SK17242000A3 - Agonista a antagonista selektívny k il-2 - Google Patents

Description

Predkladaný vynález sa všeobecne týka oblasti farmakológie a imunológie. Presnejšie sa vynález týka nových prostriedkov na selektívnu aktiváciu T lymfocytov (PHA-blastov), ktoré majú nízku aktivačnú schopnosť pre NK bunky („prirodzených zabijakov,,). Nové prostriedky obsahujú varianty cytokínovej rodiny, presnejšie ľudského interleukínu 2 (,,IL-2„).

Doterajší stav techniky

Interleukín 2 (IL-2) je silný imunostimulátor aktivujúci rôzne bunky imunitného systému, vrátane T lymfocytov, B lymfocytov a monocytov. IL-2 je tiež účinný a zásadný rastový faktor pre T lymfocyty. Z dôvodu týchto aktivít sa IL-2 testoval na schopnosť liečenia nádorov. Ľudský IL-2 je liek na liečenie metastatického karcinómu ľadvín a metastatického melanómu schválený FDA. Použitie IL-2 u pacientov je obmedzené závažnou toxicitou spojenou s terapiou IL-2; zistilo sa, že iba 20 % vhodných pacientov skutočne dostane terapiu. Medzi toxicitu spojenú s terapiou IL-2 patrí horúčka, nevoľnosť, zvracanie, zvýšená priepustnosť kapilár a závažná hypotenzia. I napriek týmto toxickým reakciám je IL-2 účinná terapia pre schválené indikácie (približne 17 % objektívnych odpovedí).

Hoci štrukturálno/funkčná analýza myšieho IL-2 bola rozsiahla (Zurawski,

S. M. a Zurawski, G. (1989), EMBO J., 8, 2583 - 2590; Zurawski, S. M. a kol. (1990), EMBO J., 9, 3899 - 3905; Zurawski, G. (1991), Trends Biotechnol., 9,

250 - 257; Zurawski, S. M. a Zurawski, G. (1992), EMBO J., 11, 3905 - 3910; Zurawski a kol., EMBO J., 12, 5113 - 5119 (1993)), prebehla iba obmedzená analýza ľudského IL-2. Väčšina štúdií s ľudskými IL-2 mutantmi sa vykonala na myších bunkách; avšak prebehli obmedzené štúdie s použitím ľudských PHAblastov, ktoré exprimujú vysoko afinitný IL-2 receptor IL-2R alfa beta gama. Štúdie na PHA-blastoch potvrdili význam zvyškov Asp-20 a D-skrutkovnice

590/B ·· ···· • · · • · · • · · • · • · ·· · •••e ·· • · · • · · ···· ···· ·· ·· ·· ·· ľudského IL-2. Preukázalo sa, že pozície Asp-20 a Gln-126 ľudského IL-2 sú primárne zvyšky zodpovedné za interakciu s beta- a gama- podjednotkami IL-2 receptoru, v príslušnom poradí (prehľad je uvedený v Theze a kol., Immunology Today, 17, 481 - 486 (1996)). Hoci sa preukázalo, že zvyšky v C-skrutkovnici myšieho IL-2 sa zúčastňujú interakcie s myším IL-2R beta (Zurawski a kol., EMBO J., 12, 5113 - 5119 (1993)), nepreukázalo sa, že by ekvivalentné zvyšky v ľudskom IL-2 mali rovnaké vlastnosti (týmito zvyškami v ľudskom IL-2 by mali byť Asp-84 a Asp-88). Vzhľadom k preukázanej významnej druhovej špecificite medzi myším a ľudským IL-2 (ľudský IL-2 vykazuje 1OO-krát nižšiu aktivitu v myších systémoch), je ťažké predvídať, či rovnaký typ interakcií prebieha v inom druhu. Nie sú známe žiadne štúdie využívajúce bunky exprimujúce iba ľudský receptor so strednou afinitou IL-2R beta gama.

Niektorí ľudskí IL-2 mutanti sa skúmali na svoju aktivitu na ľudských PHA blastoch (Xu a kol., Eur. Cytokine Netw., 6, 237 - 244 (1995)). Mutanti obsahujúci substitúcie Asp-20 leukínom (D20L), rovnako ako arginínom, asparagínom a lyzínom, mali ťažké defekty vo svojej schopnosti indukovať proliferáciu PHA blastov. Tak sa v odbore prijíma, že mutácia Asp20 vedie k vzniku mutantov so zníženou aktivitou. Ďalej, Xu a kol. uvádzajú, že doteraz (1995) neboli identifikovaní žiadni použiteľní IL-2 mutanti pre klinické alebo výskumné použitie.

Ľudský IL-2 Q126D mutant vytvorený Buchli a Ciardelli, Árch. Biochem. Biophys., 307, 2, 411 - 415 (1993) vykazuje významne zníženú aktivitu ako v účinnosti, tak v agonizme; v testoch na ľudských T lymfocytoch vykazuje 10OO-krát nižšiu aktivitu ako IL-2 a správa sa ako čiastočný agonista. V testoch na myších T lymfocytoch je tento mutant takmer inaktívny. Obe testované bunečné línie exprimovali vysoko afinitnú formu IL-2 receptoru. Na oboch typoch buniek vykazuje Q126D schopnosť antagonizovať aktivitu sprostredkovanú IL-2, hoci v teste na ľudských T lymfocytoch je táto schopnosť iba čiastočná.

590/B • · · · · ···· · • · · · • · · • · · · · • · · · · ·· ·· · • · • · · · · • · · · • · · · · • · · · · ·· ·· ·

Zhi-yong, W. a kol., Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 25, 5, 558 560 (sept. 1993) vykonali substitúcie na IL-2 v pozíciách 62, 69, 99 a 126 a preukázali 20-násobné a 30-násobné zníženie aktivity v porovnaní s prirodzeným IL-2 pre 62-Leu-IL-2 a 126-Asp-IL-2, v príslušnom poradí, v teste na myších T lymfocytoch (CTLL-2). Avšak autori neuvádzajú ani nenaznačujú, že substitúcia v pozícii 126 môže spôsobiť selektívnu aktivitu T lymfocytov vzhľadom k NK bunkám, ani neuvádzajú, či majú takéto zmeny podobné účinky na ľudské T-lymfocyty.

Collins, L. a kol., PNAS USA, 85, 7709 - 7713 (1988) popisujú, že substitúcia Asp v pozícii 20 Asn (D20N) alebo Lys (D20K) vedie k 100-násobnej až 1000-násobnej strate väzby vzhľadom k ľudskému IL-2 ako na vysoko (IL2R alfa beta gama, v Collins a kol. označovaný ako p55/p70), tak stredne (IL2R beta gama, v Collins a kol. označovaný ako p70) afinitívnom receptore. Väzba na IL-2R alfa sa zdá byť nezmenená pre oba mutované proteíny. Táto práca uvádza, že narušenie väzby na stredne afinitný receptor pre IL-2 (IL-2 beta gama) tiež vedie k narušeniu väzby na vysoko afinitný receptor pre IL-2 (IL-2 alfa beta gama), čo naznačuje, že rôzne väzby alebo aktivácie medzi IL-2 beta gama a IL-2 alfa beta gama nie sú možné dosiahnuť substitúciou Asp v pozícii 20.

Berndt, W. G. a kol., Biochemistry, 33, 21, 6571 - 6577 (1994) použili kombinatoriálnu kazetovú mutagenézu pre simultánne mutovanie pozícií 17 21 v prirodzenom IL-2, o ktorých sa predpokladá, že interagujú so stredne afinitným receptorom pre IL-2. Z 2610 vyšetrovaných klonov bolo iba 42 klonov aktívnych. Výskumníci zistili, že pozície 20 a 21 majú zásadný význam pre biologickú aktivitu. Nie sú uvedené ani naznačené jednotlivé substitúcie s výnimkou L21V.

U.S. patent č. 5 229 109 (Grimm a kol.) popisuje toxicitu analógov IL-2 používaných na imunoterapiu a liečenie nádorov. Vlastnosti dvoch analógov IL2 so substitúciami v pozíciách Arg38 (na alanín) a Phe42 (na lyzín) sa analyzovali a porovnali s vlastnosťami prirodzeného IL-2. Zistilo sa, že analógy si uchovávajú schopnosť väzby na stredne afinitný receptor pre IL-2, ale viažu

590/B

BBBB BB

B B

B ·

BB

B B B BBB

B B B B B

B B B B B B

BBBB B B

B· BB BB ·

BI BBBB

B

B B B B B B B

BB BB sa iba minimálne na tzv. „vysoko afinitný,, receptor pre IL-2. V súčasnosti sa predpokladá, že stredne afinitný receptor sa skladá iba z p75 (IL-2R beta) a vysoko afinitný receptor sa skladá z iba p55 + p75 receptorového komplexu (IL2R alfa beta). Analógy si tiež uchovávajú svoju schopnosť stimulovať mononukleárne bunky periférnej krvi za vzniku lymfokínmi aktivovaných zabijakov „LAK buniek,,. Je významné, že sekrécie IL-1 beta a TNFalfa sa významne znížili v reakcii na analógy v porovnaní s prirodzenou IL-2 molekulou. Aminokyselinové zvyšky popísané v tejto prihláške sú tie zvyšky, ktoré by mali špecificky interagovať s IL-2R alfa (p55); eliminácia interakciou s IL-2 R alfa vedie k zníženiu aktivity na bunkách nesúcich vysoko afinitný receptor pre IL-2 a nemala by ovplyvniť aktivitu buniek nesúcich stredne afinitný receptor pre IL2. Tak by sa mala udržať tvorba LAK buniek (o ktorých sa predpokladá, že pochádzajú zNK buniek). Tu popísaní mutanti sa týkajú aminokyselinových zvyškov 20, 88 a 126; predpokladá sa, že tieto aminokyseliny špecificky interagujú s IL-2R (p75; pozícia 20 a 88) a IL-2R gama (nebolo známe v dobe podania patentu od Grimma a kol., pozícia 126). V dôsledku toho zostávajú interakcie s IL-2 R alfa nezmenené. Mechanisticky by mutanti popísaní Grimmom a kol. mali znižovať interakcie s vysoko afinitným receptorom pre IL2, ale nemali by mať vplyv na interakcie s receptorom pre IL-2 so strednou afinitou; mutanti popísaní v predkladanom vynáleze by mali mať opačné charakteristiky - mali by mať zvýšenú schopnosť interakcie s receptorom pre IL-2 so strednou afinitou (IL-2R beta gama) a mali byť mať malý alebo žiaden defekt funkčných interakcií s receptorom pre IL-2 s vysokou afinitou (IL-2R alfa beta gama).

U.S. patent č. 5 206 344 (Goodson a kol.) popisuje mutantov IL-2, v ktorých je jeden z aminokyselinových zvyškov zrelej prirodzenej sekvencie IL2 nahradený cysteínovým zvyškom, ktoré sú potom pripravené a konjugované prostredníctvom cysteínového zvyšku s polymérom vybraným z homopolymérov polyetylénglykolu alebo polyetoxylovaných polyolov, kde homopolyméry sú nesubstituované alebo substituované na jednom konci alkylovou skupinou. Títo mutanti sú pripravení expresiou mutantných génov v hostiteľovi, kde tieto mutantné gény boli pripravené z génov pôvodných

590/B ·· ···· proteínov miestne cielenou mutagenézou. Ďalej, iné druhy IL-2 môžu byť konjugované prostredníctvom cysteínového zvyšku v pozícii 125 zrelého IL-2 proteínu, ktorá nie je nutná pre biologickú aktivitu IL-2. Nie je tu uvedený popis mutácií, ktoré spôsobujú zníženú toxicitu.

U.S. patent č. 4 959 314 (Lin a kol.) popisuje mutantov biologicky aktívnych proteínov, ako je IFN-beta a IL-2, v ktorých boli cysteínové zvyšky, ktoré nie sú zásadné pre biologickú aktivitu, deletované alebo nahradené inými aminokyselinami za účelom eliminácie miest pre intermoiekulové zosieťovanie alebo tvorbu nesprávnych intermolekulových disulfidových mostíkov. Títo mutanti boli pripravení bakteriálnou expresiou mutantných génov kódujúcich mutantné proteíny, kde tieto mutantné gény boli pripravené z génov pôvodných proteínov oligonukleotidmi riadenou mutagenézou. Nie je tu uvedený popis mutácii, ktoré spôsobujú zníženú toxicitu.

U.S. patent č. 5 116 943 (Halenbeck a kol.) popisuje, že biologicky aktívny referenčný terapeutický proteín je chránený pred oxidáciou spôsobom obsahujúcim substitúciu konzervatívnych aminokyselín za každý metionylový zvyšok citlivý na oxidáciu chlóramínom T alebo peroxidom, kde ostatné, necitlivé metionylové zvyšky nie sú substituované. Takto pripraveným mutantom rezistentným na oxidáciu je výhodne ľudský mutant interleukínu 2 alebo interferónu beta a konzervatívnou aminokyselinou je najlepšie alanín. Nie je tu uvedený popis mutácií, ktoré spôsobujú zníženú toxicitu.

U.S. patent č. 4 853 332 (Mark a kol.) sa týka mutantov IL-2 a IFN-gama, v ktorých boli cysteínové zvyšky, ktoré nie sú zásadné pre biologickú aktivitu, deletované alebo nahradené inými aminokyselinami za účelom eliminácie miest pre intermoiekulové zosieťovanie alebo tvorbu nesprávnych intermolekulových disulfidových mostíkov. Patent popisuje, že substitúcia cysteínu 125 serínom v IL-2 vedie k vzniku mutantu s aktivitou porovnateľnou s prirodzeným IL-2.

U.S. patent č. 5 696 234 (Zurawski a kol.) sa týka mutantov cicavčích ;cytokínov a spôsobov na vyhľadávanie agonistov a antagonistov cicavčích cytokínov. Presnejšie, preukázalo sa, že ľudský dvojitý mutant IL-2 P82A/Q126D má antagonistickú aktivitu na myších Baf3 bunkách súčasne

590/B ·· · ···· ·· ·· ···· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· transfektovaných ľudskou alfa a beta podjednotkou IL-2R. Je uvedená slabá agonistická aktivita. Tiež je uvedené, že mutanti myšieho IL-2 vykazujú čiastočne agonistickú a antagonistickú aktivitu na HT2 bunky, hlavne Q141D, Q141K, Q141V a Q141L. Nie sú popísané žiadne aktivity mutantov, ktoré by vykazovali alebo naznačovali selektívne agonistické účinky pre mutácie v pozíciách 20, 88 a 126.

Zurawski a kol. popisujú mutantov myšieho IL-2, ktorí sú aktívni na bunkách exprimujúcich IL-2R alfa beta gama, ale inaktívni na bunkách exprimujúcich IL-2R beta gama (Zurawski, G., Trends Biotechnol., 9, 250 257 (1991); Zurawski, S. M. a Zurawski, G., EMBO J., 11, 3905 - 3910 (1992)). Mutanti myšieho IL-2, ktorí majú tieto vlastnosti, majú substitúcie Asp-34 na Ser alebo Thr a Gln-141 na Lys. Asp-34 a Gln-141 myšieho IL-2 sa zdajú byť ekvivalentmi Asp-20 a Gln-141 ľudského IL-2, v príslušnom poradí. Hoci sa tieto práce týkajú „selektívneho agonistu,, IL-2, nepopisujú, že by boli menej toxické, ale skôr ich popisujú ako potenciálnych antagonistov endogénneho IL-2.

EP 0 267 795 A2 (Zurawski a kol.) popisuje rôznych mutantov myšieho IL-2, vrátane niektorých mutantov obsahujúcich delécie a/alebo substitúcie v prvých tridsiatich N-koncových aminokyselinových zvyškoch, ktoré sú biologicky kompetentné, ale táto práca neobsahuje, neuvádza ani nenaznačuje tu popísané aminokyselinové substitúcie v ekvivalentných zvyškoch myšieho IL-2. Existuje potreba vylepšenej IL-2 molekuly, ktorá by mala nižšiu toxicitu a ktorá by bola lepšie tolerovaná.

Taniguchi a kol., U.S. 4 738 927 popisuje rekombinantnú DNA, ktorá obsahuje rekombinantnú DNA kódujúcu polypeptid majúci biologickú aktivitu IL2, kde uvedenou aktivitou je navodenie rastu bunečnej línie cytotoxických Tlymfocytov a DNA vektor schopný propagácie v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách, kde kódujúca sekvencia uvedeného génu je umiestnená v pozícii za promótorovou sekvenciou, kde uvedený polypeptid je tvorený celkom 132 až 134 aminokyselinami v aminokyselinovej sekvencií polypeptidu. Tiež sú popísané gény, rekombinantné DNA vektory, hostiteľské

590/B ·· ···· ···· ·· • · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· ·· • · · · • · · • · · · • · · ·· ·· · bunky a spôsoby rekombinantnej produkcie prirodzeného IL-2. Taniguchi a kol. nepopisujú akékoľvek varianty alebo mutantov a neuvádzajú, ktoré pozície v proteíne sú zodpovedné za prenos signálu alebo väzobnú aktivitu.

Je jasné, že sú potrební mutanti IL-2, ktorí nevykazujú toxicitu obmedzujúcu dávku súčasných mutantov IL-2, aby bolo možné využiť terapeutický potenciál tohto cytokínu.

Podstata vynálezu

Vynález sa zameriava na polypeptid obsahujúci mutant ľudského IL-2 očíslovaný podľa prirodzeného IL-2, kde uvedený ľudský IL-2 je substituovaný aspoň v pozíciách 20, 88 alebo 126, kde uvedený mutant prednostne aktivuje T lymfocyty vzhľadom k NK bunkám. Vynález poskytuje menej toxický mutovaný IL-2, ktorý umožňuje väčšie terapeutické využitie tohto interleukínu.

Ďalej sa vynález zameriava na mutantný IL-2 obsahujúci jednu mutáciu v pozíciách aspartát 20, asparagin 88 a glutamín 126. Konkrétni mutanti sú reprezentovaní skratkami D20X, N88X a Q126X, kde „X„ je špecifická aminokyselina, ktorá po substitúcii v ľudskom IL-2 spôsobuje selektívnu aktivitu pre bunky exprimujúce IL-2R alfa beta gama receptor (napríklad T lymfocyty) vzhľadom k bunkám exprimujúcim IL-2R beta gama receptor (napríklad NK bunkám). Medzi mutantov vykazujúcich viac ako 1000-násobnú selektivitu patria D20H, D20I , N88G, N88I, N88R a Q126L. Konkrétne, títo mutanti tiež pôsobia na T lymfocyty v podstate aktivitou prirodzeného IL-2. Sú identifikované tiež ďalšie mutácie, ktoré spôsobujú selektivitu nižšiu ako 1000násobnú, ale vyššiu ako 10-násobnú. Vynález tiež obsahuje polynukleotidy kódujúce mutantov podľa predkladaného vynálezu, vektory obsahujúce polynukleotidy, transformované hostiteľské bunky, farmaceutické prostriedky obsahujúce mutantov a terapeutické spôsoby liečenia s použitím mutantov.

Vynález sa tiež týka spôsobu selekcie mutantov IL-2 pomocou testu využívajúceho IL-2 alfa beta gama v porovnaní s IL-2R beta gama, kde aktivita mutantného IL-2 je zvýšená vzhľadom k aktivite prirodzeného IL-2 v jednom

590/B ···· ·· ·· ···· • · ·

9 9 • · · • 9 9 · ·· ·· ·· • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · teste viac ako v druhom. IL-2R alfa beta gama a IL-2R beta gama sú vhodné kombinácie ektodomén receptorových podjednotiek a používajú sa na priame meranie väzby mutantných IL-2 pre každý receptorový komplex. IL-2R alfa beta gama test využíva odpovede buniek nesúcich IL-2 alfa beta gama a IL-2 beta gama test využíva odpovede buniek nesúcich IL-2 beta gama. Bunkou nesúcou IL-2 alfa beta gama je PHA-blast a bunkou nesúcou IL-2 beta gama je NK bunka. Testom je proliferácia buniek nesúcich IL-2 alfa beta gama a IL-2 beta gama.

Vynález sa tiež týka vektoru obsahujúceho polynukleotid kódujúci mutant podľa predkladaného vynálezu, ktorý riadi expresiu mutantného ľudského IL-2 majúceho aktivačnú aktivitu pre PHA-blasty, ale zníženú aktivačnú aktivitu pre NK bunky, kde uvedený vektor sa môže transfektovať do cieľového organizmu a potom môže in vivo exprimovať uvedený mutantný ľudský IL-2 kódovaný uvedeným polynukleotidom.

Vynález sa tiež týka spôsobu liečenia pacienta postihnutého ochorením liečiteľným IL-2, pri ktorom sa uvedenému pacientovi podá terapeuticky účinné množstvo mutantného ľudského IL-2 číslovaného podľa prirodzeného IL-2 majúceho aktivačnú aktivitu pre PHA-blasty, ale zníženú aktivačnú aktivitu pre NK bunky. Tento spôsob je použiteľný vtedy, keď je ochorením liečiteľným IL-2 HIV, nádor, autoimunitné ochorenie, infekčné ochorenie, pri vykonávaní protinádorovej vakcinácie, kde sa používa ako adjuvans a pri bežnej vakcinácii, na imunitnú stimuláciu v starobe alebo u inak imunokompromitovaných pacientov, rovnako ako u ľudských pacientov so SCID alebo pri iných terapeutických aplikáciách vyžadujúcich stimuláciu imunitného systému.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 až 7 ukazujú krivky dávka - odpoveď pre prirodzený ľudský IL-2 (IL-2) a D20H (obr. 1), IL-2 a D20I (obr. 2), IL-2 a N88G (obr. 3), IL-2 a N88I (obr. 4), IL-2 a N88R (obr. 5), IL-2 a Q126E (obr. 6), IL-2 a Q126L (obr. 7). A: jednotlivé krivky závislosti od dávky IL-2 (plné krúžky) a mutantného proteínu (prázdne krúžky) pre test proliferácie primárnych ľudských T lymfocytov (PHA

590/8 ·· ···· • · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · ···· ·· ·· ·· ·· ·· • · • · blastov). B jednotlivé krivky závislosti od dávky IL-2 (plné trojuholnŕčky) a mutantného proteínu (prázdne trojuholníčky) pre test proliferácie primárnych ľudských NK buniek.

Obr. 8A - 8D. Toxicita Proleukínu™ u šimpanzov sa hodnotila na dvoch zvieratách (X-159, trojuholníčky a X-124, štvorčeky), v porovnaní s kontrolným vehikulom (X-126, kosoštvorce). Toxicita sa hodnotila podľa renálnych parametrov (dusíkaté metabolity v krvi (BUN). A) Kreatinín, B) a pečeňových funkcií (celkový bilirubín, C: ALT, D).

Obr. 9. Graf zmeny telesnej hmotnosti v priebehu 30 dní. Telesná hmotnosť zvierat liečených IL-2/N88R (trojuholníčky), Proleukínom (štvorčeky) alebo vehikulom (kosoštvorce) sa merala v uvedené dni.

Obr. 10A - 10D. V uvedené dni sa hodnotil počet lymfocytov (A), celkový počet leukocytov (B), neutrofilov (C) a trombocytov (D) u zvierat liečených IL2/N88R (trojuholníčky), Proleukínom (štvorčeky) alebo vehikulom (kosoštvorce).

Obr. 11A - 11 D. V uvedené dni sa hodnotila močovina (A, BUN), kreatinín (B), fosfor (C) a aniónová medzera (D) u zvierat liečených IL-2/N88R (trojuholníčky), Proleukínom (štvorčeky) alebo vehikulom (kosoštvorce).

Obr. 12A- 12D. V uvedené dni sa hodnotil celkový bilirubín (A), ALT (B), flbrinogén (C) a aktivovaný protrombinový čas (D) u zvierat liečených IL-2/N88R (trojuholníčky), Proleukínom (štvorčeky) alebo vehikulom (kosoštvorce).

Obr. 13A - 13D. V uvedené dni sa hodnotili koncentrácie sodíka (A), chloridov (B), vápnika (C) a draslíka (D) v krvi zvierat liečených IL-2/N88R (trojuholníčky), Proleukínom (štvorčeky) alebo vehikulum (kosoštvorce).

Obr. 14A - 14C. V uvedené dni sa hodnotili koncentrácie albumínu (A), hematokrit (B) a hemoglobín (C) v krvi zvierat liečených IL-2/N88R (trojuholníčky), Proleukínom (štvorčeky) alebo vehikulom (kosoštvorce).

590/B • •·· ·· ·· ···· ·· • · · · · · · • t · · · ·

Obr. 15A - 15B. Sú uvedené vplyvy IL-2/N88R (štvorčeky), Proleukínu (kosoštvorce) a vehikulá (trojuholníčky) na celkovú populáciu T lymfocytov (A, CD3+ bunky), populáciu CD4+ T lymfocytov (B) a na populáciu CD8+ T lymfocytov.

Obr. 16A - 16B. Sú uvedené vplyvy IL-2/N88R (štvorčeky), Proleukínu (kosoštvorce) a vehikulá (trojuholníčky) na celkovú populáciu T lymfocytov (A, CD3+ bunky), populáciu CD4+ T lymfocytov (B) a na populáciu CD8+ T lymfocytov.

Obr. 17. Efekt IL-2/N88R a Proleukínu na aktiváciu T lymfocytov s ohľadom na priemer fluorescencie CD25 pozitívnych buniek. Vplyv IL-2/N88R (štvorčeky), Proleukínu (kosoštvorce) a vehikulá (trojuholníčky) je uvedený pre populáciu CD3+, CD4+ T lymfocytov. Na hodnotenie priemernej fluorescencie tejto populácie sa nezískal dostatočný počet CD3+/CD8+ buniek.

Obr. 18A - 18B. Sú uvedené vplyvy IL-2/N88R (štvorčeky), Proleukínu (kosoštvorce) a vehikulá (trojuholníčky) na populáciu CD4+ T lymfocytov (A, CD3+/CD4+ bunky), populáciu CD8+ T lymfocytov (B, CD3+/CD8+ bunky) a na populáciu všetkých T lymfocytov (C, CD3+ bunky) a na populáciu NK buniek (D, CD3-/CD16+ bunky).

Obr. 19. Graf pľúcnych metastáz vzhľadom k dávke u myší liečených Proleukínom (prázdne kolieska) alebo IL-2/N88R (plné kolieska). Pľúcne metastázy sa spočítali pri skončení štúdie.

Obr. 20. Plazmidová mapa IL-2/N88R vektoru pBC1IL2SA.

Popis výhodných uskutočnení

A. Všeobecná časť

Účinok IL-2 na T lymfocyty je sprostredkovaný väzbou na IL-2 receptorové proteíny. Rôzne bunečné povrchové proteíny na T lymfocytoch viažu IL-2. Prvým identifikovaným receptorom je jeden polypeptid, označený

590/B ···« ·· ·· ···· • · · • · · • · · ή ή · · · ·

IL-2R alfa, ktorý je 55 kD polypeptid (p55), ktorý sa objavuje po aktivácii T lymfocytov a ktorý sa pôvodne označil Tac (podľa T aktivácie) antigén. IL-2R alfa viaže IL-2 s K_d približne 10'⁸ M a je tiež známy ako „nízko afinitný,, IL-2 receptor. Väzba IL-2 na bunky exprimujúce iba IL-2R alfa nevedie k žiadnej detekovateľnej biologickej odpovedi.

Druhým IL-2 receptorom je väzobný komplex zložený z IL-2Rb a IL-2Rg; IL-2Rg, 64 kD polypeptid, je tiež známy ako spoločný gama (gama_c) reťazec, pretože je spoločný pre mnoho receptorov pre cytokíny. IL-2Rb má veľkosť približne 70 - 75 kD (preto sa označuje ako p70 alebo p75) a patrí do rodiny cytokínových receptorov typu I, ktorá je charakterizovaná motívom dva proteíny/WSXWS. IL-2R beta je exprimovaný súčasne s gama_c. Afinita väzby IL-2 na IL-2R gama_c je vyššia ako afinita väzby na IL-2R alfa, s Ka približne 10⁹ M; tiež sa označuje ako „stredne afinitný,, receptor pre IL-2. IL-2 spôsobuje rast buniek exprimujúcich IL-2Rbeta gamac a polovica maximálnej stimulácie rastu sa vyskytuje pri rovnakej koncentrácii IL-2, ktorá spôsobuje polovicu maximálnej väzby (t.j. 1 x 10'⁹ M). IL-2R beta gamacje signálny receptorový komplex, ktorý môže viazať IL-15.

Tretí známy IL-2 receptorový komplex je IL-2R alfa gama_c komplex. Bunky, ktoré exprimujú ako IL-2R alfa, tak IL-2R beta gama_c, môžu viazať IL-2 oveľa pevnejšie s Ka približne 10'¹¹ M, a preto je tento komplex tiež známy ako „vysoko afinitný,, komplex. Stimulácia rastu takýchto buniek prebieha pri podobne nízkych koncentráciách IL-2. Ako väzba IL-2, tak stimulácia rastu môžu byť blokované protilátkami proti IL-2R alfa, IL-2R beta alebo gama_c, a najúčinnejšie kombináciou protilátok k viacerým podjednotkám receptoru. Tieto pozorovania naznačujú, že IL-2R alfa tvorí komplex s IL-2R beta gama_c, čo zvyšuje afinitu signálneho receptoru k IL-2, a tak umožňuje dodanie rastového signálu pri významne nižších koncentráciách IL-2. Predpokladá sa, že IL-2 sa najprv rýchlo viaže na IL-2R alfa a táto väzba uľahčuje asociáciu s IL-2 R beta gama_c. Pokojné T lymfocyty exprimujú IL-2R beta gama_c, ale iba malé množstvá IL-2R alfa; zvýšenie povrchovej expresie IL-2R alfa sa môže stimulovať IL-2. Pri aktivácii T lymfocytov sprostredkovanej receptorom pre antigén sa rýchlo exprimuje IL-2R alfa, čo znižuje koncentráciu IL-2 potrebnú ·· • · · · · · • · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· ·

590/B ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· ····

9 na stimuláciu rastu. Väzba IL-2 na IL-2R beta gama_c komplex vedie k prenosu signálu Jak/STAT signalizačnou dráhou.

Objavili sme mutantov ľudského IL-2, ktorí prednostne aktivujú T lymfocyty (PHA blasty; bunky, ktoré exprimujú vysoko afinitný receptor pre IL-2 - IL-2R beta gama) pred NK bunkami (bunky, ktoré exprimujú stredne afinitný receptor pre IL-2 - IL-2R beta gama). Mutanti sa substitúciou Asp-20 za histidín (D20H) alebo izoleucín (D20I), Asn-88 za arginín (N88R), glycín (N88G) alebo izoleucín (N88I) alebo Gln-126 za leucín (Q126L) alebo glutamát (G126E) vykazujú nečakane úplnú aktivitu IL-2 na PHA blastoch a slabú (ak vôbec nejakú) aktivitu na NK bunky. Predchádzajúce štúdie mutovaných ľudských IL-2 spočívali v analýze myších bunečných systémov a keď sa použili ľudské bunky, tak sa nepoužili bunky exprimujúce iba IL-2R beta gama (ako sú NK bunky). Ďalej, štúdie využívajúce ľudské PHA blasty ukázali, že substitúcia Asp-20 (Leu, Arg, Asp alebo Lys; Xu a kol., Eur. Cytokine Netw., 6, 237 - 255 (1995) alebo Gln-126 (Asp; Buchli a Ciardelli, Árch. Biochem. Biophys., 307, 2, 411 - 415 (1993)) viedli k zisku mutantných ľudských IL-2 majúcich vážne narušenú aktivitu. Predchádzajúce štúdie vykonané za použitia myšieho IL-2 identifikovali mutované myšie IL-2 majúce rôzne aktivity (Zurawski a kol., EMBO J., 12, 5113 - 5119 (1993)), ale žiadna z mutácií neviedla k výsledkom, ktoré by boli podobné výsledkom získaným v predkladanom vynáleze. Mutantné ľudské IL-2 obsahujúce identické mutácie v synonymných pozíciách s mutantným myším IL-2 nemali podobné aktivity, a preto sa zdá, že myšie príklady nie sú použiteľné na predpovedanie funkcie ľudských mutantov. Vynálezcom nie sú známe žiadne štúdie mutovaných ľudských IL-2 porovnávajúce relatívne aktivity na ľudských bunkách exprimujúcich IL-2 receptor IL-2R alfa beta gama (napríklad PHA-blastoch) a na bunkách exprimujúcich IL-2 receptor IL-2R beta gama (napríklad NK bunkách). Predpokladá sa, že analýza in vivo potvrdí, že popísaní mutanti majú lepší terapeutický index in vivo oproti prirodzenému ľudskému IL-2 z dôvodov zníženej toxicity, čo umožňuje získať terapeuticky použiteľné prostriedky na liečenie ochorení vyžadujúcich stimuláciu imunitného systému.

590/B ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· ···· • · · • · · • · · · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · • ·

Interleukín 2 (IL-2) sa v súčasnosti používa klinicky na liečenie metastázujúceho karcinómu ľadvín. Avšak, jeho závažná toxicita obmedzuje jeho použitie iba na podskupinu najzdravších pacientov a toxicita limitujúca dávku znižuje jeho celkovú účinnosť. Predpokladá sa, že akútna toxicita IL-2 je sprostredkovaná aktiváciou NK buniek, zatiaľ čo jeho účinnosť je sprostredkovaná priamou aktiváciou T lymfocytov (Jacobson a kol., Prac. Natl. Acad. Sci. USA (United States), 17. sept., 1996, 93, 19, 10405 - 10410; Smith, K. A., Blood, 1993, 81, 6, str. 1414 - 1423; Kaplan a kol., Biotechnology, 10, 2, 157 - 162). T lymfocyty exprimujú iný receptor pre IL-2 ako NK bunky (T lymfocyty: IL-2R alfa beta gama, vysoko afinitný receptor pre IL-2; NK bunky, IL-2R beta gama, stredne afinitný receptor pre IL-2). Tu popísaní mutanti ľudského IL-2 selektívne aktivujú receptor pre IL-2 T lymfocytov a nie receptor pre IL-2 NK buniek.

Terapia nízkymi dávkami IL-2 sa použila s určitým úspechom na prekonanie priamej aktivácie NK buniek (Jacobson a kol., Prac. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 10405 - 10410). Táto stratégia využívala teóriu, že pri nízkych dávkach IL-2 sa aktivuje iba vysoko afinitný receptor pre IL-2 a nie receptor pre IL-2 so strednou afinitou. Forma receptoru pre IL-2 so strednou afinitou, IL-2R beta gama, je exprimovaná iba na NK bunkách, zatiaľ čo T lymfocyty exprimujú vysoko afinitnú formu, IL-2R alfa beta gama.

Avšak vynálezcovia riešia problémy toxicity ir.ým spôsobom. Narušenie interakcií IL-2 s IL-2R beta a/alebo IL-2R gama pomocou modifikácie špecifických väzobných zvyškov na väzobnom povrchu IL-2 by malo zabrániť účinnej väzbe (a preto aktivácii) buniek exprimujúcich iba IL-2R beta gama. Avšak na bunkách exprimujúcich IL-2R alfa beta gama stále prebieha počiatočná väzba na IL-2R alfa, a tak väzba na bunky, a preto môže terapia nízkymi dávkami navrhnutá Jacobsonom a kol. stále ešte vykazovať toxické vedľajšie účinky. Z dôvodu väzby na IL-2R alfa môže na bunečnom povrchu prebehnúť účinná aktivácia IL-2R beta a IL-2R gama, i napriek narušenej interakcii modifikovaného IL-2 s IL-2R beta a/alebo IL-2R gama. Tak sa môže vytvoriť komplex IL-2/ IL-2R alfa beta gama schopný prenosu signálu. Variant

590/B ···· ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· ···· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· ·· ·

IL-2 môže byť schopný selektívne aktivovať vysoko afinitné receptory pre IL-2 na T lymfocytoch prednostne pred stredne afinitnými receptormi pre IL-2 na NK bunkách, a preto môže podľa našich predpokladov mať zvýšený terapeutický index vzhľadom k prirodzenému IL-2 z dôvodov zníženej toxicity. Variant IL-2 so zvýšeným terapeutickým indexom by mal mať výrazne širší rozsah použitia ako pri liečení nádorov (ako priame a/alebo pomocné liečenie), tak pri liečení imunodeficiencií (ako je napríklad HIV, tuberkulóza). Ďalšie potenciálne využitia IL-2 sú odvodené od jeho imunostimulačnej aktivity a zahrňujú spolu s priamym liečením nádorov, imunodeficiencií ako je HIV alebo ľudská SCID tiež liečenie infekčných ochorení, ako je tuberkulóza; použitie ako adjuvans v „protinádorovej vakcíne,, a použitie pri stimulácii imunitného systému, ako je napríklad štandardná vakcinácia alebo liečenie starých chorých.

Vhodné substitúcie vAsp-20, Asn-88 alebo Gln-126 redukujú väzobné interakcie s IL-2R beta (Asp-20 a Asn-88) alebo IL-2R gama (Gln-126). Každá substitúcia vedie k vzniku mutantov IL-2, ktorí si zachovávajú svoju aktivitu na T lymfocyty a ktorí majú zníženú aktivitu na ľudské NK bunky.

Pretože nie je možné predvídať vplyv danej substitúcie pred hodnotením v testoch na NK a T bunkách, vykonali sa všetky možné substitúcie prirodzených aminokyselín (okrem Cys) v pozíciách Asp-20, Asn-88 a Gln-126 a obmedzená, ale rôznorodá sada mutácií sa vykonala v pozícii Asp-84 kvôli testovania toho, či títo mutanti interagujú s IL-2 R beta. Ďalšie mutácie v pozícii Asp-84 sa testovali vtedy, keď sa pozoroval ich zreteľný efekt na interakcie s IL2R beta. Dáta pre 46 samostatných substitúcií v týchto pozíciách sú uvádzané v tabuľke 1, ďalej.

Mutácie boli pripravené s použitím miestne cielenej mutagenézy na prirodzenej ľudskej cDNA pre IL-2. Správne klony boli subklonované do expresného vektoru vhodného na expresiu v heterológnom systéme (napríklad E. coli, bakulovíruse, kvasinkách alebo cicavčích bunkách, ako sú napríklad ovariálne bunky čínskeho škrečka (CHO)). Prečistené proteíny sa testovali v teste proliferácie T-lymfocytov (PHA blastov) a teste proliferácie NK buniek. Rôzne reakcie vyvolané jednotlivými mutantmi v týchto dvoch testoch, t.j. ECso,

590/B ···· ··

9· ···· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· • * · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · ·· ·· · * ukázali mutácie, ktoré majú tieto aktivity. Presnejšie, mutanti, ktorí stimulujú relatívne silnejšiu reakciu v teste na PHA-blastoch (T lymfocytoch) (oproti prirodzenému IL-2) v porovnaní s reakciou v teste na NK bunkách (oproti prirodzenému IL-2) budú ukazovať na substitúcie, ktoré dodávajú bunečnú špecificitu založenú na schopnosti väzby špecifických mutantov na IL-2R alfa beta gama a aktiváciu IL-2R alfa beta gama exprimovaného na týchto bunkách, ale na neschopnosť viazať sa na - a tak aktivovať - bunky exprimujúce iba IL2R beta gama. Mutanti IL-2 vykazujúci túto vlastnosť budú preto in vivo mať imunostimulačné vlastnosti so zníženou toxicitou spojenou s terapiou IL-2 v zmysle vyššej priepustnosti kapilár a hypotenzie.

B. Definície

Uloženie CHO bunečnej línie použitej na produkciu rekombinantného proteínu podľa predkladaného vynálezu sa vykonalo v ATCC, 12301 Parklawn

Drive, Rockville, MD, 20852, USA, 5.5.1999, pod prírastkovým číslom:_.

Pretože uložený kmeň sa uložil za podmienok Budapešťskej zmluvy, je dostupný patentovým úradom, ktoré sú signatármi Budapešťskej zmluvy.

Ako je tu použitý, označuje termín „prirodzený IL-2„ IL-2, či prirodzený alebo rekombinantný, ktorý sa skladá zo 133 aminokyselinovej bežnej sekvencie prirodzeného ľudského IL-2 (bez signálneho peptidu, ktorý sa skladá z ďalších 20 N-koncových aminokyselín), ktorého aminokyselinové sekvencia je popísaná vo Fujita a kol., PNAS USA, 80, 7437 - 7441 (1983), s alebo bez ďalšieho N-koncového metionínu, ktorý sa musí použiť vtedy, ak je proteín exprimovaný ako intracelulárna frakcia v E. coli.

Ako je tu použitý, označuje termín „mutantný IL-2„ polypeptid, v ktorom sa vykonali špecifické substitúcie vzhľadom k zrelému ľudskému interleukínu-2. Tabuľka 1 ďalej popisuje 46 jednotlivých pripravených substitúcií v IL-2 a ich príslušnú aktivitu. Výhodnými vyhotoveniami sú tí mutanti, ktorí majú aspoň 100-násobnú relatívnu aktivitu. Najviac výhodnými vyhotoveniami sú tí mutanti, ktorí majú aspoň 1000-násobnú relatívnu aktivitu: aspartátový (Asp) zvyšok (D) v pozícii 20 (,,D20„), pri číslovaní podľa prirodzeného IL-2, je substituovaný izoleucínom („D20l„) alebo histidínom („D20H„); asparagínový zvyšok (Asn)

590/B ·· · ·· ···· ·· ···· ·· • · • · · • · · · • · · · · • · • · • · • · · v pozícii 88 (N88) je substituovaný izoleucínom (N88I), glycinom (N88G) alebo arginínom (N88R) a glutamínový zvyšok (Gin) v pozícii 126 (Q126) je substituovaný leucínom (Q126L), glutamátom (Q126E) alebo aspartátom (Q126D). Výhodní IL-2 mutanti majú v ostatných nesubstituovaných zvyškoch aminokyselinovú sekvenciu identickú s prirodzeným IL-2. Avšak mutanti IL-2 podľa predkladaného vynálezu sa môžu tiež charakterizovať aminokyselinovými inzerciami, deléciami, substitúciami a modifikáciami v jednom alebo viacerých miestach v alebo na iných zvyškoch prirodzeného reťazca IL-2 polypeptidu. Podľa predkladaného vynálezu môže akákoľvek takáto inzercia, delécia, substitúcia a modifikácia viesť k vzniku mutanta IL-2, ktorý si zachováva selektívnu aktivitu pre PHA blasty a zároveň má zníženú schopnosť aktivovať NK bunky a spadá do rozsahu predkladaného vynálezu.

Kombinovanie výhodných alebo najmä výhodných substitúcií popísaných vyššie v jednej rekombinantnej molekule IL-2 môže viesť ku kombinovaným mutantom majúcim aktivitu podobnú aktivite popísanej pre mutantov s jednou mutáciou. Napríklad sa môže predpokladať, že molekula IL-2 obsahujúca kombináciu dvoch alebo viacerých mutácií vybraných z tabuľky 1 môže byť agonistom IL-2 selektívnym pre T lymfocyty s relatívnou aktivitou podobnou relatívnej aktivite jednotlivých tu popísaných substitúcií. Kombinovaní mutanti spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu.

Uprednostňujeme konzervatívne modifikácie a substitúcie v iných pozíciách IL-2 (t.j. také, ktoré majú minimálny vplyv na sekundárnu a terciárnu štruktúru mutantu). Medzi takéto konzervatívne substitúcie patria substitúcie popísané v Dayhoff: The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978) a v Argos, EMBO J., 8, 779 - 785 (1989). Napríklad aminokyseliny patriace do jednej z nasledujúcich skupín predstavujú konzervatívne zmeny:

- ala, pro, gly, gin, asn, ser, thr,

- cys, ser, tyr, thr,

- val, ile, leu, met, ala, phe,

590/B

I ···· • · • · ···· ·· • · · • · · . :: :

·· ··

- lys, arg, his,

- phe, tyr, trp, his, a

- asp, glu.

Ďalej uprednostňujeme modifikácie a substitúcie, ktoré nevkladajú miesta na ďalšie intermolekulové zosieťovanie alebo nesprávnu tvorbu disulfidových väzieb. Napríklad je známe, že IL-2 obsahuje tri cys zvyšky, v pozíciách 58, 105 a 125 zrelej sekvencie.

Termín „číslovanie podľa sekvencie prirodzeného IL-2„ označuje identifikáciu vybranej aminokyselinovej sekvencie s ohľadom na pozíciu, v ktorej sa aminokyselina normálne vyskytuje v zrelej sekvencii prirodzeného IL2. Keď sú v mutantnom IL-2 vykonané inzercie alebo delécie, tak môže byť Asp, ktorý je normálne v pozícii 20, posunutý v mutantnom proteíne, ako je odborníkom jasné. Avšak umiestnenie posunutého Asp sa môže ľahko určiť prehliadnutím a porovnaním susedných aminokyselín s aminokyselinami susediacimi v Asp v prirodzenom IL-2.

Termín „bunky obsahujúce IL-2R alfa beta gama receptor,, označuje bunky, o ktorých je známe, že majú receptor tohto typu, t.j. T lymfocyty, aktivované T lymfocyty, B lymfocyty, aktivované monocyty a aktivované NK bunky. Termín „bunky obsahujúce IL-2R beta gama receptor,, označuje bunky, o ktorých je známe, že majú receptor tohto typu, t.j. B lymfocyty, pokojné monocyty a pokojné NK bunky.

IL-2 mutanti podľa predkladaného vynálezu sa môžu produkovať akoukoľvek vhodnou metódou známou v odbore. Medzi takéto metódy patria konštrukcie DNA sekvencie kódujúcej IL-2 mutantov podľa predkladaného vynálezu a expresia týchto sekvencií vo vhodne transformovanom hostiteľovi. Tento spôsob produkuje rekombinantných mutantov podľa predkladaného vynálezu. Avšak mutanti podľa predkladaného vynálezu sa môžu tiež produkovať, i keď menej výhodne, chemickou syntézou alebo kombináciou chemickej syntézy a rekombinantnej DNA technológie. Spôsoby vsádzkovej produkcie alebo perfúznej produkcie sú odborníkom v odbore známe. Pozri

590/B ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· BB • · · • · · • · · • · · · ·· BB ·· ····

BB

B · · • B

B ·

B ·

BB B

Freshey, R. I. (ed.), „Animal Celí Culture: A Practical Approach,,, 2. vyd., 1992, IRL Press, Oxford, Anglicko; Mather, J. P., „Laboratory Scaleup of Celí Cultures (0,5 - 50 liters),,, Methods Celí Biology, 57, 219 - 527 (1998); Hu, W. S. a Aunins, J. G., „Large - Scale Mammalian Celí Culture,,, Curr. Opin. Biotechnol., 8, 148 - 153 (1997); Konštantínov, K. B., Tsai, Y., Moles, D., Matanguihan, R., „Control of long - term perfusin Chinese hamster ovary celí culture by glucosa auxostat,,, Biotechnol. Prog., 12,100-109 (1996).

V jednom vyhotovení rekombinantnej metódy na produkciu mutantov podľa predkladaného vynálezu je DNA sekvencia konštruovaná izoláciou alebo syntetizovaním DNA sekvencie kódujúcej prirodzený IL-2 a potom zmenou kodónu pre Asp20 na kodón pre izoleucín (I) miestne cielenou mutagenézou. Táto technika je dobre známa, pozri napríklad Mark a kol., „Site-specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene,,., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662 - 5666 (1984) a U.S. patent č. 4 588 585, ktoré sú tu uvedené ako odkazy.

Inou metódou konštrukcie DNA sekvencie kódujúcej mutantný IL-2 podľa predkladaného vynálezu je chemická syntéza. Táto napríklad zahrňuje priamu syntézu peptidu chemickými prostriedkami s použitím sekvencie kódujúcej mutantný IL-2 majúci vlastnosti podľa predkladaného vynálezu. Tento spôsob môže vkladať prirodzené i neprirodzené aminokyseliny v pozíciách, ktoré ovplyvňujú interakcie IL-2 s IL-2R beta alebo IL-2R gama. Alternatívne môže byť chemicky syntetizovaný pomocou oligonukleotidového syntezátora gén, ktorý kóduje požadovaný mutantný IL-2. Takéto oligonukleotidy sú navrhnuté podľa aminokyselinovej sekvencie požadovaného mutovaného IL-2 a výhodne s použitím tých kodónov, ktoré sa prednostne využívajú v hostiteľskej bunke, v ktorej je rekombinantný mutant exprimovaný. V tomto smere je dobre známe, že genetický kód je degenerovaný - to znamená, že aminokyselina môže byť kódovaná viac ako jedným kodónom. Napríklad Phe(F) je kódovaný dvoma kodónmi - TTC alebo TTT, Tyr(Y) je kódovaný TAC alebo TAT a his(H) je kódovaný CAC alebo CAT, Trp(W) je kódovaný jediným kodónom, TGG. V súlade s tým je jasné, že pre danú DNA sekvenciu kódujúcu určitý mutantný IL-2 bude existovať veľa degenerovaných DNA sekvencií, ktoré budú kódovať

590/B ···· ·· • · · e · · • · · • · · · ·· ·· ·· ···· • · · • · · » · · « ·· ·· tento mutovaný IL-2. Napríklad je jasné, že okrem výhodnej DNA sekvencie pre mutant D20I uvedenej v SEQ ID č. 1 existuje mnoho degenerovaných DNA sekvencií, ktoré tiež kódujú uvedený mutantný IL-2. Tieto degenerované DNA sekvencie spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu. Preto označuje termín „degenerované varianty,, v predkladanom vynáleze všetky DNA sekvencie, ktoré kódujú, a tak umožňujú expresiu určitého mutantu.

DNA sekvencie kódujúce mutantný IL-2 podľa predkladaného vynálezu, či pripravené miestne cielenou mutagenézou, chemickou syntézou alebo inými prostriedkami, môže a nemusí tiež obsahovať DNA sekvencie kódujúce signálnu sekvenciu. Takáto signálna sekvencia, keď je prítomná, môže byť sekvenciou rozpoznávanou bunkami vybranými pre expresiu mutantného IL-2. Môže sa jednať o prokaryotickú alebo eukaryotickú sekvenciu alebo o ich kombináciu. Môže sa tiež jednať o signálnu sekvenciu prirodzeného IL-2. Obsiahnutie signálnej sekvencie závisí od toho, či je žiaduce secernovať mutantný IL-2 z rekombinantných buniek, v ktorých sa syntetizoval. Pokiaľ sú vybrané bunky prokaryotické, tak je zvyčajne výhodné, aby DNA sekvencia nekódovala signálnu sekvenciu. Pokiaľ sú vybrané bunky eukaryotické, tak je zvyčajne výhodné, aby sa signálna sekvencia kódovala a najvýhodnejšie je, aby sa použila prirodzená signálna sekvencia IL-2.

Štandardné spôsoby sa môžu použiť na syntetizovanie génu kódujúceho mutantný IL-2 podľa predkladaného vynálezu. Napríklad, kompletná aminokyselinová sekvencia sa môže použiť na konštrukciu spätne translatovaného génu. Môže sa syntetizovať DNA oligomér obsahujúci nukleotidovú sekvenciu kódujúcu mutantný IL-2. Napríklad sa môže syntetizovať niekoľko malých oligonukleotidov kódujúcich časti požadovaného polypeptidu, ktoré sa môžu potom ligovať. Jednotlivé oligonukleotidy zvyčajne obsahujú 5’ alebo 3' prekrývajúce sa konce pre komplementárne zostavenie.

Po zostavení (syntézou, miestne cielenou mutagenézou alebo iným spôsobom) sa môže DNA sekvencia kódujúca mutovaný IL-2 podľa predkladaného vynálezu inzertovať do expresného vektoru a operatívne naviazať na sekvenciu kontrolujúcu expresiu vhodnú na expresiu mutantného

590/B ·· · ···· ·· • · · • · · • · · · • · · ·

99 ·· ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ··

IL-2 vo vybranom transformovanom hostiteľovi. Správne zostavenie sa môže potvrdiť sekvencovaním nukleotidov, reštrikčným mapovaním a expresiou biologicky aktívneho polypeptidu vo vhodnom hostiteľovi. V odbore je dobre známe, že kvôli získaniu vysokej úrovne expresie transfektovaného génu v hostiteľovi sa musí gén operatívne naviazať na sekvencie kontrolujúce transkripciu a transláciu, ktoré sú funkčné vo vybranom hostiteľovi na expresiu.

Voľba sekvencie kontrolujúcej expresiu a expresného vektora závisí od voľby hostiteľa. Môžu sa použiť rôzne kombinácie hostiteľa/vektoru. Vhodnými expresnými vektormi pre eukaryotických hostiteľov sú napríklad vektory obsahujúce sekvenciu na kontrolu expresie zo SV40, hovädzieho papiloma vírusu, adenovírusu a cytomegalovírusu. Vhodnými expresnými vektormi pre bakteriálnych hostiteľov sú známe bakteriálne plazmidy, ako sú plazmidy z E. coli, vrátane col E1, pCR1, pER32z, pMB9 a ich derivátov, plazmidy s väčším počtom hostiteľov, ako je RP4, fágové DNA, napríklad rôzne deriváty fágu lambda, napríklad NM989 a iné DNA fágy, ako je MI3 a filamentózne jednoreťazcové DNA fágy. Vhodnými expresnými vektormi pre kvasinky sú 2μ plazmid a jeho deriváty. Vhodným vektorom pre hmyzie bunky je pVL941. Uprednostňujeme pFastBac™ (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Čate a kol., „Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene in Animal Cells,,, Celí, 45, str. 685 - 698 (1986).

Ďalej, v týchto vektoroch sa môže použiť akákoľvek z mnohých sekvencií na kontrolu expresie. Medzi takéto použiteľné sekvencie na kontrolu expresie patria sekvencie kontrolujúce expresiu asociované so štrukturálnymi génmi uvedených expresných vektorov. Príklady použiteľných sekvencií na kontrolu expresie zahrňujú napríklad skoré a neskoré promótory SV40 alebo adenovírusu, lac systém, trp systém, TAC alebo TRC systém, hlavný operátorový a promótorový región fágu lambda, napríklad PL, kontrolné regióny fd obalového proteinu, promótor pre 3-fosfoglycerát kinázu alebo iné glykolytické enzýmy, promótory kyslej fosfatázy, napríklad PhoA, promótory kvasinkového alfa-párovacieho systému, polyhedrónový promótor bakulovírusu a iné sekvencie, o ktorých je známe, že kontrolujú expresiu génov

590/B ···· ·· • · · * · · • · · • 9 · · ·· ·· ·· ····

• · · ·

9 9 9

99 ·

prokaryotických alebo eukaryotických buniek alebo iných vírusov a rôzne ich kombinácie.

Akýkoľvek vhodný hostiteľ sa môže použiť na produkciu mutantných IL-2 podľa predkladaného vynálezu, vrátane baktérií, húb (vrátane kvasiniek), rastlín, hmyzu alebo iných vhodných živočíšnych buniek alebo bunečných línií, rovnako ako vrátane transgénnych zvierat alebo rastlín. Presnejšie, medzi týchto hostiteľov patria dobre známi prokaryotickí a eukaryotickí hostitelia, ako sú kmene E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, huby, kvasinky, hmyzie bunky ako sú bunky Spodoptera frugiperda (Sf9), živočíšne bunky ako sú ovariálne bunky čínskeho škrečka (CHO) a myšie bunky, ako sú NS/O, bunky afrických makakov ako sú COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 a BNT 10 a ľudské bunky, rovnako ako rastlinné bunky, v tkanivovej kultúre. Na expresiu v živočíšnych bunkách prednostne využívame CHO bunky a COS 7 bunky v kultúrach, hlavne CHO bunečnú líniu CHO (DHFR-) alebo HKB líniu.

Je potrebné si uvedomiť, že nie všetky vektory a sekvencie na kontrolu expresie budú účinkovať rovnako dobre pri expresii DNA sekvencií podľa predkladaného vynálezu. Ani všetci hostitelia nie sú rovnako výkonní pri použití rovnakého expresného systému. Avšak odborník v odbore môže vykonať výber z týchto vektorov, sekvencií na kontrolu expresie a hostiteľov bez zbytočného experimentovania. Napríklad pri výbere vektoru sa musí brať do úvahy hostiteľ, lebo vektor sa musí replikovať v hostiteľovi. Počet kópií vektoru, schopnosť kontrolovať tento počet vektorov a expresia akýchkoľvek iných proteínov kódovaných vektorom, ako sú antibiotické markéry, sa musia tiež zobrať do úvahy. Napríklad medzi vhodné vektory na použitie v predkladanom vynáleze patria tie vektory, ktoré umožňujú amplifikáciu DNA kódujúcej mutované IL-2 v určitom počte kópií. Takéto amplifikovateľné vektory sú dobre známe v odbore. Patria medzi ne, napríklad, vektory amplifikovateľné DHFR amplifikáciou (pozri napríklad Kaufman, U.S. patent 4 470 461, Kaufman a Sharp, „Construction of a Modular Dihydrofolate Reductase cDNA Gene: Analysis of Signals Utilized for Efficient Expression,,, Mol. Celí. Biol., 2, str. 1304 - 1319 (1982)) alebo glutamín syntetázovou (,,GS„) amplifikáciou (pozri napríklad U.S. patent 5 122 464 a Európska patentová prihláška 338 841).

590/B «··· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· · ·· ···· • · · ·· ·· ··

Pri výbere sekvencie kontrolujúcej expresiu sa musia brať do úvahy rôzne faktory. Medzi takéto faktory patria, napríklad, relatívna účinnosť sekvencie, jej kontrolovateľnosť a jej kompatibilita s DNA sekvenciou kódujúcou mutantný IL-2 podľa predkladaného vynálezu, hlavne s ohľadom na jej sekundárne štruktúry. Hostitelia by sa mali vybrať tak, aby boli kompatibilní s vybraným vektorom, musí sa brať do úvahy toxicita produktu kódovaného DNA sekvenciou podľa predkladaného vynálezu, charakteristiky ich sekrécie, schopnosť hostiteľov správne skladať proteín, ich požiadavky na fermentáciu alebo kultiváciu a ľahkosť prečistenia produktu kódovaného DNA sekvenciami.

Za použitia týchto parametrov môže odborník v odbore vybrať rôzne kombinácie vektor/sekvencia kontrolujúce expresiu/hostiteľ, ktoré budú exprimovať požadované DNA sekvencie pri fermentácii alebo vo veľkoobjemovej živočíšnej kultúre, napríklad s použitím CHO buniek alebo COS 7 buniek.

Mutantné IL-2 získané spôsobom podľa predkladaného vynálezu môžu byť glykozylované alebo neglykozylované podľa toho, ktorý hostiteľský organizmus sa použil na produkciu mutantného proteínu. Ak sú ako hostitelia vybrané baktérie, tak je produkovaný mutantný IL-2 neglykozylovaný. Eukaryotické bunky, naopak, glykozylujú mutantný IL-2, hoci zrejme nie rovnakým spôsobom, ako je glykozylovaný prirodzený IL-2. Mutantný IL-2 produkovaný transformovanými hostiteľmi sa môže prečistiť akýmkoľvek vhodným spôsobom. Sú známe rôzne spôsoby na prečistenie IL-2, pozri napríklad Current Protocols in Protein Science, zv. 2, ed.: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hídde L. Ploegh, Dávid W. Spencer, Paul T. Wingsfield, Unit 6.5 (Copyright 1997, John Wiley and Sons, Inc.). Preferujeme opätovné zloženie z inklúznych teliesok vytvorených v E. coli alebo z kondiciovaného média buď z cicavčích alebo z kvasinkových kultúr produkujúcich daný mutantný proteín s použitím katiónovej výmeny, gólovej filtrácie alebo kvapalinovej chromatografie s reverznou fázou, pozri príklady 1 (E. coli) a 10 (perfúzia CHO buniek) uvedené ďalej.

590/B ·· • · · · ·

9 · · · · ·· ··

·· ···· • · · • · · • · · · · · ·· ··

Biologická aktivita mutantných IL-2 podľa predkladaného vynálezu sa môže hodnotiť akýmkoľvek vhodným spôsobom známym v odbore. Medzi takéto testy patrí test proliferácie PHA blastov a proliferácie NK buniek. Mutantné proteíny s vhodnou aktivitou, t.j. plne aktívne na IL-2R alfa beta gama, ale so zníženou aktivitou na bunkách nesúcich IL-2R beta gama, sa môžu zistiť s použitím týchto dvoch testov. „Relatívna aktivita,, mutantného proteínu sa meria vzhľadom k prirodzenému IL-2 a ako je tu popísané ďalej v príkladoch, je pomerom aktivity v teste proliferácie PHA blastov k aktivite v teste proliferácie NK buniek.

Mutantné IL-2 podľa predkladaného vynálezu sa podávajú v dávke približne rovnakej alebo vyššej, ako je dávka používaná pri terapii prirodzeným alebo rekombinantným IL-2. Výhodne sa podá účinné množstvo mutantného IL2. Termín „účinné množstvo,, označuje množstvo schopné zabrániť alebo zmierniť závažnosť alebo šírenie liečeného stavu alebo ochorenia. Odborníkom v odbore bude jasné, že účinné množstvo mutantného IL-2 závisí, okrem iného, od ochorenia, dávky, protokolu podávania mutantného IL-2, od toho, či je mutantný IL-2 podaný samostatne alebo v kombinácii s inými terapeutickými činidlami, od sérového polčasu prostriedku a od celkového zdravotného stavu pacienta.

Mutantný IL-2 sa výhodne podáva v prostriedku obsahujúcom farmaceutický prijateľný nosič. „Farmaceutický prijateľný nosič,, je nosič, ktorý nespôsobuje žiadne nežiaduce účinky u pacienta, ktorému sa podáva. Takéto farmaceutický prijateľné nosiče sú dobre známe v odbore. Prednostne využívame 2 % HSA/PBS pri pH 7,0.

Mutantné IL-2 podľa predkladaného vynálezu sa môžu pripraviť vo forme farmaceutických prostriedkov s použitím dobre známych postupov, pozri napríklad Remington's Pharmaceutical Science od E. W. Martina, ktorá je tu uvedená ako odkaz a ktorá popisuje vhodné prípravky. Farmaceutický prípravok obsahujúci mutantný IL-2 môže byť v rôznej forme, vrátane kvapaliny, gélu, lyofilizovanej formy alebo inej vhodnej formy. Výhodná forma závisí od konkrétneho liečeného stavu a bude zrejmá odborníkom v odbore.

590/B ···· ·· •fl ····

Farmaceutické prípravky obsahujúce mutantný IL-2 sa môžu podať orálne, vo forme aerosólu, intravenózne, intramuskulárne, intraperitoneálne, intradermálne alebo subkutánne alebo akýmkoľvek iným prijateľným spôsobom. Výhodný spôsob podania závisí od konkrétneho liečeného stavu a bude zrejmý odborníkom v odbore. Farmaceutické prípravky mutantného IL-2 sa môžu podať spoločne s inými terapeutickými činidlami. Tieto činidlá môžu byť súčasťou rovnakého farmaceutického prípravku alebo sa môžu podať separované od mutantného IL-2, buď súčasne alebo podľa akéhokoľvek prijateľného protokolu liečenia. Ďalej, farmaceutický prípravok mutantného IL-2 sa môže použiť ako pomocná liečba pri inej terapii.

V súlade s tým poskytuje predkladaný vynález prostriedky a spôsoby na liečenie nádorov, HIV, autoimunitných ochorení, infekčných ochorení, na použitie ako adjuvans vo vakcínach pri protinádorovej vakcinácii a bežnej vakcinácii, na imunostimuláciu v starobe alebo u inak imunokompromitovaných jedincov, rovnako ako u ľudí so SCID alebo na iné terapeutické aplikácie vyžadujúce celkovú stimuláciu imunitného systému u akéhokoľvek vhodného živočícha, výhodne u cicavca, najlepšie u človeka. Ako bolo uvedené v časti Doterajší stav techniky, má IL-2 veľa účinkov. Niektorými z týchto účinkov je stimulácia PHA blastov, pokojných T lymfocytov, B lymfocytov, monocytov a NK buniek, atď.; mutantné proteíny podľa predkladaného vynálezu sú aktívne na tých bunkách, ktoré exprimujú iba vysoko afinitný receptor pre IL-2, ako sú pokojné T lymfocyty, ale nie na bunkách exprimujúcich stredne afinitný receptor pre IL-2, ako sú NK bunky alebo monocyty.

Tiež sa predpokladá použitie DNA sekvencií kódujúcich mutantný IL-2 podľa predkladaného vynálezu v génovej terapii. Predpokladaná génová terapia zahrňuje liečenie tých ochorení, pri ktorých sa predpokladá účinok terapie IL-2 sprostredkovaný jeho aktivitou na lymfocyty, ako sú napríklad nádory, HIV, autoimunitné ochorenia, infekčné ochorenia, ďalej použitie ako adjuvans vo vakcínach pri protinádorovej vakcinácii a bežnej vakcinácii, pre imunostimuláciu v starobe alebo u inak imunokompromitovaných jedincov, rovnako ako u ľudí so SCID a ochorení, ktoré inak reagujú na IL-2 alebo

590/B ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· ···· ·· ·· ·· • · · • · • · · »· · infekčné ochorenia spôsobené činidlami, ktoré sú citlivé na imunitnú odpoveď sprostredkovanú IL-2.

Lokálne podanie mutantného IL-2 s použitím génovej terapie môže dodať terapeutické činidlo do cieľovej oblasti. Predpokladá sa použitie in vitro a in vivo metód génovej terapie. Je známych niekoľko metód na prenos potenciálne terapeutických génov do definovaných bunečných populácií, pozri napríklad Mulligan, „The Basic Science of Gene Therapy,,, Science, 260, 926 931 (1993). Medzi tieto metódy patria:

(1) Priamy prenos génu (pozri napríklad Wolff a kol., „Direct Gene Transfer Into Mouse Muscle in Vivo,,, Science, 247,1465 - 1468 (1990).

(2) Liposómami sprostredkovaný prenos DNA (pozri napríklad Caplan a kol., „Liposome-mediated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium of Patients with Cystic Fibrosis,,, Náture Med., 3, 39 - 46 (1995), Crystal, „The Gene as a Drug,„ Náture Med., 1, 15 - 17 (1995); Gao a Huang, „A Novel Cationic Liposome Reagent for Efficient Transfection of Mammaliam Cells,,, Biochem. Biophys. Res. Comm., 179, 280-285 (1991).

(3) Retrovírusom sprostredkovaný prenos DNA (pozri napríklad Kay a kol., „In Vivo Gene Therapy of Hemophilia B: Sustained Partia! Correction in Factor IXDeficient Dogs„, Science, 262, 177 - 19 (1993); Anderson, „Human Gene Therapy,,, Science, 256, 808 - 813 (1992).

(4) DNA vírusom sprostredkovaný prenos DNA. Medzi takéto vírusy patria adenovírusy (výhodne vektory na báze Ad-2 alebo Ad-5), herpes vírusy (výhodne vektory na báze herpes simplex vírusu) a parvovírusy (výhodne vektory na báze „defektných,, alebo neautonómnych parvovírusov, lepšie vektory na báze adeno-asociovaného vírusu, najlepšie vektory na báze AAV-2), pozri napríklad Ali a kol., „The Use of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy,,, Gene Therapy, 1, 367 - 384 (1994), U.S. patent 4 797 368, ktorý je tu uvedený ako odkaz a U.S. patent 5 139 941, ktorý je tu uvedený ako odkaz.

590/8 ···· ·· ·· ···· • · · · · · • · · · · · ·· ·· ··

Voľba konkrétneho vektorového systému na prenos vybraného génu závisí od rôznych faktorov. Jedným významným faktorom je charakter populácie cieľových buniek. Hoci sa retrovírusové vektory rozsiahlo študovali a používali v mnohých aplikáciách génovej terapie, sú tieto vektory zvyčajne nevhodné na infikovanie nedeliacich sa buniek. Okrem toho majú retrovírusy onkogénny potenciál.

Adenovírusy majú výhodu v tom, že majú široký rozsah hostiteľov, môžu infikovať pokojné alebo konečne diferencované bunky, ako sú neuróny alebo hepatocyty a zdajú sa byť v podstate neonkogénne (pozri Ali a kol., vyššie, str. 367). Adenovírusy sa neintegrujú do genómu hostiteľa. Pretože sú prítomné extrachromozomálne, je riziko inzerčnej mutagenézy značne znížené, Ali a kol., vyššie, str. 373.

Adeno - asociované vírusy majú rovnaké výhody ako vektory na báze adenovírusov. Avšak AAV vykazujú miestne cielenú integráciu do ľudského chromozómu 19, Ali a kol., vyššie, str. 377.

Vo výhodnom vyhotovení sa DNA kódujúca mutantný IL-2 podľa predkladaného vynálezu použije v génovej terapii na liečenie imunodeficitov ako je HIV infekcia; infekčných ochorení ako je tuberkulóza, a nádorov, ako je renálny karcinóm.

V súlade s týmto vyhotovením sa génová terapia DNA kódujúcej mutantný IL-2 podľa predkladaného vynálezu podáva pacientovi súčasne s alebo ihneď po diagnóze ochorenia.

Tento spôsob využíva výhody selektívnej aktivity mutantných IL-2 podľa predkladaného vynálezu kvôli zabráneniu nežiaducej toxicite a nežiaducim účinkom. Odborníkom v odbore bude jasné, že v tomto vyhotovení sa môže použiť akýkoľvek vhodný vektor pre génovú terapia obsahujúci DNA pre mutantný IL-2. Techniky na prípravu takýchto vektorov sú známe, pozri napríklad Anderson, W. F., Human Gene Therapy, Náture, 392, 25 - 30 (1998); Verma, I. M. a Somia, N., Gene Therapy - Promises, Problems and Prospects, Náture, 389, 239 - 242 (1998). Dodanie vektoru obsahujúceho DNA pre

590/B ···· ·· • · · • · · · ·· ·· ·· ···· • · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · · ·· ··· mutantný IL-2 do cieľového miesta sa môže vykonať s použitím akejkoľvek známej techniky.

Kvôli lepšiemu pochopeniu predkladaného vynálezu sú uvedené nasledujúce príklady. Tieto príklady sú iba ilustratívne a nijako neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu. Všetky citované publikácie sú tu uvedené ako odkazy v plnom rozsahu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Produkcia mutantných proteínov v E. coli

Mutantné proteíny boli pripravené miestne cielenou mutagenézou za použitia primérov obsahujúcich kodóny zodpovedajúce požadovaným mutáciám, v podstate za použitia spôsobu popísaného v Kunkel, T. A., Roberts, J. D. a Zakour, R. A., „Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection,, (1987), Methods Enzymol., 154, 367 - 382. Stručne, ľudská cDNA pre IL-2 obsahujúca reštrikčné miesta BamHI a Xbal bola subklonovaná do M13 fágového vektoru M13 mp19 (New England Biolabs, Beverly, MA) s použitím rovnakých miest. cDNA pre prirodzený IL-2 sa získala s použitím polymerázovej reťazovej reakcie (,,PCR„) zo súboru cDNA pripraveného z mRNA izolovanej z ľudských lymfocytov periférnej krvi indukovaných 24 hodín forbol-12-myristát-13-acetátom (10 ng/ml). Použité PCR priméry boli pre 5' koniec otvoreného čítacieho rámca IL-2:

5'-CCT CAA CTC CTG AATTCA TGT ACA GGA TGC-3' (SEQ ID NO: 3) a pre 3' koniec otvoreného čítacieho rámca IL-2:

5'-GGA AGC GGA TCC TTA TCA AGT CAG TGT TGA G-3' (SEQ ID NO: 4).

Reštrikčné miesta pre EcoRI (5'-koniec) a BamHI (3'-koniec) sa vložili do každého oligonukleotidu a sú uvedené kurzívou. Použité podmienky PCR boli 1 minúta pri 94 °C, 1 minúta pri 58,7 °C a 1 minúta pri 72 °C po celkovo 25

590/B ···· ·· • · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· •β ···· ·· • · · · • · · • · · · cyklov. Správnosť takto získanej cDNA sekvencie IL-2 bola potvrdená sekvencovaním s použitím Sequenase^R sekvencovacieho gitu (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL), podľa návodu výrobcu. Jednoreťazcová DNA obsahujúca uracil (U-DNA) sa získala transformáciou E. coli kmeňa CJ236 (BioRad Laboratories, Hercules, CA) M13 mp19 obsahujúcim IL-2 cDNA. Miestne cielená mutagenéza využívala všeobecne priméry obsahujúce 15 nukleotidov homológnych k templátovej U-DNA 5' ku kodónom určeným pre mutagenézu, do ktorej nukleotidov boli vkladané požadované zmeny a ďalších 10 nukleotidov homologických k templátovej U-DNA 3' od posledného zmeneného nukleotidu. Najprv bola miestne cielená mutagenéza použitá na vloženie Ncol reštrikčného miesta na začiatok zrelej sekvencie ľudského IL-2. Použitie tohto reštrikčného miesta vkladá N-koncový metionínový zvyšok, ktorý bude riadiť expresiu v cytoplazme E. coli, za použitia napríklad expresného vektoru pET3d. Primérom použitým pre tento účel bol:

5'-GCA CTT GTC ACA AAC ACC ATG GCA CCT ACT TCA AGT-3’ (SEQ ID NO: 5)

Konkrétnymi primérmi použitými na vloženie mutácií v pozíciách D20, N88 a Q126 boli:

D20X: 5'-GGA GCA TTT ACT GCT GNN NTT ACA GAT G-3' (SEQ ID NO: 6)

N88X: 5'-GGG ACT TAA TCA GCN NNA TCA ACG TAA TAG-3' (SEQ ID NO: 7)

Q126X: 5'-GGA TTA CCT TTT GTN NNA GCA TCA TCT C-3' (SEQ ID NO: 8), kde NNN bol nahradený vhodným kodónom pre histidín (CAC) alebo izoleucín (ATC) (v pozícii D20), arginín (CGT), glycín (GGT) alebo izoleucín (ATC) (v pozícii N88) alebo leucín (CTG) (v pozícii Q126). Ďalšie mutácie sa pripravili s použitím podobnej stratégie a vhodného kodónu pre danú mutáciu. Priméry boli fosforylované s použitím T4 polynukleotid kinázy (New England Biolabs, Beverly, MA), podľa návodu výrobcu. Po tepelnom naviazaní priméru na U-DNA templát a extenziou pomocou T7 DNA polymerázy (BioRad Laboratories, Hercules, USA) boli bunky E. coli kmeňa DH5 alfa™ (Gibco BRL, Gaithersburg,

590/B ···· ·· • · ·· • · · · · · · ·· ···· • · · · • · · · ·· ·· • · · · · · • · · · · · ·· ·· ··

MD) transformované 5 μΙ reakčnej zmesi a umiestnili sa na LB médium obsahujúce 0,7 % agaru. Po inkubácii pri 37 °C boli plaky expandované zoškriabaním jedného plaku a jeho prenesením do 2 ml LB média a kultiváciou cez noc pri 37 °C. Jednoreťazcová DNA bola izolovaná s použitím M13 prečisťovacieho gitu (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) podľa návodu výrobcu a klony obsahujúce požadovanú mutáciu sa identifikovali sekvencovanim jednoreťazcovej DNA s použitím Sequenase^R sekvencovacieho gitu (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) podľa návodu výrobcu. cDNA mutantného IL-2 z replikačnej formy DNA zodpovedajúcej plakom obsahujúcim správne mutovanú sekvenciu sa izolovala za použitia Ncol a Xbal a subklonovala do plazmidového vektoru pET3a (Stratagene, San Diego, CA) (Strát.). E. coli kmeňa BL21 sa transformovali vektorom pET3a obsahujúcim mutovanú sekvenciu a kultivovali sa do ABS₂₈o medzi 0,60 a 1,0 a v túto dobu sa pridalo 0,4 mM IPTG kvôli indukcii produkcie mutovaného IL-2.

Príklad 2

Extrakcia a prečistenie mutovaných IL-2 z E. coli hodiny po indukcii sa bunky získali odstredením pri 10 000 x g. Rekombinantné mutantné IL-2 boli renaturované a prečistené najprv dispergovaním buniek v 10 objemoch (objem/hmotnosť za vlhka) sacharózového/Tris/EDTA pufra (0,375 M sacharózy, 10 mM Tris/HCI pH 8,0, 1 mM EDTA). Dispergované bunky boli sonikované 3-krát pri 300 W s 30 sekundovými zotavovacími intervalmi v ľadovom kúpeli, za použitia Missonix model XL2020 sonikátora vybaveného 1 palcovou štandardnou sondou. Sonikovaný materiál sa potom odstredil pri 17 000 x g v priebehu 20 minút pri 4 °C. Peleta, ktorá by mala mať v túto dobu bielu farbu, sa premyla resuspendovaním a odstredením raz v sacharózovom/Tris/EDTA pufre, dvakrát v Tris/EDTA pufre (50 mM Tris/HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA) a nakoniec sa resuspendovala v 10 objemoch 0,1 M Tris/HCI, pH 8,0 pufra (v túto dobu sa odobrala vzorka na analýzu na géli) a odstredila sa v priebehu 20 minút pri 17 000 x g.

590/B ···· ·· • · ·· • · · 9 9 · · ·· ····

9 9 9 · · · ·· ··

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 ·· 99

Peleta sa rozpustila pridaním 3 objemov 8 M guanidínium chloridu v 0,1 M Tris/HCI (pH 8,0) a 0,1 % (obj./obj.) 2-merkaptoetanolu. Po inkubácii po dobu 2 hodiny pri teplote okolia sa vzorka odstredila v priebehu 20 minút pri 17 000 x g. Vzniknutý roztok sa dialyzoval po dobu približne 20 hodín proti 20 objemom 10 mM Tris/HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA pri 4 °C. Roztok sa potom odstredil pri 17 000 x g v priebehu 20 minút, upravil sa pomocou 0,1 % kyseliny trifluóroctovej a prefíltroval sa cez 0,22 mikrónovú filtračnú jednotku. Roztok sa preniesol hneď do silikónovej nádoby a vniesol sa do C8 kolóny (Vydac 208TP54). Mutantné IL-2 sa prečistili za použitia 20 minútového lineárneho gradientu 45 - 885 % acetonitrilu v 0,1 % TFA. Koncentrácia eluovaného proteinu sa stanovila A280 a aminokyselinovou analýzou. Proteín sa potom rozdelil (po 100 ml) do silikónových skúmaviek a uskladnil sa pri -20 °C. Takto prečistený mutovaný proteín zvyčajne vytváral jediný prúžok pri SDS-PAGE (pri farbení striebrom) a kvantifikoval sa aminokyselinovou analýzou (presnosť zvyčajne vyššia ako 90 %).

Príklad 3

Test proliferácie T lymfocytov

Mononukleárne bunky periférnej krvi (PBMC) sa izolovali z približne 100 ml normálnej ľudskej krvi (Irwin Memoriál Blood Bank, San Francisko, CA) riedenej 1:2 v chladnom Dulbeccovom fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (bez Ca²⁺ a Mg²⁺; DPBS). Aplikoval sa Ficol-Paque (Pharmacia) a vzorka sa odstredila kvôli izolácii PBMC a potom sa vykonalo dôkladné premytie v chladnom DPBS. PHA blasty (aktivované T lymfocyty) sa pripravili resuspendovaním buniek v RPMI 1640 obsahujúcom 10 % fetálne hovädzie sérum (Hyclone), do ktorého sa pridalo 1 % (hmot./obj.) každej z nasledujúcich zložiek: L-glutamín; neesenciálne aminokyseliny; pyruvát sodný a antibiotikum - antimykotikum (RPMI médium) s hustotou 1 x 10⁶ buniek/ml. Pridal sa fytohemaglutinín (PHA-P, Sigma) v konečnej koncentrácii 10 ng/ml a bunky sa inkubovali pri 37 °C, 5 % CO2 po dobu 3 dni. Bunky sa odobrali a premyli sa dvakrát v DPBS, resuspendovali sa v RPMI médiu a umiestnili sa na 9631 590/B ···· ·· • · · ·· ···· ·· • · · · · · • · · · ·· ·· • · · · ·· ·· • · · ·· ··· jamkovú platňu s plochým dnom s hustotou 1 x 10⁵ buniek/jamka v 200 μΙ s rôznymi koncentráciami IL-2 alebo mutovaného IL-2 v RPMI médiu. Platne sa inkubovali po dobu 48 hodín pri 37 °C, pulzovali sa 1 μ(3ϊ ³H-tymidínu (DuPont NEN^r, Boston, MA)/jamka po dobu 6 hodín, odobrali sa a merala sa ich rádioaktivita na filtroch zo sklených vláken.

Príklad 4

Test proliferácie NK buniek

Mononukleárne bunky periférnej krvi (PBMC) sa izolovali z približne 100 ml normálnej ľudskej krvi (Irwin Memoriál Blood Bank, San Francisko, CA) riedenej 1 : 2 v chladnom Dulbeccovom fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (bez Ca²⁺ a Mg²*, DPBS). Aplikovalo sa Ficol-Paque (Pharmacia) a vzorka sa odstredila kvôli izolácii PBMC a potom sa vykonalo dôkladné premytie v chladnom DPBS. NK bunky sa separovali od ostatných buniek. Na tento účel sa použil Miltenyi Biotec's git na izoláciu NK buniek (Bergisch Gladbach, Nemecko, kat. č. 465-01). Git sa skladá z dvoch činidiel, separačných kolón a veľmi silne magnetického nosiča. Prvým činidlom je zmes monoklonálnych protilátok CD3, CD4, CD19, CD33 myšieho lgG1 izotypu konjugovaných s hapténom. Toto činidlo je určené na depléciu T lymfocytov, B lymfocytov a myeloidných buniek z PBMC. Predpokladá sa, že pre tento účel sa môže použiť akákoľvek vhodná sada protilátok rozpoznávajúcich tieto typy buniek. Druhým činidlom sú koloidné super-paramagnetické MAC mikrokorálky konjugované s anti-hapténovou protilátkou. Bunky sa resuspendovali v PBS s 0,5 % hovädzím sérovým albumínom a 2 mM EDTA (PBS/EDTA). Objem suspenzie závisí od počtu použitých buniek a je uvedený v návode od Miltenyi Biotec. Zvyčajne sa pri počte buniek 5 x 10⁸ PBMC bunky resuspendujú v 800 μΙ pufre a potom sa použije 200 μΙ každého činidla. Po inkubácii s činidlami sa bunky pridali do kolóny (resuspendovanej v 2 ml pufra). Iné ako NK bunky adherovali na magnet a NK bunky sa izolovali a odoberali z výtokovej frakcie. Bunky sa premyjú, resuspendujú sa v RPMI médiu (ktoré obsahuje RPMI 1640, do ktorého sa pridalo 1 % hmotn./obj.) každej z nasledujúcich zložiek: L31 590/B ···· ·· • · · • · e • · · • · · · ·· ·· ·· ···· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· • · ·

9

9 ·

·· · glutamín; neesenciálne aminokyseliny; pyruvát sodný a antibiotikum antimykotikum (všetko od Gibco, BRL, Gaithersburg, MD); 10 % fetálne hovädzie sérum (Hyclone)) a umiestnili sa na 96-jamkovú platňu s plochým dnom s hustotou 1 x 10⁵ buniek/jamka v 200 μΙ s rôznymi koncentráciami IL-2 alebo mutovaného IL-2 v RPMI médiu. Platne sa inkubovali po dobu 48 hodín pri 37 °C, pulzovali sa 1 μθί ³H-tymidínu (DuPont NEN^R, Boston, MA)/jamka po dobu 6 hodín odobrali sa a merala sa ich rádioaktivita na filtroch zo sklených vláken.

Príklad 5

Mutantné proteíny selektívne aktivujúce T lymfocyty vzhľadom k NK bunkám

Mutantné proteíny boli pripravené miestne cielenou mutagenézou (Kunkel a kol., 1987, Methods Enzymol., 154, 367 - 382) v pozíciách Asp-20, Asp-84, Asn-88 a Gln-126 a boli exprimované v E. coli s použitím pET-3a expresného systému podľa návodu výrobcu (Stratagene). Mutantné proteíny sa prečistili z inklúznych teliesok v guanidíne-HCI, znova sa zložili a spracovali chromatografiou s použitím HPLC, ako bolo popísané prv. Získaný proteín mal podľa striebrom farbenej SDS-PAGE viac ako 95 % čistotu a analyzoval sa na koncentráciu a čistotu aminokyselinou analýzou (AAA presnosť zvyčajne väčšia ako 90 %). Sekvencia mutantných proteínov vykazujúcich vhodnú aktivitu bola potvrdená hmotnostnou spektrometriou. Takto prečistené mutantné proteíny sa testovali v testoch proliferácie T lymfocytov a NK buniek, ako bolo popísané vyššie. Relatívne aktivity pre mutantné IL-2 v testoch na lymfocytoch a NK bunkách sú uvedené v tabuľke 1.

590/B ···· ·· ·· ···· ·· • · · ·· · · · ·

Tabuľka 1 Mutantné proteíny hodnotené na selektívnu aktivitu pre T lymfocyty

Mutantný proteín	Relatívna aktivita
	T vs. NK bunky	T bunky	NK bunky
wt IL-2	1	1,00000	1,00000
D20 mutanti
D20A	5	0,00024	0,00005
D20H	3900	0,37081	0,00009
D20I	7600	4,59635	0,00061
D20K	330	0,06301	0,00019
D20L	100	0,00063	0,00001
D20M	490	0,05372	0,00011
D20N	160	0,03000	0,00019
D20Q	100	0,03180	0,00032
D20R	33	0,00018	0,00001
D20S	170	0,06640	0,00038
D20T	1	1,00000	1,00000
D20 V	10	0,00093	0,00009
D20Y	1000	0,06587	0,00007
N88 mutanti
N88A	50	0,50000	0,01
N88E	10	0,01172	0,00115
N88F	22	0,02222	0,001
N88G	980	8,33333	0,00853
N88H	3	0,00100	0,001
N88I	9600	0,98074	0,00010
N88K	3	0,00010	0,00032
N88L	4	0,00400	0,001

590/B ·· ·· ····

9999

999

9 9 • · ·

9 ·

9 9 ·

99 >9

9 9 9 9 • 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99 99

N88M	250	0,25000	0,001
N88R	6200	0,89730	0,00015
N88S	80	0,00200	0,16000
N88T	395	0,50000	0,001266
N88V	67	0,06670	0,001
N88W	1	0,00100	0,001
N88Y	8	0,00800	0,001
Q126 mutanti
Q126A	0,30	0,01743	0,05809
Q126D	240	0,14630	0,00061
Q126E	400	10,0000	0,02500
Q126F	32	0,87358	0,02749
Q126G	100	0,55556	0,00556
Q126H	0,03	0,02216	0,73875
Q126I	33	0,00100	0,00003
Q126K	1,0	1,00000	1,00000
Q126L	680	3,06186	0,00447
Q126M	9,1	19,94092	2,19298
Q126N	10	6,57895	0,64993
Q126P	3,0	0,00032	0,00011
Q126R	11	4,02695	0,36392
Q126S	33	0,03417	0,00103
Q126T	3,3	0,00010	0,00003
Q126V	330	1,00556	0,00302
Q126W	1,0	0,20000	0,20000
Q126Y	10	0,88500	0,08850

590/B ···· ·· • · · · · • · · · · • · · · · · • · · · 9 · ·· ·· ·· ·· ···· • · • · · · • · e • · · · ·· ·· ·

Aktivity mutantných proteínov sú popísané podľa relatívnej koncentrácie mutantného proteínu nutnej na dosiahnutie 50 % maximálnej odpovede (EC50) v porovnaní s EC50 prirodzeného IL-2 v rovnakom teste; v prípade viacerých testov pre rovnaký mutovaný proteín sú uvedené hodnoty geometrických priemerov. Hodnota EC50 pre prirodzený IL-2 je v rozmedzí od 10 pM do 150 pM v teste na T lymfocytoch a od 50 pM do 200 pM v teste na NK bunkách. Pomer aktivity mutantných proteínov pre T lymfocyty a NK bunky je vyjadrený ako relatívna aktivita mutantného proteínu na T lymfocytoch delená relatívnou aktivitou mutantného proteínu na NK bunkách. Tento pomer je určený pre každý mutantný proteín s použitím iba aktivity získanej z testov na T lymfocytoch a NK bunkách využívajúcich bunky od jedného darcu.

Aktivity mutantných proteínov sa môžu klasifikovať do 6 všeobecných kategórii: (1) 1000-násobná selektivita pre T lymfocyty; (2) viac ako 100-, ale menej ako 1000-násobná selektivita pre T lymfocyty; (3) viac ako 10-, ale menej ako 100-násobná selektivita pre T lymfocyty; (4) zlepšená aktivita na T lymfocyty vzhľadom k IL-2; (5) selektivita pre NK bunky; (6) 10-násobná selektivita buď pre T lymfocyty alebo pre NK bunky.

Trieda 1: D20H, I a Y; N88G, I a R.

Trieda 2: D20K, L, M, N, Q a S; N88M a T; Q126D, E, G, L a V.

Trieda 3: D20R; N88A, E, F, S a V; Q126F, I, N, R a S.

Trieda 4: D20I; N88G; Q126E, L, M, N a R.

Trieda 5: Q126A, H.

Trieda 6: D20A, T a V; N88H, K, L, W a Y; Q126K, P, T, W a Y.

V triedach 1 - 3 sú výhodné mutantné proteíny tie, ktoré majú aktivitu na T lymfocytoch rovnakú ako IL-2 alebo lepšiu. V triede 1 toto spĺňa D20H a I; N88G, I a R; v triede 2 N88M a T; Q126D, E, G, a V; v triede 3 N88A, Q126F a G. Mutantné proteíny v triede 4 by mali mať vyššiu účinnosť ako prirodzený IL2 in vivo.

590/B ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· ···· • · · • · · • · · • · · · ·· ··

Ako je vidno z tabuľky 1, žiadna jediná mutácia neviedla kinaktivite mutantného IL-2 v oboch testoch. Avšak možno predpokladať, že kombinácia mutácií, ktoré vedú k vážnemu narušeniu aktivity, bude potenciálne viesť k zisku antagonistu IL-2 na T lymfocytoch alebo na iných typoch buniek nesúcich vysoko afinitný receptor pre IL-2. Takýto antagonista je predpovedateľný z týchto dát, pretože mutácie boli navrhnuté iba kvôli zmene interakcií s IL-2R beta a IL-2R gama. Jedným takýmto príkladom je dvojito mutovaný proteín D20R/Q126T. Kombinácia slabo aktívnych mutácií v jednej molekule by mala mať kombinatoriálny charakter, to znamená, že keď má D20R 0,00018 aktivitu na T lymfocytoch a Q126T má 0,0001 aktivitu na T lymfocytoch, mal by dvojito mutovaný proteín D20R/Q126T mať 0,000000018 aktivitu prirodzeného IL-2 na T lymfocytoch. Ďalšie kombinácie sa môžu pripraviť podľa uvedených dát.

Príklad 6

Biologická aktivita prirodzeného IL-2 a mutovaných IL-2

Obr. 1 až 7 ukazujú krivky dávka - odpoveď pre prirodzený ľudský IL-2 (IL-2) a D20H (obr. 1), IL-2 a D20I (obr. 2), IL-2 a N88G (obr. 3), IL-2 a N88I (obr. 4), IL-2 a N88R (obr. 5), IL-2 a Q126E (obr. 6) a IL-2 a Q126L (obr. 7). A: jednotlivé krivky závislosti od dávky IL-2 (plné krúžky) a mutantného proteínu (prázdne krúžky) pre test proliferácie primárnych ľudských T lymfocytov (PHA blastov). B. jednotlivé krivky závislosti od dávky IL-2 (plné trojuholníčky) a mutantného proteínu (prázdne trojuholníčky) pre test proliferácie primárnych ľudských NK buniek.

Pre pokus popísaný na obr. 1 je dávka prirodzeného IL-2 vedúca k 50 % maximálnej proliferácii (EC50) približne 1,5 x 10'¹° M pre T lymfocyty (A) a približne 1 x 10'¹⁰ M pre test na NK bunkách (B). EC50 pre D20H je približne 2 x 10‘¹° v tomto teste na T lymfocytoch, ale je menšia ako 1 x 10‘⁵ M v tomto teste na NK bunkách. Čisté zlepšenie v aktivite D20H na T lymfocyty vzhľadom k aktivite na NK bunky je tak viac ako 50 000-násobné, ako bolo stanovené

590/B

9999 99 99 9999 99

999 99 9 999 · 9 9 · 9 9 9

99» 9 999 9 v tomto teste. Podobné výsledky sa získali z krvi od ďalších darcov (dáta nie sú uvedené).

Pre pokus popísaný na obr. 2 je dávka prirodzeného IL-2 vedúca k 50 % maximálnej proliferácii (EC50) približne 1,5 x 1O'¹⁰ M pre T lymfocyty (A) a približne 3 x 1O'¹⁰ M pre test na NK bunkách (B). EC₅o pre D20I je tiež približne 1,5 x 1O'¹⁰ v tomto teste na T lymfocytoch, ale je iba 5 x 10^-6 M v tomto teste na NK bunkách. Čisté zlepšenie v aktivite D20I na T lymfocyty vzhľadom k aktivite na NK bunky je tak viac ako 16 000-násobné, ako bolo stanovené v tomto teste. Podobné výsledky sa získali z krvi od ďalších darcov (dáta nie sú uvedené).

Pre pokus popísaný na obr. 3 je dávka prirodzeného IL-2 vedúca k 50 % maximálnej proliferácii (EC50) približne 4 x 10'¹¹ M pre T lymfocyty (A) a približne 2 x 1O'¹⁰ M pre test na NK bunkách (B). EC50 pre N88G je približne 5 x 10‘¹² v tomto teste na T lymfocytoch, ale je iba 3 x 10’⁸ M v tomto teste na NK bunkách. Čisté zlepšenie v aktivite N88G na T lymfocyty vzhľadom k aktivite na NK bunky je tak viac ako 1200-násobné, ako bolo stanovené v tomto teste. Podobné výsledky sa získali z krvi od ďalších darcov (dáta nie sú uvedené).

Pre pokus popísaný na obr. 4 je dávka prirodzeného IL-2 vedúca k 50 % maximálnej proliferácii (EC50) približne 1,5 x 10'¹° M pre T lymfocyty (A) a približne 1 x 10'¹° M pre test na NK bunkách (B). ECso pre N88I je približne 4 x 1O'¹⁰ v tomto teste na T lymfocytoch, ale je iba 5 x 10‘⁶ M v tomto teste na NK bunkách. Čisté zlepšenie v aktivite N88I na T lymfocyty vzhľadom k aktivite na NK bunky je tak viac ako 18 000-násobné, ako bolo stanovené v tomto teste. Podobné výsledky sa získali z krvi od ďalších darcov (dáta nie sú uvedené).

Pre pokus popísaný na obr. 5 je dávka prirodzeného IL-2 vedúca k 50 % maximálnej proliferácii (EC50) približne 1,5 x 10'¹⁰ M pre T lymfocyty (A) a približne 1 x 10'¹⁰ M pre test na NK bunkách (B). EC50 pre N88R je približne 9 x 10'¹¹ v tomto teste na T lymfocytoch, ale je iba 3 x 10'⁷ M v tomto teste na NK bunkách. Čisté zlepšenie v aktivite N88R na T lymfocyty vzhľadom k aktivite na NK bunky je tak viac ako 5000-násobné, ako bolo stanovené v tomto teste. Podobné výsledky sa získali z krvi od ďalších darcov (dáta nie sú uvedené).

590/B ···· ·· ··· ·· · ··· ··· · · · e· • · ··· · ··· · ···· ···· a · a· ·· aa a· ·· a ·· ····

Pre pokus popísaný na obr. 6 je dávka prirodzeného IL-2 vedúca k 50 % maximálnej proliferácii (EC50) približne 8 x 10'¹² M pre T lymfocyty (A) a približne 5 x 10'¹¹ M pre test na NK bunkách (B). EC₅₀ pre Q126E je približne 8 x 10'¹³ v tomto teste na T lymfocytoch, ale je iba 2 x 10'⁹ M v tomto teste na NK bunkách. Čisté zlepšenie v aktivite Q126E na T lymfocyty vzhľadom k aktivite na NK bunky je tak viac ako 400-násobné, ako bolo stanovené v tomto teste. Podobné výsledky sa získali z krvi od ďalších darcov (dáta nie sú uvedené).

Pre pokus popísaný na obr. 7 je dávka prirodzeného IL-2 vedúca k 50 % maximálnej proliferácii (EC50) približne 5 x 10'¹¹ M pre T lymfocyty (A) a približne 8 x 10’¹¹ M pre test na NK bunkách (B). EC50 pre Q126L je tiež približne 2 x 10’¹¹ v tomto teste na T lymfocytoch, ale je iba 2 x 10’⁸ M v tomto teste na NK bunkách. Čisté zlepšenie v aktivite Q126L na T lymfocyty vzhľadom k aktivite na NK bunky je tak viac ako 625-násobné, ako bolo stanovené v tomto teste. Podobné výsledky sa získali z krvi od ďalších darcov (dáta nie sú uvedené).

Príklad 7

Štúdia toxicity na šimpanzoch

IL-2/N88R bol vybraný z mutantných IL-2 proteínov uvedených v tabuľke 1 preto, že vykazoval selektívnu agonistickú aktivitu pre T lymfocyty v teste na primárnych ľudských T lymfocytoch a NK bunkách. Vzhľadom k prirodzenému IL-2 je 6000-krát aktívnejší na T lymfocyty ako na NK bunky a vykazuje v podstate rovnakú aktivitu na T lymfocytoch ako prirodzený IL-2. IL-2/N88R bol produkovaný v CHO bunkách, prečistený a hodnotený na šimpanzom modeli aktivity a toxicity IL-2. V tomto in vivo modeli sa vykazuje aktivita na T lymfocyty porovnateľná s aktivitou komerčne dostupného rekombinantného variantu IL-2 (Proleukín™, Chiron Corporation, Emeryville, CA), ale indukuje iba mierne nežiaduce účinky v porovnaní s týmto prípravkom (ako v zmysle objektívnych, tak klinických parametrov).

590/B ···· ·· ·· ···· ·· ··· ·· · ··· • · · · · · t • · · · · · ··· · ·· ·· · · ·· ·· ·

A. Usporiadanie štúdie

1. Materiály a metódy

Časť štúdie prebiehajúca za života zvierat sa vykonala v New Iberia Research Center (New Iberia, LA, Sponsor Bayer Corporation, Berkeley, CA) a skladala sa z dvoch fáz, v ktorých sa použilo 11 dospelých alebo mladých šimpanzov s telesnou hmotnosťou v rozmedzí od 45 do 70 kg.

Fáza I štúdie bola fáza stanovenia dávky a pri nej sa podávala podkožná dávka vehikulá alebo dávka Proleukínu (1,2 mg/m²) dvakrát denne (BID) po dobu 5 dní. Fáza II štúdie bolo porovnanie vehikulá, Proleukínu a IL-2/N88R podávaných podkožné každých 12 hodín (q12h) po dobu 5 dní. Dávka IL2/N88R bola vybraná tak, aby sa dosiahli účinky porovnateľné s Proleukínom podľa farmakokinetickej analýzy. Vzorky krvi sa odoberali na biochemické vyšetrenie krvi, CBC, hematologické vyšetrenie/vyšetrenie koagulácie a na FACS analýzu populácie T lymfocytov a NK buniek, ako je podrobne popísané v časti 5 a 6.

Tabuľka 2A Protokol fázy I

Počet	Počet	Testovaná	Dávka	Frekvencia
skupín	zvierat	substancia
1	1	vehikulum	NA	BID po dobu 5 dní
2	2	Proleukín	1,2 mg/m2	BID po dobu 5 dní

Počet	Počet	Testovaná	Dávka	Frekvencia
skupín	zvierat	substancia
1	2	vehikulum	NA	q12h po dobu 5 dní
2	3	Proleukín	1,2 mg/m2	q12h po dobu 5 dní
3	3	IL-2/N88R	1,2 mg/m2	q12h po dobu 5 dní

590/B • · ·· ···· ···· • · • · • · • · · ·· • · · • · · • · · · · • · · · ·· ·· ·· ·

2. Dávkovanie

V deň štúdie, kedy sa vykonávali odbery krvi, boli zvieratá uvedené do celkovej anestézie pomocou i.m. podania ketamínu v dávke približne 10 mg/kg pred podaním testovanej substancie alebo vehikulá. V deň štúdie, kedy sa nevykonávali odbery krvi, sa zvieratá znehybnili pomocou klietky pred podaním testovanej substancie alebo vehikulá. Dávka sa podávala podkožnou injekciou každých 12 hodín po dobu 5 dní a miesto injekcie sa oholilo v deň 1 štúdie. Pre každú dávku sa zaznamenalo miesto a doba podania dávky.

3. Klinické pozorovania

a) Denné sledovanie a príjem potravy. Každé zviera sa sledovalo dvakrát denne a akékoľvek abnormálne pozorovanie sa hlásilo riaditeľovi štúdie. Zvieratá, ktoré vyzerali ako choré, sa sledovali riaditeľom štúdie, veterinárom projektu a reprezentantom sponzora. Spotreba potravy sa sledovala a zaznamenávala dvakrát denne podľa vizuálneho sledovania.

b) Telesná hmotnosť. Telesná hmotnosť sa zistila pred štúdiou, pred podaním dávky v deň 1 a zakaždým, keď boli zvieratá anestetizované kvôli odberu krvi.

c) Pozorovanie miesta injekcie. Miesto injekcie sa sledovalo denne. Zaznamenával sa akýkoľvek abnormálny vzhľad, ako napríklad sčervenanie alebo opuch.

590/B ···· ·· ·· ···· ·· ··· ·· · ··· ··· · · · ·· ·· ··· · ··· · ·· ·· ·· ·· ·· ·

Tabuľka 3A Protokol odberu vzoriek vo fáze II

Čas	CBC	Chem.	Koag.	FACS	Sponzorov test
Pred štúdiou	x	x	x	x	x
Deň 1, pred dávkou	x	x	x	x	x
Deň 1,15 minút					x
Deň 3, pred dávkou	x	x	x	x	x
Deň 3,15 minút					x
Deň 6	x	x	x	x	x
Deň 8	x	x	x	x	x
Deň 10	x	x	x	x	x
Deň 12	x	x	x	x	x
Deň 15	x	x	x	x	x
Deň 30	x	x	x	x	x

4. Spracovanie vzoriek

a) Biochemické vyšetrenia séra. Približne 2 ml krvi sa odobrali od každého zvieraťa do skúmaviek vo vyššie uvedených dobách. Časy odberu krvi sa zdokumentovali a krv sa nechala zraziť pri teplote okolia. Vzorky sa potom odstredili, sérum sa separovalo a odoslalo sa do NIRC Clinical Pathology Laboratory. NIRC štandardný panel biochemického vyšetrenia séra je uvedený v tabuľke 4.

590/B ···· ·· ·· ···· ·· ··· ·· · ··· • · I · · · · • · ··· · ··· · ···· ···· · ·

Tabuľka Panel biochemických vyšetrení séra

Sodík	Fosfor
Draslík	Močovina
Chloridy	Kreatinín
Celkový bilirubín	Celkový proteín
Alkalická fosfatáza	Albumín
Laktát dehydrogenáza (LDH)	Pomer albumínu/globulínov
Aspartát aminotransferáza (AST)	Glukóza
Alanín aminotransferáza (ALT)	Vápnik
Oxid uhličitý (CO2)	Gama - glutamyl transferáza (GGT)

b) Hematologické vyšetrenie. Približne 2 ml krvi sa odobrali od každého zvieraťa do skúmaviek s EDTA vo vyššie uvedených časoch a odoslali sa do NIRC Clinical Pathology Laboratory. NIRC, štandardný hematologický panel, zahrňujúci krvný obraz, diferenciál a počet trombocytov, sa vykonal pre všetky vzorky.

c) Sponzorský test. Približne 6 ml krvi sa odobralo do skúmaviek s EDTA vo vyššie uvedených časoch. Časy odberu krvi sa zdokumentovali. Vzorky sa potom odstredili, plazma sa separovala a rozdelila sa do troch samostatných skúmaviek. Plazma sa uskladnila v zmrazenom stave (-60 °C alebo menej) a odoslala sa do Bayer Corporation, Berkeley, CA, hneď po skončení štúdie.

5. FACS

a) Postup. Približne 5 ml vzorky krvi sa odobrali do heparínu sodného ako antikoagulačného činidla v časoch uvedených pre FACS analýzu.

590/B ···· ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· ···· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · • · ·· ·

Vzorky plné krvi sa získali buď v EDTA, ACD alebo v heparíne. Počet buniek sa upravil tak, aby bol v rozsahu od 2 do 20 tisíc na mm³.

x 75 sklenené alebo plastové skúmavky sa vhodne označili použitým panelom protilátok. Protilátka alebo zmes protilátok sa pridala do skúmaviek v objemoch odporučených výrobcom.

100 μΙ dobre premiešanej vzorky krvi sa pridalo do každej skúmavky a zmes sa inkubovala po dobu 30 minút pri teplote okolia, chránená pred svetlom.

Po inkubácii sa pridali 2 ml roztoku pre lýziu (Becton Dickinson FACS brand lysing solution, BD č. 92-0002), zmes sa jemne premiešala vírením a nechala sa stáť po dobu 10 minút pri teplote okolia. Skúmavky sa potom odstredili pri teplote okolia v priebehu 5 minút pri 300 x g. Supernatanty sa dekantovali, nadbytok kvapaliny sa odsal a ku každej bunečnej pelete sa pridal 1 ml PBS pufra (GIBCO 14190 - 144). Po jemnom premiešaní sa skúmavky odstredili pri teplote okolia v priebehu 5 minút pri 300 x g. Supernatanty sa dekantovali, nadbytok kvapaliny sa odsal pred pridaním 1 ml fixačného roztoku (0,5 % roztok formaldehydu, pripravený riedením 10 % formaldehydu (Polyscience, Inc., č. 0418) 1 : 20 PBS pufrom) k bunečnej pelete a vykonalo sa jemné premiešanie vírením kvôli resuspendovaniu. Vzorky sa potom analyzovali na Coulter EPICS SL prietokovom cytometri.

Protilátky použité pre štúdiu: MlgG1/MlgG1 izotopová kontrola (Becton Dickinson kat. č. 349526), CD45-PerCP (Becton Dickinson kat. č. 347464), CD8-FITC (Becton Dickinson kat. č. 347313), CD25-PE (Becton Dickinson kat. č. 30795X), CD4-FITC (Becton Dickinson kat. č. 340133), CD16-PE (Becton Dickinson kat. č. 347617), CD3-PerCP (Becton Dickinson kat. č. 347344).

6. Profil koagulácie

Približne 2 ml vzorky plnej krvi sa odobrali do skúmaviek s citrátom sodným ako antikoagulačným činidlom vo vyššie uvedených časoch. Koagulačný profil zahrňoval protrombinový čas (PT), aktivovaný parciálny tromboplastínový čas (APTT) a fibrinogén.

590/B ···· · ··· ·· · ··· ··· · · · ·· ·· · · · · ··· · ···· ···· ·· ·· ····

B. Výsledky a diskusia

1. Stanovenie dávky Proleukínu

Primárnym cieľom tejto fázy bola identifikácia optimálnej dávky Proleukínu kvôli porovnaniu s IL-2/N88R. Táto optimálna dávka Proleukínu bola vybraná ako dávka, ktorá je tolerovateľná (nižšia ako maximálna tolerovaná dávka), ktorá ideálne spôsobuje klinicky významnú, ale strednú a reverzibilnú toxicitu. Dávka Proleukínu 1,2 mg/m², BID, bola vybraná ako počiatočná dávka podľa extrapolácie režimov klinického podávania Proleukínu, ich toxicity a vlastných výsledkov vzťahu dávka Proleukínu - odpoveď pre opice makak.

Dva šimpanzy boli liečené týmto spôsobom Proleukínom. Tieto zvieratá sa stávali menej aktívnymi, vyčerpanými a dehydratovanými počas aplikácie dávok. U oboch zvierat došlo k rozvoju závažných gastrointestinálnych príznakov v deň 3 alebo 4, vrátane zníženej chuti k jedlu, hnačiek, zvracania. Podávanie lieku sa skončilo u jedného zvieraťa (č. X-159) po 3 dňoch kvôli vážnej renálnej (obr. 8A, 8B) a stredne ťažkej hepatálnej (obr. 8C, 9D) dysfunkcii zistenej podľa biochemického vyšetrenia krvi. V tomto vyšetrení sa zistila elevácia močoviny (BUN), kreatinínu a celkového bilirubínu, ALT (SGPT). Laktát - Ringerov roztok sa aplikoval i.v. obom zvieratám liečeným Proleukínom v deň 3 a 4 (zviera č. X-159) a v deň 4 iba (zviera X-124) buď pri resuscitácii alebo ako prevencia dehydratácie. Zviera č. X-159 sa vylúčilo zo štúdie v deň 8 z dôvodu renálnej dysfunkcie a možného trombu v ľavej nohe, ktorý sa prejavil veľmi slabým pulzom (femorálnym) a celá končatina bola chladná a opuchnutá. Hoci u jedného zvieraťa sa vyskytli veľmi významné toxické účinky, druhé zviera malo menej závažné toxické účinky a profil nežiaducich účinkov pre obe zvieratá bol reverzibilný. Podľa týchto výsledkov bola dávka 1,2 mg/m² Proleukínu a ekvivalentná dávka (podľa expozície) IL2/N88R, q12 hodín, vybrané ako vhodný dávkový režim kvôli porovnávaniu týchto zlúčenín.

590/B

2. Porovnanie IL-2/N88R s Proleukínom

Klinické pozorovanie. Tabuľka 5 uvádza klinické pozorovania vykonané v priebehu štúdie. Hodnoty sú vyjadrené v stupnici 1 až 5, kde 5 označuje vážny stav. Všetky zvieratá liečené Proleukínom boli ťažko choré; pozorovalo sa jedno úmrtie spojené s Proleukínom. Hodnoty popísané po dni 6 pre skupinu liečenú Proleukínom odrážajú dáta pre zvyšné dve zvieratá. Najčastejším vedľajším účinkom liečenia IL-2/N88R sa zdali byť mierne Gl ťažkosti (emézia), hoci liečenie neindukovalo nominálnu toxicitu v zmysle parametrov uvedených v tabuľke 4. Telesná hmotnosť v skupine liečenej Proleukínom sa znížila o 6 % v deň 6 a ďalej sa znížila až o 10 % v deň 10 a potom sa zvoľna opäť zvyšovala (pozri obr. 9). Naopak, skupiny liečené vehikulom a IL-2/N88R mali najviac 1 3 % úbytok hmotnosti.

Tabuľka 5 Klinické pozorovanie*

Liečenie	Celkový stav	Strata chuti k jedlu	Letargia	Gl	Nepokoj
IL-2/N88R	dobrý	1	1	5	1
Proleukín	ťažko chorý	5	4/5	5	4/5
Vehikulum	normálny	0	0	0	0

* rozmedzie 1 až 5, kde 5 označuje najzávažnejší stav

a) Hematológia. IL-2/N88R indukoval bunečné účinky súhlasné s aktiváciou Proleukínom, konkrétne lymfocytózu (obr. 10A); zvýšenie počtu leukocytov (obr. 10B) a neutrofilov (obr. 10C) sa tiež zaznamenalo. IL-2/N88R indukoval iba marginálnu trombocytopéniu (nadir približne 15 %) v porovnaní s Proleukínom (nadir približne 50 %) v priebehu liečebnej časti štúdie (obr. 10D).

590/B ···· ·· ··· ·· · ··· ··· · · · I · • · ··· · ··· · ···· ···· · · ·· ····

b) Renálna funkcia. BUN hladiny boli u všetkých zvierat liečených Proleukínom badateľne vyššie v dni 6 a 8 (obr. 11A). BUN koncentrácie boli vyššie ako 130 mg/dl u dvoch z týchto zvierat; koncentrácia kreatinínu sa tiež dramaticky zvýšila u dvoch zvierat v dni 6 a 8 (obr. 11 B), čo ukazuje na celkové zníženie renálnych funkcií. Okrem toho sa v skupine liečenej Proleukínom tiež zvýšila v dni 6 a 8 sérová koncentrácia fosforu a aniónová medzera. Naopak, u zvierat liečených IL-2/N88R zostávali tieto parametre počas štúdie v podstate normálne (obr. 11C a D).

c) Pečeňové funkcie. Celkový bilirubín sa viac ako strojnásobil v skupine liečenej Proleukínom v deň 6 a zostával vo vysokých hodnotách v dni 10 (obr. 12A). Naopak, iba jedno zviera v skupine liečenej IL-2/N88R malo prechodné, mierne zvýšenie v deň 3 a deň 6. Sérové koncentrácie SGPT sa dramaticky zvýšili a dosiahli hodnoty vyššie ako 100 U/l u všetkých zvierat liečených Proleukínom v deň 6 (obr. 12B). Koncentrácia SGPT u zvieraťa č. A199 dosiahla 651 U/l a SGOT 2789 U/l (Lab Note Book: NIRC č. 8754-9852-Phase II, Tabuľka 1, Individual and Group Mean Chemistry Values, str. 17 z 21 strán tabuľky), čo ukazuje na závažné pečeňové zlyhanie.

d) Koagulácia. Koncentrácia fibrínogénu sa viac ako zdvojnásobila v skupine liečenej Proleukínom i IL-2/N88R a dosiahla vrchol v deň 6 (obr. 12C). Zdá sa, že zvýšenie prebehlo prv v skupine liečenej Proleukínom ako v skupine liečenej IL-2/N88R. Toto je zrejmé na zvýšení o 51 % vs. 5 % v deň 3. Zmeny v koncentrácii fibrínogénu môžu byť dôsledkom akútnej proteínovej reakcie, skôr ako defektov koagulácie, pretože neboli zrejmé významné zmeny v APTT alebo PT v rovnakom období (obr. 12D). Avšak od dňa 10 sa hodnoty APTT začali mierne zvyšovať v skupine liečenej Proleukínom, hoci absolútne hodnoty zostávali v normálnom rozmedzí. Rovnaký trend, ale v menšom rozsahu, sa tiež pozoroval v skupine liečenej IL-2/N88R. Avšak je zaujímavé, že koncentrácie fibrínogénu sa znížili v rovnakej dobe v oboch skupinách.

e) Homeostáza. Koncentrácia sodíka vsére sa znížila na 135 MEQ/I u dvoch z troch zvierat liečených Proleukínom v deň 8, ale zostala normálna u ostatných zvierat (obr. 13A). Koncentrácie chloridov sa v skupine liečenej Proleukínom

590/B

•	··	··	····	··
•	• · • ·	• •	• · • ·	• · • ·	··
•	• · ··	• · ··	• · ··	• · · ··	··

tiež znížili pod 95 MEQ/1 odo dňa 3 a zostávali nízke do dňa 15 (obr. 13B). Koncentrácia vápnika bola nižšia u dvoch z troch zvierat liečených Proleukínom v dni 6 a 8 a znížila sa až na 4,9 a 3,1 mg/dl u zvieraťa A199 (obr. 13C). Koncentrácie draslíka sa znížili na 3 MEQ/I v dňoch 3 až 12 u všetkých zvierat liečených Proleukínom s výnimkou zvieraťa A199, u ktorého sa koncentrácia draslíka zvýšila na toxickú koncentráciu 7,2 MEQ/I pred vyradením zvieraťa zo štúdie (obr. 13D).

f) Známky zvýšenej priepustnosti kapilár. Koncentrácia sérového albumínu sa znížila ako v skupine liečenej Proleukínom (37 %), tak v skupine liečenej IL2/N88R (19 %) (obr. 14A). Vyšší hematokrit sa pozoroval v skupine liečenej Proleukínom v dni 3 a 6 (obr. 14B), naopak, hematokrity sa znížili v rovnakú dobu ako v skupine liečenej vehikulom, tak IL-2/N88R, a zostávali nízke, čo ukazuje na miernu anémiu spôsobenú mnohými odbermi krvi (obr. 14B a C). Zvýšenie hematokritu v skupine liečenej Proleukínom spoločne so znížením koncentrácie albumínu ukazuje na vznik syndrómu zvýšenej priepustnosti kapilár.

3. Aktivácia buniek

Účinnosť Proleukínu a IL-2/N88R sa sledovala podľa zmien percenta CD25 pozitívnych lymfocytov (migrácia + proliferácia) a priemernej fluorescencie pre CD25 alebo počtu CD25 antigénov exprimovaných na povrchu daných T lymfocytov (CD25 = nízko afinitné IL-2R). Expresia CD25 bola sledovaná na celkovej populácii T lymfocytov (CD3+ buniek), rovnako ako na CD3+ CD4+ a CD3+ CD8+ populáciách.

Aktivita IL-2 na NK bunky sa sledovala pomocou analýzy zmien v populácii CD3-CD16+ a CD3-CD25+CD16+ NK buniek. Absolútne počty CD3+, CD4+, CD8+, NK buniek boli vypočítané násobením percenta buniek počtom lymfocytov na mm³, kde táto hodnota sa získala počas hematologického vyšetrenia.

590/B ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· ···· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ··

a) Regulácia expresie CD25 na povrchu T lymfocytov. Percento aktivovaných T lymfocytov, ako je určené percentom CD25 pozitívnych buniek, sa zvýšilo v deň 6 štúdie, väčšinou na CD3+CD4+ subpopuláciu T lymfocytov. Zdá sa, že Proleukín indukuje expresiu CD25 na vyššom percente CD3+, CD3+CD4+ a CD3+CD8+ subpopuláciu T lymfocytov v deň 6. Avšak v deň 8 bolo percento buniek exprimujúcich CD25 antigén identické pre lymfocyty šimpanzov liečených Proleukínom a šimpanzov liečených IL-2/N88R (obr. 15A, B a C). Žiadne farbenie na CD25 na povrchu prirodzených zabijakov (NK) buniek sa nepozorovalo ani u šimpanzov liečených Proleukínom, ani IL-2/N88R. Chýbanie expresie IL-2R alfa (antigénu bunečného povrchu farbeného CD25) na povrchu vybranej populácie NK buniek (CD3-/CD16+) je pravdepodobne zodpovedné za tento výsledok.

Absolútny počet CD3+CD25+ T lymfocytov sledoval rovnaký vývoj ako percentuálne zastúpenie CD3+CD25+ T lymfocytov s tým, že Proleukín sa zdal byť aktívnejší ako IL-2/N88R (obr. 16A). IL-2/N88R vykazoval podobný aktivačný potenciál na T lymfocyty ako Proleukín pre CD3+CD4+ T lymfocyty, rovnako tak ako bolo zvýšenie absolútneho počtu CD3+CD4+CD25+ lymfocytov indukované IL-2/N88R rovnaké ako zvýšenie indukované Proleukínom (obr. 16B). Zdalo sa, že Proleukín indukoval zvýšenie počtu CD3+CD8+CD25+ T lymfocytov väčšie ako IL-2/N88R (obr. 16C).

Počet CD25 molekúl (priemer fluorescencie) exprimovaných na CD3+CD4+ subpopulácie T lymfocytov sledoval podobné kinetiky ako pri liečení Proleukínom, tak IL-2/N88R (obr. 17).

b) Presuny lymfocytov: efekty liečenia Proleukínom a IL-2/N88R

Vplyv Proleukínu a IL-2/N88R na populáciu T lymfocytov a NK buniek sa stanovil pomocou analýzy zmien absolútneho počtu cirkulujúcich lymfocytov pred, počas a po liečení (obr. 18). Zdalo sa, že IL-2/N88R má väčší vplyv ako Proleukín na zvýšenie absolútneho počtu cirkulujúcich CD3+CD4+ lymfocytov (obr. 18A) a o niečo menší vplyv ako Proleukín na zvýšenie absolútneho počtu cirkulujúcich CD3+CD8+ lymfocytov (obr. 18B). Obe zlúčeniny mali porovnateľný, aj keď slabý, vplyv na zvýšenie celkového počtu CD3+

590/B ···· ·· ·· ···· ··· · · · · · · ··· ··· ·· ·· ··· · · · · · ···· · · · · ·· ·· ·· ·· ·· ·· · lymfocytov (obr. 18C). Ani Proleukín, ani IL-2/N88R neovplyvňovali presun NK buniek (obr. 18D).

C. Záver

IL-2/N88R bol pripravený pomocou vyšetrovania mutantných IL-2 proteínov v testoch na primárnych ľudských T lymfocytoch a NK bunkách. Vykazuje in vitro približne 6000-násobnú selektivitu pre T-lymfocyty vzhľadom k NK bunkám. Vzhľadom k jeho bunkovému profilu sa predpokladá, že bude indikovať iba mierne vedľajšie účinky pri podaní v dávkach, ktoré budú vyvolávať významnú aktiváciu T lymfocytov. Pokusy na šimpanzoch, porovnávajúce Proleukín s IL-2/N88R potvrdili, že IL-2/N88R má poznateľné lepší profil bezpečnosti ako Proleukín a zároveň si zachováva porovnateľnú schopnosť indukovať aktiváciu T lymfocytov.

Príklad 8

Účinnosť selektívneho agonistu IL-2 N88R v myšom modeli pľúcnych metastáz nádoru CT-26

Protokol: Myšiam (Balb/c samice, vek 6-8 týždňov) bolo intravenózne podané 1 x 10⁵ CT-26 buniek (myší karcinóm hrubého čreva) v 0,2 ml PBS do laterálnej chvostovej žily v deň 0. Liečba Proieukínom alebo IL-2/N88R v rôznych dávkach (riedidlo: 5% dextróza vo vode (D5W) alebo D5W, podávaná i.v., raz denne po dobu 8 dni (QD x 8) bola zahájená 1 deň po implantácii. IL-2/N88R bol pripravený pri teplote okolia riedením do D5W za použitia silikonovaných skúmaviek pomocou tuberkulínovej injekčnej striekačky a dávka bola podaná zvieratám počas 2 hodín po príprave. Proleukín bol pripravený pridaním 0,7 ml sterilnej vody pre injekcie (SWFI) do každej skúmavky (konečná koncentrácia 1,86 mg/ml). Riedenia boli vykonané rovnako ako riedenia pre IL-2/N88R do D5W (tabuľka 6). Zvieratá boli utratené v deň 11. Pľúca boli odstránené a zvážené, premyli sa v PBS a tkanivo sa prenieslo do Bouinovho roztoku. O 24 hodín neskôr sa tkanivo prenieslo do 10 %

590/B ···· ·· ·· ···· ·· · ··· ·· · ···· ··· ··· ··· • · ··· · ··· · · ···· ···· ·· · ·· ·· ·· ·· ·· ··· formalinu. Počet metastatických kolónií v pľúcach sa spočítal pod disekčným mikroskopom.

Tabuľka 6 Dávky a skupiny v štúdii na myšom modeli CT-26 nádore

Skupina	n	Liečenie	Dávka, mg/kg
1	14	D5W	NA
2	11	Proleukín	3 mg/kg
3	11	Proleukín	10 mg/kg
4	11	IL-2/N88R	1 mg/kg
5	12	IL-2/N88R	3 mg/kg
6	12	IL-2/N88R	10 mg/kg
7	12	IL-2/N88R	30 mg/kg
8	11	IL-2/N88R	60 mg/kg

Tabuľka 7 ukazuje počet metastáz u jednotlivých myší. Porovnateľná účinnosť sa pozorovala pre IL-2/N88R i pre Proleukín. Pri vysokej dávke IL2/N88R (skupina 8, 60 mg/kg) mali všetky okrem jednej myši 12 metastáz alebo menej; 3 myši nemali žiadne metastázy. Toto je v protiklade k najvyššej testovanej dávke Proleukínu, pri ktorej mali všetky prežívajúce myši 12 metastáz alebo viac.

590/B ···· ·· ·· ···· ·· • · · ·· · ··· ··· · · · ·· • · ··· · ··· · ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·

Tabuľka 7 Jednotlivé počty metastáz a priemery metastáz

Skupín a	Pľúcne metastázy (sú uvedené počty pre jednotlivé myši)
1	0	129	183	179	155	165	200	152	148
2	118	126	107	111	118	110	137	114	135
3	12	38	18	19	30
4	169	173	189	200	120	117	136	122	200
5	171	176	186	159	192	139	117	200	195
6	92	111	112	114	109	84	68	47	58
7	15	13	59	62	23	55	46	16	9
8	7	0	3	2	4	9	7	0	12

						Priemer	SEM	P hodnota (2-cestná)
1	158	200	194	165	125	154	13,42
2	158	132				124	4,61	0,07278
3						23	4,66	0,00003
4	163	110				154	10,41	0,97029
5	116	192				168	9,31	0,43401
6	49	112				87	8,16	0,00060
7	4	8	2			26	6,57	0,00000
8	55	0				9	4,75	0,00000

590/B ···· ·· ·· ···· ·· · ··· ·· · ···· ··· · · · ··· ·· ··· · ··· · · ···· ···· ·· · ·· ·· ·· ·· ·· ···

Štatisticky významné (p < 0,05) zníženie počtu metastáz sa pozorovalo u myší liečených IL-2/N88R v dávkach 10, 30 a 60 mg/kg (skupiny 6, 7 a 8, v príslušnom poradí) a v skupine liečenej 10 mg/kg Proleukínu (skupina 3). Tieto výsledky sú znázornené graficky na obr. 19. Dáta sú v grafe ako log dávky: pre Proleukín boli dávky 3 a 10 mg/kg; pre IL-2/N88R boli dávky 1, 3, 10, 30 a 60 mg/kg. Vypracovanie krivky za použitia nelineárnej rovnice (4parametrická zhoda) viedlo k zisku hodnôt IC50 5,2 mg/kg pre Proleukín a 10,9 mg/kg pre IL-2/N88R.

Z dát získaných v tomto pokuse bola hodnota IC50 pre zníženie počtu metastáz pre IL-2/N88R vypočítaná na 10,9 mg/kg (8,6 - 13,9 mg/kg pri 95 % intervale spoľahlivosti) a pre Proleukín bola vypočítaná na 5,2 mg/kg (3,5 - 7,7 mg/kg pri 95 % intervale spoľahlivosti).

Prežívanie myší je uvedené v tabuľke 8. V skupine s 10 mg/kg Proleukínu uhynula jedna (1) myš v deň 7 a ďalších päť (5) myší uhynulo v deň 8. Jedna (1) myš uhynula v deň 8 v každej skupine liečenej 3 alebo 10 mg/kg IL-2/N88R a žiadne úmrtie sa nepozorovalo v skupinách liečených 1, 30 alebo 60 mg/kg IL-2/N88R. Okrem toho, všetky myši liečené 3 mg/kg Proleukínu a všetky myši liečené 10 mg/kg Proleukínu boli choré; žiadna morbidita sa nepozorovala u myší liečených IL-2/N88R.

Tabuľka 8 Prežívanie myší liečených IL-2/N88R alebo Proleukínom

Skupina	Deň
	0 (%)	7* (%)	8 (%)	11 (%)
D5W1	100	100	100	100
Pro 3 mg/kg2	100	100	100	100
Pro 10 mg/kg2	100	90,9	45,5	45,5
IL-2/N88R 1 mg/kg2	100	100	100	100
IL-2/N88R 3 mg/kg3	100	100	91,7	91,7
IL-2/N88R 10 mg/kg3	100	100	91,7	91,7
IL-2/N88R 30 mg/kg3	100	100	100	100
IL-2/N88R 60 mg/kg2	100	100	100	100

590/B ·· ···· ·· • · · · · · • e · · · • · · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· · ···· ·· • · · • · t

CO · · ·

Ju · · · · ·· ·· n = 14 myší/skupina n = 11 myší/skupina n = 12 myší/skupina žiadne úmrtia sa nepozorovali pred dňom 7.

Proleukínom liečené zvieratá v oboch skupinách bola moribundné. Žiadna morbidita sa nepozorovala u akéhokoľvek zvieraťa liečeného IL2/N88R.

Na záver, táto štúdia naznačuje, že IL-2/N88R je rovnako účinný ako Proleukín v redukcii rastu nádoru (ako je meraný počtom pľúcnych metastáz v CT26 modeli). Ďalej IL-2/N88R je významne menej toxický ako Proleukín.

Príklad 9

Vývoj stabilnej, vysoko produktívnej CHO bunečnej línie exprimujúcej IL2/N88R

Bunečné línie so stabilnou produkciou secernujúcou vysoké množstvá IL-2//N88R mutantného proteínu sa pripravili transfekciou CHO (dhfr-) buniek expresným vektorom uvedeným na obr. 20 (ATCC prírastkové č. _).

Jednotlivé prvky IL2N88R expresného vektora sú uvedené v plazmidovej mape (obr. 20). Táto mapa ukazuje CMVe/p (cytomegalovírusový skorý promótor); PA (SV40 polyadenylačné signálne sekvencie); a DHFR (dihydrofolátreduktázovú expresnú kazetu).

Vektor bol konštruovaný s použitím štandardných techník rekombinantnej DNA. Všeobecne pozri Sambrook a kol., Molecular Cloning, 2. vyd. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Short Protocols in Molecular Biology, 2. vyd., 1992, John Wiley and Sons; Methods in Enzymology, zv. 185, ed. Goeddel a kol., Academic Press, Inc., Londýn, 1991. Expresný vektor

590/B ···· ·· ·· ···· ·· ··· ·· · ·· t t · ··· ·· ·· ··· · ··· · ·· ·· ·· ·· ·· obsahoval samostatné expresné kazety pre IL2N88R gén a amplifikovateľný a selektovateľný gén DHFR (dihydrofolátreduktáza). Približne 1 x 10⁶ CHO (ovariálne bunky čínskeho škrečka) buniek bolo transfektovaných 10 ng pCB1IL2SA s použitím Lipofectí nového činidla (Life Technology Inc., Bethesda, Maryland) podľa návodu výrobcu. Bunky sa potom selektovali za prítomnosti 50 nM metotrexatu a kultivovali sa v DME/F12 médiu (Life Technologies, Inc.) neobsahujúcom tymidín a hypoxantín a obsahujúcom 5 % dialyzované fetálne teľacie sérum. Bunečné populácie sa vyšetrovali na produkcii IL2N88R s použitím komerčného ELISA gitu (R and D Systems). Populácie s vysokou produkciou sa selektovali v médiu obsahujúcom zvyšujúce sa koncentrácie metotrexatu (100 až 400 nM metotrexatu) a vyšetrovali sa na produkciu IL2N88R. Kvôli získaniu klonov s vysokou a stabilnou produkciou sa použilo klonovanie s limitným riedením. Klonovanie sa vykonalo za absencie metotrexatu s použitím štandardných technik tkanivovej kultivácie.

Príklad 10

Bezsérová produkcia IL2N88R v perfúznom bioreaktore

Kontinuálna produkcia IL2N88R sa vykonala s použitím fermentácie s kontinuálnou perfúziou. 19-litrová Wheaton fermentačná nádoba sa naočkovala stabilnou CHO bunečnou líniou z príkladu 9 v dávke 2 x 10⁶ buniek/ml a perfúzia sa vykonávala s rýchlosťou výmeny média 5 l/deň. Produkčným médiom bolo médium na báze DMEM/F12 (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) doplnené rekombinantným ľudským inzulínom (10 pg/l) (HUMULIN™, Eli Lilly, Inc., Indianapolis, IN) a FeSO₄. EDTA (50 μΜ). Hustota buniek sa udržiavala na 4 x 10⁶ buniek/ml. Priemerný denný výťažok bol 200 mg/deň. Produkcia IL2N88R bola stabilne udržiavaná po dobu 30 dní.

590/B ···· ·· ·· ···· ·· ··· ·· · ··· • · · ··· ·· • · ··· · ··· · ·· ·· ·· ·· ·· ···

Príklad 11

Prečistenie IL2/N88R produkovaného v CHO bunkách

Nasledujúci postup sa použil pre eluát perfúzie popísanej vyššie. Perfúzne médium sa odobralo a vnieslo do S-sefarózovej kolóny. Kolóna sa uviedla do rovnováhy 2 milimolárnym fosfátovým pufrom s 5 milimolárnym NaCl pri pH 7,0. Vodivosť média (,,TCF„) sa upravila na 4 milisiemensy pridaním vody a úpravou na rovnaké pH pomocou kyseliny fosforečnej.

Po vnesení TCF do kolóny sa kolóna premyla rovnakým pufrom kvôli uvedeniu do rovnováhy. Eluácia sa vykonala pomocou posunu pH. Mutované proteíny sa eluovali 20 mM etanolamínom, pH 10,5, za zisku S-eluátu.

Aniónová výmena sa vykonala spracovaním S-eluátu na QAE Fast Flow™ kolóne (Pharmacia) uvedenej do rovnováhy 10 mM hydrogénuhličitanovým pufrom pri pH 10,5. Prietok sa udržiaval na 250 cm/hod. Po základnom premytí sa IL-2SA eluoval 20 mM fosfátom pri pH 4,0.

Hydroxyapatitová chromatografia (HAP) sa vykonala spracovaním QAE eluátu (1 :1 s WFI) na kolóne naplnenej keramickým hydroxyapatitom (Type II, BioRad, Hercules, CA) uvedenej do rovnováhy 0,10 mM fosfátom pri pH 7,0. Prietok sa udržiaval na 250 cm/hod. Po základnom premytí sa IL-2SA eluoval 100 mM fosfátom pri pH 7,0.

Eluát z hydroxyapatitovej kolóny sa spracoval ultrafiltráciou na objem 300 ml na Millipore Pelicon-2 jednotke opatrenej troma PES 5K náplňami (Millipore Corporation, Bedford, MA).

Ultrafiltrovaný HAP eluát sa ďalej prečistil spracovaním na S100HR (Pharmacia) kolóne s vylučovaním podľa veľkosti pri 35 cm/hod. Kolóna sa uviedla do rovnováhy 10 mM fosfátom a 150 mM NaCl pH 7,0.

Zásobný materiál pre gélovú filtráciu sa nariedil WFI kvôli dosiahnutiu vodivosti 4,0 mMhos/cm a znova sa aplikoval do S-sefarózovej kolóny za

590/B ···· ·· ·· ···· ·· • · · ·· · ··· ··· · · t · · • · ··· · ··· · • · · · ···· · B ·· ·· ·· ·· ·· · podmienok popísaných vyššie. IL2SA sa eluoval 10 mM fosfátovým pufrom s 1 molárnym NaCl pri pH 7,0.

Konečný materiál z katiónovej výmeny sa dialyzoval cez noc proti fosfátom pufrovanému salinickému roztoku (PBS) a potom sa riedil sterilným PBS na koncentráciu 6 mg/ml. Získaný nariedený materiál sa potom sterilné filtroval, rozdelil do podielov a zmrazil pri -70 °C. Celkový výťažok bol 65 %.

Ďalšie uskutočnenia vynálezu budú odborníkom v odbore zrejmé. Vynález popisuje spôsob na získanie mutovaných proteínov, ktoré tu nie sú výslovne popísané, ale ktoré spôsobujú aktiváciu T lymfocytov, ako je preukázaná proliferáciou PHA blastov a zníženou proliferáciou NK buniek, a preto patria takto mutované proteíny do rozsahu predkladaného vynálezu. Koncept a pokusy tu popísané možno s použitím heterológnych multimerizačných receptorových systémov použiť na iné cytokíny, hlavne na príbuzné cytokíny IL-7, IL-9 a IL15, IL-10, interferón alfa a interferón gama.

590/B ···· ·· ·· ···· ·· ··· ·· · ··· ··· ··· ·· ·· · · · · ··· · ···· · · · · ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·

Sekvencie

Predkladaný vynález obsahuje nasledujúce sekvencie:

SEQ ID NO: 1: hlL-2 (aminokyselinová sekvencia)

SEQ ID NO: 2: hlL-2 (cDNA)

SEQ ID NO: 3: 5’ PCR primer. IL-2

SEQ ID NO: 4: 3’ PCR primer, IL-2

SEQ ID NO: 5: mutagénny primer pre IL-2 expresný vektor SEQ ID NO: 6: mutagénny primer pre mutácie D20X SEQ ID NO: 7: mutagénny primer pre mutácie N88X SEQ ID NO: 8: mutagénny primer pre mutácie Q126X

590/B ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· ···· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· ·· ·

Zoznam sekvencií <110> Shanefelt, Armén B.

Greve, Jeffrey M.

Jesmok, Gary Lembach, Kenneth J.

Wetzel, Gayle D.

<120> Agonista a antagonista selektívny k IL-2 <130> IL-2 sekvence č. 1-8 <140>

<141>

<150> 09/080080 <160> 8 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Glu 15

His

Ala 1

Pro Thr Ser Ser Ser 5

Thr

Lys Lys Thr 10

Gin Leu Gin

Leu

Leu

Leu

Leu

Asp

Leu

Gin

Met

íle

Leu

Asn

Gly

íle

Asn

Asn

Tyr

Lys

20

25

30

Asn

Pro

Lys

Leu

Thr

Arg

Met

Leu

Thr

Phe

Lys

Phe

Tyr

Met

Pro

Lys

35

40

45

Lys

Ala

Thr

Glu

Leu

Lys

His

Leu

Gin

cys

Leu

Glu

Glu

Glu

Leu

Lys

50

55

60

Pro

Leu

Glu

Glu

Val

Leu

Asn

Leu

Ala

Gin

Ser

Lys

Asn

Phe

His

Leu

65

70

75

80

Arg

Pro

Arg

Asp

Leu

íle

Ser

Asn

íle

Asn

Val

íle

Val

Leu

Glu

Leu

85

90

95

Lys

Gly

Ser

Glu

Thr

Thr

Phe

Met

Cys

Glu

Tyr

Ala

Asp

Glu

Thr

Ala

100

105

110

Thr

íle

Val

Glu

Phe

Leu

Asn

Arg

Trp

íle

Thr

Phe

Cys

Gin

Ser

íle

115

120

125

íle

Ser

Thr

Leu

Thr

130 <210> 2 <211> 465 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120 ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· ···· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· • · · * · • · · • · ·· .

ttacagatga acatttaagt gaagaactca agacccaggg acaacattca tggattacct ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180 tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240 aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300 aettaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360 tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tetgaacaga 420 tttgtcaaag catcatctca acactgactt gataa 465 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cctcaactcc tgaattcatg tacaggatgc <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ggaagcggat ccttatcaag tcagtgttga g 31 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 26 gcacttgtca caaacaccat ggcacctact tcaagt <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggagcattta ctgctgnnnt tacagatg 28 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gggacttaat cagcnnnatc aacgtaatag ^J

<210>	8
<211>	28
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	8

ggattacctt ttgtnnnagc atcatctc

Claims (23)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid obsahujúci mutovaný ľudský interleukín 2 očíslovaný podľa prirodzeného IL-2, kde uvedený ľudský IL-2 je substituovaný v aspoň jednej z pozícií 20, 88 alebo 126, kde uvedený mutovaný proteín prednostne aktivuje T lymfocyty vzhľadom k NK bunkám (prirodzeným zabijakom).
2. 2. Mutovaný ľudský IL-2 podľa nároku 1, v ktorom je uvedená pozícia 20 prirodzeného IL-2 substituovaná.
3. 3. Mutovaný ľudský IL-2 podľa nároku 2, v ktorom je uvedená pozícia 20 prirodzeného IL-2 substituovaná izoleucínom.
4. 4. Mutovaný ľudský IL-2 podľa nároku 2, v ktorom je uvedená pozícia 20 prirodzeného IL-2 substituovaná histidínom.
5. 5. Mutovaný ľudský IL-2 podľa nároku 1, v ktorom je uvedená pozícia 88 prirodzeného IL-2 substituovaná.
6. 6. Mutovaný ľudský IL-2 podľa nároku 5, v ktorom je uvedená pozícia 88 prirodzeného IL-2 substituovaná arginínom.
7. 7. Mutovaný ľudský IL-2 podľa nároku 5, v ktorom je uvedená pozícia 88 prirodzeného IL-2 substituovaná izoleucínom.
8. 8. Mutovaný ľudský IL-2 podľa nároku 5, v ktorom je uvedená pozícia 88 prirodzeného IL-2 substituovaná glycínom.
9. 9. Mutovaný ľudský IL-2 podľa nároku 1, v ktorom je uvedená pozícia 126 prirodzeného IL-2 substituovaná.
10. 10. Mutovaný ľudský IL-2 podľa nároku 9, v ktorom je uvedená pozícia 126 prirodzeného IL-2 substituovaná aspartátom.

    31 590/B

    9999 99 ·· 9999 ·· ·

    9 · 9 ·· · 9 · ··

    9 9 · 999 999

    99 999 · 999 9 9

    999· ···· ·· · ·· 99 ·· ·· 99 999
11. 11. Mutovaný ľudský IL-2 podľa nároku 9, v ktorom je uvedená pozícia 126 prirodzeného IL-2 substituovaná glutamátom.
12. 12. Mutovaný ľudský IL-2 podľa nároku 9, v ktorom je uvedená pozícia 126 prirodzeného IL-2 substituovaná leucínom.
13. 13. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polypeptid podľa nároku 1 v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom.
14. 14. Polynukleotid obsahujúci DNA sekvenciu kódujúcu mutovaný ľudský IL-2 podľa nároku 1 a jeho degenerované varianty.
15. 15. Prokaryotická hostiteľská bunka transformovaná polynukleotidom podľa nároku 14.
16. 16. Vektor obsahujúci polynukleotid podľa nároku 14.
17. 17. Spôsob liečenia cicavca postihnutého ochorením liečiteľným IL-2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie terapeuticky účinného množstva mutovaného ľudského IL-2 podľa nároku 1.
18. 18. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že uvedené ochorenie liečiteľné IL-2 je vybrané zo skupiny zahrňujúcej HIV, nádory vrátane karcinómu ľadvín a malígneho melanómu, autoimunitné ochorenie, infekčné ochorenie, imunodeficiencie vrátane SCID a iné stavy vyžadujúce celkovú stimuláciu imunitného systému.
19. 19. Spôsob selekcie mutovaných IL-2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje hodnotenie mutovaných IL-2 v testoch využívajúcich IL-2R alfa beta gama alebo IL-2R beta gama, kde aktivita mutovaných IL-2 je zvýšená oproti aktivite prirodzeného IL-2 v jednom teste viac ako v druhom.

    31 590/B ···· ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· ···· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· ··
20. 20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že IL-2R alfa beta gama a IL-2R beta gama sú jednotlivé podjednotkové ektodomény receptoru vo vhodnej kombinácii a sú použité na priame meranie väzby mutovaných IL-2 a každý receptorový komplex.
21. 21. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že IL-2 alfa beta gama test využíva reakcie buniek nesúcich IL-2 alfa beta gama a IL-2 beta gama test využíva reakcie buniek nesúcich IL-2 beta gama.
22. 22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že bunkou nesúcou IL-2 alfa beta gama je PHA blast a bunkou nesúcou IL-2 beta gama je NK bunka.
23. 23. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že testom je proliferácia buniek nesúcich IL-2 alfa beta gama a buniek nesúcich IL-2 beta gama.