejsou stejně výkonní při použití stejného expresního systému. Nicméně, odborník v oboru může provést výběr z těchto vektorů, sekvencí pro kontrolu exprese a hostitelů bez zbytečného experimentování. Například, při výběru vektoru musí být brán v úvahu hostitel, neboť vektor se musí replikovat v hostiteli. Počet kopií vektoru, schopnost kontrolovat tento počet vektorů a exprese jakýchkoliv jiných proteinů kódovaných vektorem, jako jsou antibiotické markéry, musí být také brány v úvahu. Například, mezi výhodné vektory pro použití v předkládaném vynálezu patří ty vektory, které umožňují amplifikaci DNA kódující mutované IL-2 v určitém počtu kopií. Takové amplifikovatelné vektory jsou dobře známé v oboru. Patří mezi ně, například, vektory amplifikovatelné DHFR amplifikaci (viz například Kaufman, patent US 4 470 461, Kaufman and Sharp, „Construction of a Modular Dihydrofolate Reductase cDNA Gene: Analysis of Signals Ultilized for Effícient Hxpression, Mol. Cell. Biol. 2, str. 1304-19 (1982)) nebo glutamin syntetasovou („GS) amplifikaci (viz například patent US 5 122 464 a Evropská patentová přihláška 338 841).

Při výběru sekvence kontrolující expresi musejí být brány v úvahu různé faktory. Mezi takové faktory patří, například, relativní účinnost sekvence, její kontrolovatelnost, a její kompatibilita s DNA sekvencí kódující mutantní IL-2 podle předkládaného vynálezu, zejména s ohledem na její sekundární struktury. Hostitelé by měly být vybráni tak, aby byly kompatibilní s vybraným vektorem, musí být brána v úvahu toxicita produktu kódovaného DNA sekvencí podle předkládaného vynálezu, charakteristiky jejich sekrece, schopnost hostitelů správně skládat protein, jejich požadavky na fermentaci nebo kultivaci, a snadnost přečištění produktu kódovaného DNA sekvencemi.

Za použití těchto parametrů může odborník v oboru vybrat různé kombinace vektor/sekvence kontrolující expresi/hostitel, které budou exprimovat požadované DNA sekvence při fermentaci nebo ve velkoobjemové živočišné kultuře, například za použití CHO buněk nebo COS 7 buněk.

Mutantní IL-2 získané způsobem podle předkládaného vynálezu mohou být glykosylované nebo neglykosylované, podle tohoto, který hostitelský organismus byl použit pro produkci mutantního proteinu. Pokud jsou jako hostitelé vybrány bakterie, tak je produkovaný mutantní IL-2 neglykosylovaný. Eukaryotické buňky, naopak, glykosylují mutantní IL-2, ačkoliv patrně ne stejným způsobem, jako je glykosylován přirozený IL-2. Mutantní IL-2 produkovaný transformovanými hostiteli může být přečištěn jakýmkoliv vhodným způsobem. Jsou známé různé způsoby pro přečištění IL-2. Viz například Current Protocols in Protein Science, svazek 2, Ed.: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Spencer, Paul T. Wingfield, Unit 6.5 (Copyright 1997, John Wiley and Sons, lne.). Preferujeme opětovné složení z inkluzních tělísek vytvořených v E. coli, nebo z kondiciovaného média buď ze savčích, nebo z kvasinkových kultur produkujících daný mutantní protein za použití kationtové výměny, gelové filtrace nebo kapalinové chromatografie s reverzní fází. Viz příklady 1 (E. coli) a 10 (perfuze CHO buněk) uvedené dále.

Biologická aktivita mutantních IL-2 podle předkládaného vynálezu může být hodnocena jakýmkoliv vhodným způsobem známým v oboru. Mezi takové testy patří test proliferace PHA blastů a proliferace NK buněk. Mutantní proteiny s vhodnou aktivitou, tj. plně aktivní na IL-2RctPgam- 12 CZ 302071 Β6 ma, ale se sníženou aktivitou na buňkách nesoucích IL-2Rpgamma, mohou být zjištěny za použití těchto dvou testů. „Relativní aktivita“ mutantního proteinu se měří vzhledem k přirozenému IL-2 a jak je zde popsáno dále v příkladech, je poměrem aktivity v testu proliferace PHA blastů ku aktivitě v testu proliferace NK buněk.

Mutantní IL-2 podle předkládaného vynálezu budou podány v dávce přibližně stejné nebo vyšší, než je dávka používaná při terapii přirozeným nebo rekombinantním IL-2. Výhodně je podáno účinné množství mutantního IL-2. Termín „účinné množství“ označuje množství schopné zabránit nebo zmírnit závažnost nebo šíření léčeného stavu nebo onemocnění. Odborníkům v oboru bude jasné, že účinné množství mutantního IL-2 závisí, mimo jiné, na onemocnění, dávce, protokolu podávání mutantního IL-2, na tom, zdaje mutantní IL-2 podán samostatně nebo v kombinaci s jinými terapeutickými činidly, na sérovém poločasu prostředku a na celkovém zdravotním stavu pacienta.

Mutantní IL-2 je výhodně podán v prostředku obsahujícím farmaceuticky přijatelný nosič. „Farmaceuticky přijatelný nosič“ je nosič, který nezpůsobuje žádné nežádoucí účinky u pacienta, jemuž je podán. Takové farmaceuticky přijatelné nosiče jsou dobře známé v oboru. Přednostně využíváme 2% HSA/PBS při pH 7,0.

Mutantní IL-2 podle předkládaného vynálezu mohou připraveny ve formě farmaceutických prostředků za použití dobře známých postupů. Viz například, Remingtonů Pharmaceutical Science od E. W. Martin, která je zde uvedena jako odkaz a která popisuje vhodné přípravky. Farmaceutický přípravek obsahující mutantní IL-2 může být v různé formě, včetně kapaliny, gelu, lyofílizované formy nebo jiné vhodné formy. Výhodná forma závisí na konkrétním léčeném stavu a bude zřejmá odborníkům v oboru.

Farmaceutické přípravky obsahující mutantní IL—2 mohou být podány orálně, ve formě aerosolu, intravenosně, intramuskulámě, intraperitoneálně, intradermálně nebo subkutánně nebo jakýmkoliv jiným přijatelným způsobem. Výhodný způsob podání závisí na konkrétním léčeném stavu a bude zřejmý odborníkům v oboru. Farmaceutické přípravky mutantního IL-2 mohou být podány společně sjínými terapeutickými činidly. Tato činidla mohou být součástí stejného farmaceutického přípravku, nebo mohou být podána separované od mutantního IL-2, buď současně, nebo podle jakéhokoliv přijatelného protokolu léčby. Dále, farmaceutický přípravek mutantního IL-2 může být použit jako pomocná léčba při jiné terapii.

V souladu s tím poskytuje předkládaný vynález prostředky a způsoby pro léčbu nádorů. HIV, autoimunitních onemocnění, infekčních onemocnění, pro použití jako adjuvans ve vakcínách pri protinádorové vakcinaci a běžné vakcinaci, pro imunostimulaci ve stáří nebo u jinak imunokompromitovaných jedinců, stejně jako u lidí se SC1D, nebo pro jiné terapeutické aplikace vyžadující celkovou stimulaci imunitního systému u jakéhokoliv vhodného živočicha, výhodně u savce, nejlépe u člověka. Jak bylo uvedeno v části Dosavadní stav techniky, má IL-2 mnoho účinků. Některými z těchto účinků je stimulace PHA blastů, klidových T lymfocytů, B lymfocytů, monocytů a NK buněk atd.; mutantní proteiny podle předkládaného vynálezu jsou aktivní na těch buňkách, které exprimují pouze vysoce afinitní receptor pro IL-2, jako jsou klidové T lymfocyty, ale ne na buňkách exprimujících středně afinitní receptor pro IL-2, jako jsou NK buňky nebo monocyty.

Také se předpokládá použití DNA sekvencí kódujících mutantní IL-2 podle předkládaného vynálezu v genové terapii. Předpokládaná genová terapie zahrnuje léčbu těch onemocnění, při kterých se předpokládá účinek terapie IL-2 zprostředkovaný jeho aktivitou na lymfocyty, jako jsou například nádory, HIV, autoimunitní onemocnění, infekční onemocnění, dále použití jako adjuvans ve vakcínách při protinádorové vakcinaci a běžné vakcinaci, pro imunostimulaci ve stáří nebo u jinak imunokompromitováných jedinců, stejně jako u lidí se SCID, a onemocnění, která jinak reagují na IL-2 nebo infekční onemocnění způsobená činidly, která jsou citlivá na imunitní odpověď zprostředkovanou IL-2.

- 13CZ 302071 B6

Lokální podání mutantního IL-2 za použití genové terapie může dodat terapeutické činidlo do cílové oblasti. Předpokládá se použití in vitro a in vivo metod genové terapie. Je známo několik metod pro přenos potenciálně terapeutických genů do definovaných buněčných populací. Viz například Mulligan, „The basic Science Of Gene Therapy“, Science 260: 926-31 (1993). Mezi tyto metody patří:

(1) Přímý přenos genu (viz například Wolff et al., „Direct Gene Transfer lnto Mouše Muscle In Vivo“ Science 247: 1465-68 (1990);

(2) Liposomy zprostředkovaný přenos DNA (viz například Caplan et al., „Liposome-mediated CFTR Gene Transfer To the Nasal Epithelium Of PatientsWith Cystic Fibrosis“, Nátuře Med. 3: 39-^46 (1995); Crystal, „The Gene As A Drug“, Nátuře Med. 1: 15-17 (1995); Gao and Huang, „A Novel Cationic Liposome Reagent For Effícient Transfection Of Mammalian Cells“, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 280-85 (1991);

(3) Retrovirem zprostředkovaný přenos DNA (víz například Kay et al., „In Vivo Gene Therapy Of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor lX-Deficient Dogs“, Science 262: 177— 19 (1993); Anderson „Human Gene Therapy“, Science 256: 808-13 (1992).

(4) DNA virem zprostředkovaný přenos DNA. Mezi takové viry patří adenoviry (výhodně vektory na bázi Ad-2 nebo Ad-5), herpes viry (výhodně vektory na bázi herpes simplex viru) a parvoviry (výhodně vektory na bázi „defektních“ nebo neautonomních parvovírů, lépe vektory na bázi udeno-asociovaného viru, nejlépe vektory na bázi AAV-2). Viz například Ali et al., „The Use Of DNA Viruses As Vectors For Gene Therapy“, Gene Therapy, 1: 367-84 (1994); patent US 4 797 368, který je zde uveden jako odkaz a U.S. patent 5139941, který je zde uveden jako odkaz.

Volba konkrétního vektorového systému pro přenos vybraného genu závisí na různých faktorech. Jedním významným faktorem je charakter populace cílových buněk. Ačkoliv byly retrovirové vektory rozsáhle studovány a používány v mnoha aplikacích genové terapie, jsou tyto vektory obvykle nevhodné pro infikování nedělících se buněk. Kromě toho mají retroviry onkogenní potenciál.

Adenoviry mají výhodu v tom, že mají široký rozsah hostitelů, mohou infikovat klidové nebo konečně diferencované buňky, jako jsou neurony nebo hepatocyty, a zdají se být v podstatě neonkogenními (viz Ali et al., výše, str. 367). Adenoviry se neintegrují do genomu hostitele. Protože jsou přítomné extrachromosomálně, je riziko inserění mutageneze značně sníženo. Ali et al., výše, str. 373.

Adeno-asociované viry mají stejné výhody jako vektory na bázi adenovirů. Nicméně, AAV vykazují místně cílenou integraci do lidského chromosomu 19. Ali et al„ výše, str. 377.

Ve výhodném provedení je DNA kódující mutantní IL-2 podle předkládaného vynálezu použita v genové terapii pro léčbu imunodefícitů jako je HIV infekce; infekčních onemocnění jako je tuberkulosa; a nádorů, jako je renální karcinom.

V souladu s tímto provedením je genová terapie DNA kódující mutantní IL-2 podle předkládaného vynálezu podána pacientovi současně s nebo ihned po diagnose onemocnění.

Tento způsob využívá výhody selektivní aktivity mutantních IL-2 podle předkládaného vynálezu pro zabráněni nežádoucí toxicitě a nežádoucím účinkům. Odborníkům v oboru bude jasné, že v tomto provedení může být použit jakýkoliv vhodný vektor pro genovou terapii obsahující DNA pro mutantní IL-2. Techniky pro přípravu takových vektorů jsou známé. Viz například Anderson, W. F., Human Gene Therapy, Nátuře 392: 25-30 (1998); Verma, I. M. and Somia, N„ Gene Therapy - Promises, Problems and Prospects, Nátuře 389: 239-242 (1998). Dodání vektoru

- 14CZ 302071 B6 obsahujícího DNA pro mutantní IL-2 do cílového místa může být provedeno za použití jakékoliv známé techniky.

Pro lepší porozumění předkládanému vynálezu jsou uvedeny následující příklady. Tyto příklady jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu. Všechny citované publikace jsou zde uvedeny jako odkazy v plném rozsahu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Produkce mutantních proteinů v E. coli

Mutantní proteiny byly připraveny místně cílenou mutagenezi za použití primerů obsahujících kodony odpovídající požadovaným mutacím, v podstatě za použití způsobu popsaného v Kunkel, T. A., Roberts, J. D., and Zakour, R. A., „Rapid and efficient site-specific mutagenezis without phenotypic selection (1987), Methods Enzymol. 154: 367-382. Stručně, lidská cDNA pro IL-2 obsahující restrikční místa BamHI a Xbal byla subklonována do M13 fágového vektoru M13 mp!9 (New England Biolabs, Beverly, MA) za použití stejných míst. cDNA pro přirozený IL-2 byla získána za použití polymerázové řetězové reakce („PCR“) ze souboru cDNA připraveného z mRNA izolované z lidských lymfocytů periferní krve indukovaných 24 hodin forbol-12-myristat-13-acetatem (10 ng/ml). Použité PCR primery byly, pro 5' konec otevřeného čtecího rámce IL-2:

5'-CCT CAA CTC CTG AA T TCA. TGT ACA GGA TGC- 3' (SEQ ID NO: 3);

a pro 3' konec otevřeného čtecího rámce IL-2:

5'-GGA AGC GGA TCC TTA TCA AGT CAG TGT TGA G- 3' (SEQ ID NO: 4).

Restrikční místa pro EcoRI (5'-konec) a BamHI (3-konec) byla vložena do každého oligonukleotidu a jsou uvedena kurzívou. Použité podmínky PCR byly 1 minuta pri 94 °C, 1 minuta při 58,7 °C a 1 minuta pri 72 °C po celkem 25 cyklů. Správnost takto získané cDNA sekvence IL-2 byla potvrzena sekvencováním za použití Sequenase® sekvencovacího kitu (Amersham Life Sciences, Arlington Heíghts, IL), podle návodu výrobce. Jednořetězcová DNA obsahující uráčil (U-DNA) byla získána transformací E. coli kmene CJ236 (BioRad Laboratories, Hercules, CA) M13 mpl9 obsahujícím IL-2cDNA. Místně cílená mutageneze využívala obecně primery obsahující 15 nukleotidů homologních ktemplátové U-DNA 5' ke kodonům určeným pro mutagenezi, do jejichž nukleotidů byly vkládány požadované změny, a dalších 10 nukleotidů homologických k templátové U-DNA 3' od posledního změněného nukleotidu. Nejprve byla místně cílená mutageneze použita pro vložení Ncol restrikčního místa na začátek zralé sekvence lidského IL-2. Použití tohoto restrikčního místa vkládá N-koncový methioninový zbytek, který bude řídit expresi v cytoplazmě E. coli, za použití, například, expresního vektoru pET3d. Primerem použitým pro tento účel byl:

5'—GCA CTT GTC ACA AAC ACC ATG GCA CCT ACT TCA AGT-3' (SEQ ID NO: 5).

Konkrétními primery použitými pro vložení mutací v pozicích D20, N88 a Q126 byly:

D20X: 5'-GGA GCA TTT ACT GCT GNN NTT ACA GAT G-3' (SEQ ID NO: 6);

N88X: 5'-GGG ACT TAA TCA GCN NNA TCA ACG TAA TAG-3' (SEQ ID NO: 7);

Q126X: 5'-GGA TTA CCT TTT GTN NNA GCA TCA TCT C-3' (SEQ ID NO: 8),

- 15 CZ 302071 B6 kde NNN byl nahrazen vhodným kodonem pro histidin (CAC) nebo ísoleucín (ATC) (v pozici D20), arginin (CGT), glycin (GGT) nebo ísoleucín (ATC) (v pozici N88) nebo leucin (CTG) (v pozicí QI26). Další mutace byly připraveny za použití podobné strategie a vhodného kodonu pro danou mutací. Primery byly fosfory lované za použití Γ4 póly nukleotid kinázy (New England

Bíolabs, Beverly, MA), podle návodu výrobce. Po tepelném navázání primeru na U-DNA templát a extensi pomocí T7 DNA polymerázy (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) byly buňky E. coli kmene DH5a'^M (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) transformovány 5 μΙ reakční směsi a byly umístěny na LB médium obsahující 0,7% agar. Po inkubaci při 37 °C byly plaky expandovány seškrábnutím jednoho plaku a jeho přenesením do 2 ml LB média a kultivací přes noc při io 37 °C. Jed no řetězcová DNA byla izolována za použití M13 přec išťo vací ho kitu (Qiagen lne., Chatsworth, CA) podle návodu výrobce, a klony obsahující požadovanou mutaci byly identifikovány sekveneováním jednořetězcové DNA za použití Sequenase^w sekvencovacího kitu (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL), podle návodu výrobce. cDNA mutantního 1L2 zreplikační formy DNA odpovídající plakům obsahujícím správně mutovanou sekvenci byla izolována za použití Ncol a Xbal a byla subklonována do plazmidového vektoru pET3a (Stratagene, San Diego, CA) (Strat.). E. coli kmene BL21 byly transformovány vektorem pET3a obsahujícím mutovanou sekvenci a byly kultivovány do ABS?8o mezi 0,60 a 1,0, a v tuto dobu byly přidány 0,4 Mm 1PTG pro indukci produkce mutovaného IL-2.

Příklad 2: Extrakce a přečištění mutovaných IL—2 z E. coli hodiny po indukci byly buňky získány odstředěním při 10 000 x g. Rekombinantní mutantní IL-2 byly renaturovány a přečištěny nejprve dispergováním buněk v 10 objemech (objem/hmot25 nost za vlhka) sacharózového/Tris/EDTA pufru (0,375 M sacharózy, 10 mM Tris/HCI pH 8,0, 1 mM EDTA). Dispergované buňky byly sonikovány 3-krát při 300 W se 30 sekundovými zotavovacími intervaly v ledové lázni, za použití Missonix model XL2020 sonikátoru vybaveného 1 palcovou standardní sondou. Sonikovaný materiál se potom odstředil při 17 000 xg během 20 minut při 4 °C. Peleta, která by měla mít v tuto dobu bílou barvu, se promyla resuspendoválo ním a odstředěním jednou v sacharózovém/Tris/EDTA pufru, dvakrát v Tris/EDTA pufru (50 mM Tris/HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA) a nakonec se resuspendovala v 10 objemech 0,1 M Tris/HCI, pH 8,0, pufru (v tuto dobu se odebral vzorek pro analýzu na gelu) a odstředila se během 20 minut při 17 000 x g.

Peleta se rozpustila přidáním 3 objemů 8 M guanidinium chloridu v 0,1 M Tris/HCI (pH 8,0) a 0,1% (obj./obj.) 2-merkaptoethanolu. Po inkubaci po dobu 2 hodin při teplotě okolí se vzorek odstředil během 20 minut při 17 000 x g. Vzniklý roztok se dialyzoval po dobu přibližně 20 hodin proti 20 objemům 10 mM Tris/HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA při 4 °C. Roztok se potom odstředil při 17 000 x g během 20 minut, upravil se pomocí 0,1% kyseliny trifluoroctové a přefiltroval

-to se přes 0,22 mikronovou filtrační jednotku. Roztok se přenesl ihned do silikonované nádoby a vnesl se do C8 kolony (Vydac 208TP54). Mutantní IL-2 se přečistily za použití 20 minutového lineárního gradientu 45 až 885% acetonitrilu v 0,1% TFA. Koncentrace eluovaného proteinu byla stanovena A280 a aminokyselinovou analýzou. Protein byl potom rozdělen (po 100 ml) do silikonovaných zkumavek a byl uskladněn při -20 °C. Takto přečištěný mutovaný protein obvykle vytvářel jediný proužek při SDS-PAGE (při barvení stříbrem) a byl kvantifikován aminokyselinovou analýzou (přesnost obvykle vyšší než 90 %).

Příklad 3: Test proliferace T lymfocytů

Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) byly izolovány z přibližně 100 ml normální lidské krve (Irwin Memoriál Blood Bank, San Francisko, CA) ředěné 1:2 v chladném Dulbeccově fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (bez Ca²⁺ a Mg²⁺; DPBS). Aplikoval se Ficol-Paque (Pharmacia) a vzorek se odstředil pro izolaci PBMC a potom se provedlo důkladné promytí v chladném DPBS. PHA blasty (aktivované T lymfocyty) se připravily res uspendováním buněk

- 16CZ 302071 B6 v RPMI 1640 obsahujícím 10% fetální hovězí sérum (Hyclone), do kterého se přidalo 1 % (hmot,/obj.) každé z následujících složek: L-glutamin; neesenciální aminokyseliny; pyruvát sodný; a antibiotikum-antimykotikum (RPMI médium) v hustotě 1 x 10^ó buněk/ml. Přidal se fytohemaglutinin (PHA-P; Sigma) v konečné koncentraci 10pm/ml a buňky se inkubovaly při

37 °C, 5% CO₂ po dobu 3 dnů. Buňky se odebraly a promyly se dvakrát v DPBS, resuspendovaly se v RPMI médiu a umístily se na 96-jamkovou plotnu s plochým dnem v hustotě 1 χ 10⁵ buněk/jamku ve 200 μί s různými koncentracemi IL-2 nebo mutovaného IL-2 v RPMI médiu. Plotny se inkubovaly po dobu 48 hodin při 37 °C, pulzovaly se 1 pCi ³H-thymidinu (DuPont NEN*¹, Boston, MA)/jamku po dobu 6 hodin, odebraly se a měřila se jejich radioaktivita na io filtrech ze skelných vláken.

Příklad 4: Test proliferace NK buněk

Mononukleámí buňky periferní krve (PBMC) byly izolovány z přibližně 100 ml normální lidské krve (Irwin Memoriál Blood Bank, San Francisko, CA) ředěné 1:2 v chladném Dulbeccově fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (bez Ca²⁺ a Mg²⁺; DPBS). Aplikoval se Ficol-Paque (Pharmacia) a vzorek se odstředil pro izolaci PBMC a potom se provedlo důkladné promytí v chladném DPBS. NK buňky se separovaly od ostatních buněk. Pro tento účel se použil Miltenyi

Bioteďs kit pro izolaci NK buněk (Bergisch Gladbach, Germany, kat. č. 465-01). Kit se skládá ze dvou činidel, separačních kolon a velmi silně magnetického nosiče. Prvním činidlem je směs monoklonálních protilátek CD3, CD4, CD19, CD33 myšího IgGl izotypu konjugovaných s haptenem. Toto činidlo je určeno pro depleci T lymfocytů, B lymfocytů a myeloidních buněk z PBMC. Předpokládá se, že pro tento účel může být použita jakákoliv vhodná sada protilátek rozpoznávajících tyto typy buněk. Druhým činidlem jsou koloidní super-paramagnetické MAC mikrokorálky konjugované s anti-haptenovou protilátkou. Buňky se resuspendovaly v PBS s 0,5% hovězím sérovým albuminem a 2 mM EDTA (PBS/EDTA). Objem suspenze závisí na počtu použitých buněk aje uveden v návodu od Milteneyi Biotec. Obvykle se při počtu buněk 5 x 10⁸ PBMC buňky resuspendují v 800 μί pufru a potom se použije 200 μί každého činidla. Po inkubaci s činidly se buňky přidaly do kolony (resuspendované ve 2 ml pufru). Jiné než NK buňky adherovaly na amgnet a NK buňky byly izolovány a odebírány z výtokové frakce. Buňky se promyjí, resuspendují se v RPMI médiu (které obsahuje RPMI 1640, do kterého se přidalo 1% (hmot./obj.) každé z následujících složek: L-glutamin; neesenciální aminokyseliny; pyruvat sodný; a antibiotikum-antimykotikum (vše od Gibco/BRL, gaithersburg, MD; 10% fetální hovězí sérum (Hyclone)) a umístily se na 96-jamkovou plotnu s plochým dnem v hustotě 1 χ I0⁵ buněk/jamku ve 200 μί s různými koncentracemi IL-2 nebo mutovaného IL-2 v RPMI médiu. Plotny se inkubovaly po dobu 48 hodin při 37 °C, pulzovaly se 1 pCi ³H-thymidinu (DuPont NEN , Boston, MA)/jamku po dobu 6 hodin, odebraly se a měřila se jejích radioaktivita na filtrech ze skelných vláken.

Příklad 5: Mutantní proteiny selektivně aktivující T lymfocyty vzhledem k NK buňkám

Mutantní proteiny byly připraveny místně cílenou mutagenezí (Kunkel et al., 1987, Methods

Enzymol. 154: 367-382) v pozicích Asp-20, Asp-84, Asn-88 a Gln-126 a byly exprimovány v E. coli za použití pET-3a expresního systému podle návodu výrobce (Stratagene). Mutantní proteiny byly přečištěny z inklusních tělísek v guanidinu-HCl, byly znovu složeny a byly zpracovány chromatografií za použití HPLC, jak bylo popsáno dříve. Získaný protein měl podle stříbrem barvené SDS-PAGE více než 95% čistotu a byl analyzován na koncentraci a čistotu amí50 no kyše li novou analýzou (AAA přesnost obvykle větší než 90 %). Sekvence mutantních proteinů vykazujících vhodnou aktivitu byla potvrzena hmotnostní spektrometrií. Takto přečištěné mutantní proteiny byly testovány v testech proliferace T lymfocytů a NK buněk, jak byly popsány výše. Relativní aktivity pro mutantní IL-2 v testech na lymfocytech a NK buňkách jsou uvedeny v tabulce 1.

- 17 C7. 302071 B6

Tabulka 1 - Mutantní proteiny hodnocené na selektivní aktivitu pro T lymfocyty

	relativní aktivita	relativní aktivita
Mutantní protein	T VJ. NK buňky	Tbuňky	NK buňky
wtIL-2	1	1.00000	1.00000
D20 muteins
D20A	5	0.00024	0.00005
D20H	3900	0.37081	0.00009
D20I	7600	4.59635	0.00061
D20K	330	0.06301	0.00019
D20L	100	0.00063	0.00001
D20M	490	0.05372	0.00011
D20N	160	0.03000	0.00019
D20Q	100	0.03180	0.00032
D20R	33	0.00018	0.00001
D20S	170	0.06640	0.00038
D20T	1	1.00000	1.00000
D20V	10	0.00093	0.00009
D20Y	1000	0.06587	0.00007
N88 mutant
N88A	50	0.50000	0.01
N88E	10	0.01172	0.00115
N88F	22	0.02222	0.001
N88G	980	833333	0.00853
N88H	3	0.00100	0,001
N88I	9600	0.98074	0.00010
N88K	3	0.00010	0.00032
N88L	4	0.00400	0.001
N88M	250	035000	0.001
N88R	6200	0.89730	0.00015
N88S	80	0.00200	0.16000
N88T	395	0.50000	0.001266
N88V	67	0.06670	0.001
N88W	1	0.00100	0.001
N88Y	1 8	0.00800	0.001

- 18CZ 302071 B6

Q126 mutanty Q126A	0.30	0.01743	0.05809
QI26D	240	0.14630	0.00061
Q126E	400	10.0000	0.02500
Q126F	32	0.87358	0.02749
Q126G	100	055556	0.00556
Q126H	0.03	0.02216	0.73875
Q126I	33	0.00100	0.00003
Q126K	1.0	1.00000	1.00000
Q126L	680	3.06186	0.00447
Q12ÓM	9.1	19.94092	2.19298
Q126N	10	657895	0.64993
Q126P	3.0	0.00032	0.00011
Q126R	11	4.02695	036392
Q126S	33	0.03417	0.00103
Q126T	3.3	0.00010	0.00003
Q126V	330	1.00556	0.00302
Q126W	1.0	020000	020000
Q126Y	10.	0.88500	0.08850

Aktivity mutantních proteinů jsou popsány podle relativní koncentrace mutantního proteinu nutné pro dosažení 50% maximální odpovědi (EC₅₀) ve srovnání s EC₅₀ přirozeného IL-2 ve stejném testu; v případě více testů pro stejný mutovaný protein jsou uvedeny hodnoty geometrických průměrů. Hodnota EC₅₀ pro přirozený IL-2 je v rozmezí od 10 do 150 pM v testu na T lymfocytech a od 50 do 200 pM v testu na NK buňkách. Poměr aktivity mutantních proteinů pro T lymfocyty a NK buňky je vyjádřen jako relativní aktivita mutantního proteinu na T lymfocytech dělená relativní aktivitou mutantního proteinu na NK buňkách. Tento poměr je určen pro každý mutantní protein za použití pouze aktivity získané z testů na T lymfocytech a NK buňkách využívajících buněk od jednoho dárce.

Aktivity mutantních proteinů mohou být klasifikovány do 6 obecných kategorií: (1) 1000-násobná selektivita pro T lymfocyty; (2) více než 100-, ale méně než 1000-násobná selektivita pro T lymfocyty; (3) více než 10-, ale méně než 100-násobná selektivita pro T lymfocyty; (4) zlepšená aktivita na T lymfocyty vzhledem k IL-2; (5) selektivita pro NK buňky; (6) 10-násobná selektivita buď pro T lymfocyty, nebo pro NK buňky.

Třída 1: D20H, 1 aY; N88G, 1 a R.

Třída 2: D20K, L, Μ, N, Q a S; N88M a T; Q126D, E, G, L a V.

Třída 3: D20R; N88A, E, F, S a V; QI26F, I, N, R a S.

Třída4: D20I;N88G; Q126E, L, M,NaR.

Třída 5: Q126A, H,

Třída 6: D20A, T a V; N88H, K, L, W a Y; Q126K, P, T, W a Y.

V třídách I až 3 jsou výhodnými mutantními proteiny ty, které mají aktivitu na T lymfocyty stejnou jako IL-2 nebo lepší. V třídě 1 toto splňuje D20H a I; N88G, I a R; v třídě 2 N88M a T; Q126D, E, G, L a V; v třídě 3 N88A, Q126F a G. Mutantní proteiny ve třídě 4 by měly mít vyšší účinnost než přirozený IL-2 in vivo.

- 19CZ 302071 B6

Jak je vidět z tabulky 1, žádná jediná mutace nevedla k inaktivitě mutantního IL-2 v obou testech. Nicméně, lze předpokládat, že kombinace mutací, které vedou k vážnému narušení aktivity, bude potenciálně vést k zisku antagonisty IL-2 na T lymfocytech nebo na jiných typech buněk nesoucích vysoce afinitní receptor pro IL-2. Takový antagonista je před poved itelný z těchto dat, s protože mutace byly navrženy pouze pro změnu interakcí s lL-2Rp a IL-2Rgamma. Jedním takovým příkladem je dvojitě mutovaný protein D20R/Q126T. Kombinace slabě aktivních mutací v jedné molekule by měla mít kombinatoriální charakter, to znamená, že když má D20R

0,00018 aktivity na T lymfocytech a Q126T má 0,0001 aktivity na T lymfocytech, měl by dvojitě mutovaný protein D20R/Q126T mít 0,000000018 aktivity přirozeného IL-2 na T lymfocytech.

io Další kombinace mohou být připraveny podle uvedených dat.

Příklad 6: Biologická aktivita přirozeného IL-2 a mutovaných 1L—2

Obr. 1 až 7 ukazují křivky dávka-odpověď pro přirozený lidský IL-2 (IL-2) a D20H (obr. 1), IL-2 a D20I (obr. 2), IL-2 a N88G (obr. 3), IL-2 a N88I (obr. 4), IL-2 a N88R (obr. 5), IL-2 a Q126E (obr. 6) a IL-2 a Q126L (obr. 7). A: jednotlivé křivky závislosti na dávce IL-2 (plné kroužky) a mutantního proteinu (prázdné kroužky) pro test proliferace primárních lidských T lymfocytů (PHA blastů). B. jednotlivé křivky závislosti na dávce IL-2 (plné trojúhelníčky) a mutantního proteinu (prázdné trojúhelníčky) pro test proliferace primárních lidských NK buněk.

Pro pokus popsaný na obr. 1 je dávka přirozeného IL-2 vedoucí k 50% maximální proliferaci (EC_5tí přibližně 1,5 x 10 ¹⁰ M pro T lymfocyty (A) a přibližně 1 x 10“'° M pro test na NK buňkách (B). EC50 pro D20H je přibližně 2 x 10 ¹⁰ v tomto testu na T lymfocytech, aleje menší než

1 x 10“⁵ M v tomto testu na NK buňkách. Čisté zlepšení v aktivitě D20H na T lymfocyty vzhledem k aktivitě na NK buňky je tak více než 50 000-násobné, jak bylo stanoveno v tomto testu. Podobné výsledky byly získány z krve od dalších dárců (data nejsou uvedena).

Pro pokus popsaný na obr. 2 je dávka přirozeného IL-2 vedoucí k 50% maximální proliferaci .10 (EC_S0) přibližně 1,5 x ΙΟ¹⁰ M pro T lymfocyty (A) a přibližně 3 x 10’¹⁰ M pro test na NK buňkách (B). EC₅₀ pro D20I je také přibližně 1,5 x 10“¹⁰ v tomto testu na T lymfocytech, aleje pouze 5 x 10 ⁶ M v tomto testu na NK buňkách. Čisté zlepšení v aktivitě D20I na T lymfocyty vzhledem k aktivitě na NK buňky je tak více než 16 000—násobné, jak bylo stanoveno v tomto testu. Podobné výsledky byly získány z krve od dalších dárců (data nejsou uvedena).

Pro pokus popsaný na obr. 3 je dávka přirozeného IL-2 vedoucí k 50% maximální proliferaci (EC₅o) přibližně 4 x 10“'¹ M pro T lymfocyty (A) a přibližně 2 x 10“^,ú M pro test na NK buňkách (B). EC50 pro N88G je přibližně 5 x 10“¹² v tomto testu na T lymfocytech, aleje pouze 3 x 10”⁸ M v tomto testu na NK buňkách. Čisté zlepšení v aktivitě N88G na T lymfocyty vzhledem k aktivitě na NK buňky je tak více než 1200-násobné, jak bylo stanoveno v tomto testu. Podobné výsledky byly získány z krve od dalších dárců (data nejsou uvedena).

Pro pokus popsaný na obr. 4 je dávka přirozeného IL-2 vedoucí k 50% maximální proliferaci (EC50) přibližně 1,5 x 10“'° M pro T lymfocyty (A) a přibližně 1 x 10“^l° M pro test na NK buň45 kách (B). EC₅₀ pro N88I je přibližně 4x IO“¹⁰ v tomto testu na T lymfocytech, ale je pouze 5 x 10 ^ó M v tomto testu na NK buňkách. Čisté zlepšení v aktivitě N88I na T lymfocyty vzhledem k aktivitě na NK buňky je tak více než 18 000-násobné, jak bylo stanoveno v tomto testu. Podobné výsledky byly získány z krve od dalších dárců (data nejsou uvedena).

Pro pokus popsaný na obr. 5 je dávka přirozeného IL-2 vedoucí k 50% maximální proliferaci (EC_So) přibližně 1,5 x 10“¹⁰ M pro T lymfocyty (A) a přibližně 1 x 10“^ιθ M pro test na NK buňkách (B). EC50 pro N88R je přibližně 9 x 10“^u v tomto testu na T lymfocytech, ale je pouze 3 x 10“⁷ M v tomto testu na NK buňkách. Čisté zlepšení v aktivitě N88R na T lymfocyty vzhledem k aktivitě naNK buňky je tak více než 5000-násobné, jak bylo stanoveno v tomto testu. Podobné výsledky byly získány z krve od dalších dárců (data nejsou uvedena).

-20CZ 302071 B6

Pro pokus popsaný na obr 6 je dávka přirozeného IL-2 vedoucí k 50% maximální proliferaci (EC₅₀) přibližně 8 x 10¹² M pro T lymfocyty (A) a přibližně 5 x 10 ¹¹ M pro test naNK buňkách (B). EC₅₀ pro Q126E je přibližně 8 x 10 v tomto testu na T lymfocytech, ale je pouze 2 x

10'⁹ M v tomto testu na NK buňkách. Čisté zlepšení v aktivitě Q126E na T lymfocyty vzhledem k aktivitě na NK buňky je tak více než 400-násobné, jak bylo stanoveno v tomto testu. Podobné výsledky byly získány z krve od dalších dárců (data nejsou uvedena).

Pro pokus popsaný na obr. 7 je dávka přirozeného IL-2 vedoucí k 50% maximální proliferaci io (EC₅₀) přibližně 5 x 10¹¹ M pro T lymfocyty (A) a přibližně 8 x 10“¹¹ M pro test naNK buňkách (B). EC;₀ pro Q126L je přibližně 2 x 10'¹¹ v tomto testu na T lymfocytech, ale je pouze 2 x 10'⁸ M v tomto testu na NK buňkách. Čisté zlepšení v aktivitě Q126L na T lymfocyty vzhledem k aktivitě na NK buňky je tak více než 625-násobné, jak bylo stanoveno v tomto testu. Podobné výsledky byly získány z krve od dalších dárců (data nejsou uvedena).

Příklad 7: Studie toxicity na šimpanzech

IL-2/N88R byl vybrán z mutantních ÍL-2 proteinů uvedených v tabulce 1 proto, že vykazovat selektivní agonistickou aktivitu pro T lymfocyty v testu na primárních lidských T lymfocytech a NK buňkách. Vzhledem k přirozenému IL-2 je 6000-krát aktivnější na T lymfocyty než na NK buňky, a vykazuje v podstatě stejnou aktivitu na T lymfocytech jako přirozený IL-2. IL-2/N88R byl produkován v CHO buňkách, byl přečištěn a byl hodnocen na šimpanzím modelu aktivity a toxicity IL-2. V tomto in vivo modelu je vykazovaná aktivita na T lymfocyty srovnatelná s aktivitou komerčně dostupné rekombinantní varianty IL-2 (Proleukin™, Chiron Corporation, Emeryville, CA), ale indukuje pouze mírné nežádoucí účinky ve srovnání s tímto přípravkem (jak ve smyslu objektivních, tak klinických parametrů).

A. Uspořádání studie

1. Materiály a metody

Část studie probíhající za života zvířat byla provedena v New lberia Research Center (New lberia, LA, Sponsor Bayer Corporation, Berkeley, CA) a skládala se ze dvou fází, ve kterých bylo použito 11 dospělých nebo mladých šimpanzů s tělesnou hmotností v rozmezí od 45 do 70 kg.

Fáze 1 studie byla fáze stanovené dávky a byla při ní podávána podkožně dávka vehikula nebo dávka PROLEUKINU (1,2 mg/m²) dvakrát denně (BID) po dobu 5 dnů. Fáze II studie bylo srovnání vehikula, PROLEUKINU a IL-2/N88R podávaných podkožně, každých 12 hodin (q 12h) po dobu 5 dnů. Dávka IL-2/N88R byla vybrána tak, aby bylo dosaženo účinků srovnatelných s PROLEUKINEM podle farmakokinetické analýzy. Vzorky krve byly odebírány na biochemické vyšetření krve, CBC, hematologické vyšetření/vyšetření koagulace a na FACS analýzu populace T Iymfocytů a NK buněk, jak je podrobně popsána v části 5 a 6.

Tabulka 2A: Protokol fáze I

I Počet skupin	Počet zvž řat	Testovaná substance	Dávka	Frekvence j
í	1	vehikulum	NA	BID po dobu 5 dní)
2	2	PROLEUKIN	1,2 mg/m2	BID po dobu 5 dnú

-21 C7 302071 B6

— Počet skupin	Počet zvířat	Testovaná substance	Dávka	Fr ekvei	i ice
1	2	vehikul um	NA	q 1 2 h po	dobu 5 dnů
2	3	PP0LEUKIN	1,2 mg/m2	q12 h po	dobu 5 dnů
3 t	3	IL-2/N88P	1,2 mg/rn2	q)2h po	dobu 5 dnů i

2. Dávkování

V den studie, kdy byly prováděny odběry krve, byla zvířata uvedena do celkové anestesie pomocí i.m. podání ketaminu v dávce přibližně 10 mg/kg před podáním testované substance nebo vehikula. V den studie, kdy nebyly prováděny odběry krve, byla zvířata znehybněna pomocí klece před podáním testované substance nebo vehikula. Dávka byla podávána podkožní injekcí každých 12 hodin po dobu 5 dnů a místo injekce bylo oholeno v den I studie. Pro každou dávku bylo i« zaznamenáno místo a doba podání dávky.

3. Klinická pozorování (a) Denní sledování a příjem potravy. Každé zvíře bylo sledováno dvakrát denně a jakékoliv abnormální pozorování bylo hlášeno řediteli studie. Zvířata vypadající nemocně byla sledována ředitelem studie, veterinářem projektu a representantem sponzora. Spotřeba potravy byla sledována a zaznamenána dvakrát denně podle vizuálního sledování.

(b) Tělesná hmotnost. Tělesná hmotnost byla zjištěna před studií, před podáním dávky v den 1 a pokaždé, když byla zvířata anestetizována pro odběr krve.

(c) Pozorování místa injekce. Místa injekce byla sledována denně. Byl zaznamenáván jakýkoliv abnormální vzhled, jako například zarudnutí nebo otok.

Tabulka 3A: Protokol pro odběr vzorků v fázi II

-22 CZ 302071 B6

4. Zpracování vzorků (a) Biochemické vyšetření séra. Přibližně 2 ml krve byly odebrány od každého zvířete do zkuma5 vek ve výše uvedených dobách. Časy odběru krve byly zdokumentovány a krev se nechala srazit při teplotě okolí. Vzorky se potom odstředily, sérum se separovalo a odeslalo se do NIRC

Clinical Pathology Laboratory. NIRC standardní panel biochemického vyšetření séra je uveden v tabulce 4:

io

Tabulka 4: Panel biochemických vyšetření séra

Sodík

Dras1 í k

Chloridy

Celkový bilirubin

Alkalická fosfát áza

Laktat dehydrogenáza (LDH) Aspartat aminotransferáza (AST) A1 anin ami notransferáza (ALT) Oxid uhličitý (CO2)

Fosfor

Močov i na

Kreatinin

Celkový protein

Albumin

Poměr alburaiηυ/g1obu1inů

G1 ukóza

Vápník

Gamma-glutamyl transferáza (GGT) (b) Hematologické vyšetření. Přibližně 2 ml krve byly odebrány od každého zvířete do zkumavek s EDTA ve výše uvedených časech a byly odeslány do NIRC Clinical Pathology Laboratory. NIRC standardní hematologický panel, zahrnující krevní obraz, diferenciál a počet trombocytů, byl proveden pro všechny vzorky.

(c) Sponzorský test. Přibližně 6 ml krve bylo odebráno do zkumavek s EDTA ve výše uvedených časech. Časy odběru krve byly zdokumentovány. Vzorky se potom odstředily, plazma se separovala a rozdělila se do třech samostatných zkumavek. Plazma se uskladnila ve zmrazeném stavu (60 °C nebo méně) a odeslala se do Bayer Corporation, Berkeley, CA, ihned po dokončení studie.

5. FACS (a) Postup. Přibližně 5 ml vzorky krve se odebraly do heparinu sodného jako antikoagulačního činidla v časech uvedených pro FACS analýzu.

Vzorky plné krve byly získány buď v EDTA, ACD, nebo v heparinu. Počet buněk byl upraven tak, aby byl v rozsahu od 2 do 20 tisíc na mm³.

x 75 skleněné nebo plastové zkumavky byly vhodně označeny použitým panelem protilátek. Protilátka nebo směs protilátek se přidala do zkumavek v objemech doporučených výrobcem.

100 μΙ dobře promíseného vzorku krve se přidalo do každé zkumavky a směs se inkubovala po dobu 30 minut při teplotě okolí, chráněná před světlem.

Po inkubaci se přidaly 2 ml roztoku pro lýzu (Becton Dickinson FACS brand lysing solution, BD

č. 92-0002), směs se jemně promísila vířením a nechala se ustát po dobu 10 minut při teplotě okolí. Zkumavky se potom odstředily při teplotě okolí během 5 minut při 300 x g. Supematanty se dekantovaly, nadbytek kapaliny se odsál a ke každé buněčné peletě se přidal 1 ml PBS pufru

-23CZ 302071 B6 (GIBCO 14190—144). Po jemném promísení se zkumavky odstředily při teplotě okolí během 5 minut při 300 x g. Supernatanty se dekantovaly, nadbytek kapaliny se odsál před přidáním I ml fixačního roztoku (0,5% roztok formaldehydu, připravený ředěním 10% formaldehydu (Polyscíence, lne., č. 0418) 1:20 PBS pufrem) k buněčné peletě a provedlo se jemné promísení vířením pro resuspendování. Vzorky se potom analyzovaly na Coulter EPICS SL průtokovém eytometru.

Protilátky použité pro studii: MlgGl/MlgGl izotypová kontrola (Becton Dickinson kat. č. 349526), CD45-PerCP (Becton Dickinson kat. č. 347464), CD8-F1TC (Becton Dickinson kat. č. ío 347313), CD25-PE (Becton Dickinson kat. č. 30795X), CD4-F1TC (Becton Dickinson kat. č.

340133), CD16-PE (Becton Dickinson kat. č. 347617), CD3-PerCP (Becton Dickinson kat. ě.

347344).

6. Profil koagulace

Přibližně 2 ml vzorky plné krve se odebraly do zkumavek s citrátem sodným jako antikoagulačním činidlem ve výše uvedených časech. Koagulační profil zahrnoval protrombínový čas (PT) aktivovaný parciální tromboplastinový čas (ΑΡΤΙ') a fibrinogen.

2o B. Výsledky a diskuse

1. Stanovení dávky PROLEUK1NU

Primárním cílem této fáze byla identifikace optimální dávky PROLEUKINU pro srovnání s 1L25 2/N88R. Tato optimální dávka PROLEUKINU byla vybrána jako dávka, která je tolerovatelná (nižší než maximální tolerovaná dávka), která ideálně způsobuje klinicky významnou, ale střední a reverzibilní toxicitu. Dávka PROLEUKINU 1,2 mg/m², BID, byla vybrána jako počáteční dávka podle extrapolace režimů klinického podávání PROLEUKINU, jejich toxicity a vlastních výsledků vztahu dávka PROLEUKINU-odpověď pro opice makak.

Dva šimpanzi byli léčení tímto způsobem PROLEU KIN EM. Tato zvířata se stávala méně aktivními, vyčerpanými a dehydratovanými během aplikace dávek. U obou zvířat došlo k rozvoji závažných gastrointestinálních příznaků v den 3 nebo 4, včetně snížené chuti k jídlu, průjmu, zvracení. Podávání léku bylo ukončeno u jednoho zvířete (č. X-159) po 3 dnech pro vážnou renální (obr. 8A, 8B) a středně těžkou hepatální (obr. 8C, 8D) dysfunkci zjištěnou podle biochemického vyšetření krve. V tomto vyšetření byla zjištěna elevace močoviny (BUN), kreatininu a celkového bilirubinu, ALT (SGPT). Laktat-Ringerův roztok byl aplikován i.v. oběma zvířatům léčeným PROLEUKINEM v den 3 a 4 (zvíře č. X-159) a v den 4 pouze (zvíře X-124) buď při resuscitaci, nebo jako prevence dehydratace. Zvíře č. X-159 byly vyloučeno ze studie v den 8 z důvodu renální dysfunkce a možného trombu v levé noze, který se projevil velmi slabým pulzem (femorálním) a celá končetina byla chladná a oteklá. Ačkoliv u jednoho zvířete se vyskytly velmi významné toxické účinky, druhé zvíře mělo méně závažné toxické účinky a profil nežádoucích účinků pro obě zvířata byl reverzibilní. Podle těchto výsledků byly dávka 1,2 mg/m² PROLEUKINU a ekvivalentní dávka (podle expozice) IL-2/N88R, q 12 hodin, vybrány jako vhodný dávkovači režim pro srovnávání těchto sloučenin.

2. Srovnání 1L-2/N88R s PROLEUKINEM

Klinická pozorování. Tabulka 5 uvádí klinická pozorování provedená během studie. Hodnoty jsou vyjádřeny ve stupnici 1 až 5, kde 5 označuje vážný stav. Všechna zvířata léčená PROLEUKINEM byla těžce nemocná; bylo pozorováno jedno úmrtí spojené s PROLEUKfNEM. Hodnoty popsané po dni 6 pro skupinu léčenou PROLEUKINEM odrážejí data pro zbývající dvě zvířata. Nejčastějším vedlejším účinkem léčby IL-2/N88R se zdály být mírné Gl obtíže (emese), ačkoliv léčba neindukovala nominální toxicitu ve smyslu parametrů uvedených v tabulce 4.

Tělesná hmotnost ve skupině léčené PROLEUKINEM se snížila o 6 % v den 6 a dále se snížila

-24CZ 302071 B6 až o 10 % v den 10 a potom se zvolna opět zvyšovala (viz obr. 9). Naopak, skupiny léčené vehikulem a 1L-2/N88R měly nejvíce 1 až 3 % úbytek hmotnosti.

Tabulka 5: Klinická pozorování*

Léčba	Celkový stav	Ztráta chuti k j ídlu	Letargie	Gl	Neklid
II-2/N88R	dobrý	1	1	5	1
PROLEUKIN	těžce nemocný	5	4/5	5	4/5
Vehikulum	normá 1 ní	0	0	0	0

* rozmezí 1 až 5, kde 5 označuje nejzávažnější stav (a) Hematologie. IL-2/N88R indukovala buněčné účinky souhlasné s aktivací PROLEUKINEM, konkrétně lymfocytosu (obr. 10A); zvýšení počtu leukocytů (obr. 10B) a neutrofilů (obr. 10C) bylo také zaznamenáno. IL-2/N88R indukoval pouze marginální trombocytopenii (nadir přibližně 15%) ve srovnání s PROLEUKINEM (nadir přibližně 50%) během léčebné části studie (obr. 10D).

(b) Renální funkce. BUN hladiny byly u všech zvířat léčených PROLEUKINEM znatelně vyšší ve dny 6 a 8 (obr. 11 A). BUN koncentrace byly vyšší než 130 mg/dl u dvou z těchto zvířat; koncentrace kreatininu se také dramaticky zvýšila u dvou zvířat ve dny 6 a 8 (obr.11B), což ukazuje na celkové snížení renátních funkcí. Kromě toho se ve skupině léčené PROLEUKINEM také zvýšila ve dny 6 a 8 sérová koncentrace fosforu a aniontová mezera. Naopak, u zvířat léčených IL-2/N88R zůstávaly tyto parametry během studie v podstatě normální (obr. 1IC a D).

(c) Jatemí funkce. Celkový bilirubin se více než ztrojnásobil ve skupině léčené PROLEUKINEM v den 6 a zůstával na vysokých hodnotách ve dnu 10 (obr. 12A). Naopak, pouze jedno zvíře ve skupině léčené 1L-2/N88R mělo přechodné, mírné zvýšení v den 3 a den 6. Sérové koncentrace SGPT se dramaticky zvýšily a dosáhly hodnot vyšších než 100 U/I u všech zvířat léčených PROLEUKINEM v den 6 (obr. 12B). Koncentrace SGPT u zvířete č. A199 dosáhla 651 U/l a SGOT 2789 U/l (Lab Notě Book: NIRC č. 8754-9852-Phase II, Tabulka 1, Individual and Group Mean Chemistry Values, strana 17 z 21 stran tabulky), což ukazuje na závažné jatemí selhání.

(d) Koagulace. Koncentrace fibrinogenu se více než zdvojnásobila ve skupině léčené PROLEUKINEM i 1L-2/N88R a dosáhla vrcholu v den 6 (obr. 12C). Zdá se, že zvýšení proběhlo dříve než ve skupině léčené PROLEUKINEM než ve skupině léčené IL-2/N88R. Toto je patrné na zvýšení o 51 % vs. 5 % v den 3. Změny v koncentraci fibrinogenu mohou být důsledkem akutní proteinové reakce, spíše než defektů koagulace, protože nebyly patrné významné změny v APTT nebo PT ve stejném období (obr. I2D). Nicméně, ode dne 10 se hodnoty APTT začaly mírně zvyšovat ve skupině léčené PROLEUKINEM, ačkoliv absolutní hodnoty zůstávaly v normálním rozmezí. Stejný trend, ale v menším rozsahu, byl také pozorován ve skupině léčené IL-2/N88R. Nicméně, je zajímavé, že koncentrace fibrinogenu se snížily ve stejné době v obou skupinách.

(e) Homeostáza. Koncentrace sodíku v séru se snížila na 135 MEQ/1 u dvou ze tří zvířat léčených PROLEUKINEM v den 8, ale zůstala normální u ostatních zvířat (obr. 13A). Koncentrace chloridů se ve skupině léčené PROLEUKINEM také snížily pod 95 MEQ/1 od dne 3 a zůstávaly nízké do dne 15 (obr. 13B). Koncentrace vápníku byla nižší u dvou ze tří zvířat

-25 CZ 302071 B6 léčených PROLEUKINEM v dny 6 a 8 a snížila se až na 4,9 a 3,1 mg/dl u zvířete A199 (obr. 13C). Koncentrace draslíku se snížily na 3 MEQ/1 ve dnech 3 až 12 u všech zvířat léčených PROLEUKINEM s výjimkou zvířete A199, u kterého se koncentrace draslíku zvýšila na toxickou koncentraci 7,2 MEQ/1 před vyřazením zvířete ze studie (obr. 13D).

(f) Známky zvýšené propustnosti kapilár. Koncentrace sérového albuminu se snížila jak ve skupině léčené PROLEUKINEM (37%), tak ve skupině léčené IL -2/N88R (19%) (obr. 14A). Vyšší hematokrit byl pozorován ve skupině léčené PROLEUKINEM ve dny 3 a 6 (obr. 14B). Naopak, hematokrity se snížila ve stejnou dobu jak ve skupině léčené vehíkulem, tak IL-2/N88R, a zůstáκι vály nízké, což ukazuje na mírnou anemii způsobenou mnoha odběry krve (obr. 14B a C). Zvýšení hematokritu ve skupině léčené PROLEUKINEM společně se snížením koncentrace albuminu ukazuje na vznik syndromu zvýšené propustností kapilár.

3. Aktivace buněk

Účinnost PROLEUKINu a IL-2/N88R byla sledována podle změn procenta CD25 pozitivních lymfocytů (migrace + proliferace) a průměrné fluorescence pro CD25 nebo poctu CD25 antigenů exprimovaných na povrchu daných T lymfocytů (CD25 = nízko afinitní IL 2R). Exprese CD25 byla sledována na celkové populaci T lymfocytů (CD3+ buněk), stejně jako na CD3+CD4+ a

2o CD3+CD8+ populacích.

Aktivita IL-2 na NK buňky byla sledována pomocí analýzy změn v populaci CD3-CD16+ a CD3-CD25+CD16+ NK buněk. Absolutní počty CD3+, CD4+, CD8+, NK buněk byly vypočteny násobením procenta buněk počtem lymfocytů na mm³, kde tato hodnota byla získána během hematologického vyšetření.

(a) Regulace exprese CD25 na povrchu T lymfocytů. Procento aktivovaných T lymfocytů, jak je určeno procentem CD25 pozitivních buněk, se zvýšilo v den 6 studie, většino na CD3+CD4+ subpopulaci T lymfocytů. Zdá se, že PROLEUKIN indukuje expresi CD25 na vyšším procentu .to CD3+, CD3+CD4+ a CD3+CD8+ subpopulaci T lymfocytů v den 6. Nicméně, v den 8 bylo procento buněk exprimujících CD25 antigen identické pro lymfocyty šimpanzů léčených PROLEUKINEM a šimpanzů léčených IL-2/N88R (obr. 15A, B a C). Žádné barvení na CD25 na povrchu přirozených zabíječů (NK) buněk nebylo pozorováno ani u šimpanzů léčených PROLEUKINEM, ani IL-2/N88R. Chybění exprese IL-2Ra (antigenu buněčného povrchu barveného

CD25) na povrchu vybrané populace NK buněk (CD3-/CD16+) je pravděpodobně odpovědné za tento výsledek.

Absolutní počet CD3+CD25+ T lymfocytů sledoval stejný vývoj jako procentuální zastoupení CD3+CD25+ T lymfocytů stím, že PROLEUKIN se zdál být aktivnější než IL-2/N88R (obr. 16A). IL-2/N88R vykazoval podobný aktivační potenciál na T lymfocyty jako PROLEUKIN pro CD3+CD4+ T lymfocyty, stejně tak jako bylo zvýšení absolutního počtu CD3+CD4+CD25+ lymfocytů indukované IL-2/N88R stejné jako zvýšení indukované PROLEUKINEM (obr. I6B). Zdálo se, že PROLEUKIN indukoval zvýšení počtu CD3+CD8+CD25+ T lymfocytů větší než IL-2/N88R (obr. 16C).

Počet CD25 molekul (průměr fluorescence) exprimovaných na CD3+CD4+ subpopulaci T lymfocytů sledoval podobné kinetikyjak při léčbě PROLEUKINEM, tak IL-2/N88R (obr. 17).

(b) Přesuny lymfocytů: efekty léčby PROLEUKINEM a IL-2/N88R

Vliv PROLEUKINU a 1L-2/N88R na populaci T lymfocytů a NK buněk byl stanoven pomocí analýzy změn absolutního počtu cirkulujících lymfocytů před, během a po léčbě (obr. 18). Zdálo se, že 1L-2/N88R má větší vliv než PROLEUKIN na zvýšení absolutního počtu cirkulujících CD3+CD4+ lymfocytů (obr. 18A) a o něco menší vliv než PROLEUKIN na zvýšení absolutního počtu cirkulujících CD3+CD8+ lymfocytů (obr. 18B). Obě sloučeniny měly srovnatelný, i když

-26CZ 302071 B6 slabý, vliv na zvýšení celkového počtu CD3+ lymfocytů (obr. 18C). Ani PROLEUKIN, ani IL2/N88R neovlivňovaly přesun NK buněk (obr. 18D).

C. Závěr

IL-2/N88R byl připraven pomocí vyšetřování mutantních IL-2 proteinů v testech na primárních lidských T lymfocytech a NK buňkách. Vykazuje in vitro přibližně 6000-násobnou selektivitu pro T lymfocyty vzhledem kNK buňkám. Vzhledem kjeho buněčnému profilu se předpokládá, že bude indukovat pouze mírné vedlejší účinky při podání v dávkách, které budou vyvolávat významnou aktivaci T lymfocytů. Pokusy na Šimpanzech, srovnávající PROLEUKIN s IL2/N88R, potvrdily, že IL-2/N88R má znatelně lepší profil bezpečnosti než PROLEUKfN a zároveň si zachovává srovnatelnou schopnost indukovat aktivaci T lymfocytů.

Příklad 8: Účinnost selektivního agonisty IL-2 N88R v myším modelu plicních metastáz nádoru CT-26

Protokol: Myším (Balb/c samice, stáří 6 až 8 týdnů) bylo intravenosně podáno 1 χ 10⁵ CT-26 buněk (myší karcinom tlustého střeva) v 0,2 ml PBS do laterální ocasní žíly v den 0. Léčba

PROLEUKINEM nebo IL-2/N88R v různých dávkách (ředidlo: 5% dextrosa ve vodě (D5W) nebo D5W, podávaná i.v,, jednou denně po dobu 8 dnů (QD x 8) byla zahájena 1 den po implantaci. IL-2/N88R byl připraven při teplotě okolí ředěním do D5W za použití silikonovaných zkumavek pomocí tuberkulinové injekční stříkačky a dávka byla podána zvířatům během 2 hodin po přípravě. PROLEUKIN byl připraven přidáním 0,7 ml sterilní vody pro injekce (SWFI) do každé zkumavky (konečná koncentrace 1,86 mg/ml). Ředění byla provedena stejně jako ředění pro 1L2/N88R do D5W (tabulka 6). Zvířata byla utracena v den 11. Plíce byly odstraněny a zváženy, promyly se v PBS a tkáň se přenesla do Bouinova roztoku. O 24 hodin později se tkáň přenesla do 10% formalinu. Počet metastatických kolonií v plících se spočítal pod disekčním mikroskopem.

Tabulka 6: Dávky a skupiny ve studii na myším modelu CT-26 nádoru

j Skupina	n	Léčba	Dávka, mg/kg J
1	14	D5W	NA
2	1 1	PROLEUKIN	3 mg/kg
3	11	PROLEUKIN	10 mg/kg
4	11	IL-2/N88R	1 mg/kg
5	12	IL-2/N88R	3 mg/kg
6	12	IL-2/N88R	10 mg/kg
7	12	IL-2/N88R	30 mg/kg
8	1 1	IL-2/N88R	60 mg/kg

Tabulka 7 ukazuje počet metastáz u jednotlivých myší. Srovnatelná účinnost byla pozorována pro IL-2/N88R i pro PROLEUKIN. Pří vysoké dávce IL-2/N88R (skupina 8, 60 mg/kg) měly všechny kromě jedné myši 12 metastáz nebo méně: 3 myši neměly žádné metastázy, Toto je v protikladu k nejvyšší testované dávce PROLEUKINU, při které měly všechny přežívající myši

12 metastáz nebo více.

-27CZ 302071 B6

Ϊ abulka 7: Jednotlivé počty metastáz a průměry metastáz

C skupina	Plicní metastasy (jsou uvedeny počty pro jednotlivé mySi)l	Průměr	SEM	P hodnota (2 -čestná)
1	0 129 183 179 155 165 200 152 148 158 200 194 165 125	154	13.42
2	118 126 107 111 1L8 110 137 1 14 135 158 132	124	4.61	0.07278
3	12 38 18 19 30	23	4.66	0.00003
4	169 173 189 200 120 117 136 122 200 163 110	154	10.41	0.97029
5	171 176 186 159 192 139 117 200 195 116 192	168	9.31	0.43401
6	92 lil 112 114 109 84 68 47 58 49 112	87	8.16	0.00060
7	15 13 59 62 23 55 46 16 9 4 8 2	26	6.57	0.00000
8	70 3 24970 12 55 0	9 |	|4.75	0.00000

Statisticky významné (p<0,05) snížení počtu metastáz bylo pozorováno u myší léčených 1L5 2/N88R v dávkách 10, 30 a 60 mg/kg (skupiny 6, 7 a 8, v příslušném pořadí), a ve skupině léčené mg/kg PROLEUKINU (skupina 3). Tyto výsledky jsou znázorněny graficky na obr. 19. Data jsou ve grafu jako log dávky: pro PROLEUKIN byly dávky 3 a 10 mg/kg; pro IL-2/N88R byly dávky 1, 3, 10, 30 a 60 mg/kg. Vypracování křivky za použití nelineární rovnice (4-parametrická shoda) vedlo k zisku hodnot IC₅o 5,2 mg/kg pro PROLEUKIN a 10,9 mg/kg pro IL-2/N88R.

[0

Z dat získaných v tomto pokusu byla hodnota IC₅₀ pro snížení počtu metastáz pro IL-2/N88R vypočtena na 10,9 mg/kg (8,6-13,9 mg/kg při 95% intervalu spolehlivosti) a pro PROLEUKIN byla vypočtena na 5,2 mg/kg (3,5 až 7,7 mg/kg pri 95% intervalu spolehlivosti).

Přežívání myší je uvedeno v tabulce 8. Ve skupině s 10 mg/kg PROLEUKIN uhynula jedna (1) myš v den 7 a dalších pět (5) myší uhynulo v den 8. Jedna (1) myši uhynula v den 8 v každé skupině léčené 3 nebo 10 mg/kg IL-2/N88R a žádná úmrtí nebyla pozorována ve skupinách léčených 1, 30 nebo 60 mg/kg IL-2/N88R. Kromě toho, všechny myši léčené 3 mg/kg PROLEUKINU a všechny myši léčené 10 mg/kg PROLEUKINU byly nemocné; žádná morbidita nebyla pozorována u myší léčených IL-2/N88R.

Tabulka 8: Přežívání myší léčených IL-2/N88R nebo PROLEUKIN EM

Skupina	Den 0	7*	fi	11
D5W1	100%	100%	100%	100%

Pro 3 mg/kg2	100%	100%	100%	100%
Pro 10 mg/kg2	100%	90,9%	45,5%	45,5%
IL-2/N88R 1 mg/kg2	100%	100%	100%	100%
IL-2/N88R 3 mg/kg2	100%	100%	91,7%	91,7%
IL-2/N88R 10 mg/kg3	100%	100%	91,7%	91 ,7%
IL-2/N88R 30 mg/kg3	100%	100%	100%	100%
IL-2/N88R 60 mg/kg2	100%	100%	100%	100%

¹ n - 14 myší/skupinu η = 11 myší/skupinu ³ n = 12 myší/skupinu ⁴ žádná úmrtí nebyla pozorována před dnem 7.

-28CZ 302071 B6

PROLEUKINEM léčená zvířata v obou skupinách byla moribundní. Žádná morbidita nebyla pozorována u jakéhokoliv zvířete léčeného IL-2/N88R.

Závěrem, tato studie naznačuje, že 1L-2/N88R je stejně účinný jako PROLEUKIN v redukci růstu nádoru (jak je měřen počtem plicních metastáz v CT26 modelu). Dále, IL-2/N88R je významně méně toxický než PROLEUKIN.

Příklad 9: Vývoj stabilní, vysoce produktivní CHO buněčné linie exprimující IL-2/N88R

Buněčné linie se stabilní produkcí secemující vysoká množství IL-2/N88R mutantního proteinu byly připraveny transfekcí CHO(dhfr-) buněk expresním vektorem uvedeným na obr. 20. Jednotlivé prvky IL2N88R expresního vektoru jsou uvedeny v plazmidové mapě (obr. 20). Tato mapa ukazuje CMVe/p (cytomegalovirový časný promotor); PA (SV40 pólyadenylační signální sekvenci); a DHFR (dihydrofolatreduktasovou expresní kazetu).

Vektor byl konstruován za použití standardních technik rekombinantní DNA. Obecně viz Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. vydání, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Short Protocols in Molecular Biology, 2. vydání, 1992, John Wiley and Son; Methods in Enzymology, svazek 185, ed. Goeddel et al., Academie Press, lne., London, 1991. Expresní vektor obsahoval samostatné expresní kazety pro IL2N88R gen a amplifikovatelný a selektovatelný gen DHFR (dihydrofolatreduktasa). Přibližně 1 x 10⁶ CHO (ovariální buňky čínského křečka) buněk bylo transfektováno 10 gg pCBl IL2SA za použití Li pofecti nového činidla (Life Technology lne., Bethesda, Maryland) podle návodu výrobce. Buňky byly potom selektovány za přítomnosti 50 nM methotrexatu a byly kultivovány v DME/F12 médiu (Life Technologies, lne.) neobsahujícím thymidin a hypoxantin a obsahujícím 5% dialyzované fetální telecí sérum. Buněčné populace byly vyšetřovány na produkci IL2N88R za použití komerčního ELISA kitu (R and D Systems). Populace s vysokou produkcí byly selektovány v médiu obsahujícím zvyšující se koncentrace methotrexatu (100 až 400 nM methotrexatu) a byly vyšetřovány na produkci 1L2N88R. Pro získání klonů s vysokou a stabilní produkcí bylo použito klonování s limitním ředěním. Klonování bylo provedeno za absence methotrexatu za použití standardních technik tkáňové kultivace.

Příklad 10: Bezsérová produkce IL2N88R v perfuzním bioreaktoru

Kontinuální produkce IL2N88R byla provedena za použití fermentace s kontinuální perfuzí. 19litrová Wheaton fermentační nádoba byla naočkována stabilní CHO buněčnou linií z příkladu 9 v dávce 2 x 10⁶ buněk/ml a perfuze byla prováděna s rychlostí výměny média 5 litrů/den. Produkčním médiem bylo médium na bázi DMEM/F12 (Life Technologies, lne., Rockwille, MD) doplněné rekombinantním lidským inzulínem (10gg/l) (HUMULIN™, Eli Lilly, lne., Indianapolis, IN) a FeSO4.EDTA (50 gM). Hustota buněk byla udržována na 4 x 10⁶ buněk/ml. Průměrný denní výtěžek byl 200 mg/den. Produkce IL2N88R byla stabilně udržována po dobu 30 dnů.

Příklad 11. Přečištění IL2/N88R produkovaného v CHO buňkách

Následující postup byl použit pro eluát perfuze popsané výše. Perfuzní médium bylo odebráno a vneseno do S-sepharosové kolony. Kolona byla uvedena do rovnováhy 2 milimolámím fosfátovým pufrem a 5 milimolámím NaCI pri pH 7,0. Vodivost média („TCF“) byla upravena na 4 milisiemensy přidáním vody a úpravou na stejné pH pomocí kyseliny fosforečné.

Po vnesení TCF do kolony se kolona promyla stejným pufrem pro uvedené do rovnováhy. Eluce se provedla pomocí posunu pH. Mutované proteiny byly eluovány 20 mM ethanolaminěm, pH 10,5, za zisku S-eluátu.

-29CZ 302071 B6

Aniontová výměna se provedla zpracováním S-eluátu na QAE Fast Flow koloně (Pharmacia) uvedené do rovnováhy 10 mM hydrogenuhličitanovým pufrem pri pH 10,5. Průtok byl udržován na 250 cm/h. Po základním promytí byl IL-2SA eluován 20 mM fosfátem při pH 4,0.

Hydroxyapatitová chromatografie (HAP) byla provedena zpracováním QAE eluátu (1:1 s WF!) na koloně naplněné keramickým hydroxy apatitem (Type II, BioRad, Hercules, CA) uvedené do rovnováhy 0,10 mM fosfátem pri pH 7,0. Průtok byl udržován na 250 cm/h. Po základním promytí byl IL-25A eluován 100 mM fosfátem při pH 7,0.

ío Eluát z hydroxyapatitové kolony byl zpracován ultrafiltrací na objem 300 ml na Millipore Pelicon-2 jednotce opatřené třemi PES 5K náplněmi (Millipore Corporation, Bedford, MA).

Ultra filtrovaný HAP eluát byl dále přečištěn zpracováním na S100HR (Pharmacia) koloně s vylučováním podle velikosti pri 35 cm/h. Kolona byla uvedena do rovnováhy 10 mM fosfátem a 150 mM NaCl pH 7,0.

Zásobní materiál pro ge lovou filtraci byl naředěn WFI pro dosažení vodivosti 4,0 mMhos(cm a byl znovu aplikován do S-sepharosové kolony za podmínek popsaných výše. 1L2SA byl eluován 10 mM fosfátovým pufrem s 1 molárním NaCl pri pH 7,0.

Konečný materiál z kationtové výměny byl dialyžován přes noc proti fosfátem pufrovanému šalinickému roztoku (PBS) a potom byl ředěn sterilním PBS na koncentraci 6 mg/ml. Získaný naředěný materiál byl potom sterilně filtrován, rozdělen do podílů a zmrazen při -70 C. Celkový výtěžek byl 65 %.

Další provedení vynálezu budou odborníkům v oboru zřejmá. Vynález popisuje způsob pro získání mutovaných proteinů, které zde nejsou výslovně popsány, ale které způsobují aktivaci T lymfocytů, jak je prokázána proliferaci PHA blastů, a sníženou proliferaci NK buněk, a proto patří takové mutované proteiny do rozsahu předkládaného vynálezu. Koncept a pokusy zde .ío popsané je možno za použití heterologních multimerních receptorových systémů použít na jiné cytokiny, zejména na příbuzné cytokiny IL-7, 1L-9 a IL-15, IL—10, interferon a a interferon gamma.

Sekvence

Předkládaný vynález obsahuje následující sekvence:

SEQ ID NO: 1: hIL-2 (aminokyselinová sekvence)

SEQ ID NO: 2: hlL-2 (cDNA)

SEQ ID NO: 3: 5' PCR primer, IL-2 SEQ ID NO: 4: 3' PCR primer, IL-2 SEQ ID NO: 5: mutagenní primer pro IL-2 expresní vektor SEQ ID NO: 6: mutagenní primer pro mutace D20X SEQ ID NO: 7: mutagenní primer pro mutace N88X

SEQ ID NO: 8: mutagenní primer pro mutace Q126X

Seznam sekvencí <110> Shanefelt, Armén B.

Greve, Jeffrey M. Jesmok, Gary Lembach, Kenneth J. Wetzel, Gayie D.

-30CZ 302071 B6 <120> Agonista a antagonista selektivní k IL-2 <130> IL-2 sekvence č. 1-8 <I4O>

<I4I>

<150> 09/080080 <160> 8 < 170> Patentln Ver 2.0 io <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Ala

Pro

Thr

Ser

Ser

Ser

Thr

Lys

Lys

Thr

Gin

Leu

Gin

Leu

Glu

His

1

5

10

15

Leu

Leu

Leu

Asp

Leu

Gin

Met

Ile

Leu

Asn

Gly

Ile

Asn

Asn

Tyr

Lys

20

25

30

Asn

Pro

Lys

Leu

Thr

Arg

Met

Leu

Thr

Phe

Lys

Phe

Tyr

Met

Pro

Lys

35

40

45

Lys

Ala

Thr

Glu

Leu

Lys

His

Leu

Gin

Cys

Leu

Glu

Glu

Glu

Leu

Lys

50

55

60

Pro

Leu

Glu

Glu

Val

Leu

Asn

Leu

Ala

Gin

Ser

Lys

Asn

Phe

His

Leu

65

70

75

80

Arg

Pro

Arg

ASP

Leu

Xle

Ser

Asn

Ile

Asn

Val

Ile

Val

Leu

Glu

Leu

85

90

95

Lys

Gly

Ser

Glu

Thr

Thr

Phe

Met

Cys

Glu

Tyr

Ala

Asp

Glu

Thr

Ala

100

105

110

Thr

Xle

Val

Glu

Phe

Leu

Asn

Arg

Trp

Xle

Thr

Phe

Cys

Gin

Ser

Ile

115

120

125

Xle Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 465 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgtacagga tgcaactcct gtettgcatt caagttctac aaagaaaaca ttttgaatgg gcacctactt ttacagatga acatttaagt gaagaactca agacccaggg acaacattca tggattacct tttacatgcc aacctctgga acttaatcag tgtgtgaata tttgtcaaag aattaataat caagaaggcc ggaagtgcta caatatcaac tgctgatgag catcatctca gcactaagtc cagctacaac tacaagaatc acagaactga aatttagetc gtaatagttc acagcaacca acactgactt ttgcacttgt tggagcattt ccaaactcac aacatcttca aaagcaaaaa tggaactaaa ttgtagaatt gataa cacaaacagt 60 actgctggat 120 caggatgctc ISO gtgtctagaa 240 cttteactta 300 gggatctgaa 360 tctgaacaga 420

65

-31 CZ 302071 B6 io <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Homosapiens <400> 3 cctcaactcc tgaattcatg tacaggatgc <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Homosapiens <400> 4 ggaagcggat ccttatcaag tcagtgttga g <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gcacttgtca caaacaccat ggcacctact tcaagt <2 Ϊ 0> 6 <21l> 28 <212> DNA <213> Homosapiens <400> 6 ggagcattta ctgctgnnnt tacagatg <210> 7 35 <211> 30 <212> DNA <213> Homosapiens <400> 7 gggacttaat cagcnnnatc aacgtaatag <2l0> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ggattacctt ttgtnnnagc atcatctc

- 32 CZ 302071 B6

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid mutovaného lidského interleukinu 2 (IL-2), očíslovaného podle přirozeného typu IL-2, kde uvedený mutovaný lidský IL-2 je substituován vzhledem k přirozenému typu v alespoň jedné z pozic 20, 88 nebo 126, kde substituce v pozici 20 je vybrána z isoleucinu nebo histidinu, a kde substituce v pozici 88 je vybrána z argininu nebo isoleucinu nebo glycinu a kde io substituce v pozici 126 je leucin, a přičemž uvedený mutovaný lidský IL-2 přednostně aktivuje T lymfocyty vzhledem k buňkám přirozeného zabíječe.
2. 2. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 1 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
3. 3. Polynukleotid obsahující DNA sekvenci kódující polypeptid podle nároku 1 a jeho degenerované varianty.
4. 4. Prokaryotická hostitelská buňka transformovaná polynukleotidem podle nároku 3.
5. 5. Vektor obsahující polynukleotid podle nároku 3.
6. 6. Polypeptid podle nároku 1 pro léčení savce postiženého stavem léčitelným IL-2, podáváním terapeuticky účinného množství tohoto polypeptidů.
7. 7. Polypeptid podle nároku 6, kde uvedený léčitelný stav IL-2 je vybrán ze souboru zahrnujícího HIV, nádory včetně karcinomu ledvin a maligního melanomu, autoimunitní onemocnění, infekční onemocnění, imunodeficienci včetně SCID nebo jiné terapeutické aplikace vyžadující celkovou stimulaci imunitního systému.
8. 8. Použití polypeptidů obsahujícího mutovaný lidský interleukin 2 (IL-2) očíslovaného podle přirozeného typu IL-2 podle nároku 1, pro výrobu farmaceutického prostředku pro přednostní aktivaci T Iymfocytů vzhledem k buňkám přirozeného zabíječe, kde uvedený mutovaný lidský 1L—2 je substituovaný vzhledem k přirozenému typu v alespoň jedné z pozic 20, 88 nebo 126, a

   35 kde substituce v pozici 20 je vybrána z isoleucinu nebo histidinu, a kde substituce v pozici 88 je vybrána z argininu nebo isoleucinu nebo glycinu, a kde substitucí v pozici 126 je leucin.