BRPI9910504B1 - polipeptídeos agonistas e antagonistas seletivos de il-2, polinucleotideos que os codificam, composição farmacêutica contendo os referidos polipeptídeos, vetor e célula hospedeira - Google Patents

Abstract

patente de invenção: <b>"agonistas e antagonistas seletivos de il-2"<d>. a invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma muteína de il-2 humana numerada de acordo com a il-2 do tipo silvestre onde a referida il-2 humana é substituída em pelo menos uma das posições 20, 88 ou 126, por meio das quais a referida muteína preferivelmente ativa as células t sobre as células nk. d20h e i. n88g, i e r, em particular têm uma atividade diferencial de célula t relativa, muito maior do que a il-2 nativa, com predita toxidade in vivo reduzida associada. a invenção também inclui polinucleotídeos codificando para as muteínas da invenção, vetores contendo os polinucleotídeos, células hospedeiras transformadas, composições farmacêuticas compreendendo as muteínas e métodos terapêuticos de tratamento.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍ-DEOS AGONISTAS E ANTAGONISTAS SELETIVOS DE IL-2, POLINU-CLEOTIDEOS QUE OS CODIFICAM, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO OS REFERIDOS POLIPEPTÍDEOS, VETOR E CÉLULA HOSPEDEIRA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido é uma continuação em parte de U.S. N° de série 09/080.080, depositada em 15 de maio de 1998.

FUNDAMENTO 1. Campo da Invenção A invenção refere-se aos campos de farmacologia e imunologia. Mais especificamente, a invenção refere-se a novas composições de substância para seletivamente ativar as células T (PHA-blasts), e tendo ativação reduzida de células Exterminadoras Naturais ("NK"). As novas composições incluem variantes da família citocina, e em particular lnterleucina-2 humana ("IL-2"). 2. Descrição da Técnica Relacionada A lnterleucina-2 (IL-2) é um potente estimuiador de imunidade, ativando diversas células do sistema imune, incluindo células T, células B, e monócitos. A IL-2 é também um potente e crítico fator de desenvolvimento de células T. Foi em virtude destas atividades que a IL-2 foi testada quanto a sua capacidade de tratar câncer. A IL-2 humana é uma droga aprovada pelo FDA para o tratamento de carcinoma renal metastático e melanoma metastático. O uso de IL-2 em paciente elegível é restrito devido à grave toxidade associada com a terapia de IL-2; estima-se que na melhor das hipóteses apenas 20% de pacientes elegíveis realmente recebem a terapia. As toxidades associadas com a terapia da IL-2 incluem febre grave, náusea, vômito, perda vascular e grave hipotensão. A despeito destas toxidades, entretanto, a IL-2 é eficaz para suas indicações aprovadas (~17% de taxa de resposta objetiva).

Embora a análise de estrutura/função de camundongo IL-2 ter sido extensiva (Zurawski, S. M. e Zurawski, G. (1989) Embo J 8: 2583 - 90; Zurawski, S. M. e outros, (1990) Embo J. 9: 3899 - 905; Zurawski, G. (1991). Trends Biotechnol 9; 250 - 7; Zurawski, S. M. e Zurawski, G. (1992) Embo J. 11; 3905 - 10. Zurawski, e outros, EMBO J, 12 5113 - 5119 (1993)), apenas análise limitada de IL-2 humana ocorreu. A maioria dos estudos com muteí-nas de IL-2 humana foi realizada em células de murino; entretanto, estudos limitados ocorreram empregando PHA-blastos humanos, que expressam a IL-2RcxPy de receptor IL-2 de afinidade elevada. Os estudos empregando os PHA-blastos confirmaram a importância dos resíduos Asp-20 e o D-hélice de IL-2 humana. Foi mostrado que a posição Asp-20 e Gln-126 de IL-2 humana são os resídflbs primários responsáveis para a interação com as subunida-des β e γ do receptor IL-2, respectivameníe (revisada em Thèze, e outros, Immunol. Today, 17, 481 - 486 (1996)). Embora os resíduos na hélice C de IL-2 de camundongo tenham demonstrado serem envolvidos em interação com a IL-2RP de camundongo (Zurawski, e outros, EMBO J, 12 5113-5119 (1993)), os resíduos equivalentes em IL-2 humana demonstraram ter as mesmas propriedades (estes resíduos em IL-2 humana seriam Asp-84 e Asn-88). Porque a especificidade de espécies significantes é mostrada entre a IL-2 humana e de camundongo (IL-2 humana exibe a atividade reduzida -100 vezes em sistemas de murino), é difícil predizer se o mesmo tipo de interações é ocorrido dentro das fronteiras das espécies). Nenhum estudo é conhecido empregando células expressando apenas a IL-2RPy de receptor de afinidade intermediária humana.

Algumas muteínas de IL-2 humanas foram examinadas quanto a sua atividade em PHA-blastos humanos (Xu, e outros, Eur. Cytokine Netw, 6, 237 a 244 (1995)). As muteínas contendo substituições de Asp-20 com Leucina (D20L), bem como a Arginina, Asparagina, e Lisina, foram demonstradas terem graves imperfeições em sua capacidade de induzir a proliferação de PHA-blastos. Desse modo, esta técnica ensina que a substituição de Asp-20 resultará em muteínas de atividade comprometida. Adicionalmente, Xu, e outros declaram que até esta data (1995) nenhuma muteína de IL-2 útil foi identificada para qualquer das duas aplicações clínica ou de pesquisa. A muteína Q126D de IL-2 humana gerada por Buchli e Ciardélli, Arch. Biochem. Biophys, 307(2): 411 a 415, (1993) exibiu atividade signifi-cantemente comprometida em ambas potência e agonismo; em ensaios de célula T humana, ela exibiu atividade menos -1.000 vezes do que a IL-2 e comportou-se como um agonista parcial. Em ensaios de célula T de murino, a muteína foi quase inativa. Ambas as linhagens celulares testadas expressaram a forma de afinidade elevada do receptor IL-2. Em ambas os tipos de célula, Q126D exibiu a capacidade de antogonizar a atividade mediada por IL-2, embora apenas parcialmente no ensaio de célula T humana.

Zhi-yong, W., e outros, Acta Biochimica et Biophysica Sinica 25 (5): 558 - 560 (Setembro de 1993) realização experiências de substituição em IL-2 nas posições 62, 69, 99 e 126, demonstrando uma redução de 20 vezes e 30 vezes em atividade quando comparado à IL-2 wt, com a 62-Leu-IL-2 e 126-Asp-IL-2, respectivamente, em um ensaio de célula T de camun-dongo (CTLL-2). Entretanto, não existe nenhum ensinamento ou sugestão de quais as substituições na posição 126 que podem conferir atividade seletiva a célula T sobre as células NK, ou indicar se tais alterações teriam um efeito similar nas células T humanas.

Collins, L., e outros, PNAS USA 85: 7709 a 7713 (1988) reportaram que a substituição de Asp na posição 20 com ou Asn (D20N) ou Lys (D20K) resultou em uma perda de ligação ~100 a 1000 vezes relativo à IL-2 humana para ambos os receptores de afinidade elevada (IL-2Rapy, denominada p55/p70 em Collins, e outros) e intermediária (IL-2RPy, denominada "p70" em Collins, e outros). A ligação à IL-2Ra pareceram não afetadas por ambas as proteínas mutantes. Este trabalho ensina que o rompimento de ligação ao receptor de IL-2 de afinidade intermediária (IL-2RPy) também conduzirá ao rompimento de ligação ao receptor de IL-2 de afinidade elevada (IL-2RaPy), sugerindo que a ligação diferencial ou ativação entre IL-2R3y ou IL-2Rotpy não é obtenível pela substituição de Asp na posição 20.

Berndt, W. G., e outros, Biochemistry 33 (21): 6571 a 6577 (1994) empregaram a mutagênese de cassete combinatorial para simultaneamente mutar as posições 17 a 21 em IL-2 nativa, que são suspeitas a interagir com o receptor IL-2 de afinidade intermediária. Apesar de 2610 clones selecionados, somente 42 estavam ativos. Eles descobriram que as posições 20 e 21 eram de importância primária para atividade biológica. Não há sugestão ou instrução de substituições individuais exceto para L21V.

Patente US N° 5,229,109 (Grimm, e outras) descreve análogos de IL-2 de baixa toxicidade para uso em imunoterapia e tratamento de câncer. As propriedades de dois análogos L-2 com substituições nas posições Arg38 (para Alanina) e Phe42 (para Lisina) foram analisadas e comparadas àquelas da IL-2 nativa. Os análogos foram constatados serem capazes de manter sua capacidade de ligar-se ao receptor de IL-2 intermediário, ao mesmo tempo que ligando apenas minimamente ao assim chamado receptor de "elevada afinidade". Neste momento o receptor de afinidade intermediária foi considerado consistir apenas.de p75 (IL-2RP), e o receptor de afinidade elevada foi considerado consistir apenas de p55 + p75 complexo receptor (IL-2Rap). Os análogos também mantiveram sua capacidade de estimular as células mononucleares de sangue periférico para gerar a morte ativada por linfocina (LAK). Notavelment®, a secreção de IL-1 β e TNFa foi significante-mente reduzída-em resposta aos análogos, quando comparado à molécula de IL-2 nativa. Os resíduos de aminoácido descritos nesta patente são aqueJês que interagem especificamente com a IL-2Ra (p55); eliminação de interações com a IL-2Ra resultaria em atividade reduzida em receptor de IL-2 de elevada afinidade, e não afetaria a atividade ao receptor IL-2 de afinidade intermediária transportando células. Desse modo, a geração de células LAK (que supõem-se que sejam derivadas de células NK) deve ser mantida. As muteínas descritas aqui são direcionadas a resíduo de aminoácido nas posições 20, 88 e 126; estas posição são supostas interagirem especificamente com a IL-2RP (p75; posições 20 e 88), e IL-2Ry (não conhecida no momento do depósito da patehte cfexGrimm, e outras, posições 126). Como uma conseqüência, oc interações com a IL-2Ra permanece não alterada. Mecanicamente, as muteínas descritas por Grimm, e outros, terão interações diminuídas com o receptor de afinidade elevada de IL-2, porém não deve ter nenhum efeito sobre o receptor de afinidade intermediária de IL-2; as muteínas ctescritas aqui têm a característica oposta, possuindo um defeito pronunciada em sua capacidade de interagir com o receptor IL-2RPy de afinidade intermediária a IL-2, e exibe pouco ou nenhum defeito em interações funcionais com o receptor IL-2Ra,py de afinidade elevada de IL-2. A Patente U. S. N° 5.206.344, (Goodson e outros) divulga muteí-nas de IL-2 na qual um dos aminoácidos da sequência nativa madura de IL-2 é substituído por um resíduo de cisteína, que é então preparado e conjugado por meio do resíduo de cisteína substituído para um polímero selecionado homopolímeros de polietileno glicol ou polióis polioxietilado, onde os homo-polímeros são não-substituídos ou substituídos em uma extremidade com um grupo alquila. Estas muteínas são feitas por meio de expressão de hospedeiro de genes mutantes codificando as muteínas que foram alteradas dos genes para as proteínas de origem por mutagênese direcionada ao sítio. Além disso, outras espécies de IL-2 podem ser conjugadas por meio do resíduo de cisteína na posição 125 da proteína de IL-2 madura que não é necessária para a atividade biológica da IL-2. Não existe divulgação de mutações que conferem toxidade reduzida. A Patente U. S. N° 4.959.314 (Lin e outros) divulga muteínas de proteínas biologicamente ativas tais como IFN-β e IL-2 nas quais os resíduos de cisteína que não são essenciais para a atividade biológica foram deleta-dos ou substituídos com outros aminoácidos para eliminar sítios para a reti-culação intermolecular ou formação de ponte de disulfeto intramolecular incorreta. Estas muteínas são feitas por meio de expressão bacteriana de genes mutantes que codificam as muteínas que foram sintetizadas dos genes para as proteínas de origem por mutagênese direcionada ao oligonucleotí-deo. Não existe divulgação de mutações que conferem toxidade reduzida. A Patente U. S. N° 5.116.943 (Halenbeck e outros) divulga que uma proteína terapêutica de referência biologicamente ativa é protegida contra a oxidação por um método envolvendo substituir um aminoácido con-servativo para cada resíduo de metionila suscetível à cloramina T ou oxidação de peróxido, onde resíduos de metionila não suscetíveis adicionais não são então substituídos. A muteína resistente à oxidação assim produzida é preferivelmente uma muteína humana de interleucina-2 ou interferon-β, e o aminoácido conservativo é mais preferivelmente alanina. Não existe nenhuma divulgação de mutações que conferem toxidade reduzida. A Patente U. S. N° 4.853.332 (Mark e outros) é direcionada às muteínas de IFN-γ e IL-2 nos quais resíduos de cisteína que não são essenciais para a atividade biológica foram deletados ou substituídos com outros aminoácidos para eliminar sítios para reticulação intermoiecular ou formação de ponte de disulfeto intramolecular incorreta. A patente divulga que uma substituição em IL-2 na cisteína 125 para serina resulta em uma muteína com atividade comparável à IL-2 nativa. A Patente U. S. N° 5.696.234 (Zurawski e outros) é direcionada às muteínas de citocinas de mamífero, e métodos para avaliação quanto aos agonistas e antagonistas de citocinas de mamífero. Em particular, a muteína dupla de IL-2 humana P82A/Q126D é demonstrada como tendo atividade antagonista em células Baf3 de murino co-transfectadas com subunidades α e β IL-2R humana. Pouca atividade agonista é mostrada. Além disso, as muteínas de IL-2 de murino são demostradas exibirem parcial atividade agonista e antagonista em células HT2, em particular Q141D, Q141K, Q141V e Q141L. Nenhuma atividade de muteína é descrita que exiba ou sugira um efeito agonista seletivo para mutações nas posições 20, 88 e 126.

Zurawski, e outros, descreve as muteínas IL-2 de murino que têm propriedades de serem ativas em células expressando IL-2RaPy, porém inativas em células expressando IL-2R3y (Zurawski, G., Trends Biotechnol. 9: 250 a 257 (1991); Zurawski, S. M. e Zurawski, G. Embo. J. 11: 3905 a 3910 (1992)). As muteínas IL-2 de murino que exibiram estas propriedades tinham as substituições Asp-34 para Ser ou Thr, e Gln-141 para Lys. Asp-34 e Gln-141 de IL-2 de camundongo parecem equivalentes à Asp-20 e Gln-141 de IL-2 humana, respectivamente. Embora estas referências refiram-se às muteínas de IL-2 "agonistas seletivas", elas não descrevem seu potencial como sendo menos tóxico, porém de preferência como sendo antagonistas potenciais de IL-2 endógena. A EP 0267 795 A2 (Zurawski e outros) divulga uma variedade de muteínas de IL-2 de camundongo em toda a seqüência, incluindo algumas coifrtérido deleções e/ou substituições dentro do primeiro dos trinta de ami-noácido N-terminal que são biologicamente competentes, porém não inclui, discussão ou sugestão das substituições de aminoácido divulgadas aqui nos resíduos de IL-2 de camundongo equivalentes. Existe uma necessidade para uma molécula de IL-2 melhorada que tem toxidade reduzida e é mais geralmente tolerada.

Taniguchi e outros, U. S. N° 4.738.927 é direcionado a um DNA recombinante que compreende um DNA recombinante codificando um poli-peptídeo que possui uma atividade biológica de IL-2, onde a referida atividade é promoção de desenvolvimento de uma linhagem de célula de linfócito T citotóxico, e um DNA vetor capaz de propagação em uma célula procariótica ou eucariótica, a seqüência de codificação de referido gene sendo localizada em uma posição a jusante de uma seqüência promotora, onde o referido polipeptídeo tem 132 a 134 aminoácidos em total na seqüência de aminoá-cido do polipeptídeo. Também descrevem um gene, vetores de DNA recombinante, células hospedeiras e métodos de recombinantemente produzir a IL-2 nativa. Taniguchi e outros não descrevem quaisquer variantes ou mu-teínas, e não ensinam que as posições na proteína são responsáveis por atividade de sinalização ou ligação. É evidente que as muteínas de IL-2 que não exibem a toxidade de limitação de dose das muteínas IL-2 recombinantes da técnica anterior são necessárias para obter vantagem terapêutica do potencial desta citoci-na.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma muteína de IL-2 humana numerada de acordo com a IL-2 do tipo silvestre onde a referida IL-2 humana é substituída em pelo menos uma das posições 20, 88 ou 126, por meio da qual a referida muteína preferivelmente ativa as células T sobre as células NK. Esta invenção realiza uma muteína de IL-2 menos tóxica que permite uso terapêutico maior desta interleucina.

Além disso, a invenção é direcionada às muteínas de IL-2 tendo mutações únicas nas posições Aspartato 20, Asparagina 88, e Glutamina 126. As muteínas específicas são representadas pelos designadores D20X, N88X e Q126X, onde "X" é um aminoácido espécifico que quando substituído em IL-2 humana, confere atividade seletiva para células expressando o receptor IL-2RaJ3y (por exemplo, células T) de preferência para células ex- r pressando o receptor IL-2Rpy (por exemplo, células NK). As muteínas exibindo seletividade maior do que 1000 vezes, incluem D20H, D20I, N88G, N88R e Q126L. Em particular estas muteínas também exibem atividade de IL-2 to tipo eèsencialmente silvestre em células T. Outras mutações são também identificadas que fornecem seletividade de menos do que 1000 vezes porém maior do que 10 vezes. A invenção também inclui polinucleotí-deos codificando para as muteínas da invenção, vetores contendo os polinu-cleotídeos, células hospedeiras transformadas, composições farmacêuticas compreendendo as muteínas, e métodos terapêuticos de tratamento empregando as muteínas. A invenção é também direcionada a um método de seleção das muteínas IL-2 através de avaliação em ensaios utilizando a ΙΙ_-2αβγ em comparação com Ι1_-2βγ, onde a atividade de uma muteína de IL-2 é aumentada relativa à IL-2 wt em um ensaio preferivelmente para a outra. A IL-2αβγ e ΙΕ-2βγ são os ectodomínios de subunidades receptoras individuais em combinação apropriada, e são empregadas para avaliar diretamente a ligação de muteínas IL-2 a cada complexo receptor. O ensaio de Ιί-2αβγ utiliza uma resposta de um tipo de célula transportando a Ιί-2αβγ, e o ensaio de Ιί-2βγ utiliza uma resposta de um tipo de célula transportando a Ιί-2βγ. A célula transportando a Ιί-2αβγ é um PHA-blasto, e a célula transportando a Ιί-2βγ é uma célula NK. O ensaio é a proliferação para igualmente o tipo de célula transportando a Ιί-2βγβο tipo de célula transportando-a Ιί-2βγ. A invenção é também direcionada a um vetor compreendendo o polinucleotídeo codificando uma muteína desta invenção, o vetor direcionando a expressão de uma muteína de IL-2 tendo a atividade de ativação da célula PHA-blasto, porém tendo atividade de ativação da célula NK reduzida, o vetor sendo capaz de habilitar a transfecção de um organismo alvo e expressão in vivo subsequente da referida muteína de IL-2 humana codificada por referido polinucleotídeo. A invenção é também direcionada a um método de tratar um paciente atingido com uma condição tratável de IL-2 administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma muteína de IL-2 humana numerada de acordo com a IL-2 tipo silvestre tendo a atividade de ativação de PHA-blasto, porém tendo atividade de ativação* de célula NK reduzida. Este método é aplicável ondeva condição tratável cfê IL-2 é HIV, Câncer, ctoença auto-imune, doença infecciosa; auxiliar de vacina em vacina de Câncer e terapia de vacina convencional, para estimulação imune nos idosos ou de maneira diferente imunocompromissado, bem como em pacientes SCID humanos, ou outra aplicação terapêutica requerendo estimulação do sistema imune. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS: Figuras 1 a 7 mostram as curvas de resposta de dose de IL-2 humana wt (IL-2) e D20H (Fig. 1), IL-2 e D20I (Fig. 2), IL-2 e N88G (Fig. 3), IL-2 e N88I (Fig. 4), IL-2 e N88R (Fig. 5), IL-2 e Q126E, (Fig. 6), e IL-2 e Q126L (Fig. 7). A: Resposta de dose individual de IL-2 (círculos fechados) e muteína (círculos abertos) nos ensaios de proliferação de células T humanas primárias (PHA-blastos). B: resposta de dose individual de IL-2 (triângulos fechados) e muteína (triângulos abertos) no ensaio de proliferação de célula NK humana primária.

Figuras 8A-8D. Toxidade de PROLEUKIN™ em chimpanzé foi avaliada em dois animais (X-159, triângulos, e X-124, quadrados), quando comparado a controle de veículo (X-126, diamantes). A toxidade foi avaliada por parâmetros renais (Blood Urea Nitrogen (BUN), A; Creatinina, B) e função hepática (Bilirubina total, C; ALT, D).

Figura 9. Gráfico de alteração do percentual de peso corporal durante 30 dias. Peso corporal para animais tratados com a IL-2/N88R (triângulos), PROLEUKIN (quadrados) ou veículo (diamantes) foi medido nos dias indicados.

Figuras 10A a 10D. Linfócitos (A), células brancas totais (B), neutrófilos (C), e plaquetas (D) para animais tratados com a IL-2/N88R (triângulos), PROLEUCINA (quadrados) ou veículo (diamantes) foram avaliados nos dias indicados.

Figuras 11A a 11 D. Nitrogênio de uréia sangüínea (A, BUN), creatinina (B), fósforo (C), e lacuna ânion (D) para animais tratados com a IL-2/N88R (triângulos), PROLEUCINA (quadrados) ou veículo (diamantes) foram avaliados nos dias indicados.

Figuras 12A a 12D. A Bilirubin (A), ALT (B), Fibrinogênio (C), e tempo de protrombina ativada (D) para animais tratados com IL-2/N88R (triângulos), PROLEUCINA (quadrados) ou veículo (diamantes) foram avaliadas nos dias indicados.

Figuras 13A e 13D. Níveis sangüíneos de sódio (A), íon de cloreto (B), cálcio (C), e potássio (D) para animais tratados com IL-2/N88R (triângulos), PROLEUCINA (quadrados) ou veículo (diamantes) foram avaliados nos dias indicados.

Figuras 14A a 14C. Níveis de albumina no sangue (A), hemató-crito (B), e hemoglobina (C) para animais tratados com IL-2/N88R (triângulos), PROLEUCINA (quadrados) ou veículo (diamantes) foram avaliados nos dias indicados.

Figuras 15A a 15C. O efeito de IL-2/N88R (quadrados), PROLEUCINA (diamantes), e veículo (triângulos) são indicados para a população de célula T (A, células CD3+), população de célula T CD4+ (B), população de célula T CD8+ (C).

Figuras 16A a 16C. O efeito de IL-2/N88R (quadrados), PROLEUCINA (diamantes), e veículo (triângulos) são indicados para a população de célula T total (A, células CD3+), população de célula T CD4+ população de célula T CD8+ (C).

Figura 17. Efeito de IL-2/N88R e PROLEUCINA em ativação de célula T com respeito ao veículo de fluorescência de células positivas CD25. O efeito de IL-2/N88R (quadrados), PROLEUCINA (diamantes), e veículo (triângulos) são indicados para a população de célula T CD3+CD4+. Os números insuficientes de células CD3+/CD8+ foram obtidos para avaliar o veículo de fluorescência nesta população.

Figuras 18A a 18D. O efeito de IL-2/N88R (quadrados), PROLEUCINA (diamantes), e veículo (triângulos) são indicados para a população de célula T CD4+ (A, células CD3+/CD4+), a população de célula T CD8+ (B, células CD3+/CD8+), população de célula T total (C, células CD3-/CD16+).

Figura 19. Gráfico de metástase de pulmão verso dose em ca-mundongos tratados com PROLEUCINA (círculos abertos) ou IL-2/N88R (círculos fechados). A metástase de pulmão foi contada na conclusão do estudo.

Figura 20. Mapa de plasmídeo do vetor pBC1 IL2SA de IL2N88R. DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERIDAS A. Fundamento A ação de IL-2 em células T é mediada pela ligação às proteínas receptoras de IL-2. As proteínas de superfície celular distintas em células T ligam-se à IL-2. A primeira a ser identificada é um polipeptídeo único, chamado de IL-2Ra, que é um polipeptídeo 55 kD (p55) que aparece na ativação da célula T e foi originalmente chamado antígeno Tac (para a ativação de T). A IL-2Ra liga-se à IL-2 com um Kd de aproximadamente 1CT8 M, eé também conhecida como o receptor de IL-2 de " baixa afinidade". A ligação de IL-2 às células expressando apenas IL-2Ra não induz a qualquer resposta biológica detectável. O segundo receptor de IL-2 é um complexo de ligação composto de IL-2Rb e IL-2Rg; IL-2Rg, um polipeptídeo de 64 kD, é também conhecido como a cadeia γ (yc) comum porque é compartilhada entre diversos receptores de citocina. A IL-2Rb é de cerca de 70 a 75 kD (chamada variadamente p70 ou p75) e é um membro do tipo I da família de receptor de citocina caracterizado pelos dois motivos de cisteínaA/VSXWS. A IL-2RP é expressa coordenadamente com yc. A afinidade de ligação de IL-2 à IL-2Rpyc é maior do que aquela à IL-2Ra, com um Kd de aproximadamente 10'9 M; é também conhecida como o receptor IL-2 de "afinidade intermediária". A IL-2 causa desenvolvimento de células expressando a IL-2Ra3yc, com estimulação de desenvolvimento semimáximo ocorrendo na mesma concentração de IL-2 que produz ligação semimáxima (isto é, 1 x 10"9 Μ). A IL-2RPyc é o mesmo complexo receptor sinalizando que pode ligar-se a IL-15. O terceiro complexo receptor de IL-2 conhecido é o complexo IL- 2RaByc. As células que expressam igualmente a IL-2Ra e IL-2RByc podem ligar-se à IL-2 muito mais firmemente, com um Kd de aproximadamente 1CT11 M, e então são também conhecidas como o complexo de "afinidade elevada". A estimulação de desenvolvimento de tais células ocorre em uma concentração de IL-2 similarmente baixa. Igualmente a ligação de IL-2 e estimulação de desenvolvimento podem ser bloqueadas pelos anticorpos para IL-2Ra, IL-2RB, ou yc e mais eficientemente por uma combinação de anticorpos para multiplicar as subunidades receptoras. Estas observações sugerem que a IL-2Ra forma um complexo com a IL-2RPyc, aumentando a afinidade do receptor de sinalização para a IL-2 e desse modo permitindo um sinal de desenvolvimento a ser liberado em concentrações de IL-2 significantemente inferiores. Acredita-se que IL-2 primeiro liga-se rapidamente ao IL-2Ra, e isto facilita associação com [L-2RPyc· Células T em repouso expressam IL-2RPyc mas somente pequenas quantidade de IL-2Rot; aumento da superfície expressa em IL-2Ra pode ser estimulada por IL-2. Em ativação de cplula T mediada por receptor antígeno, IL-2Roc é rapidamente expresso, desse modo reduzindo a concentração de IL-2 necessária a estimulação do crescimento. Ligando IL-2 ao complexo IL-2RaPyc resulta em transdução de sinal através de um caminho de sinalização Jak/STAT. de sinal através de uma trilha de sinalização Jak/STAT.

Descobriu-se muteínas de IL-2 humana que preferenciaímente ativa as células T (PHA-blastos; células que expressam a IL-2RaPy de receptor IL-2 de alta afinidade) em relação às células Exterminadoras Naturais (NK) (células que expressam a IL-2RctPy receptora de IL-2 de afinidade intermediária). As muteínas que substituem o Asp-20 com Histidina (D20H ou Isoleucina (D20I), Asn-88 com Arginina (N88R), Glicina (N88G), ou Isoleuci-na (N88I), ou Gln-126 com Leucina (Q126L), ou Glutamato (Q126E) exibem atividade de IL-2 inesperadamente repleta em PHA-blastos, e pouca (se existir) atividade em células NK. Estudos anteriores de muteínas de IL-2 humana contaram com sistemas celulares de murino de análise, e quando células humanas foram empregadas, não utilizaram células expressando apenas a IL-2RBy (tal como células NK). Adicionalmente, aqueles estudos utíli- zando PHA-blastos humanos mostraram que a substituição de Asp-20 (com Leu, Arg, Asp ou Lys; Xu e outros, Eur. Cytokine Netw, 6, 237 a 244 (1995)) ou G!n-126 (com Asp; Buchli e Ciardelli, Arch. Biochem. Biophys, 307(2): 411 a 415, (1993)) resulta em muteínas de IL-2 humana tendo atividade seriamente comprometida. Estudos anteriores empregando a IL-2 de murino identificaram as muteínas de IL-2 de camundongo com atividades diferindo (Zurawski, e outros, EMBO J, 12 5113 a 5119 (1993)), porém nenhuma das mut^ões que produziram estes resultados foram sugestivas daquelas identificadas no trabalho aqui descrito. As muteínas IL-2 humanas contendo mutações idênticas nas posições sinônimas com muteínas de IL-2 de murino não exibiram atividades similares, e por esse motivo sugerem que os exemplos de murino não sejam predição de funcionalidade humana. Nenhum estudo de muteínas de IL-2 humana é conhecido pelos inventores comparan-do-se as atividades relativas em células humanas expressando a IL-2Rapy (por exemplo, PHA-blastos) em relação à expressão da IL-2Rpy de rece'tpr de OÇ-2 (por exemplo, células NK). Espera-se que a análise in vivo confirme que φ muteínas descritas tenham um índice terapêutico melhorado em IL-2 humana do tipo silvestre através da redução de toxidade, desse modo provendo compostos terapeuticamente úteis para o tratamento de distúrbios requerendo a estimulação do sistema imune. A interleucina 2 (IL-2) está atualmente em uso na clínica para o tratamento de câncer renal metastático. Entretanto, sua toxidade grave tem limitado seu emprego para apenas um subgrupo dos pacientes mais saudáveis, e a toxidade limitante de dosé é presumida comprometer sua eficácia total. A toxidade aguda de IL-2 foi proposta ser mediada por meio de ativação de células NK, ao passo que a eficácia é mediada pela ativação direta de células T (Jacobson, e outros, Proc Natl Acad Sei USA (Estados Unidos), Sep 17 1996, 93(19) p10405-10; Smith KA, B/ood 1993, 81 (6) p1414 -23; Kaplan, e outros, Biotechnology, 10(2) p157 - 62). As células T expressam um receptor diferente para a IL-2 do que fazem as células NK (células T: IL-2RaPy, o receptor de IL-2 de elevada afinidade; células NK: IL-2R3y, o receptor de IL-2 de afinidade intermediária). As muteínas de IL-2 humanas descritas aqui seletivamente ativam o receptor de IL-2 de célula T e não o receptor de IL-2 de célula NK. A terapia de dose baixa com IL-2 foi utilizada para envolver diretamente ativando as células NK com algum sucesso (Jacobson, e outros (1996). Proc Natl Acad Sei USA 93: 10405 - 10). Esta estratégia incorporou a concepção de que em doses baixas de IL-2, apenas o receptor de IL-2 de afinidade elevada será ativado para a exclusão do receptor de ΙΕ-2Όθ afinidade intermediária. A forma de afinidade intermediária do receptor de IL-2, IL~2Rpy, é expressa nas células NK, ao mesmo tempo que as células T expressam a forma de afinidade elevadà, IL-2Ra£y.

Entretanto, os inventores abordaram o problema de toxidade de um ângulo diferente. O rompimento das interações de IL-2 com IL-2RP e/ou IL-2Ry através de modificação apropriada de resíduos de ligação específica na superfície de ligação de IL-2 foi hipotetizado para prevenir a ligação efetiva (e dessa maneira a ativação) às células expressando apenas a IL--2Rpy. Entretanto, em células expressando a IL-2RaPy, a ligação inicial à IL-2Ra, e desse modo ligação à célula, ainda ocorrerá, e então a terapia de dose baixa sugerida por Jacobs e outros pode ainda manifestar efeitos colaterais tóxicos. Em virtude de ligação à IL-2Ra, restabelecimento eficaz de IL-2RP e IL-2Ry pode ocorrer na superfície celular a despeito das interações prejudicadas da IL-2 modificada com IL-2RP e/ou IL-2Ry. Um complexo de IL-2/IL-2RaPy de sinalização competente pode desse modo ser formado. Uma variante de IL-2, capaz de seletivamente ativar os receptores de IL-2 de afinidade elevada em células T, de preferência para os receptores de IL-2 dé afinidade intermediária em células NK, acredita-se que possa ter um índice terapêutico aumentado sobre a IL-2 do tipo silvestre devido a um perfil de toxidade reduzida. Uma variante de IL-2 com um índice terapêutico aumentade-tería-uma faixa significaníemente expandida de uso em ambos os tratamentos de câncer (como uma terapia direta e/ou auxiliar) e imunodeficiência (por exemplo, HIV e tuberculose). Outros usos potenciais de IL-2 são derivados de sua atividade imunoestimuladora, e incluem além disso tratamento direto de câncer, imunodeficiência, tal como HIV ou pacientes de ,SCID humanos; doença infecciosa, tal como a tuberculose; como um auxiliar em estratégias de "vacina de câncer"; e para indicações de estimulação do sistema imune, tal como protocolos de vacinação padrão realçada ou para o tratamento do idoso. A substituição apropriada em Asp-20, Asn-88 ou Gln-126 reduziu as interações de ligação para qualquer das duas IL-2RP (asp-20 e Asn-88) ou IL-2Ry (Gln-126). O efeito de rede de tais substituições resultou em mu-teínas de IL-2 que mantiveram atividade em células T humanas, e tiveram atividade reduzida em células NK humanas.

Como não foi possível predizer o resultado de uma mencionada substituição antes da avaliação nos ensaios de célula T e NK, todas as possíveis substituições de aminoácido natural (exceto Cys) foram feitas nas posições Asp-20, Asn-88 e Gln-126, e um grupo limitado porém diverso grupo de mutações foi criado na posição Asp-84 para testar se elas realmente interagiram com a IL-2Rp. As mutações adicionais seriam testadas na posição Asp-84 se os efeitos em interações de 1L-2RP evidentes foram observados. Os dados para auarenta e seis substituições separadas naquelas posições são apresentados na Tabela 1, infra.- As mutações foram introduzidas empregando-se a mutagênese direcionada ao sítio no cDNA de IL-2 humana do tipo silvestre. Os clones corretos foram subclonados em um vetor de expressão adequado para a expressão em um sistema heterólogo (por exemplo, E. coli, baculovírus, células de levedura ou mamíferas tal como, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO). As proteínas purificadas foram testadas em ensaios de proliferação de célula T (PHA-blasto e proliferação de NK. As respostas diferentes geradas pelas muteínas individuais entre estes ensaios, isto é, EC50, indicam mutações que afetam estas atividades. Especificamente, as muteínas que estimulam uma resposta relativamente mais forte no ensaio de PHA-blasto (célula T) (verso IL-2 do tipo silvestre) quando comparado com a resposta em ensaio de célula NK (verso IL-2 do tipo silvestre) sugerirão substituições que fornecem especificidade celular com base na capacidade de muteínas específicas para ligar-se a e ativar a IL-2RaPy expressa nestas células, porém incapazes de ligarem-se, e desse modo não ativam, as células expressando apenas a ΙΙ_-2Κβγ. As muteínas IL-2 exibindo esta propriedade desse modo possuirão in vivo as propriedades imunoestimuladoras da IL-2 com toxidades associadas à terapia de IL-2 e perda vascular e hipoten- são. B. Definições Depósito de uma linhagem de célula CHO empregada para produzir a proteína recombinante aqui descrita foi feito na ATCC, 12301 Pa-rklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, em 5 de maio de 1999, Depósito N°_______. Uma vez que a cepa referida está sendo mantida sob os termos do Tratado de Budapest, será disponibilizada para um signatário de posse de patente pelo Tratado de Budapest.

Como aqui empregado, "IL-2 do tipo silvestre", se nativa ou recombinante, tendo as 133 seqüências de aminoácido de ocorrência normal de ÍL-2 humana nativa (menos o peptídeo sinal, consistindo de um adicional de 20 aminoácidos de N-terminal), cuja seqüência de aminoácido é descrita em Fujita, e outros, PNAS USA, 80, 7437 a 7441 (1983), com ou sem uma Metionina de N-terminal adicional que é necessariamente incluída quando a proteína é expressa como uma fração intracelular em E. coli.

Como aqui empregado, "muteína IL-2" significa um polipeptídeo onde as substituições específicas para a proteína de interleucina-2 madura humana foram feitas. A Tabela 1, infra, divulga quarenta e seis muteínas de IL-2 de substituição individual feitas, e seus dados de atividade relativa correspondentes. As modalidades preferidas incluem aquelas muteínas tendo pelo menos 100 vezes a atividade relativa. As modalidades particularmente preferidas incluem a seguinte, que exibe maior do que 1000 vezes a atividade relativa: aspartato (Asp) resíduo (D) na posição 20 ("D20"), quando numerado de acordo com a IL-2 do tipo silvestre, é substituído com isoleucina, ("D201") ou Histidina ("D20H"); o resíduo de asparagina (Asn) na posição 88 (N88) foi substituído com a Isoleucina (N88I), Glicina (N88G), ou Arginina (N88R); e o resíduo de glutamina (Gin) na posição 126 (Q126) foi substituído com a Leucina (Q126L) ou Glutamato (Q126E) ou Aspartato (Q126D). As muteínas IL-2 preferidas têm uma seqüência de aminoácido idêntica à IL-2 do tipo silvestre nos outros resíduos não-substituídos. Entretanto, as muteínas de IL-2 desta invenção podem também ser caracterizadas por inserções de aminoácido, deleções, substituições e modificações em um ou mais sítios dentro ou em outros resíduos de cadeia de polipeptídeo de IL-2 nativa. De acordo com esta invenção quaisquer tais inserções, deleções, substituições e modificações podem resultar em uma muteína de IL-2 que mantém uma atividade seletiva de PHA-blasto ao mesmo tempo que tendo capacidade reduzida para ativar as células NK, e se incluem no escopo desta patente. A combinação das substituições preferidas ou particularmente preferidas acima descritas em uma única molécula de IL-2 recombinante pode resultar em combinação de mutantes tendo atividade similar àquela divulgada aqui pelos mutantes únicos. Por exemplo, pode ser suposto que uma molécula de IL-2 tendo uma combinação de duas ou mais mutações selecionadas da Tabela 1 pode resultar em um agonista de IL-12 seletivo de célula T com atividade relativa similar à atividade relativa das substituições únicas aqui divulgadas. Os mutantes de combinação incluem-se no espírito e escopo da presente invenção.

Preferi-se as modificações conservativas e outras posições de IL-2 (isto é, aquelas que têm um efeito mínimo na estrutura secundária ou terciária da muteína). Tais substituições conservativas incluem aquelas descritas por Dayhoff em The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978), e por Argos em EMBO J., 8: 779 a 785 (1989). Por exemplo, os aminoácidos pertencentes a um dos seguintes grupos representam as alterações conservativas: - ala, pro, gly, gin, asn, ser, thr; - cys, ser, tyr, thr; - vai ile, leu, met, ala, phe; - lys, arg, his; - phe, tyr, trp, his; e -asp, glu.

Também preferi-se as modificações ou substituições que não introduzem sítios para a reticulação intermolecular adicional ou formação de ligação de bissulfeto incorreta. Por exemplo, a IL-12 é sabida ter três resíduos de cys, nas posições to tipo silvestre 58, 105 e 125 da seqüência madura.

Por "numerada de acordo com a IL-2 do tipo silvestre" pretende-se identificar um aminoácido escolhido com referência à posição na qual aquele aminoácido normalmente ocorre na seqüência madura de IL-2 do tipo silvestre. Onde as inserções ou deleções são feitas para a muteína IL-12, alguém versado na técnica apreciará que o Asp de ocorrência normal na posição 20 possa ser deslocado de posição na muteína. Entretanto, a localização do Asp deslocado pode ser facilmente determinada pela inspeção e correlação dos aminoácidos de flanqueamento com aqueles Asp de flanque-amento em IL-2 do tipo silvestre. O termo "tipos de célula tendo o receptor IL-2Rapy" significa as células sabidas terem este tipo de receptor, isto é, células T, células T ativadas, células B, monócitos ativados, e células NK ativadas, o termo "tipos de célula tendo o receptor IL-2Ro$y" significa as células sabidas terem aquele tipo de receptor, isto é, células B, monócitos em repouso, e células NK em repouso.

As muteínas de IL-2 da presente invenção podem ser produzidas por qualquer método adequado conhecido na técnica. Tais métodos incluem construção de uma seqüência de DNA codificando as muteínas de IL-2 desta invenção e expressando aquelas seqüências em um hospedeiro adequadamente transformado. Este método produzirá as muteínas recombi-nantes desta invenção. Entretanto, as muteínas desta invenção podem também ser produzidas, se bem que menos preferivelmente, por síntese química ou uma combinação de síntese química e tecnologia de DNA recombi-nante. Os métodos de produção em batelada ou produção de perfusão são geralmente dentro da experiência da técnica. Observe Freshey, R. I. (ed), "Animal Cell Culture: A Practical Approach." Segunda edição, 1992, IRL Press, Oxford, England; Mather, J. P. "Laboratory Scaleup of Cell Cultures (0,5 a 50 litros)", Methods Cell Biology 57: 219 a 527 (1998); Hu, W. S., e Aunins, J. G., "Large-scale Mammalian Cell Culture", Curr Opin Biotechnol 8: 148 a 153 (1997); Konstantinov, K. B., Tsai, Y., Moles, D., Matanguihan, R., "Control of long-term perfusion Chinese hamster ovary cell culture by glucose auxostat." Biotechnol Prog 12: 100 a 109 (1996).

Em uma modalidade de um método recombinante para a produção de uma muteína desta invenção, uma sequência de DNA é construída isolando-se ou sintetizando-se uma seqüência de DNA codificando a IL-2 do tipo silvestre e então alterando o códon para Asp20 para um códon para a Isoleucina (I) por mutagênese específica de sítio. Esta técnica é bem-conhecida. Observe, por exemplo, Mark e outros, "Site-specific Mutagenesis Of The Human Fibroblást Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, pp. 5662 a 66 (1984); e patente dos U.S. N° 4.588.585, aqui incorporada por referência.

Outro método de construção de uma seqüência de DNA codificando as muteínas de IL-2 desta invenção seria síntese química. Este por exemplo inclui a síntese direta de um peptídeo por método químico da seqüência de proteína codificando para uma muteína de IL-2 exibindo as propriedades descritas na invenção. Este método pode incorporar igualmente aminoácidos naturais e não-naturais nas posições que afetam as interações de IL-2 com a IL-2RP ou IL-2Ra3y. Alternativamente um gene que codifica a muteína IL-2 desejada pode ser sintetizado por métodos químicos empregando um sintetizador de oligonucleotídeo. Tais oligonucleotídeos são designados com base na seqüência de aminoácido da muteína de IL-2 desejada, e preferivelmente selecionando aqueles códons que são favorecidos na célula hospedeira na qual a muteína recombinante será produzida. Neste sentido, é bem reconhecido que o código genético seja degenerado - que um aminoácido pode ser codificado por mais do que um códon. Por exemplo, Phe (F) é codificado por dois códons, TTC ou TTT, Tyr (Y) é codificado por TAC ou TAT e his (H) é codificado por CAC ou CAT. Trp (W) é codificado por um único códon, TGG. Portanto, aprecia-se que para uma dada seqüência de DNA codificando uma muteína de IL-2 particular, existam muitas se-qüências degeneradas de DNA que codificarão para aquela muteína de IL-2. Por exemplo, aprecia-se que em adição à seqüência de DNA preferida para a muteína D20I mostrada na SEQ ID N0:1, existirão muitas seqüências de DNA degenerada que codificam para a muteína IL-2 mostrada. Estas seqüências de DNA degeneradas são consideradas dentro do escopo desta invenção. Portanto, "variantes degeneradas destes" no contexto desta invenção significa todas as seqüências de DNA que codificam para e desse modo capacitam a expressão de uma muteína particular. A seqüência de DNA codificando a muteína IL-2 desta invenção, se preparada por mutagênese direcionada ao sítio, síntese química ou outros métodos, pode ou não pode também incluir seqüências de DNA que codificam uma seqüência sinal. Tal seqüência sinal, se presente, deve ser uma reconhecida pela célula escolhida para expressão da muteína IL-2. Ela pode ser procariótica, eucariótica ou uma combinação das duas. Ela pode ser também a seqüência sinal de IL-2 nativa. A inclusão de uma seqüência sinal depende de se eia é desejada para segregar a muteína iL-2 das células recombinantes nas quais é feita. Se as células escolhidas são procarióticas, geralmente prefere-se que a seqüência de DNA não codifice uma seqüência sinal. Se as células escolhidas são eucarióticas, geralmente prefere-se que uma seqüência sinal seja codificada e mais preferivelmente que a seqüência sinal IL-2 do tipo silvestre seja empregada.

Os métodos padrão podem ser aplicados para sintetizar um gene codificando uma muteína de IL-2 de acordo com esta invenção. Por exemplo, seqüência de aminoácido completa pode ser usada para construir um gene retro-traduzido. Um oligômero de DNA contendo uma seqüência de nucleotídeos codificados para muteína IL-2 pode ser sintetizada. Por exemplo, vários oligonucleotídeos pequenos codificados para porções de poli-peptídeo desejado podem ser sintetizados e então ligados. Oligonucleotídeos individuais tipicamente contêm projeções 5' ou 3' para construção complementar. Uma vez construída agrupadas (por síntese, mutagênese direcionada ao sítio ou outro método), as seqüências de DNA codificando uma muteína IL-2 desta invenção serão inseridas em um vetor de expressão e operativamente ligadas a uma seqüência de controle de expressão apropriada para a expressão da muteína de IL-2 no hospedeiro transformado desejado. O próprio agrupamento pode ser confirmado por seqüenciamento de nucleotídeo, mapeamento de restrição, e expressão de um polipeptídeo biologicamente ativo em um hospedeiro adequado. Com é bem-conhecido na técnica, a fim de obter níveis de expressão elevados de um gene trans-fectado em um hospedeiro, o gene deve ser operativamente ligado a se-qüências de controle de expressão transcricional e translacional que são funcionais no hospedeiro de expressão escolhido. A escolha de sequência de controle de expressão e vetor de expressão dependerão da escolha de hospedeiro. Uma ampla variedade de combinações de hospedeiro de expressão/vetor pode ser empregada. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos, incluem, por exemplo, vetores compreendendo seqüências de controle de expressão de SV40, papiloma vírus bovino, adenovírus e citomegalovírus. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros bacterianos incluem plasmídeos bacteria-nos conhecidos, tal como plasmídeos de E. coíi, incluindo col El, pCR1, pER32z, pMB9 e seus derivados, plasmídeos de faixa de hospedeiro mais ampla, tal como RP4, DNAs de fago, por exemplo, diversos derivados de fago lambda, por exemplo, NM989, e outros fagos de DNA, tal como M13 e fagos de DNA de filamento único filamentoso. Os vetores de expressão úteis para as células de levedura incluem o plasmídeo 2μ e os derivados deste. Os vetores úteis para células de inseto incluem pVL 941. Preferi-se o pFas-tBac™ 1 (GibcoBRL, Gaithersburg, MD). Cate e outros, "Isolation Of The Bo-vine e Human Genes For Mulierian Inhibiting Substance And Expression Of The Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685 - 98 (1986).

Além disso, qualquer de uma ampla variedade de seqüências de controle de expressão pode ser empregada nestes vetores. Tais seqüências de controle de expressão úteis incluem as seqüências de controle de expressão associadas com genes estruturais dos vetores de expressão anteriores. Exemplos de seqüências de controle de expressão úteis incluem, por exemplo, os promotores precoces e tardios de SV40 ou adenovírus, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, o operador principal e regiões promotoras de fago lambda, por exemplo PL, as regiões de controle de pro- teína de revestimento fd, o promotor para cinase de 3-fosfoglicerato ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de fosfatase de ácido, por exemplo, PhoA, os promotores do sistema de α-mapeamento de levedura, o promotor poliedro de Baculovírus, e outras seqüências sabidas controlarem a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou suas viroses e várias combinações deste.

Qualquer hospedeiro adequado pode ser empregado para produzir as muteínas IL-2 desta invenção, incluindo bactérias, fungos (incluindo leveduras), planta, inseto, mamífero, ou outras células de animal apropriadas ou linhagens de células, bem como plantas ou animais transgênicos. Mais particularmente, estes hospedeiros podem incluir hospedeiros eucarióticos e procarióticos conhecidos, tal como linhagens de E. coli, Pseudomonas, Bacilos, Streptomyces, fungos, levedura, células de inseto tal como Spodoptera frugiperda (Sf9), células de animal tal como células de ovário de hamster chinês (CHO) e camundongo tal como NS/O, células de macaco verde africano tal como COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, e BNT 10, e células humanas, bem como células de planta em cultura de tecido. Para expressão de célula animal, preferi-se células CHO e células COS 7 em culturas e particularmente a linhagem de célula CHO, CHO (DHFR-) ou a linhagem HKB.

Deve ser evidentemente entendido que não todos os vetores e seqüências de controle de expressão funcionarão igualmente bem para expressar as seqüências de DNA aqui descritas. Nem funcionarão todos os hospedeiros igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. Entretanto, alguém versado na técnica pode fazer uma seleção entre estes vetores, seqüências de controle de expressão e hospedeiros sem experimentação indevida. Por exemplo, selecionando um vetor, o hospedeiro deve ser considerado porque o vetor deve replicar neste. O número de cópias dos vetores, a capacidade de controlar aquele número de cópias, e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tal como marcadores de antibiótico, deve ser também considerado. Por exemplo, os vetores preferidos para uso nesta invenção incluem aqueles que permitem o DNA codificando as muteínas IL-2 a serem amplificadas em número de cópia. Tais ve- tores amplificáveis são bem-conhecidos na técnica. Eles incluem, por exemplo, vetores capazes de serem amplificados por amplificação DHFR (observe, por exemplo, Kaufman, patente U.S. N° 4.470.461, Kaufman e Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolato Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304 a 19 (1982)) ou amplificação de sintetase de glutamina ("GS") (observe, por exemplo, a patente U.S. 5.122.464 e pedido europeu publicado N° 338.841).

Selecionando-se uma seqüência de controle de expressão, uma variedade de fatores deve também ser considerada. Estes incluem, por exemplo, a resistência relativa da seqüência, sua controlabilidade, e sua compatibilidade com a seqüência de DNA real codificando a muteína de IL-2 desta invenção, particularmente com respeito às estruturas secundárias potenciais. Os hospedeiros devem ser selecionados por consideração de sua compatibilidade com o vetor escolhido, a toxidade do produto codificado pelas seqüências de DNA desta invenção, suas características de secreção, sua capacidade de dobrar os polipeptídeos corretamente, suas exigências de fermentação ou cultura, e a facilidade de purificação dos produtos codificados pelas seqüências de DNA.

Dentro destes parâmetros, alguém versado na técnica pode selecionar várias combinações de vetor/seqüência de controle de expres-são/hospedeiro que expressarão as seqüências de DNA desejadas na fermentação ou em cultura animal de grande escala, por exemplo, empregando células CHO ou células COS-7.

As muteínas IL-2 obtidas de acordo com a presente invenção podem ser glicosiladas ou desglicosiladas dependendo do organismo hospedeiro usado para produzir a muteína. Se as bactérias são escolhidas como o hospedeiro, então a muteína de IL-2 produzida será desglicosilada. As células eucarióticas, por outro lado, glicosilarão as muteínas IL-2, embora talvez não do mesmo modo como a IL-2 nativa é glicosilada. A muteína de IL-2 produzida pelo hospedeiro transformado pode ser purificada de acordo com qualquer método adequado. Vários métodos são conhecidos para a purificação de IL-2. Observe, por exemplo, Current Protocols in Protein Sei- ence, Vol. 2, Eds. John E. Coligan, Bem M. Dunn, Hidde L. Ploehg, David W. Speicher, Paul T. Wingfield, Unit 6,5 (Copyright 1997, John Wiley and Sons, Inc. Preferi-se redobramento dos corpos de inclusão gerados na E, coli, ou de veículo condicionado de ou culturas mamíferas ou de levedura produzindo uma suposta muteína empregando-se permuta de cátion, filtragem de gel, e ou cromatografia líquida de fase reversa. Observe os Exemplos 1 (E. coli) e 10 (perfusão de célula CHO) abaixo. A atividade biológica das muteínas de IL-2 desta invenção pode ser testada por qualquer método adequado conhecido na técnica. Tais testes incluem proliferação de PHA-blasto e proliferação de célula NK. As muteínas de atividade apropriada, isto é, totalmente ativas em IL-2RaPy, com atividade reduzida em células transportando a IL-2Rpy, será confirmada empregando-se os dois testes. A "atividade relativa" de uma muteína é medida com respeito à IL-2 tipo silvestre, e, como descrito ainda nos exemplos, é a relação da atividade de proliferação de PHA-blasto para proliferação de célula NK. A muteína de IL-2 desta invenção será administrada em uma dose de aproximadamente paralela àquela ou maior do que empregada em terapia com a IL-2 nativa do tipo silvestre ou recombinante. Uma quantidade eficaz da muteína iL-2 é preferivelmente administrada. Uma "quantidade eficaz" significa uma quantidade capaz de prevenir ou reduzir a gravidade ou dispersão da condição ou indicação sendo tratada. Será evidente para aqueles versados na técnica que a quantidade eficaz de muteína de IL-2 dependa, entre outras coisas, da doença, a dose, o horário de administração da muteína de IL-2, quer a muteína de IL-2 seja administrada sozinha ou em conjunto com outros agentes terapêuticos, o soro de meia vida da composição, e a saúde geral do paciente. A muteína de IL-2 é preferivelmente administrada em uma composição incluindo um portador farmaceuticamente aceitável. "Portador far-maceuticamente aceitável" significa um portador que não causa qualquer efeito desagradável em pacientes nos quais é administrado. Tais portadores farmaceuticamente aceitáveis são bem-conhecidos na técnica. Preferi-se HSA/PBS a 2% em pH 7,0.

As muteínas IL-2 da presente invenção podem ser formuladas em composições farmacêuticas pelos métodos bem-conhecidos. Observe, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science by E. W. Martin, por meio deste incorporado por referência, descreve formulações adequadas. A composição farmacêutica da muteína IL-2 pode ser formulada em uma variedade de formas, incluindo líquida, gel, liofilizada, ou qualquer outra forma adequada. A forma preferida dependerá da indicação particular sendo tratada e será evidente para alguém versados na técnica. A composição farmacêutica de muteína IL-2 pode ser administrada oralmente, por aerossol, intravenosamente, intramuscularmente, intra-peritonealmente, intradermicamente ou subcutaneamente, ou de qualquer outra maneira aceitável. O modo preferido de administração depende da indicação particular sendo tratada e será evidente para alguém versado na técnica. A composição farmacêutica da muteína de IL-2 pode ser administrada em conjunto com outros agentes terapêuticos. Estes agentes podem ser incorporados como parte da mesma composição farmacêutica ou pode ser administrado separadamente da muteína de IL-2, ou coincidentemente ou de acordo com outro escala de tratamento aceitável. Além disso, a composição farmacêutica de muteína de IL-2 pode ser empregada como um auxiliar para outras terapias.

Portanto, esta invenção fornece composições e métodos para o tratamento de HIV, Câncer, doença auto-imune, doença infecciosa, auxiliar de vacina em vacina de Câncer e terapia de vacina convencional, para a estimulação imune em idoso ou de outra maneira em indivíduos imunocom-prometidos, bem como em pacientes SCID humanos, ou outra aplicação terapêutica requerendo estimulação geral do sistema imune em qualquer animal, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente ser humano. Como previamente observado na seção de Fundamento, a IL-2 tem muitos efeitos. Alguns destes são a estimulação de PHA-blastos, células T em repouso, células B, monócitos, e células NK, etc.; as muteínas descritas aqui terão atividades em tipos de célula expressando apenas o receptor de IL-2 de elevada afinidade, tal como células T em repouso, porém não o receptor de IL-2 de afinidade intermediária, tal como células NK ou monócitos.

Também contemplado é o uso das seqüências de DNA codificando as muteínas de IL-2 desta invenção em aplicações de terapia de gene. As aplicações de terapia de gene contempladas incluem o tratamento daquelas doenças nas quais a IL-2 é esperada fornecer uma terapia eficaz devido a sua atividade de célula T, por exemplo, HIV, Câncer, doença auto-imune, doença infecciosa, auxiliar de vacina em terapia de vacina de Câncer e vacina convencional, para imunoestimulação no idoso ou de outra maneira imunocomprometido, bem como em pacientes SCID humanos, e doenças que são de outra maneira responsivo à IL-2 ou agentes infecciosos sensíveis à resposta imune mediada pela IL-2. A liberação local de muteínas de IL-2 empregando a terapia de gene pode fornecer o agente terapêutico para a área alvo. Igualmente as metodologias de terapia de gene in vitro e in vivo são contempladas. Diversos métodos para transferência dos genes potencialmente terapêuticos para populações de células definidas são conhecidos. Observe, por exemplo, Mulíigan, "The Basic Science Of Gene Therapy", Science, 260: 926 - 31 (1993). Estes métodos incluem: 1) Transferência de Gene Direta. Observe, por exemplo, Wolff e outros, "Direct Gene transfer Into Mouse Muscle In Vivo", Science, 247 : 1465-68 (1990); 2) Transferência de DNA mediada por Lipossoma. Observe, por exemplo, Caplen e outros, "Liposome-mediated CFTR Gene Transfer To The Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis", Nature Med. 3 : 39 - 46 (1995); Crystal, "The Gene As A Drug", Nature Med. 1:15-17 (1995); Gao and Huang, "A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection Of Mammalian Cells", Biochem. Biophys. Res. Comm., 179 : 280 - 85 (1991); 3) Transferência de DNA mediada por retrovírus. Observe, por exemplo, Kay e outros, "In Vivo Gene Therapy Of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs", Science, 262 : 117 a 19 (1993); Anderson, "Human Gene Therapy", Science, 256 : 808 -13 (1992). 4) Transferência de DNA mediada por Vírus de DNA. Tais viro- ses de DNA incluem adenoviroses (preferivelmente vetores com base em Ad-2 ou Ad-5), viroses de herpes (preferivelmente vetares com base no vírus do herpes simples), e parvoviroses (preferivelmente vetores com base no parvovírus "defectivo" ou não-autônomo, mais preferivelmente vetores com base no vírus associado com adeno, mais preferivelmente vetores com base em AAV-2). Veja, por exemplo, Ali e outros, "The Uso Of DNA Viruses As Vectors For Gene Therapy", Gene Therapy. 1: 367-84 (1994); patente U.S. 4.797.368, incorporada aqui por referência, e patente U.S. 5.139.941, incorporado aqui por referência. A escolha de um sistema vetor particular para transferência do gene de interesse dependerá de uma variedade de fatores. Um fator importante é a natureza da população da célula alvo. Embora os vetores retrovi-rais tenham sido extensivamente estudados e empregados em um número de aplicações de terapia de gene, estes vetores são geralmente inadequados para células não divididas pela infecção. Além disso, as retroviroses têm o potencial para oncogenicidade.

As adenoviroses têm a vantagem de que elas têm uma ampla faixa hospedeira, podem infectar células controladamente ou terminalmente diferenciada, tal como neurônios ou hepatócitos, e parecem essencialmente não oncogênico. Observe, por exemplo, Ali e outros, supra, p. 367. As adenoviroses não parecem integrar no genoma hospedeiro. Porque eles existem extracromossomalmente, o risco de mutagênese insercional é enormemente reduzido. Ali e outros, supra, p. 373.

As viroses associadas com adeno exibem vantagens similares como os vetores baseados em adenoviral. Entretanto, AA Vs exibe integração específica de sítio em cromossoma humano 19. Ali e outros, supra, p. 377.

Em uma modalidade preferida, o DNA codificando a muteína IL-2 desta invenção é empregado em terapia de gene para doenças de imunodeficiência tal como HIV; doenças infecciosas tal como tuberculose; e cânce-res, tal como carcinoma renal.

De acordo com esta modalidade, a terapia de gene com DNA codificando as muteínas da IL-2 desta invenção é fornecida para um paciente em necessidade dela, coincidente com, ou imediatamente após a dia-gnose.

Este método leva vantagem da atividade seletiva das muteínas de IL-2 desta invenção para prevenir toxidade indesejada e efeitos adversos. O técnico experiente apreciará que qualquer vetor de terapia de gene adequada contendo o DNA de muteína de IL-2 possa ser empregado de acordo com esta modalidade. As técnicas para construção de um tal vetor são conhecidas. Observe, por exemplo, Anderson, W. F., Human Gene Therapy, Nature, 392 25 - 30 (1998); Verma, I. M., e Somia, N., Gene Therapy - Pro-mises, Problems, and Prospects, Nature, 389, 239 a 242 (1998). A introdução do vetor contendo DNA de muteína de IL-2 ao sítio alvo pode ser realizada empregando-se técnicas conhecidas. A fim de que esta invenção possa ser melhor entendida, os seguintes exemplos são mencionados. Estes exemplos são para o propósito de ilustração apenas, e não devem ser construídos como limitantes do escopo da invenção de modo algum. Todas as publicações aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade. C. Exemplos Exemplo 1 Produção de Muteínas em E. coli.

As muteínas foram geradas por mutagênese direcionada ao sítio empregando-se prímeres contendo códons correspondendo à mutação desejada essencialmente como descrito por Kunkel TA, Roberts JD, e Zakour RA, "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selec-tion" (1987), Methods Enzymol 154: 367 a 382. Resumidamente, o cDNA de IL-2 humana contendo os sítios de enzima de restrição Bam Hl e Xba I foi subclonado no vetor M13 mp19 de fago M13 (New England Biolabs, Beverly, MA) empregando os mesmos sítios. O cDNA de IL-2 do tipo silvestre foi obtido empregando-se Reação de Cadeia de Polimerase ("PCR") de um grupo de cDNA isolado de linfócitos de sangue periférico humano induzido 24 horas com forboi 12-miristato 13-ascetato (10 ng/ml). Os prímeres PCR empre- gados foram, para a extremidade 5' da estrutura de leitura aberta de IL-2, 5'-CCT- CAA CTC CTG AAT TC A TGT ACA GGA TGC -3' (SEQ ID NO:3); e para a extremidade 3' da estrutura de leitura aberta de IL-2, 5’-GGA AGC GGA TCC TTA TC A AGT CAG TGT TGA G -3' (SEQ ID NO:4);

Os sítios de enzima de restrição Eco RI (extremidade 5') e Bam Hl (extremidade 3') foram incorporados em cada oligonucleótido e são indicados por itálicos. As condições PCR empregadas foram 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 58,7°C, e 1 minuto a 72°C durante 25 ciclos. A seqüência de IL-2cDNA correta desse modo obtida foi confirmada por seqüenciamento empregando-se o kit de seqüenciamento Sequenase® (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) como descrito pelo fabricante. O DNA de filamento único contendo uracila (U-DNA) foi obtido transformando-se a linhagem CJ236 de E. coli (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) com IL-2cDNA-contendo M13 mp19. A mutagênese direcionada ao sítio utilizada em príme-res gerais contendo 15 nucleotídeos homólogos para o U-DNA 5' padrão para o(s) códon(s) alvejados por mutagênese, nucleotídeos que incorporam a alteração desejada, e um adicional de 10 nucleotídeos homólogos para o U-DNA 3' padrão do último nucleotídeo alterado. Inicialmente, a mutagênese direcionada ao sítio foi empregada para introduzir um sítio de restrição Nco I no início da seqüência madura de IL-2 humana. O uso deste sítio de restrição incorpora um resíduo de metionina terminal que direcionará a expressão no espaço citoplásmico de E. coli empregando-se por exemplo, o vetor de expressão pET3d. O prímer empregado para este propósito foi: 5'-GCA CTT GTC ACA AAC ACC ATG GCA CCT ACT TC A AGT-3' (SEQ ID NO: 5) Os prímeres específicos empregados para incorporar mutações nas posições D20, N88 e Q126 foram: D20X; 5'-GGA GCA TTT ACT GCT GNN NTT ACA GAT G-3' (SEQ ID NO: 6) N88X: 5' -GGG ACT TAA TCA GCN NNA TCA ACG TAA TAG-3 ' ÍSEQ ID NO: 7) Q12SX: 5'-GGA TTA CCT TTT GTN NNA GCA TCA TCT C-3' (SEQ ID NO:8) Onde NNN foi substituído com um códon apropriado para Histi-dina (CAC) ou Isoleucina (ATC) (na posição D20), arginina (CGT), glicina (GGT), ou isoleucina (ATC) (na posição N88), ou leucina (CTG) (na posição Q126). Outras mutações utilizaram uma estratégia similar e um códon apropriado para uma suposta mutação. Os prímeres foram fosforilados empregando-se cinase de polinucleotídeo T4 (New England Biolabs, Beverly, MA) empregando-se o protocolo do fabricante. Após anelamento do prímer para o padrão U-DNA e extensão com polimerase de DNA T7 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), células do E. coli linhagem DH5a™ (GibcoBRL, Gai-thersburg, MD) foram transformados com 5 μΙ de mistura de reação e cha-peado em veículo LB contendo 0,7% de agar. Após a incubação a 37°C, placas foram expandidas apreendendo uma única placa e transferindo para 2 ml de veículos de LB e desenvolvendo-a durante a noite a 37°C. O DNA de filamento único foi isolado empregando-se um kit de purificação M13 (Qia-gen, Inc., Chatsworth, CA) por protocolo do fabricante, e clones contendo a mutação desejada foram identificados sequenciando-se o DNA de filamento único empregando-se o kit de seqüenciamento Sequenase® (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) por protocolo do fabricante. O cDNA de mu-teína de IL-2 de DNA de Forma Replicativa correspondendo às placas contendo a seqüência mutada correta foi isolado empregando-se Nco\ e Xba I, e subclonado ao vetor de plasmídeo pET3a (Stratagene, San Diego, CA) (Strat). O E. coli de linhagem BL21 foi transformado com a muteína contendo o vetor pET3a, e desenvolvido em um ABS280 de entre 0,60 e 1,0, tempo em que 0,4 mM IPTG para induzir a produção de muteína de IL-2 foram adicionados.

Exemplo 2 Extração e Purificação de Muteínas de IL-2 de E. coli.

Três horas após a indução as células foram colhidas por centri-fugação a 10.000 X g. As muteínas de IL-2 recombinantes foram renaturali-zadas e purificadas primeiro dispersando-se as células em 10 volumes (vol./massa úmida) de tampão de sacarose/Tris/ EDTA (0.375M de sacaro-se, 10 mM Tris/HCL pH 8,0, 1 mM de EDTA). As células dispersas foram sonicadas 3 vezes a 300 W com 30 segundos de intervalos de repouso em um banho de gelo, empregando-se um sonicador XL2020 modelo Missonix equipado com uma sonda padrão de 2,54 cm (1 polegada). O material soni- cado foi então centrifugado a 17.000 x g durante 20 minutos a 4°C. Os pé-letes, que devem ser brancos em cor neste ponto, foram lavados por res-suspensão e centrifugação uma vez em tampão de sacarose/Tris/EDTA, duas vezes com tampão Tris/EDTA (50 mM Tris/HCL pH 8,0, 1 mM de EDTA), e finalmente ressuspensas em 10 vol. 0,1 M de tampão Tris/HCL, pH 8,0 (a amostra é tomada neste ponto para análise de gel) e centrifugada durante 20 minutos a 17.000 x g. O pélete foi dissolvido adicionando-se 3 volumes de 8 M de cloreto de guanidino em 0,1 M de Tris/HCL (pH 8,0), e 0,1% (vol/vol) de 2-mercaptoetanol. Após a incubação durante 2 horas em temperatura ambiente, a amostra foi centrifugada durante 20 minutos a 17.000 x g. O pélete foi dissolvido adicionando-se 3 volumes de 8M de cloreto de guanidino em 0,1 M Tris/HCL (pH 8,0), e 0,1% (vol/vol) de 2-mercaptoetanol. Após a incubação durante 2 horas em temperatura ambiente, a amostra foi centrifugada durante 20 minutos a 17.000 x g. A solução resultante foi dializada durante aproximadamente 20 horas contra 20 volumes de 10 mM Tris/HCL, pH 8,0, 1 mM de EDTA a 4°C. A solução foi centrifugada a 17.000 x g durante 20 minutos, ajustada em 0,1% de ácido trifluo-roacético, e filtrada em uma unidade de filtro de 0,22 mícrons. A solução foi transferida imediatamente para um frasco siliconizado e carregada em uma coluna C8 (Vydac 208TP54). As muteínas de IL-2 foram purificadas empregando-se um gradiente linear de 20 minutos empregando-se de 45 a 85% de acetonitrila em 0,1% de TFA. A concentração da proteína eluída foi determinada por A280 e análise de aminoácido. A proteína foi então aliquotada (100 ml) em tubos siliconizado e estocada em 20°C. A muteína desse modo purificada foi tipicamente uma banca única como observado por SDS-PAGE (mancha de prata), e foi quantificada por análise de aminoácido (precisão tipicamente de >90%).

Exemplo 3 Teste de Proliferação de Célula T

As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas de aproximadamente 100 ml de sangue humano normal (Irwin Me- morial Blood Bank, San Francisco, CA) diluídos 1:2 em salina tamponada por fosfato de Dulbecco's frio (Ca2+ e Mg2+ livre; DPBS). Ficoll-Paque (Pharmacia) é sustentado e a amostra é centrifugada para isolar o PBMC, seguido por lavagens extensivas em DPBS frio. Os PHA-blastos (células T ativadas) foram gerados ressuspendendo-se as células em RPMI 1640 contendo 10% de soro bovino fetal (Flyclone), ao qual 1% (peso/volume) de cada do seguinte é adicionado: L-glutamina; aminoácidos não essenciais; piruvato de sódio; e antibiótico-antimicótico (veículo RPMI) em uma densidade de 1X106 células/ml. Fitohemaglutanina (PHA-P; Sigma) foi adicionada em uma concentração final de 10 μg/ml, e as células foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 durante 3 dias. As células foram colhidas e lavadas duas vezes em DPBS, ressuspensas em veículos RPMI e chapeadas em placas de base plana de cavidade 96 em uma densidade de 1 X 105 células/cavidade em 200 μΙ com variações de concentrações de IL-2 ou muteína em veículos RPMI. As placas foram incubadas durante 48 horas a 37°C, pulsadas com 1 pCi 3H-timidina (DuPont NEN®, Boston, MA)/cavidade durante 6 horas, colhidas, e a radioatividade foi medida após colher as células sobre os filtros de fibra de vidro.

Exemplo 4 Teste de Proliferação de Célula NK

As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas de aproximadamente 100 ml de sangue humano normal (Irwin Memorial Blood Bank, San Francisco, CA) diluído 1:2 em salina tamponada por fosfato de Dulbecco frio (Ca2+ e Mg2+ livre; DPBS). Ficoll-Paque (Pharmacia) é sustentado e a amostra é centrifugada para isolar o PBMC, seguido por lavagens extensivas em DPBS frio. As células NK foram separadas de outras células. O kit de isolamento de célula NK de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany; Cat# 465-01) é preferido para este propósito. O kit consiste em dois reagentes, colunas de separação e um suporte de coluna magnético muito poderoso. O primeiro reagente é um coquetel de anticorpos CD3, CD4, CD19, CD33 monoclonais conjugados com hapteno de isótipo IgGI de camundongo. Isto é para esgotar o PMBC de células T, células B e células mielóides. É considerado que qualquer grupo adequado de anticorpos reconhecendo estes tipos de célula pode ser empregado. O segundo reagente consiste em microcontas MACs super-paramagnéticas coloidais conjugadas a um antiporto anti-hapteno. As células são ressuspensas em PBS com 0,5% de albumina de soro bovino e 2mM de EDTA (PBS/EDTA). O volume da suspensão é dependente do número de células empregado e é provido em um diagrama por Miltenyi Biotec. Tipicamente, com um número de célula de 2 a 5 x 108 de PBMC, as células são ressuspensas em 800 μΙ_ do tampão e então 200 μΙ_ de cada reagente é empregado. Após a incubação com os reagentes, as células são adicionadas à coluna (ressuspensa em 2 ml de tampão). As células não -NK aderem ao magneto (esgotado) e as células NK são isoladas e coletadas no fluxo todo. As células são lavadas, ressuspensas em veículos RPMI (contêm: RPMI 1640, ao qual 1% de cada do seguinte é adicionado: L-glutamina; aminoácidos não essenciais; piruvato de sódio; antibiótico-antimicótico (todos de Gibco/BRL, Gaithers-burg, MDS); 10% de soro bovino fetal (Hyclone)), e chapeado em placas de base plana de cavidade 96 em uma densidade de 1 x 105 células/cavidade em 200 μΙ. As células foram colhidas e lavadas duas vezes em DPBS, ressuspensas em veículos RPMI e colocadas em placas de base plana de cavidade 96 em uma densidade de 1 x 105 células/cavidade em 200 μΙ com concentrações de variação de IL-2 ou muteína de veículos RPMI. As placas foram incubadas durante 48 horas a 37°C, pulsadas com 1 μΟο 3H-timidina (DuPont NEN®, Boston, MA)/cavidade para 6 horas, colhidas, e a radioatividade foi medida após a colheita de células em filtros de fibra de vidro.

Exemplo 5 Muteínas que seletivamente ativam as Células T sobre as Células NK

As muteínas foram geradas empregando-se a mutagênese direcionada ao sítio (Kunkel e outros (1987), Methods Enzymol 154: 367 a 382) nas posições Asp-20, Asp-84, Asn-88 e Gln-26, e foram expressas em E. coli empregando o sistema de expressão pET-3a como descrito pelo Fabricante (Stratagene). As muteínas foram purificadas pela recuperação de corpos de inclusão em guanidina-HCL, redobrado, e cromatografado empre- gando-se HPLC, como previamente descrito. A proteína resultante apareceu >95% pura por SDS-PAGE manchada por prata, e foi analisada por concentração e pureza pela análise de aminoácido (AAA precisão tipicamente de >90%). As muteínas tendo atividade apropriada foram confirmadas na se-qüência empregando-se a análise de espectrometria de massa. As muteínas assim purificadas foram testadas nos testes de célula T e NK previamente descritos. As atividades relativas para muteínas de IL-2 nos testes de célula T e NK são indicadas na Tabela 1. TABELA 2 Muteínas avaliadas para a atividade seletiva de célula T.

Atividade Relativa Atividade Relativa Muteína Células T Verso NK Célula T Célula NK peso IL-2 1 1.00000 1.00000 Muteínas D20 D20A 5 0.00024 0.00005 D20H 3900 0.37081 0.00009 D20I 7600 4.59635 0.00061 D20K 330 0.06301 0.00019 D20L 100 0.00063 0.00001 D20M 490 0.05372 0.00011 D20N 160 0.03000 0.00019 D20Q 100 0.03180 0.00032 D20R 33 0.00018 0.00001 D20S 170 0.06640 0.00038 D20T 1 1.00000 1.00000 D20V 10 0.00093 0.00009 D20Y 1000 0.06587 0.00007 N88 Muteínas N88A 50 0.50000 0.01 N88E 10 0.01172 0.00115 N88F 22 0.02222 0.001 N88G 980 8.33333 0.00853 - continuação da Tabela 2 - N88H 3 0.00100 0.001 N88I 9600 0.98074 0.00010 N88K 3 0.00010 0.00032 N88L 4 0.00400 0.001 N88M 250 0.25000 0.001 N88R 6200 0.89730 0.00015 N88S 80 0.00200 0.16000 N88T 395 0.50000 0.001266 N88V 67 0.06670 0.001 N88W 1 0.00100 0.001 N88Y 8 0.00800 0.001 Q126 Muteínas Q126A 0.30 0.14630 0.00061 Q126D 240 0.14630 0.00061 Q126E 400 10.0000 0.02500 Q126F 32 0.87358 0.02749 Q126G 100 0.55556 0.00556 Q126H 0.03 0.02216 0.73875 Q126I 33 0.00100 0.00003 Q126K 1.0 1.00000 1.00000 Q126L 680 3.06186 0.00447 Q126M 9.1 19.94092 2.19298 Q126N 10 6.57895 0.64993 Q126P 3.0 0.00032 0.00011 Q126R 11 4.02695 0.36392 Q126S 33 0.03417 0.00103 Q126T 3.3 0.00010 0.00003 Q126V 330 1.00556 0.00302 Q126W 1.0 0.20000 0.20000 Q126Y 10. 0.88500 0.08850 As atividades de muteínas são descritas em termos da concen- tração relativa de muteínas requerida para produzir uma resposta de 50% da resposta máxima (EC50) em comparação com a EC50 de IL-2 em peso no mesmo teste de sinal, no caso de ensaios múltiplos na mesma muteína, o veículo geométrico dos valores é listado. Os valores EC50 para a IL-2 wt variada entre ~10 pM e 150 pM no teste de célula T, e ~50 pM e ~200 pM no teste de célula NK. A relação de atividade de célula T verso célula NK de muteínas é expresso como a atividade relativa da muteína em células T dividida pela atividade relativa de muteína em células NK. Esta relação é determinada por cada muteína empregando apenas a atividade determinada de supostos testes de célula T e NK empregando-se as células de um doador único.

As atividades de muteína podem ser classificadas em 6 amplas categorias; 1) seletividade de célula T de 1000 vezes; 2) seletividade de célula T de 100- porém <1000 vezes; 3) seletividade de célula T de 10- porém <100 vezes; 4) atividade melhorada relativa à IL-2 sobre as células T; 5) seletividade de célula NK; 6) seletividade de 10- vezes para ou células T ou células NK.

Classe 1: D20H, e Y; N88G, I, e R.

Classe 2: D20K, L, Μ, N. Q e S; N88M T; Q126D, E, G, L e V.

Classe 3: D20R; N88A, E, F, S e V; Q126F, I, N, R e S.

Classe 4: D20I; N88G; Q126E, L, Μ, N e R.

Classe 5: Q126A, H.

Classe 6: D20A, Te V; N88H, K, L, We Y; Q126K, P, T, We Y.

Dentro das Classes 1 a 3, as muteínas preferidas são aquelas que exibem cerca de wt IL-2 ou melhor atividade nas células T. Na Classe 1, isto incluiría D20H e I; N88G, I e R; em Classe 2, isto inclui N88M e T, Q126D, E, G, L e V; em Classe 3, isto inclui N88A, Q126F e G. As muteínas na Classe 4 são preditas terem potência maior do que wt IL-2 in vivo.

Pode ser observado na Tabela I que nenhuma mutação única resultou em uma muteína de IL-2 inativa em ambos os ensaios. Entretanto, pode ser derivado que uma combinação de mutações que resultou em atividade seriamente comprometida de duas diferentes posições potencialmente produziríam uma atividade IL-2 antagonista em células T, ou outros tipos de célula transportando receptor IL-2 de elevada afinidade. Um tal antagonista é predito destes dados como as mutações foram designadas alterarem apenas as interações com IL-2Rp IL-2Ry. Um tal exemplo seria a muteína dupla D20R/Q126T. A combinação de mutações fracamente ativas em uma molécula é predita ser combinatorial em natureza, isto é, D20R tem 0,00018 atividade sobre as células T, Q126T 0,0001 de atividade sobre as células T, a muteína dupla D20R/Q126T seria suposta de ter 0,000000018 a atividade de wt IL-2 sobre as células T. Outras combinações podem ser derivadas dos dados fornecidos.

Exemplo 6 Atividade Biológica de wt IL-2 e Muteínas IL-2 As figuras 1 a 7 rniostram as curvas de resposta de dose de wt de IL-2 humana (IL-2) e D20H ^Fig. 1), IL-2 e D20I (Fig. 2), IL-2 e N88G (Fig. 3), IL-2 e N88I (Fig. 4), IL-2 e N88R (Fig. 5), IL-2 e Q126E, (Fig. 6), e IL-2 e Q126L (Fig. 7). A: Resposta de dose individual de IL-2 (círculos fechados) e muteína (círculos abertos) no teste de proliferação de célula T humana primária (PHA-blastos). B: Resposta de dose individual de IL-2 (triângulos fechados) e muteína (triângulos abertos) no teste de proliferação de célula NK humana primária.

Particularmente com respeito à Figura 1, para a experiência mostrada, a dose de wt IL-2 que produz 50% de proliferação máxima (EC5o) é ~1,5 X 10'10 M para ensaio de célula T (A) e ~1 X 10'10 M para a célula NK (B). O EC50 para D20H foi de ~2 X 10'10 M neste ensaio de célula T, porém estimado ser > 1 X 10'5 M neste ensaio de célula NK. O desenvolvimento líquido em atividade de célula T de D20H sobre a atividade de célula NK é desse modo >50.000 vezes como determinado para este ensaio. Os resultados similares foram obtidos com sangue de doadores adicionais (dados não mostrados).

Particularmente com respeito à Figura 2, para a experiência mostrada, a dose de wt IL-2 que produz 50% de proliferação máxima (EC50) é ~1,5 X 10-10 M para ensaio de célula T (A) e ~3 X 10 10 M para a célula NK (Β). Ο EC50 para D20I foi de -1,5 X 10'10 M neste ensaio de célula T, porém estimado ser de apenas -5 X 10'6M neste ensaio de célula NK. O desenvolvimento líquido em atividade de célula T de D20I sobre a atividade de célula NK é desse modo -16.000 vezes como determinado para este ensaio. Os resultados similares foram obtidos com sangue de doadores adicionais (dados não mostrados).

Particularmente com respeito à Figura 3, para a experiência mostrada, a dose de wt IL-2 que produz 50% de proliferação máxima (EC50) é -4 X 10'11 M para ensaio de célula T (A) e -2 X 10'10 M para a célula NK (B). O EC50 para N88G foi de -5 X 10~12 M neste ensaio de célula T, porém estimado ser de apenas -3 X 10"8M neste ensaio de célula NK. O desenvolvimento líquido em atividade de célula T de N88G sobre a atividade de célula NK é desse modo -1,200 vezes como determinado para este ensaio. Os resultados similares foram obtidos com sangue de doadores adicionais (dados não mostrados).

Particularmente com respeito à Figura 4, para a experiência mostrada, a dose de wt IL-2 que produz 50% de proliferação máxima (EC50) é -1,5 X 10'10 M para ensaio de célula T (A) e -1 X 10'10 M para a célula NK (B). O EC50 para N88I foi de -4 X 10'10 M neste ensaio de célula T, porém estimado ser de apenas -5 X 10'6M neste ensaio de célula NK. O desenvolvimento líquido em atividade de célula T de N88I sobre a atividade de célula NK é desse modo -18.000 vezes como determinado para este ensaio. Os resultados similares foram obtidos com sangue de doadores adicionais (dados não mostrados).

Particularmente com respeito à Figura 5, para a experiência mostrada, a dose de wt IL-2 que produz 50% de proliferação máxima (EC50) é -1,5 X IO'10 M para ensaio de célula T (A) e -1 X 10'10 M para a célula NK (B). O EC50 para N88R foi de -9 X 10"11 M neste ensaio de célula T, porém estimado ser de apenas -3 X 10"7M neste ensaio de célula NK. O desenvolvimento líquido em atividade de célula T de N88R sobre a atividade de célula NK é desse modo -5.000 vezes como determinado para este ensaio. Os resultados similares foram obtidos com sangue de doadores adicionais (da- dos não mostrados).

Particularmente com respeito à Figura 6, para a experiência mostrada, a dose de wt IL-2 que produz 50% de proliferação máxima (EC50) é ~ 8 X 10~12 M para ensaio de célula T (A) e ~ 5 X 10'11 M para a célula NK (B). O EC50 para Q126E foi de ~ 8 X 10'13 M neste ensaio de célula T, porém estimado ser de apenas ~ 2 X 10~9 M neste ensaio de célula NK. O desenvolvimento líquido em atividade de célula T de Q126E sobre a atividade de célula NK é desse modo ~ 400 vezes como determinado para este ensaio. Os resultados similares foram obtidos com sangue de doadores adicionais (dados não mostrados).

Particularmente com respeito à Figura 7, para a experiência mostrada, a dose de wt IL-2 que produz 50% de proliferação máxima (EC50) é ~ 5 X 10'11 M para ensaio de célula T (A) e ~ 8 X 10~11 M para a célula NK (B). O EC50 para Q126L foi de ~ 2 X 10'11 M neste ensaio de célula T, porém estimado ser de apenas ~ 2 X 10'8 M neste ensaio de célula NK. O desenvolvimento líquido em atividade de célula T de Q126L sobre a atividade de célula NK é desse modo ~ 625 vezes como determinado para este ensaio. Os resultados similares foram obtidos com sangue de doadores adicionais (dados não mostrados).

Exemplo 7 Estudos de Toxidade de Chimpanzé A IL-2/N88R foi selecionada das proteínas mutantes de IL-2 na Tabela 1 por causa de sua atividade agonista seletiva de célula T demonstrada em ensaios de célula T e NK humanas primárias. Relativo à IL-2 do tipo silvestre, ela é de ~ 6.000 vezes mais ativa em células T do que em células NK, e exibe atividade essencialmente equivalente à wt IL-2 em células T. A IL-2/N88R foi produzida em células CHO, purificadas, e avaliadas em um modelo de chimpanzé de atividade e toxidade de IL-2. Neste modelo in vivo, ela exibiu atividade de célula T comparável a uma variante recombi-nante comercialmente disponível de IL-2 (PROLEUKIN™, Chiron Corporation, Emeryville, CA), contudo induziu apenas efeitos colaterais suaves em comparação (ambos em termos de parâmetros objetivos e clínicos). A. Projeto Experimental 1. Materiais e Métodos A porção em vida do estudo ocorreu em New Ibéria Research Center (New Ibéria, LA, Sponsor Bayer Corporation, Berkeley, CA) e envolveu duas fases de estudos e 11 adultos jovens para chimpanzés machos adultos com pesos corporais que variavam de cerca de 45 a 70 kg. A Fase I do estudo foi uma fase de determinação de soe e envolveu liberção de uma dose subcutânea e um veículo ou uma dose subcu-tânea de PROLEUKIN em 1,2 mg/m2, duas vezes diariamente (BID) durante 5 dias. A Fase II do estudo é uma comparação do veículo, PROLEUKIN, e IL-2/N88R aplicada subcutaneamente, a cada 12 horas (q12h) durante 5 dias. A dose de IL-2/N88R foi selecionada para fornecer exposição comparável à PROLEUKIN baseada na análise farmacocinética. Amostras de sangue foram tomadas para análises de química sangüínea, CBC, hematolo-gia/coagulação, e análise FACS de populações de célula T e NK como detalhado nas Seções 5 e 6. TABELA 2A Fase I Protocolo TABELA 2B

Fase I I Protocolo 2. Procedimento de Dosagem Em 5 dias de estudo no qual o sangue deveria ser obtido, animais foram completamente anestesiados empregando-se cetamina IM em uma dose de aproximadamente 10 mg/kg antes da administração do artigo de teste ou veículo. Nos dias de estudo no qual a amostra de sangue não foi requerida, animais foram fisicamente presos empregando-se uma gaiola de opressão antes da administração do artigo de teste ou veículo. A dose foi administrada por injeção subcutânea a cada 12 horas durante 5 dias, se o sítio de injeção foi aparado dos cabelos no Dia 1 do estudo. O sítio e tempo de dosagem foi avaliado para cada dose. 3. Observações Clínicas (a) Observações Diárias e Consumo de Alimento Cada animal foi observado duas vezes diariamente e qualquer observação anormal foi reportada para o Diretor do Estudo. Animais parecendo doentes foram trazidos para a atenção do Diretor de Estudo, Veterinário do Projeto, e o Patrocinador Representativo. O consumo de alimento foi confirmado e registrado duas vezes diariamente por observação visual. (b) Pesos Corporais Os pesos corporais foram tomados antes do estudo, antes da dosagem no dia 1, e a cada vez que os animais foram sedados para coleção de sangue. (c) Observação de Sítios de Iniecão Os sítios de injeção foram observados diariamente. Qualquer aspecto anormal tal como vermelhidão e inchação foi registrado.

Tabela 3A: Escala para a Fase II de Coleção de Amostra,_________________________ 4. Manuseio da Amostra (a) Químicas de Soro Aproximadamente 2 ml de amostras de sangue foram coletadas de cada animal em tubos sem anticoagulante nos pontos do tempo especificado acima. Os tempos de coleção de sangue foram documentados e o sangue foi permitido coagular em temperatura ambiente. As amostras foram então centrifugadas, o soro separado e enviado para o NIRC Clinicai Patho-logy Laboratory. O painel de química de soro padrão NIRC incluído na TABELA 4: Painel de Química de Sangue (b) Hematologia Aproximadamente 2 ml de amostras de sangue foram coletados de cada animal em tubos de EDTA nos pontos do tempo acima especificados e enviados para o NIRC Clinicai Pathology Laboratory. O painel de hematologia NIRC padrão, incluindo contagem de sangue completa, diferencial, e contagem de plaquetas, foram desenvolvidos em todas as amostras. (c) Ensaios Responsáveis Aproximadamente uma amostra de 6 ml de sangue foi coletada em tubos com EDTA como um anticoagulante nos tempos acima especificados. Os tempos de coleção de sangue foram documentados. As amostras foram centrifugadas, o plasma separado e aliquotado em três tubos separados. O plasma foi estocado congelado (-60°C ou abaixo) e expedido para a Bayer Corporation, Berkeley, CA logo que o estudo foi completado.

5. FACS (a) Procedimento Aproximadamente uma amostra de sangue de 5 ml foi coletada em anticoagulante de heparina de sódio nos tempos especificados para análise FACS.

Espécime de sangue total foi obtida em ou EDTA, ACD ou heparina. Os números celulares foram ajustados para ficarem na faixa de 2 a 20 mil por mm3. 12 X 75 tubos de vidro ou plástico foram apropriadamente rotulados para o painel de anticorpo sendo desenvolvido. O anticorpo ou coquetel de anticorpo foram adicionados aos tubos seguindo volumes sugeridos pelo fabricante. 100 μΙ de espécime de sangue bem misturado foram adicionados por tudo e a mistura foi incubada durante 30 mn em temperatura ambiente, luz de forma protegida.

Após a incubação, 2 ml de solução de lise (solução de lise branda de Becton Dickinson FACS, BD# 92-0002) foram adicionados, a mistura foi girada suavemente e deixada permanecer durante 10 minutos em temperatura ambiente. Os tubos quando então centrifugados em temperatura ambiente durante 5 minutos a 30 X g. Os sobrenadantes foram decanatados, o excesso de líquido enxugado em 1 ml de tampão PBS (GIBCO 14190-144) foi adicionado a cada pélete de célula. Após um giro suave, os tubos foram centrifugados em temperatura ambiente durante 5 mn a 300 X g. Os sobrenadantes foram decantados e o excesso de líquido enxugado antes adicionando 1 ml de solução fixativa (0,5% de solução de formaldeído, preparada diluindo 10% de formaldeído (Polyscience, Inc. #0418) 1:20 com tampão de PBS) sobre as péletes de célula e girando suavemente para ressuspensão. As amostras foram então analisadas em uma pá de Citômetro de Fluxo EPICS SL.

Os anticorpos empregados para o estudo: o controle de isótipo MlgG1/MlgG1 (Becton Dickinson, Cat. # 349526), CD45-PerCP (Becton Di- ckinson, Cat. # 347464), CD8-FITC (Becton Dickinson, Cat. # 347313), CD25-PE (Becton Dickinson, Cat. # 30795X), CD4-FITC (Becton Dickinson, Cat. # 340133), CD16-PE (Pharmingen, Cat. # 347617), CD3-PerCP (Becton Dickinson, Cat. # 347344). 6. Perfil de Coagulação Aproximadamente uma amostra de sangua total de 2 ml foi coletada em tubos com citrato de sódio adicionado como um anticoagulante nos pontos de tempo acima especificados. O perfil de coagulação consistiu em Tempo de Protrombina (PT), Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (APTT) e Fibrinogênio. B. Resultados e Discussão I. Determinação de Dose de PRQLEUKIN A meta primária desta fase foi identificar uma dose de PRO-LEUKIN ideal para comparação com IL-2/N88R. Esta dose ideal de PRO-LEUKIN foi alvejada para ser uma dose tolerável (menor do que a dose máxima tolerada) que idealmente causará toxidade clinicamente significante, porém moderada e reversível. Uma dose de PROLEUKIN de 1,2 mg/M2, BID, foi determinada como a dose inicial com base na extrapolação de espécies cruzadas dados os regimes de dose clínica de PROLEUKIN, suas toxi-dades correspondentes, e resultados de resposta de dose de PROLEUKIN em macaco cynomolgus em cativeiro.

Dois chimpanzés foram tratados deste modo com PROLEUKIN. Estes animais tornaram-se aumentadamente menos ativo, angustiados, e desidratados em todo o curso da dose. Ambos os animais desenvolveram sérios sintomas gastrintestinais iniciando nos dias 3 ou 4, incluindo apetite reduzido, diarréia, vômito. Dosagem em um animal (número X-159) foi des-continuada após 3 dias de dosagem por causa de disfunção renal grave (Figura 8A&B) e hepática moderada refletida em químicas sangüíneas. Estas incluem elevações de nitrogênio de uréia sangüínea (BUN), creatinina e bili-rubina total, ALT (SGPT). A solução de Rigers lactada foi administrada i.v. em ambos os animais tratados com PROLEUKIN no dia 3 e 4 (animal X-159) e dia 4 apenas (animal X-124) como ressuscitação ou para prevenir outra desidratação. O animal número X-159 foi removido do estudo no dia 8 devido à disfunção renal e possível trombo na perna direita como indicado por pulso muito mínimo (femoral), e o bezerro inteiro foi resfriado e ampliado. Embora significante toxidade tenha sido observada em um animal, o outro animal experimentou menos eventos graves e o perfil de eventos adversos para ambos os animais foi reversível. Com base nisto, 1,2 mg/M2 de PRO-LEUKIN e a dose equivalente (com base na exposição) de IL-2/N88R, q12hr foi determinado ser um regime de dose apropriada para comparar estes dois compostos.

2. Comparação de IL-2/N88R à PROLEUKIN

Observações Clínicas A Tabela 5 lista as observações clínicas feitas durante o estudo. Valores são reportados em uma escala de 0 a 5, onde 5 é grave. Todos os animais tratados com a PROLEUKIN ficaram gravemente doentes; houve uma morte associada com o tratamento de PROLEUKIN. Os valores reportados após o dia 6 para o grupo de PROLEUKIN refletem os dados dos dois animais restantes. O efeito colateral mais óbvio de tratamento de IL-2/N88R pareceu ser distúrbio de Gl suave (emese) embora o tratamento tenha induzido toxidade nominal em termos dos parâmetros indicados na Tabela 4. O peso corporal do grupo de PROLEUKIN caiu 6% no dia 6 e declinou tão baixo quanto 10% no dia 10 e recuperou-se lentamente a seguir (veja a Figura 9). Ao contrário, IL-2/N88R e os grupos de veículo teve meramente 1 a 3% de perda de peso no máximo. TABELA 5 Observações C ínicas*_____________________________________________ * Escala de 0 a 5, onde 5 é mais grave. (a) Hematologia IL-2/N88R induziu efeitos celulares consistentes com a ativação de PROLEUKIN, em particular linfocitose (Figura 10A), aumento em células brancas sanguíneas (Figura 10B) e nutrófilos (Figura 10C) foram observados. A IL-2/N88R induziu apenas uma trombocitopenia marginal (nadir de ~15%) comparado à PROLEUKIN {nadir ~50%) durante a porção de tratamento do estudo (Figura 10 D). (b) Função Renal Os níveis BUN foram acentuadamente mais elevados em todos os animais tratados com PROLEUKIN nos dias 6 e 8 (Figura 11 A). Os níveis BUN foram acima de 130 mg/dL em dois destes animais; Os níveis de crea-tinina também aumentaram dramaticamente em dois animais em ambos os dias 6 e 8 (Figura 11B) indicando um colapso total da função renal. Além disso, igualmente a lacuna de fósforo e ânion no soro também aumentou no grupo tratado com PROLEUKIN nos dias 6 e 8. Ao contrário, em todos os animais IL-2/N88R, estes parâmetros renais permaneceram basicamente normal em todo o estudo (Figura 11 C&D). (c) Função Hepática A bilirubina total mais do que tripla no grupo de PROLEUKIN no dia 6 e permaneceu elevada em todo o dia 10 (Figura 12A). Ao contrário, apenas um animal no grupo IL-2/N88R teve um aumento menor transitório nos dias 3 e 6. O nível de soro SGPT elevou-se dramaticamente e atingiu acima de 100 U/L em todos os animais de PROLEUKIN no dia 6 (Figura 12B). O nível de SGPT em animal número A199 atingiu 65I U/L, e o SGOT 2789 U/L (Lab Note Book: NIR # 8754 - 9852 - Fase II, Tabela 1 Individual and Group Mean Chemistry Values, página 17 de 21 da tabela), indicando uma falha grave no fígado. (d) Coagulação O nível de fibrinogênio mais do que dobrado em ambos os grupos PROLEUKIN e IL-2/N88R e atingiu o pico no dia 6 (Figura 12C). O aumento parece ter acontecido precoce no grupo de PROLEUKIN do que os animais IL-2/N88R. Isto é refletido por um aumento de 51% verso 5% no dia 3. As alterações em fibrinogênio podem ser um resultado de resposta de proteína aguda em vez de defeitos de coagulação uma vez que não existiu nenhuma alteração significativa em APTT ou PT conseqüentemente durante o mesmo período de tempo (Figura 12D). Entretanto, iniciando do dia 10 o nível de APTT em animais de PROLEUKIN exibiu uma tendência óbvia embora o valor absoluto permanecesse dentro da faixa normal. A tendência normal, embora para uma extensão inferior, foi também observada no grupo IL-2/N88R. Interessantemente, entretanto, o nível de fibrinogênio pareceu ter derivado inferior durante o mesmo período de tempo conseqüentemente em ambos os grupos. (c) Homeostase Os níveis de sódio no soro diminuíram para abaixo de 135 MEQ/L em dois dos três animais de PROLEUKIN no dia 8, porém permaneceram normais no restante dos animais (Figura 13A). Os níveis de cloreto no grupo de PROLEUKIN foram também reduzidos para abaixo de 95 MEQ/L iniciando no dia 3 e permaneceu baixa até o dia 15 (Figura 13B). O nível de cálcio foi inferior em dois dos três animais de PROLEUKIN nos dias 6 e 8, e atingiu tão baixo quanto 4,9 3,1 mg/dL em animal A199 (Figura 13C). O nível de potássio diminuiu para abaixo de 3 MEQ/L nos dias 3 a 12 em todos os animais tratados com PROLEUKIN exceto animal A199 cujo nível de potássio realmente aumentou para um nível tóxico de 7,2 MEQ/L antes ser feito o estudo (Figura 13D). (f) Sinais de Perda Vascular O nível de albumina no soro diminuiu em ambos os grupos de PROLEUKIN (37%) e IL-2/N88R (19%) (Figura 14A). Um aumento em nível de hematócrito foi observado no grupo de PROLEUKIN nos dias 3 e 6 (Figura 14B). Ao contrário, os níveis de hematócrito em ambos os grupos de controle de veículo e IL-2/N88R diminuíram durante o mesmo período de tempo e permaneceram baixos indicando anemia suave como esperado devido às coleções de amostra de sangue múltiplas (Figura 14B&C). A elevação de hematócrito no grupo PROLEUKIN quando acoplado com uma diminuição em albumina é consistente com o desenvolvimento de síndrome de perda capilar. 3. Ativação Celular A eficácia de PROLEUKIN e IL-2/N88R foi seguida em toda a variação da percentagem de linfócitos positivos CD25 (tráfico + proliferação) e método de fluorescência para CD25 ou número de antígenos de CD25 expressos na superfície de uma dada célula T (CD25 = baixa afinidade de IL-2R). A expressão CD25 foi seguida na população total de célula T (células CD3+) bem como as populações de CD3+CD4+ e CD3+CD8+. A atividade de IL-2 em células Exterminadoras Naturais (NK) foi seguida por meio de uma análise do tráfico de células CD3-CD16+ e CD3-CD25+CD16+. Os números absolutos de células CD3+, CD4+, CD8+, NK foram determinados multiplicando-se a percentagem de células pelo número de linfócitos por mm3, dados obtidos durante a análise de hematologia.

(a) Regulação de CD25 de Expressão sobre a Superfície de Célula T A percentagem de células T ativadas, como indicado pelas células CD25 positivas, foi super regulada pelo dia 6 do estudo, principalmente na subpopulação de célula CD3+CD4+T. A PROLEUKIN parece induzir a expressão de CD25 em uma percentagem superior de subpopulações de CD3+, CD3+CD4+ e CD3+CD8+ de células T no dia 6. Entretanto, pelo dia 8 a percentagem de células expressando o antígeno CD25 foi idêntica- nos linfócitos de chimpanzés tratados pela PROLEUKIN e os chimpanzés tratados com IL-2/N88R (Figura 15A, B e C). Nenhum manchamento para o CD25 na superfície da população de célula Exterminadora Natural (NK) foi observado em ou chimpanzés tratados com PROLEUKIN ou IL-2/N88R. A falta de expressão de IL-2Ra (o antígeno alvejado para manchamento de superfície celular por CD25) na superfície da população de célula NK selecionada (CD3-/CD16+) é suspeita de ser responsável por estes resultados. 0 número absoluto de células CD3+CD25+T seguiu um padrão similar como a percentagem de células CD3+CD25+T, com PROLEUKIN pareceu mais ativo do que IL-2/N88R (Fig. 16A). A IL-2/N88R exibiu um potencial de ativação de célula T similar como a PROLEUKIN na população de célula CD3+CD4+T, como a super regulação do número absoluto de linfóci- tos CD3+CD4+CD25+ induzido por IL-2/N88R foi idêntico à super regulação mostrada com PROLEUKIN (Fig. 16B). A PROLEUKIN pareceu aumentar o número de células CD3+CD8+CD25+ T para uma extensão maior do que a IL-2/N88R (Fig. 16C). O número de moléculas de CD25 (método de fluorescência) expresso sobre a subpopulação de célula CD3+CD4+T seguiu cinéticos idênticos com ou tratamento com PROLEUKIN ou IL-2/N88R (Fig. 17).

(b) Tráfico de Linfócito: Efeito de Tratamento com PROLEUKIN e IL-2/N88R

As atividades de PROLEUKIN è IL-2/N88R sobre as populações de célula T e NK foram determinadas por meio de análise da variação no número absoluto de linfócitos circulantes antes, durante e após o tratamento (Fig. 18). A IL-2/N88R pareceu ter uma atividade maior do que a PRO-LEUKIN para aumentar o número absoluto de linfócitos circulantes CD3+CD4+ (Fig. 18A), e uma atividade ligeiramente reduzida comparado à PROLEUKIN para aumentar o número absoluto de linfócitos circulantes CD3+CD8+ (Fig. 18B). Ambos os compostos tiveram um efeito comparável, contudo modesto, sobre o aumento do número total de linfócitos CD3+ (Fig. 18C). Nem a PROLEUKIN nem a IL-2/N88R afetaram o tráfico de células NK (Fig. 18D). C. Conclusão A IL-2/N88R foi gerada por meio de uma análise de proteínas IL-2 mutantes em ensaios de células T e NK primárias. Ela exibe seletividade in vitro para as células T sobre as células NK de ~ 6.000 vezes. Com base neste perfil celular, foi postulado que ela apenas induz efeitos colaterais suaves quando administrada em uma dose que evoque significante ativação da célula T. Experiências em chimpanzés, comparando a PROLEUKIN com a IL-2/N88R, confirmaram que a IL-2/N88R teve um perfil saudável signifi-cantemente melhor do que a PROLEUKIN, ao mesmo tempo que retendo comparável capacidade de induzir a ativação da célula T.

Exemplo 8;

Eficácia de Agonista Seletivo de IL-2 N88R no Modelo de Tumor de Metástase de Pulmão CT-26 de Murino Protocolo: Camundongos (Balb/c, fêmeas, de 6 a 8 semanas de idade) foram injetados intravenosamente (IV) com 1 x 105 de células CT-26 (carcino-ma de cólon de murino) em 0,2 ml de PBS na veia lateral do rabo no dia 0. O tratamento foi com PROLEUKIN ou IL-2/N88R em diferentes doses (diluente: 5% de dextrose em água (D5W)), ou D5W, liberada IV, um vez diariamente durante 8 dias (QD x 8) iniciando no dia 1 após a implantação. A IL-2/N88R foi preparada em temperatura ambiente por diluição na D5W empregando-se frasconetes siliconizados empregando-se uma seringa de tuberculina e dosada para animais dentro de 2 horas da preparação. A PROLEUKIN foi preparada adicionando-se 0,7 ml de água estéril para injeção (SWFI) a cada frasconete (concentração final, 1,86 mg/ml). As diluições foram feitas conforme descrito para IL-2/N88R em D5W (Tabela 6). Os animais foram sacrificados no Dia 11. Os pulmões foram removidos e pesados, enxaguados em PBS, e o tecido transferido par solução de Bouin. 24 horas mais tarde, o tecido foi transferido para formalina a 10%. O número de colônias metastáticas nos pulmões foi contado sob um microscópio de dissecação. TABELA 6 Dose e Grupos em Estudo de Modelo de Tumor CT-26 de Murino A tabela 7 mostra o número de metástase contada em camundongos individuais. A eficácia comparável foi observada para ambos a IL-2/N88R e PROLEUKIN. Na dose elevada de IL-2/N88R (grupo 8, 60 mg/kg), todos exceto um camundongo teve 12 metástase ou febre; 3 dos camun-dongos não exibiram nenhuma metástase. Isto é em contraste à dose mais elevada de PROLEUKIN testada, onde todos os camundongos sobreviventes tiveram 12 metástase ou superior. TABELA 7 rVnínrtnm A mÁlnrlnp /"Ιλ inntónlncn inrJiwirli inl rr\r\ lin+nrlnn Significante redução (P<0,05) em metástase foi observada em camundongos tratados com IL-2/N88R em doses de 10, 30 e 60 mg/kg (grupos 6, 7 e 8, respectivamente), e em grupo tratado com 10 mg/kg de PRO-LEUKIN (grupo 3). Estes resultados são mostrados graficamente na Figura 19. Os dados são traçados empregando-se o log da dose: para PRO-LEUKIN, as doses foram a 3 e 10 mg/kg; para IL-2/N88R, as doses foram a 1,3, 10, 30 e 60 mg/kg. A curva de ajuste empregando-se uma equação não linear (ajuste de parâmetro 4) produziu valores IC50 de 5,2 mg/kg para a PROLEUKIN, e 10,9 mg/kg para a IL-2/N88R. A partir dos dados nesta experiência, o IC50 com respeito à redução em número de metástase para a IL-2/N88R foi calculado ser 10,9 mg/kg (8,6 a 13,9 mg/kg a 95% de confiança), e para a PROLEUKIN ser de 5,2 mg/kg (3,5 a 7,7 mg/kg a 95% de confiança). A sobrevivência dos camundongos é mostrada na Tabela 8. No grupo de 10 mg/kg de PROLEUKIN, um(1) camundongo morreu no dia 7, e mais cinco (5) morreram no dia 8. Um (1) camundongo morreu no dia 8 em cada dos grupos tratados com 3 ou 10 mg/kg de IL-2/N88R, e nenhuma morte foi observada em ou 1, 30, ou 60 mg/kg de IL-2/N88R. Adicionalmente, a maioria dos camundongos tratados com 3 mg/kg de PROLEUKIN e todos os camundongos tratados com 10 mg/kg de PROLEUKIN ficaram mo-rimbundos; nenhuma morbidez foi observada em camundongos tratados com IL-2/N88R. TABELA 8 Sobrevivência de Camundongos Tratados com ÍL-2/N88R ou PROLEUKIN. - continuação da Tabela 8 - 1n = 14 camundongos/grupo. 4 Nenhuma morte foi observada antes do dia 7.

Os animais tratados com PROLEUKIN em ambos os grupos ficaram morim-bundos. Nenhuma morbidez foi observada em qualquer animal tratado com a IL-2/N88R.

Em resumo, estes estudos indicam que a IL-2/N88R é tão eficaz quanto a PROLEUKIN na redução de opressão de tumor (como medido pela contagem de metástase de pulmão no modelo CT26). Além disso, a IL-2/N88R mostrou-se ser substancialmente menos tóxica do que a PROLEUKIN.

Exemplo 9: Desenvolvimento de Linhagens de Célula CHO de Produção Elevada, Estável, que expressa a IL2N88R.

As linhagens de célula de produção estável que segregam elevadas quantidades da muteína ÍL2N88R foram desenvolvidas transfectando-se as células CHO (dhfr-) com o vetor de expressão mostrado na Figura 20 (ATCC Depósito N°______). Os elementos individuais do vetor de expressão IL2N88R são mostrados no mapa de plasmídeo (Fig. 20). Ele mostra CMVe/p = promotor precoce de citomegalovírus; PA = SV40 seqüência sinal de poliadenilação; DHFR = cassete de expressão de redutase de dihidrofo-lato. O vetor foi construído empregando-se técnicas de DNA recom-binante. Observe geralmente Sambrook e outros, Molecular Cloninq, 2a Ed., 1989, Cold Spring Harbor Press; Short Protocols in Molecular Bioloqy, 2a Ed., 1992, John Wiley & Son; Methods in Enzymology, vol. 185, Ed. Goeddel e outros, Academic Press, Inc., London, 1991. O vetor de expressão contém cassetes de expressão discreta para o gene IL2N88R e o gene DHFR ampli-ficável e selecionável (redutase de dihidrofolato). Cerca de 1 x 106 células CHO (ovário de hamster chinês) foram transfectadas com 10 ug de pBC1IL2SA empregando-se reagentes de Lipofectina (Life Technology Inc., Bethesda, Maryland) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram então selecionadas na presença de 50 nM de metotrexato e desenvolvidas em veículos DME/F12 (Life Tehnologies, Inc.) deficiente em timidina e hipoxantina mais 5% de soro bovino fetal dializado. As populações de célula foram analisadas quanto a produção de IL2N88R com um kit ELISA comercial (R & D Systems). As populações de produção elevada foram ainda selecionadas em veículos contendo aumento das concentrações de metotrexato (100 a 400 nM de metotrexato) e analisadas quanto a produção de IL2N88R. A limitação de clonagem de diluição foi então aplicada para derivar clones com elevada e estável produtividade. A clonagem foi feita na ausência de metotrexato empregando-se técnicas de cultura de tecido padrão.

Exemplo 10: Produção Livre de Soro de IL2N88R em um Bioreator de Perfusão. A produção contínua de IL2N88R foi feita por fermentação de perfusão contínua. Uma fermentadora Wheaton de 19 litros foi inoculada com uma linhagem de célula CHO estável de Exemplo 9 a 2 x 106 células/ml e perfundida em uma taxa de permuta de veículo de 5 litros/dia. O veículo de produção foi um veículo com base em DME/F12 (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) suplementada com insulina humana recombinante (10 ug/ml) (HUMULIN™, Eli Lilly, Inc., Indianapolis, IN) e FeS04.EDTA (50 uM). A densidade celular foi mantida a 4 x 106 células/ml. A produção média diária da fermentadora foi de -200 mg/dia. A produção de IL2N88R foi estavelmente mantida durante 30 dias.

Exemplo 11: Purificação de IL-2/N88R Produzida em Células CHO. O seguinte procedimento foi aplicado ao eluído de perfusão descrito acima. O veículo de perfusão foi colhido e aplicado a uma coluna de S- sefarose. A coluna foi equilibrada com 20 milimolares de Tampão de Fosfato com 5 milimolares de NaCI a pH 7,0. A alimentação ("TCF") é ajustada para 4 milisiemens de condutividade com a adição de água e ajustada ao mesmo pH com ácido fosfórico.

Após o TCF ser carregado a coluna é lavada no mesmo tampão de equilíbrio. A eluição é realizada por uma modificação de pH. As muteínas foram eluídas com 20 mM de etanolamina, pH 10,5, para lavar as muteínas da coluna para produzir o eluído S. A permuta de ánion foi realizada passando o eluído S através de uma coluna de QAE Fast Flow™ (Pharmacia) equilibrado com 10 mM de tampão de Bicarbonato em pH 10,5. A taxa de fluxo foi mantida a 250 cm/hr. Após a lavagem para embasamento a IL-2SA foi eluída com 20 mm de fosfato pH 4.0. A cromatografia de hidroxiapatita (HAP) foi realizada passando-se o eluído de QAE diluído (1:1 com WFI) através de uma coluna embalada com hidroxiapatita de cerâmica (Tipo II, BioRad, Hercules, CA) equilibrada com 0,10 mM de Fosfato em pH 7,0. A taxa de fluxo foi mantida a 250 cm hr- 1. Após a lavagem para embasamento a IL2SA foi eluída com 100 mM de Fosfato em pH 7,0. O eluído de hidroxiapatita foi ultrafiltrado a 300 ml de volume com uma unidade Millipore Pelicon-2 equipada com três cartuchos PES 5K (Millipore Corporation, Bedford, MA). O eluído HAP ultrafiltrado foi ainda purificado passando através de uma coluna de exclusão de tamanho S100HR (Pharmacia) a 35 cm/hr. A coluna foi equilibrada com 100 mM de Fosfato e 150 mM de NaCI pH 7,0. O "pool" de Filtragem de Gel foi diluído com WFI para atingir a condutividade de 4,0 mMhos/cm e foi reaplicado à S-Sepharose sob condições previamente descritas. IL2SA foi eluída com 10 mM de tampão de fosfato com 1 molar de NaCI em pH 7,0. O "pool" de permuta de cátion final foi dializado contra Phos-phate Buffered Saline (PBS) durante a noite e diluído com PBS estéril em um concentração de 6 mgs/ml. O cavidade diluído final foi então filtrado esté- ril, aliquotado e então congelado a -70°C. A recuperação total foi de 65%.

Outras modalidades da invenção tornar-se-ão evidentes para aquele versado na técnica. Esta invenção ensina como obter muteínas não especificamente descritas aqui, porém que causam a ativação de célula T como evidenciado por proliferação de PHA-blasto, e proliferação de célula NK reduzida, e desse modo aquelas muteínas se incluem no espírito e escopo da invenção. A concepção e método experimental aqui descritos seriam aplicáveis às outras citocinas utilizando sistemas receptores multiméricos heterólogos, em particular relacionados com as citocinas IL-7, IL-9 e IL-15, IL-10, interferon α e interferon γ.

REIVINDICAÇÕES

Claims (5)

1. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma muteína de interleucina-2 (IL-2) humana e de ser numerado conforme a IL-2 do tipo silvestre (SEQ ID NO. 1), em que a referida muteína de IL-2 humana é substituída em relação ao tipo silvestre em pelo menos uma das posições 20, 88 ou 126, em que a substituição na posição 20 é selecionada a partir de isoleucina, ou histidina e em que a substituição da posição 88 é selecionada a partir de arginina ou isoleucina ou glicina, e em que a substituição na posição 126 é leucina, e por meio das quais a referida muteína de IL-2 humana preferencialmente ativa as células T sobre as células Exterminadoras Naturais.

2. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo, como definido na reivindicação 1, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

3. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de DNA codificando uma muteína de interleucina-2 (IL-2) humana, em que referida seqüência de DNA é substituída em relação ao cDNA codificando a IL-2 do tipo silvestre (SEQ ID NO. 2) em pelo menos uma das posições 118-120 (i), 322-324 (ii) ou 376-378 (iii), em que a substituição na posição (i) é selecionada de ATT, ATC, ATA, ou CAT, CAC, e em que a substituição na posição (ii) é selecionada de CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG, ou ATT, ATC, ATA, ou GGT, GGC, GGA, GGG, e em que a su-batituição na posição (iii) é TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG.

4. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo, como definido na reivindicação 3.

5. Célula hospedeira procariótica caracterizada pelo fato de que é transformada com o vetor, como definido na reivindicação 4.