KR20220008323A - 면역 세포를 증식하는 il-2 돌연변이 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IL-2 돌연변이 단백질, 상기 IL-2 돌연변이 단백질을 포함하는 융합 단백질 또는 접합체, 및 상기 IL-2 돌연변이 단백질, 융합 단백질 또는 접합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 야생형 IL-2 단백질과 비교하여, 본 발명의 IL-2 돌연변이 단백질은 고-친화도 IL-2 수용체에 대한 친화도를 제거하거나 감소하고 중간-친화도 IL-2 수용체에 대한 친화도를 기본적으로 유지한다.

Description

면역 세포를 증식하는 IL-2 돌연변이 단백질
본 발명은 단백질 공학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 새로운 인터루킨-2(IL-2) 돌연변이체 및 그 제조 방법에 관한 것이고, 상기 인터루킨-2(IL-2) 돌연변이체는, 야생형 IL-2 오리지널 단백질에 비해 결합 파트너 IL-2 수용체 α 서브유닛과의 결합 능력이 감소되지만, IL-2 수용체 β 서브유닛 및 IL-2 수용체 γ 서브유닛과의 결합 능력, 및 상응하는 생물학적 활성을 유지하여, T 이펙터 세포 및 NK 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 종양 면역 세포의 증식을 더 잘 자극할 수 있다.
인터루킨-2(IL-2, Interleukin-2 )는 면역계의 세포 성장 인자의 일종으로 면역계에서 백혈구의 세포 활성을 조절하고 Th0 및 CTL의 증식을 촉진할 수 있으며 항체 반응, 조혈 및 종양 모니터링에도 참가한다. IL-2는 IL-2 수용체(IL-2R)와 결합하여 그 작용를 매개하며, IL-2R은 α, β, γ 이 3개의 사슬로 이루어지며, 서로 다른 조합은 IL-2에 대해 친화도가 다른 수용체 형태를 생성할 수 있다. IL-2Rγ 사슬은 단독으로 IL-2에 결합할 수 없으며, βγ 사슬은 중간-친화도 IL-2R이고, αβγ 사슬은 고-친화도 IL-2R이다.
IL-2는 주로 활성화된 T 세포, 특히 헬퍼 T 세포에 의해 합성된다. 이는 T 세포의 증식 및 분화를 자극하고, 세포독성 T 림프구(CTL)의 생성 및 말초혈림프구의 세포독성 세포 및 림포카인 활성 살해(LAK) 세포로의 분화를 유도하며, 시토카인 및 세포 용해 분자의 T 세포 발현을 촉진하고, B 세포의 증식 및 분화, 및 B 세포에 의한 면역글로불린의 합성을 촉진하며, 자연살해(NK)세포의 생성, 증식 및 활성화를 자극한다.
IL-2는 체내에서 림프구 개체군을 증폭시키고 이러한 세포의 효과기 기능을 향상시키는 능력은 IL-2에 항종양 효과를 부여하여, IL-2 면역 요법이 특정 전이성 암에 대해 유력한 치료 선택이 되게 한다. 따라서, 고용량 IL-2 치료가 전이성 신장암 및 악성 흑색종을 갖는 환자에서의 사용이 승인되었다. 그러나, IL-2는 이펙터 세포의 증폭 및 활성을 매개할 뿐만 아니라 말초 면역 관용을 유지하는데 중요하게 수반된다는 점에서 면역 반응에서 이중적 기능을 갖는다.
IL-2 면역 요법에 관련된 것은 재조합 인간 IL-2 치료에 의해 발생되는 부작용이다. 고용량 IL-2 치료를 받는 환자는 흔히 심각한 심혈관, 폐, 신장, 간, 위장, 신경학, 피부, 혈액 및 전신적인 부작용을 경험하며, 이것은 면밀한 모니터링 및 입원환자(in-patient) 관리를 요구한다. 이러한 부작용의 대부분은 다수의 장기에서 체액혈관외유출(예를 들면, 폐 및 피부 부종 및 간세포 손상을 야기) 및 혈관내 체액 고갈(혈압 강하 및 심박수의 상호보완적 증가를 야기)을 유발하는 혈관 투과도의 병리학적 증가인 소위 혈관(또는 모세관) 누출 증후군(VLS)의 발생에 의해 설명될 수 있다. VLS를 피하기 위해 저용량 IL-2 방안을 환자에게 시험하였지만, 이는 치료 결과 감소를 대가로 한다.
종양 면역은 최근 몇 년 동안 종양을 치료하는 효과적인 방법이다. PD-1 또는 PD-L1 억제제, 및 CTLA-4, CD-47 항체 등과 같은 다른 유사한 면역 억제제를 통해 종양 세포에 대한 체내 T 세포 및 NK 세포의 살해를 구현한다. IL-2는 효과적인 T 세포 및 NK 세포 성장 촉진 인자로 알려져 있지만, 상기 부작용으로 인해 그 적용이 제한적이다.
세포 면역 치료도 최근 몇 년 동안 종양이나 자가 면역 질환을 치료하는 효과적인 방법이다. 인체 자가 면역 세포를 수집하여 시험관 내(in vitro)에서 배양하여 그 개수를 수천 배 증가시키고 표적 살해 기능을 향상시킨 후 인체로 되돌려보내 혈액 및 조직 중의 병원체, 암세포, 돌연변이 세포를 사멸하고, 면역 관용을 깨며, 생체의 면역 능력을 활성화하고 강화하여, 치료와 건강 관리의 이중 효과를 달성한다. 시토카인 유도 살해세포(CIK) 요법, 수지상세포(DC) 요법, DC+CIK 세포 요법, 자연살해세포(NK) 요법, DC-T, CART, CAR-NK 세포 요법 등에서, 시험관 내 증폭 과정에서 IL-2를 종종 사용하는데, 야생형 IL-2는 비종양 살해 면역 세포도 함께 증폭시키므로, CD8 등 면역 세포를 보다 효과적으로 증폭시키는 IL-2가 필요하다.
본 분야에서는 IL-2 면역 치료와 관련된 이러한 문제를 극복하기 위하여 여러가지 방법을 사용하고 있다. 예를 들어, IL-2와 특정 항-IL-2 단클론 항체를 조합하여 체내에서 IL-2 치료 효과를 향상시킨다(Kamimura et al. J Immunol 177, 306-14(2006); Boyman et al. Science 311, 1924-27(2006)). 또한 IL-2를 다양한 방식으로 돌연변이시켜 독성을 감소하거나 및/또는 그 효능을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, Hu 등(Blood 101, 4853-4861(2003), 미국 특허 공개번호 2003/0124678)은 IL-2의 38번 위치에서의 아르기닌 잔기를 트립토판으로 치환하여 IL-2의 혈관 투과 활성을 제거하였다. Shanafelt 등(NatureBiotechnol 18, 1197-1202(2000))은 아스파라긴 88을 아르기닌으로 돌연변이시켜 T 세포에 대한 선택적 증폭을 강화하고, 독성 부작용이 있는 NK 세포 증폭을 감소하였다. Heaton 등(Cancer Res 53, 2597-602(1993); 미국 특허 제5,229,109호)은 2개의 돌연변이 Arg38Ala 및 Phe42Lys를 도입시켜 NK 세포로부터의 전염증성 시토카인 분비를 감소하였다. Gillies 등(미국 특허 공개번호 2007/0036752)은 IL-2 중의 3개의 잔기(Asp20Thr, Asn88Arg 및 Glnl26Asp)를 치환하여 VLS를 감소하였다. Gillies 등(W02008/0034473)은 또한 아미노산으로 Arg38Trp 및 Phe42Lys 돌연변이 IL-2와 CD25의 계면을 치환하여, CD25와의 상호작용 및 Timf 세포 활성화를 감소하여 효능을 향상시켰다. 동일한 목적으로, Wittrup 등(W02009/061853)은 CD25에 대한 친화도를 증가하지만 수용체를 활성화시키지 않음으로써 길항제 작용을 하는 IL-2 돌연변이체를 얻었다. 돌연변이를 도입하는 목적은 수용체 β 서브유닛 및/또는 γ 서브유닛과의 상호작용을 파괴하는 것이다. 그러나, 이러한 공지된 IL-2 돌연변이체 중 어느 것도 앞에서 언급된 IL-2 면역 치료와 관련된 문제, 즉 VLS의 유도에 의해 야기된 독성, AICD의 유도에 의해 야기된 종양 내성 및 Timf 세포의 활성화에 의해 야기된 면역 억제를 극복하지 못하였다. 로슈 글리카트 아게 회사(CN103492411A)는 IL-2 중 F42A, Y45A 및 L72G 이 3개의 위치에서의 아미노산을 돌연변이시켜, 고-친화도 IL-2 수용체에 대한 IL-2 단백질의 친화도를 감소하고 중간-친화도 IL-2 수용체에 대한 상기 돌연변이 IL-2 단백질의 친화도를 유지하지만, 동시에 얻어진 IL-2 돌연변이체의 생물학적 활성도 감소한다. 예를 들어, 마이애미 대학교(CN107074967A)는 융합 단백질을 구축하였는데, 상기 융합 단백질은 인터루킨-2 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편의 제1 폴리펩티드 및 제1 폴리펩티드의 오픈 리딩 프레임과 융합된 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제2 폴리펩티드는 인터루킨-2 수용체 α(IL-2Rα)의 세포외 도메인 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 포함하며, 여기서 상기 융합 단백질은 IL-2 활성을 갖는다. 구축된 융합 단백질은 자체 결합을 통해 세포 표면에 대한 IL-2의 고-친화도 IL-2Rα 결합 작용을 제거하지만, 상기 융합 단백질에 자체 또는 상이한 분자 간의 상호결합이 존재할 수 있어, 폴리머 생성이 용이하고, 생산 및 품질 제어에 불리하며; 상기 융합 단백질은 체내에서 결합 및 해리 균형이 존재하므로, 세포 표면에 대한 고-친화도 IL-2Rα 결합 작용을 완전하게 제거할 수 없고, 여전히 세포 표면 IL-2Rα와 결합할 수 있다.
따라서, 본 분야에는 IL-2 치료 효과를 개선하고 강화된 IL-2 폴리펩티드를 안정적이고 간편하게 생산할 필요가 있다.
본 발명은 새로운 IL-2 돌연변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 야생형 IL-2와 비교하여, 본 발명의 IL-2 돌연변이체는 IL-2 면역 치료와 관련된 문제를 극복할 수 있지만, 필요한 생물학적 활성을 여전히 유지할 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 IL-2 돌연변이체를 제공하고, 야생형 IL-2와 비교하여, 상기 IL-2 돌연변이체의 아미노산 잔기에서 돌연변이가 발생함으로써, IL-2와 이의 수용체의 결합 능력이 변경되며; 상기 IL-2 돌연변이체가 고-친화도 IL-2 수용체에 대한 친화도를 제거하거나 감소하고 중간-친화도 IL-2 수용체에 대한 친화도를 기본적으로 유지한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 고-친화도 IL-2 수용체는 IL-2 수용체의 이종삼량체 형태로서, 수용체 α 서브유닛, 수용체 β 서브유닛 및 수용체 γ 서브유닛으로 이루어지고; 상기 중간-친화도 IL-2 수용체는 IL-2 수용체 β 서브유닛 및 IL-2 수용체 γ 서브유닛만 포함하며, IL-2 수용체 α 서브유닛은 없다.
바람직한 실시형태에서, 야생형 IL-2와 비교하여, 상기 IL-2 돌연변이체와 고-친화도 IL-2 수용체의 결합 친화도는 55% 이상 감소하고, 더 바람직하게는 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 감소하며, 가장 바람직하게는 상기 IL-2 돌연변이체와 고-친화도 IL-2 수용체는 결합하지 않고;
상기 IL-2 돌연변이체와 중간-친화도 IL-2 수용체의 결합 친화도는 야생형 IL-2와 중간-친화도 IL-2 수용체의 결합 친화도의 50% 이상이며, 더 바람직하게는 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상이고; 가장 바람직하게는, 상기 IL-2 돌연변이체와 중간-친화도 IL-2 수용체의 결합 친화도는 야생형 IL-2와 중간-친화도 IL-2 수용체의 결합 친화도와 상응하다.
바람직한 실시형태에서, 상기 IL-2 돌연변이체는 T 이펙터 세포 및 NK 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 종양 면역 세포의 증식을 활성화하는 작용을 유지한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에 대응되는 39번, 49번, 73번 및 109번 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기 돌연변이가 발생한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에 대응되는 39번, 49번, 73번 및 109번 중 어느 하나의 위치에서 아미노산 잔기 돌연변이가 발생한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에 대응되는 39번 위치에서만 아미노산 잔기 돌연변이가 발생한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에 대응되는 39번 위치의 아미노산 잔기 및, 49번, 73번 및 109번 중 어느 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기 돌연변이가 발생하고;
상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에 대응되는 49번 위치의 아미노산 잔기 및 39번, 73번 및 109번 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기 돌연변이가 발생하며;
상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에 대응되는 73번 위치의 아미노산 잔기 및 39번, 49번 및 109번 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기 돌연변이가 발생하고;
상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에 대응되는 109번 위치의 아미노산 잔기 및 39번, 49번 및 73번 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기 돌연변이가 발생한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에 대응되는 39번, 49번, 73번 및 109번 중 1개, 2개, 3개 또는 4개의 위치에서 돌연변이가 발생한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에서 M39D, M39E, M39Q, M39N, M39A, K49N, A73T, A73S 및 D109N 중 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이가 발생한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에서 M39D, M39E, M39Q, M39N 또는 M39A 아미노산 잔기 점 돌연변이가 발생하고; 바람직하게는 M39D, M39E, M39Q 또는 M39N; 더 바람직하게는 M39D, M39E 또는 M39Q; 보다 더 바람직하게는 M39D 또는 M39E; 가장 바람직하게는 M39D 아미노산 잔기 점 돌연변이가 발생한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 IL-2 돌연변이체는 O-글리코시드 위치를 제거한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에 대응되는 3번 위치에서 돌연변이가 발생함으로써, O-글리코시드 위치를 제거한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2 단백질에 대응되는 3번 위치에서 T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K 및 T3P 등 아미노산 잔기 돌연변이가 발생하고; 바람직하게는 T3A 아미노산 잔기 돌연변이가 발생한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 IL-2 돌연변이체는 C125L, C125S, C125A 등 125번의 cys 위치를 돌연변이시키고; 바람직하게는 C125S를 돌연변이시킨다.
제2 양태에서, 본 발명은 융합 단백질 또는 접합체를 제공하고, 상기 융합 단백질 또는 접합체는 제1 양태에 따른 IL-2 돌연변이체 및 비-IL-2 기능 부분을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 비-IL-2 기능 부분은,
인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 Fc 단편, 및 90% 이상의 상동성을 갖는 Fc 단편 돌연변이체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 Fc 단편;
인간 혈청 알부민(HSA);
항-HSA 항체 또는 항체 단편;
트랜스페린;
인간 융모성 생식선 자극호르몬 β 서브유닛 카르복시말단펩티드(CTP);
엘라스틴-유사 폴리펩티드(elastin-like peptide, ELP);
항원 결합 부분으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 항원 결합 부분은,
항체 또는 이의 활성 항체 단편;
Fab 분자, scFv 분자 및 VHH 분자; 또는
세포 수용체 또는 리간드이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 융합 단백질 중의 IL-2 돌연변이체와 비-IL-2 기능 부분은 직접 연결될 수 있고, 어댑터를 통해 연결될 수도 있으며; 상기 어댑터는(G3S)4와 같은 G3S의 반복 서열 또는 G4S의 반복 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 AAA 또는 GS의 반복 서열일 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 IL-2 돌연변이체 또는 융합 단백질은,
폴리에틸렌 글리콜 변형(PEG화);
폴리시알산 변형(PSA화);
포화지방산 변형;
히알루론산 변형(Hyaluronic acid, HA);
폴리아미노산 변형(proline-alamine-serine polymer, PAS화)을 추가로 수행하여 접합체를 형성할 수 있다.
제3 양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 제1 양태에 따른 IL-2 돌연변이체 또는 제2 양태에 따른 융합 단백질 또는 접합체를 코딩한다.
제4 양태에서, 본 발명은 발현 벡터를 제공하고, 상기 발현 벡터는 제3 양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
제5 양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 제공하고, 상기 숙주 세포는 제4 양태에 따른 발현 벡터를 포함하거나, 또는 상기 숙주 세포의 게놈은 제3 양태에 따른 폴리뉴클레오티드와 통합된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포이고; 바람직하게는 효모, 곤충 세포, 동물 세포이며; 포유동물 세포일 수 있다.
제6 양태에서, 본 발명은 무세포 발현 모드를 제공하고, 상기 발현 시스템은 제4 양태에 따른 발현 벡터를 포함한다.
제7 양태에서, 본 발명은 약학 조성물을 제공하고, 상기 약학 조성물은 제1 양태에 따른 IL-2 돌연변이체 또는 제2 양태에 따른 융합 단백질 또는 접합체 및 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함한다.
제8 양태에서, 본 발명은 T림프구 및 자연살해(NK) 세포의 시험관 내 증폭 또는 개체 질환의 치료를 위한 약물의 제조에서 제1 양태에 따른 IL-2 돌연변이체 또는 제2 양태에 따른 융합 단백질의 용도를 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 질환은 IL-2를 적용하여 면역 치료하는 질환이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 질환은 암, 면역 질환, 인간면역결핍 바이러스(HIV) 감염, C형 간염 바이러스(HCV) 감염, 류마티스 관절염, 아토피 피부염 등이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 암, 면역 질환, 인간면역결핍 바이러스(HIV) 감염, C형 간염 바이러스(HCV) 감염, 류마티스 관절염, 아토피 피부염 등은 면역시스템을 자극하거나 면역 세포를 증식하는 것을 통해 치료된다.
제9 양태에서, 본 발명은 T림프구 및 자연살해(NK) 세포의 시험관 내 증폭 또는 개체 질환의 치료에 사용되는 제1 양태에 따른 IL-2 돌연변이체 또는 제2 양태에 따른 융합 단백질을 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 질환은 IL-2를 적용하여 면역 치료하는 질환이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 질환은 암, 면역 질환, 인간면역결핍 바이러스(HIV) 감염, C형 간염 바이러스(HCV) 감염, 류마티스 관절염, 아토피 피부염 등이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 암은 면역시스템을 자극하거나 면역 세포를 증식하는 것을 통해 치료되는 암이다.
제10 양태에서, 본 발명은 제1 양태에 따른 IL-2 돌연변이체 또는 제2 양태에 따른 융합 단백질 또는 접합체 또는 제6 양태에 따른 약학 조성물을 IL-2 면역 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 치료 방법은 면역시스템을 자극하거나 면역 세포를 증식하는 것을 통해 암 또는 면역 질환, 인간면역결핍 바이러스(HIV) 감염, C형 간염 바이러스(HCV) 감염, 류마티스 관절염, 아토피 피부염 등을 치료한다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상술한 기술적 특징과 아래(예를 들어 실시예)에서 구체적으로 설명될 기술적 특징은 서로 결합되어 새로운 또는 바람직한 기술적 해결수단을 형성할 수 있음을 이해해야 한다. 편폭의 제한으로 인해 여기서 일일이 설명하지 않는다.
본 발명은 면역시스템을 자극하거나 면역 세포를 증식하는 것을 통해 암 또는 면역 질환, 인간면역결핍 바이러스(HIV) 감염, C형 간염 바이러스(HCV) 감염, 류마티스 관절염, 아토피 피부염 등을 치료한다.
도 1은 효소결합면역흡착제 검정법에 의해 검출된 IL-2 돌연변이체와 CD25의 결합 능력을 나타낸다.
도 2는 rhIL-2 및 돌연변이 인터루킨-2(His 태그)에 반응하는 CTLL-2 세포의 증식 상황을 나타낸다.
도 3은 rhIL-2 및 돌연변이 인터루킨-2(Fc 태그)에 반응하는 CTLL-2 세포의 증식 상황을 나타낸다.
도 4는 rhIL-2 및 돌연변이 인터루킨-2(His 태그)에 반응하는 NK92 세포의 증식 상황을 나타낸다.
도 5는 rhIL-2 및 돌연변이 인터루킨-2(Fc 태그)에 반응하는 NK92 세포의 증식 상황을 나타낸다.
도 6a 내지 도 6y는 각각 서열 SEQ ID NO: 1-25를 나타낸다.
도 7a 내지 도 7l는 각각 서열 SEQ ID NO: 26-37을 나타낸다.
도 8a 및 8b는 각각 IL-2gm1-HSA, IL-2gm4-HSA, IL-2gm6-HSA, IL-2gm1a-HSA, IL-2gm1b-HSA, IL-2gm1c-HSA, IL-2gm1d-HSA, 야생형 IL-2-HSA와, 인간 IL-2Rα 서브유닛 및 재조합 인간 IL-2Rβγ 이종이량체의 친화도를 나타낸다.
도 9는 IL-2 돌연변이체 및 야생형 IL-2가 NK92 세포 증식을 자극하는 상황을 나타낸다.
도 10은 IL-2 돌연변이체에 의해 유도된 IFN-γ의 방출을 나타내고, 여기서, 도 10a는 상이한 농도의 IL-2gm1-HSA, IL-2gm4-HSA 및 야생형 IL-2-HSA에서 NK92 세포가 인터페론 γ의 방출을 자극하도록 유도하는 것을 나타내며; 도 10b는 상이한 농도의 IL-2gm6-HSA 및 야생형 IL-2-HSA에서 NK92 세포가 인터페론 γ의 방출을 자극하도록 유도하는 것을 나타낸다.
도 11은 NK 세포 및 Treg 세포에 대한 IL-2gm6-HSA 및 야생형 IL-2-HSA의 증식 작용을 나타내고; 여기서, 도 11a는 상이한 농도의 IL-2gm6-HSA 및 야생형 IL-2-HSA와 6일 동안 인큐베이팅한 후 NK 세포의 증식 상황을 나타내며; 도 11b는 상이한 농도의 IL-2gm6-HSA 및 야생형 IL-2-HSA와 6일 동안 인큐베이팅한 후 Treg 세포의 증식 상황을 나타낸다.
도 12는 NK 세포 및 CD4+T 세포에 대한 IL-2gm1-HSA 및 야생형 IL-2-HSA의 증식 작용을 나타내고; 여기서, 도 12a는 0 ~ 500 nM 샘플 농도의 자극하에, IL-2gm1-HSA가 야생형 IL-2-HSA에 비해 NK 세포의 증식에 대한 자극 작용을 유의하게 증가였음을 나타내며; 도 12b는 0 ~ 500 nM 농도의 자극 조건하에, IL-2gm1-HSA가 야생형 IL-2-HSA에 비해 CD4+T 세포의 증식에 대한 자극 작용을 모두 유의하게 감소하였음을 나타낸다.
발명자들은 광범위하고 심층적 연구를 통해, IL-2 폴리펩티드에 대해 부위 특이적 돌연변이한 후 글리코실화 변형이 발생한 신규 IL-2 돌연변이 폴리펩티드가 고-친화도 IL-2 수용체에 대한 IL-2 단백질의 친화도를 제거하거나 감소할 수 있고 중간-친화도 IL-2 수용체에 대한 상기 돌연변이 IL-2 단백질의 친화도를 유지시키는 동시에 IL-2의 생물학적 활성을 유지하여, T 이펙터 세포 및 NK 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 종양 면역 세포의 증식을 더 잘 자극할 수 있어 치료의 목적을 달성하는 것을 예기치 않게 발견하였다. 본 발명은 이를 바탕으로 완성되었다.
부위 특이적 돌연변이 기술
부위 특이적 돌연변이는 알려진 단백질의 구조와 기능을 기반으로 알려진 DNA 서열의 특정 뉴클레오티드를 치환, 삽입 또는 삭제하여 새로운 형질을 가진 돌연변이 단백질 분자를 생성하는 단백질 공학 기술이다.
부위 특이적 돌연변이 기술은 단백질의 물리적 및 화학적 성질을 변경할 수 있고, 예를 들어 단백질 약물의 안정성을 향상시키고, 단백질 약물의 용해 성능을 향상시키며, 기질에 대한 효소의 특이성을 변경하고 효소 활성을 향상시키며 친화성 및 특이성을 개선하는 것과 같이 생물학적 성질을 개선할 수 있다.
부위 특이적 돌연변이 기술은 결합 도메인의 아미노산을 돌연변이시켜 리간드와 수용체, 효소와 기질 사이의 결합 활성을 증가 또는 제거할 수 있으며, 이러한 돌연변이는 단백질의 특성을 변경하여 2차 구조 또는 고수준 구조 및 가지고 있는 전하 등 특성의 변화를 초래한다. 돌연변이된 아미노산이 마침 핵심 항원-항체 작용 위치에 있다면, 상기 아미노산 변화는 상기 위치의 전하 및 2차 구조 또는 고수준 구조의 변화를 초래하여, 리간드와 수용체, 효소와 기질 사이가 결합될 수 없어 돌연변이의 목적을 달성한다. 동시에 원래 항체가 이 위치를 인식하지 못하게 되어 새로운 항원을 형성한다. 이것은 이러한 기존 돌연변이 방법에서 불가피하게 발생한다.
본 발명의 IL-2 돌연변이체
본 발명에서, 부위 특이적 돌연변이를 통해 IL-2 폴리펩티드에 아미노산 잔기가 발생하도록 함으로써, IL-2 폴리펩티드와 IL-2R 수용체의 결합 모드를 변경한다. 본 발명의 변경된 IL-2 돌연변이체와 IL-2 수용체의 친화도는 변경된다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 IL-2 돌연변이체는 고-친화도 IL-2 수용체에 대한 친화도를 제거하거나 감소하지만 중간-친화도 IL-2 수용체에 대한 친화도를 유지하고, 동시에 IL-2의 생물학적 활성을 유지한다. 따라서, 본 발명의 IL-2 돌연변이체는 T 이펙터 세포 및 NK 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 종양 면역 세포의 증식를 더 잘 자극할 수 있을 뿐만 아니라, 야생형 IL-2와 비교하여, 이의 부작용 또한 유의하게 감소되므로, 보다 좋은 치료 목적을 달성할 수 있다.
본 발명의 IL-2 돌연변이체 또는 융합 단백질이 글리코실화 변형을 갖는 경우, 바람직하게는 진핵 세포 발현을 사용하고, 세포 배양을 통해 얻어진다. 효모, 곤충 세포, 동물 세포를 선택할 수 있고, 유전자 변형 동물을 선택할 수도 있다. 구체적인 실시형태에서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포이고; 바람직하게는 효모, 곤충 세포, 동물 세포이며; 본 발명의 IL-2 돌연변이체 또는 융합 단백질이 글리코실화 변형을 갖지 않는 경우, 무세포 발현, 대장균, 효모 등 발현을 사용할 수 있고, 바람직하게는 무세포 발현 및 효모 세포를 사용한다.
효모 세포 또는 곤충 세포를 숙주 세포로 사용할 경우, 얻어진 IL-2 돌연변이체의 글리코 타입은 비-인간의 것일 수 있다. 당업자는 비-인간 글리코 타입을 인간 글리코 타입으로 추가로 개조할 수 있다는 것을 알고 있다.
다른 실시형태에서, 원핵 박테리아 발현 발효 또는 시험관 내 무세포 합성을 사용하여 IL-2 돌연변이체를 얻은 후, 시험관 내 효소 촉매 작용 등 방법을 통해 정확하게 글리코실화된 IL-2 돌연변이체를 얻을 수도 있다. 체내 및 시험관 내 변형 방안은 모두 동일한 목적, 즉 IL-2의 부위 특이적 글리코실화를 달성할 수 있다.
단백질의 글리코실화 변형 및 돌연변이
단백질 글리코실화는 복잡한 번역 후 변형 과정으로, 단백질 특정 위치에서 글리코실화 변형을 수행하고, 일반적으로 변형 위치는 아스파라긴 잔기(N-연결) 또는 세린/트레오닌 잔기(O-연결)이며, N-연결 글리코실화 변형은 일반적으로 Asn-X-Ser/Thr(X는 비-프롤린 아미노산이고, N당 위치라고 함)에서 발생하고; O-연결 글리코실화 변형은 일반적으로 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 잔기(O-글리코시드 위치라고 함)에서 발생하며, N-아세틸갈락토사민(Gal-NAc) 및 Ser/Thr의 히드록시를 통해 O-글리코시드 결합을 형성한다. 상응하게, 부위 특이적 돌연변이를 통해 야생형 IL-2에 도입된 글리코실화 위치는 인공 글리코실화 위치이다.
본 발명자들은 인공적으로 도입된 글리코실화 돌연변이를 통해 수용체 단백질과 리간드 단백질 사이의 결합 표면에 입체 공간 구조를 추가하여, 수용체와 리간드가 직접 접촉할 수 없도록 한다. 아울러 특정 위치에서 돌연변이가 발생할 경우 글리코실화 변형이 없는 경우에도 수용체와 리간드의 결합을 유의하게 변경할 수 있다. 본 발명은 기존의 여러 아미노산 부위 특이적 돌연변이와 완전히 다르며, 본 발명은 아미노산의 돌연변이 개수를 유의하게 감소한다. 기존의 부위 특이적 돌연변이는 다수의 아미노산 후의 단백질 결합 표면의 친수성 영역 또는 소수성 영역을 변경하거나, 또는 이의 고수준 구조를 병경하여, 두 단백질이 접촉한 후 안정적인 결합 상태를 형성할 수 없도록 한다. 본 발명에서, 글리코실화 돌연변이 후, 결합 표면이 당쇄에 의해 파괴되어, 두 단백질이 접근할 수 없으므로, 위치 선택이 적절할 경우, 결합을 제거하는 그 능력은 기존 돌연변이 방법보다 훨씬 높으며, 또는 39번 위치의 아미노산 메티오닌과 같은 하나의 아미노산만 변경하는 것을 통해, 리간드와 수용체 사이의 결합을 감소하거나 제거하는 목적을 달성할 수 있다.
구체적으로, 본 발명자들은 인터루킨-2와 인터루킨-2 수용체의 결합 가능한 영역 및 근처의 아미노산 서열에서 돌연변이 부위를 선택하고, 원래 아미노산 서열 중 ASN, Thr 또는 Ser을 포함하는 위치를 이용하며; 바람직하게는 Thr 또는 Ser 위치의 처음 두 아미노산을 선택하여 돌연변이시켜, 돌연변이 부위의 아미노산이 글리코실화가 완료된 후 당쇄에 의해 커버되도록 하고, 면역원성을 최대한 감소한다. Asn 위치 이후에 Thr 또는 Ser를 돌연변이시키는 것도 가능한 해결수단이다.
39번 위치의 점 돌연변이는 글리코실화 여부와 상관없이 수용체와의 결합 능력을 변경할 수 있고, 점 돌연변이만 존재하므로, 생성된 잠재적 면역원성은 아주 작다.
기존에는 고분자 아미노산 및 복잡한 방향족 고리를 포함하는 아미노산은 면역원성이 상대적으로 크고, 다중 돌연변이는 보다 현저한 면역원성을 생성하다고 인식되고 있다. 당쇄는 분자량이 크고, 특히 N당은 복잡한 2-안테나, 3-안테나 내지 4-안테나 구조가 존재하므로(Jonathan J. Lyons et al. Glycans instructing immunity: the emerging role of altered glycosylation in clinical immunology.Front. Pediatr., 11 June 2015를 참조), 결합 위치 근처에 있는 임의의 돌연변이는 모두 두 단백질 사이의 결합에 영향을 미친다.
본 발명의 교시에 따라, 당업자는 부위 특이적 돌연변이를 통해 야생형 IL-2에 보다 적은 돌연변이 위치를 도입하는 방법을 알 수 있다. 얻어진 IL-2 돌연변이체의 면역원성을 감소하기 위해, 본 발명의 IL-2 돌연변이체는 돌연변이 부위 개수를 최대한 감소하고 천연 IL-2에 존재하는 아미노산 잔기를 이용하여 새로운 글리코실화 위치를 생성하여, 얻어진 IL-2 돌연변이체의 구조가 천연 IL-2에 더 가까워지도록 함으로써, 단백질 다른 구조 위치에 대한 돌연변이의 영향을 피하고, 생물학적 활성을 유지한다. 구체적인 실시형태에서, 야생형 IL-2의 39번, 49번, 73번 및 109번 중 하나 이상의 위치(즉, 1개, 2개, 3개 또는 4개의 위치)에서 아미노산 잔기 돌연변이가 발생한다. 구체적인 실시형태에서, 야생형 IL-2에서 M39D, M39E, M39Q, M39N, M39A, K49N, A73T, A73S 및 D109N 중 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이가 발생하고; 바람직하게는 M39D, M39E, M39Q, M39N 또는 M39A 점 돌연변이; 더 바람직하게는 M39D, M39E, M39Q 또는 M39N 점 돌연변이; 보다 더 바람직하게는 M39D, M39E 또는 M39Q 점 돌연변이; 보다 더 바람직하게는 M39D 또는 M39E 점 돌연변이; 가장 바람직하게는 M39D 점 돌연변이가 발생한다.
본 분야의 일반 방법에 기반하여, IL-2 폴리펩티드의 원래 O-글리코시드 위치를 제거할 수도 있고, O-글리코시드를 제거하는 것은 IL-2생물학적 활성에 영향을 미치지 않는다. O-글리코시드는 구조가 복잡하고 분석이 어려운데, 생산 품질 관리의 복잡성을 감소하기 위해, 일반적으로 유전자 공학 돌연변이 기술을 이용하여 상기 글리코실화 위치를 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명의 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2 단백질에 대응되는 3번 위치에서 T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K 및 T3P 등 아미노산 잔기 돌연변이가 발생하고; 바람직하게는 T3A 아미노산 잔기 돌연변이가 발생할 수 있다. IL-2유전자 산물의 정제 및 리폴딩 과정에서, 예를 들어 이황화 결합의 미스매칭 또는 분자 사이에서 이황화 결합의 형성은 모두 IL-2의 활성을 감소할 수 있다. 현재 점 돌연변이를 이용하여, 125번째 위치의 시스테인을 류신 또는 세린으로 돌연변이시켜, 하나의 이황화 결합만 형성하도록 함으로써, IL-2리폴딩 과정에서 활성을 보장하고 있다. 또한 단백질 공학 기술을 이용하여 신규 rIL-2를 생산한다는 보고도 있는데, IL-2 분자의 125번째 위치의 시스테인을 알라닌으로 변경함으로써, 변경된 IL-2의 활성이 천연 IL-2보다 현저하게 증가하도록 한다. 따라서, 본 발명의 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2 단백질에 대응되는 125번 위치에서 C125L, C125A, C125S 아미노산 잔기 돌연변이가 발생할 수 있고; 바람직하게는 C125S 아미노산 잔기 돌연변이가 발생할 수 있다.
본 발명의 IL-2 돌연변이 단백질은 고-친화도 IL-2 수용체에 대한 친화도를 제거하거나 감소하지만, 중간-친화도 IL-2 수용체에 대한 IL-2 돌연변이체의 친화도를 기본적으로 유지할 수 있다. 본문에서, "제거하거나 감소"는 원래 수준과 비교(예를 들어 야생형 IL-2 및 고-친화도 IL-2 수용체의 친화도와 비교)하여, 50%를 초과하여 변경되는 경우를 의미한다. 따라서, 본문에 기재된 "고-친화도 IL-2 수용체에 대한 IL-2 돌연변이체의 친화도를 제거하거나 감소한다"는 것은 야생형 IL-2 단백질과 비교하여, 본 발명의 IL-2 돌연변이체와 고-친화도 IL-2 수용체의 결합 친화도를 50% 이상, 더 바람직하게는 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 감소하고, 가장 바람직하게는 상기 IL-2 돌연변이 단백질과 고-친화도 IL-2 수용체는 결합하지 않음을 의미한다. 유사하게, 본문에 기재된 "중간-친화도 IL-2 수용체에 대한 IL-2 돌연변이체의 친화도를 기본적으로 유지한다"는 것은 상기 IL-2 돌연변이체와 중간-친화도 IL-2 수용체의 결합 친화도가 야생형 IL-2와 중간-친화도 IL-2 수용체의 결합 친화도의 50% 이상, 더 바람직하게는 60% 이상70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상임을 의미한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 IL-2 돌연변이체와 중간-친화도 IL-2 수용체의 결합 친화도는 야생형 IL-2와 중간-친화도 IL-2 수용체의 결합 친화도와 상응하다.
이 밖에, 시험 대상 간의 매우 큰 개체 차이로 인해, 본 발명자들은 선행기술의 일부 IL-2 돌연변이 단백질이 상이한 분자 구조 또는 상이한 실험 배치(experimental batch) 사이에서 상대적으로 차이가 큰 효과를 나타낸다는 것을 발결하였다. 예를 들어 낮은 농도와 높은 농도에서 상대적으로 차이가 큰 효과를 나타낸다. 그러나, 본 발명의 IL-2 돌연변이체는 낮은 농도와 높은 농도에 모두 우수한 기술적 효과를 나타낼 수 있다.
"에 대응되는"
본문에서 사용되는 용어 "에 대응되는"은 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 구체적으로, "에 대응되는"은 2개의 서열의 상동성 또는 서열 동일성을 비교한 후, 하나의 서열이 다른 하나의 서열의 지정 위치에 대응되는 위치를 나타낸다. 따라서, 예를 들어, "야생형 IL-2에 대응되는 특정 아미노산 서열과 야생형 IL-2의 아미노산 서열을 비교하고, 상기 아미노산 서열에서 야생형 IL-2에 대응되는 위치를 찾는 것을 의미한다.
당업자에게 공지된 서열 상동성 또는 동일성을 측정하는 방법은 전산 분자 생물학(Computational Molecular Biology), Lesk, A.M., ed., 옥스포드대학출판사, 뉴욕, 1988; 바이오컴퓨팅: 정보학 및 게놈 프로젝트(Biocomputing:Informatics and Genome Projects), Smith, D.W., ed., 학술출판사, 뉴욕, 1993; 서열 데이터의 컴퓨터 분석(Computer Analysis of Sequence Data), 제1 부분, Griffin, A.M. 및 Griffin, H.G., ed., Humana Press, 뉴저지, 1994; 분자 생물학의 서열 분석(Sequence Analysis in Molecular Biology), von Heinje, G., 학술출판사, 1987, 및 서열 분석 프라이머Sequence Analysis Primer), Gribskov, M.와 Devereux, J., ed., M Stockton Press, 뉴욕, 1991 및 Carillo, H.와 Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073(1988)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 동일성을 측정하는 바람직한 방법은 시험하는 서열 사이에서 가장 큰 매칭을 얻는 것이다. 동일성을 측정하는 방법은 대중이 획득할 수 있는 컴퓨터 프로그램에 컴파일되어 있다. 2개의 서열 사이의 동일성을 측정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 패키지(Devereux, J. et al. 1984), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul, S, F. et al. 1990)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 대중은 NCBI 및 다른 소스에서 BLASTX 프로그램(BLAST 매뉴얼, Altschul, S. et al. NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S. et al. 1990)을 얻을 수 있다. 잘 알려진 Smith Waterman 알고리즘도 동일성 측정에 사용될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 또는 접합체
본 발명의 IL-2 돌연변이체에 기반하여, 당업자는 본 발명의 IL-2 돌연변이체와 비-IL-2의 다른 기능 부분을 융합 단백질 또는 접합체로 제조할 수 있다는 것을 알 수 있다. 본문에서, 접합체는 IL-2 돌연변이 폴리펩티드의 잔기에 공유결합되는 수용성 중합체를 의미한다. 구체적인 실시형태에서, 상기 비-IL-2 기능 부분은 Fc 단편, 인간 혈청 알부민(HSA), 항-HSA 항체 또는 항체 단편, 트랜스페린, 인간 융모성 생식선 자극호르몬 β 서브유닛 카르복시말단펩티드(CTP), 엘라스틴-유사 폴리펩티드(elastin-like peptide, ELP) 및 항원 결합 부분을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 상기 항원 결합 부분은 항체 또는 이의 활성 항체 단편, Fab 분자, scFv 분자 및 VHH 분자, 면역글로불린 분자, 수용체 단백질 분자 또는 리간드 단백질 분자일 수 있고; 상기 면역글로불린 분자는 IgG 분자일 수 있다.
본 분야의 일반 조작에 기반하여, 당업자는 본 발명의 IL-2 돌연변이체를 함유하는 융합 단백질 또는 접합체를 얻는 방법을 알 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 IL-2 돌연변이체를 다른 비-IL-2 기능 부분에 직접 연결할 수 있고, 어댑터를 통해 연결할 수도 있다. 상기 어댑터는 (G3S)4와 같은 G3S의 반복 서열 또는 G4S의 반복 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 AAA 또는 GS의 반복 서열일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 돌연변이체 또는 융합 단백질 접합체에 대해 폴리에틸렌 글리콜 변형(PEG화), 폴리시알산 변형(PSA화), 포화지방산 변형, 히알루론산 변형(Hyaluronic acid, HA) 또는 폴리아미노산 변형(proline-alamine-serine polymer, PAS화)을 수행하여 접합체를 형성할 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물 및 이의 투여 방식
본 발명의 IL-2 돌연변이체에 기초하여, 본 발명은 약학 조성물을 더 제공한다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 IL-2 돌연변이체 또는 융합 단백질 또는 접합체 및 임의의 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함한다.
선택 가능하게, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함한다. 원하는 경우, 본 발명의 IL-2 돌연변이 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체에 약학적으로 허용 가능한 부형제를 첨가하여 조성물을 형성할 수 있다.
예시적인 부형제는 당, 무기염, 항미생물제, 항산화제, 계면활성제, 완충제, 산, 염기, 아미노산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 부형제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 당, 유도체화 당(당알코올, 알돈산, 에스테르화 당 및/또는 당중합체)과 같은 당은 부형제로 존재할 수 있다. 특정 당부형제는 예를 들어 과당, 말토오스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보오스 등과 같은 단당류; 락토오스, 수크로스, 트레할로오스, 셀로비오스 등과 같은 이당류; 라피노오스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등과 같은 다당류; 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 소르비톨(글루시톨), 이노시톨, 사이클로덱스트린 등과 같은 당알코올을 포함한다.
부형제는 구연산, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨, 인산이수소 나트륨, 인산수소이나트륨 및 이들의 조합과 같은 무기염 또는 완충제를 더 포함할 수 있다.
조성물은 미생물의 성장을 방지하거나 억제하는 항미생물제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 실시예에 적합한 항미생물제의 비제한적인 구현예로는 염화 벤잘코늄, 염화 벤제토늄, 벤질알코올, 페놀, 페네틸 알코올, 및 이들의 조합을 포함한다.
마찬가지로 항산화제도 조성물에 존재할 수 있다. 항산화제는 산화를 방지함으로써, 단백질, 접합체 또는 제제의 다른 성분의 변질을 방지한다. 본 발명의 하나 이상의 실시예에 적합한 항산화제는 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸히드록시아니솔, 부틸히드록시톨루엔, 하이포아인산, 모노티오글리세롤 및 이들의 조합을 포함한다.
계면활성제는 부형제로 존재할 수 있다. 예시적인 계면활성제는, "트윈 20" 및 "트윈 80", 및 F68 및 F88과 같은 플루로닉 등과 같은 폴리소르베이트; 소르비탄 에스테르; 인지질(예를 들어 레시틴 및 다른 포스파티딜콜린), 지방산 및 지방 에스테르와 같은 지질; 콜레스테롤과 같은 스테로이드를 포함한다.
산 또는 염기는 부형제로서 조성물에 존재할 수 있다. 사용할 수 있는 산의 비제한적인 구현예로는 염산, 아세트산, 인산, 구연산, 말산, 젖산, 포름산, 트라이클로로아세트산, 질산, 과염소산, 황산, 푸마르산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산을 포함한다. 적합한 염기의 구현예로는 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 아세트산암모늄, 아세트산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 구연산나트륨, 포름산나트륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 푸마르산칼륨 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
여기서, 조성물에서 부형제로 존재할 수 있는 하나 이상의 아미노산을 설명한다. 이 측면에서, 예시적인 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 글리신을 포함한다.
조성물 중의 접합체(즉 활성제와 중합체 시약 사이에 형성된 접합체)의 양은 다수의 요소에 따라 달라지지만, 조성물을 단위 용량 용기(예를 들어 하나의 바이알)에 저장할 때 가장 바람직한 치료 유효량일 것이다. 또한, 약물 제제를 하나의 주사기에 수납할 수 있다. 치료 유효량은 점차 증가하는 양의 약물을 반복적으로 투여하는 것을 통해 임상적으로 원하는 종점을 생성하는 양을 실험적으로 결정할 수 있다.
조성물 중 임의의 개별 부형제의 양은 부형제의 활성 및 조성물의 특정 필요에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 임의의 개별 부형제의 가장 바람직한 양은 일반 실험을 통해 결정되고, 즉 상이한 양의 부형제(범위는 낮은 것에서 높은 것까지)를 포함하는 조성물을 제조하여, 안정성 및 다른 파라미터를 검사하고, 이어서 현저한 역효과가 없는 경우에 가장 바람직한 성능을 얻는 범위를 결정한다.
그러나, 전반적으로, 부형제는 조성물에서 부형제의 약 1 중량% 내지 약 99 중량%, 바람직하게는 약 5 중량% 내지 약 98 중량%, 더 바람직하게는 약 15 중량% 내지 약 95 중량%의 양으로 존재하고, 가장 바람직하게는 농도가 30 중량%보다 작다.
이러한 조성물은 재구성이 가능한 산제 또는 동결건조제 및 액체 제제와 같이 모든 유형의 제제 및 주사에 특히 적합한 제제를 포함한다. 주사 전 고체 조성물의 재구성에 적합한 희석제의 구현예로는 주사용 정균수, 수중 5% 덱스트로스, 인산염 완충 식염수, 멸균수, 탈이온수 및 이들의 조합을 포함한다. 액체 약학 조성물의 경우, 용액제 및 현탁제가 고려된다.
본 발명의 하나 이상의 실시예의 조성물은 전형적으로(반드시 그렇지는 않음) 주사를 통해 투여되므로, 투여 직전에는 전반적으로 액상 용액제 또는 현탁제이다. 약물 제제는 시럽제, 유제, 연고제, 정제, 산제 등과 같은 다른 형태를 사용할 수도 있다. 경폐, 경직장, 경피, 경점막, 경구, 척수강내, 종양내, 종양주위, 복강내, 피하, 동맥내 등과 같은 다른 투여 모드를 더 포함한다.
본 발명은 반응성 증상을 갖는 환자의 치료에 치료 유효량의 용량으로 투여하는 방법을 더 제공한다. 주사할 수 있다(예를 들어 근육내, 피하 및 비경구). 비경구 투여에 적합한 제제의 유형으로는 주사에 즉시 사용 가능한 용액제, 사용 전 용매와 조합되는 건조 산제, 주사에 즉시 사용 가능한 현탁제, 사용 전 용매와 조합되는 건조 불용성 조성물 및 투여 전 희석되는 유제 및 액체 농축제를 특히 포함한다.
투여 방법은 상기 돌연변이 단백질, 융합 단백질 또는 접합체를 투여하는 것을 통해 치료 또는 예방할 수 있는 임의의 증상을 치료하는데 사용될 수 있다. 당업자는 특정 조성물이 어떤 증상을 효과적으로 치료할 수 있는지를 알고 있다. 예를 들어, 신장 세포 암종, 전이성 흑색종, C형 간염 바이러스(HCV), 인간면역결핍 바이러스(HIV), 급성 골수성 백혈병, 비호지킨림프종, 피부T세포림프종, 소아 류마티스관절염, 아토피 피부염, 유방암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환이 있는 환자를 치료한다.
투여할 실제 용량은 피험자의 연령, 체중 및 전반적인 상태 및 치료하는 증상의 중증도, 위생 보건 전문가의 판단에 따라 달라질 것이다. 치료 유효량은 당업자에게 공지되거나 및/또는 관련 참조 문서 및 문헌에 기재되어 있다. 전반적으로, 치료 유효량의 범위는 약 0.001 mg 내지 1000 mg이고, 바람직하게는 0.01 mg/일 내지 100 mg/일의 용량 내에 있고, 더 바람직하게는 0.10 mg/일 내지 50 mg/일의 용량 내에 있다. 예를 들어 유기인산염에스테르 중독 증상이 완화 및/또는 완전히 없어질 때까지 주어진 용량으로 주기적으로 투여할 수 있다.
임상 의사의 판단, 환자의 필요에 따라 결정될 수 있고, 다양한 투여 일정으로 단위 용량을 투여할 수 있다. 특정 투여 일정은 당업자에게 공지되어 있거나 일반 방법을 사용하여 실험적으로 측정할 수 있다. 예시적인 투여 일정은 1일 2회, 1일 1회, 주 3회, 주 2회, 주 1회, 월 2회, 월 1회 투여 및 다른 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일단 임상 종점이 구현되면, 조성물의 투여를 중단한다.
본 발명의 바람직한 특정 실시예를 결부하여 본 발명을 설명하였지만, 전술한 설명 및 하기 실시예는 설명을 위한 것이고 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 본 발명의 범위 내의 다른 측면, 장점 및 변형은 당업자에게 있어서 자명한 것이다.
본 발명의 IL-2 돌연변이체의 용도 및 사용 방법
상술한 바와 같이, 본 발명의 IL-2 돌연변이체는 고-친화도 IL-2 수용체에 대한 IL-2 단백질의 친화도를 제거하거나 감소하고 중간-친화도 IL-2 수용체에 대한 상기 돌연변이 IL-2 단백질의 친화도는 유지시키는 동시에 IL-2의 생물학적 활성을 유지함으로써, T 이펙터 세포 및 NK 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 종양 면역 세포의 증식을 더 잘 자극할 수 있다. 따라서, 본 발명의 IL-2 돌연변이체, 융합 단백질, 접합체 또는 약학 조성물은 상응하는 약물로 제조될 수 있다. 상기 약물은 T림프구 및 자연살해(NK) 세포의 시험관 내 증폭 또는 IL-2를 적용하여 면역 치료하는 질환를 치료하는데 사용될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 상기 질환은 면역시스템을 자극하거나 면역 세포를 증식하는 것을 통해 치료해야 하는 암과 같은 암이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 질환은 면역 질환, 인간면역결핍 바이러스(HIV) 감염, C형 간염 바이러스(HCV) 감염, 류마티스 관절염, 아토피 피부염 등일 수도 있다.
본 발명은 CAT-T, CAR-NK 등 세포 치료 과정 중 세포의 시험관 내 증폭에서 야생형 IL-2를 대체하여 사용될 수 있다.
본 발명의 장점:
1. 본 발명의 IL-2 돌연변이 단백질은 고-친화도 IL-2 수용체와의 친화도를 감소하거나 제거하고 중간-친화도 IL-2 수용체와의 친화도를 기본적으로 유지한다.
2. 본 발명의 IL-2 돌연변이체의 구조는 천연 IL-2에 더 가까우므로, 단백질의 다른 구조 위치에 대한 돌연변이의 영향을 피하고, 생물학적 활성을 유지한다.
3. 선행기술의 다른 IL-2 돌연변이체와 비교하여, 본 발명의 IL-2 돌연변이체는 면역원성이 더 낮다.
4. 본 발명의 IL-2 돌연변이체는 분자 설계가 간단하여, 상이한 분자에 적용하기에 편리하다.
5. 본 발명의 IL-2 돌연변이체는 생산 및 품질 조절이 편리하고, 일반적으로 시험관 내 재변형 과정이 필요하지 않아, 단계가 줄어들며 생산 효율을 향상시킨다.
6. 본 발명의 IL-2 돌연변이체는 다른 분자와 이중 기능 또는 다중 기능의 단백질 또는 면역 조성물을 형성하기에 편리하다.
7. 본 발명의 IL-2 돌연변이체는 면역 치료에 사용될 수 있지만, 천연 IL-2로 인한 혈관(또는 모세관) 누출 증후군(VLS)을 일으키지 않는다.
이하, 구체적인 실시예를 결부하여 본 발명을 더 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위해 사용된 것이며 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 다음 실시예에서 구체적인 조건이 없는 실험 방법은 일반적으로 Sambrook et al., 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)과 같은 일반 조건에 따르거나 제조업체에서 건의하는 조건에 따른다.
실시예
실시예 1. 돌연변이 인터루킨-2(IL-2) 단백질의 합성
1. 유전자 합성
인터루킨-2(IL-2) 단백질의 돌연변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 자동화된 유전자 합성 방법으로 얻었다. 일부 실시예에서, 유전자 단편 말단에 HIS 태그를 추가하는 것은 정제에 도움을 주고; 일부 실시예에서, 유전자 단편 말단에 IgG1-Fc를 추가하는 것은 정제에 도움을 주며, 아울러 Fc 태그도 단백질 약물 반감기을 연장하는 일반적인 수단이다. 유전자 단편 측면에는 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 위치가 있다. 모든 유전자 합성 서열은, 진핵 세포에서 단백질을 표적 분비시키는 선도펩티드를 코딩하는 5'말단 DNA 서열을 갖도록 설계된다.
Figure pct00001
2. 플라스미드 구축
합성 후의 유전자를 pcDNA3.4 플라스미드에 아클로닝하고, 방법은 제조사의 사용 설명서에 따라 분자 생물학 시약을 사용하였다.
3. 돌연변이 인터루킨-2(IL-2) 단백질의 발현
Expi293F 세포(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 플라스미드를 형질감염하였고, 세포는 37 ℃의 온도 및 8%의 CO2의 조건에서 진탕(VWR Scientific) 배양하였으며, 형질감염 전날 진탕플라스크(Corning Erlenmeyer Flasks)에 접종하였고, 형질감염 방법은 제조사의 사용 설명서에 따라 진행하였다.
2일차, 4일차 및 5일차의 세포 상층 현탁액을 각각 수집하여 웨스턴 블로팅을 진행하여 단백질의 발현을 확인하였다.
실시예 2. CD25단백질의 발현
유전자 합성
CD25단백질의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 23)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 자동화된 유전자 합성 방법으로 얻었다. SEQ ID NO: 24(GGGSGGGSGGGSGGGS)는 어댑터의 아미노산 서열이다. 일부 실시예에서, 유전자 단편은 어댑터를 통해 IgG1-Fc와 공동 발현되어, 정제에 도움을 준다. 유전자 단편 측면에는 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 위치가 있다. 모든 유전자 합성 서열은, 진핵 세포에서 단백질을 표적 분비시키는 선도펩티드를 코딩하는 5'말단 DNA 서열을 갖도록 설계된다. SEQ ID NO: 25는 예시적인 선도펩티드 서열을 나타낸다. 합성 후의 유전자를 pcDNA3.4 플라스미드에 아클로닝하고, 방법은 제조사의 사용 설명서에 따라 분자 생물학 시약을 사용하였다.
Expi293F 세포(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 플라스미드를 형질감염하였고, 세포는 37 ℃의 온도 및 8%의 CO2의 조건에서 진탕(VWR Scientific) 배양하였으며, 형질감염 전날 진탕플라스크(Corning Erlenmeyer Flasks)에 접종하였고, 형질감염 방법은 제조사의 사용 설명서에 따라 진행하였다.
2일차, 4일차 및 5일차의 세포 상층 현탁액을 각각 수집하여 웨스턴 블로팅을 진행하여 단백질의 발현을 확인하였다.
실시예 3. ELISA, Fortebio 또는 biacore를 이용한 CD25와의 결합 친화도의 검출 실험
본 발명자들은 효소결합면역흡착제 검정법을 이용하여 IL-2 돌연변이체와 CD25의 결합 능력을 검출하였다.
CD25(실시예 2에서 유래됨)을 96웰 고흡착 마이크로웰 플레이트(3590, Costar)에 코팅하고, 세척하고 차단하였다. 검출할 샘플을 적당한 농도로 희석하고, 웰에 넣었다. TMB로 발색하고, ELISA 판독기(M5, Molerlder Devies)로 450/650 nm의 파장에서 각 웰의 신호값을 판독하였다. rhIL-2는 주사용 재조합 인간 인터루킨-2(quanqi(泉奇))이다.
IL-2 돌연변이체 및 CD25에 대한 rhIL-2의 결합 활성 개요
농도(ug/ml) 결합 활성(%)
1 0.2 0.04
IL-2gm1 0.88% 1.08% 1.66%
IL-2gm2 30.99% 31.26% 16.64%
IL-2gm3 10.33% 5.62% 2.27%
IL-2gm4 14.79% 7.50% 3.18%
IL-2gm5 0.88% 1.08% 1.51%
IL-2gm6 0.88% 1.08% 1.36%
IL-2gm7 8.10% 2.96% 1.82%
IL-2gm8 0.74% 0.99% 1.51%
IL-2gm9 0.88% 1.18% 1.51%
IL-2gm10 0.88% 1.08% 1.51%
IL-2gm11 12.49% 5.03% 2.42%
IL-2gm12 2.77% 1.48% 1.97%
IL-2gm13 2.23% 1.18% 1.51%
IL-2gm14 0.74% 0.99% 1.51%
IL-2gm15 0.68% 0.99% 1.36%
IL-2qm 0.74% 0.99% 1.51%
rhIL-2 100.00% 100.00% 100.00%
참고: 각 농도에서 IL-2gm의 결합 활성은 rhIL-2(결합 활성 100%)를 대조군으로 사용한다.
결과는 도 1을 참조한다. 도면으로부터 알 수 있는 바, 실험 농도에서, rhIL-2가 결합되어 있음을 명확하게 알 수 있으며, 결합 활성 용량 관련성이 있는 결합 크기를 비교해보면: rhIL-2 > IL-2gm2 > IL-2gm4 > IL-2gm11 > IL-2gm3 > IL-2gm7 > IL-2gm12 > IL-2gm13이다. 이러한 농도에서, 용량 관련성이 없는 것은 결합되지 않는 것으로 판단할 수 있고, 이는 IL-2gm1, IL-2gm5, IL-2gm6, IL-2gm8, IL-2gm9, IL-2gm10, IL-2gm14, IL-2gm15, IL-2qm(CN103492411A)을 포함한다. IL-2gm1, IL-2gm5, IL-2gm6, IL-2gm8, IL-2gm9, IL-2gm10, IL-2gm14, IL-2gm15는 CD25와의 결합 능력을 완전히 상실하고; IL-2gm2, IL-2gm4, IL-2gm11, IL-2gm3, IL-2gm7, IL-2gm12, IL-2gm13은 CD25와의 결합 능력을 일부 상실하였음을 증명하였다.
실시예 4. CTLL2 세포를 이용한 세포 증식 분석
본 실시예에서, 발명자들은 CTLL2 세포를 이용하여 세포 증식 분석에서 rhIL-2 및 실시예 1의 돌연변이 인터루킨-2의 활성을 평가하였다.
실험 플레이트에 동일한 개수의 CTLL-2 세포(IL-2 의존성에 속하고 세포 표면에서 CD25를 고도로 발현하는 마우스 세포독성 T 림프구 세포주)를 접종한 다음, 농도 구배에 따라 rhIL-2 및 IL-2 돌연변이체를 각각 넣고, 48시간 동안 인큐베이팅한 후 cell Titer Glo 발광 완충액을 넣었다. 화학 발광을 통해 세포 내 ATP의 함량(SpectraMaxM5)을 검출하고, 각각의 웰의 세포 개수를 검출함으로써, 세포 증식에 대한 상이한 농도의 rhIL-2 및 IL-2 돌연변이체의 영향을 검출하였다. 데이터는 GraphPad Prism7 소프트웨어로 분석하고, 곡선은 비선형 회귀분석(Nonlinear regression)으로 피팅하였다. 용량-반응 곡선의 비선형 회귀분석으로부터 세포 증식의 EC50 값(최대 반응의 50%를 나타내기 위해 필요한 시험 화합물 농도)을 얻었다.
세포 증식 분석을 사용하여 rhIL-2 및 돌연변이 인터루킨-2(His 태그)의 활성을 측정하였고, 표 2 및 도 2에 결과의 개요를 나타내었다. 모든 시험 물품은 용량 의존적 방식으로 CTLL-2 세포의 성장을 유도하였다. 세포 증식 배수가 상응할 경우, EC50이 클수록 CTLL2의 성장을 자극하는 이의 활성이 더 약하다는 것을 증명하는 것으로 생각한다. 이러한 변화는 CD25와의 결합에 대한 이의 돌연변이 단백질의 영향에 기인한 것이고, 돌연변이 단백질은 IL-2Rβγ 이종이량체 활성화에 의한 IL-2R 신호 전달을 유지하므로, 농도가 증가된 후, 세포는 여전히 효과적으로 증폭하였다. rhIL-2에 대한 모든 IL-2 돌연변이체(His 태그)의 효능은 8.314%를 초과하지 않았다. IL-2gm(1 ~ 15)는 CD25와의 결합을 제거할 수 있고, IL-2Rαβγ 이종삼량체를 형성하지 않았기에 자극 작용이 감소된다는 것을 증명하였다. 바람직하게, IL-2gm1, IL-2gm3, IL-2gm5, IL-2gm6, IL-2gm7, IL-2gm8, IL-2gm9, IL-2gm10, IL-2gm12, IL-2gm14 및 IL-2gm15는 대조군 샘플 rhIL-2에 비해 증식 효과가 50배를 초과하였다. 여기서, IL-2gm1, IL-2gm6, IL-2gm14는 100배를 초과하였다.
rhIL-2 및 돌연변이 인터루킨-2(His 태그)에 반응하는 CTLL-2 세포 증식의 개요
시험 샘플 EC50(nM) rhIL-2 대비 효능(%)
rhIL-2 2.90E-03 100%
IL-2gm1-His 8.34E+01 0.003%
IL-2gm2-His 6.38E-02 4.547%
IL-2gm3-His 1.65E-01 1.763%
IL-2gm4-His 9.06E-02 3.199%
IL-2gm5-His 8.221 0.035%
IL-2gm6-His 5.15E+01 0.006%
IL-2gm7-His 3.65E-01 0.794%
IL-2gm8-His 8.838 0.033%
IL-2gm9-His 2.385 0.122%
IL-2gm10-His 1.56E+01 0.019%
IL-2gm11-His 3.49E-02 8.314%
IL-2gm12-His 1.56E-01 1.865%
IL-2gm13-His 1.44E-01 2.012%
IL-2gm14-His 4.79E+01 0.006%
IL-2gm15-His 1.65E+01 0.018%
세포 증식 분석을 사용하여 rhIL-2 및 돌연변이 인터루킨-2(Fc 태그)의 활성을 측정하였고, 표 3 및 도 3에 결과의 개요를 나타내었다. 모든 시험 물품은 용량 의존적 방식으로 CTLL-2 세포의 성장을 유도하였다. 세포 증식 배수가 상응할 경우, EC50이 클수록 CTLL2의 성장을 자극하는 이의 활성이 더 약하다는 것을 증명하였다. 이러한 변화는 CD25와의 결합에 대한 이의 돌연변이 단백질의 영향에 기인한 것이고, 돌연변이 단백질은 IL-2Rβγ 이종이량체 활성화에 의한 IL-2R 신호 전달을 유지하므로, 농도가 증가된 후, 세포는 여전히 효과적으로 증폭하였다. rhIL-2에 대한 모든 IL-2 돌연변이체(Fc 태그)의 효능은 31.546%를 초과하지 않았다. 마찬가지로 IL-2gm(4 ~ 6)의 이중체 형식은 CD25와의 결합을 제거할 수 있고, IL-2Rαβγ 이종삼량체를 형성하지 않았기에 자극 작용이 감소된다는 것을 증명하였다. 바람직하게, IL-2qm-Fc, IL-2gm5 및 IL-2gm6은 대조군 샘플 rhIL-2에 비해 CTLL2에 대한 증식 효과가 50배를 초과하였다. 여기서, IL-2qm-Fc, IL-2gm6-Fc는 시험 농도 범위에서 현저한 세포 증식을 관찰하지 못하였다.
rhIL-2 및 돌연변이 인터루킨-2(Fc 태그)에 반응하는 CTLL-2 세포 증식의 개요
시험 샘플 EC50(nM) rhIL-2 대비 효능(%)
rhIL-2 2.90E-03 100%
IL-2gm4-Fc 9.19E-03 31.546%
IL-2gm5-Fc 1.73E-01 1.681%
IL-2gm6-Fc 5.95E+00 0.049%
IL-2qm-Fc 2.07E+13 0.000%
실시예 5. NK92 세포를 이용한 세포 증식 분석
본 발명자들은 NK92 세포를 이용하여 세포 증식 분석에서 rhIL-2, 실시예 1의 돌연변이 인터루킨-2의 활성을 평가하였다.
실험 플레이트에 동일한 개수의 NK92 세포(NK-92 세포는 급진성 비호지킨림프종을 앓고 있는 50세 백인 남성의 말초혈액 단핵세포에서 유래된 IL-2 의존성 NK 세포주이다. 이의 일부 세포 표면에서 CD25를 발현함)를 접종한 다음, 농도 구배에 따라 rhIL-2 및 IL-2 돌연변이체를 각각 넣고, 72시간 동안 인큐베이팅한 후 cell Titer Glo 발광 완충액을 넣었다. 화학 발광을 통해 세포 내 ATP의 함량(SpectraMaxM5)을 검출하고, 각각의 웰의 세포 개수를 검출함으로써, 세포 증식에 대한 상이한 농도의 rhIL-2 및 IL-2 돌연변이체의 영향을 검출하였다. 데이터는 GraphPad Prism7 소프트웨어로 분석하고, 곡선은 비선형 회귀분석(Nonlinear regression)으로 피팅하였다. 용량-반응 곡선의 비선형 회귀분석으로부터 세포 증식의 EC50 값(최대 반응의 50%를 나타내기 위해 필요한 시험 화합물 농도)을 얻었다.
세포 증식 분석을 사용하여 rhIL-2 및 돌연변이 인터루킨-2(His 태그)의 활성을 측정하였고, 표 4 및 도 4에 결과의 개요를 나타내었다. 모든 시험 물품은 용량 의존적 방식으로 NK92 세포의 성장을 유도하였다. 세포 증식 배수가 상응할 경우, EC50이 클수록 NK92의 성장을 자극하는 이의 활성이 더 약하다는 것을 증명하였다. 이러한 변화는 CD25와의 결합에 대한 이의 돌연변이 단백질의 영향에 기인한 것이고, 돌연변이 단백질은 IL-2Rβγ 이종이량체 활성화에 의한 IL-2R 신호 전달을 유지하므로, 농도가 증가된 후, 세포는 여전히 효과적으로 증폭하였다. rhIL-2에 대한 모든 IL-2 돌연변이체(His 태그)의 효능은 1.721%를 초과하지 않았다. IL-2gm(1 ~ 15)표면에서 CD25를 발현하는 일부 NK92 세포에서 CD25와의 결합을 제거하고, IL-2Rαβγ 이종삼량체를 형성하지 않았기에 자극 작용이 감소된다는 것을 증명하였다. 여기서, IL-2gm1, IL-2gm5 및 IL-2gm14가 가장 명확하고, 증식 효과는 100배보다 크게 감소했다.
rhIL-2 및 돌연변이 인터루킨-2(His 태그)에 반응하는 NK92 세포 증식의 개요
시험 샘플 EC50(nM) rhIL-2 대비 효능(%)
rhIL-2 1.93E-03 100
IL-2gm1-His 3.85E+01 0.005%
IL-2gm2-His 1.12E-01 1.721%
IL-2gm3-His 2.21E+00 0.088%
IL-2gm4-His 2.34E-01 0.828%
IL-2gm5-His 20.68 0.009%
IL-2gm6-His 7.08E+00 0.027%
IL-2gm7-His 5.57E-01 0.347%
IL-2gm8-His 8.91 0.022%
IL-2gm9-His 1.067 0.181%
IL-2gm10-His 1.27E+01 0.015%
IL-2gm11-His 2.80E-01 0.690%
IL-2gm12-His 2.96E-01 0.653%
IL-2gm13-His 2.93E-01 0.661%
IL-2gm14-His 2.32E+01 0.008%
IL-2gm15-His 7.76E+00 0.025%
세포 증식 분석을 사용하여 rhIL-2 및 돌연변이 인터루킨-2(Fc 태그)의 활성을 측정하였고, 표 5 및 도 5에 결과의 개요를 나타내었다. 모든 시험 물품은 용량 의존적 방식으로 NK92 세포의 성장을 유도하였다. 세포 증식 배수가 상응할 경우, EC50이 클수록 NK92의 성장을 자극하는 이의 활성이 더 약하다는 것을 증명하였다. 이러한 변화는 CD25와의 결합에 대한 이의 돌연변이 단백질의 영향에 기인한 것이고, 돌연변이 단백질은 IL-2Rβγ 이종이량체 활성화에 의한 IL-2R 신호 전달을 유지하므로, 농도가 증가된 후, 세포는 여전히 효과적으로 증폭하였다. rhIL-2에 대한 모든 IL-2 돌연변이체(Fc 태그)의 효능은 34.783%를 초과하지 않았다. 마찬가지로 IL-2qm-Fc, IL-2gm(4 ~ 6)의 이중체 형식은 CD25를 발현하는 일부 NK92 세포와 CD25의 결합을 감소할 수 있고, IL-2Rαβγ 이종삼량체를 형성하지 않았기에 자극 작용이 감소된다는 것을 증명하였다. 바람직하게, IL-2qm-Fc, IL-2gm6-Fc는 rhIL-2에 비해 100배보다 크게 감소되었다. 그러나 NK92 세포에 대한 IL-2qm의 증폭 배수는 다른 돌연변이 단백질보다 현저하게 작다.
rhIL-2 및 돌연변이 인터루킨-2(Fc 태그)에 반응하는 NK92 세포 증식의 개요
시험 샘플 EC50(nM) rhIL-2 대비 효능(%)
rhIL-2 5.28E-03 100
IL-2gm4-Fc 1.52E-02 34.783%
IL-2gm5-Fc 7.11E-02 7.425%
IL-2gm6-Fc 8.24E-01 0.641%
IL-2qm-Fc 3.06E-01 1.727%
실시예 6. 본 발명의 돌연변이 단백질의 반감기 연구
본 발명자들은 본 발명의 방법으로 얻은 돌연변이 단백질의 체내 반감기를 더 연구하였고, 본 발명의 방법으로 얻은 돌연변이 단백질의 체내 반감기가 모두 상이한 정도로 증가하였음을 발견하였다.
실시예 7. IL-2 돌연변이 단백질의 합성(HSA 태그)
본 발명자들은 다음과 같은 IL-2 돌연변이체를 더 합성하였다.
Figure pct00002
IL-2 돌연변이체 분자 IL-2gm1, IL-2gm4, IL-2gm6, IL-2gm7 코딩 서열과 HSA 코딩 서열을 연결하고, 분자 클로닝 수단을 통해 진핵 발현 벡터에 구축하여 IL-2 돌연변이체 분자의 발현 벡터를 제조하였다. Freestyle 배지에서 배양된 293E 세포를 사용하여 IL-2 돌연변이체 분자의 일시적 형질감염 발현을 진행하였다. 형질감염 24시간 전에, 1 L의 세포 배양 플라스크에 0.5Х106 개 세포/ml의 293E 세포 150 ml를 접종하고, 37℃의 온도 및 5%의 CO2의 인큐베이터에서 120 rpm으로 진탕 배양하였다. 형질감염 시 먼저 150 μl의 293 fectin을 취하여 2.85 ml의 OptiMEM에 넣고, 충분히 균일하게 혼합한 후, 실온에서 2분 동안 인큐베이팅하였으며; 동시에 IL-2 분자를 발현하기 위한 플라스미드 150 μg을 각각 OptiMEM으로 3 ml까지 희석하였다. 상기 희석된 형질감염 시약 및 플라스미드를 충분히 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이팅한 후, 모든 혼합물을 세포에 넣고 균일하게 혼합하였으며, 37℃의 온도 및 5%의 CO2의 인큐베이터에서 120 rpm으로 7일 동안 진탕 배양하였다. 세포 배양 상층액을 수집하고, 0.22 마이크로미터의 필터막으로 상층액을 여과한 후, Q-HP 이온교환 크로마토그래피 컬럼(GE)을 이용하여 정제하였으며, 20 mM의 Tris 0-500 mM NaCl를 이용하여, pH 8.0 조건에서 선형 용출하고, 부피에 따라 샘플을 연속 수집하였다. 4 ~ 20%의 구배 젤(진스크립트사)을 이용하여 각 수집 성분에 대해 SDS-PAGE 검출을 수행하고, 전기 영동 순도에 따라 샘플을 합했다.
실시예 9. Biacore 검출을 이용한 수용체와의 결합 친화도의 검출 실험
야생형과 비교하여 IL-2 돌연변이체와 수용체의 친화도를 연구하기 위하여, 다음과 같은 조건에서 재조합 단량체 IL-2Rα 서브유닛을 사용하여 Biacore 8K(GE)를 통해 인간 IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2 돌연변이체및야생형 IL-2-HSA의 친화도를측정하는바, 인간 IL-2Rα 서브유닛을 CM5 칩에 고정하였다(190RU). 25 ℃의 온도 조건하에 HBS-EP 완충액에서 IL-2 돌연변이체 및 IL-2-HSA를 분석물로 사용하였다. IL-2Rα에 대해, 분석물 농도는 200 nM에서 1.526 nM(1:2 희석)로 낮아지고, 30 μl/분으로 유동하였다(결합시간은 80초이고, 해리 시간은 300초임). IL-2Rα에 대해, 20 mM의 NaOH를 사용하여 30 ul/min으로 10초 동안 재생하였다. IL-2Rα에 대해, 1:1 결합, RI≠0, R 최대치=전체 피팅 데이터를 사용하였다.
아래 조건에서 재조합 IL-2Rβγ 이종이량체를 사용하여 Biacore 8K(GE)를 통해 인간 IL-2Rβγ 이종이량체에 대한 IL-2 돌연변이체 및 야생형 IL-2-HSA의 친화도를 측정하였는 바, 인간 hIL-2Rβ, γ ECD-N-hIgG1Fc를 Protein A 칩에 고정하였다(400RU). 25 ℃의 온도 조건하에 HBS-EP 완충액에서 IL-2 돌연변이체 및 IL-2-HSA를 분석물로 사용하였다. IL-2Rβγ에 대해, 분석물 농도는 200 nM에서 1.5625 nM로 낮아지고(1:2 희석), 30 μl/분으로 유동하였다(결합시간은 80초이고, 해리 시간은 300초임). IL-2Rβγ에 대해, 10 mM의 글리신(Glycine)(pH1.5)을 사용하여 30 ul/min으로 30초 동안 재생하였다. IL-2Rβγ에 대해, 1:1 결합, RI≠0, R 최대치=일부 피팅 데이터를 사용하였다.
결과는 다음과 같다.
야생형과 비교하여 IL-2 돌연변이체와 수용체의 친화도(KD)
시험 샘플 인간 유래 IL-2Rα
(항상적)		 인간 유래 IL-2Rα
(동적)		 인간 유래 IL-2Rβγ 이종이량체
(동적)
IL-2-HSA 야생형 5.56E-08M 1.06E-07M 1.53E-08M
IL-2gm1-HSA 결합 없음 결합 없음 1.38E-08M
IL-2gm4-HSA 7.26E-08M 3.54E-08M 3.30E-08M
IL-2gm6-HSA 결합 없음 결합 없음 2.89E-08M
IL-2gm1a-HSA 결합 없음 결합 없음 3.65E-08M
IL-2gm1b-HSA 결합 없음 결합 없음 2.83E-08M
IL-2gm1c-HSA 결합 없음 결합 없음 3.84E-08M
IL-2gm1d-HSA 6.62E-08M 1.13E-08M 2.30E-08M
야생형 IL-2-HSA와 비교하여 인간 IL-2Rα 서브유닛과의 친화도: IL-2gm1-HSA, IL-2gm6-HSA, IL-2gm1a-HSA, IL-2gm1b-HSA 및 IL-2gm1c-HSA는 결합이 없고, IL-2gm4-HSA 및 IL-2gm1d-HSA는 결합이 있다.
야생형 IL-2-HSA와 비교하여 재조합 인간 IL-2Rβγ 이종이량체와의 친화도: IL-2gm1-HSA, IL-2gm4-HSA, IL-2gm6-HSA, IL-2gm1a-HSA, IL-2gm1b-HSA, IL-2gm1c-HSA 및 IL-2gm1d-HSA는 야생형과 상응하다.
따라서, IL-2gm1-HSA, IL-2gm1a-HSA, IL-2gm1b-HSA 및 IL-2gm1c-HSA는 바람직한 목적 분자이다.
도 8a는 IL-2gm1-HSA, IL-2gm4-HSA, IL-2gm6-HSA, IL-2gm1a-HSA, IL-2gm1b-HSA, IL-2gm1c-HSA, IL-2gm1d-HSA, 야생형 IL-2-HSA와 인간 IL-2Rα 서브유닛의 친화도를 나타낸다.
도 8b는 IL-2gm1-HSA, IL-2gm4-HSA, IL-2gm6-HSA, IL-2gm1a-HSA, IL-2gm1b-HSA, IL-2gm1c-HSA, IL-2gm1d-HSA, 야생형 IL-2-HSA와 재조합 인간 IL-2Rβγ 이종이량체의 친화도를 나타낸다.
실시예 10. NK92 세포를 이용한 세포 증식 분석
NK92 세포는 급진성 비호지킨림프종을 앓고 있는 50세 백인 남성의 말초혈액 단핵세포에서 유래된 IL-2 의존성 NK 세포주이다. 이의 일부 세포 표면에서 CD25를 발현한다. 본 발명자들은 NK92 세포를 이용하여 세포 증식 분석에서 IL-2gm1-HSA, IL-2gm4-HSA, IL-2gm6-HSA 및 야생형 IL-2-HSA의 활성을 평가하였다.
대수 성장기에 있는 NK92 세포를 수확하고, 기초 배지 MEM-α로 1회 세척한 후, 이(5000 개/웰)와 상이한 농도의 IL-2gm1-HSA, IL-2gm4-HSA, IL-2gm6-HSA 및 야생형 IL-2-HSA를 실험 배지(Gibco(제품 번호 32561-037)에서 구입한 MEM-α배지에 12.5%의 소태아 혈청 및 12.5%의 말 혈청을 첨가함)에서, 37 ℃의 온도, 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 48h 동안 공동 배양하였다. 각각의 웰에 100 μl의 ATP 검출 기질 CellTiter-Glo(promega(제품 번호 G7571)에서 구입함)을 넣고, ELISA 판독기(Molecular Devices(모델 I3x)에서 구입함)에서 단점법으로 전체 파장 형광 값을 검출하였다.
세포 증식 분석을 사용하여 IL-2gm1-HSA, IL-2gm4-HSA, IL-2gm6-HSA 및 야생형 IL-2 분자 IL-2-HSA의 활성을 측정하고, 결과는 도 9에 도시된 바와 같다. 모든 시험 물품은 용량 의존적 방식으로 NK92 세포의 성장을 유도하였다. 세포 증식 배수가 상응할 경우, EC50이 클수록 NK92의 성장을 자극하는 이의 활성이 더 약하다는 것을 증명하였다. 이러한 변화는 CD25와의 결합에 대한 이의 돌연변이 단백질의 영향에 기인한 것고, IL-2gm1-HSA 돌연변이 단백질은 IL-2Rβγ 이종이량체 활성화에 의한 IL-2R 신호 전달의 활성화를 유지하므로, 농도가 증가된 후, 세포는 여전히 효과적으로 증식하였다. IL-2-HSA와 비교하여 IL-2gm1-HSA가 NK92 세포 증식을 자극하는 비활성은 1.07%로, IL-2gm1-HSA가 표면에서 CD25를 발현하는 일부 NK92 세포에서 CD25와의 결합을 제거하고, IL-2Rαβγ 이종삼량체를 형성하지 않았기에 자극 작용이 감소된다는 것을 증명하였다. IL-2-HSA와 비교하여 IL-2gm1-HSA가 NK92 세포 증식을 자극하는 효과는 약 100배 감소되었다. IL-2-HSA와 비교하여 IL-2gm4-HSA가 NK92 세포 증식을 자극하는 비활성은 1.78%이고, IL-2-HSA와 비교하여 IL-2gm6-HSA가 NK92 세포 증식을 자극하는 비활성은 0.087%이다. 농도가 증가된 후, 세포는 여전히 효과적으로 증식하였으며, 생물학적 활성을 유지하였다.
실시예 11. IL-2 돌연변이체에 의해 유도된 IFN-γ 방출의 측정
대수 성장기에 있는 NK92 세포를 수확하고, 기초 배지 MEM-α로 1회 세척한 후, 이(5000 개/웰)와 상이한 농도의 IL-2gm1-HSA, IL-2gm4-HSA, IL-2gm6-HSA 및 야생형 IL-2-HSA를 실험 배지(Gibco(제품 번호 32561-037)에서 구입한 MEM-α배지에 12.5%의 소태아 혈청 및 12.5%의 말 혈청을 첨가함)에서, 37 ℃의 온도, 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 24h 동안 공동 배양하였다. 상층액을 수확하고 R&D에서 유래된 항-인간 IFN-γ ELISA 키트(# SIF50)를 사용하여 IFN-γ 방출을 분석하였다.
결과는 도 10a에 도시된 바와 같이, IL-2gm1-HSA, IL-2gm4-HSA 및 야생형 IL-2-HSA는 모두 인터페론 γ에 대해 자극 작용이 있다.
결과는 도 10b에 도시된 바와 같이, IL-2gm6-HSA 및 야생형 IL-2-HSA는 모두 인터페론 γ에 대해 자극 작용이 있다.
실시예 12. PBMC 증식에 대한 IL-2 돌연변이체의 자극 측정
본 발명자들은 헤파린나트륨 튜브에 건강한 중국인(n=2)의 신선한 혈액 샘플을 수집하고 PBMC를 분리한 후, RPMI-1640 배지(10%의 FBS 함유)로 PBMC를 재현탁하고 48웰 플레이트(1*106개/웰)에 접종하였으며, 상이한 농도의 IL-2gm6-HSA 및 야생형 IL-2-HSA로 PBMC를 자극하고, 37 ℃의 온도, 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 6일 동안 공동 배양하였다. 세포 표면 및 세포내 마커 항체로 FACS 염색을 수행하여 상이한 세포 집단을 검출하고, 샘플은 모두 LSRFortessaTM 세포 분석기를 통해 얻었다.
NK 세포는 CD3-/CD56+로 한정하고, Treg 세포는 CD3+CD4+CD25+Foxp3+로 한정하였다.
결과는 도 11a 내지 도 11b에 도시된 바와 같다. 여기서 도 11a는 4 nM의 농도에서, 야생형 IL-2-HSA와 비교하여 NK 세포의 증식에 대한 IL-2gm6-HSA의 자극 작용이 조금 차하고; 100 nM의 농도에서, 야생형 IL-2-HSA와 비교하여 NK 세포의 증식에 대한 IL-2gm6-HSA의 자극 작용이 유의하게 증가하였음을 나타내고; 도 11b는 4 nM 및 100 nM의 농도에서, 야생형 IL-2-HSA와 비교하여 Treg 세포의 증식에 대한 IL-2gm6-HSA의 자극 작용이 모두 유의하게 감소되었음을 나타낸다.
따라서, 상기 실험에서, IL-2gm6-HSA는 NK 세포에 대해 현저한 증식 자극 작용이 있고, Treg 세포에 대해 현저한 증식 억제 작용이 있다.
이어서, 본 발명자들은 또한 IL-2gm1-HSA 및 야생형 IL-2-HSA가 PBMC 증식을 자극하는 작용을 측정하였다.
NK 세포는 CD3-/CD56+로 한정하고, CD4+ 세포는 CD3+/CD4+로 한정하였다.
결과는 도 12a 내지 도 12b에 도시된 바와 같다. 여기서 도 12a는 0-500 nM 샘플 농도의 자극하에, IL-2gm1-HSA가 야생형 IL-2-HSA에 비해 NK 세포의 증식에 대한 자극 작용을 유의하게 증가하였음을 나타내고; 도 12b는 0-500 nM 농도의 자극 조건하에, IL-2gm1-HSA가 야생형 IL-2-HSA에 비해 CD4+T 세포의 증식에 대한 자극 작용을 모두 유의하게 감소하였음을 나타낸다.
따라서, 상기 실험에서, IL-2gm1-HSA는 NK 세포에 대해 현저한 증식 자극 작용이 있고, CD4+T 세포에 대해 현저한 증식 억제 작용이 있다.
본 발명에서 언급된 모든 문헌은 각 문헌이 개별적으로 참조로 인용된 것처럼 본 발명에서 참조로 인용된다. 또한, 본 발명의 상기 교시 내용을 읽은 후, 당업자는 본 발명에 다양한 변경 또는 수정을 가할 수 있으며, 이러한 등가 형태도 본 발명에 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 범위에 속한다는 것을 이해해야 한다.
<110> SHANGHAI GP BIOTECH CO. LTD <120> IL-2 MUTANT PROTEIN PROLIFERATING IMMUNE CELLS <130> P2020-0859 <150> CN2019103996411 <151> 2019-05-14 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2gm1 <400> 1 Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Asn Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr His His His His His His 130 135 <210> 2 <211> 718 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2gm1-HSA <400> 2 Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys 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Cys Lys His 565 570 575 Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 580 585 590 Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 595 600 605 Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 610 615 620 Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 625 630 635 640 Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 645 650 655 Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 660 665 670 Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 675 680 685 Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 690 695 700 Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 705 710 715 720 Leu <210> 36 <211> 721 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2-gm1c-HSA <400> 36 Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Gln Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Ala Ala Ala Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 130 135 140 His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 145 150 155 160 Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 165 170 175 Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 180 185 190 Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 195 200 205 Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 210 215 220 Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 225 230 235 240 His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 245 250 255 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 260 265 270 Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 275 280 285 Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 290 295 300 Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 305 310 315 320 Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys 325 330 335 Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 340 345 350 Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 355 360 365 Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile 385 390 395 400 Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 405 410 415 Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp 420 425 430 Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser 435 440 445 Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 450 455 460 Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 465 470 475 480 Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 485 490 495 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 500 505 510 Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 515 520 525 Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 530 535 540 Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 545 550 555 560 Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 565 570 575 Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 580 585 590 Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 595 600 605 Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 610 615 620 Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 625 630 635 640 Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 645 650 655 Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 660 665 670 Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 675 680 685 Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 690 695 700 Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 705 710 715 720 Leu <210> 37 <211> 721 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2-gm1d-HSA <400> 37 Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Ala Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Ala Ala Ala Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 130 135 140 His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 145 150 155 160 Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 165 170 175 Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 180 185 190 Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 195 200 205 Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 210 215 220 Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 225 230 235 240 His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 245 250 255 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 260 265 270 Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 275 280 285 Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 290 295 300 Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 305 310 315 320 Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys 325 330 335 Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 340 345 350 Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 355 360 365 Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile 385 390 395 400 Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 405 410 415 Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp 420 425 430 Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser 435 440 445 Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 450 455 460 Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 465 470 475 480 Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 485 490 495 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 500 505 510 Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 515 520 525 Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 530 535 540 Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 545 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Claims (10)

  1. IL-2 돌연변이체로서,
    상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에 대응되는 39번, 49번, 73번 및 109번 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기 돌연변이가 발생하고; 바람직하게는 39번 위치에서만 돌연변이가 발생하는 것을 특징으로 하는 IL-2 돌연변이체.
  2. IL-2 돌연변이체로서,
    상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에 대응되는 39번 위치 및, 49번, 73번 및 109번 중 어느 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기 돌연변이가 발생하는 것을 특징으로 하는 IL-2 돌연변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에서 M39D, M39E, M39Q, M39N, M39A, K49N, A73T, A73S 및 D109N 중 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이가 발생하는 것을 특징으로 하는 IL-2 돌연변이체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에서 M39D, M39E, M39Q, M39N 또는 M39A 아미노산 잔기 점 돌연변이가 발생하고; 바람직하게는 M39D, M39E, M39Q 또는 M39N; 더 바람직하게는 M39D, M39E 또는 M39Q; 보다 바람직하게는 M39D 또는 M39E; 가장 바람직하게는 M39D 아미노산 잔기 점 돌연변이가 발생하는 것을 특징으로 하는 IL-2 돌연변이체.
  5. 융합 단백질 또는 접합체로서,
    상기 융합 단백질 또는 접합체는 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 IL-2 돌연변이체 및 비-IL-2 기능 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질 또는 접합체.
  6. 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 IL-2 돌연변이체 또는 제5항에 따른 융합 단백질 또는 접합체를 코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 발현 벡터로서,
    상기 발현 벡터는 제6항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  8. 숙주 세포로서,
    상기 숙주 세포는 제7항에 따른 발현 벡터를 포함하거나, 또는 상기 숙주 세포의 게놈은 제6항에 따른 폴리뉴클레오티드와 통합되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  9. 약학 조성물로서,
    상기 약학 조성물은 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 IL-2 돌연변이체 또는 제5항에 따른 융합 단백질 또는 접합체 및 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 개체 질환의 치료를 위한 약물의 제조에서 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 IL-2 돌연변이체 또는 제5항에 따른 융합 단백질의 용도.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2022011893A (es) * 2020-03-31 2022-10-18 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Nuevos analogos de il-2 inmunoestimuladores.
CN113667003A (zh) * 2020-05-14 2021-11-19 上海盖浦生物科技有限公司 一种增殖调节性t细胞的突变体蛋白

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5229109A (en) 1992-04-14 1993-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy
US7371371B2 (en) * 2001-08-13 2008-05-13 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
EP1454138B1 (en) * 2001-12-04 2012-01-18 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
US7569215B2 (en) * 2003-07-18 2009-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides
HUE027902T2 (en) * 2004-02-09 2016-11-28 Human Genome Sciences Inc Corp Service Company Albumin fusion proteins
CN1930300A (zh) * 2004-03-05 2007-03-14 希龙公司 预测患者治疗药物耐受性的体外试验系统
AU2011218682B2 (en) * 2005-05-11 2013-11-21 Eth Zurich Recombinant N-glycosylated proteins from procaryotic cells
PT2066796E (pt) 2006-09-20 2011-10-11 Mt Biomethan Gmbh Procedimento e dispositivo para a separação do metano e do dióxido de carbono do biogás
CN104004739A (zh) * 2007-10-15 2014-08-27 北卡罗来纳-查佩尔山大学 半衰期延长的人因子ix变体
WO2009061853A2 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (il-2) polypeptides
SI2673294T1 (sl) * 2011-02-10 2016-08-31 Roche Glycart Ag Mutirani polipeptidi interlevkina-2
US9546203B2 (en) * 2013-03-14 2017-01-17 Amgen Inc. Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions
EP2968450A4 (en) * 2013-03-15 2016-10-26 Angelica Therapeutics Inc MODIFIED TOXINS
CN104231068A (zh) * 2014-01-27 2014-12-24 苏州发士达生物科技有限公司 人白细胞介素ii突变体及其应用
JP6306201B2 (ja) * 2014-02-06 2018-04-04 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ インターロイキン−２融合タンパク質及びその使用
MA40094B1 (fr) 2014-08-06 2022-05-31 Univ Miami Protéines de fusion de l'interleukine-2/récepteur alpha de l'interleukine-2 et procédés d'utilisation
CN116472281A (zh) * 2020-04-28 2023-07-21 安维塔生物科学股份有限公司 白介素-2多肽及其融合蛋白，及其药物组合物和治疗应用

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